FR2674538A1 - Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta 1,3-glucanase bacteries contenant cet adn, cellules vegetales et plantes transformees. - Google Patents

Abstract

1. La présente invention concerne un ADN recombinant qui code pour une protéine à activité beta -1,3-glucanase ou pour un précurseur de cette dernière qui comprend la séquence (a1 ) suivante: (CF DESSIN DANS BOPI) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1 ). Application: ADN recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité beta-1,3-glucanase.

Description

ADN recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité -1,3- glucanase, bactéries contenant cet ADN, cellules végétales et plantes transformées.

L'invention concerne un ADN recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité B-1,3-glucanase, ou pour un précurseur de cette protéine, une bactérie contenant cet ADN recombinant, une cellule végétale, une plante ou une partie de plante, en particulier une semence végétale, transformées par cet ADN recombinant, ainsi que cette nouvelle protéine et un procédé pour la préparer.

Il est connu que les plantes cultivées sont soumises à des attaques par des parasites, tels que les champignons phytopathogènes, qui sont responsables de pertes importantes de récoltes. Le principal moyen actuel de lutte contre ces champignons réside dans l'utilisation de substances chimiques à activité fongicide. On sait aujourd'hui que les plantes réagissent naturellement à ces attaques par divers mécanismes de défense, malheureusement en général à déclenchement trop tardif et d'intensité trop faible, pour être suffisamment efficaces.

Lrun de ces mécanismes comprend l'induction d'une enzyme appelée f3-1,3-glucanase E.C.3.2.1.39 (Kombrink et al., 1988, Pr Ntl
Acad. Sci. USA, 85, 982-986 et Pegg et al., 1981, Physiol. Plant.

Pathol. 19,371-382). Cette induction peut être artificiellement déclenchée sous l'effet d'éliciteurs, c'est-à-dire de composés d'origine biologique capables d'induire dans une plante saine les réactions de défense qu'elle déploie naturellement lors d'une infection par des agents pathogènes, ou d'un déséquilibre hormonal provoqué par l'auxine, les cytokinines ou l'éthylène (Abeles et al., 1971, Plant Physiol. 47,129-134 et de Loose et al., 1988,
Gene, 70,13-23).

Les p-1,3-glucanes sont des polymères linéaires polysaccharidiques constitués d'unités de glucose associées par des liaisons p-1,3 présentant parfois des ramifications de type g-1,4 ou p-1,6 (Farka 1982, in "Fungal protoplasts", Peberdy et Ferencry éditions Dekker Inc). Ces polysaccharides constituent un composant typique du squelette de la paroi de la plupart des champignons et notamment des champignons phytopathogènes. Les -1,3-glucanases sont capables de les dégrader par fragmentation des chaines de B-1,3-glucane. La plupart des p-1,3-glucanases végétales connues sont de type endo.

Il est connu d'autre part que les progrès récents des technologies dites d'ADN recombinant et de la transformation des cellules végétales ainsi que de la régénération de plantes entières à partir de ces dernières, permettent l'introduction d'un gène d'intérêt dans des cellules végétales, une plante ou une partie de plante, de façon à obtenir un phénotype avantageux.

Des séquences d'ADN codant pour plusieurs p-1,3- glucanases végétales, notamment une p-1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (De Loose et al., 1988, Gene, 70,13-23) et une B-1,3-glucanase de soja (Takeuchi et al., 1990, Plant Physiol, 93,673-682) ont été isolées, clonées et déterminées. La demande de brevet EP-A-O 353 191 décrit l'isolement et le clonage de différents fragments d'ADN complémentaire dont l'assemblage permet de déduire la séquence d'ADN complémentaire codant pour une p-1,3- glucanase de tabac, ainsi que de la séquence d'ADN génomique codant pour cette enzyme.Le document EP-O 392 225 divulgue notamment la construction d'un gène chimérique codant pour cette p-1,3-glucanase de tabac, la transformation du tabac par ce dernier et la vérification par Western Blot et révélation à l'aide d'anticorps polyclonaux, de la surexpression de cette protéine endogène dans les plantes transformées. Cette demande de brevet ne montre pas que la p-1,3-glucanase de tabac recombinante est active biologiquement ni a fortiori qu'elle confère une résistance desdites plantes transformées aux agents pathogènes.

On sait, par ailleurs, que les p-1,3-glucanases, telles que par exemple la p-1,3-glucanase de Bacillus substilis, sont des enzymes utiles dans la conversion de la biomasse, notamment dans certains secteurs de l'industrie papetière et dans l'industrie agroalimentaire, en particulier la brasserie (Meaden, 1986, Brewers
Gardian, 115, 7 et MacQueen, octobre 1987, New Scientist, 66).

Il est connu enfin que de nombreuses protéines recombinantes peuvent être produites par des cellules eucaryotes et des bactéries, suite à l'introduction dans celles-ci de gènes codant pour lesdites protéines à l'aide des techniques classiques de génie génétique.

La présente invention concerne un nouvel ADN recombinant caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité p-1,3- glucanase ou pour un précurseur de cette dernière, cette protéine à activité p-1,3-glucanase comprenant la séquence d'acides aminés (a1) suivante :: Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ser Ala Asn Asp
Val Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asn Asn île Lys Arg Met Arg Leu Tyr Asp
Pro Asn Gln Ala Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ser Gly Ile Glu Leu Ile
Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Gly Leu Ala Thr Asn Pro Asp Thr
Ser Arg Gln Trp Val Gln Lys Asn Val Leu Asn Phe Trp Pro Ser Val Lys
Ile Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Val Gly Gly Ser Ser
Ser Val Ala Gln Tyr Val Leu Pro Ala Ile Gln Asn Val Tyr Gln Ala Ile
Arg Ala Gln Gly Leu His Asp Gln île Lys Val Ser Thr Ser Ile Asp Met
Thr Leu Ile Gly Asn Ser Phe Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg Gly Asp
Val Arg Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Ile Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Asn Ala
Pro Leu Leu Val Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Arg
Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ala Pro Asn Val Val Val Trp
Asp Gly Gln Tyr Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Val
His Ala Ala Ile Asp Asn Thr Lys Ile Gly Tyr Val Glu Val Val Val Ser
Glu Ser Gly Trp Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ala Ala Thr Tyr Asp Asn Ala
Arg Val Tyr Leu Asp Asn Leu Val Arg Arg Ala Asn Arg Gly Ser Pro Arg
Arg Pro Ser Lys Pro Thr Glu Thr Tyr île Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn
Gln Lys Asn Pro Glu Ile Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Asn Pro Asn Lys
Gln ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (jazz
Cet ADN recombinant peut comporter immédiatement en aval de la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1) la séquence codant pour la séquence d'acides aminés (a4) suivante ::
Lys Lys Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Gly Lys Arg Leu Gly Lys Val Val Ile
Asp Asp Phe Asn Ala Thr Thr Ser Ile Lys Ser Asp Val tronquée dans sa partie carboxyterminale de O à 29 acides aminés.

Un degré d'homologie élevé signifie ici une homologie (rapport entre les acides aminés identiques et le nombre total d'acides aminés) d'au moins 80 %, et de préférence d'au moins 90 %, des séquences d'acides aminés, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453.

La séquence peptidique déjà connue la plus proche de celle de la séquence (a1) de 307 acides aminés est celle de la protéine de 369 acides aminés déduite de l'ADN complémentaire d'une p1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (cf. la banque de données Swissprot réf. Gus$Nipl. et De Loose et al., 1988, Gene, 70,13-23). Une comparaison de ces deux séquences à l'aide de la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48,443-453, montre que 213 acides aminés sont identiques sur 307, soit une homologie d'environ 69 %. Cette méthode algorithmique, qui considère tous les alignements possibles et crée un alignement, représenté sur la figure 7, dans lequel le plus possible d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignées est minimal, est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - option GAP.

Ce nouvel ADN recombinant peut servir à l'expression de cette protéine à activité B-1,3-glucanase, soit pour conférer à une plante ou une partie de plante qui exprime celle-là, une résistance accrue aux agents pathogènes, soit pour produire cette protéine à l'aide de cellules eucaryotes, notamment les ascomycètes, tels que la levure ou les champignons filamenteux, par exemple,
Cryphonectria parasitica ou les cellules végétales, ou de microorganismes procaryotes, tels que par exemple Escherichia coli.

Cet ADN recombinant comporte de préférence en amont de la séquence codant pour la séquence (a1) ou de la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1) une séquence signal, choisie en fonction de la cellule hôte, qui a pour fonction de permettre l'exportation de la protéine hors du cytoplasme.

Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, tels que par exemple Escherichia coli, cette séquence signal peut être, soit une séquence dérivée d'une séquence codant pour un précurseur naturel d'une protéine exportée par un microorganisme procaryote, par exemple le peptide signal OmpA (Ghrayeb et al., 1984, EMBO Journal, 3, 2437-2442) ou un précurseur de la phosphatase alcaline (J.Bact. 1983, 154, 366-3747), soit une séquence non endogène provenant d'une séquence codant pour précurseur eucaryote (par exemple le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine), soit une séquence codant pour un peptide signal synthétique (par exemple celui décrit dans la demande de brevet FR n0 2 636 643, de séquence
Met Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Cys
Leu Pro Ser Trp Asn Ala Gly Ala.

Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que les ascomycètes, par exemple la levure Saccharomyces cerevisiae ou le champignon filamenteux Cryphonectria parasitica, cette séquence signal est de préférence une séquence dérivée d'une séquence codant pour un précurseur naturel d'une protéine sécrétée par ces cellules, par exemple pour la levure le précurseur de l'invertase (demande de brevet EP-O 123 289) ou le précurseur de la séquence prépro de la phéromone alpha (demande de brevet
DK 2484/84), ou pour Cryphonectria parasitica, le précurseur de la séquence prépro de l'endothiapepsine, de séquence
Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly
Ala Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn Ala Ser
Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg Asn Pro Asn
Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly
Val Pro Ile Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln Asn Ser Thr Ser Gly
Leu Ala Glu Arg
Pour une expression dans les cellules végétales, on utilise comme séquence signal, soit une séquence codant pour le peptide signal d'une protéine de cellule végétale connue pour être exportée, par exemple,
Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu Thr Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val
Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala soit une séquence signal codant pour le peptide signal de séquence (a2) suivante
Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu
Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly le peptide signal codé par la séquence signal pouvant éventuellement être séparé de la séquence (a1) dans la protéine codée par un ou plusieurs acides aminés, en particulier par la séquence d'acides aminés (a3) suivante
Asn Leu Arg Met Ala Asp Ala Gln
Les séquences d'acides aminés (a1), (a2), (a3) et (a4) peuvent, par exemple, être codées par les séquences nucléotidiques (Na1), (Na2), (Na3) et (Na4) ci-après (nua1) =
ATTGGTGTGT GTTATGGCAT GCTGGGCAAC AATCTACCGT CAGCAAACGA TGTTATAGGT
CTTTATAGAT CAAATAACAT AAAGAGAATG AGACTCTATG ATCCTAATCA AGCTGCTCTA
GAAGCACTTA GAAATTCTGG CATTGAACTC ATTCTTGGGG TGCCAAACTC TGACCTTCAA
GGCCTTGCCA CCAATCCTGA CACTTCTCGT CAATGGGTGC AAAAAAACGT GTTGAACTTT
TGGCCTAGTG TCAAAATCAA GTACGTGGCA GTTGGAAATG AAGTGAGTCC CGTTGGAGGC
TCTTCTTCGG TAGCCCAATA TGTTCTACCT GCCATCCAAA ATGTATACCA AGCAATAAGA
GCTCAAGGCC TTCATGATCA AATCAAGGTT TCAACATCTA TTGACATGAC CCTAATAGGA
AACTCTTTCC CTCCATCGCA AGGTTCCTTC AGGGGTGATG TGAGATCATA CCTAGATCCC
ATAATTGGGT ACTTGGTATA TGCAAATGCA CCATTACTAG TCAATGTGTA CCCTTATTTT
AGTTACACTG GTAACCCCCG TGACATATCA CTTCCCTATG CTCTTTTCAC AGCACCAAAT
GTTGTGGTAT GGGATGGTCA ATATGGGTAC CAAAATTTGT TTGATGCTAT GTTGGATTCA
GTACATGCAG CCATTGATAA CACTAAGATT GGTTATGTGG AGGTTGTTGT ATCCGAGAGT
GGGTGGCCAT CAGATGGAGG ATTTGCTGCC ACTTATGACA ACGCACGCGT GTACTTAGAC
AATTTGGTTC GTCGTGCTAA TAGAGGAAGC CCAAGAAGGC CTTCGAAGCC CACTGAGACT
TATATATTTG CCATGTTCGA TGAAAATCAA AAAAATCCAG AGATAGAGAA ACATTTTGGG
CTCTTCAATC CCAACAAACA A (Na
ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG
GAACTATTGA CAGGA (Na3) :
AACCTTCGCA TGGCAGATGC TCAA (Na
AAAAAATACC CATTTGGGTT TGGAGGAAAG AGGCTAGGGA AAGTTGTTAT TGACGACTTC
AATGCAACAA CTTCCATTAA GAGTGATGTG
L'invention concerne aussi une unité d'expression de l'ADN recombinant défini pécédemment, portée avantageusement par un vecteur, dit vecteur d'expression.

Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, en particulier dans Escherichia coli, I'ADN recombinant doit être inséré dans une unité d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de transcription efficace en aval du gène à exprimer. Cette unité doit également comporter un marqueur de sélection ou être introduite dans la cellule hôte en même temps qu'une unité d'expression d'un marqueur de sélection (par exemple à l'aide d'un vecteur d'expression qui porte ces deux unités). Toutes ces séquences doivent être choisies en fonction de la cellule hôte.

Pour une expression dans les cellules eucaryotes, telles que les ascomycètes, l'unité d'expression selon l'invention comprend l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression.

Pour une expression dans les cellules ascomycètes, telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insérer l'ADN recombinant entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription. L'unité d'expression porte un marqueur de sélection ou est introduite dans la cellule hôte en même temps qu'un marqueur de sélection. De préférence, ce marqueur de sélection est un marqueur auxotrophe (qui complémente une mutation des cellules réceptrices) qui permet la sélection des cellules qui ont intégré l'ADN recombinant en un nombre de copies élevé, soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie.Pour une expression dans les cellules ascomycètes, telles que celles des champignons filamenteux, par exemple ceux des genres Aspergillus, Neurospora,
Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, l'unité d'expression selon l'invention porte l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, et éventuellement un marqueur de sélection et/ou des séquences télomériques. il est en effet possible de sélectionner les transformants ayant intégré un ADN d'intérêt à l'aide d'un marqueur de sélection situé soit sur la même unité que l'ADN d'intérêt, soit sur une autre unité, ces deux unités étant alors introduites par cotransformation. L'ADN recombinant de l'invention peut être soit intégré au génome des champignons filamenteux, soit conservé sous forme extrachromosomique grâce à des séquences permettant la réplication et la partition de cet ADN.

Pour une expression dans les cellules végétales, il convient d'insérer l'ADN recombinant défini précédemment entre un promoteur et un terminateur efficaces dans les végétaux.

Le promoteur est de préférence un promoteur constitutif fort, par exemple le promoteur 35S du virus de la mosaique du chou-fleur, ou un promoteur commandant une expression tissu - ou organe - spécifique comme le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase-oxygénase qui s'exprime préférentiellement dans les feuilles et tout particulièrement les tissus du mésophylle (Kuhlemeier et al., 1987, Ann Rev Plant
Physiol 38 : 221-257).On peut également utiliser un promoteur spécifique commandant par exemple une expression dans les graines ou au cours d'un stade précis du développement de la plante, ou un promoteur inductible à la suite d'un choc thermique, d'une blessure ou de l'interaction entre la plante et des parasites (Kuhlemeier et al., 1987 référence citée ci-dessus), si une expression de l'ADN recombinant est recherchée dans ces situations.

On utilise la séquence terminatrice, comportant des sites de polyadénylation pouvant être isolée de gènes végétaux ou de gènes s'exprimant dans les végétaux, comme par exemple le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens.

L'invention concerne également une bactérie, par exemple de l'espèce E. coli, qui contient l'ADN recombinant défini précédemment, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expression. Cette bactérie peut être utilisée dans la préparation d'une protéine à activité p-1,3-glucanase.

L'invention a également trait à une bactérie, par exemple de l'espèce E. coli, qui contient l'ADN recombinant défini cidessus avec les moyens permettant sa réplication, laquelle donc peut servir au clonage de cet ADN recombinant et ainsi qu'à une bactérie susceptible d'infecter une plante avec transfert de matériel génétique, par exemple de l'une des espèces Agrobacterium rhizogenes et Agrobacterium tumefaciens, qui contient cet ADN dans un contexte permettant sa réplication et donc peut servir à transformer des cellules végétales. La transformation des cellules végétales par I'ADN recombinant ci-dessus peut également être effectuée par une autre méthode biologique telle que la voie du tube pollinique (Zhong-xun Luo et al., Plant Molec. Biol.Rep., 1988, 6, 165176) et la transformation directe de graines en germination (Toepfer R. et al., 1989, The Plant Cell., 1, 133-139), ou par une méthode physique telle que l'utilisation de polyéthylèneglycol, l'électroporation (Chistou P. et al., 1987, Proc. Ntl. Acad. Sci.

USA, 84, 3662-3699) et le bombardement à l'aide de microprojectiles (Klein T.M. et al., 1988, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 85, 85028505).

L'invention concerne également une cellule végétale caractérisée en ce qu'elle est transformée par l'ADN recombinant défini précédemment, avec les moyens nécessaires à son expression.

Cette cellule végétale peut provenir d'une espèce de grande culture, telle que par exemple le mais, le soja, la betterave, le blé, l'orge, le pavot, le colza, le tournesol, la luzerne et le sorgho, d'une espèce florale telle que le rosier, l'oeillet, le gerbera ou d'une espèce potagère telle que la carotte, la tomate, la salade, la chicorée, le poivron, le melon et le chou. Des especes particulièrement appréciées sont le colza Brassica napus, le tournesol Helianthus annuus et le tabac Nicotiana tabacum.

L'étape de transformation qui concerne une ou quelques cellules est suivie d'une étape de multiplication de ces cellules transformées de façon à obtenir des cals, lesquels peuvent donner naissance à des plantes transformées, par des processus d'organogénèse ou d'embryogénèse.

L'invention concerne donc aussi une plante ou une partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment. Une partie de plante particulièrement appréciée est la partie apte à former une nouvelle plante complète, notamment après semis, enfouissement ou repiquage, ou à produire des semences. Une telle partie est par exemple un grain, une graine, une semence, une bouture, une marcotte, etc. Ces plantes peuvent être l'une quelconque des espèces ci-dessus et plus particulièrement des espèces
Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.

L'invention a également trait à un procédé pour obtenir des plantes résistantes aux parasites, tels que les champignons phytopathogènes, qui comprend une étape de transformation de cellules végétales par cet ADN recombinant, suivie d'une étape de multiplication des cellules transformées et d'une étape de régénération des plantes.

De préférence, l'étape de transformation des cellules végétales est effectuée in vitro à l'aide d'une agrobactérie (c'est-à-dire d'une bactérie du genre Agrobacterium) ayant intégré I'ADN recombinant d'intérêt.

L'invention concerne aussi les plantes résistantes aux agents pathogènes susceptibles d'être obtenues à l'aide du procédé défini ci-dessus.

L'invention a également trait à l'utilisation d'une plante contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment, comme géniteur dans un programme de sélection pour créer de nouvelles variétés végétales.

L'invention concerne aussi une nouvelle protéine à activité ss-1,3-glucanase, qui comprend la séquence (a1) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (al)- Cette protéine peut comporter immédiatement en aval de la séquence (a1) la séquence (a4) tronquée dans sa partie carboxyterminale de O à 29 acides aminés.

Cette protéine présente de préférence une masse moléculaire apparente de 36 + 3, 37 + 3 ou 39 + 3 kDa. Dans le cas ou elle a une masse moléculaire apparente de 37 + 3 kDa elle comprend avantageusement la séquence (a3) immédiatement en amont de la séquence (a1) ou de la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a
Cette protéine présente un intérêt comme enzyme de conversion de la biomasse qui contient des p-1,3-glucanes, notamment dans certains secteurs de l'industrie papetière et dans l'industrie agroalimentaire, en particulier la brasserie.

L'invention a également trait à un procédé de préparation de cette protéine qui comprend la mise en culture de bactéries, cellules végétales, cals végétaux, de plantes ou de parties de plantes contenant I'ADN recombinant défini précédemment, la lyse de ceux-ci, l'isolement et la purification de cette protéine.

L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ciaprès, divisé en sections, qui comprend des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certaines de ces sections concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention et d'autres des exemples de réalisation de l'invention donnés bien sûr à titre purement illustratif.

Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook et al. : "Molecular cloning : a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à
New York (2e édition).

La description ci-après sera mieux comprise en se reportant aux figures 1 à 7.

La figure 1 représente une carte de restriction du fragment HindIII-EcoRI contenu dans le plasmide pBR1310 et contenant l'ADN complémentaire codant pour la p-1,3-glucanase de soja.

La figure 2 représente la séquence nucléotidique de l'insert HindIII-HindIII, partie de l'ADN complémentaire de la p- 1,3-glucanase de soja, les sites de restriction utilisés pour le clonage dans M13mp19 et pour les constructions ultérieures étant indiqués par des flèches, ainsi que la séquence peptidique déduite de cet ADN complémentaire.

La figure 3 représente la séquence nucléotidique du fragment HindIII-HindIII de l'ADN complémentaire de la p-1,3-glucanase de soja, après mutagenèse (à l'issue de la section 6c), les sites de restriction utilisés pour le clonage dans M13mp19 et pour les constructions ultérieures étant indiqués par des flèches, ainsi que la séquence peptidique de la protéine traduite.

La figure 4 représente la séquence nucléotidique du fragment NdeI-HindIII de la partie codante du plasmide pBR59, plasmide d'expression dans E. coli, encadrée par les sites de restriction
NdeI et HindIII et la séquence peptidique de la protéine traduite.

La figure 5 représente la séquence nucléotidique du gène recombinant complet et la séquence peptidique de la protéine traduite.

La figure 6 représente la séquence peptidique de la partie commune des protéines traduites dans E. coli et dans le tabac.

La figure 7 représente un alignement d'après la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453, de la séquence peptidique déduite de l'ADN complémentaire de la p-1,3glucanase de soja (cf. figure 2) et de la séquence peptidique connue la plus proche, celle déduite de l'ADN complémentaire de la p-1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (banque de données
Swissprot réf. Gub$-Nipl).

Section 1 : Préparation d'anticorps polyclonaux contre la p-1,3
glucanase de tabac a) Purification de la p-1,3-glucanase de tabac.

Une p-1,3-glucanase de tabac a été purifiée jusqu'à homogénéité à partir de cals de tabac comme décrit ci-après. Des cals de tabac ont été cultivés in vitro sur un milieu de Murashige et
Skoog (Murashige T. et Skoog F., 1962, Physiol. Plant., 15, 473497). Des extraits cellulaires sont obtenus par broyage du matériel végétal dans une solution tampon Tris-HCl 50mM pH 8,4 contenant 15 mM de p-mercaptoéthanol et 5 % de polyvinylpolypyrrolidone.

La protéine est purifiée à partir de cet extrait par precipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie en phase liquide sur une colonne échangeuse de cations à base de polymère synthétique, et chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé selon le protocole décrit ci-après :
Etape 1 :
L'extrait protéique est traité par le sulfate d'ammonium (43 % de saturation). Les protéines ayant précipité sont recueillies par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solubilisées dans une solution tampon (acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2) et dialysées pendant une nuit à 40C contre une solution tampon acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2.

Extemporanément, la concentration en acétate de la solution tampon de l'extrait protéique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à l'emploi (PD10 Pharmacia).

Etape 2 :
L'extrait protéique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions à base de polymère synthétique (colonne
Mono-S de Pharmacia) selon la technique FPLC de Pharmacia.

L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient linéaire de 10 à 500 mM d'acétate d'ammonium.

A chaque étape, la f3-1,3-glucanase est identifiée par son poids moléculaire (Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS - révélation à l'argent) et son activité est mesurée par une méthode colorimétrique (cf. section 8, ci-après) utilisant la laminarine (p-1,3-glucane extrait de Laminaria digitata
Sigma - réf. L9634) comme substrat.

b) Préparation d'anticorps polyclonaux.

On a ensuite injecté à des lapins 25 ug de p-1,3glucanase de tabac dans 500 ul d'adjuvant complet de Freund.

Trois injections de rappel de 25 ug dans l'adjuvant incomplet de
Freund (500 ,ul) ont été réalisées à 3 semaines d'intervalle.

L'immunsérum a été prélevé 3 semaines après la dernière injection.

Cet immunsérum reconnaît la p-1,3-glucanase de tabac, il reconnaît également la p-1,3-glucanase de soja. On a en effet vérifié qu'il permet de révéler cette dernière protéine par la technique de Western Blot (décrite dans la section 13 ci-après) à partir d'un extrait des protéines totales de soja (Glycine max cv
Mandarin).

Section 2 : Construction d'une banque phagique d'ADN complémentaire
a partir d'ARN messagers de cultures cellulaires de
soja.

a)- Préparation d'ARN messagers de cellules de soja.

Les ARN totaux de cellules de soja âgées de 5 jours (Glycine max cv Mandarin), cultivées in vitro en absence d'auxine selon la méthode décrite par Leguay et al., 1987, Develop. Genetics 8 : 351-364, ont été extraits selon la méthode décrite par
Jouanneau et al., 1984 Plant Physiol 74 ; 663-668, résumée ciaprès. Les cellules préalablement lavées dans une solution saline sont broyées dans l'azote liquide ; l'homogénéisat est ensuite extrait par un mélange de phénol redistillé et de chloroforme.

Après une étape de précipitation éthanolique, les ARN totaux sont dissous dans une solution tamponnée à pH 7,6.

La fraction poly (A) + des ARN messagers (ARNm) a été isolée après 2 cycles de chromatographie d'affinité sur une colonne d'oligo (dT) cellulose comme décrit dans Sambrook et al.

("Molecular cloning : A Laboratory manual", second Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory 1989). La quantification des ARN messagers est réalisée par spectrophotométrie selon un protocole bien connu de l'homme de l'art.

b) Synthèse des ADN complémentaires.

Les ADN complémentaires (ADNc) ont été synthétisés selon la méthode décrite par Gübler et Hoffman, 1983 (Gene, 25 : 263269), méthode qui favorise la synthèse et le clonage d'ADNc complets : 7 ,ug d'ARNm ont ainsi été traités pour la fabrication du premier brin d'ADNc à l'aide du kit "Protoclone GT system" de
Promega (réf. P3010).

c) Clonage des ADN complémentaires.

L'ADNc double brin synthétisé est ensuite méthylé à l'aide de la méthylase EcoRI dans les conditions décrites dans l'ouvrage de référence Sambrook et al. (op cité). Cette enzyme permet de protéger les sites éventuels EcoRI de l'ADNc contre une coupure par ltendonucléase EcoRI, cette protection disparaissant pour les répliques de l'ADNc (qui ne sont pas méthylées).

Des linkers synthétiques EcoRI (fragments d'ADN double brin contenant le site EcoRI) sont alors rajoutés par ligation aux extrémités de l'ADNc. Après coupure par l'endonucîéase EcoRI et élimination des linkers par chromatographie sur une colonne de tamis moléculaire G50 (Pharmacia), l'ADNc est ligué à l'aide de la
T4 DNA ligase dans le phage lambda gtlî, vecteur de clonage et d'expression décrit par Huynh et al., "DNA cloning : a pratical approach" IRL Press, D.M. Glover 1985, p. 49, selon le protocole "lambda gt11 system", de Promega (réf-T3011), l'ADN phagique étant préalablement ouvert par l'endonucléase de restriction EcoRI et déphosphorylé.Des parties aliquotes du milieu de ligation sont ensuite empaquetées dans des particules phagiques en utilisant le kit commercialisé par Amersham ("In vitro packaging system for lambda DNA", réf. N334).

Le nombre de recombinants est ensuite estimé par comptage des plages de lyse obtenues sur un tapis bactérien de la souche
E. coli Y1090 (Sambrook, et al., réf. ci-dessus, op. cité). Environ 106 clones ont été obtenus. L'étalement d'une partie aliquote de la suspension phagique sur un tapis bactérien en présence de X-gal (bromo-5-chloro-4-indolyl-3-p-D-galactoside) et d'isopropylthio-p
D-galactoside (IPTG), selon la technique décrite par Huynh et al., réf. ci-dessus, a permis de déterminer que 81 % de ces phages ont intégré un ADNc de soja.

Section 3 : Criblage immunologique de la banque phagique d'ADN com
plémentaire construite à partir des ARN messagers de
cellules de soja.

La réalisation d'une banque dans le vecteur lambda gt11 permet de réaliser l'expression des ADNc clonés, c'est-à-dire de faire synthétiser les protéines codées par les ARN messagers qui ont servi à construire cette banque. Cette synthèse se fait après induction par l'iPTG (isopropylthio-p-D-galactoside) ; les protéines synthétisées peuvent alors être reconnues par les anticorps obtenus contre la p-1,3-glucanase de tabac (cf. section 1). Les clones produisant ces protéines peuvent ensuite être repérés et isolés selon un protocole connu de l'homme de l'art et décrit par exemple dans Sambrook et al. (op. cité).

106 phages de la bande d'ADNc de soja sont étalés sur des boites de Pétri et des plages de lyse sont obtenues au bout de 2 h 30 min d'incubation à 420C. Un filtre de nitrocellulose (Schleicher et Schüll, BA 85) imprégné d'IPTG est déposé sur la surface des boites et laissé en contact avec le milieu gélosé pendant 4 h à la température de 370C, puis remplacé par un second filtre qui est laissé pendant 6 h sur le même milieu.

Les filtres retirés de la boite sont ensuite immergés pendant 30 min dans une solution, appelée solution TNT, composée de 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % du détergent Tween 20, puis pendant 30 min dans un tampon appelé tampon de blocage, composé de gélatine en solution à 1 % dans la solution TNT. Les filtres sont alors traités pendant 3 h dans une solution renfermant les anticorps polyclonaux anti p-1,3-glucanase obtenus précédemment (cf. section 1), dilués dans le tampon de blocage. Ils ont ensuite été immergés pendant 10 min successivement dans chacune des solutions suivantes : Solution TNT + 0,1 % BSA (albumine de sérum bovin) Solution TNT + 0,1 % BSA + 0,1 % de détergent Nonidet P40 (Sigma) Solution TNT + 0,1 % BSA.

Le complexe antigène-anticorps formé est ensuite révélé à l'aide d'anticorps secondaires conjugués par couplage avec une peroxydase ("Immuno conjugate GAR/IgG (H+L)/Po" de Nordic
Immunology, Tilburg, Pays-Bas). La réaction chimique de révélation utilise le chloro-4 naphtol-1 comme substrat chromogène (donnant un précipité bleu). Les plages de lyse positives, c'est-à-dire correspondant à des clones qui synthétisent la p-1,3-glucanase, sont alors repérées sur la boite de Pétri et les bactériophages sont prélevés pour être purifiés grâce à un criblage immunologique secondaire, conduit de façon strictement identique au criblage primaire. Un de ces clones a été retenu pour la suite de l'étude
Section 4 : Caractérisation partielle de l'ADN phagique du clone de
p-1,3-glucanase du soja.

a) Préparation de l'ADN phagique.

Le clone phagique retenu est amplifié et son ADN est extrait selon le protocole décrit dans le kit d'Amersham "cDNA cloning system GT11" (réf. RPN 1280), résumé ci-après. Les phages sont prélevés par carottage et transférés dans une culture de la souche E. coli Y1090 ; au bout de 15 min, 5 ml de milieu Luria (Gibco) contenant 5 mM de CaCl2 et 50 ,ug/ml d'ampicilline sont rajoutés. Après une incubation pendant 4 h à 430C sous agitation, la culture est centrifugée à 3 000 tr/min pendant 10 min. L'ADN des particules phagiques présentes dans le surnageant est ensuite extrait et purifié par traitement au polyéthylèneglycol et chlorure du sodium NaCl, centrifugation, traitement à la protéinase K et précipitation.

b) Analyse de l'ADN phagique des clones sélectionnés
L'ADN des clones de p-1,3-glucanase a été hydrolysé par l'enzyme de restriction EcoRI. On obtient ainsi un seul fragment
EcoRI-EcoRI de 2 300 pb environ par coupure au niveau des sites de clonage. il n'y a donc pas de site EcoRI dans I'ADN complémentaire.

L'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments obtenus par l'action de plusieurs endonucléases sur le fragment EcoRI-EcoRI d'environ 2 300 pb a permis de montrer que celui-ci contient un site PvuII à quelques paires de bases d'un des sites EcoRI.

Section 5 : Construction du plasmide pBR1310, isolement de l'insert
d'ADN complémentaire codant pour la p-1,3-glucanase de
soja et détermination de sa séquence.

a) Clonage dans le plasmide pGEM-3Z
Par hydrolyse du clone retenu à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et PvuII, le fragment EcoRI-PvuII d'environ 2 300 pb contenant l'ADNc de p-1,3-glucanase de soja a été isolé, après une électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion.

Le plasmide pGEM-3Z (Promega, Madison, Wi, E.U.A.) a été ouvert à l'aide des endonucléases de restriction EcoRI et SmaI, puis purifié et isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion. Ce plasmide comprend un "polylinker" (multisite de clonage) comportant successivement les sites de restriction EcoRI,
SmaI et HindIII.

La ligation à l'aide de l'ADN ligase T4 dans ce plasmide ainsi ouvert du fragment EcoRI-PvuII d'environ 2 300 pb contenant I'ADNc codant pour la p-1,3-glucanase de soja permet d'obtenir un plasmide, appelé plasmide pBR1310 (ligation des extrémités franches
SmaI et PvuII avec disparition de ces sites) qui est cloné dans la bactérie E. coli souche JM109 (Sambrook et al., op. cité). Le vecteur obtenu a ensuite été extrait et purifié par la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, dans Sambrook et al., op.

cité).

L'utilisation de plusieurs enzymes de restriction a permis d'établir la carte de restriction du fragment HindIII-EcoRI contenu dans le plasmide pBR1310 et contenant l'ADNc codant pour la p-1,3-glucanase, représentée sur la figure 1.

Le fragment HindIII-HindIII (de 1490 pb environ), a été préparé par digestion du fragment HindIII-EcoRI par l'endonucléase
HindIII, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion et isolé. Ce fragment a été cloné dans l'ADN de la forme replicative du phage simple brin M13mp19 (Pharmacia) ouvert au site de restriction HindIII. Le vecteur M13 renfermant I'insert HindIII
HindIII de 1490 pb est appelé M13BR137. La séquence de cet insert a été déterminée selon la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et al., PNAS-USA, 14, 5463-5467, 1977).

b) Analyse de la séquence de l'ADNc de la p-1,3-glucanase de soja.

La description ci-après sera mieux comprise à l'aide de la figure 2.

Cette séquence renferme une seule phase de lecture ouverte (non interrompue par un codon stop) compatible avec le poids moléculaire apparent observé par électrophorèse sur gel d'agarose : la séquence commençant par un codon ATG en position 114 et terminée par le codon stop TAA en position 1226 codant pour une protéine de 370 acides aminés.

Le logiciel UWGCG de l'Université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl.Ac.Res., 12, 8711-8721- option : Recherche de peptide-signal d'après la méthode de G. von Heijne, 1986,
Nucl.Ac.Res., 14, 483-490, prévoit dans cette séquence une seule partie codant pour un peptide signal pour une expression dans les cellules eucaryotes, la séquence suivante (Na2) appelée séquence pré (commençant au nucléotide 114 et se terminant au nucléotide 188) =
ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG
GAACTATTGA CAGGA codant pour le peptide-signal de 25 acides aminés de séquence (a2) suivante ::
Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu
Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly
Un peptide-signal est attendu par l'homme de l'art car les p-1,3-glucanases sont des protéines qui peuvent être naturelle ment, soit accumulées dans les vacuoles de cellules végétales, soit sécrétées, ce qui exige la présence d'un peptide-signal.

Ce logiciel prévoit pour une expression dans les cellules procryotes une seule partie codant pour un peptide-signal, la séquence suivante, appelée ici séquence pré-procaryote (commençant au nucléotide 114 et se terminant au nucléotide 209)
ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG
GAACTATTGA CAGGAAACCT TCGCATGGCA GATGCT codant pour un peptide-signal de 32 acides aminés de séquence ::
Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu
Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Asn Leu Arg Met Ala Asp Ala
La séquence peptidique déjà connue la plus proche de celle de la protéine de 370 acides aminés déduite de l'ADN complé mentaire de la p-1,3-glucanase de soja est celle de la protéine de 369 aminés déduite de l'ADN complémentaire d'une p-1,3-glucanase de
Nicotiana plumbaginifolia (cf. la banque de données Swissprot réf.

GubSNipl. et De Loose et al., 1988, Gene, 70, 13-23).

Une comparaison de ces deux séquences à l'aide de la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol, 48,443-453, mise en oeuvre dans le logiciel UWGCG de l'université de
Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl.Ac.Res. 12,8711-8721, option GAP, montre que 224 acides aminés sont identiques, soit une homologie d'environ 60 %. Cette méthode algorithmique considère tous les alignements possibles et crée un alignement, représenté sur la figure 7, dans lequel le plus possible d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignées est minimal.

Section 6 : Construction d'un vecteur d'expression dans E. coli :
le plasmide pBR59.

a) Mutagénèse silencieuse de la partie codante pour éliminer le
site de restriction SacI (en position 575) de la partie codante.

La séquence GAG CTC du site de restriction SacI situé en position 575 du vecteur M13BR137, est remplacée par mutagénèse dirigée comme décrit ci-après, par la séquence GAG CAC. Le codon
GCT, correspondant à un résidu alanine dans la séquence initiale d'ADNc, est donc remplacé par le codon GCA correspondant également à un résidu alanine (mutation silencieuse).

La forme simple brin du vecteur M13BR137 est isolée selon le protocole décrit par Sambrook et al., op cité à partir d'une culture de la souche bactérienne E. coli DH5aF' (Gibco-BRL) préalablement transformée par ce vecteur selon le protocole préconisé par le fabricant. Sur cette matrice simple brin, la mutagénèse est effectuée suivant le protocole du kit "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system" (Amersham-réf. RPN 1523-version 2), à l'aide d'un oligonucléotide synthétisé chimiquement sur le synthétiseur d'ADN Biosearch 8700 de Millipore, dont la séquence est représentée ci-dessous ::
GATCATGAAG GCCTTGTGCT CTTATTGCTT GG
La technique de mutagénèse dirigée décrite en détail dans le livret accompagnant ce kit et résumée ci-après, consiste à hybrider l'oligonucléotide ci-dessus avec la forme simple brin du vecteur M13BR137, puis à faire agir la polymérase de Klenow et l'ADN ligase T4 en présence de thionucléotide dCTP-a-S (a-thio- désoxycytidine triphosphonate) de façon à obtenir une forme circulaire double brin du phage recombinant, dont l'un des brins porte la mutation souhaitée et est protégé vis-à-vis de la coupure par l'endonucléase NciI et de la dégradation par l'exonucléase III. On induit alors sur l'autre brin (ayant servi de matrice) une césure à l'aide de l'endonucléase NciI, puis ce brin est éliminé par l'action ultérieure de I'exonucléase III.

Le vecteur résultant, appelé vecteur M13BR138, a été cloné dans la souche E. coli DHSaF' et séquencé ; il présente, comme attendu, une séquence mutée par remplacement d'un codon GCT par un codon GCA, lequel a supprimé le site de restriction SacI de la partie codante.

b) Mutagénèse de la partie 5' de l'insert codant pour la p-1,3-
glucanase de soja pour introduire les sites de restriction NdeI
et BamHI.

La forme simple brin du vecteur M13BR138 est isolée comme décrit plus haut, une mutagénèse dirigée est ensuite réalisée dans les mêmes conditions que précédemment en utilisant l'oligonucléotide synthétisé chimiquement et dont la séquence est reportée ci-après :
GAGAAGGCAT GGATCCAAAC ATATGAATAC ACCAC
Le vecteur issu de cette mutagénèse, appelé vecteur
M13BR139, est cloné dans la souche bactérienne E. coli DH5αF' ; il a- été séquencé, ce qui a confirmé l'introduction en amont du codon
ATG d'initiation de la traduction, des sites de restriction NdeI et
BamHI.

c) Mutagénèse de la partie 3' de l'insert du vecteur M13BR139 pour
introduire les sites de restriction HindIII et SacI.

La forme simple brin du vecteur M13BR139 est isolée, une mutagénèse dirigée est ensuite réalisée sur la partie 3' de l'insert à l'aide de l'oligonucléotide de séquence suivante et dans les conditions déjà décrites :
CAGAGATTTT GAAGCTTAGG AGCTCAACCT TACACATC
Le vecteur résultant de cette mutagénèse appelé vecteur
M13BR140, est cloné dans la souche bactérienne E. coli DHSaF'. Sa séquence a été déterminée, ce qui a confirmé la création en aval du codon stop TAA des sites de restriction HindIII et SacI. Cette séquence est représentée sur la figure 3.

d) Construction du plasmide pBR141.

La forme réplicative du vecteur M13BR140 est isolée et purifiée selon le protocole de Birnboim et Doly décrit dans
Sambrook et al., op. cité. L'insert NdeI-HindIII renfermant la partie codante de la p-1,3-çlucanase a été isolé par digestion par les enzymes de restriction NdeI et HindIII et purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et électroélution (Sambrook et al., op.

cité). Cet insert est ensuite ligué à l'aide de T4 DNA ligase dans le grand fragment NdeI-HindIII du plasmide p373,2, dont la construction et les éléments constitutifs sont décrits dans la demande de brevet EP-A-0360641 (la figure 3 de ce document représente la carte de restriction de ce plasmide), préalablement ouvert par digestion avec les enzymes de restriction NdeI et HindIII.Ce grand fragment contient notamment, successivement de l'extrémité NdeI à l'extrémité Hindiii, un promoteur analogue du promoteur "tac" (Sambrook et al., op. cité) inductible par l'isopropyl-p-D-galac- toside, un gène codant pour la ss-lactamase (conférant la résistance à l'ampicilline) dans un contexte permettant son expression, une origine de réplication dans E. coli et un terminateur de transcription dérivé du phage fd. Le vecteur obtenu, appelé plasmide pBR141 est cloné dans la souche E. coli RR1. La structure du plasmide est vérifiée par la réalisation d'une carte de restriction.

e) Construction du plasmide pBR59
L'ADN plasmidique du clone contenant le plasmide pBR141 est extrait selon le protocole de Birnboim et Doly (Sambrook et al., op. cité).

L'élimination de la séquence pré-procaryote prévue (cf.

section 5) de la p-1,3-glucanase de soja est réalisée par élimina- tion de la séquence comprise entre les sites de restriction NdeI et
SphI et remplacement de cette séquence par le linker synthétique de séquence donnée ci-après :
TATGATTGGT GTGTGTTATG GCATGACTAA CCACACACAA TACC de façon à reconstituer la séquence codant pour la protéine dépourvue du peptide-signal prévu dans les cellules procaryotes, le premier acide aminé de cette dernière : le résidu glutamine (susceptible de se cycliser en pyroglutamate, ce qui rend impossible la détermination de la séquence amino-terminale) étant remplacé par un résidu méthionine initiateur de traduction.

La ligation de ce linker à l'aide de T4 DNA ligase permet d'obtenir un plasmide, appelé plasmide pBR59, lequel est cloné dans la souche bactérienne E. coli RR1. Dans ce vecteur, la p-1,3- glucanase est sous le contrôle d'un promoteur (décrit dans la demande de brevet EP-A-0360641) analogue du promoteur "tac" (Sambrook et al., op. cité) inductible par llisopropylthio-ss-D galactoside (IPTG). La séquence de la partie codante du plasmide pBR59, encadrée par les sites NdeI et HindIII, est représentée sur la figure 4.

Section 7 : Expression de la p-1,3-glucanase de soja dans E. coli.

La souche de E. coli RR1 contenant le vecteur d'expression pBR59 et une souche E. coli RR1 contenant le plasmide p373,2 sont cultivées dans le milieu Luria (Gibco) contenant 100 mg/l de l'antibiotique ampicilline pendant une nuit à 370C. Après une dilu tion de la culture au 1/100ème dans le même milieu, les bactéries sont remises en culture durant 1 heure à 370C, puis de l'iPTG est ajouté à une concentration finale 1 mM. La culture est alors poursuivie pendant 3 heures et les bactéries sont récoltées par centrifugation.

Les bactéries sont remises en suspension dans un tampon, appelé tampon de charge de composition suivante :
- 0,125 M Tris-HCl pH 6,8
- 4 % dodécyl sulfate de sodium
- 20 % glycérol
- 0,02 % bleu de bromophénol
- 10 % ss-mercaptoéthanol puis le mélange est porté à 100 C pendant 10 min. (Ce qui provoque la lyse des bactéries et la dénaturation des protéines.) 10 pg de protéines solubilisées sont déposés sur un gel d'électrophorèse de polyacrylamide selon le protocole décrit par Laemmli (U.K. Laemmli,
Nature 227, 1970, 680-685). Après l'électrophorèse, le gel est coloré à l'aide de bleu de Coomassie. On constate pour le clone de p-1,3-glucanase la présence de trois bandes surnuméraires absentes pour la souche témoin.

Section 8 : Mesure de l'activité enzymatique de la p-1,3-glucanase
recombinante de soja exprimée dans E. coli, isolement
et purification de trois formes de cette protéine et
détermination de leurs séquences amino-terminales.

1. Mesure de l'activité enzymatique de la p-1,3-glucanase recombi
nante.

L'activité de la p-1,3-glucanase est mesurée par une méthode colorimétrique permettant d'estimer la quantité de monomères ou d'oligomères libérés par l'enzyme à partir d'un substrat (la laminarine) en déterminant le pouvoir réducteur des sucres ainsi libérés. Cette méthode, décrite par G. Ashwell, 1957, dans "Methods in Enzymology III", 73-105, S.P. Colowick et N.U. Kaplan
Eds. est résumée ci-après.

A une solution contenant une concentration de p-1,3- glucanase choisie pour se situer dans une gamme de réponse linéaire, on ajoute 50 ,ul d'une solution contenant 50 mg/ml de laminarine (p-1,3-glucane extrait de Laminaria digitata-Sigmaréf.L9634). Le volume du mélange réactionnel est ajusté à 500 ,ul à
L'aide d'une solution tampon acétate de sodium 0,2 M, pH 5,0.Après une heure d'incubation à 40 C, une partie aliquote de 200 l est ajoutée à 200 l de réactif de Somogyi (mélange de 25 ml de la solution aqueuse comprenant 2,5 X de Na2 C03, 2,5 % de KNaC4H4O6, 4H20, 2 % de NaHC03, 20 % de Na2SO4 et de 1 ml de solution aqueuse contenant 15 % de CuSO4, 5H20), puis portée à 100 C pendant 45 min.

Les tubes sont alors refroidis dans la glace avant d'ajouter 200 l du réactif de Nelson (solution aqueuse de 5,5 % de molybdate d'ammonium, de 4,6 % d'acide sulfurique concentré et 12 % de
Na2HASO4, 7H2O).

Le volume du mélange est ajusté à 5 ml avec de l'eau distillée et son absorbance est mesurée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 500 nm.

La quantité de sucres réducteurs libérée est estimée par comparaison avec les valeurs d'absorbance obtenues avec une gamme étalon établie à l'aide d'une solution de glucose. L'activité enzymatique de la p-1,3-glucanase est exprimée en nanomoles d'équivalent glucose libérées par minute, dans les conditions de l'essai enzymatique décrit ci-dessus.

2. Isolement et purification de trois formes de la p-1,3-glucanase
recombinante : a) Méthode
Les différentes formes de la protéine recombinante ont été isolées et purifiées à partir du centrifugat obtenu dans la section 7 (fin du premier paragraphe). L'isolement et la purification comprennent des étapes d'extraction, de précipitation au sulfate d'ammonium, de chromatographie en phase liquide FPLC sur une colonne échangeuse de cations à base de polymère synthétique et de chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé, selon le protocole décrit ci-après
ETAPE 1:
Le culot bactérien est traité sous agitation à 4 C par une solution tampon pH 8 (Tris 30 mM, EDTA 1 mM). Après centrifugation (15 000 g, 30 min) le surnageant recueilli (lysat) constitue l'extrait brut.

ETAPE 2 :
L'extrait protéique est précipité par le sulfate d'ammonium (60 % de saturation). Les protéines ayant précipité sont recueillies par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solubilisées dans une solution tampon (acétate d'ammonium 100 mM, pH 5,2) et dialysées pendant une nuit à 40C contre une solution tampon d'acétate d'ammonium 100 mM, pH 5,2.

Extemporanément, la concentration de la solution tampon de l'extrait protéique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à l'emploi (PD 10 Pharmacia).

ETAPE 3 :
L'extrait protéique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions sur une colonne à base de polymère synthétique (colonne Mono-S de Pharmacia) selon la technique FPLC de
Pharmacia.

L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM, pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient linéaire de 10 à 500 mN d'acétate d'ammonium.

ETAPE 4
Les fractions contenant une activité p-1,3-glucanase sont concentrées par ultrafiltration sur une cartouche de concentration
Centricon 10 (Amicron). La purification de la protéine est pour suivie par chromatographie (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé (colonne Superose 12 Pharmacia). L'élution est réalisée par une solution tampon d'acétate d'ammonium 500 mM, pH 5,2.

A chaque étape, les différentes formes de la p-1,3- glucanase recombinante sont identifiées par leur poids moléculaire (Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS révélation à l'argent), par leurs activités mesurées par la méthode colorimétrique décrite précédemment et par leurs réactions positives avec les anticorps polyclonaux dirigés contre la p-1,3- glucanase de tabac préparés dans la section 1.

b) Résultats
On isole et purifie ainsi trois formes de la protéine recombinante présentant une activité p-1,3-glucanase de poids moléculaires apparents de 36 + 3, 37 + 3 et 39 + 3 kDa. (Le poids moléculaire de la protéine déduite de la séquence codante est de 37 387 Da.) Leurs activités spécifiques respectives mesurées sont de 1,65, 1,75 et 1,76 nanomoles d'équivalent glucose libéré par minute par microgramme de protéines, valeurs non différentes significativement.

3. Détermination de la séquence amino-terminale des trois formes de
la p-1,3-glucanase recombinate.

Le séquençage des extrémités amino-terminales des trois formes de la p-1,3-glucanase recombinante a été réalisé. Les échantillons à traiter sont portés à la surface d'un filtre PVDF : difluorure de polyvinylidène) qui est introduit dans un séquenceur de protéines (Modèle 470 A, commercialisé par la Société Applied Biosystems E.U.A.) équipé d'un chromatographe (Modèle 430 d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phénylthiohydantoiques formés, après chaque cycle de dégradation.

Les séquences amino-terminales respectives déterminées sont représentées ci-après, le symbole X représentant un acide aminé non déterminé :
Met Ile Gly Val X Tyr Gly Met Leu
Met Ile Gly Val X Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro
Met Ile Gly Val X Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro
Ces séquences correspondent à la séquence déduite de la partie codante du plasmide pBR59 (cf. figure 4). il n'y a donc pas de maturation post-traductionnelle de la partie amino-terminale.

Les différences observées de poids moléculaires pour une activité spécifique voisine sont donc probablement le résultat d'une maturation carboxy-terminale post-traductionnelle.

Section 9 : Construction d'un vecteur d'expression dans les
cellules végétales : le vecteur binaire pBR6O.

a) Préparation d'un gène recombinant complet de la p-1,3-glucanase
de soja et clonage de celui-ci dans le vecteur binaire pBIN19.

L'ADN portant la séquence codante a été obtenu par coupure du vecteur M13BR140, obtenu dans la section 6c) (cf.

figure 3), à l'aide des enzymes de restriction BamHI et SacI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion.

Cet ADN a été inséré entre une séquence promotrice comprenant le promoteur dit 35S du virus de la mosaique du chou-fleur (35S CaMV) et une séquence terminatrice comprenant le terminateur de la napoline synthase d'Agrobacterium tumefaciens.

b) Préparation de la séquence promotrice comprenant le promoteur
35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.

A partir du plasmide pBI121 (Clontech) par coupure à l'aide des endonucléases HindIII et BamHI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment HindIII-BamHI d'environ 900 pb contenant le promoteur 35S est isolé. Ce fragment est recoupé par HindII. Le fragment d'environ 410 pb, portant le site BamHI, est traité par l'-ADN ligase T4 en présence d'un linker HindIII (séquence synthétique contenant un site HindIII). Après coupure par l'endonucléase
HindIII et électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment HindIII
BamHI résultant (d'environ 420 pb) est isolé et purifié.

c) Préparation de la séquence terminatrice comprenant le termina
teur de la nopaline synthase (NOS) d'Agrobacterium tumefaciens.

A partir du plasmide pBI121 (Clontech) par coupure à l'aide des enzymes de restriction SacI et EcoRI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, un fragment de 250 pb environ, renfermant le terminateur de la nopaline synthase, a été isolé.

On a ligué à l'aide de l'ADN ligase T4 la séquence promotrice, la séquence codante de l'ADN complémentaire de la p-1,3glucanase et la séquence terminatrice dans le vecteur binaire pBIN19 ouvert à l'aide des endonucléases HindIII et EcoRI. Ce vecteur porte deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet (cf. Bevan, 1984, Nucl. Ac.

Res., 12, 8711-8721) pouvant être transféré aux cellules végétales.

Le gène de résistance à la kanamycine servira de marqueur de sélection au cours des étapes de transformation et d'analyse de la descendance des plantes transformées.

Le vecteur obtenu est appele plasmide pBR6O. La séquence nucléotidique du gène recombinant complet, vérifiée par séquençage, ainsi que la séquence peptidique déduite sont représentée sur la figure 5. Le plasmide est cloné dans la souche E. coli MC1061 (Clontech).

Section 10 : Transfert dans Agrobacterium tumefaciens du plasmide
pBR60 contenant le gène recombinant de p-1,3-glucanase a) Transfert dans Agrobacterium tumefaciens.

Ce transfert est réalisé comme décrit ci-apres par conjugaison tripa renta le entre la souche E. coli MC1061 contenant le vecteur pBR60 et la souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech) à l'aide de la souche E. coli HB101 contenant le plasmide mobilisateur pRK2013 (D.M. Figurski et al., 1979, Pro. Ttl.

Ac. Sci. USA, 76, 1648-1652).

La souche E. coli MC1061 contenant le plasmide pBR60 et une souche E. coli HB101 (Clontech) contenant le plasmide mobilisa teur pRK2013 sont cultivées à 370C dans du milieu Luria (Gibco) en présence de 25 mg/l de kanamycine.

La souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 est cultivée à 280C dans du milieu Luria (Gibco) en présence de 100 mg/l de rifampicine (elle est résistante à cet antibiotique) ; 200 p1 de chacune des trois cultures sont mélangés, étalés sur du milieu
Luria gélosé (Gibco) et incubés toute la nuit à 280C. Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans 5 ml de milieu Luria et des parties aliquotes sont étalées sur des boites de Pétri contenant un milieu minimum gélosé (décrit dans "Plant Molecular Biology Manual"
Gelvin et al., Kluwer Academic Press, 1988) en présence de 100 mg/l de rifampicine et 25 mg/l de kanamycine.Dans ces conditions, seules poussent les colonies d'Agrobacterium tumefaciens ayant intégré le plasmide pBR60 (les souches d'E. coli ne peuvent pas pousser dans ces conditions). Celles-ci contiennent le gène recombinant de p-1,3-glucanase dans un contexte permettant sa réplication.

La résistance aux deux antibiotiques des colonies sélectionnées est vérifiée en repiquant celles-ci sur le même milieu de sélection deux fois de suite. La présence du gène recombinant de p1,3-glucanase dans Agrobacterium tumefaciens est vérifiée par la méthode de Southern Blot sur une préparation d'ADN total (Lyse des cellules, purification de l'ADN par extraction à l'aide du mélange phénol/chloroforme, selon le protocole décrit par Gelvin dans l'ouvrage cité ci-dessus, coupure de I'ADN purifié à l'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur membrane et hybridation selon les techniques bien connues de l'homme de l'art).

b) Transfert dans Agrobacterium rhizogenes
Ce transfert est réalisé de la même façon que le transfert dans Agrobacterium tumefaciens décrit en a), avec la souche Acrobacterium rhizogenes A4 décrite par GUERCHE et al., (1987) Mol. gen. genet. 206, 382.

Section 11 : Obtention de plantes de tabac transformées
Le tabac Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pBR60 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de l'homme du métier (Horsch R.B. et al., 1985, Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après.

Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac
N. tabacum (variété Wisconsin Havana 38 sensible aux champignons pathogènes) sont incubés dans une culture d'A. tumefaciens hébergeant le plasmide pBR60. Les disques égouttés sur papier Whatman ont été transférés sur des milieux de culture en boites de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals, puis produire des bourgeons en présence de céfotaxime (500 ,ug/ml) destinée à éliminer Agrobacterium tumefaciens et de kanamycine (100 pg/ml).

Les bourgeons résistants à la kanamycine ont été ensuite transférés sur un milieu permettant l'induction des racines en présence de céfotaxime et de kanamycine. Les plantules sont ensuite repiquées en terrines dans un substrat composé de tourbe et de terreau et mises à croître en serre. Toutes les plantes transformées (génération RO) ayant survécu aux étapes de régénération et d'acclimatation en serre se sont révélées morphologiquement normales et fertiles. Elles ont été autofécondées et ont donné des graines (génération Roi).

Section 12 : Analyse de I'ADN génomique des plantes de tabac trans
formées (génération RO) selon la technique de Southern
Blot.

L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été isolé à partir de feuilles matures de plantes transgéniques de la génération RO selon la méthode d'extraction à l'aide de bromure de cétyltriméthylammonium et de purification par précipitation, décrite dans l'ouvrage "Plant Molecular Biology Manual" déjà cité.

10 pg de cet ADN génomique ont été digérés pendant une nuit à 370C avec 20 unités des enzymes de restriction HindIII et
EcoRI. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (1 Z). L'ADN a été transféré selon la méthode de Southern Blot sur un filtre de Nylon (Hybond N
Amersham), et hybridé avec une sonde nucléotidique comprenant une partie de la séquence du gène recombinant, marqué par couplage à la peroxydase (kit ECL, Amersham). Les membranes sont ensuite lavées et révélées selon le protocole recommandé par Amersham.

L'analyse des films permet de tirer les conclusions suivantes : - certaines plantes ne possèdent pas de copies du gène recombinant transféré (absence de signal), - la plupart des plantes testées contiennent au moins une copie sans réarrangement de la construction : promoteur 35S CaMV séquence codante de l'ADN complémentaire de p-1,3-glucanase terminateur NOS, - certains profils suggèrent qu'il existe des réarrangements internes dans la construction, mais ces évènements sont rares.

Section 13 : Mise en évidence de l'expression de la p-1,3-glucanase
de soja dans les plantes de tabac transformées.

a) Préparation des extraits bruts de protéines de plantes de tabac
transformées (génération RO).

Les extraits bruts de protéines ont été préparés à partir de différents tissus de la plante (racine, tige, feuille, etc.).

Les fragments de tissus ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20 C. La podre a été extraite à 4 C en présence d'un tampon acétate d'ammonium 0,1 M, pH 5,2 et soumise à une centrifugation à 10 000 g. La concentration des pro téines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines, en suivant la technique de Bradford (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254).

b > Mise en évidence par immuno-empreinte (Western Blot).

On soumet les extraits bruts de protéines de différentes plantes transformées et des plantes non transformées (témoins) à un
Western Blot, technique bien connue de l'homme de l'art et décrite notamment par H. Towbin et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1972, 4350-4354, qui comprend les étapes suivantes : - dénaturation par chauffage à 1000C pendant 10 min dans un tampon, dénommé tampon de charge constitué de Tris HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS 4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, glycérol 20 %, p-mercaptoéthanol 10 % (selon le protocole décrit par Laemmli, U.K. Laemmli Nature, 227, 1970, 680-685) ; - séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisat selon le protocole décrit par Laemmli (réf.

ci-dessus) - électrotransfert desdites protéines contenues dans le gel sur une membrane en PVDF (selon la technique de H. Towbin et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 76, 1979, 4350-4354).

L'immunodétection est réalisée selon un protocole qui comprend les étapes suivantes : - saturation de la membrane PVDF sur laquelle les protéines ont été transférées par incubation pendant au minimum 2 heures à 370C dans une solution de gélatine à 3 X, - 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % du détergent Tween 20, - incubation (pendant 1 heure à 370C) en présence de l'immunsérum préparé précédemment (contenant les anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine recombinante) dilué au 1/10 000 dans du tampon phosphate salin, - 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % du détergent Tween 20.

Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d'Amersham ("Blotting detection kit"), utilisé selon les indications du fabricant.

L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine d'environ 37 + 3 kDa pour les plantes transformées, absente des plantes témoins (la protéine déduite de la séquence de l'ADNc, clivée de son peptide signal supposé pour une expression dans les cellules eucaryotes, a un poids moléculaire de 38 156 Da).

L'analyse selon la technique de Western Blot a été effectuée sur 30 plantes transformées (répondant positivement au
Southern Blot). 28 plantes ont montré une expression de la p-1,3glucanase recombinante en Western Blot. La non-expression pour deux plantes résulte probablement de l'insertion du gène recombinant dans un contexte ne permettant pas la transcription.

c) Comparaison des migrations électrophorétiques des p-1,3
glucanases de soja (protéines recombinantes et protéine natu
relle).

Les bandes obtenues pour les différentes formes de la protéine recombinante obtenues par expression dans E. coli (cf.

section 7) et la protéine recombinante obtenue dans les plantes de tabac transformées ont été comparées à celle obtenue pour la protéine naturelle présente dans un extrait de cellules de soja (cf.

section 1) et la p-1,3-glucanase naturelle de tabac présente dans un extrait de cellules de tabac (cf. section 1), par migration électrophorétique sur des pistes parallèles selon le protocole décrit par Laemmli (UK. Laemmli, Nature 227, 1970, 680-685). Les tailles de ces protéines ont été comparées à celles de protéines de masses moléculaires connues (marqueurs de poids moléculaires compris entre 14 000 et 97 400 Da de Bio-Rad- réf. 61-0304).

Les empreintes obtenues après Western Blot montrent que la p-1,3-glucanase de soja synthétisée dans le tabac présente le même poids moléculaire apparent que celui de la protéine naturelle de soja : 37 + 3 kDa. La maturation post-traductionnelle de cette protéine est donc effectuée de la même façon dans un autre végétal que le soja. Les trois formes de p-1,3-glucanase de soja synthétisées dans E. coli présentent des poids moléculaires apparents de 36 + 3, 37 + 3 et 39 + 3 kDa, le poids moléculaire apparent de la protéine de 36 + 3 kDa étant légèrement plus faible que celui de la protéine naturelle, la différence observée pouvant correspondre à la différence entre les séquences polypeptidiques codées (cf. les figures 4 et 5). La protéine recombinante de 36 + 3 kDa a donc pro bablement subi la même maturation carboxyterminale que la p-1,3glucanase de soja naturelle.Les deux autres protéines recombinantes synthétisées dans le tabac correspondent probablement à des maturations carboxy-terminales incomplètes. D'autre part, la différence maximum entre les poids moléculaires des trois formes de la p-1,3-glucanase de soja exprimées dans E. coli, est égale à 3 kDa, ce qui correspond à environ 30 acides aminés.

Section 14 : Obtention de plantes de colza transformées.

La transformation est réalisée selon le protocole de
P. Guerche et al. (P. Guerche et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 206, 382). Les différents milieux de culture sont ceux décrits par
Pelletier et al. (Pelletier et al., 1983, Mol. Gen. Genet., 191, 244). Leur composition sera explicitee par la suite (tableau 1).

a) Obtention de racines transformées.

Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité apicale de plantes de colza (Brassica napus : variétés de printemps
Brutor et Westar et variété d'hiver) de 1 m de haut environ. Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A.

L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhizogenes contenant le plasmide pBR6O.

Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélosé (15 gZl) et complémenté par 500 pg de céfotaxime/ml.

b) Régénération de plantes transformées.

Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours sur le milieu D contenant 3 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, puis placés sur le milieu RCC d'induction de bourgeons.

Des plantes racinées sont ensuite obtenues par passage des bourgeons sur les milieux F et G.

TABLEAU 1
Composition des différents milieux utilisés pour l'obtention de plantes de colza transformées.

Milieu
<tb> Composition <SEP> A
<tb> (mg/l)
<tb> NH4NO3 <SEP> 1 <SEP> 650 <SEP> 1 <SEP> 650 <SEP> 1 <SEP> 650 <SEP> 825
<tb> KNO3 <SEP> 1 <SEP> 900 <SEP> 2 <SEP> 500 <SEP> 1 <SEP> 900 <SEP> 1 <SEP> 900 <SEP> 950
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 134
<tb> NaH2PO4 <SEP> 150
<tb> KH2PO4 <SEP> 170 <SEP> 170 <SEP> 170 <SEP> 85
<tb> CaCL22H2O <SEP> 440 <SEP> 750 <SEP> 440 <SEP> 440 <SEP> 220
<tb> MgSO47H2O <SEP> 370 <SEP> 250 <SEP> 370 <SEP> 370 <SEP> 185
<tb> H3BO3 <SEP> 12,4 <SEP> 3 <SEP> 12,4 <SEP> 6,2 <SEP> 6,2
<tb> MnSO44H2O <SEP> 33,6 <SEP> 10 <SEP> 33,6 <SEP> 22,3 <SEP> 22,3
<tb> ZnSO47H2O <SEP> 21 <SEP> 2 <SEP> 21 <SEP> 8,6 <SEP> 8,6
<tb> KI <SEP> 1,66 <SEP> 0,75 <SEP> 1,66 <SEP> 0,83 <SEP> 0,83
<tb> Na2MoO42H2O <SEP> 0,5 <SEP> 0,25 <SEP> 0,5 <SEP> 0,25 <SEP> 0,25
<tb> CuSo45H2O <SEP> 0,05 <SEP> 0,025 <SEP> 0,05 <SEP> 0,25 <SEP> 0,25
<tb> CoCl26H2O <SEP> 0,05 <SEP> 0,025 <SEP> 0,05 <SEP> 0,25 <SEP> 0,25
<tb> FeSO47H2O <SEP> 22,24 <SEP> 27,8 <SEP> 27,8 <SEP> 27,8 <SEP> 22,24
<tb> TABLEAU 1 (suite 1)

Milieu
<tb> Composition <SEP> A <SEP> B <SEP> RCC <SEP> F <SEP> G
<tb> (mg/l)
<tb> Na2EDTA <SEP> 29,84 <SEP> 37,3 <SEP> 37,3 <SEP> 37,3 <SEP> 29,84
<tb> Inositol <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Acide <SEP> nicotinique <SEP> 0,5 <SEP> 1 <SEP> 0,5 <SEP> 1 <SEP> 0,5
<tb> Pyridoxine <SEP> HCL <SEP> 0,5 <SEP> 1 <SEP> 0,5 <SEP> 1 <SEP> 0,5
<tb> Thiamine <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Glicine <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> 20 <SEP> 000 <SEP> 10 <SEP> 000
<tb> Saccharose <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> 10 <SEP> 000
<tb> D-mannitol <SEP> 70 <SEP> 000 <SEP> 10 <SEP> 000
<tb> N.A.A. <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1
<tb> B.A. <SEP> 1 <SEP> 0,5 <SEP> 0,5
<tb> 2,4D <SEP> 0,25
<tb> Adénine <SEP> sulfate
<tb> I.F.A. <SEP> 0,5
<tb> GA <SEP> 0,02
<tb> Twen <SEP> 80 <SEP> 10
<tb> TABLEAU 1 (suite 2)

Milieu
<tb> Composition <SEP> A <SEP> B <SEP> RCC <SEP> F <SEP> G
<tb> (mg/l)
<tb> Agar <SEP> 8000 <SEP> 8000 <SEP> 8000 <SEP> 8000
<tb> pH <SEP> 5,8 <SEP> 5,8 <SEP> 5,8 <SEP> 5,8 <SEP> 5,8
<tb> Gentamicine <SEP> (sulfate) <SEP> 10
<tb> NAA = acide naphtalène acétique
BA = benzyl-6-aminopurine 2,4D = acide dichloro-2,4-phénoxyacétique
IPA = N6-(2-iso-pentényl)adénine
GA3 = acide gibbérellique
EDTA = acide éthylénediaminetétraacétique.

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité p-1,3-glucanase ou pour un précurseur de cette dernière qui comprend la séquence (al) suivante :

Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ser Ala Asn Asp

Val Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Ile Lys Arg Met Arg Leu Tyr Asp

Pro Asn Gln Ala Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ser Gly Ile Glu Leu Ile

Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Gly Leu Ala Thr Asn Pro Asp Thr

Ser Arg Gln Trp Val Gln Lys Asn Val Leu Asn Phe Trp Pro Ser Val Lys île Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Val Gly Gly Ser Ser

Ser Val Ala Gln Tyr Val Leu Pro Ala Ile Gln Asn Val Tyr Gln Ala Ile

Arg Ala Gln Gly Leu His Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ser Ile Asp Met

Thr Leu île Gly Asn Ser Phe Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg Gly Asp

Val Arg Ser Tyr Leu Asp Pro île Ile Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Asn Ala

Pro Leu Leu Val Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Arg

Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ala Pro Asn Val Val Val Trp

Asp Gly Gln Tyr Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Val

His Ala Ala Ile Asp Asn Thr Lys Ile Gly Tyr Val Glu Val Val Val Ser

Glu Ser Gly Trp Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ala Ala Thr Tyr Asp Asn Ala

Arg Val Tyr Leu Asp Asn Leu Val Arg Arg Ala Asn Arg Gly Ser Pro Arg

Arg Pro Ser Lys Pro Thr Glu Thr Tyr Ile Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn

Gln Lys Asn Pro Glu île Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Asn Pro Asn Lys Gln ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a

2.ADN recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend immédiatement en aval de la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1) la séquence codant pour la séquence d'acides aminés (a4) ci-après :

Lys Lys Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Gly Lys Arg Leu Gly Lys Val Val Ile

Asp Asp Phe Asn Ala Thr Thr Ser île Lys Ser Asp Val tronquée dans sa partie carboxy-terminale de O à 29 acides aminés.

3. ADN recombinant selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte, en amont de la séquence (a1) ou de la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1), une séquence signal.

4. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence signal est une séquence codant pour le peptide signal de séquence (a2) suivante :

Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu

Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly

5. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le peptide signal codé par la séquence signal est séparé de la séquence (a2) de la protéine codée, par le peptide de séquence (a3) suivante :

Asn Leu Arg Met Ala Asp Ala Gln

6. ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence promotrice comportant le promoteur 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur.

7. ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence terminatrice comportant le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens.

8. ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a > est la séquence (Na1) suivante :

ATTGGTGTGT GTTATGGCAT GCTGGGCAAC AATCTACCGT CAGCAAACGA TGTTATAGGT

CTTTATAGAT CAAATAACAT AAAGAGAATG AGACTCTATG ATCCTAATCA AGCTGCTCTA

GAAGCACTTA GAAATTCTGG CATTGAACTC ATTCTTGGGG TGCCAAACTC TGACCTTCAA

GGCCTTGCCA CCAATCCTGA CACTTCTCGT CAATGGGTGC AAAAAAACGT GTTGAACTTT

TGGCCTAGTG TCAAAATCAA GTACGTGGCA GTTGGAAATG AAGTGAGTCC CGTTGGAGGC

TCTTCTTCGG TAGCCCAATA TGTTCTACCT GCCATCCAAA ATGTATACCA AGCAATAAGA

GCTCAAGGCC TTCATGATCA AATCAAGGTT TCAACATCTA TTGACATGAC CCTAATAGGA

AACTCTTTCC CTCCATCGCA AGGTTCCTTC AGGGGTGATG TGAGATCATA CCTAGATCCC

ATAATTGGGT ACTTGGTATA TGCAAATGCA CCATTACTAG TCAATGTGTA CCCTTATTTT

AGTTACACTG GTAACCCCCG TGACATATCA CTTCCCTATG CTCTTTTCAC AGCACCAAAT

GTTGTGGTAT GGGATGGTCA ATATGGGTAC CAAAATTTGT TTGATGCTAT GTTGGATTCA

GTACATGCAG CCATTGATAA CACTAAGATT GGTTATGTGG AGGTTGTTGT ATCCGAGAGT

GGGTGGCCAT CAGATGGAGG ATTTGCTGCC ACTTATGACA ACGCACGCGT GTACTTAGAC

AATTTGGTTC GTCGTGCTAA TAGAGGAAGC CCAAGAAGGC CTTCGAAGCC CACTGAGACT

TATATATTTG CCATGTTCGA TGAAAATCAA AAAAATCCAG AGATAGAGAA ACATTTTGGG

CTCTTCAATC CCAACAAACA A

9. ADN recombinant selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a2) est la séquence (Na2) suivante :

ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG

GAACTATTGA CAGGA

10. ADN recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a3) est la séquence (Na3) suivante :

AACCTTCGCA TGGCAGATGC TCAA

11.ADN recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a4) est la séquence (Na4) suivante :

AAAAAATACC CATTTGGGTT TGGAGGAAAG AGGCTAGGGA AAGTTGTTAT TGACGACTTC

AATGCAACAA CTTCCATTAA GAGTGATGTG

12. Bactérie caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expression, l'ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à î1.

13. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 11, avec les moyens nécessaires à son expression.

14. Cellule végétale selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.

15. Plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 11, avec les moyens nécessaires à son expression.

16. Plante ou partie de plante selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.

17. Partie de plante selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle est apte à former une nouvelle plante complète ou à produire des semences.

18. Partie de plante selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est une semence.

19. Protéine à activité p-1,3-glucanase, caractérisée ce qu'elle comprend la séquence (a1) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1).

20. Protéine selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comporte immédiatement en aval de la séquence (a1) la séquence d'acides aminés (a4).

21. Protéine selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 36 + 3 kDa.

22. Protéine selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 37 + 3 kDa.

23. Protéine selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence (a3) immédiatement en amont de la séquence (a1) ou de la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a

24. Protéine selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 39 + 3 kDa.

25. Procédé pour préparer la protéine selon l'une des revendications 19 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de bactéries, de cellules végétales, de cals végétaux, de plantes, ou de parties de plantes contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 11, la lyse de ceux-ci, l'isolement et la purification de cette protéine.