JPH06500237A - β―１，３―グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 β−１，３−グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ。

このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物産業上の利用分野 本発明は、β−１，３−グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質またはこの蛋白質 の前駆体をコードする組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを含む細菌、この組換え ＤＮＡにより形質転換された植物細胞、植物または植物の一部、特に植物の種子 並びにこの新規蛋白質およびそれの製造方法に関するものである。

従来の技術 農作物は、かなりの収穫量喪失に関与する寄生物、例えば植物病原菌類による攻 撃を受けやすいことが知られている。これらの菌類に対する現時点での主たる制 御手段は、殺菌活性を有する化学物室の使用に存する。植物はそれらの攻撃に対 して様々な防御機構により自然に反応するが、不幸にして、前記機構は、一般に 非常に遅（かつ非常に低い強度で誘発されるため、充分に有効とはいえないこと が知られている。

これらの機構の一つは、β−１，３−グルカナーゼＥ、　Ｃ，３，２，１，３９ として知られている酵素の誘導を含む（コンブリンク等、１９８８、「プロシー ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒ、　Ｎｔｌ、　Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８５．９８２−９８６およびペッグ等、１９８１、「 フィジオロジカル・プラント・バトロジーＪ（Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、 　Ｐａｔｈｏｌ、）、１９．３７１−３８２）。この誘導は、誘引物質、すなわ ち健康な植物において防御反応を誘導し得る生物起源の化合物の作用を通じて人 工的に誘発され得、それは病原体による感染中またはオーキシン、サイトカイニ ンまたはエチレンにより誘発されるホルモン不均衡中に自然展開する（アベレス 等、１９７１、ｒプラント・フィジオロジーＪ（Ｐ　１ａｎｔＰ　ｈｙｓｉｏｌ 、　）、４７．１２９−１３４およびデ・シーズ等、１９８８、「ジーンＪ（Ｇ ｅｎｅ）、７０．１３−２３）。

β−１，３−グルカン類は、β−（１→４）またはβ−（１→６）型分枝鎖を有 することもある、β−（１→３）結合により結合したグルコース単位により構成 される直鎖多糖類ポリマーである（ファルカ、１９８２、「ファンガル・プロト ブラスツＪ（Ｆ　ｕｎｇａｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）中、ペパーディーおよ びフェレンフライ、デツカ−・インコーホレイテッドにより出版）。これらの多 糖類は、たいていの菌類、特に植物病原菌の壁の骨格の典型的成分を構成する。

β−１，３−グルカナーゼは、β−１，３−グルカン鎖の分断によりそれらを分 解し得る。最もよく知られている植物β−１，３−グルカナーゼは、エンド型に 属する。

さらに、いわゆる組換えＤＮＡテクノロジーおよび植物細胞の形質転換並びに後 者からの総体植物の再生における最近の進歩によって、興味の対象である遺伝子 が植物細胞、植物または植物の一部へ導入されることにより有利な表現型が獲得 され得ることが知られている。

幾つかの植物β−１，３−グルカナーゼ、特にニコチアナ・プルムパギニフォリ ア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）β−１，３−グル カナーゼ（デ・シーズ等、１９８８、「ジーンＪ（Ｇｅｎｅ）、７０，１３−２ ３）および大豆β−１，３−グルカナーゼ（タケウチ等、１９９０、「プラント ・フィジオロジーＪ（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、９３．６７３−６８２ ）をコードするＤＮＡ配列が、分離され、クローンされ、決定された。特許出願 ＥＰ−Ａ−０３５３１９１は、相補的ＤＮＡの相異なるフラグメント（それらを 組み立てることにより、タバコβ−１，３−グルカナーゼをコードする相補的Ｄ ＮＡ配列が推定され得る）およびこの酵素をコードするゲノ　。

ムＤＮＡ配列の分離およびクローニングについて記載している。ＥＰ−０３９２ ２２５文書は、特にこのタバコβ−１，３−グルカナーゼをコードするキメラ遺 伝子の構築、後者によるタバコの形質転換および形質転換植物におけるこの内在 性蛋白質の過剰発現に関するポリクローナル抗体を用いたウェスタン・プロット および視覚化による証明を開示している。この特許出願は、組換えタバコβ−１ ゜３−グルカナーゼが生物活性を有することも、まして、それが病原体に対する 前記形質転換植物の抵抗力を付与することも示していない。

さらに、β−１，３−グルカナーゼ類、例えばバララス・サチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）β−１，３−グルカナーゼは、バイオマスの変換、特 に製紙産業の幾つかのセクターおよび農業食品産業、特に醸造業において有用な 酵素であることが知られている（ミーデン、１９８６、ブルヮーズ・ガーディア ン（Ｂｒｅｗｅｒｓ　Ｇｕａｒｄｉａｎ）、１１５．７およびｖックイーン、１ ９８７年１０月、ｒ二、−−サイエンティストＪ（Ｎｅｖ　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ ）、６６）。

最後に、慣用的遺伝子工学技術を用いて組換え蛋白質をコードする遺伝子を真核 生物細胞および細菌に導入した後、これらによって多くの組換え蛋白質が産生さ れ得ることも知られている。

発明の構成 本発明は、下記アミノ酸配列（ａｔ　）　：Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＭＱｔ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＡＳｎ　ｒＡｕ　Ｐｒｏ　 ５ｅｒＡｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＶａｌＩｌｅ　Ｇｌｙ　ｋｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ 　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ工ｌｅ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔ ｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａ ｌａＬ４ｉｌｕ　Ａｒｇ　ｘｓｎ　Ｓｅｒ　ＧＩＹＩｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ工１ ａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ５ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ 　ＡｒｇＧｉｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＸＡｕ　 Ａｓｎ　Ｐｈａ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＶａｌＬｙｓ工ｌ＠Ｌｙｓ　Ｔｙｒ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ 　ＶａｌＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　 Ｔ’ｙｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ工ｌ＠Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔ ｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ工１ａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｈｌ ｓ　ＡｓｐＧｉｎ工ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ工１ａ　Ａ ｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ工１ｅ　ＧｌｙＡｓｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ 　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　Ｓａｒ 　’ｒ’ｙｒＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ工ｌｅ　Ｓｅｒ 　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔ’ｙｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ＰｈａＴｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ 　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ 　Ｇｌｙ　ＴｙｒＧｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　 Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｌａ工ｌａ　Ａｓｐ　Ａ ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ工ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａ ｌ　Ｖａｌ　５ａｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＰｈｅＡｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＡｓｐ　Ａｓｎ　Ａ ｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａ ｒｇ　ｋｒｇ　ＡｌａＡｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒ ｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＴｙｒ工ｌａ　 Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｍａｔ　ＰｈｅＡｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ工ＩｅＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ 　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＬｙｇＬｙｓ または配列（ａ、）と高度の相同性を有する配列を含む、β−１，３−グルカナ ーゼ活性を有する蛋白質またはその前駆体（この蛋白質はβ−１，３−グルカナ ーゼ活性を有する）をコードすることを特徴とする、新規組換えＤＮＡに関する ものである。

本明細書で、高度の相同性とは、ニードルマンおよびランシュの最適配列調節７ ４（１９７０、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ、　Ｍ ｏｌ。

Ｂ　ｉｏｌ、　）、４８．４４３−４５３）による最大相同性に基づいて一列に 並べた場合、アミノ酸配列が少なくとも８０％および好ましくは少な（とも９０ ％の相同性（アミノ酸の合計数に対する同一アミノ酸の割合）を示すことを意味 する。この方法は、特にユニバージティー・オブ・ライスコンシンのＵＷＧＣＧ ソフトウェア：デバリュー等、１９８４、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ Ｊ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ。

Ｒｅｓ、　）、１２．８７１１−８７２１−ＧＡＰオプションにおいて使用され ている。

３０７アミノ酸の配列（ａｔ）のペプチド配列に最も近い既知ペプチド配列は、 ニコチアナ・ブルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕ＋＊ｂａｇｉ ｎｉｆｏｌｉａ）β−１，３−グルカナーゼの相補的ＤＮＡから推定された３６ ９アミノ酸の蛋白質のペプチド配列である（スイスプロット・データバンク・レ ファレンス、Ｇｕｓ＄　Ｎ１ｐ１．およびデ・ルース等、１９８８、「ジーンＪ （Ｇｅｎｅ）、７０．１３−２３参照）。ニードルマンおよびランシュ、１９７ ０、ｒジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、）、４８．４４３−４５３頁の方法を用いたこれら２配列の比較結果は 、３０７のうちの２１３アミノ酸が同一であり、約６９％相同性に相当すること を示している。全ての可能な配列を考慮に入れて、一つの配列を作成するこのア ルゴリズム的方法は、最大可能数の同一アミノ酸が塩基対を形成し、−列に並べ られた配列における穴の数が最少であるＦｉｇ、７に示されており、特にユニバ ージティー・オブ・ライスコンシンのＵＷＧＣＧソフトウェア：デバリュー等、 １９８４、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチＪ　（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒ ｅｓ。

）、１２．８７１１−８７２１−ＧＡＰオプションにおいて使用されている。

この新規組換えＤＮＡは、β−１，３−グルカナーゼ活性を有するこの蛋白質の 発現に使用されることにより、蛋白質を発現する植物または植物の一部において 病原体に対する高い抵抗力を付与するか、または真核生物細胞、特に子嚢菌類、 例えば酵母または糸状菌類、例えばクリフォネクトリア・バラシティ力（Ｃｒｙ ｐｈ。

ｎｅｃｔｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、または植物細胞、または原核微生物 、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を用いてこ の蛋白質を産生じ得る。

この組換えＤＮＡは、アミノ酸配列（ａｌ）をコードするヌクレオチド配列の下 流に隣接して、下記アミノ酸配列（ａ４）・Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　 Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　 ＶａｌＩｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌをコードするヌクレオチド配列 を、そのカルボキシ末端部分がＯ〜２７のアミノ酸により切頭形にされた状態で 含み得る。

有利なことに、この組換えＤＮＡは、アミノ酸配列（ａｌ）をコードするヌクレ オチド配列の上流に隣接して、Ｇｉｎに対するコドンを含む。

特に価値が高いＤＮＡ、例えば前記のものは、β−１，３−グルカナーゼ活性を 有する蛋白質またはその前駆体をコードし、下記配列（ａＳ）：Ｇｉｎ 工ｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＣＹｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　ＡＳｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　５ｅｒＡｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＶａｌＩｌ ｅ　Ｇｌｙｆｘｕ　Ｔ’ｙｒ　Ａｒ（Ｊ　Ｓｅｒ　Ａｇｎ　Ａｓｎ工１ａ　Ｌｙ ｓｘｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｒ（Ｊ　Ｌｅｕ　Ｔ’ｙｒ　Ａｓｐ　ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇ ｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　ＡｌａＬａｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｓａ ｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ工ｍｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ａｓｎ５ａｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　ＡｒｇＧｉｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｉ ｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｈａ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓａ ｒ　ＶａｌＬｙｓ工ｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＶａｌＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　八ｌａ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａ ｌａ　工１ｅＧｉｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　工１ｅ　Ａｒ ｇ　八ｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　ＡｓｐＧｉｎ工ｌａ　Ｌｙｓ　 Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ工１ａ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ工１ ｅ　ＧｌｙＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ 　Ｓａｒ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＶａｌＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　工１ｅ　工ｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔ ｙｒ　ＡｌａＡｓｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ｒｘｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａ ｌ　Ｔ’ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｐｈｉ　Ｓｉｒ　’ｒ’ｙｒＴｈｒ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ工ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａ ｌａ　Ｉ、ｅｕ　ＰｈａＴｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖ ａｌ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＧｌｎ　Ａｓ ｎ　Ｉ、ｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　ＴＪａｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｌａ工ｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ工ｌ ａ　Ｇｌｙ　’Ｉ’ｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　５ａｒＧ ｌｕ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　１１％ｙｒＡｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　 ＡｌａＡｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＴｙｒ工ｌａ　Ｐｈａ　Ａｌａ 　Ｍｅｔ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｕ工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　ＰｈｅＧｌｙ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＬｙｇＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈ ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙ ｓ　ＶａｌＶａｌ工１ｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｓａｒ工ｌａ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ａｓｎ５ａｒ を含むものである。

この組換えＤＮＡは、好ましくは所望によりＧｌｎに対するコドンが先行してい てもよい配列（ａｌ）をコードする配列の上流に、蛋白質を細胞質から運び出し 得る機能を有する、宿主細胞に従い選択されたシグナル配列を含む。

原核微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） で発現させる場合、このシグナル配列は、原核微生物により運び出された蛋白質 の天然前駆体、例えばＯ＋ａｐＡシグナルペプチド（ブライニブ等、１９８４、 ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、３．２４３７−２４４２）ま たはアルカリ性ホスファターゼ前駆体（「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー Ｊ（Ｊ、Ｂａｃｔ、）、１９８３．１５４．３６６−７４７）をコードする配列 から誘導された配列、または真核生物前駆体（例えばヒト成長ホルモンの天然前 駆体の一つのシグナルペプチド）をコードする配列に由来する非内在性配列、ま たは配列：Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ 　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａの合成シグ ナルペプチド（例えば、フランス国特許出願第２６３６６４３号に記載されたも の）をコードする配列であり得る。

真核生物細胞、例えば子嚢菌類、例えばサツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母または糸状菌クリフオネ クトリア・バラシティ力（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ）における発現の場合、このシグナル配列は、好ましくはこれらの細胞により分 泌される蛋白質の天然前駆体、例えば酵母の場合インベルターゼ前駆体（特許出 願ＥＰＯ１２３２８９）またはアルファ・フェロモンのプレプロ配列の前駆体（ 特許出願ＤＫ２４８４／８４）、またはクリフォネクトリア・バラシティ力（Ｃ ｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）の場合、配列：Ｍｅｔ　Ｓ ｅｒ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　ＬａｕＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｓａ ｒ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　ＧｌｙＬｙｓ 　Ｐｒｏ　ＶａＩＡｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔ’ｙｒＳａｒ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　 Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　ＧｌｙＰ ｒｏ　］、＋ａｕ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

１１Ｑ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒＧｌｙ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇのエンドチアペプシンのプレプロ配列の前駆体（フランス国特許出願第２６ ６６５９０号に記載）をコードする配列から誘導された配列である。

植物細胞における発現の場合、例えば配列：Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｐ ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ ａｕ　Ａｌａを有する、運び出されることが知られている植物細胞蛋白質のシグ ナルペプチド、例えばフランス国特許出願第２６６５１７７号記載のものをコー ドする配列、または下記配列（ａ２）： Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　 Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　＾１ａＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａ ｒｇＭｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ のシグナルペプチドをコードするシグナル配列が、シグナル配列として使用され る。

アミノ酸配列（ａ、）、（ａ２）および（ａ４）は、例えば下記ヌクレオチド配 列（Ｎａｐ）、（Ｎａｇ）および（Ｎａ４）によりコードされ得る。

（Ｎａｐ）： ＣＴＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡ　ＡＡＡＡＡＡＡ（Ｎａ２　）　： ＧＣＴ’ＴＣＴＴＣＴＧ　ＧＭＣＴＡＴＴＧＡ　ＣＡＧＧＡＡＡＣＣＴ　ＴＣＧ ＣＡＴＧＧＣＡ　ＧＡＴＧＣＴ（Ｎａ４）： また本発明は、有利には発現ベクターと呼ばれるベクターにより行なわれる、上 記組換えＤＮＡの発現用ユニットに関するものである。

原核微生物、特にエシェリヒア・コ１バＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に おける発現の場合、組換えＤＮＡは、特に有効なプロモーター、次いで発現され る遺伝子の上流にあるリポソーム結合部位、および発現される遺伝子の下流にあ る有効な転写停止配列を含む発現ユニットに挿入されなければならない。またこ のユニットは、選択マーカーを含むか、または選択マーカーの発現のためのユニ ットとして（例えばこれらのユニットの両方をもつ発現ベクターを用いて）同時 に宿主細胞へ導入されなければならない。これらの配列は全て宿主細胞に従い選 択されなければならない。

真核生物細胞、例えば子嚢菌類における発現の場合、本発明による発現ユニット は、発現に要する手段と共に上記組換えＤＮＡを含む。

子嚢菌類細胞、例えば酵母、例えばサツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ　ａｃ ｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現の場合、一方の 有効なプロモーターとして認められた配列および他方の転写ターミネータ−の間 に組換えＤＮＡを挿入するのが適当である。発現ユニットは選択マーカーをもつ か、または選択マーカーと同時に宿主細胞へ導入される。好ましくは、この選択 マーカーは、高コピー数の組換えＤＮＡを細胞のゲノムまたはマルチコピーベク ターへ組み込んだ細胞の選択を可能にする栄養要求変異種マーカー（受容細胞の 突然変異を補足する）である。

子嚢菌類細胞、例えば糸状菌の細胞、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ボドスポラ（Ｐ　ｏｄｏ ｓｐｏｒａ）、トリコブルｖ　（Ｔ　ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはクリフォネ クトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属の細胞における発現の場合、本発明 による発現ユニットは、その発現に必要とされる手段、および所望により選択マ ーカーおよび／またはテロマー配列と共に上記組換えＤＮＡを含む。事実、興味 の対象であるＤＮＡと同じユニットまたは別のユニット（これら２つのユニット は同時形質転換により導入される）に位置する選択マーカーを用いて興味の対象 であるＤＮＡを組み込んだ形質転換体を選択するのが可能である。本発明の組換 えＤＮＡは、糸状菌のゲノムへ組み込まれるか、またはこのＤＮＡを複製および スプリット（開裂）させ得る配列を介して染色体外形態で保存され得る。

植物細胞における発現の場合、植物において有効であるプロモーターおよびター ミネータ−間に上記組換えＤＮＡを挿入するのが適当である。

プロモーターは、好ましくは強力な構成プロモーター、例えばカリフラワー・モ ザイクウィルスの３５５プロモーター、または組織もしくは器官特異的発現を制 御するプロモーター、例えばリブロース１．５−２燐酸カルボキシラーゼ／オキ シゲナーゼの小サブユニットのプロモーターであり、これは葉および殊に中温生 物組織で優先的に発現される（クーレマイヤー等、１９８７、「アニュアル・レ ビュー・オブ・プラント・フィジオロジーＪ（Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、）、３８：２２１−２５７）。また、例えば植物の種子または植 物の正味生長段階中における発現を制御する特異的プロモーター、または熱ショ ック、創傷または植物および寄生体間の相互作用後に（ただし、組換えＤＮＡの 発現がこれらの状況で望まれる場合）誘導性を示すプロモーター（クーレマイヤ ー等、１９８７、上記参考文献）を使用することも可能である。

植物遺伝子または植物で発現される遺伝子から分離され得るポリアデニル化部位 を含むターミネータ−配列、例えばツバリンシンターゼ・ターミネータ−、アグ ロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓ）が使用される。

本発明はまた例えばエシェリヒア・コリ（１：、　ｃｏｌｉ）種の細菌に関する ものであり、これはその複製およびその発現に必要とされる手段と共に上記組換 えＤＮＡを含む。この細菌は、β−１，３−グルカナーゼ活性を有する蛋白質の 製造において使用され得る。

本発明はまた、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）種の細菌であって 、それを複製させ得る手段と共に上記組換えＤＮＡを含むため、この組換えＤＮ Ａのクローニングに使用され得る細菌、並びに例えばアグロバクテリウム・リゾ ゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）およびアグロバ クテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ）種のうちの一つの遺伝物質の移動を伴いながら植物に感染し得る細菌 であって、それを複製させ得る状況の中でこのＤＮＡを含むため、植物細胞の形 質転換に使用され得る細菌に関するものである。また、上記組換えＤＮＡによる 植物細胞の形質転換は、別の生物学的方法、例えば花粉管方法（ツォングークン ・ルオ等、「プラント・モレキュラー・バイオロジー・レポーツ」（Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、）、１９８８．６．１６５−１７６）およ び発芽中の種子の直接形質転換法（トエブファーＲ１等、１９８９、「ザ・プラ ント・セル」（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．）、１．１３３−１３９）、ま たは物理的方法、例えばポリエチレング；、１コールの使用、エレクトロポレー ション（チストゥＰ０等、１９８７、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナナイテッド・ステー ブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８４．３６６２−３６９９）およびマイクロプ ロジェクティルを用いたボンバード（クレインＴ、Ｍ、等、１９８８、「ブロシ ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オ ブ・ザ・ユナナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、 　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８５．８５０２−８５０５）により遂行され 得る。

本発明はまた、発現に必要とされる手段を伴った上記組換えＤＮＡにより形質転 換されることを特徴とする植物細胞に関するものである。この植物細胞は、主要 作物品種、例えばとうもろこし、大豆、ビート、小麦、大麦、ケシ、ナタネ、ヒ マワリ、アルファルファおよびモロコシ、花品種、例えばバラ、カーネーション およびガーベラ、または食用品種、例えばニンジン、トマト、レタス、チコリ、 コンヨウ、メロンおよびキャベツに由来し得る。特に価値の高い種類は、ブラッ シカ・ナブス（Ｂ　ｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）ナタネ、へりアンラス・アン ラス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）ヒマワリおよびニコチアナ・タバク ム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ＋ｏ）タバコである。

一つまたは数個の細胞を必然的に伴う形質転換段階に次いで、これらの形質転換 細胞の増殖段階が行なわれることによりカルスが得られ、器官形成または胚形成 プロセスにより形質転換植物が生じ得る。

この故、本発明は、発現に必要とされる手段と共に上記組換えＤＮＡを含むこと を特徴とする植物または植物の一部に関するものである。特に価値の高い植物部 分は、特に播種するか、地面に埋めるかまたは移植した後に完全な新規植物を形 成するかまたは種子を生産し得る部分である。前記の植物部分は、例えば穀粒、 成熟受精胚珠、種子、切り枝、走出波などである。これらの植物は、上記種類、 さらに特定すればニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ＋ ｍ）、へりアンラス・アンラス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ）および ブラッシ力・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）のいずれか一つであり得 る。

また本発明は、寄生体、例えば植物病原菌に対する植物の抵抗力を得る方法であ って、この組換えＤＮＡによる植物細胞の形質転換段階、次いで形質転換細胞の 増殖段階および植物再生段階を含む方法に関するものである。

好ましくは、植物細胞の形質転換段階は、興味の対象である組換えＤＮＡが組み 込まれたアグロバクテリウム（すなわちアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ）属の細菌）を用いてインビトロで行なわれる。

本発明はまた、上記方法を用いて獲得され得る、病原体に対する植物の抵抗力に 関するものである。

本発明はまた、新規植物変種作成用選択プログラムにおける母体としての、発現 に必要とされる手段と共に上記組換えＤＮＡを含む植物の使用に関するものであ る。

本発明はまた、配列（ａ、）、および所望により配列（ａｌ）の下流に隣接して カルボキシ末端が０〜２７個のアミノ酸により切頭状にされた配列（ａ４）を含 んでいてもよい、β−１，３−グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質、および配 列（ａｓ）を含む新規蛋白質に関するものである。

この蛋白質は、好ましくは３６±３．３７±３または３９±３ｋＤａの見かけ上 の分子質量を有する。

この蛋白質は、特に製紙産業の幾つかのセクターおよび農業食品産業、特に醸造 業における、β−１，３−グルカンを含むバイオマス転換用酵素として興味深い ものである。

本発明はまた、上記組換えＤＮＡを含む細菌、植物細胞、植物カルス、植物また は植物部分の培養、その溶解並びにこの蛋白質の分離および精製を含む、この蛋 白質の製造方法に関するものである。

本発明は、実験結果およびその検討を含め、セクンタンに分割された下記の記載 事項からより明確に理解されるはずである。これらのセクションの中には、本発 明を遂行する目的で行なわれた実験に関するものもあれば、純粋に説明により当 然与えられる本発明の実施例に関するものもある。

当業界の熟練者に熟知されている下記集合的技術の大部分は、サムプルツク等に よる著書、「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアルＪ（ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕ ａｌ）、ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバ−・プレス編集社により １９８９年出版（第２版）に詳細に記載されている。

Ｆｉｇ、１〜７を参考にすると、下記の記載事項はより明確に理解されるはずで ある。

Ｆｉｇ、ｌは、プラスミドｐＢＲ１３１０に含まれ、大豆β−１，３−グルカナ ーゼをコードする相補的ＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメン トの制限部Ｆｉｇ、を示す。

Ｆｉｇ、２は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体のヌクレオチド配列、大 豆β−１，３−グルカナーゼの相補的ＤＮＡの一部分、Ｍ１３ｍｐ１９でのクロ ーニングおよび矢印により示されている後続の構築に使用される制限部位並びに この相補的ＤＮＡから推定されるペプチド配列を示す。

Ｆｉｇ、３は、突然変異誘発後（セクション６ｃの最後で）の大豆β−１，３− グルカナーゼの相補的ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ　−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント のヌクレオチド配列、Ｍ１３ｍｐ１９でのクローニングおよび矢印により示され ている後続の構築に使用される制限部位並びに翻訳された蛋白質のペプチド配列 を示す。

Ｆｉｇ、４は、Ｎｄｅ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が近接している、プラ スミドｐＢＲ５９、すなわちエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における発 現プラスミドの暗号化部分のＮｄｅ　Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのヌクレ オチド配列および翻訳された蛋白質のペプチド配列を示す。

Ｆｉｇ、５は、完全組換え遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳された蛋白質の ペプチド配列を示す。

Ｆｉｇ、５は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｌ）およびタバコにおいて翻訳 された蛋白質の共通部分のペプチド配列を示す。

Ｆｉｇ、７は、大豆β−１，３−グルカナーゼの相補的ＤＮＡから推定されるペ プチド配列（Ｆｉｇ、２参照）およびニコチアナ・ブルムバギニフォリア（Ｎｉ ｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）β−１，３−グルカナーゼ （スイスプロット・データバンク・レファレンスＧｕｂ＄−Ｎｉｐｌ）の相補的 ＤＮＡから推定される最も近い既知ペプチド配列の、ニードルマンおよびランシ ュ、１９７０、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪＯ，Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、）、４８．４４３−４５３の方法に基づいたアラインメントを示 す。

セクション１：　タバコβ−１，３−グルカナーゼに対するポリクローナル抗体 の調製 ａ）タバコβ−１，３−グルカナーゼの精製。

タバコβ−１，３−グルカナーゼはタバコカルスから下記のようにして均貢物と して精製される。タバコカルスはイン・ビトロでムラシゲおよびスクーグの培地 （ムラシゲ・ティーおよびスクーグ・エフ（１９６２年）、ライジオロジカル・ プラント・バソロジー、１５巻、４７３−４９７頁）で培養した。細胞抽出物は 植物原料を、１５＋ａＭβ−メルカプトエタノールおよび５％のポリビニルピロ リドンを含む５０ｍＭ　ｈリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐｌ＋８．４中でひくことによ り得た。

蛋白は抽出物から、下記のプロトコールに従って、硫酸アンモニウム沈殿、合成 樹脂を基本にした陽イオン交換カラムによる液体クロマトグラフィー、架橋アガ ロースでの排除クロマトグラフィー（分子ふるいわけ）により精製した。

段階１ 蛋白抽出物は硫酸アンモニウム（４３％飽和）で処理した。沈殿した蛋白を遠心 （１５，０００ｇ、　３０分）により回収し、緩衝液（１０ｈＭ酢酸アンモニウ ム、ｐＨ１５，２）に溶解し、１０００１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５， ２に対して４℃で一晩透析した。

操作の直前に、調整済みミ二カラム（ファルマシア社、ＰＤ−１０）を通して蛋 白抽出物の緩衝液の酢酸濃度を１ｈｌｌへ合わせた。

段階２ 蛋白抽出液はそれから合成ポリマーを基本にしたカラムを用いたイオン交換クロ マトグラフィー（ファルマシア　モノ−Ｓカラム）をフアルマシアＦＰＬＣ技術 に従って行った。

抽出物を１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５，２で平衡化したモノ−Ｓカ ラムに入れた。カラムに吸着した蛋白は１０から５００ｄ酢酸アンモニウムの直 線勾配で溶出させた。

それぞれの段階で、β−１，３−グルカナーゼはその分子量により同定しくＳＤ Ｓ存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動−銀により可視化）、その活性は比 色学的方法（下記第８節参考）でラミナリン（ラミナリア・ジギタタ、シグマ− 商品番号Ｌ９６３４−からのβ−１，３−グルカン抽出物）を使用して測定した 。

ｂ）ポリクローナル抗体の調製。

ついで、ウサギに５０ｈ７のフロイント完全アジュバント中２５１１９のタバコ β−１゜３−グルカナーゼを注射した。フロインド不完全アジュバント（５００ μり中２５μ９の３回の追加免疫注射は３週間間隔で行った。免疫血清は最後の 注射の３週間後に得た。

この免疫血清はタバコβ−１，３−グルカナーゼを認識する：大豆β−１，３グ ルカナーゼもまた認識する。それは事実上、全大豆（グリシン・マックス変種マ ンダリン）蛋白の抽出液からウェスタン・プロット法（下記第１３節参照）によ り後者の蛋白を可視化され得ることが証明された。

セクション２：　大豆細胞培養からのメツセンジャーＲＮＡ由来相補的ＤＮＡの ファージライブラリーの構築 ａ）大豆細胞のメツセンジャーＲＮＡの調製。

オーキシンの不存在下レゲーら（１９８７年）、デベロップ、ジェネティクス、 ８巻３５１−３６４頁に記載の方法に従って、イン・ビトロで培養した５日目の 大豆細胞（グリシン・マックス変種マンダリン）の全ＲＮＡは、下記に要約した シュノーら（１９８４年）、プラント・フィジオロジー、７４巻６６３−６６８ に記載の方法に従って抽出した。予め生理食塩水で洗浄した細胞は、液体窒素中 で摩砕する；ホモジネートは、それから再蒸冒したフェノールおよびクロロホル ムの混合液で抽出する。エタノール沈殿の段階後、全ＲＮＡはｐＨ７，６の緩衝 液に溶解する。

メツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）のポ１バＡ）４画分は、サムブロークら （“モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル、２版、コー ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８９年））に記載のオリゴ（ ｄＴ）−セルロースカラムのアフィニティークロマトグラフィー２サイクル後に 単離した。メツセンジャーＲＮＡの定量は本分野の技術者に良（知られたプロト コールに従ってスペクトロフォトメトリーにより行った。

ｂ）相補的ＤＮＡの合成 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、相補的ＤＮＡの合成およびクローニングに有利な 方法であるギュブラーおよびホフマン（１９８３年）（ンーン、２５巻２６３− ２６９頁）に記載の方法に従って合成したニアμ９のｍＲＮＡをプロメガプロト クローン・ジ−ティー・システム”キット（商品番号Ｐ３０１０）を使用してｃ ＤＮＡの最初の鎖を製造するための方法で処理した。

Ｃ）相補的ＤＮＡのクローニング 合成された２本１１１ｃＤＮＡはついでＥｃｏＲＩメチラーゼを使用してサムブ ロークら（前掲）の参考文献中記載の条件下でメチル化を行った。この酵素はｃ ＤＮＡの潜在的なＥｃｏＲＩ部位をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの開裂に対し て保護することが可能で、この保護はｃＤＮＡの複製物については消滅している （メチル化されていない）。

合成ＥｃｏＲＩリンカ−（ＥｃｏＲＩ部位を含む２本鎖ＤＮＡ断片）は、ついで ｃＤＮＡの末端への結合によって加えた。エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで開裂 およびＧ−５０分子ふるい（ファルマシア）のカラムによるクロマトグラフィー でリンカ−を除去した後、ｃＤＮＡはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ヒュイニー ら、“ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ”アイ・アール・ エル・プレス、ディー・エム・プロバー（１９８５年）４９頁に記載の、クロー ニングおよび発現ベクターであるファージラムダｇｔｌｌ中に、プロメガ・プロ トコール（参考Ｔ３０１１）　“ラムダｇｔｌｌシステム”に従ってライゲート した。ファージＤＮＡは予め制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよび２リン酸 化により開裂しである。ライゲージシン培地の一部分をついで、アメルシャム（ “イン・ビトロ・パフケージング・システム・フォー・ラムダＤＮＡ、商品番号 Ｎ３３４）により市販されているキットを使用してファージ粒子中に封入した。

形質転換の数をついでエシェリキア・コリ株Ｙ１０９０の細菌のローン上に得ら れた溶菌プラークを計数することにより決定した（サムブロークら、上記参考、 前掲）。約１０６個のクローンが得られた。Ｘ−ギャル（５−ブロモ−４−クロ ロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド）およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガ ラクトンド（ＩＰＴのの存在下で、細菌のローン上のファージ懸濁液の一部分の 平板培養の広がりは、ヒュイニーら、上記参考、前掲に記載の技術に従って、８ １％のファージが大豆ｃＤＮＡに融合されることが測定されることを可能にした 。

セクション３：　大豆細胞メツセンジャーＲＮＡ［から構築された相補的ＤＮＡ のファージライブラリーの免疫学的スクリーニング。

ベクターラムダｇｔｌｌのライブラリーの産物は、クローンｃＤＮＡの発現を可 能にし、このライブラリーを構築するために使用されるメツセンジャーＲＮＡに よりコードされる蛋白の合成を可能にする；合成は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ −Ｄ−チオガラクトシド）による誘導の後起こる；ついで合成蛋白はタバコβ− １，３−グルカナーゼに対して得られた抗体により（第１節参照）認識され得る 。ついで、これらの蛋白を合成するクローンは本分野の技術者に既知の、および 例えばサムブロークら（前掲）に記載のプロトコールに従って、同定し単離する ことが可能である。

大豆ｃＤＮＡライブラリーの１０６個のファージはベトリ皿に置き、溶菌プラー クは２時間３０分、４２℃でのインキュベージ５ンにより得られる。ＩＰＴＧで 満たしたニトロセルロースフィルター（シェリヒャーおよびシュル、ＢＡ８５） を皿の表面に置き、４時間、３７℃の温度で寒天培地に接触させて置き、ついで 、２番目のフィルターに変え、６時間同じ培地に放置する。

培地から除去したフィルターは、それからＴＮＴ溶液と呼ばれる１０１Ｍトリス −１１ＣＩ、ｐＨ８，０，１５０ｍＭＮａＣ１，０，０５％ツイン２０界面活性 剤からなる液に３０分、ついで遮断緩衝液と呼ばれるＴＮＴ溶液中にゼラチン１ ％溶液を含む緩衝液に３０分浸す。フィルターはついで３時間、上記により得ら れた抗−β−１，３−グルカナーゼポリクローナル抗体（第１節参照）を含む溶 液で処理し、遮断緩衝液で希釈した。それらはついで１０分間ずつ連続して以下 の溶液に浸した：・ＴＮＴ溶液＋０，１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）・ＴＮＴ 溶液＋０．１％絽＾＋ノニデエトＰ４０界面活性剤（シグマ社）・ＴＮＴ溶液＋ ０．１％絽＾。

生成した抗原−抗体複合体はついでペルオキシダーゼと結合した２次抗体結合（ ノルディック・イムノロジー、ティルブルグ、オランダの“イムノ・フンジュゲ ーｈＧＡＲ／ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／Ｐａ“）を用いて可視化する。化学的可視化反 応は、色素産生基賀として４−クロロ−１−ナフトールを用いて行った（青色沈 殿を産生ずる）。

β−１，３−グルカナーゼを合成するクローンに対応する陽性溶菌プラークは、 ついでペトリ皿上で同定され、１次免疫スクリーニングと全く同じ方法で行われ る２次免疫スクリーニングによりバクテリオファージは除去され、精製される。

これらのクローンのうち１個が研究を続けるため選択された。

セクション４：　大豆β−１，３グルカナーゼクローンのファージＤＮＡの部分 的な特性。

ａ）ファージＤＮＡの調製。

選択されたファージクローンは増幅され、ＤＮＡを下記に要約したアメルシャム キット“ｃＤＮＡクローニング・システムＧＴＩＩ”（商品番号ＲＰＮ１２８０ ）に述べられているプロトコールに従って抽出する。ファージは芯取り器を用い て除去し、エシェリキア・コリ株Ｙ１０９０の培養系に移す１１５分後、５ＩＩ ＭのＣａＣ１１および５０１１９／菖ｌのアンピシリンを含む５冨ｌのルリア培 地（ギブコ社）を加える。４時間、４３℃で振盪しながらインキュベーションの 後、培養物は３．０００ｒｐ＋ｎで１０分遠心する。上清に存在するファージ粒 子のＤＮＡは、ついで抽出し、ポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウムに よる処理し、遠心し、プロトコールにで処理し、沈殿により精製する。

ｂ）選択クローンのファージＤＮＡの分析。

β−１，３−グルカナーゼクローンは制限酵素ＥｃｏＲＩで加水分解した。約２ ．３００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の１本が、クローニング部位での開 裂により得られた。相補的ＤＮＡ中にはそれゆえＥｃｏＲＩ部位はない。

約２．３００ｂｐＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片に対する数種のエンドヌクレアー ゼの作用により得られた断片のアガロースゲル電気泳動による分析は、ＥｃｏＲ Ｉ部位から数塩基対後にＰｖｕｌＩ部位が含まれることが示され得る。

セクション５：　プラスミドｐＢ２１３１０の構築、大豆β−１，３−グルカナ ーゼのコード部分を挿入した相補的ＤＮＡの単離およびその配列決定。

ａ）プラスミドｐＧＥｌｌ−３２へのクローニング。

制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩを使用して選択したクローンを加水分解す ることにより、大豆β−１，３−グルカナーゼｃＤＮＡを含む約２．　ａｏｏｂ ｐのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片を低融解温度アガロースゲル電気泳動を行った 後単離した。

プラスミドｐＧＥＭ−３２（プロメガ、マジソン、ライ−、ニーニスニー）を制 限エンドヌクレアー（＝７：ｃｏＲＩおよびＳｍＩを使用して開裂し、低融合温 度アガロースゲル電気泳動により精製および単離を行った。このプラスミドは、 連続的にＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む“ポリリン カー”（多重部位をクローニングする）を含む。

大豆β−１，３−グルカナーゼをコードするｃＤＮＡを含む、約２．３００ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ｈｕｌＩ断片のＴ４ＤＮＡリガーゼを使用したこのように開裂され たプラスミドへのライゲージ３ンは、プラスミドｐＢＲ１３１０と呼ばれるプラ スミド（これらの部位の消滅を伴うＳｍａＩおよｒｖｙＩＩ鈍端のライゲーショ ン）を得ことを可能にし、このプラスミドはエシェリキア・コリ細菌株ＪＭ１０ ９ヘクローンされる（サムブルーフら、前掲）。ついで、得られたベクターを抽 出し、アルカリ融解法により精製する（ビルンポイムおよびドリー、サムブルー フら、前掲）。

数個の制限酵素の使用は、プラスミドｐＢＲ１３１０に含まれる、β−１，３− グルカナーゼをコードするｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の制 限地図の作製を可能にした。Ｆｉｇ、　ｌに示す。

ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１４９０ｂｐ）はＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ ｃｏＲＩ断片をエンドヌクレアーゼＢ１ｎｄＩＩにより消化させることにより調 製し、低融合温度アガロースゲル電気泳動により精製し、単離した。この断片は ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で開裂された１本鎖ファージＭ１３ｍｐ１９（ファルマ シア）複製された形のＤＮＡヘクローンされた。１４９０ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部位を含むベクターＭ１３はＭ１３ＢＲ１３７と呼ばれる。

この挿入部の配列はンデオキシリボヌクレオチド法（サンガーら、ビーエヌエー エスーユーエス工−、１４巻、５４６３−５４６７頁）に従って決定する。

ｂ）大豆β−１，３−グルカナーゼのｃＤＮＡ配列の分析。

下記の記載は、図２を参考にして、よりよい理解が得られるであろう。

この配列は１個の開裂読み取り枠（停止コドンにより遮断されていない）を含み 、アガロースゲル電気泳動により観察された分子量と一致している：配列は１１ ４位のＡＴＧコドンで始まり、１２２４−１２２６位の丁Ａ＾停止コドンで停止 し、３７０アミノ酸をコードする。

ライスコンシン大学のＵＷＧＣＧソフトウェアニドブローら、（１！１１８４年 ）、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ、１２巻、８７１１−８７２１頁−オプ ション：ジー・フォノ・ヘイジュネ、（１９８６年）、ヌクレイツク・アシッズ ・リサーチ、１４巻、４８３−４９０頁の方法に従ったシグナルペプチドの試験 はこの配列中に、真核細胞中へ発現するためのシグナルペプチドをコードする単 一部分、下記の配列（ａｘ）　：Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａ ｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｔｈ ｒ　Ｌｅｕ　kｅｕ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　 Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａの３２個アミノ酸のシグナルペプチド をコードする前記列と呼ばれる下記の配列（Ｎａ２）（ヌクレオチド１１４で開 始し、ヌクレオチド２０９で終了する戸ＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＧＣＴ ＡＧ　ＡＡＡＣ（ＡＧＡＧＧ　ＴＴＣＴＣＡＴＴＧＧ　ＣＴＡＣＴＣＴＣＣＴ　 ＧＣＴＴＣＴＴ（Ｔf ＧＡにＣＴＡＴＴＧＡ　ＣＡＧＧＡＡＡＣＣＴ　ＴＣＧＣＡＴＧＧＣＡ　ＧＡＴ ＧＣＴをもたらす。

シグナルペプチドは、β−１，３−グルカナーゼが天然に植物細胞の小胞体に蓄 積され得るか、分泌され得るかのいずれかであり、その際シグナルペプチドの存 在を必要とする蛋白であるから当業者に期待されている。

大豆β−１，３−グルカナーゼの相補的ＤＮＡを起源とする３７０個のアミノ酸 の蛋白の配列と最も近い既知の蛋白配列は、ニコチアナ・ブルムバギニフォリア β−１，３−グルカナーゼの相補的ＤＮＡを起源とする３６９個のアミノ酸の蛋 白である（スイスポート・データ・バンク参照番号Ｇｕｂ＄Ｎ１ｐｌおよびデ・ ルースら、（１９１１１８年）、ジーン、７０巻、１３−２３頁参照）。

ニーデルマンおよびランシュ（１９７０年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー ・バイオロジー、４８巻、４４３−４５３頁の方法を用いるこれら２つの配列の 比較は、ライスコンシン大学ＵｆＧＣＧソフトウェアニドブローら、（１９８４ 年）、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ、１２巻、８７１１−８７２１頁、Ｇ ＡＰオプションに採用され、２２４個のアミノ酸は、約６０％相同性の均等性で 一致することが示された。この計算法はあらゆる可能性のある組合わせを検討し て、Ｆｉｇ、　７に示される一致するアミノ酸の最大数が組合わせられ直列配列 中の穴あき部分が最小になるような１個の直列を見４種の植物のβ−１，３−グ ルカナーゼが現在までに既知であり、そのアミノ末端配列はずでに実験的に決定 されている。それらはニコチアナ・タバクム（エイチ・シンシら、（１９８８年 ）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス・ニー ニスニー、８５巻、５５４１−５５４５頁）、ニコチアナ・ブルムバギニフォリ ア（エム・デ・ルースら（１９８８年）、ジーン、７０巻、１２−２３頁）、フ ァセロルス・ブルガリス豆（ビー・ブイ・ニブイントンら（１９９１年）、プラ ント・モレキュラー・バイオロジー、１６巻、８１−９４頁）およびホールブラ ム・プルガレ大麦（ビー・ビー・ホイら、（１９８８年）フェツス・レター、２ ３０巻、６７−７１頁）のβ−１，３−グルカナーゼである。

それらのアミノ末端配列は強い相同性を示し、１５個のアミノ末端のアミノ酸で ８０％のオーダーである。双子葉植物にニコチアナ・タバクム、ニコチアナ・ブ ルムバギニフォリアおよびファセロルス・ブルガリス）の場合、Ｇｌｎで開始し 、あればＳｅｒの後にＩｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙが続（ 。上記のソフトウェアで予想された成熟大豆（双子葉植物）β−１，３−グルカ ナーゼの配列は、またＧｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ＶａｌＣｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ であることは注目され得る。

セクション６、　エシェリキア・コリ中で発現するベクターの構築：ブラスミド ｐＢＲ５９ ａ）コード部分の５ａｃＩ制限部位（５７５位）を除去するためのコード部位の 沈黙変異誘発。

ベクターＭ１３ＢＲ１３７の５７５位に位置する５ａｃＩ制限部位のＧＡＧ　Ｃ ＴＣ配列は、下記のような直接変異誘発によりＧＡＧ　ＣＡＣ配列に置換される 。コドンＧＣＴは、最初のｃＤＮＡ配列のアラニン残基に対応し、従ってこれも アラニン残基に対応するコドンχＡにここから置像される（沈黙変異）。

ベクターＭ１３ＢＲ１３７の１本鐘形はサムブロークら、前掲に記載のプロトコ ールに従って、あらかじめ製造者の推薦するプロトコールに従って、このベクタ ーで形質転換したエシェリキア、コリ細菌株ＤＨ５ａＦ’　（ギブコーピーアー ルエル）の培養物から単離される。この１本鎖鋳型上に、変異は“オリゴヌクレ オチド・ブイレフテッド・イン・ビトロ・ムタジェネシス・システム”キット（ アメルシャムー商品番号ＲＰＮ１５２３−バージョン２）のプロトコールに従っ て、ミリポア・バイオサーチ８７００ＤＮＡ合成器で化学合成されたオリゴヌク レオチド、その配列を下記に示す・ ＧＡＴＣＡＴＧＡＡＧ　ＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴ　ＣＴｒＡＴｒＧＣＴＴ　ＧＧを 使用して行った。

直接変異技術の詳細はこのキットに添付の小冊子に述べてあり、下記に要約する と、上記オリゴヌクレオチドを１本鎖形のベクターＭ１３ＢＲ１３７と共にハイ ブリダイズし、ついで、チオヌクレオチドｄＣＴＰ−ａ−Ｓ（α−チオデオキシ シチジン三リす酸）の存在下、クレノーポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ 中で反応し、環状の２本鎖形の形質転換ファージを得ることからなり、そのうち １本の鎖は所望突然変異をしており、エンドヌクレアーゼＮｃｉＩによる開裂お よびエキソヌクレアーゼＩＩＩによる分解から保護されている。（鋳型として働 いている）もう一方の鎖に、ついで、エンドヌクレアーゼＮｃｉＩを用いて割れ 目を挿入し、この鎖はその後エクソヌクレアーゼの次の作用により除去される。

ベクターＭ１３ＢＲ１３ｇと呼ばれる得られたベクターはエシェリキア・コリ株 Ｄｌ］５ａＦ’中ヘクローンされ配列決定される　それは予想通りコドンＧＣＴ からコドンＧＣＡの置換で変異しており、それはコード部分から５ａｃＩ制限部 位が除かれていた。

ｂ）ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入するための大豆β−１，３−グル カナーゼをコードする挿入部コードの５°位の変異誘導。

１本鎖の形であるベクターＭ１３ＢＲ１３８は上記と同様に単離され、ついで、 前に下記： ＧＡＧＡＡＧＧＣＡＴ　ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣ 配列のオリゴヌクレオチドを化学合成するのに使用したのと同じ条件下で直接変 異誘導を行う。

この変異により得られるベクターはＭ１３ＢＲ１３９と呼ばれ、エシェリキア・ コリ細菌株ＤＢ５ａＦ’にクローンされる；配列決定され、ＡＴＧ翻訳開始コド ンの上流にあるＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の導入が確認された。

ｃ　）ＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｃＩ制限部位を導（ためのベクターＭ１３ＢＲ １３９の挿入部の３゛位の変異誘導。

１本鎖の形であるベクターＭ１３ＢＲ１３９は単離され、直接変異誘導は挿入部 の３′位に下記： ＣＡＧＡＧＡＴｍ　ＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧ　ＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴ　ＴＡＣＡＣ ＡＴＣ配列のオリゴヌクレオチドを使用して、すでに述べた条件下で行う。

変異により得られたベクターはベクターＭ１３ＢＲ１４０と呼ばれ、エシェリキ ア・コリ細菌株ＤＨ５ａＦ’にクローンされる。この配列は決定され、ＴＡＡ停 止コドンの下流のＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｃＩ制限部位を創製が確認された。

この配列はＦｉｇ、　３に示す。

ｄ）プラスミドｐＢＲ１４１の構築。

複製可能な形のベクターＭ１３ＢＲ１４０はサムブルーフ中、前掲、に記載され たビルンポイおよびドリーのプロトコールに従って、単離および精製を行う。β −１゜３−グルカナーゼコード部位を含むＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部は制 限酵素ＮｄｅＩおよびＢｉｎｄＩＩＩの消化により単離され、アガロースゲル電 気泳動および電気抽出（サムブロークら、前掲）により精製する。この挿入部は ついで、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｉｎｄＩＩＩ制限酵素で予め開裂された特許 出願番号第ＥＰ−＾−０，３６０，６４１号の構築物および構成の要因であるプ ラスミドｐ３７３．２（本発明のＦｉｇ、　３はこのプラスミドの制限地図を示 す）の大ＮｄｅＩ−）ＴｉｎｄＩＩＩ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲ ーションする。

この大断片は、特に、連続的にＮｄｅＩ末端からＨｉｎｄＩＩＩ末端まで、イソ プロピル−β−Ｄ−ガラクトシドを誘導し得るゴａＣ”プロモーター（サムブル ーフら、前掲）に類似のプロモーター、発現可能な形でβ−ラクタマーゼをコー ドする遺伝子（アンピシリンに対する抵抗性を与える）、エシェリキア・コリ中 の複製起点、およびファージｆｄ由来の転写ターミネータ−を含む。得られたベ クターはプラスミドｐＢＲ１４１と呼ばれ、エシェリキア・コリ株ＲＲＩ中に挿 入される。プラスミドの構造は制限地図の作製により確認される。

ｅ）プラスミドｐＢＲ５９の構築。

プラスミドｐＢＲ１４１を含むクローンのプラスミドＤＮＡはビルンボイムおよ びドリーら（サムブローク中、前掲）のプロトコールに従って、抽出した。

大豆β−１，３−グルカナーゼをもくろむ原核生物の前記列（セクション５参照 ）の除去はＮｄｅＩおよび５ｐｈＩ制限部位の間に含まれる配列の除去および下 記：ＴＡＴＧＡＴｒＧＧＴ　ＧＴＧＴＧＴｒＡＴＧ　ＧＣＡＴＧＡＣＴＡＡ　Ｃ ＣＡＣＡＣＡＣＡＡ　ＴＡＣＣ配列の合成リンカ−でこの配列を置換することに より行い、原核生物の細胞にも（ろまれるシグナルペプチドを欠く蛋白をコード する配列を作り替える。この蛋白の最初のアミノ酸、すなわち、グルタマート残 基（ピログルタミン酸への環状化を可能にし、アミノ末端配列決定を不可能にす る）を翻訳開始コドンであるメチオニン残基に置換する。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションは、プラスミドｐＢＲ５９と呼ばれ るプラスミドを得ることを可能にし、そのプラスミドはエシェリキア・コリ細菌 株眩１にクローンされる。このベクター中では、β−１，３−グルカナーゼは“ ｔａｃ”プロモーター（サムブロークら、前掲）の同族体であるイソプロピルβ −Ｄ−１．３−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を誘導可能なプロモーター（特許 出願番号第ＥＰ−Ａ−０，３６０，６４１号に記載）の制御下にある。プラスミ ドｐＢＲ５９のコード部分の配列はＮｄｅＩおよびＢｉｎｄＩＩＩ部位の側面に あり、Ｆｉｇ、　４に示す。

セクション７：　エシェリキア・コリ中の大豆β−１，３−グルカナーゼの発現 。

発現ベクターｐＢＲ５９を含むエシェリキア・コリ株ＲＲＩおよびプラスミドｐ ３７３．２を含むエシェリキア・コリ株ＲＢ１を、抗生物質アンピシリン１００ ｍｇ／７を含むルリア培地（ギブコ社）で−晩３７℃で培養した。培養を同じ培 地で１／１００に希釈した後、細菌を再び１時間３７℃の培養を行い、ＩＰＴＧ はそれから最終濃度１ｍＭになるように加える。培養はそれから３時間続け、細 菌は遠心により回収する。

細菌を、以下の組成ニ ー　０．１２５Ｍ　トリス−■ＣＩ、ｐＨ５，８−４％　ドデシル硫酸ナトリウ ム 一２０％グリセリン −０，０２％ブロモフェノールブルー −１０％β−メルカプトエタノール である充填緩衝液と呼ばれる緩衝液中に再懸濁し、混合物は、それから（細菌の 溶解および蛋白の変成のため）１０分で１００℃にした。１０ｊ９の可溶化蛋白 はレミリ（ニー・ケー・レミリ、ネーチャー、２２７巻（１９７０年）６８０− ６８５頁）に記載のプロトコールに従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動を行 う。電気泳動後、このゲルはクーマシブルーを用いて染色する。対照株にはない ３個の余分のバンドの存在がβ−１，３−グルカナーゼクローンでは示される。

セクション８：エシェリキア・コリに発現する組換大豆β−１，３−グルカナー ゼの酵素活性の測定、本タンパク質の３形態の単離および精製、およびそれらの アミノ末端の配列の決定 １、組換大豆β−１，３−グルカナーゼの酵素活性の測定β−１，３−グルカナ ーゼの活性は、基質（ラミナリン）から酵素により遊離したモノマーおよびオリ ゴマーの量をこのようにして遊離した糖の還元力を測定して推定することを可能 にする比色法により測定した。この方法は、Ｇ、アッシュウェル、１９５７年、 メリーズ・イン・エンザイモロジ−１１Ｌ　７３〜１０５頁、ｓ、　ｐ、カロウ ックおよびＮ、　Ｕ、カブラン、Ｅｄｓ、　、に記載され、以下に要約する。

ラミナリン５０ｍｇ／ｎｌを含む溶液５０μｍ（ラミナリア・ジギタタから抽出 したβ−１，３−グルカン−シグマ社製−商品番号Ｌ９７３４）を直線応答範囲 内にあるように選択された濃度のβ−１，３−グルカナーゼを含む溶液に加える 。反応混合物の容量を０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ５，Ｑを使用して ５００μｍにする。１時間４０℃でインキュベージジン後、２００μｍ部をソモ ギー試薬（２，５％Ｎａｇ　ＣＯ２，２，５％ＫａＣａＨ＜Ｏｓ’　４ＨｚＯ１ ２％ＮａＨＣ○３．２０％Ｎａ、ＳＯ２および１５％ＣｕＳＯ４”５Ｈ！Ｏを含 む水溶液１ｍ１（７）混合物）２００μｍに加え、ついで４５分間１００℃にす る。ネルラン試薬（５，５％モリブデン酸アンモニウム、４．６％濃硫酸および １２％Ｎａ５ｓｏ、・７Ｈ１０の水溶液）２００μｍを加える前に氷中管を冷却 する。

混合物の容量を蒸留水で希釈して５ｍｌにし、その吸光度を波長５００ｎｍで分 光光度計により測定する。

遊離した還元糖の量は、グルコース溶液を使用して確立した検量線から得た吸光 値と比較して推定される。β−１，３−グルカナーゼ酵素活性は、上記の酵素試 験条件下遊離グルコース当量のナノモル７分で表す。

２、組換β−１，３−グルカナーゼの３種の形態の単離および精製ａ）方法 組換型タンパク質の種々の形態を、セクション７（第１段落の終わり）で得られ た遠心分離物から単離および精製した。単離および精製は、以下のプロトコール に従って、抽出段階、硫酸アンモニウム沈澱、合成ポリマーを基質とするカチオ ン交換カラムでのＦＰＬＣ液体クロマトグラフィーおよび架橋結合アガロースで の排除クロマトグラフィーを含む： 工程１ 細菌小球を４℃で撹拌しつつｐＨ８緩衝液（３０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ） で処理する。遠心分離後（１５０００ｇ、３０分）、集めた上清（溶解産物）は 、粗抽出物を構成する。

工程２ タンパク質抽出物を硫酸アンモニウム（６０％飽和溶液）で沈澱させる。沈澱し たタンパク質を遠心分離（１５０００ｇ、３０分間）で集め、緩衝溶液（１０ｍ Ｍ０ｍＭ酢酸アンモラム５．２）中可溶化し、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝 液、ｐＨ５，２で一夜４℃で透析する。

操作直前に、タンパク質抽出物の緩衝液の濃度を既製のミ二カラム（ファルマシ アＰＤ−１０）を通してｌＱｍＭにする。

工程３ タンパク質抽出物をついでファルマシアＦＰＬＣ法に従って、合成ポリマー（フ ァルマシア社製モノーＳカラム）を基質とするイオン交換クロマトグラフィーに より精製する。

抽出物を１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，２）で平衡化したモノ−Ｓ カラムに入れる。カラムに残存したタンパク質を１０〜５００ｍＭの酢酸アンモ ニウム直線勾配で溶出する。

工程４ β−１，３−グルカナーゼ活性を含む画分をセントリコン１０濃縮カートリツジ （アミコン社）上で限外濾過して濃縮する。タンパク質の精製を架橋結合アガロ ース上でクロマトグラフィーにより続ける。溶出を５００ｍＭ酢酸アンモニウム 緩衝液（ｐＨ５，２）で行う。

各工程で、組換β−１，３−グルカナーゼの種々の形態を、それらの分子量（Ｓ ＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動−銀を用いて視覚化）、上記の比 色法により測定されたそれらの活性およびセクション１で製造されたタバコβ− １，３−グルカナーゼに対するポリクローナル抗体とのそれらの陽性反応により 同定する。

ｂ）　結果 見掛は分子量３６±３．３７±３、および３９±３ｋＤａであるβ−１，３−グ ルカナーゼ活性を所有する組換タンパク質の３種の形態を分離および精製する（ コード化配列から推定されるタンパク質の分子量は３７３８７Ｄａである）。

それら各々測定された特異的活性は、遊離グルコース当量１．６５．１．７５お よび１．７６ｎＭ／分／タンパク質ｍｇであり、値は顕著に異ならない。

３、組換β−１，３−グルカナーゼの３種の形態のアミノ末端の配列の決定組換 β−１，３−グルカナーゼの３種の形態のアミノ末端の配列決定を行った。

処理した試料をＰＶＤＦ　（ポリビニリデンジフルオリド）フィルターの表面に 置き、各分解サイクル後、生成したフェニルチオヒダントイン誘導体を連続して 分析するクロマトグラフ（アプライドバイオシステム４３０型）を装備するタン パク質ンークエンサー（アプライドバイオシステム（ニーニスニー）社製４７０ Ａ型）に入れる。

決定された各アミノ末端配列を以下に示し、略語Ｘは決定されなかったアミノ酸 を示す： Ｍｅｔ　Ｉ　ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｘ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　ＬｅｕＭｅ ｔ　Ｉ　ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｘ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ 　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｍｅｔ　Ｉ　ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｘ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

それらの配列は、プラスミドｐＢＲ５９のコード化部分から推定される配列に対 応する（Ｆｉｇ、４参照）。従って、アミノ末端部分の翻訳後の成熟はない。類 似の特異的活性の分子量における観察された相違は、おそらく約２７種のアミノ 酸上で生じるカルボキシ末端の翻訳後の成熟の結果である。

セクション９：植物細胞における発現ベクターの構築二二元性ベクターｐＢＲ６ ａ）　大豆β−１，３−グルカナーゼの完全組換遺伝子の製造および二元性ベク ターｐＢＩＮ１９へのクローニング コード化配列担持するＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよび５ａｃｌを使用して ベクターＭ１３ＢＲ１４０の切断により得、低融解温度アガロースゲル上で電気 泳動により精製する。このＤＮＡを、カリフラワーモザイクウィルス（３５ＳＣ ａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを含むプロモーター配列とアグロバクテリウム・ ツメファシェンスのツバリンシンターゼターミネータ−を含むターミネータ−配 列の間に挿入した。

ｂ）　カリフラワーモザイクウィルスの３５５プロモーターを含むプロモーター 配列の製造 ３５Ｓプロモーターを含む約９００−ｂｐのＨｉｎ＋ＨＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を 、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いての切断、ついで アガロースゲル電気泳動によりプラスミドｐＢ１１２１（クローチック）から単 離する。この断片をＨｉｎｄＩＩで再び切断する。ＢａｍＨＩ部位を担持する約 ４１０−ｂｐの断片をＨｉｎｄＩＩＩリンカ−の存在下Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処 理する（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む合成配列）。エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ 　Ｉ　Ｉで切断およびアガロースゲル電気泳動後、生じたＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｂ ａｍＨＩ断片（約４２０−ｂｐ）を単離し、精製する。

Ｃ）　アグロバクテリウム・ツメファシェンスのツバリンシンターゼ（ＮＯ８） ターミネータ−を含むターミネータ−配列の製造ツバリンシンターゼターミネー タ−を含む約２５０−ｂｐの断片を、制限酵素Ｓａｃ　ＩおよびＥｃｏＲＩを用 いる切断、ついでアガロースゲル電気泳動によりプラスミドｐＢ１１２１から単 離した。

プロモーター配列、β−１，３−グルカナーゼの相補性ＤＮＡのコード化配列お よびターミネータ−配列を、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄエエエおよびＥｃｏＲ Ｉを用いて開裂した二元性ベクターｐＢＩＮ１９中にＴ４リガーゼを用いて連結 した。

このベクターはカナマイシンに耐性の２種の遺伝子を担持し、一方は、細菌中発 現可能であり、もう一方は、完全組換遺伝子（ビーパン、１９８４年、ニューク レイツク・アッシズ・リサーチ、第１２巻、８７１１〜８７２１頁）のすぐ上流 に局在し、植物細胞に移入が可能である。カナマイシン耐性遺伝子は形質転換工 程および形質転換された植物の後代の分析の間選択マーカーとして働く。

得られたベクターはプラスミドｐＢＲ６０と称する。配列決定により実証される 完全組換遺伝子のヌクレオチド配列は、推定されるペプチド配列とともにＦ　ｉ ｇ。

５に掲げる。プラスミドをエシェリキア・コリ株ＭＣ１０６１（クローンチック ）中ヘクローン化する。

セクション１０：β−１，３−グルカナーゼの組換遺伝子を含むプラスミドｐＢ Ｒ６０のアガロバクテリウム・ツメファシスへの移入ａ）　アガロバクテリウム ・ツメファシスへの移入この移入は、可動化プラスミドｐＲＫ２０１３を含むエ シェリキア・コリ株ＨＢ１０１を使用して、プラスミドｐＢＲ６０を含むエシェ リキア・コリ株ＭＣｌ０６１とアガロバクテリウム・ツメファシェンス株ＬＢＡ ４４０４　（クローンチック）間の３結合により下記のように行う（Ｄ、　Ｍ、 フィブルスキー等、１９７９年、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンス・ニーニスニー、７６巻、１６４８〜１６５２頁）。

プラスミドｐＢＲ６０を含むエシェリキア・コリ株ＭＣ１０６１および可動プラ スミドｐＲＫ２０１３を含むエシェリキア・コリ株ＨＢ１０１（クローンチック ）をカナマイシン２５ｍｇ／］の存在下ルリア培地（ギブコ社製）で３７℃で培 養する。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス株ＬＢＡ４４０４を、リファンピシン（ 抗生物質に耐性である）１００ｍｇ／Ｉの存在下ルチア培地で２８℃で培養する １３種培養の各々２００μｍを混合し、ルチア寒天培地（ギブコ社製）上にブレ ートし、−夜２８℃でインキュベートする。細菌をついでルリア培地５ｍｌに再 懸濁し、一部をリファンピシン１００ｍｇ／Ｉおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌ の存在下寒天最小培地（「プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル 」、ゲルビン等、クルーエル・アカデミツク・プレス、１９８８年に記載された ）を含むペトリ皿にプレートする。それらの条件下、プラスミドｐＢＲ６０を組 み込んだアグロバクテリウム・ツメファシェンコロニーだけが成育する（エシェ リキア・コリがそれらの条件下で成育できない。）これらのコロニーは、その複 製できる環境においてβ−１，３−グルカナーゼの組換遺伝子を含む。

両方の抗生物質に対する選ばれたコロニーの耐性を、連続して２回同じ選択培地 でそれらを移植することにより実証した。アガロバクテリウム・ツメファシェン ス中のβ−１，３−グルカナーゼの組換遺伝子の存在を総ＤＮＡ製造におけるサ ザンプロット法により確証した。（上記で引用された研究でガルビンにより記載 されたプロトコールに従って、細胞溶解、フェノール／クロロホルム混合物を使 用しての抽出、当技術の熟練者に周知の技術に従う制限酵素を使用して精製ＤＮ Ａの切断による精製、アガロースゲル電気泳動、膜への移送、およびハイブリダ イゼーション）。

ｂ）　アガロバクテリウム・リゾジェネスへの移入この移入はａ）に記載のアガ ロバクテリウム・ツメファシェンスへの移入と同様に、ゲルッヒ等、（１９８７ 年）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス、第２０６巻、３ ８２頁、アガロバクテリウム・リゾゲネス株で行う。

セクション１１：形質転換されたタバコ植物の獲得インビトロで培養したニコチ アナ・タバクムタバコを、以下に記載の主な工程であるホルシュ等、当技術の熟 練者に周知の製造法に従ってプラスミドｐＢＲ６０を含むアグロバクテリウム・ リゾジェネスで感染させる。

Ｎ　タバクムタバコ植物のディスク（ライスコンシン・ハバナ３８変種、病原菌 性真菌感受性）をプラスミドｐＢＲ６０を含むＡ、リゾジェネスの培養中でイン キュベートする。ワットマン紙で除水したディスクをペトリ皿中培養培地へ移植 し、形質転換された細胞を繁殖させ、カルスを得、ついでアガロバクテリム・リ ゾジェネスの除去するようにしたセホタキンム（５００μｇ／ｍＩ）、およびカ ナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）の存在中発芽させた。

カナマイシン耐性の芽は、ついでセホタキシムの存在生根の誘発が可能な培地へ 移植した。幼植物を泥炭および堆肥で組成された基質のポットへ移植し、ついで 温室中で成長させておく。温室で再生および順化の工程で生存する形質転換させ た植物すべて（Ｒ０世代）は、形態的に正常、および受精可能であることを示す 。それらは、自家受精植物であり、種を形成する（Ｒ１世代）。

セクション１２＋サザンプロツト法による形質転換されたタバコ植物（Ｒ０世代 ）のゲノムＤＮＡ分析 高分子量のゲノムＤＮＡを、既に引用された研究「プラント・モレキュラー・バ イオロジー・マニュアル」に記載のセチルトリメチルアンモニウムプロミドを使 用する抽出および沈澱による精製方法に従って、Ｒ０世代の遺伝子導入植物の成 熟葉から単離する。

このゲノムＤＮＡ１０ｕｇを、制限酵素Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ　 ２０単位で一夜３７℃で分解した。得られた制限断片をアガロースゲル（１％） で電気泳動により分離した。ＤＮＡを、ナイロンフィルター上すザンプロット法 により移植し、組換遺伝子の配列の部分を含むヌクレオチドプローブでハイブリ ダイズし、ペルオキシダーゼ（ＥＣＬキット、アマジャム社製）にカップリング して標識化する。

ついで、アメルシャムの推薦するプロトコルにより洗浄し、可視化する。

フィルムの分析により、以下のことが推定できるニー　いくつかの植物は移植さ れた組換遺伝子の複写を有しない（シグナル不在）、−試験された植物の大部分 は、構築の再配列なしに少なくとも１つの複写を含む　３５Ｓ　ＣａＭＶプロモ ーター　−β−１，３−グルカナーゼの相補性ＤＮＡのコード化配列　−ＮＯＳ ターミネータ−１−いくつかのプロフィルは、構築中内部の再配列であるが、こ れらの現象はまれである。

セクション１３　形質転換されたタバコ植物（２０世代）での大豆β−１，３− グルカナーゼの発現の証明 ａ）形質転換されたタバコ植物（Ｒ０世代）の粗タンパク質の製造粗タンパク質 抽出物を様々な植物組織（根、茎、葉など）から製造した。この組織断片を液体 窒素で凍結し、粉末にし、−２０℃で保管する。粉末を０．１Ｍ酢酸アンモニウ ム緩衝液ｐＨ５，２の存在下４℃で抽出し、１００００ｇで遠心分離する。総タ ンパク質濃度を、ブラッド法（ブラッド、Ｍ、Ｍ、　、１９７６年、アナリティ カル・オブ・バイオケミストリー、７２巻、２４８〜２５４頁）により、上清（ 以後、粗タンパク質抽出物と称する）について測定した。

ｂ）イムノブロッティングによる証明（ウェスタンプロット）種々の形質転換さ れた植物および形質転換されていない（対照）粗タンパク質抽出物に、当技術の 熟練者に周知の技術、および詳細には、以下の工程を含むトービン等、プローデ ィンゲス・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスニー、７６ 巻、１９７２年、４３５０〜４３５４頁に記載のウェスタンプロット法を行うニ ー　充填緩衝液と称する、０．１２５Ｍ１−リス−ＨＣＬ　ｐＨ６，８，４％Ｓ ＤＳ。

０．００２％ブロモフェニルブルー、２０％グリセリン、１０％β−メルカプト エタノールを含む緩衝液中１０分間１００℃への加熱による変性（ラエミリ、ネ ーチャー、２２７巻、１９７０年、６８０〜６８５頁に記載のプロトコールに従 って）。

−ラエミリ（上記、参照）により記載されたプロトコールによる可溶化物中に含 まれる種々のタンパク質の電気泳動による分離；−ＰＮＤＦ膜上へのゲル中に含 まれる上記のタンパク質の電気移動（Ｈ，！−−ビン等、ブロン−ディゲス・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンイズ・ニーニスニー、７６巻、１９７ ９年、４３５０〜４３５４頁）：免疫検定を以下の工程を含むプロトコールに従 って行うニー　タンパク質が３％ゼラチン溶液中３７℃２時間を越えないインキ ュベーションにより移されたＰＶＤＦ膜の飽和、 −０，０５％ツイーン２０洗浄剤を含むリン酸緩衝化食塩水での３回の洗浄、− 　リン酸緩衝化食塩水で１／１００００に希釈した上記で製造の免疫血清（組換 タンパク質を認識するポリクローナル抗体を含む）の存在下のインキュベーショ ン（１時間３７℃）、 −０，０５％トウイーン２０洗浄剤を含むリン酸緩衝化食塩水での３回の洗浄。

ついで、抗原−抗体複合体をアメルシャム社製キ・ソトＲＰＮ２３（ｒプロ１． ティング検知キット」）をその使用説明書に従ってアルカリホスファターゼ結合 ストレブタビジン／ビオチン系を使用して視覚化する。

得られたプロットは、対照植物に存在しない形質転換された植物の約３７±３ｋ Ｄａのタンパク質の存在を示す。（ｃＤＮＡ配列に由来する蛋白質は、この蛋白 質から真核性細胞中発現のための推定されるシグナルペプチドは切断されており 、３８１５６Ｄａの分子量を有する。）ウェスタンプロット法の記載の分析を３ ０種の形質転換された植物（二対して行った。２８種の植物は、ウェスタンプロ ットにおいて組換β−１，３−グルカナーゼの発現を示した。

Ｃ）　大豆β−１，３−グルカナーゼの電気泳動移動の比較（組換タンプくり質 および天然タンパク質） 形質転換されたタバコ植物中発現された組換タンパク質の見掛は分子量を、ラエ ミリ　（ＵＫ、ラエミリ、ネーチャー、２２７巻、１９７０年、６８０〜６８５ 頁）により開示されたプロトコールに従って平行路における電気泳動移動（こよ り大豆細胞（セクション１、参照）およびタノくコ細胞中の抽出物に存在する天 然タバコβ−１，３−グルカナーゼ（セクション１、参照）の抽出物中存在する 天然タンパク質のそれと比較した。これらのタンプくり質の大きさを、周知の分 子量のタンパク質のそれらと比較した（バイオ−ラッド１４０００〜９７４００ Ｄａの分子量マーカー　−参照番号６ｌ−０３０４）。

ウェスタンプロット後に得られたプロットは、タバコ中合成された大豆β−１゜ ３−グルカナーゼが天然大豆タンパク質のそれ（３７±３ｋＤａ）と同じ見掛は 分子量を有するということを示す。このタンパク質の翻訳後の成熟は、従って大 豆の他の植物で同様の方法で行われる。大豆β−１，３−グルカナーゼの見掛け の分子量は、分子量が３４９６９Ｄａであるタバコβ−１，３−グルカナーゼの それより約３ｋＤａ高い（Ｈ，タンプ等、１９８８年、プロシーディンゲス・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ・ニーニスニー、８５巻、５５４ １〜５５４５頁）。大豆β−１，３−グルカナーゼの分子量は、従って約３８ｋ Ｄａの範囲にあり、セクション５に記載の３３８個のアミノ酸の成熟タンパク質 のセクション５に記載の分子量、３８１５６Ｄａに非常に近い。

セクション１４：病原性真菌に対する形質転換されたタバコ植物（Ｒ１世代）の 耐性の測定 カナマイシンの存在下再生されたタバコ植物を自家受粉した。成熟種（Ｒ１世代 ）をカナマイシン１００μｇ／ｍｌで補足したムラシゲおよびスコッグ培地にま く。

１３種の選択された形質転換植物、およびＷ３８と略号される病原性真菌チャラ ラ・エレガンス（別名チェラビオブシス・バシコラ）感受性のニコチアナ・タバ クム変異株つイスコンシンハバナ３８植物起源のＲ１世代のカナマイシン耐性幼 植物をこの真菌に対するそれらの耐性を評価するために温室に移動する。後者は 、それらの壁にβ−１，３−グルカンを有するタバコの病原性真菌の典型である ため選ばれる。検討は、形質転換された植物の後代により変わるが１６〜２５の 間を変化する幼植物の数を含む。この検討で選択されたプロトコールを以下に記 載する： 幼植物をポット（３ｘ３ｃｍ）で培養する。５番目の葉が発現したとき、植物を 首の部分にこの真菌の５Ｘ１０’内生分生胞子の懸濁物をつけることにより植物 に接種する。

内生分生胞子を２２℃および暗室でポテトデキントロース寒天培地（ディフコ社 製）で維持されたこの真菌の菌糸培養から取る。チャララ・エレガンスに対する 耐性を接種４５日後評価する。

植物を感染の徴候および植物成長性発展の程度により記録する。

２種の記録を以下のように行う・ −植物の地上部分の重量（ｇ）の測定 −植物全体からみて疾病の影響を考慮した耐性指数の測定等級を以下の分類基準 により定義する：０点：植物が枯れる。

１点：頂芽は緑のままであり、根系はだめになっている。

２点：植物の成長は、対照の成長の２５％どまりであり、根系は完全に壊死性炎 になっている。

３点：植物の成長は、対照の５０％に達し、根系には健康な部分を示す。

４点：植物の成長は、対照と同様である。

形質転換された植物の後代の耐性指数は、この植物に由来した幼植物に割り当て られた点数の平均値を示す。

以下の表は、得られた主な結果を示す：第１表 形質転換されたタバコ植物の後代における病原性真菌に対する耐性の測定Ｗ３８ ：形質転換されていないニコチアナ・タバクム変異株つイスコンシンハバナ３８ 植物 形質転換されたタバコ植物の後代の１２／１３は、耐性値および形質転換されて いないの後代のＷ３８植物のそれより高い地上部分の重量を有する。

したがって、本発明の組換ＤＮＡを有するタバコ植物の形質転換は、それらの後 代に病原性真菌への耐性を増強する。

セクション１５：形質転換されたタバコ植物（Ｒ１世代）から組換β−１，３− グルカナーゼの精製およびアミノ末端配列の決定１）組換β−１，３−グルカナ ーゼの精製組換タンパク質を、下記のプロトコールに従って、硫酸アンモニウム 沈澱および架橋結合されたアガロース上合成ポリマーを基礎とするカチオン交換 カラムによるＦＰＬＣ液体クロマトグラフィーにより、形質転換されたタバコ葉 タンパク質の粗抽出物から精製する。

組換β−１，３−グルカナーゼの精製のプロトコール工程１：タンパク質抽出物 を硫酸アンモニウム（６０％飽和溶液）で沈澱させる。

沈澱したタンパク質を遠心分離（１５０００ｇ、３０分間）で回収し、緩衝溶液 （１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，２）で可溶化し、１００ｍＭ酢酸アン モニウム緩衝溶液（ｐＨ５，２）に対して一夜４℃で透析する。

操作直前に、タンパク質抽出物の緩衝液濃度を既製のミ二カラム（ファルマシ７ ＰＤ−１０）を通してｌｏｍＭにする。

工程２：ついで、タンパク質抽出物をＦＰＬＣ法（ファルマシア）を使用して合 成ポリマー（ファルマシア　モノ−８カラム）を基礎とするイオン交換クロマト グラフィーにより精製する。

抽出物を１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５，２で平衡化したモノ−Ｓカ ラムに適用する。カラムに残ったタンパク質を１０〜５０ｍＭ酢酸アンモニウム 直線勾配で溶出する。

各工程で、大豆β−１，３−グルカナーゼは、その分子量（（ＳＤＳの存在下ポ リアクリルアミドゲル電気泳動　−銀を用いての視覚化）およびそのイムノプロ ット（セクション１３ｂ参照）およびセクション８１に記載の比色法により測定 されたその活性）により同定される。

２）　組換β−１，３−グルカナーゼのアミノ末端配列の決定上記のプロトコー ルに従って組換β−１，３−グルカナーゼの精製後、アミノ末端の配列決定が行 われた。ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、処理されたサンプル は、Ｈ，Ｉ−−ビン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシイズ・ニーニスニー、（１９７９年）　、４３５０〜４３５４頁に記載 の方法に従って電気移動によりＰＶＤＦフィルター（ポリビニルイデンジフルオ リド）の表面に移す。各々分解サイクル後、生成したフェニルチオヒダントイン 誘導体を継続的に分析するクロマトグラフ（アブライドバイオシステムズ社製４ ３０型）を備えるタンパク質シークエンサー（アブライドバイオシステムズ（ニ ーニスニー）社製４７０Ａ型）へ入れる。

シークエンサーの正確な操作にもかかわらず、対照タンパク質：ラクトグロビン のアミノ末端配列の決定により照合されたアミノ末端の配列を決定することは不 可能であった。

従って、おそらく組換β−１，３−グルカナーゼのアミノ末端配列は、双子葉植 物の既に決定されたアミノ末端配列との比較により予想されるようにＧｌｎで始 まる（セクション５、参照）ようである。

アミノ末端Ｇｉｎはもう１つの大豆β−１，３−グルカナーゼで不活されること が既に実際に示されている（タケウチ等、１９９０年、プラント・フィジオロジ ー、９３巻、６７３〜６８２頁）。

セクション１６：形質転換されたナタネ植物の製造形質転換をＰ、ケルヒラ等の プロトコールに従って行う（Ｐ、ゲルヒラ等、１９８７年、モレキュラー・アン ド・ジェネラル・ジェネティックス、２０６巻、３８２頁）。種々の培養培地は 、ベレッテール等により記載されたものである（ペレッテール等、１９８３年、 モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテックス、１９１巻、２４４頁）。

それらの組成物を以下詳細に記載する（第２表）。

ａ）　形質転換された根の製造 茎断片を高さ約１ｍのナタネ植物の葉先から取り除（（ブラシカ・ナブス：夏品 種パードルおよびウェスターおよび各品種）。これらの断片の表面を無菌化し、 滅菌水ですすぎ、長さ約１．５　ｃｍの断片に切り、培地Ａを含む管に入れる。

この断片の先への接種は、プラスミドｐＢＲ６０を含むアガロバクテリウム・リ ゾゲネスのｌｌＩ！物の適用により行う。

形質転換された根は、１〜２週間後に茎断片に現れる。それらを除去し、セフォ タキシム５００μｇ／ｍ＋を補足した寒天培地Ｂ　（１５ｇ／ｌ）に置く。

ｂ）　形質転換された植物の再生 根断片を２．４−ジクロロフェノキン酢酸３ｍｇ／ｌを含む培地りで１５日間接 種し、ついで芽を誘発するためにＲＣＣ培地に置く。ついで、挿し木植物を培地 ＦおよびＧに芽の培養により得る。

セクション１７．形質転換されたナタネ植物における大豆β−１，３−グルカナ ーゼの発現の証明 ａ）　形質転換されたナタネ植物（ＲＯ世代）の粗タンパク質抽出物の製造粗タ ンパク質抽出物を植物の葉から製造する。それらの抽出物を液体窒素で凍結し、 粉末にし、−２０℃で保管する。粉末を０．４Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ ５，２存在下４℃で抽出し、１００００ｇで遠心分離にかける。総タンパク質濃 度を上溝（以後粗タンパク質抽出物と称する）につきブラッドフォード法（ブラ ッドフォード法、Ｍ、Ｍ、　、１９７６年、アナリティカル・オブ・バイオケミ ストリー、７２巻、２４８〜２５４頁）により決定した。

ｂ）　イムノブロッティングによる証明（ウェスタンプロット）種々の形質転換 された植物および形質転換されていない植物（対照）の粗タンパク質抽出物に、 上記の当技術の熟練者に周知の方法であるウェスタンプロット法を行う。

ついで、抗体−抗原複合体を、使用説明書に従って使用されるアメルシャム社製 キットＲＰＮ２３　（プロッティング検知キット）を用いてアルカリホスファタ ーゼ結合ストレブタビジン／ビオチン機構を使用して視覚化する。

得られたプロットは、対照植物にはない形質転換された植物の約３７±３ｋＤａ のタンパク質の存在を示す。

ウェスタンプロット法による分析は、３０種の形質転換された植物に対して行わ れた（サザンプロット法に陽性反応を示す）。３８種の植物は、ウェスタンプロ ット法で組換β−１，３−グルカナーゼの発現を示す。

ｔｅ　め　ｇｅｍ　し　−−ばｆ ｔｅｌ　Ｃ：　Ｃ＞　ｒ＝　ｎ、　−６１国際調査報告 ”−”−”Ａｍ−”−−Ｐ（７／ＦＲ９２１００２６８―、−−＾−−−１昧　 ＰＣＴ／ＦＲ９２１００２６８フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ ９／２４　９１６１−４Ｂ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　ルゲ、ジャン−ジャックフランス３１３２０、オーズヴイル・ トローザン、アレ・デ・フィアクル　３番 Ｉ （７２）発明者　グリシン、ルネ フランス３１７５０ニスカルケン、リュ・ド・ノールーズ　１３番 （７２）発明者　トパン、アラン フランス３１７００、コルヌバリュー、リュ・ド・クラビネ　２番

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．下記配列（ａ１）： 【配列があります】 または配列（ａ１）と高度の相同性を有する配列を含む、β−１，３−グルカナ ーゼ活性を有する蛋白質またはその前駆体をコードすることを特徴とする、組換 えＤＮＡ。
2. ２．アミノ酸配列（ａ１）をコードするヌクレオチド配列の下流に隣接して、下 記アミノ酸配列（ａ４）： 【配列があります】 をコードするヌクレオチド配列を、そのカルボキシ末端部分が０〜２７個のアミ ノ酸により切頭形にされた形で含むことを特徴とする、請求項１記載の組換えＤ ＮＡ。
3. ３．アミノ酸配列（ａ１）をコードするヌクレオチド配列の上流に隣接して、Ｇ ｌｎに対応するコドンを含むことを特徴とする、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
4. ４．下記配列（ａ５）： 【配列があります】 を含む、β−１，３−グルカナーゼ活性を有する蛋白質またはこの蛋白質の前駆 体をコードすることを特徴とする、請求項３記載の組換えＤＮＡ。
5. ５．アミノ酸配列（ａ１）をコードするヌクレオチド配列に先行するＧｌｎに対 応するコドンの上流に、シグナル配列を含むことを特徴とする、請求項３および ４のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ。
6. ６．シグナル配列が、下記配列（ａ２）：【配列があります】 のシグナルペプチドをコードする配列であることを特徴とする、請求項５記載の 組換えＤＮＡ。
7. ７．アミノ酸配列（ａ１）をコードするヌクレオチド配列が、下記配列（Ｎａ１ ）：【配列があります】 であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ。
8. ８．アミノ酸配列（ａ２）をコードするヌクレオチド配列が、下記配列（Ｎａ２ ）：【配列があります】 であることを特徴とする、請求項６記載の組換えＤＮＡ。
9. ９．アミノ酸配列（ａ４）をコードするヌクレオチド配列が、下記配列（Ｎａ４ ）：【配列があります】 であることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ。
10. １０．複製および発現に必要とされる手段を伴う請求項１〜２のいずれか１項記 載の組換えＤＮＡを含むことを特徴とする細菌。
11. １１．発現に必要とされる手段を伴う請求項１〜９のいずれか１項記載の組換え ＤＮＡにより形質転換されることを特徴とする植物細胞。
12. １２．ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ヘリアン ツス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｓ）およびブラッシカ・ナプス （Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）種のうちの一つに属することを特徴とする、請 求項１１記載の植物細胞。
13. １３．発現に必要とされる手段を伴う請求項１〜９のいずれか１項記載の組換え ＤＮＡを含むことを特徴とする、植物または植物の一部。
14. １４．ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ヘリアン ツス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）およびブラッシカ・ナプ ス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）種のうちのーつに属することを特徴とする、 請求項１３記載の植物または植物の一部。
15. １５．完全な新規植物を形成し得るかまたは種子を生産し得ることを特徴とする 、請求項１３および１４のいずれか１項記載の植物の一部。
16. １６．種子であることを特徴とする、請求項１５記載の植物の一部。
17. １７．配列（ａ１）を含むことを特徴とする、β−１，３−グルカナーゼ活性を 有する蛋白質。
18. １８．配列（ａ１）の下流に隣接して、カルボキシ末端部分が０〜２７個のアミ ノ酸により切頭形にされたアミノ酸配列（ａ４）を含むことを特徴とする、請求 項１７記載の蛋白質。
19. １９．配列（ａ５）を含むことを特徴とする、β−１，３−グルカナーゼ活性を 有する蛋白質。
20. ２０．３６±３ｋＤａの見かけ上の分子質量を有することを特徴とする、請求項 １７〜１９のいずれか１項記載の蛋白質。
21. ２１．３７±３ｋＤａの見かけ上の分子質量を有することを特徴とする、請求項 １７〜１９のいずれか１項記載の蛋白質。
22. ２２．３９±３ｋＤａの見かけ上の分子質量を有することを特徴とする、請求項 １７〜１９のいずれか１項記載の蛋白質。
23. ２３．発現に必要とされる手段を伴う請求項１〜９のいずれか１項記載の組換え ＤＮＡを含む細菌、植物細胞、植物カルス、植物または植物の一部の培養、その 溶解およびこの蛋白質の分離および精製を含むことを特徴とする、請求項１７〜 ２２のいずれか１項記載の蛋白質の製造方法。