JP3512217B2 - エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、新規なエンド型キシロ
グルカン転移酵素遺伝子に関する。 【０００２】 【従来の技術】キシログルカン（以下ＸＧと略す）は植
物細胞壁の主要成分であり、植物細胞壁中ではセルロー
スミクロフィブリルの表面に結合してセルロースミクロ
フィブリルを架橋し、複雑な網目構造を形成している。
細胞壁の構築と再構築には、ＸＧの架橋の分解と再構築
が必要であると考えられているが、その機構は明らかに
されていない。アルバーシャイム (Albersheim) はＸＧ
の再構築の機構についてエンド型のトランスグリコシラ
ーゼが作用するという仮説を示した〔プラント バイオ
ケミストリー (Plant Biochemistry) 、１９７６年 ア
カデミックプレス (Academic Press) 発行、第２２５〜
２７４頁〕。また、本発明者らも、先にマメ科植物であ
るビグナ アンギュラリス (Vignaangularis)種子の芽
生えの上胚軸アポプラスト部分（植物体のうち、細胞の
原形質膜の外側のすべて、すなわち細胞壁と細胞間隙と
から成る部分）より得た抽出液について検討し、２０％
飽和から８０％飽和硫安沈殿画分に、ＸＧ分子の分子量
を不均化する作用を見出した〔ニシタニ (Nishitani)
ら、フィジオロジア プランタルム (Physiologia Plan
tarum)、第８２巻、第４９０〜４９７頁（１９９
１）〕。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＸＧ
の再構築、分子量の不均化等に関与する酵素であるエン
ド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子を提供することに
ある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子に関
し、Escherichia coli JM １ O ９ /pCX １ O １ (FERM P −１
３７６８ ) に保持されているプラスミドである pCX １０
１を制限酵素 EcoRI 及びＨ indIII により切断して得られ
る、図１に示す制限酵素地図で表される約１．２ _kbp_
のＤＮＡ断片、 Escherichia coli JM １ O ９ /pRX １ O ２
(FERM BP −４２２１ ) に保持されているプラスミドで
ある pRX １０２を制限酵素 EcoRI 及びＨ indIII により切断
して得られる、図２に示す制限酵素地図で表される約
１．１ _kbp_ のＤＮＡ断片、並びに Escherichia coli J
M １ O ９ /pNX １ O １ (FERM P −１３８０３ ) に保持されて
いるプラスミドである pNX １０１を制限酵素 SacI 及び Xba
I により切断して得られる、図３に示す制限酵素地図で
表される約１．２ _kbp_ のＤＮＡ断片から選択されるＤ
ＮＡに含まれることを特徴とする。 【０００５】本発明者らは、ビグナ アンギュラリスよ
り、ＸＧの再構築、分子量の不均化等に関与する酵素を
単離精製することに成功した。次に該酵素が、ＸＧ分子
を切断し、生じたＸＧ分子断片を他のＸＧに再結合する
という新規で植物生理学的に重要な作用を有しており、
該酵素がＸＧの転移方法に使用できることを見出し、該
作用を有する酵素をエンド型ＸＧ転移酵素と命名した。 【０００６】更に本発明者らは、ビグナ アンギュラリ
ス由来のエンド型ＸＧ転移酵素のアミノ酸分析を行い、
部分アミノ酸配列を決定し、次に、そのアミノ酸配列よ
りＰＣＲ用のプライマーを調製し、ビグナ アンギュラ
リスｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エンド型ＸＧ
転移酵素をコードする遺伝子を増幅しプローブを作製し
た。続いて、該プローブを用いてビグナ アンギュラリ
スのｃＤＮＡライブラリー中よりエンド型ＸＧ転移酵素
をコードする遺伝子を含有するクローン体を検索し、エ
ンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子を単離し、次い
で、該遺伝子をプローブとして用いて種々の植物より目
的の遺伝子をクローニングした。また、クローニングし
た遺伝子をプローブとして用いて、更に別の植物より目
的の遺伝子をクローニングできることを見出し、本発明
を完成した。 【０００７】該遺伝子を導入して形質転換した生物又は
細胞を培養し、該培養物からエンド型ＸＧ転移酵素を採
取することができる。更に、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子のアンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡを
細胞内に導入することにより、若しくは、エンド型ＸＧ
転移酵素遺伝子より得られる少なくとも１５塩基対から
なるＤＮＡ配列を、転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するように、細胞内で
作用しうるプロモーターに連結したことを特徴とするア
ンチセンスＲＮＡ生成用カセットを細胞内に導入するこ
とにより、生物体内でのエンド型ＸＧ転移酵素の発現を
制御することができ、これらの方法によって植物体の形
態を制御することができ、これらを導入した植物体を創
製できる。また、エンド型ＸＧ転移酵素が発現されるよ
うにエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を細胞内で作用しうる
プロモーターに連結したことを特徴とするエンド型ＸＧ
転移酵素発現用カセットを生物体に導入することによっ
て、生物体内でエンド型ＸＧ転移酵素を発現させること
ができ、該方法によって植物の形態を制御でき、該発現
用カセットを導入した植物体を創製することができる。 【０００８】以下、ビグナ アンギュラリスからのエン
ド型ＸＧ転移酵素の取得について説明する。酵素を採取
する部位は特に限定されるものではないが、例えば芽生
えの上胚軸のアポプラスト部分が好適である。ビグナ
アンギュラリスを発芽させ、これよりアポプラスト部分
の粗抽出溶液（以下、アポプラスト溶液と称する）を得
る方法は、例えば前出のフィジオロジア プランタルム
に記載の方法が効果的である。得られたアポプラスト溶
液から酵素を精製する手段としては、例えば硫安塩析、
アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過、イオン交
換カラムクロマトグラフィー等の方法を組合せて用いる
のが効果的であり、これらの方法によりグリコシダーゼ
活性の混在がない、精製された酵素を得ることができ
る。 【０００９】酵素活性の測定に用いる基質の調製方法を
次に示す。タマリンド (Tamarindus Indica Ｌ.)由来の
粗精製ＸＧを大日本製薬社より得た（商品名 Glyloid
９Ｓ）。該粗精製ＸＧ３００mgを、トリコデルマ・ビリ
デ・セルラーゼ１５０μｇにより４０mlの水溶液中で、
４５℃で２時間、部分的に加水分解した。生成物をオー
トクレーブにかけてセルラーゼを変性し、次いで限外ろ
過法〔ダイアフロ(Diaflo)ＸＭ−３００及びＹＭ５、ア
ミコン社製〕により分画した。ＸＭ−３００を通過し、
ＹＭ５で残留した画分（４０mg以上）を２mlの水に溶解
してスペロース (Superose) ６ prep カラム（１６×５
００mm、ファルマシア社製）を備えたＨＰＬＣ（島津Ｌ
Ｃ６Ａ）（以下このＨＰＬＣシステムをシステムＡと称
す）に供して、0.５ml／分の水で溶離した。画分（1.５
ml）を収集して凍結乾燥し、ＸＧ標品を得た。標品の分
子量は、前述の、酵素活性の測定に用いたのと同じクロ
マトグラフィーのシステムにより測定した。 【００１０】（酵素活性の測定方法）本発明の酵素の活
性測定は次の様に行う。すなわち、２〜２０μｇのタマ
リンド由来ＸＧに、0.２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ5.８）で希釈した酵素液１０μｌを加え、２５℃で３
０分間反応させた後、反応混合物を−５０℃で凍結する
ことにより反応を停止する。反応混合物を２０μｌの５
０mM ＮａＯＨに溶解し、ＴＳＫゲル−３０００ＰＷカ
ラム（８×３００mm、東ソー社製）及びＴＳＫゲル−５
０００ＰＷカラム（８×３００mm、東ソー社製）を備え
たノン−メタルＨＰＬＣシステムに供して、１５mMの酢
酸ナトリウムを含有する３０mMのＮａＯＨ溶液を用いて
１ml／分の流量で溶出する。溶出液を、金電極を備えた
ＰＡＤで検出する。図４に、検出結果の例を示す。すな
わち、図４は、上記の方法によるＰＡＤのクロマトグラ
フを表す図であり、縦軸にＰＡＤ応答（ｎＡ）、横軸に
溶出容積（ml）を表す。（ａ）はオートクレーブで１２
０℃、５分の処理により変性した本発明の酵素の精製標
品を用いた場合、（ｂ）はアポプラスト溶液を用いた場
合、（ｃ）は精製した酵素を用いた場合のクロマトグラ
ムを各々示し、矢印１はタマリンド由来の基質ＸＧ、矢
印２は単糖類の溶出位置を示す。（ｃ）において、１の
ピークの高さの１／２の位置におけるピークの幅は、反
応系に添加した酵素の量に比例して増大するので、基質
由来のピークの高さの１／２の位置におけるピークの幅
の増大を、本発明の酵素の活性の指標として用いる。基
質としてタマリンド由来のＸＧを用いた場合の酵素活性
の１単位は、２５℃で３０分間に上記のピークの幅を2.
３ml相当増大させる酵素の量と定義する。 【００１１】精製されたビグナ アンギュラリスのエン
ド型ＸＧ転移酵素について、例えばプロテインシークエ
ンサーを用いてアミノ酸配列の解析を行うことにより、
配列表の配列番号１で表される、Ｎ末端部分のアミノ酸
配列が決定される。該配列を基に、ＰＣＲ用のミックス
プライマーを作成することができる。例えば、配列表の
配列番号２で表されるミックスプライマーｐＡＺ−１、
及び配列表の配列番号３で表されるミックスプライマー
ｐＡＺ−２がそれぞれＤＮＡ合成機で合成され、精製
後、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の検索に使用すること
ができる。例えば、ビグナ アンギュラリスよりＲＮＡ
を調製し、次にオリゴテックス−ｄＴ３０（日本ロシュ
社製）を用いてポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの精製を行い、次に
例えば該ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡと、配列表の配列番号４で
示される、Ｍ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）の配列
を持ち、更に３′側にＴが連なった配列を有するプライ
マーｐＴＭ４を用い、逆転写酵素を作用させ、ｃＤＮＡ
を合成する。このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこ
とにより、エンド型ＸＧ転移酵素をコードするｃＤＮＡ
を増幅することができる。目的のＤＮＡを効率良く増幅
するためには２段階ＰＣＲが効果的で、例えば、プライ
マーとして上述のミックスプライマーｐＡＺ−１及びＭ
１３プライマーＭ４を用いて１段階目のＰＣＲを行い、
この反応生成物を鋳型として、ミックスプライマーｐＡ
Ｚ−２及びＭ１３プライマーＭ４を用いて２段階目のＰ
ＣＲを行うことにより、約1.１kbp のＤＮＡ断片が増幅
される。増幅されたＤＮＡ断片は、例えばｐＵＣ１１９
の Hinc IIサイトにサブクローニングすることができ
る。次に、例えばこれらの増幅ＤＮＡをプローブとし、
ビグナ アンギュラリスより調製したｃＤＮＡライブラ
リー又はゲノムライブラリーより、エンド型ＸＧ転移酵
素をコードする遺伝子を組込んだクローン体を検索する
ことができる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば前述の
ビグナ アンギュラリスｃＤＮＡよりｃＤＮＡ合成キッ
トシステムプラス（アマシャム社製）を用いて調製する
ことができる。前述の増幅ＤＮＡ断片をプローブとして
プラークハイブリダイゼーションを行うことにより、例
えば１×１０⁴ 個のプラークより５個の陽性プラークが
得られ、該プラークのファージベクターに挿入されてい
るＤＮＡ断片を抽出して、例えば約1.１kbp の長さのＤ
ＮＡ断片を得ることができる。該断片の制限酵素地図を
図５に示す。また、該断片のＤＮＡ塩基配列の一部を配
列表の配列番号５に示す。 【００１２】該断片を適当なプラスミドの制限酵素部位
に挿入し、該断片の挿入されたプラスミドを用いて適当
な宿主を形質転換することができる。該断片をｐＵＣ１
１９のEcoRＩサイトに組込んだプラスミドは、ｐＶＸ１
０３と命名され、ｐＶＸ１０３で形質転換された大腸菌
ＪＭ１０９株は、Escherichia coli JM109／pVX103と命
名、表示され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第４１０４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１０４）とし
て寄託されている。 【００１３】上述のビグナ アンギュラリス由来のエン
ド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子は、該酵素をコー
ドする遺伝子の一例であり、該遺伝子、若しくはその部
分配列をプローブとして用いることにより、他の植物種
よりエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子をクローニングする
ことができる。また、該遺伝子のクローニングに用いら
れるプライマーを使用して、他の植物種について、エン
ド型ＸＧ転移酵素の遺伝子を増幅し、クローニングする
こともできる。対象とする植物としては、例えば双子葉
植物であれば、トマト、タバコが、また例えば単子葉植
物であれば、コムギ、イネ、トウモロコシが挙げられ
る。 【００１４】例えば、上述の操作で得られる約1.１kbp
のｃＤＮＡを、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキ
ットによって〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識し、これをハ
イブリダイゼーションのプローブとして用い、λＥＸｌ
ｏｘ^TMイントロダクトリークローニングキット（ノバジ
ェン社製）を用いて、トマト（Lycopersicon esculentu
m)ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーをプラー
クハイブリダイゼーション法により検索することができ
る。陽性プラークよりファージを単離し、例えばファー
ジベクター中に挿入されているエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子を約1.２kbp のＤＮＡ断片として切り出し、精製す
ることができる。該断片の制限酵素地図を図６に示す。
またこの断片のＤＮＡ塩基配列の一部を配列表の配列番
号６に示す。 【００１５】更に、後述の方法により、配列表の配列番
号６に示されるＤＮＡ塩基配列のうち、塩基番号４６番
から９３０番の部分をコードするＤＮＡ断片を含むプラ
スミドを構築することができる。該プラスミドはｐＴＸ
３０１と命名され、ｐＴＸ３０１により形質転換された
大腸菌ＪＭ１０９株は、Escherichia coli JM109/pTX30
1 と命名、表示され、該菌株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４２２３として寄託さ
れている。 【００１６】ビグナ アンギュラリスのエンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子を含有する約1.１kbpのｃＤＮＡ断片をプ
ローブとしてトウモロコシ、コメのｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を
含むＤＮＡ断片を調製することができる。これらのＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図を図１、図２にそれぞれ示す。ト
ウモロコシ、コメのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を導入したプラスミドはそれぞれｐＣＸ１０
１、ｐＲＸ１０２と命名され、これらのプラスミドを用
いて形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株はそれぞれEsch
erichia coli JM109/pCX101 、Escherichia coli JM109
/pRX102 と命名され、Escherichia coliJM109/pCX101
は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−
１３７６８として寄託されており、Escherichia coli J
M109/pRX102 はＦＥＲＭ ＢＰ−４２２１として寄託さ
れている。 【００１７】また、プラスミドｐＴＸ３０１に導入され
ているトマトのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を含む約９
３０bpのＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同様の方
法により、タバコのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を含む
約1.２bpの長さのＤＮＡ断片を調製することができる。
タバコのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を含む約1.２kbp
の長さのＤＮＡ断片を導入したプラスミドはｐＮＸ１０
１と命名され、プラスミドｐＮＸ１０１を用いて形質転
換された大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109
/pNX101 と命名、表示され、該菌株は、工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３８０３として
寄託されている。この約1.２kbp の長さのＤＮＡ断片の
制限酵素地図を図３に示す。またこのＤＮＡ断片のＤＮ
Ａ塩基配列の一部を配列表の配列番号７に示す。 【００１８】これらの菌株からエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子を調製し、該遺伝子を用いて適当な発現用プラスミ
ドを構築し、該発現用プラスミドを用いて適当な宿主を
形質転換し、該形質転換体を培養することにより、エン
ド型ＸＧ転移酵素を生産することができる。 【００１９】生物体内、例えば植物体内においてエンド
型ＸＧ転移酵素遺伝子の発現を調節することにより、植
物の細胞壁の成長を調節することができ、例えば、これ
らの遺伝子の発現を制御することにより、細胞壁の再構
築を阻害し、矮性の植物を作出することができる。エン
ド型ＸＧ転移酵素遺伝子の発現を制御する方法として
は、例えばエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンス
ＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを生物体に導入する方法
を用いることができる。導入するアンチセンスＤＮＡと
しては、例えば本発明で得られるエンド型ＸＧ転移酵素
遺伝子のアンチセンスＤＮＡ若しくはその一部を用いる
ことができる。該アンチセンスＤＮＡの配列の例を配列
表の配列番号８番に示す。すなわち、配列表の配列番号
８番は、配列表の配列番号７番で示されるタバコのエン
ド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡの配列を
示すものである。アンチセンスＤＮＡとしては例えば、
このアンチセンスＤＮＡの一部を適当に切断して得た断
片を用いても良いし、このアンチセンスＤＮＡ配列に基
づいて合成したＤＮＡを用いてもよい。 【００２０】導入するアンチセンスＲＮＡとしては、例
えばエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡ
若しくはその一部を用いることができる。該アンチセン
スＲＮＡの配列の例を配列表の配列番号９番に示す。す
なわち、配列表の配列番号９番は、それぞれ配列表の配
列番号７番で示される、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の
アンチセンスＲＮＡの配列を示すものである。例えば、
このアンチセンスＲＮＡの一部を適当に切断して得た断
片を用いても良いし、このアンチセンスＲＮＡ配列に基
づいて合成したＲＮＡや、例えばエンド型ＸＧ転移酵素
遺伝子若しくはその一部を用いて、イン ビドロ (in v
itro) 転写系でＲＮＡポリメラーゼを作用させて生成し
たＲＮＡを用いてもよい。導入するアンチセンスＤＮＡ
若しくはアンチセンスＲＮＡの領域、及び長さに関して
は、導入するアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮ
Ａが生物体内でエンド型ＸＧ転移酵素の内在性のＲＮＡ
と会合することによってその機能を抑制するものであれ
ば特に限定はないが、挿入断片の長さは１５塩基対以上
が望ましい。また、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセン
スＲＮＡには、生体内で分解されにくい様に化学的な修
飾等を施しておくことができる。 【００２１】アンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンス
ＲＮＡを生物体に導入する方法としては、例えばマイク
ロインジェクション法〔モレキュラー ジェネラル ジ
ェネティクス（Mol. Gen. Genetics）、第２０２巻、第
１７９〜１８５頁（１９８５）〕、ポリエチレングリコ
ール法〔ネイチャー (Nature）、第２９６巻、第７２〜
７４頁（１９８２）〕、パーティグルガン法〔ネイチャ
ー、第３２７巻、第７０〜７３頁（１９８７）〕や、ア
ンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡを含有す
る小細胞、細胞、リソソーム等とプロトプラストとの融
合法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブ ザ サイエンシーズオブ ザ ＵＳ
Ａ、第７９巻、第１８５９〜１８６３頁（１９８
２）〕、エレクトロポレーション法〔プロシーディング
ズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ ザ サイ
エンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第５８２４
〜５８２８頁（１９８５）〕等の方法を挙げることがで
きる。 【００２２】また、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子より得
られるＤＮＡ配列を、細胞内で作用しうるプロモーター
に、転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセ
ンスＲＮＡが生成されるように連結した、アンチセンス
ＲＮＡ生成用カセットを構築して植物体内に導入する方
法も有効である。アンチセンスＲＮＡ生成用カセット
は、例えば、プロモーターの下流に転写によりエンド型
ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成するよ
うにエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子の配列又はその一部
を連結して構築することができる。ここで用いる遺伝子
配列としては、転写により生成されるアンチセンスＲＮ
Ａが生物体内でエンド型ＸＧ転移酵素の内在性のＲＮＡ
と会合することによってその機能を抑制するものであれ
ば特に限定はないが、挿入断片の長さは１５塩基対以上
が望ましい。例えばエンド型ＸＧ転移酵素の遺伝子の一
部を適当な制限酵素で切断して、プロモーターの下流の
適当な部位に転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の
アンチセンスＲＮＡが生成されるように連結することが
できる。また、例えば本発明で得られるエンド型ＸＧ転
移酵素遺伝子配列に基づいて、エンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子の適当な領域が増幅されるようなＰＣＲ用プライマ
ーを作製し、該プライマーを用いてエンド型ＸＧ転移酵
素遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮ
Ａ断片を適当なベクターに組込まれているプロモーター
領域の下流に、転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
のアンチセンスＲＮＡが生成されるように連結してアン
チセンスＲＮＡ生成用カセットを構築してもよい。この
場合には、挿入する増幅ＤＮＡ断片を、転写によりエン
ド型ＸＧ転移酵素遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生成さ
れるように、ベクター内に存在する適当な制限酵素サイ
トを選択して挿入するが、これらの制限酵素の認識配列
を５′末端側に有するプライマーを用いて、ＰＣＲを行
うのが有効である。 【００２３】また例えばエンド型ＸＧ転移酵素が発現さ
れるように細胞内で作用しうるプロモーターに連結した
エンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを構築し、該カセ
ットを生物体、例えば植物体に導入して植物体内でエン
ド型ＸＧ転移酵素を発現させることができ、よって植物
体の形態を制御することができる。エンド型ＸＧ転移酵
素発現用カセット中に挿入されるエンド型ＸＧ転移酵素
遺伝子としては、植物細胞中でエンド型ＸＧ転移酵素の
活性が発現されるために必要な領域を含んでいればよい
が、例えばシグナルペプチドをコードする配列から終止
コドンまでを含んでいることが望ましい。例えばエンド
型ＸＧ転移酵素の遺伝子の一部を適当な制限酵素で切断
してプロモーターの下流の適当な部位にエンド型ＸＧ転
移酵素が発現されるように連結することができる。ま
た、例えば本発明で得られるエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子配列に基づいて、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の適当
な領域が増幅されるようなＰＣＲ用プライマーを作製
し、該プライマーを用いてエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
を鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡ断片を
適当なベクターに組込まれているプロモーター領域の下
流にエンド型ＸＧ転移酵素が発現されるように連結して
エンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを構築してもよ
い。この場合挿入する増幅ＤＮＡ断片を、ベクター内に
存在する適当な制限酵素サイトを選択して挿入するが、
アンチセンスＲＮＡ生成用カセットの場合と同様に、こ
れらの制限酵素の認識配列を５′末端側に有するプライ
マーを用いてＰＣＲを行うのが有効である。 【００２４】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットに用いられるプ
ロモーター配列は、細胞内で機能しうるものであれば特
に限定はなく、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に由来する
ものでも、他の遺伝子由来のものでも良い。プロモータ
ーには転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流に
あって正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始
させる機能を担っているＴＡＴＡボックスと呼ばれる領
域が含まれるが、本発明で用いられるプロモーター配列
は必ずしもＴＡＴＡボックスの前後の領域に限定される
物ではなく、この領域以外に、発現調整のためにＲＮＡ
ポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要
な、更に上流の領域を含んでいてもよい。 【００２５】例えば、アンチセンスＲＮＡ生成用カセッ
トを構築する際に、天然の植物体内でエンド型ＸＧ転移
酵素遺伝子が発現の支配を受けていたプロモーターを用
いれば、植物の器官全体に生活環の全ステージを通して
生産されるエンド型ＸＧ転移酵素の量を減少させること
ができ、矮性をもたらすことができる。また他の遺伝子
に由来するもので、非調節性のプロモーターを用いるこ
とによっても、植物の器官全体に生活環の全ステージを
通して形態変化をもたらすことができる。非調節性のプ
ロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウィ
ルスの３５Ｓプロモーターを用いることができ、これは
ｐＢＩ１２１（クロンテック社製）に含まれている。ま
た刺激によって誘導可能なプロモーターを用いれば、生
育環境に応じてその形態が変化しうる植物体を作製する
ことができる。例えば、光に応答するプロモーターを用
いれば、光照射の条件によって植物体の形態を変化させ
ることができる。例えば、器官、又は組織特異的なプロ
モーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに形態
変化を生じさせることができる。例えば葉で特異的に転
写されている遺伝子のプロモーターを用いれば、葉の形
態だけを変化させることができる。また例えば、生活環
のあるステージに特異的に機能するプロモーターを用い
ることによって、生活環の一定のステージだけエンド型
ＸＧ転移酵素の活性を増大又は減少させることができ、
その結果特定の器官、又は組織だけに形態変化を生じさ
せることができる。例えば花器形成時にだけ転写を起こ
させうるプロモーターを用いることによって、花器だけ
に形態の変化をもたらすことができる。また、花粉管形
成時にだけ機能するプロモーターを用いて構築したアン
チセンスＲＮＡ生成用カセットを用いて花粉管の伸張を
抑制することができ、その結果雄性不稔性の植物体を作
製することができる。 【００２６】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットにおいて、プロ
モーターの下流に転写によりエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子のアンチセンスＲＮＡが生成されるように、若しくは
エンド型ＸＧ転移酵素が発現されるように連結されてい
るエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子若しくはその一部の配列
を有する遺伝子断片（以下挿入配列と称する）の下流
に、転写終止配列を連結させることによって、転写を効
率よく終了させることができる。該転写終止配列は、エ
ンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に由来するものであっても良
いし、また他の遺伝子に由来するものでもよい。またポ
リＡ付加配列を挿入配列の下流に連結させることによっ
て翻訳の効率を高めることができる。該ポリＡ付加配列
はエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子に由来するものであって
も良いし、他の遺伝子、例えばアグロバクテリウムのオ
クトピンシンテターゼ〔ジ エンボ ジャーナル（The
EMBOJournal）、第３巻、第８３５〜８４６頁（１９８
４）〕やノパリンシンテターゼ〔モレキュラー アンド
アプライド ジェネティクス（Mol.and Appl.Genet.)
第１巻、第５６１〜５７３頁（１９８２）〕に由来する
ものであってもよい。 【００２７】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを生物体に導入
する方法としては、種々の公知の方法を用いることがで
き、例えば、適当なベクターにこれらのカセットを挿入
し、該ベクターを生物体に導入する方法が有効である。
この場合、ベクターに応じて、これらのカセット中には
存在せず、ベクター中のカセットを挿入したい部位にの
み存在する制限酵素認識配列をこれらのカセットの５′
末端及び３′末端に付加しておくことができる。 【００２８】これらのカセットを挿入するベクターは、
形質転換された植物を容易に選別できるように選別マー
カー遺伝子を含有することが望ましい。選別マーカー遺
伝子としては、例えば抗生物質耐性の形質をもたらす遺
伝子（抗生物質耐性遺伝子）を用いることができる。こ
のような遺伝子として、例えばＧ４１８、ハイグロマイ
シン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシ
ン、クロラムフェニコールに対する耐性をもたらす遺伝
子を挙げることができる。抗生物質耐性遺伝子がベクタ
ーに含有されていれば、抗生物質を含む培地中で生育す
る生物体を選ぶことによって形質転換された生物体、す
なわちこれらのカセットが導入された生物体を容易に選
択することができる。 【００２９】これらのカセットを挿入したベクターを直
接生物体、例えば植物体に導入する方法は、前出のマイ
クロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、
パーティグルガン法、ベクターを含有する小細胞、細
胞、リソソーム等とプロトプラストとの融合法、エレク
トロポレーション法等の方法を挙げることができる。 【００３０】また植物ウイルスをベクターとして用いる
ことによって、これらのカセットを植物体に導入するこ
とができる。利用する植物ウイルスとしては、例えばカ
リフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を用いること
ができる。すなわち、まずウイルスゲノムを一旦大腸菌
等由来のベクターに挿入して組換体を調製した後、ウイ
ルスのゲノム中にこれらのカセットを挿入する。このよ
うにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素により該
組換体から切り出し、植物に接種することによって、こ
れらのカセットを植物体に挿入することができる〔ホー
ン（Hohn）ら、モレキュラー バイオロジー オブ プ
ラント チューモアーズ（Molecular Biology of Plant
Tumors)、アカデミック プレス、ニューヨーク（Acad
emic Press、New York）、第５４９〜５６０頁（１９８
２）、米国特許第4,４０7,９５６号〕。 【００３１】更にまた、アグロバクテリウム属に属する
細菌が植物に感染すると、それが持っているプラスミド
ＤＮＡの一部を植物のゲノム中に移行させるという性質
を利用して、これらのカセットを植物体に導入すること
もできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちア
グロバクテリウム チュメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens)は植物に感染してえい瘤（crown gall)
を、また、アグロバクテリウム リゾゲネス（Agrobact
erium rhizogenes) は植物に感染して毛状根を引起こす
が、これらは感染の際にＴｉプラスミド、又はＲｉプラ
スミドと呼ばれるそれぞれの細菌中に存在するプラスミ
ド上のＴ−ＤＮＡ領域（Transferred ＤＮＡ）と呼ばれ
る領域が植物中に移行し植物のゲノム中に組込まれるこ
とに起因する。更に、Ｔｉ、又はＲｉプラスミド上には
Ｔ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組
込まれるために必須であるｖｉｒ領域と言われる領域が
ある。ｖｉｒ領域自身は、植物中に移行されることはな
く、またこのｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ領域が存在するの
と異なったプラスミド上にあっても機能しうる〔ネイチ
ャー、第３０３巻、第１７９〜１８９頁（１９８
３）〕。 【００３２】Ｔｉ、又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ
領域中に、植物のゲノム中に組込みたいＤＮＡを挿入し
ておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染
する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むこと
ができる。ここで、Ｔｉ、又はＲｉプラスミドのＴ−Ｄ
ＮＡ中のえい瘤、又は毛状根を引起こす部分を、目的と
する移行機能を損なうことなく取り除き、得られたもの
をベクターとして使用することもできる。本発明におい
てはこの様な種々のベクターを用いることができ、例え
ば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢＩ１２１（クロ
ンテック社）、ｐＢＩ−Ｈ１−３５Ｓ−ＩＧ（名古屋大
学、中村研三博士より供与）等のベクターに、アンチセ
ンスＲＮＡ生成用カセット、若しくはエンド型ＸＧ転移
酵素発現用カセットを挿入して、これらのカセットの植
物体への導入を行うことができる。なお、これらのベク
ターは、前出のｖｉｒ領域を有しておらず、該ベクター
を導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌は、ｖｉ
ｒ領域を有している他のプラスミドを含有している必要
がある。 【００３３】またこれらのベクターはアグロバクテリウ
ム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅することが
できるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプラ
スミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことができ
る。更に、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子を
含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌、及
び植物体等を形質転換する際に、形質転換体を容易に選
別することができる。また、これらのベクターにはＣａ
ＭＶの３５Ｓプロモーターが存在しており、これらのベ
クターに挿入された遺伝子を植物ゲノム中に組込んだ
後、非調節的に発現させることが可能となる。 【００３４】アンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しく
はエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットを挿入したこれ
らのベクターを用い、アグロバクテリウム属の細菌を介
してこれらのカセットを植物体のゲノム中に移行させて
形質転換を行う際には、アグロバクテリウム属の細菌が
感染しうるものでその再生系が確立されている植物体で
あれば、どの様な植物体でも形質転換を行うことができ
る。大抵の双子葉植物は、アグロバクテリウム属の細菌
を用いて形質転換を行うことができ、特に自然界でアグ
ロバクテリウム属の細菌の宿主となっている植物体は、
すべて試験管内で形質転換させることができる。穀類を
含め、単子葉植物は自然界ではアグロバクテリウム属の
細菌の宿主ではないが、例えばライムギ〔ネイチャー、
第３２５巻、第２７４〜２７６頁（１９８７）〕、トウ
モロコシ〔サイエンス、第２４０巻、第２０４〜２０７
頁（１９８８）〕、イネ〔ネイチャー、第３３８巻、第
２７４〜２７６頁（１９８９）〕等は、試験管内で形質
転換させることができる。 【００３５】形質転換は、（１）プロトプラストを用い
て行うか、（２）組織片又は未処理の細胞を用いて行う
ことができる。（１）の方法を用いるには形質転換され
たプロトプラストから植物体を再生させる系を予め確立
しておく必要があり、（２）の方法を用いるにはアグロ
バクテリウム属の細菌を用いて組織片又は未処理の細胞
を形質転換させ、それを植物体に再生する系を確立して
おく必要がある。形質転換された植物は、上述の形質転
換のマーカーとなりうる薬剤を含有する培地で植物体を
生育させることにより選択することができる。 【００３６】植物体の再生方法は、植物の種類により異
なっているが、一般的には、（１）の場合には形質転換
されたプロトプラストの懸濁液、（２）の場合には形質
転換されたプレート上の組織片又は未処理の細胞からカ
ルスを誘導し、次いでシュートを形成させることによっ
て行うことができる。また、一般的に、培地には種々の
アミノ酸のほかにオーキシンやサイトカイニン等のホル
モンを含有させておくことができる。形質転換された植
物のゲノム中に目的のアンチセンスＲＮＡ生成用カセッ
ト若しくはエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセットが挿入
されているかどうかはサザンハイブリダイゼーション等
の方法で確かめることができ、また、エンド型ＸＧ転移
酵素遺伝子のセンスＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡが
植物体内で生成されているかどうかはノザンハイブリダ
イゼーション等の方法で確かめることができる。 【００３７】上記のごとく作製されたアンチセンスＲＮ
Ａ生成用カセット若しくはエンド型ＸＧ転移酵素発現用
カセットが挿入された植物体を用いて、交配によってア
ンチセンス鎖転写用カセット若しくはエンド型ＸＧ転移
酵素発現用カセットを次世代の植物体に移して行くこと
ができる。例えば、ベクターｐＢＩ−Ｈ１−３５Ｓ−Ｉ
Ｇに、本発明により得られるエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子あるいはその一部を、転写によりアンチセンスＲＮＡ
が生成するように、若しくはエンド型ＸＧ転移酵素が発
現するように組込むことにより、上流にＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーター、その下流にエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子
あるいはその一部を結合した、アンチセンスＲＮＡ生成
用カセット若しくはエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセッ
トを含有するプラスミドを構築することができる。次
に、このようにして構築されたプラスミドを用いて、適
当なアグロバクテリウム属に属する菌株、例えばアグロ
バクテリウム チュメファシエンス ＬＢＡ４４０４株
〔Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ；ネイチャー、
第３０３巻、第１７９〜１８０頁（１９８３）、クロー
ンテック社より入手可能〕を形質転換し、該形質転換体
を目的とする植物体に感染させることにより、植物を形
質転換することができる。また、該プラスミドを適当な
制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動により目的
のフラグメントを切り出し精製して、これらのフラグメ
ントをエンド型ＸＧ転移酵素発現用カセット若しくはア
ンチセンスＲＮＡ生成用カセットとして、他のプラスミ
ドに組込み、植物の形質転換に用いることができる。 【００３８】本発明で得られる、配列表の配列番号７で
示されるタバコのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の配列に
基づいて、配列表の配列番号１０、１１、１２、１３に
示す４種類のプライマー、ＴＡＢＳＳＰ、ＴＡＢＸＡ
Ｐ、ＴＡＢＸＳＰ、ＴＡＢＳＡＰをデザインし、合成す
ることができる。プライマーＴＡＢＳＳＰ及びＴＡＢＸ
ＳＰは配列表の配列番号７の塩基番号１〜１９に対応す
る５′→３′の向きに相当する配列の５′側に制限酵素
ＳａｃＩ、若しくはＸｂａＩの切断部位を付加したも
の、ＴＡＢＸＡＰ及びＴＡＢＳＡＰは塩基番号８７１〜
８８８に対応する３′→５′の向きに相当する配列の
５′側に制限酵素ＸｂａＩ、若しくはＳａｃＩの切断部
位を付加したものである。例えばタバコのエンド型ＸＧ
転移酵素遺伝子を鋳型として、上記のプライマーのうち
ＴＡＢＳＳＰ及びＴＡＢＸＡＰの対を用いてＰＣＲ法に
より遺伝子配列の増幅を行い、増幅された約９００bpの
ＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩにより切
断し、精製した後、ｐＢＩ−Ｈ１−３５Ｓ−ＩＧのＸｂ
ａＩサイトからＳａｃＩサイトの部位に挿入することが
できる。このようにして得られたプラスミドは、カリフ
ラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター配列を持
ち、その下流のＸｂａＩサイト−ＳａｃＩサイトに配列
表の配列番号７の塩基番号１〜８８８で表される部分の
配列を転写によりアンチセンスＲＮＡが生成するように
組込んだもので、カナマイシン及びハイグロマイシン耐
性の遺伝子を有している。 【００３９】また同様にプライマーＴＡＢＸＳＰ及びＴ
ＡＢＳＡＰの対を用いてＰＣＲ法で遺伝子配列の増幅を
行い、増幅された約９００bpのＤＮＡ断片をｐＢＩ−Ｈ
１−３５Ｓ−ＩＧのＸｂａＩサイトからＳａｃＩサイト
の部位に挿入することができる。このように作成したプ
ラスミドは、同様のプロモーター、耐性遺伝子を持ち、
配列表の配列番号７の塩基番号１〜８８８の配列をエン
ド型ＸＧ転移酵素が発現されるように組込んだものであ
る。これらのプラスミドを用いて、エレクトロポレーシ
ョン法により適当なアグロバクテリウムの菌株、例えば
アグロバクテリウム チュメファシエンス ＬＢＡ４４
０４株を形質転換することができる。 【００４０】形質転換したアグロバクテリウムにより目
的の植物を形質転換する方法は特に限定されるものでは
ない。例えば、滅菌した葉を約１cm平方のリーフディス
クにし、形質転換させたアグロバクテリウムを感染させ
る方法を用いることができる。感染させたリーフディス
クを除菌し、使用したベクターの選択マーカーとなる抗
生物質を含有するプレート上で培養すれば、形質転換さ
れた植物体を選択することができる。これらの抗生物質
を含有するプレート上に得られた植物体のゲノム中にア
ンチセンスＲＮＡ生成用カセット若しくはエンド型ＸＧ
転移酵素発現用カセットが挿入されていることの確認
は、該植物体、又はその種子から形成された植物体のＤ
ＮＡを抽出し、エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子、又はその
一部をプローブとしてサザンハイブリダイゼーション等
の方法で行うことができる。また、形質転換された植物
中において、エンド型ＸＧ転移酵素の発現が調節されて
いることの確認は、形質転換された植物体、又はその種
子のＲＮＡを抽出し、エンド型ＸＧ酵素遺伝子をプロー
ブとして用いて、ノザンハイブリダイゼーション等の方
法で行うことができる。例えば、無菌的に生育させたタ
バコの葉を滅菌したメスで約１cm平方のリーフディスク
とし、形質転換させたアグロバクテリウムをＬＢ培地で
一晩培養したものと２８℃で３日間共存培養し、除菌操
作後葉の表面を下にしてカナマイシン−ハイグロマイシ
ン−カルベニシリンを含み、0.２μｇ／ml−ナフタレン
酢酸、１μｇ／mlベンジルアデニンを含有する固形ムラ
シゲ−スクーグ（ＭＳ）培地で培養する。４週間後出現
した茎葉をディスクから切り離し、カナマイシン−ハイ
グロマイシン−カルベニシリンを含むＭＳ培地に移す。
２週間後発根した植物体をピートモス／バーミキュライ
ト３：２の土に移す。開花後得られた種子を滅菌後ハイ
グロマイシンを含むＭＳ培地に播種して発芽させること
により形質転換体を得ることができる。 【００４１】この形質転換体より常法に従ってＤＮＡを
抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、プロー
ブとして、例えばプライマーＴＡＢＳＳＰ及びＴＡＢＸ
ＡＰの対でタバコのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子を鋳型
としてＰＣＲ法により増幅した約９００bpのＤＮＡ配列
を用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、形質転
換の有無を確認することができる。 【００４２】また、この形質転換体より常法に従ってＲ
ＮＡを抽出し、約９００bpのセンスＤＮＡ配列若しくは
アンチセンスＤＮＡ配列を有するプローブを作製し、こ
れらのプローブを用いてノザンハイブリダイゼーション
を行いエンド型ＸＧ転移酵素の発現の状態を観察するこ
とができる。 【００４３】本発明で得られるエンド型ＸＧ転移酵素を
コードする遺伝子や該遺伝子にハイブリダイズする遺伝
子又はその一部の配列を有するポリヌクレオチドを用い
て、エンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子の発現過
程の観察や調節を行うこともできる。また、本発明で得
られる、エンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子を発
現させ、製造されるポリペプチドを用いて、種々の抗体
を作製することもでき、これらの抗体も、エンド型ＸＧ
転移酵素の精製等に有用である。 【００４４】以下、本発明で使用するエンド型ＸＧ転移
酵素について参考例で具体的に説明する。 参考例１ エンド型ＸＧ転移酵素の精製 ビグナ アンギュラリス オウヴィ エ オオハシ、c
v、タカラ (Ohwi et Ohashi, cv. Takara) の種子（渡
辺種子社製）をフィジオロジア プランタルム、第８２
巻、第４９０〜４９７頁（１９９１）に記載の方法で発
芽させ、アポプラスト溶液を得た。 【００４５】（硫安沈殿）合計６００mlのアポプラスト
溶液を、１０ｇのポリビニルピロリドン粉末、及び５０
mMのジチオスレイトールと２mMのＥＤＴＡを含有する0.
５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.８）６０mlと０
℃で混合して５分間保持した。不溶物質を１８０００×
ｇで３０分間遠心分離して除去した後、上澄み液に硫酸
アンモニウム粉末を添加して８０％飽和として、生成し
た沈殿（１0.５mgのタンパク質を含む）を遠心分離によ
って回収した。得られた沈殿を２mlの0.２Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ5.７）に溶解し、１mlの１００％硫酸
アンモニウム飽和溶液を添加して３３％飽和とした。生
成した沈殿を、１８０００×ｇにて３０分間遠心分離し
て回収し、1.８mgのタンパク質を含む画分を得た。 【００４６】（ Con−Ａ Sepharose ６Ｂによる分画）
上記の操作で得た沈殿を、0.１５ＭのＮａＣｌ、１mMの
ＭｎＣｌ₂ 、１mMのＭｇＣｌ₂ 、及び１mMのＣａＣｌ₂
を含有する酢酸ナトリウム緩衝液ａ（ｐＨ5.７）の2.４
mlに溶解し、同じ緩衝液ａであらかじめ平衡化したコン
−Ａセファロース６Ｂ（ Con−Ａ Sepharose ６Ｂ、フ
ァルマシア社製）（４ml）のカラムに注入した。そのカ
ラムを、３６mlの緩衝液ａ、７mMのメチル−α−Ｄ−マ
ンノピラノシドを含有する緩衝液ａの２０ml、及び５０
０mMのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含有する緩
衝液ａの４０mlで連続して溶離した。５００mMのメチル
−α−Ｄ−マンノピラノシドを含有する緩衝液ａで溶出
した画分に、本発明の酵素の活性が認められた。その活
性画分をウルトラフリー (Ultrafree 、ミリポア社製）
を用いて限外ろ過により濃縮し、４００μｌ中に６６８
μｇのタンパク質を含有する画分を得た。 【００４７】（ＴＳＫゲル２０００ＳＷによる分画）上
記の操作で得た画分のタンパク質２００μｌをＴＳＫゲ
ルＧ２０００ＳＷ（7.５×３００mm、東ソー社製）を用
い、溶離液として0.１５Ｍ酢酸ナトリウ緩衝液（ｐＨ5.
７）を0.５ml／分の流量で用いるカラムクロマトグラフ
ィーに付した。このクロマトグラフィーを繰返し、活性
画分を分画して濃縮し、上記緩衝液１００μｌ中に６０
μｇのタンパク質を含有する画分を得た。 【００４８】( Mono−Ｓによる分画）上記の操作で得た
画分を５００μｌの２０mM酢酸ナトリウム溶液で希釈
し、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）てあらか
じめ平衡化したモノ−Ｓ (Mono−Ｓ、ファルマシア社
製）のカラム（５×５０mm）に注入した。このカラム
を、2.５mlの４０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）
で溶離し、次に０−１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配を有
する４０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.７）の２０ml
を0.４ml／分の流量で用いて溶離し、約３０μｇの本発
明の酵素の精製標品を得た。以上の各々の精製工程の結
果を表１に示す。 【００４９】 【表１】 表１ ビグナ・アンギュラリスよりエンド型ＸＧ転移酵素の精製経過 ──────────────────────────────────── 精製工程 全タンパク質 全活性 比活性 収 率 精製度 （単位／μg (mg) （単位） タンパク質）（％） （倍） ──────────────────────────────────── アポプラスト溶液 10.5 2136 0.203 100 1 ３３％ 硫安分画 1.513 1766 1.17 82 5.7 Con-Ａ セファロース 0.668 938 1.40 43 6.9 ＴＳＫ 2000SW 0.06 816 13.6 38 67 Mono−Ｓ 0.03 530 17.7 24 87 ──────────────────────────────────── 【００５０】また、前述した図４において、（ｂ）はア
ポプラスト溶液を用いて反応を行った際のクロマトグラ
フである。図中矢印２は混在するグリコシダーゼにより
生じたモノマー糖の溶出位置を示している。（ｃ）の精
製酵素画分においてはモノマー糖のピークは現れず、精
製操作により混在するグリコシダーゼが除去されたこと
を示している。 【００５１】（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）上記の精製工程で得られた本発明の酵素の精製標品
をラエンミリ (Laemmili)らの方法〔ネイチャー、第２
２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）〕に従って、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。す
なわちＳＤＳを含有する１２％ポリアクリルアミドゲル
（１０×１０cm、１mm厚）を使用して泳動し、銀染色を
行い、発色させると、本発明の酵素の精製標品は分子量
約３3,０００の単一のバンドとして確認された。 【００５２】参考例２ エンド型ＸＧ転移酵素をコード
する遺伝子のクローニング ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製 ビグナ アンギュラリス オウヴィ エ オオハシ，c
v. タカラの種子を前出のフィジオロジア プロンタル
ムに記載の方法で発芽させた。発芽より１週間後、芽の
先端から２〜５cmの下方の茎を切取り、約３ｇの植物組
織を得た。これを直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素
存在下乳鉢ですりつぶして粉末にし、約３０mlの変性液
〔４Ｍグアニジンチオシアネート、２５mMクエン酸ナト
リウム（ｐＨ7.０）、0.１Ｍ ２−メルカプトエタノー
ル、0.５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム〕で
溶解した。ここに２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ4.０）３m
l、水飽和酸性フェノール３０ml、４９：１ クロロホ
ルム／イソアミルアルコール６mlを順次加え、よくかく
はんし、この懸濁液を遠心して水層を分離し、この水層
にイソプロピルアルコールを加えて遠心分離することに
よりＲＮＡの沈殿約１mgを得た。この沈殿を溶出用緩衝
液〔１０mMトリス(Tris)−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）、１mM
ＥＤＴＡ（ｐＨ8.０）、0.１％ＳＤＳ〕４００μｌを溶
かし、オリゴテックス−ｄＴ３０（日本ロシュ社）１ml
を加えることによりポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡのみを樹脂に吸
着させた。樹脂を滅菌した純水で洗浄して、約１０μｇ
のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを回収した。 【００５３】 エンド型ＸＧ転移酵素のＮ末端アミノ
酸配列の決定 参考例１で得られたエンド型ＸＧ転移酵素の精製標品の
約１nmolを用いて、アプライド バイオシステムズ社製
の４７０Ａプロテインシークエンサーにより、Ｎ末端よ
り約３０残基のアミノ酸配列を決定した。該アミノ酸配
列を、配列表の配列番号１に示す。 【００５４】 ＰＣＲ法によるエンド型ＸＧ転移酵素
ｃＤＮＡの増幅 で得られたアミノ酸配列を基に、配列表の配列番号２
で表されるプライマーｐＡＺ−１、及び配列表の配列番
号３で表されるプライマーｐＡＺ−２をデザインし、Ｄ
ＮＡ合成機で合成した。また、Ｍ１３プライマーＭ４
（宝酒造社製）の３′側に更にＴが２０個連なった配列
を有するプライマーｐＴＭ４を同様に合成した。プライ
マーｐＴＭ４の配列を配列表の配列番号４に示す。 【００５５】で得られたポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ２μｇ
を、５mM ＭｇＣｌ₂ 、５０mM ＫＣｌ、１０mMトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、0.０１％ゼラチン、ｄＮＴＰ各
１mM、2.５μＭのプライマーｐＴＭ４、２０ＵのRNase
インヒビター、５０Ｕの逆転写酵素ＲＡＶ−２（宝酒造
社製）を含む総液量２０μｌの反応液に加え、４２℃で
４０分間逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。 【００５６】このチューブに２５mM ＭｇＣｌ₂ ４μ
ｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液〔５００mMＫＣｌ、１００mMト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、0.１％ゼラチン〕８μｌ、
滅菌蒸留水６5.５μｌ、アンプリタック^TMＤＮＡポリメ
ラーゼ（シータス社製）2.５Ｕ、２０pmolのプライマー
ｐＡＺ−１、２０pmolのＭ１３プライマーＭ４（宝酒造
社製）を順次加え、ミネラルオイルを添加してＰＣＲに
供した。反応は９４℃（0.５分）、４５℃（２分）、７
２℃（１分）のサイクルを３０回繰返した後、７２℃に
７分間維持した。次いで、この反応液１μｌを鋳型とし
て、ｐＡＺ−２をセンスプライマーとして、Ｍ１３プラ
イマーＭ４をアンチセンスプライマーとしてそれぞれ用
いて同様にＰＣＲを行い、上述のサイクルを２５回繰返
した。反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供
し、約1.１kbp のｃＤＮＡが特異的に増幅されているこ
とを確認した。このｃＤＮＡを精製し、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９の制限酵素 Hinc IIサイトにサブクローニング
した。 【００５７】 ｃＤＮＡライブラリーの作製及びスク
リーニング で得られたポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより、ｃＤＮＡ合成キ
ットシステムプラス（アマシャム社製）を用いて、ジー
ン (Gene) 第２５巻、第２６３頁（１９８３）に記載の
方法に準じて、λｇｔ１０をベクターとするｃＤＮＡラ
イブラリーを作製した。でサブクローニングした約1.
１kbp のｃＤＮＡを、ランダムプライマーＤＮＡラベリ
ングキット（宝酒造社製）を用いて（α−³²Ｐ）ｄＣＴ
Ｐで標識し、ハイブリダイゼーションのプローブとし
た。このプローブを用いて、上記で作製したｃＤＮＡラ
イブラリーについてプラークハイブリダイゼーション法
を行った。１×１０⁴ 個のプラークについて検索を行っ
た結果、５個の陽性プラークが得られた。これらのプラ
ークよりファージを単離し、挿入されているＤＮＡを抽
出した。これらのＤＮＡを制限酵素EcoRＩにより切断
し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の長さを
確認した。約1.１kbp のＤＮＡ断片を精製し、プラスミ
ドｐＵＣ１１９のEcoRＩサイトにサブクローニングし、
該プラスミドをｐＶＸ１０３と命名した。得られた約1.
１kbp のＤＮＡ断片を数種の制限酵素で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により分析した。 【００５８】その結果を図５に示す。すなわち、図５は
約1.１kbp のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。制限酵素BamHＩ、Hind III、 KpnＩ等は該断片を切
断しない。 【００５９】プラスミドｐＶＸ１０３を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、形質転換体をEscherichia co
li JM109／pVX103と命名、表示した。該菌株は、微工研
条寄第４１０４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１０４）として
寄託されている。 【００６０】参考例３ エンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の
塩基配列の決定 参考例２で得られたプラスミドｐＶＸ１０３の１０μｇ
を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断した。次いでヘ
ニコフ（Henikoff）らの方法〔ジーン、第２８巻、第３
５１〜第３５９頁（１９８４）〕に従い、キロシークエ
ンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用いて、ベ
クターに組込まれたＤＮＡ断片をＸｂａＩの認識配列側
の末端より分解し、種々の大きさの断片を含むクローン
を得た。この中から適当な大きさの断片を含むプラスミ
ド８個を選択し、サンガー（Sanger）の方法〔サイエン
ス（Science)、第２１４巻、第１２０５〜１２１０頁
（１９８１）〕に従ってＢｃａＢＥＳＴ^TMダイデオキシ
シークエンシングキット（宝酒造社製）を用いて約１．
１kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その塩基配
列の一部を配列表の配列番号５に示す。配列表の配列番
号５の塩基番号５７番〜８７２番はビグナ アンギュラ
リスのエンド型ＸＧ転移酵素の成熟タンパク質をコード
する部分である。 【００６１】参考例４ トマトエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子のクローニング及び塩基配列の決定 トマト（Lycopersicon esculentum)の種子（渡辺採取場
社製）を発芽させ、芽の上胚軸部分の組織から、参考例
２−と同様にして１０μｇのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを抽
出し、λＥＸｌｏｘ^TMイントロダクトリークローニング
キット（ノバジェン社）を用いてｃＤＮＡライブラリー
を作製した。すなわち、ジーン、第２５巻、第２６３頁
（１９８３）に記載の方法に従い、ｃＤＮＡを合成した
あと、キット中にあるEcoRＩリンカー及びHind IIIリン
カーを用いて、ベクターλＥＸＬＸ〔パラゾロ（Palazz
olo)ら、ジーン、第８８巻、第２５〜３６頁（１９９
０）〕にライゲーションした後、ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。 【００６２】参考例２で得られた約1.１kbp のｃＤＮＡ
を、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットを用い
て〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーシ
ョンのプローブとして用いて上記のｃＤＮＡライブラリ
ーについてプラークハイブリダイゼーション法を行っ
た。１×１０⁵ 個のプラークに対して、約２個の割合で
陽性プラークが得られた。これらのプラークより前述の
パラゾロらの方法に従い、λファージＤＮＡからｃＤＮ
Ａを含む断片をプラスミドとして回収した。このＤＮＡ
を制限酵素EcoRＩ及びHind IIIにより切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の長さを確認した。２
個の陽性プラークのうち長い方の約1.２kbp の長さのｃ
ＤＮＡ断片を確認することができ、これを精製した後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により突出末端
を平滑末端として、プラスミドｐＵＣ１１８の Hinc II
サイトにサブクローニングし、得られたプラスミドをｐ
ＴＸ２０１と命名した。得られた約1.２kbp のＤＮＡ断
片を数種の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動
により分析した。その結果を図６に示す。すなわち、図
６は約1.２kbp のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図で
ある。プラスミドｐＴＸ２０１を制限酵素BamHＩ及び S
acＩで切断し、このＤＮＡ断片を用いて、参考例３に記
載の方法と同様にして約1.２kbp のＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。配列の一部を配列表の配列番号６番に示
す。 【００６３】参考例５ （プラスミドｐＴＸ３０１の作製）配列表の配列番号６
に示したトマトのエンド型ＸＧ転移酵素遺伝子の配列に
基づいて、２種類のプライマー、ＴＯＭＸＳＰ、ＴＯＭ
ＳＡＰをデザインし、合成した。それぞれの配列を配列
表の配列番号１４、１５に示す。ＴＯＭＸＳＰは配列表
の配列番号６の塩基番号４６〜６６に対応する５′→
３′の向きに相当する配列の５′側に制限酵素ＸｂａＩ
の切断部位を付加したもの、ＴＯＭＳＡＰは塩基番号９
２１〜９４１に対応する３′→５′の向きに相当する配
列の５′側に制限酵素ＳａｃＩの切断部位を付加したも
のである。 【００６４】鋳型として、参考例３で得られたｃＤＮＡ
約１ng（１μｌ）を0.５ml用チューブにとり、ジーンア
ンプ^TMキット中の１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、1.２５
mMｄＮＴＰ混合液１６μｌ、アンプリタック^TMＤＮＡポ
リメラーゼ2.５Ｕ、及び0.１μｇ／μｌのプライマーＴ
ＯＭＸＳＰ及びＴＯＭＳＡＰそれぞれ１μｌに滅菌蒸留
水を加えて１００μｌとし、ミネラルオイルを添加して
ＰＣＲに供した。反応条件は９４℃（３０秒）、３７℃
（２分）、７２℃（１分）のサイクルを２５回繰返し
た。反応終了後、反応液を各々エタノール沈殿により濃
縮し、ＸｂａＩ、ＳａｃＩで切断後、それぞれ精製し、
バイナリーベクターｐＢＩ−Ｈ１−３５Ｓ−ＩＧの制限
酵素ＸｂａＩからＳａｃＩサイトの部位にサブクローニ
ングした。プライマーのＴＯＭＸＳＰ及びＴＯＭＳＡＰ
の対を用いて増幅されたＤＮＡ断片を挿入したプラスミ
ドをｐＴＸ３０１と命名した。なお、ｐＴＸ３０１によ
り形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、Escherichia
coli JM109/pTX301 と命名、表示され、工業技術院生命
工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４２２３とし
て寄託されている。 【００６５】 【実施例】以下に本発明を実施例をもって示すが、本発
明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。 【００６６】実施例１ トウモロコシ（Zea mays) 種子（雪印種苗社製）を発芽
させ、参考例２−と同様にして１０μｇのポリ（Ａ）
⁺ ＲＮＡを抽出し、λＥＸｌｏｘ^TMイントロダクトリー
クローニングキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作
製した。すなわち、ジーン、第２５巻、第２６３頁（１
９８３）に記載の方法に従い、ｃＤＮＡを合成したあ
と、キット中にあるEcoRＩリンカー及びHind IIIリンカ
ーを用いて、ベクターλＥＸＬＸにライゲーションした
後、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。参考例２で得ら
れた約1.１kbp のｃＤＮＡ断片を、ランダムプライマー
ＤＮＡラベリングキットを用いて〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ
で標識し、ハイブリダイゼーションのプローブとした。
上記の方法で作成したトウモロコシのｃＤＮＡライブラ
リーについてプラークハイブリダイゼーション法を行っ
た。１×１０⁴ 個のプラークに対して、約１個の割合で
陽性プラークが得られた。これらのプラークより前述の
パラゾロらの方法に従い、λファージＤＮＡからｃＤＮ
Ａを含む断片をプラスミドとして回収した。このｃＤＮ
Ａ断片を制限酵素EcoRＩ及びHind IIIにより切断し、ア
ガロースゲル電気泳動によりｃＤＮＡ挿入断片の長さを
確認し、約1.２kbp のｃＤＮＡ断片を確認した。このｃ
ＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＸ１０１と命名し
た。得られた約1.２kbp のｃＤＮＡ断片を数種の制限酵
素で切断し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果を図１に示す。すなわち、図１は約1.２kbp の
ｃＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。プラスミ
ドｐＣＸ１０１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、形質転換体をEscherichia coli JM109/pCX101 と命
名、表示した。該菌株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３７６８として寄託されてい
る。 【００６７】実施例２ イネエンド型ＸＧ転移酵素遺伝
子のクローニング イネ種子（鹿児島大学西谷和彦博士より提供）を発芽さ
せ、参考例２−と同様にして１０μｇのポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡを抽出し、λＥＸｌｏｘ^TMイントロダクトリーク
ローニングキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製
した。すなわち、ジーン、第２５巻、第２６３頁（１９
８３）に記載の方法に従い、ｃＤＮＡを合成したあと、
キット中にあるEcoRＩリンカー及びHind IIIリンカーを
用いて、ベクターλＥＸＬＸにライゲーションした後、
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。参考例２で得られた
約1.１kbp のｃＤＮＡ断片を、ランダムプライマーＤＮ
Ａラベリングキットを用いて〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標
識し、ハイブリダイゼーションのプローブとした。上記
の方法で作成したイネのｃＤＮＡライブラリーについて
プラークハイブリダイゼーション法を行った。１×１０
⁴ 個のプラークに対して、約１個の割合で陽性プラーク
が得られた。これらのプラークより前述のパラゾロらの
方法に従い、λファージＤＮＡからｃＤＮＡを含む断片
をプラスミドとして回収した。このｃＤＮＡ断片を制限
酵素EcoRＩ及びHind IIIにより切断し、アガロースゲル
電気泳動によりｃＤＮＡ挿入断片の長さを確認し、約1.
１kbpのｃＤＮＡ断片を確認した。このｃＤＮＡ断片を
含むプラスミドをｐＲＸ１０２と命名した。得られた約
1.１kbp のｃＤＮＡ断片を数種の制限酵素で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図２
に示す。すなわち、図２は約1.１kbp のｃＤＮＡ断片の
制限酵素地図を示す図である。プラスミドｐＲＸ１０２
を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換体
をEscherichia coli JM109/pRX102 と命名、表示した。
該菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４２２１として寄託されている。 【００６８】実施例３ タバコエンド型ＸＧ転移酵素遺
伝子のクローニング及び塩基配列の決定 プラスミドｐＴＸ３０１を制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃ
Ｉにより消化して得られた約９３０bpのＤＮＡ断片を、
ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットを用いて
〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識し、ハイブリダイゼーショ
ンのプローブとした。タバコ（Nicotiana tabacum)の葉
のｍＲＮＡより作製されたファージλ−ＺＡＰIIを用い
たｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン社製）につい
てプラークハイブリダイゼーション法を行った。3.５×
１０⁵ 個のプラークに対し、５個の割合で陽性プラーク
が得られた。ＰＣＲにより挿入断片の長さを確認し、約
0.７kbp 〜1.２kbp の長さのｃＤＮＡが挿入されている
ことを確認した。このうち、約1.２kbp のものを上記の
ｃＤＮＡライブラリーのマニュアルに記載の方法により
λ−ＺＡＰIIよりｃＤＮＡを含む断片をプラスミドとし
て回収し、得られたプラスミドをｐＮＸ１０１と命名し
た。ｐＮＸ１０１を数種の制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。その結果を図３に示
す。すなわち図３は約1.２kbp のＤＮＡ断片の制限酵素
地図を示す図である。プラスミドｐＮＸ１０１を用いて
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換体をEscher
ichia coli JM109/pNX101 と命名、表示した。該菌株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１３８０３として寄託されている。 【００６９】プラスミドｐＮＸ１０１を制限酵素Ｓａｃ
Ｉ及びＸｂａＩで切断し、キロシークエンス用デレーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、ベクターに組込ま
れたＤＮＡ断片をＸｂａＩの認識配列側の末端より分解
し、種々の大きさの断片を含むクローンを得た。これら
のクローンを用い、サンガーの方法に従ってＢｃａＢＥ
ＳＴ^TMダイデオキシシークエンシングキット（宝酒造社
製）を用いて約1.２kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定
した。その塩基配列の一部を配列表の配列番号７に示
す。 【００７０】 【発明の効果】本発明により、植物細胞壁の成長の機構
において重要な意義をもつ、ＸＧ分子量の転移反応に関
与するエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺伝子が提供
される。 【００７１】 【配列表】 【００７２】配列番号：1 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端部分フラグメント 起源： 生物名：ビグナ アンギュラリス(Vigna angularis) 配列： Ala Asn Pro Arg Thr Pro Ile Asp Val Pro Phe Gly Arg Asn Tyr 1 5 10 15 Val Pro Thr Trp Ala Phe Asp His Ile Lys Tyr Leu Asn Gly Gly 20 25 30 【００７３】配列番号：2 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCGAYGTGC CGTTYGGGMG NAAYTAYGT 29 【００７４】配列番号：3 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCGACGTGGG CGTTYGAYCA YATHAARTA 29 【００７５】配列番号：4 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGACTTT TTTTTTTTTT TTTTTTT 37 【００７６】配列番号：5 配列の長さ：1133 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源：生物名：ビグナ アンギュラリス(Vigna angular
is) 配列： GTTCTTCTTT GTGGACTTGT CTGATTCTGT TATCACTGGC TTCTGCTTCT TTCGCTGCCA 60 ACCCAAGAAC TCCAATTGAT GTACCATTTG GCAGAAACTA TGTGCCTACT TGGGCCTTTG 120 ATCATATCAA ATATCTCAAT GGAGGTTCTG AGATTCAGCT TCATCTCGAT AAGTACACTG 180 GTACTGGATT CCAGTCCAAA GGGTCATACT TGTTTGGTCA CTTCAGCATG TACATAAAAT 240 TGGTTCCTGG TGATTCAGCT GGCACAGTCA CTGCTTTCTA TTTATCGTCC ACAAACGCAG 300 AACATGATGA AATAGACTTC GAGTTCTTGG GAAACAGAAC TGGGCAACCA TACATTTTAC 360 AAACAAATGT GTTCACCGGA GGCAAAGGTG ACAGAGAGCA GAGAATCTAC CTCTGGTTTG 420 ACCCTACGAC TCAATACCAC AGATATTCAG TGCTATGGAA CATGTACCAG ATTGTATTCT 480 ATGTGGATGA CTACCCAATA AGGGTGTTCA AGAACAGCAA TGACTTGGGA GTGAAGTTCC 540 CCTTCAATCA ACCAATGAAA ATATACAACA GTTTGTGGAA TGCAGATGAC TGGGCTACAA 600 GGGGTGGTTT GGAGAAAACA GATTGGTCCA AAGCCCCCTT CATAGCCTCT TACAAGGGCT 660 TCCACATTGA TGGGTGTGAG GCCTCAGTGA ATGCCAAGTT CTGTGACACA CAAGGCAAGA 720 GGTGGTGGGA TCAACCAGAG TTTCGTGACC TTGATGCTGC TCAGTGGCAA AAACTGGCTT 780 GGGTACGCAA CAAATACACC ATCTACAACT ACTGCACTGA TCGCAAACGC TACTCTCAAG 840 TCCCTCCAGA GTGCACCAGA GACCGTGACA TTTAATCATT TTAACCTATA CTTTAAGGCC 900 TCATTATTTT CAATATCACA CTCCCATAAA GTTCCCACCT AAGTGCTGAT ACAGATTTCA 960 TTTGAGCTTG CTATTGCTTC CTGTATTGTT GATAATCATA TCATCATTTA TTGCTGCTAC 1020 TGTTTGGCTA TGTACCAGAT ATGGCTCTGT GCCTTAATTT GTATCTGTAA TTCTGTTTCA 1080 CTCTGAATCA ATATACTAGT AATACTACTA GTTTATACTG GTTAAAAAAA AAA 1133 【００７７】配列番号：6 配列の長さ：1128 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：トマト(Lycopersicon esculentum) 配列： GAAAAATACA CAAACACTGG TCTCTGATTG GATTTGTTTT TCTCACCATG GGTATCATAA 60 AAGGAGTTTT ATTTAGTATT GTTTTGATTA ATTTGTCACT TGTTGTATTT TGTGGGTATC 120 CTAGAAGGCC AGTAGATGTG CCCTTTTGGA AAAACTATGA GCCAAGTTGG GCTAGTCACC 180 ATATTAAGTT CCTCAATGGT GGTACCACTA CTGATCTTAT TCTCGACAGA TCTTCAGGAG 240 CTGGATTTCA GTCAAAGAAA TCATATCTGT TTGGGCATTT CAGTATGAAA ATGAGGCTTG 300 TTGGTGGAGA CTCAGCTGGT GTTGTCACTG CATTTTACCT GTCATCGAAT AATGCAGAGC 360 ACGATGAGAT AGATTTTGAA TTTTTGGGGA ACAGAACTGG GCAGCCATAC ATATTGCAGA 420 CAAATGTATT CACAGGAGGA AAAGGAAACA GAGAACAGAG AATATATCTT TGGTTTGATC 480 CAACCAAGGG CTACCATTCT TATTCTGTTC TTTGGAATAC ATACCTCATT GTGATCTTTG 540 TGGACGACGT TCCAATTAGA GCATTCAAAA ATTCGAAAGA TCTTGGTGTG AAATTTCCAT 600 TCAATCAGCC CATGAAGATA TACTCGAGTC TATGGGACGC AGATGATTGG GCCACAAGAG 660 GTGGGCTTGA GAAAACCAAT TGGGCCAACG CCCCATTCAC CGCGTCATAC ACATCGTTCC 720 ACGTGGATGG ATGTGAAGCT GCCACGCCAC AAGAAGTCCA AGTTTGTAAC ACTAAAGGCA 780 TGAAATGGTG GGATCAAAAG GCCTTCCAAG ATTTAGATGC ATTACAGTAT AGGAGACTTC 840 GTTGGGTTCG TCAAAAATAC ACTGTTTATA ACTATTGCAC TGATAAAGCG AGGTACCCTG 900 TTCCACCACC AGAGTGCACT AAGGACAGAG ATATTTAAAA TCATAATCAA AATTAAGAGG 960 GACTTTATGA AGAAAAAAAA CTTAATATGC TTTATGTGTG AGTATTTTAA TGATCCTTAA 1020 AACAAAGTGC TTTTAATTGA GCTGTATTTC CCTAATTCTT TTTGAGTGTA TCATTATTGG 1080 TGGAGTCATG AGGATATTAT GTATCTCATG CCAGGCCTTT CATGTCTC 1128 【００７８】配列番号：7 配列の長さ：888 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源：生物名：タバコ(Nicotiana Tabacum) 配列： ATGGGTGTAA AAGGACTTTT GTTTAGTATT GTTTTGATTA ATTTGTCATT ACTAGGACTT 60 TGTGGGTATC CCAGAAAACC AGTGGATGTA CCCTTTTGGA AAAACTATGA GCCCAGTTGG 120 GCTAGTCACC ACATCAAGTA CCTCAGTGGT GGTTCCACTG TTGATCTTGT TCTTGACAGG 180 TCTTCAGGTG CTGGATTTCA GTCAAAGAAA TCATATTTGT TTGGGCACTT TAGCATGAAA 240 CTGAAGCTTG TTGGTGGAGA CTCAGCTGGC GTTGTCACTG CATTTTACCT GTCATCGAAT 300 AATGCAGAGC ACGATGAGAT AGATTTTGAA TTCTTAGGGA ACAGGACTGG GCAACCATAC 360 ATTTTGCAGA CAAATGTGTT CACGGGAGGA AAAGGAGACA GAGAGCAGAG AATCTATCTC 420 TGGTTTGACC CAACCAAGGG TTACCATTCT TATTCTGTTC TTTGGAATAC CTTCCAGATT 480 GTGATCTTTG TGGATGACGT CCCAATTAGA GCATTCAAGA ACTCAAAAGA CCTAGGTGTG 540 AAATTTCCAT TCAATCAGCC CATGAAAATA TACTCAAGCC TTTGGGATGC AGATGATTGG 600 GCCACAAGAG GTGGATTGGA GAAAACAGAC TGGTCCAATG CCCCATTTAC TGCCTCCTAC 660 ACATCATTCC ACGTGGACGG CTGTGAAGCT GCCACCCCAC AAGAAGTCCA AGTTTGTAAC 720 ACCAAAGGCA TGAGATGGTG GGATCAAAAG GCTTTCCAAG ATTTAGATGC TTTACAATAC 780 AGGAGACTTC GTTGGGTTCG CCAAAAATAC ACTATTTATA ATTATTGTAC TGATAGGAAG 840 AGGTACCCTA CACTTCCCCC AGAGTGCACT AAGGACAGAG ATATTTAA 888 【００７９】配列番号：8 配列の長さ：888 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源：生物名：タバコ(Nicotiana Tabacum) 配列： TTAAATATCT CTGTCCTTAG TGCACTCTGG GGGAAGTGTA GGGTACCTCT TCCTATCAGT 60 ACAATAATTA TAAATAGTGT ATTTTTGGCG AACCCAACGA AGTCTCCTGT ATTGTAAAGC 120 ATCTAAATCT TGGAAAGCCT TTTGATCCCA CCATCTCATG CCTTTGGTGT TACAAACTTG 180 GACTTCTTGT GGGGTGGCAG CTTCACAGCC GTCCACGTGG AATGATGTGT AGGAGGCAGT 240 AAATGGGGCA TTGGACCAGT CTGTTTTCTC CAATCCACCT CTTGTGGCCC AATCATCTGC 300 ATCCCAAAGG CTTGAGTATA TTTTCATGGG CTGATTGAAT GGAAATTTCA CACCTAGGTC 360 TTTTGAGTTC TTGAATGCTC TAATTGGGAC GTCATCCACA AAGATCACAA TCTGGAAGGT 420 ATTCCAAAGA ACAGAATAAG AATGGTAACC CTTGGTTGGG TCAAACCAGA GATAGATTCT 480 CTGCTCTCTG TCTCCTTTTC CTCCCGTGAA CACATTTGTC TGCAAAATGT ATGGTTGCCC 540 AGTCCTGTTC CCTAAGAATT CAAAATCTAT CTCATCGTGC TCTGCATTAT TCGATGACAG 600 GTAAAATGCA GTGACAACGC CAGCTGAGTC TCCACCAACA AGCTTCAGTT TCATGCTAAA 660 GTGCCCAAAC AAATATGATT TCTTTGACTG AAATCCAGCA CCTGAAGACC TGTCAAGAAC 720 AAGATCAACA GTGGAACCAC CACTGAGGTA CTTGATGTGG TGACTAGCCC AACTGGGCTC 780 ATAGTTTTTC CAAAAGGGTA CATCCACTGG TTTTCTGGGA TACCCACAAA GTCCTAGTAA 840 TGACAAATTA ATCAAAACAA TACTAAACAA AAGTCCTTTT ACACCCAT 888 【００８０】配列番号：9 配列の長さ：888 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 起源：生物名：タバコ(Nicotiana Tabacum) 配列： UUAAAUAUCU CUGUCCUUAG UGCACUCUGG GGGAAGUGUA GGGUACCUCU UCCUAUCAGU 60 ACAAUAAUUA UAAAUAGUGU AUUUUUGGCG AACCCAACGA AGUCUCCUGU AUUGUAAAGC 120 AUCUAAAUCU UGGAAAGCCU UUUGAUCCCA CCAUCUCAUG CCUUUGGUGU UACAAACUUG 180 GACUUCUUGU GGGGUGGCAG CUUCACAGCC GUCCACGUGG AAUGAUGUGU AGGAGGCAGU 240 AAAUGGGGCA UUGGACCAGU CUGUUUUCUC CAAUCCACCU CUUGUGGCCC AAUCAUCUGC 300 AUCCCAAAGG CUUGAGUAUA UUUUCAUGGG CUGAUUGAAU GGAAAUUUCA CACCUAGGUC 360 UUUUGAGUUC UUGAAUGCUC UAAUUGGGAC GUCAUCCACA AAGAUCACAA UCUGGAAGGU 420 AUUCCAAAGA ACAGAAUAAG AAUGGUAACC CUUGGUUGGG UCAAACCAGA GAUAGAUUCU 480 CUGCUCUCUG UCUCCUUUUC CUCCCGUGAA CACAUUUGUC UGCAAAAUGU AUGGUUGCCC 540 AGUCCUGUUC CCUAAGAAUU CAAAAUCUAU CUCAUCGUGC UCUGCAUUAU UCGAUGACAG 600 GUAAAAUGCA GUGACAACGC CAGCUGAGUC UCCACCAACA AGCUUCAGUU UCAUGCUAAA 660 GUGCCCAAAC AAAUAUGAUU UCUUUGACUG AAAUCCAGCA CCUGAAGACC UGUCAAGAAC 720 AAGAUCAACA GUGGAACCAC CACUGAGGUA CUUGAUGUGG UGACUAGCCC AACUGGGCUC 780 AUAGUUUUUC CAAAAGGGUA CAUCCACUGG UUUUCUGGGA UACCCACAAA GUCCUAGUAA 840 UGACAAAUUA AUCAAAACAA UACUAAACAA AAGUCCUUUU ACACCCAU 888 【００８１】配列番号：10 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGGAGCTCC CATGGGTGTA AAAGGACTTT 30 【００８２】配列番号：11 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAATCTAGAT ACTTAAATAT CTCTGTCCTT 30 【００８３】配列番号：12 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGTCTAGAC CATGGGTGTA AAAGGACTTT 30 【００８４】配列番号：13 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAAGAGCTCT ACTTAAATAT CTCTGTCCTT 30 【００８５】配列番号：14 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTTTCTAGAC CATGGGTATC ATAAAAGGAG 30 【００８６】配列番号：15 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTTGAGCTCC CATGGGTATC ATAAAAGGAG 30

【図面の簡単な説明】 【図１】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。 【図２】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。 【図３】本発明のエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。 【図４】ビグナ アンギュラリスのエンド型ＸＧ転移酵
素の反応の生成物をＰＡＤにより測定したクロマトグラ
フを示す図である。 【図５】ビグナ アンギュラリスのエンド型ＸＧ転移酵
素をコードする遺伝子断片の一例の制限酵素地図を示す
図である。 【図６】トマトのエンド型ＸＧ転移酵素をコードする遺
伝子断片の一例の制限酵素地図を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 平６−86670（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 Escherichia coli JM １ O ９ /pCX １ O １ (F
   ERM P −１３７６８ ) に保持されているプラスミドであ
   る pCX １０１を制限酵素 EcoRI 及びＨ indIII により切断し
   て得られる、下記（１）に示す制限酵素地図で表される
   約１．２ _kbp_ のＤＮＡ断片、 Escheri chia coli J
   M １ O ９ /pRX １ O ２ (FERM BP −４２２１ ) に保持されてい
   るプラスミドである pRX １０２を制限酵素 EcoRI 及びＨ in
   dIII により切断して得られる、下記（２）に示す制限酵
   素地図で表される約１．１ _kbp_ のＤＮＡ断片、並びに E
   scherichia coli JM １ O ９ /pNX １ O １ (FERM P −１３８
   ０３ ) に保持されているプラスミドである pNX １０１を
   制限酵素 SacI 及び XbaI により切断して得られる、下記
   （３）に示す制限酵素地図で表される約１．２ _kbp_ の
   ＤＮＡ断片から選択されるＤＮＡに含まれることを特徴
   とする、エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子をコー
   ドする遺伝子。