EP0536364A1 - Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta-1,3-glucanase de soja - Google Patents

Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta-1,3-glucanase de soja

Info

Publication number
EP0536364A1
EP0536364A1 EP92908870A EP92908870A EP0536364A1 EP 0536364 A1 EP0536364 A1 EP 0536364A1 EP 92908870 A EP92908870 A EP 92908870A EP 92908870 A EP92908870 A EP 92908870A EP 0536364 A1 EP0536364 A1 EP 0536364A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
leu
val
asn
gly
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP92908870A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Catherine Sass
Jean-Jacques Leguay
René GRISON
Alain Toppan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Societe National Elf Aquitaine
Sanofi SA
Original Assignee
Societe National Elf Aquitaine
Sanofi SA
Elf Sanofi SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe National Elf Aquitaine, Sanofi SA, Elf Sanofi SA filed Critical Societe National Elf Aquitaine
Publication of EP0536364A1 publication Critical patent/EP0536364A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)

Definitions

  • the invention relates to a recombinant DNA coding for a new protein with ⁇ -1, 3-glucanase activity, or for a precursor of this protein, a bacterium containing this recombinant DNA, a plant cell, a plant or a part of a plant, in particular particularly a plant seed, transformed by this recombinant DNA, as well as this new protein and a process for preparing it.
  • ⁇ -1,3-glucanase EC3.2.1.39 Kombrink et al., 1988, Pr Ntl Acad. Sci. USA, 85, 982-986 and Pegg and al., 1981, Physiol. Plant. Pathol. 19, 371-382.
  • This induction can be artificially triggered under the effect of elicitors, that is to say compounds of biological origin capable of inducing in a healthy plant the defense reactions which it deploys naturally during an infection. by pathogens, or a hormonal free imbalance caused by auxin, cytokinins or ethylene (Abeles et al., 1971, Plant Physiol. 47,129-134 and de Loose et al., 1988, Gene, 70 , 13-23).
  • ⁇ -1,3-glucans are linear polysaccharide polymers made up of glucose units associated by ⁇ -1,3 bonds sometimes having ramifications of the ⁇ -1,4 or ⁇ -1,6 type (Farka 1982, in "Fungal protoplasts", Peberdy and Ferencry Editions Dekker Inc). These polysaccharides are a typical component of the skeleton of the wall of most fungi and including phytopathogenic fungi.
  • the ⁇ -1,3-glucanases are capable of degrading them by fragmentation of the ⁇ -1,3-glucan chains. Most of the known plant ⁇ -1,3-glucanases are of the endo type.
  • DNA sequences coding for several plant ⁇ -1,3-glucanases in particular a ⁇ -1,3-glucanase from Nicotiana plumbaginifolia (De Loose et al., 1988, Gene, 70,13-23) and a ⁇ - Soy 1,3-glucanase (Takeuchi et al., 1990, Plant Physiol, 93,673-682) were isolated, cloned and determined.
  • Patent application EP-A-0 353 191 describes the isolation and cloning of different complementary DNA fragments, the assembly of which makes it possible to deduce the complementary DNA sequence coding for a tobacco ⁇ -1,3-glucanase , as well as the genomic DNA sequence encoding this enzyme.
  • Document EP-0 392225 discloses in particular the construction of a chimeric gene coding for this tobacco ⁇ -1,3-glucanase, the transformation of tobacco by the latter and verification by Western Blot and revelation using antibodies polyclonal, overexpression of this endogenous protein in transformed plants.
  • This patent application does not show that the recombinant tobacco ⁇ -1,3-glucanase is biologically active nor a fortiori that it confers resistance of said transformed plants to pathogens.
  • ⁇ -1,3-glucanases such as for example ⁇ -1,3-glucanase from Bacillus subtilis, are enzymes useful in the conversion of biomass, in particular in certain sectors of the paper industry and in the food industry, in particular the brewery (Headen, 1986, Brewers Gardian, 115, 7 and MacQueen, October 1987, New Scientist, 66).
  • the present invention relates to a new recombinant DNA characterized in that it codes for a protein with ⁇ -1,3-glucanase activity or for a precursor thereof, this protein with ⁇ -1,3-glucanase activity comprising the sequence d 'amino acids
  • a high degree of homology here means homology
  • ratio of identical amino acids to total number of amino acids of at least 80%, and preferably at least 90%, of the amino acid sequences, when aligned according to the maximum homology, according to the optimal alignment method of sequences from Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453. This method is used in particular in the UWGCG software from the University of Wisconsin: Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - GAP option.
  • the peptide sequence already known closest to that of the sequence (a.) Of 307 amino acids is that of the protein of 369 amino acids deduced from the DNA complementary to a ⁇ -1,3-glucanase from Nicotiana plumbaginifolia ( see the Swissprot database ref. Gub $ Nipl. and De Loose et al., 1988, Gene, 70.13-23).
  • This algorithmic method which considers all possible alignments and creates an alignment, shown in FIG.
  • This new recombinant DNA can be used for the expression of this protein with ⁇ -1,3-glucanase activity, either to confer on a plant or part of a plant which expresses it, increased resistance to pathogens, or to produce this protein using eukaryotic cells, in particular ascomycetes, such as yeast or filamentous fungi, for example, Cryphonectria parasitica or plant cells, or prokaryotic microorganisms, such as for example Escherichia coli.
  • eukaryotic cells in particular ascomycetes, such as yeast or filamentous fungi, for example, Cryphonectria parasitica or plant cells, or prokaryotic microorganisms, such as for example Escherichia coli.
  • This recombinant DNA can comprise immediately downstream of the nucleotide sequence coding for the amino acid sequence (a 1 ) the nucleotide sequence coding for the amino acid sequence (a,) below:
  • this recombinant DNA comprises immediately upstream of the nucleotide sequence coding for the amino acid sequence (a 1 ), a codon for Gln.
  • a DNA of this appreciated type is that which codes for a protein with ⁇ -1,3-glucanase activity or for a precursor of this protein, which comprises the following sequence (a 5 ):
  • This recombinant DNA preferably comprises, upstream of the sequence coding for the sequence (a.) Optionally preceded by a codon for Gln, a signal sequence, chosen as a function of the host cell, which has the function of allowing the export of the protein outside the cytoplasm.
  • this signal sequence can be either a sequence derived from a coding sequence for a natural precursor of a protein exported by a prokaryotic microorganism, for example the signal peptide OmpA (Ghrayeb et al., 1984, EMBO Journal, 3, 2437-2442) or a precursor of alkaline phosphatase (J. Bact .
  • a non-endogenous sequence originating from a sequence coding for a eukaryotic precursor for example the signal peptide of one of the natural precursors of human growth hormone
  • a coding sequence for a synthetic signal peptide for example that described in patent application FR No. 2,636,643, of sequence:
  • this signal sequence is preferably a sequence derived from a sequence coding for a natural precursor of a protein secreted by these cells, for example for yeast the precursor of invertase (patent application EP-0 123 289) or the precursor of the prepro sequence of the alpha pheromone (patent application DK 2484/84), or for Cryphonectria parasitica.
  • the precursor of the prepro endothiapepsin sequence of the following sequence, described in patent application FR-2 666590:
  • signal peptide of a plant cell protein known to be exported for example, the following sequence described in patent application FR 2 665 177: Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu Thr Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala be a signal sequence coding for the signal peptide sequence
  • amino acid sequences (a 1 ), (a 2 ) and (a 4 ) can, for example, be coded by the nucleotide sequences (Na 1 ), (Na 2 ) and (Na 4 ) below:
  • GAAGCACTTA GAAATTCTGG CATTGAACTC ATTCTTGGGG TGCCAAACTC TGACCTTCAA
  • AACTCTTTCC CTCCATCGCA AGGTTCCTTC AGGGGTGATG TGAGATCATA CCTAGATCCC
  • the invention also relates to an expression unit of the recombinant DNA defined above, advantageously carried by a vector, called the expression vector.
  • the recombinant DNA For expression in prokaryotic microorganisms, in particular in Escherichia coli, the recombinant DNA must be inserted into an expression unit comprising in particular an effective promoter, followed by a ribosome binding site upstream of the gene to be expressed. , as well as an efficient transcription stop sequence downstream of the gene to be expressed.
  • This unit must also contain a selection marker or be introduced into the host cell at the same time as an expression unit for a selection marker (for example using an expression vector which carries these two units). All these sequences must be chosen according to the host cell.
  • the expression unit according to the invention comprises the recombinant DNA defined above with the means necessary for its expression.
  • recombinant DNA For expression in ascomycete cells, such as yeast, for example Saccharomyces cerevisiae, recombinant DNA should be inserted between, on the one hand, sequences recognized as an effective promoter, on the other hand, a transcription terminator .
  • the expression unit carries a selection marker or is introduced into the host cell at the same time as a selection marker.
  • this selection marker is an auxotrophic marker (which complements a mutation of the cells which allows the selection of cells which have integrated the recombinant DNA into a high copy number, either in their genome or in a multicopy vector.
  • the expression unit according to the invention carries the recombinant DNA defined above with the means necessary for its expression, and possibly a selection marker and / or telomeric sequences. It is indeed possible to select the transformants having integrated a DNA of interest using a selection marker located either on the same unit as the DNA of interest, or on another unit, these two units being then introduced by cotransformation.
  • the recombinant DNA of the invention can either be integrated into the genome of filamentous fungi, or stored in extrachromosomal form thanks to sequences allowing the replication and partitioning of this DNA.
  • the recombinant DNA defined above should be inserted between an effective promoter and terminator in plants.
  • the promoter is preferably a strong constitutive promoter, for example the cauliflower mosaic virus 35S promoter, or a promoter controlling a specific tissue - or organ - expression such as the promoter of the small ribulose 1 subunit. , 5 bisphosphate carboxylase-oxygenase which is preferentially expressed in the leaves and especially the tissues of the mesophyll (Kuhlemeier et al., 1987, Ann Rev Plant Physiol 38: 221-257).
  • the terminator sequence is used, comprising polyadenylation sites which can be isolated from plant genes or from genes expressed in plants, such as the terminator of the nopaline synthase of Agrobacterium tumefaciens.
  • the invention also relates to a bacterium, for example of the species E. coli, which contains the recombinant DNA defined above, with the means necessary for its replication and its expression.
  • This bacterium can be used in the preparation of a protein with ⁇ -1,3-glucanase activity.
  • the invention also relates to a bacterium, for example of the species E. coli, which contains the recombinant DNA defined above with the means allowing its folding, which therefore can be used for the cloning of this recombinant DNA and thus than a bacterium capable of infecting a plant with transfer of genetic material, for example of one of the species Agrobacterium rhizogenes and Agrobacterium tumefaciens, which contains this DNA in a context allowing its folding and therefore can be used to transform cells vegetable.
  • the transformation of plant cells by the above recombinant DNA can also be carried out by another biological method such as the pollen tube pathway (Zhong-xun Luo et al., Plant Molec. Biol.
  • the invention also relates to a plant cell characterized in that it is transformed by the recombinant DNA defined above, with the means necessary for its expression.
  • This plant cell can come from a field crop species, such as for example corn, soybeans, beets, wheat, barley, poppies, rapeseed, sunflowers, alfalfa and sorghum, a floral species such as rosebush, carnation, gerbera or a vegetable species such as carrot, tomato, salad, chicory, pepper, melon and cabbage.
  • rapeseed Brassica napus are particularly popular species.
  • the transformation step which relates to one or a few cells is followed by a step of multiplication of these transformed cells so as to obtain calluses. which can give rise to transformed plants, by processes of organogenesis or embryogenesis.
  • the invention therefore also relates to a plant or part of a plant, characterized in that it contains, with the means necessary for its expression, the recombinant DNA defined above.
  • a particularly appreciated part of a plant is the part capable of forming a new complete plant, in particular after sowing, burying or transplanting, or producing seeds. Such a part is for example a grain, a seed, a seed, a cutting, a layer, etc.
  • These plants can be any of the above species and more particularly the species Nicotiana tabacum, Helianthus annuus and Brassica napus.
  • the invention also relates to a process for obtaining plants resistant to parasites, such as phytopathogenic fungi, which comprises a step of transformation of plant cells by this recombinant DNA, followed by a step of multiplication of the transformed cells and of a plant regeneration step.
  • parasites such as phytopathogenic fungi
  • the stage of transformation of plant cells is carried out in vitro using an agrobacterium (that is to say a bacterium of the genus Agrobacterium) having integrated the recombinant DNA of interest.
  • an agrobacterium that is to say a bacterium of the genus Agrobacterium
  • the invention also relates to plants resistant to pathogenic agents capable of being obtained using the process defined above.
  • the invention also relates to the use of a plant containing, with the means necessary for its expression, the recombinant DNA defined above, as a parent in a selection program for creating new plant varieties.
  • the invention also relates to a new protein with ⁇ -1,3-glucanase activity, which comprises the sequence (a 1 ) optionally immediately followed by the sequence (a 4 ) truncated in its carboxyterminal part from 0 to 27 amino acids, and a new protein which comprises the sequence (a 5 ).
  • This protein preferably has an apparent molecular mass of 36 ⁇ 3, 37 ⁇ 3 or 39 ⁇ 3 kDa.
  • This protein is of interest as a biomass converting enzyme which contains lucan ⁇ -1,3-g, in particular in certain sectors of the paper industry and in the food industry, in particular the brewery.
  • the invention also relates to a process for the preparation of this protein which comprises the cultivation of bacteria, plant cells, plant calluses, plants or parts of plants containing the recombinant DNA defined above, the lysis of these . isolation and purification of this protein.
  • FIG. 1 represents a restriction map of the HindIII-EcoRI fragment contained in the plasmid pBR1310 and containing the complementary DNA coding for soy ⁇ -1,3-glucanase.
  • FIG. 2 represents the nucleotide sequence of the HindIII-HindIII insert, part of the DNA complementary to soy ⁇ 1,3-glucanase, the restriction sites used for cloning in M13mp19 and for the subsequent constructions being indicated by arrows, as well as the peptide sequence deduced from this complementary DNA.
  • FIG. 3 represents the nucleotide sequence of the HindIII-HindIII fragment of the DNA complementary to soy ⁇ -1,3-glucanase, after mutagenesis (at the end of section 6c), the restriction sites used for cloning in M13mp19 and for subsequent constructions being indicated by arrows, as well as the peptide sequence of the translated protein.
  • FIG. 4 represents the nucleotide sequence of the NdeI-HindIII fragment of the coding part of the plasmid pBR59, expression plasmid in E. coli, framed by the NdeI and HindIII restriction sites and the peptide sequence of the translated protein.
  • FIG. 5 represents the nucleotide sequence of the complete recombinant gene and the peptide sequence of the translated protein.
  • FIG. 6 represents the peptide sequence of the common part of the proteins translated in E. coli and in tobacco.
  • Figure 7 shows an alignment according to the method of Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453, from the peptide sequence deduced from the DNA complementary to soy ⁇ -1,3-glucanase (cf. FIG. 2) and from the closest known peptide sequence, that deduced from the complementary DNA Nicotiana plumbaginifolia ⁇ -1,3-glucanase (Swissprot database ref. Gub $ -Nipl).
  • Section 1 Preparation of polyclonal antibodies against tobacco ⁇ -1,3-glucanase a) Purification of tobacco ⁇ -1,3-glucanase.
  • a tobacco ⁇ -1,3-glucanase was purified to homogeneity from tobacco calluses as described below.
  • Tobacco calli were cultivated in vitro on a medium of Murashige and Skoog (Murashige T. and Skoog F., 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497).
  • Cell extracts are obtained by grinding the plant material in a 50 mM Tris-HCl buffer solution pH 8.4 containing 15 mM ⁇ -mercaptoethanol and 5% polyvinylpolypyrrolidone.
  • the protein is purified from this extract by precipitation with ammonium sulphate, chromatography in phase l iqui on a cation exchange column based on synthetic polymer, and exclusion chromatography (molecular sieving) on a cross-linked agarose according to the protocol described below:
  • Step 1
  • the protein extract is treated with ammonium sulfate (43% saturation).
  • the proteins which have precipitated are collected by centrifugation (15,000 g for 30 min), dissolved in a buffer solution (100 mM ammonium acetate pH 5.2) and dialyzed overnight at 4 ° C. against an ammonium acetate buffer solution 100 mM pH 5.2.
  • the acetate concentration of the buffer solution of the protein extract is reduced to 10 mM by passage through ready-to-use mini-columns (PD10 Pharmacia).
  • the protein extract is then purified by ion exchange chromatography based on synthetic polymer (Mono-S column from Pharmacia) according to the FPLC technique from Pharmacia.
  • the extract is deposited on the Mono-S column equilibrated with a 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.2.
  • the proteins retained on the column are eluted by a linear gradient of 10 to 500 mM of ammonium acetate.
  • ⁇ -1,3-glucanase is identified by its molecular weight (electrophoresis on polyacrylamide gel in the presence of SDS - silver revelation) and its activity is measured by a colorimetric method (see section 8, below) using laminarin ( ⁇ -1,3-glucan extracted from Laminaria digitata - Sigma - ref. L9634) as substrate. b) Preparation of polyclonal antibodies.
  • Rabbits were then injected with 25 ⁇ g of tobacco ⁇ -1,3-glucanase in 500 ⁇ l of complete Freund's adjuvant.
  • Section 2 Construction of a phage library of complementary DNA from messenger RNA from soy cell cultures. a) Preparation of messenger RNA from soybean cells.
  • RNA fraction of messenger RNA was isolated after 2 cycles of affinity chromatography on an oligo (dT) cellulose column as described in Sambrook et al. ("Molecular cloning: A Laboratory manual", second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory 1989). The quantification of messenger RNAs is carried out by spectrophotometry according to a protocol well known to those skilled in the art. b) Synthesis of complementary DNAs.
  • cDNAs complementary DNAs
  • the synthesized double-strand cDNA is then methylated using EcoRI methylase under the conditions described in the reference work Sambrook et al. (op cited).
  • This enzyme makes it possible to protect the possible EcoRI sites of the cDNA against a cut by the EcoRI endonuclease, this protection disappearing for the cDNA replicas (which are not methylated).
  • Synthetic EcoRI linkers double-stranded DNA fragments containing the EcoRI site
  • Synthetic EcoRI linkers double-stranded DNA fragments containing the EcoRI site
  • the cDNA is ligated using the
  • the number of recombinants is then estimated by counting the lysis plaques obtained on a bacterial carpet of the E. coli Y1090 strain (Sambrook, et al., Ref. Above, op. City). About 10 clones were obtained. Spreading an aliquot of the phage suspension on a bacterial carpet in the presence of X-gal (bromo-5-chloro-4-indolyl-3- ⁇ -D-galactoside) and isopropylthio- ⁇ -D- galactoside (IPTG), according to the technique described by Huynh et al., ref. above, allowed to determine that 81% of these phages have integrated a soy cDNA.
  • X-gal bromo-5-chloro-4-indolyl-3- ⁇ -D-galactoside
  • IPTG isopropylthio- ⁇ -D- galactoside
  • Section 3 Immunological screening of the phage library of complementary DNA constructed from the messenger RNAs of soy cells.
  • the creation of a library in the lambda vector gt11 makes it possible to achieve the expression of the cloned cDNAs, that is to say to have the proteins encoded by the messenger RNAs which served to construct this library synthesized.
  • This synthesis is carried out after induction by IPTG (isopropy Ithio- ⁇ -D-galactoside); the proteins synthesized can then be recognized by the antibodies obtained against tobacco ⁇ -1,3-glucanase (cf. section 1).
  • the clones producing these proteins can then be identified and isolated according to a protocol known to those skilled in the art and described for example in Sambrook et al. (op. cited).
  • phages from the soy cDNA library are spread on Petri dishes and lysis plaques are obtained after 2 h 30 min of incubation at 42 ° C.
  • a nitrocellulose filter (Schleicher and Sch ⁇ ll, BA 85) impregnated with IPTG is deposited on the surface of the dishes and left in contact with the agar medium for 4 h at a temperature of 37oC, then replaced by a second filter which is left for 6 h on the same medium.
  • the filters removed from the box are then immersed for 30 min in a solution, called TNT solution, composed of 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% of Tween 20 detergent, then for 30 min a buffer called blocking buffer, consisting of gelatin in 1% solution in TNT solution.
  • TNT solution composed of 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% of Tween 20 detergent
  • a buffer called blocking buffer consisting of gelatin in 1% solution in TNT solution.
  • the filters are then treated for 3 h in a solution containing the anti- ⁇ -1,3-glucanase polyclonal antibodies obtained previously (see section 1), diluted in the blocking buffer. They were then immersed for 10 min successively in each of the following solutions:
  • TNT + 0.1% BSA solution bovine serum albumin
  • the antigen-antibody complex formed is then revealed using secondary antibodies conjugated by coupling with a peroxidase ("Immuno conjugate GAR / IgG (H + L) / Po" from Nordic Immunology, Tilburg, Netherlands).
  • the chemical revealing reaction uses chloro-4 naphthol-1 as a chromogenic substrate (giving a blue precipitate).
  • the positive lysis ranges, that is to say corresponding to clones which synthesize ⁇ -1,3-glucanase, are then identified on the Petri dish and the bacteriophages are removed to be purified by means of a secondary immunological screening. , strictly identical to primary screening. One of these clones was retained for the rest of the study.
  • Section 4 Partial characterization of phage DNA from the soybean ⁇ -1,3-glucanase clone. a) Preparation of phage DNA.
  • the phage clone retained is amplified and its DNA is extracted according to the protocol described in the Amersham kit "cDNA cloning system GT11" (ref. RPN 1280), summarized below.
  • the phages are removed by coring and transferred to a culture of the E. coli Y1090 strain; after 15 min, 5 ml of Luria medium (Gibco) containing 5 mM CaCl 2 and 50 ⁇ g / ml of ampici lline are added. After an incubation for 4 h at 43 ° C. with shaking, the culture is centrifuged at 3000 rpm for 10 min.
  • the DNA of the phage particles present in the supernatant is then extracted and purified by treatment with polyethylene glycol and sodium chloride NaCl, centrifugation, treatment with proteinase K and precipitation. b) Analysis of the phage DNA of the selected clones
  • the DNA of the ⁇ -1,3-glucanase clones was hydrolyzed by the restriction enzyme EcoRI.
  • EcoRI restriction enzyme
  • a single EcoRI-EcoRI fragment of approximately 2300 bp is thus obtained by cleavage at the cloning sites. There is therefore no EcoRI site in the complementary DNA.
  • Section 5 Construction of the plasmid pBR1310, isolation of the complementary DNA insert coding for soy ⁇ -1,3-glucanase and determination of its sequence. a) Cloning into the plasmid pGEM-3Z
  • the plasmid pGEM-3Z (Promega, Madison, Wi, E.U.A.) was opened using the restriction endonucleases EcoRI and Smal, then purified and isolated by electrophoresis on agarose gel at low melting point.
  • This plasmid comprises a "polylinker" (multisite of cloning) successively comprising the restriction sites EcoRI, Smal and HindIII.
  • Plasmid pBR1310 ligation of the Smal and PvuII blunt ends with disappearance of these sites
  • the vector obtained was then extracted and purified by the alkaline lysis method (Birnboim and Doly, in Sambrook et al., Op. Cited).
  • the HindIII-HindIII fragment (of approximately 1490 bp), was prepared by digestion of the HindIII-EcoRI fragment with the endonuclease HindIII, purified by electrophoresis on low-melting agarose gel and isolated. This fragment was cloned into the DNA of the form. replicative of the single-stranded phage M13mp19 (Pharmacia) open to the HindIII restriction site.
  • the vector M13 containing the HindIII-HindIII insert of 1490 bp is called M13BR137. The sequence of this insert was determined according to the dideoxyribonucleotide method (Sanger et al., PNAS-USA, 14, 5463-5467, 1977). b) Analysis of the cDNA sequence of soybean ⁇ -1,3-glucanase.
  • This sequence contains a single open reading phase (not interrupted by a stop codon) compatible with the apparent molecular weight observed by agarose gel electrophoresis: the sequence starting with an ATG codon in position 114 and ending with the TAA stop codon in position 1224-1226 coding for a protein of 370 amino acids.
  • a signal peptide is expected by a person skilled in the art because ⁇ -1,3-glucanases are proteins which can be natural either accumulated in the vacuoles of plant cells, or secreted, which requires the presence of a signal peptide.
  • the mature ⁇ -1,3-glucanase (that is to say cleaved from its signal peptide) provided therefore comprises 338 amino acids.
  • This software provides for expression in prokaryotic cells a part coding for a signal peptide, the same sequence (Na 2 ) coding for the same signal peptide of 32 amino acids.
  • the peptide sequence already known closest to that of the protein of 370 amino acids deduced from the DNA complementary to soy ⁇ -1,3-glucanase is that of the protein of 369 amino acids deduced from the DNA complementary to a ⁇ -1,3-glucanase from Nicotiana plumbaginifolia (cf. the Swissprot database ref. Gub $ Nipl. and De Loose et al., 1988, Gene, 70, 13-23).
  • ⁇ -1,3-glucanases are known, the amino-terminal sequences of which have been determined experimentally. They are the ⁇ -1,3-glucanases of Nicotiana tabacum tobacco (H. Shinshi et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5541-5545), of Nicotiana plumbaginifolia (M. De Loose et al., 1988, Gene, 70, 13-23), bean Phaseolus vulgaris (BV Edington et al., 1991, Plant Molecular Biology, 16, 81-94) and barley Hordeum vulgare (PB Hoj et al. , 1988, Febs Lett., 230, 67-71).
  • Section 6 Construction of an expression vector in E. coli:
  • the GAG CTC sequence of the SacI restriction site located at position 575 of the vector M13BR137 is replaced by site-directed mutagenesis as described below, by the sequence GAG CAC. Codon
  • GCT corresponding to an alanine residue in the initial cDNA sequence, is therefore replaced by the codon GCA also corresponding to an alanine residue (silent mutation).
  • the single-stranded form of the vector M13BR137 is isolated according to the protocol described by Sambrook et al., Op cited from a culture of the bacterial strain E. coli DH5 ⁇ F '(Gibco-BRL) previously transformed by this vector according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • the mutagenesis is carried out according to the protocol of the kit "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system" (Amersham-ref. RPN 1523-version 2), using an oligonucleotide synthesized chemically on the synthesizer d Millipore Biosearch 8700 DNA, the sequence of which is shown below:
  • the site-directed mutagenesis technique described in detail in the booklet accompanying this kit and summarized below, consists of hybridize the above oligonucleotide with the single-stranded form of the vector M13BR137, then cause the Klenow polymerase and the DNA ligase T4 to act in the presence of thionucleotide dCTP- ⁇ -S (oc-thiodesoxycytidine triphosphate) in order to obtain a circular double-stranded shape of the recombinant phage, one of the strands of which carries the desired mutation and is protected against cleavage by the endonuclease Ncil and degradation by exonuclease III. A hyphenation is then induced on the other strand (having served as a matrix) using the endonuclease Ncil, then this strand is eliminated by the subsequent action of exonuclease III.
  • vector M13BR138 The resulting vector, called vector M13BR138, was cloned into the E. coli DH5 ⁇ F 'strain and sequenced; as expected, it has a mutated sequence by replacing a GCT codon with a GCA codon, which has deleted the SacI restriction site from the coding part.
  • the single-stranded form of the vector M13BR138 is isolated as described above, a site-directed mutagenesis is then carried out under the same conditions as above using the chemically synthesized oligonucleotide, the sequence of which is given below:
  • vector resulting from this mutagenesis called vector
  • M13BR139 is cloned into the bacterial strain E. coli DH5 ⁇ F '; it was sequenced, which confirmed the introduction upstream of the translation initiation ATG codon, the NdeI restriction sites and
  • the single-stranded form of the vector M13BR139 is isolated, a directed mutagenesis is then carried out on the 3 ′ part of the insert using the oligonucleotide of the following sequence and under the conditions already described:
  • vector resulting from this mutagenesis called vector
  • M13BR140 is cloned into the bacterial strain E. coli DH5 ⁇ F '. Its sequence was determined, which confirmed the creation downstream of the TAA stop codon of the HindIII and SacI restriction sites. This sequence is shown in Figure 3. d) Construction of the plasmid pBR141.
  • the replicative form of the vector M13BR140 is isolated and purified according to the protocol of Birnboim and Doly described in Sambrook et al., Op. cited.
  • the insert Ndel-HindIII containing the coding part of ⁇ -1,3-glucanase was isolated by digestion with the restriction enzymes Ndel and HindIII and purified by electrophoresis on agarose gel and electroelution (Sambrook et al., Op. cited).
  • This insert is then ligated using T4 DNA ligase into the large NdeI-HindIII fragment of the plasmid p373.2, the construction and the constituent elements of which are described in patent application EP-A-0360641 (FIG.
  • the plasmid DNA of the clone containing the plasmid pBR141 is extracted according to the protocol of Birnboim and Doly (Sambrook et al., Op. Cited).
  • the first amino acid of the latter the glutamine residue (capable of cyclizing into pyroglutamate, which makes it impossible to determination of the amino-terminal sequence) being replaced by a methionine residue initiating translation.
  • plasmid pBR59 which is cloned in the bacterial strain E. coli RR1.
  • ⁇ -1,3-glucanase is under the control of a promoter (described in patent application EP-A-0360641) analogous to the inducible "tac" promoter (Sambrook et al., Op. City) by isopropylthio- ⁇ -D- galactoside (IPTG).
  • IPTG isopropylthio- ⁇ -D- galactoside
  • Section 7 Expression of soybean ⁇ -1,3-glucanase in E. coli.
  • the E. coli RR1 strain containing the expression vector pBR59 and an E. coli RR1 strain containing the plasmid p373.2 are cultured in Luria medium (Gibco) containing 100 mg / l of the antibiotic ampicillin overnight at 37oC. After a dilution of the culture to 1 / 100th in the same medium, the bacteria are returned to culture for 1 hour at 37oC, then IPTG is added to a final concentration of 1 mM. Culture is then for followed for 3 hours and the bacteria are harvested by centrifugation.
  • Luria medium Gibco
  • the bacteria are resuspended in a buffer, called a loading buffer of the following composition:
  • Section 8 Measurement of the enzymatic activity of the recombinant soybean ⁇ -1,3-glucanase expressed in E. coli, isolation and purification of three forms of this protein and determination of their amino-terminal sequences.
  • ⁇ -1,3-glucanase The activity of ⁇ -1,3-glucanase is measured by a colorimetric method making it possible to estimate the amount of monomers or oligomers released by the enzyme from a substrate (laminarin) by determining the reducing power sugars thus released.
  • This method described by G. Ashwell, 1957, in “Methods in Enzymology III", 73-105, S.P. Colowick and N.U. Kaplan Eds. is summarized below.
  • the volume of the mixture is adjusted to 5 ml with distilled water and its absorbance is measured by spectrophotometry at a wavelength of 500 nm.
  • the quantity of reducing sugars released is estimated by comparison with the absorbance values obtained with a standard range established using a glucose solution.
  • the enzymatic activity of ⁇ -1,3-glucanase is expressed in nanomoles of glucose equivalent released per minute, under the conditions of the enzymatic test described above.
  • Isolation and purification include steps of extraction, precipitation with ammonium sulphate, FPLC liquid chromatography on a cation exchange column based on synthetic polymer and exclusion chromatography (molecular sieving) on a cross-linked agarose, according to the protocol described below: STEP 1 :
  • the bacterial pellet is treated with stirring at 4 ° C. with a pH 8 buffer solution (30 mM Tris, 1 mM EDTA). After centrifugation (15,000 g, 30 min) the collected supernatant (lysate) constitutes the crude extract.
  • the protein extract is precipitated by ammonium sulphate (60% saturation).
  • the proteins which have precipitated are collected by centrifugation (15,000 g for 30 min), dissolved in a buffer solution (100 mM ammonium acetate, pH 5.2) and dialyzed overnight at 4 ° C. against an acetate buffer solution. 100 mM ammonium, pH 5.2.
  • the concentration of the buffer solution of the protein extract is reduced to 10 mM by passage through ready-to-use mini-columns (PD 10 Pharmacia).
  • the protein extract is then purified by ion exchange chromatography on a column based on synthetic polymer (Mono-S column from Pharmacia) according to the FPLC technique from Pharmacia.
  • the extract is deposited on the Mono-S column equilibrated with a 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.2.
  • the proteins retained on the column are eluted by a linear gradient of 10 to 500 mM of ammonium acetate.
  • fractions containing ⁇ -1,3-glucanase activity are concentrated by ultrafiltration on a Centricon 10 concentration cartridge (Amicron).
  • the purification of the protein is continued by chromatography (molecular sieving) on a crosslinked agarose (Superose 12 Pharmacia column). Elution is carried out with a 500 mM ammonium acetate buffer solution, pH 5.2.
  • Three forms of the recombinant protein are thus isolated and purified, exhibiting a ⁇ -1,3-glucanase activity with apparent molecular weights of 36 ⁇ 3, 37 ⁇ 3 and 39 ⁇ 3 kDa.
  • the molecular weight of the protein deduced from the coding sequence is 37,387 Da.
  • Their respective specific activities measured are 1.65, 1.75 and 1.76 nanomoles of glucose equivalent released per minute per microgram of proteins, not significantly different values.
  • Section 9 Construction of an expression vector in plant cells: the binary vector pBR60. a) Preparation of a complete recombinant gene for soy ⁇ -1,3-glucanase and cloning thereof into the binary vector pBIN19.
  • the DNA carrying the coding sequence was obtained by cutting the vector M13BR140, obtained in section 6c) (cf. FIG. 3), using the restriction enzymes BamHI and Sacl, purified by agarose gel electrophoresis at low melting point. This DNA was inserted between a promoter sequence comprising the so-called cauliflower mosaic virus (35S CaMV) promoter 35S and a terminator sequence comprising the nopaline synthase terminator from Agrobacterium tumefaciens. b) Preparation of the promoter sequence comprising the promoter 35S of the cauliflower mosaic virus.
  • 35S CaMV cauliflower mosaic virus
  • the promoter sequence, the coding sequence of the DNA complementary to ⁇ -1,3-glucanase and the terminator sequence were ligated using DNA ligase T4 in the open binary vector pBIN19 using endonucleases. HindIII and EcoRI.
  • This vector carries two genes for resistance to kanamycin, one capable of being expressed in bacteria, the other located immediately upstream of the complete recombinant gene (cf. Bevan, 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711 -8721) which can be transferred to plant cells.
  • the kanamycin resistance gene will serve as a selection marker during the transformation and progeny analysis steps of the transformed plants.
  • the vector obtained is called plasmid pBR60.
  • the nucleotide sequence of the complete recombinant gene, verified by sequencing, as well as the deduced peptide sequence are represented in FIG. 5.
  • the plasmid is cloned in the strain E. coli MC1061 (Clontech).
  • Section 10 Transfer into Agrobacterium tumefaciens of the plasmid pBR60 containing the recombinant gene for ⁇ -1,3-glucanase a) Transfer into Agrobacterium tumefaciens.
  • This transfer is carried out as described below by three-parent conjugation between the E. coli MC1061 strain containing the vector pBR60 and the Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain (Clontech) using the E. coli HB101 strain containing the mobilizing plasmid pRK2013 (DM Figurski et al., 1979, Pro. Ntl. Ac. Sci. USA, 76, 1648-1652).
  • E. co li MC1061 containing the plasmid pBR60 and an E. coli strain HB101 (Clontech) containing the plasmid mobilisa pRK2013 are cultivated at 37oC in Luria medium (Gibco) in the presence of 25 mg / l of kanamycin.
  • the Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain is cultured at 28 ° C. in Luria medium (Gibco) in the presence of 100 mg / l of rifampicin (it is resistant to this antibiotic); 200 ⁇ l of each of the three cultures are mixed, spread on Luria agar medium (Gibco) and incubated overnight at 28oC.
  • the bacteria are then resuspended in 5 ml of Luria medium and aliquots are spread on Petri dishes containing a minimum agar medium (described in "Plant Molecular Biology Manual” Gelvin et al., Kluwer Academy Press, 1988) in presence of 100 mg / l of rifampicin and 25 mg / l of kanamycin. Under these conditions, only the colonies of Agrobacterium tumefaciens which have integrated the plasmid pBR60 grow (the E. coli strains cannot grow under these conditions). These contain the recombinant ⁇ -1,3-glucanase gene in a context allowing its folding.
  • Nicotiana tabacum tobacco grown in vitro was infected with Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pBR60 according to the procedure of Horsch et al., Well known to those skilled in the art (Horsch RB et al., 1985, Science 227, 1229-1231) , the main steps of which are set out below.
  • Discs of leaves of axenic tobacco plants N. tabacum (Wisconsin Havana 38 variety susceptible to pathogenic fungi) are incubated in a culture of A. tumefaciens hosting the plasmid pBR60.
  • the discs drained on Whatman paper were transferred to culture media in petri dishes in order to multiply the transformed cells so as to obtain calluses, then produce buds in the presence of cefotaxime (500 ⁇ g / ml) intended to eliminate Agrobacterium tumefaciens and kanamycin (100 ⁇ g / ml).
  • the buds resistant to kanamycin were then transferred to a medium allowing induction of the roots in the presence of cefotaxime and kanamycin.
  • the seedlings are then transplanted into terrines in a substrate composed of peat and potting soil and put to grow in the greenhouse. All transformed plants (generation R0) having survived the stages of regeneration and acclimatization in the greenhouse were found to be morphologically normal and fertile. They were self-fertilized and gave seeds (generation R1).
  • Section 12 Analysis of the genomic DNA of transformed tobacco plants (generation R0) according to the Southern Blot technique.
  • Section 13 Demonstration of the expression of soy ⁇ -1,3-glucanase in transformed tobacco plants (of the R0 generation). a) Preparation of crude extracts of proteins from transformed tobacco plants (generation R0).
  • the crude protein extracts were prepared from different plant tissues (root, stem, leaf, etc.).
  • the tissue fragments were frozen in liquid nitrogen, reduced to powder and stored at -20oC.
  • the powder was extracted at 4oC in the presence of a 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 5.2 and subjected to centrifugation at 10,000 g.
  • the concentration of total proteins was determined on the supernatants, hereinafter called crude protein extracts, following the Bradford technique (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254).
  • loading buffer consisting of 0.125 M Tris HCl, pH 6.8, SDS
  • Immunodetection is carried out according to a protocol which comprises the following stages:
  • the fingerprint obtained shows the presence of a protein of approximately 37 ⁇ 3 kDa for the transformed plants, absent from the control plants (the protein deduced from the cDNA sequence, cleaved from its supposed signal peptide for expression in eukaryotic cells, has a molecular weight of 38,156 Da).
  • the apparent molecular weight obtained for the recombinant protein expressed in the transformed tobacco plants was compared with that obtained for the natural protein present in an extract of soybean cells (cf. section 1) and the natural ⁇ -1,3-glucanase. tobacco present in an extract of tobacco cells (see section 1), by electrophoretic migration on parallel tracks according to the protocol described by Laemmli (UK. Laemmli, Nature 227, 1970, 680-685).
  • the sizes of these proteins were compared with those of proteins of known molecular weights (molecular weight markers between 14,000 and 97,400 Da from Bio-Rad- ref. 61-0304).
  • the fingerprints obtained after Western Blot show that the soy ⁇ -1,3-glucanase synthesized in tobacco has the same apparent molecular weight as that of the natural soy protein: 37 ⁇ 3 kDa.
  • the post-translational maturation of this protein is therefore carried out in the same way in a plant other than soybeans.
  • This apparent molecular weight of soybean ⁇ -1,3-glucanase is approximately 3 kDa higher than that of tobacco ⁇ -1,3-glucanase whose molecular weight is 34,969 Da. (H. Shinshi et al., 1988, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 85, 5541-5545).
  • the molecular weight of soybean ⁇ -1,3-glucanase is therefore close to 38 kDa, which is very close to the molecular weight provided for in section 5 for the mature protein of 338 amino acids provided for in section 5, which is of 38,156 Da.
  • Section 14 Measuring resistance to pathogenic fungi in transformed tobacco plants (generation R1)
  • the regenerated tobaccos (generation R0) in the presence of kanamycin were self-pollinated.
  • the mature seeds (generation R1) are sown on Murashige and Skoog medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the seedlings are grown in pots (3 ⁇ 3 cm). When the 5th leaf appears, the plants are inoculated by depositing a suspension of 5 ⁇ 10 endoconidia of this fungus at the level of the collar.
  • the endoconidia are taken from mycelial cultures of this fungus maintained on the medium "potato dextrose agar” (Difco) at 22oC and in the dark. Resistance to Chalara elegans is assessed 45 days after inoculation.
  • the plants are noted according to the symptoms of infection and according to their level of vegetative development.
  • the resistance index of the descendants of a transformed plant represents the average of the scores made on the seedlings from this plant.
  • Section 15 Purification of recombinant ⁇ -1,3-glucanase from transformed tobacco leaves (generation R1) and determination of its amino terminal sequence
  • the recombinant protein was purified from crude extracts of proteins from transformed tobacco leaves, by precipitation with ammonium sulphate and FPLC liquid chromatography on a cation exchange column based on synthetic polymer on a crosslinked agarose, according to the protocol described below:
  • Step 1
  • the protein extract is precipitated by ammonium sulphate (60% saturation).
  • the proteins which have precipitated are recovered by centrifugation (15,000 g for 30 min), dissolved in a buffer solution (100 mM ammonium acetate pH 5.2) and dialyzed overnight at 4 ° C. against an acetate buffer solution. 100 mM ammonium pH 5.2.
  • the concentration of the buffer solution of the protein extract is reduced to 10 mM by passage through ready-to-use mini-columns (PD10. Pharmacia).
  • the protein extract is then purified by ion exchange chromatography based on synthetic polymer (column Mono-S Pharmacia) using an FPLC technique (Pharmacia).
  • the extract is deposited on the Mono-S column equilibrated with a 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.2.
  • the proteins retained on the column are eluted by a linear gradient from 10 to 500 mM of ammonium acetate.
  • soy ⁇ -1,3-glucanase is identified by its molecular weight (electrophoresis on polyacrylamide gel in the presence of SDS-silver revelation), by its immunoblot
  • the samples to be treated are brought to the surface of a PVDF (polyvinylidenedifluoride) filter by electrotransfer according to the method described by H. TOWBIN et al. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA (1979), 4350-4354, after electrophoresis on polyacrylamide gel in the presence of SDS.
  • PVDF polyvinylidenedifluoride
  • the filter is introduced into a protein sequencer (model 470 A sold by the company Applied Biosystems (EUA)) equipped with a chromotograph (model 430 from Applied Biosystems) which continuously analyzes the phenylthiohydantoic derivatives formed, after each degradation cycle. .
  • EUA Applied Biosystems
  • Stem segments are taken from the apex of rapeseed plants (Brassica napus: spring varieties Brutor and Westar and winter variety) about 1 m high. These segments are sterilized on the surface, rinsed in sterile water, cut into segments approximately 1.5 cm long and placed in a tube containing medium A.
  • the end of this segment is inoculated by depositing a suspension of the Agrobacterium rhizogenes strain containing the plasmid pBR60.
  • Transformed roots appear on the stem segment after 1 to 2 weeks, they are removed and placed on the agar medium B (15 g / l) and supplemented with 500 ⁇ g of cefotaxime / ml. b) Regeneration of transformed plants.
  • Root fragments are incubated for 15 days on medium D containing 3 mg / l of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, then placed on the RCC medium for induction of buds.
  • Rooted plants are then obtained by passing the buds over media F and G.
  • Section 17 Demonstration of the expression of soybean ⁇ -1,3-glucanase in transformed rapeseed plants. a) preparation of crude extracts of proteins from transformed rapeseed plants (generation R0)
  • the crude protein extracts were prepared from the leaves of the plant. These extracts were frozen in liquid nitrogen, reduced to powder and stored at -20oC. The powder was extracted at 4oC in the presence of a 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 5.2 and subjected to a centrifugation of 10,000 g. The concentration of total proteins was determined on the supernatants, hereinafter called crude protein extracts, following the Bradford technique (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254). b) Demonstration by immuno-fingerprints (Western Blot)
  • the antigen-antibody complex is then revealed using a streptavidin-biotin system conjugated to alkaline phosphatase with the RPN 23 kit from Amersham ("Blotting detection kit”), used according to the manufacturer's instructions.
  • the fingerprint obtained shows the presence of a protein of approximately 37 ⁇ 3 kDa for the transformed plants, absent from the control plants.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un ADN recombinant qui code pour une protéine à activité beta-1,3-glucanase ou pour un précurseur de cette dernière qui comprend la séquence (a1) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1). Application: ADN recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité beta-1,3-glucanase.

Description

ADN RECOMBINANT CODANT POUR UNE NOUVELLE PROTEINE A ACTIVITE
BETA-1,3-GLUCANASE DE SOJA
L'invention concerne un ADN recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité β-1 ,3-glucanase, ou pour un précurseur de cette protéine, une bactérie contenant cet ADN recombinant, une cellule végétale, une plante ou une partie de plante, en particulier une semence végétale, transformées par cet ADN recombinant, ainsi que cette nouvelle protéine et un procédé pour la préparer.
Il est connu que les plantes cultivées sont soumises à des attaques par des parasites, tels que les champignons phytopathogènes, qui sont responsables de pertes importantes de récoltes. Le principal moyen actuel de lutte contre ces champignons réside dans l 'uti lisation de substances chimiques à activité fongicide. On sait aujourd'hui que les plantes réagissent naturellement à ces attaques par divers mécanismes de défense, malheureusement en général à déclenchement trop tardif et d'intensité trop faible, pour être suffisamment efficaces.
L'un de ces mécanismes comprend l'induction d'une enzyme appelée β-1,3-glucanase E.C.3.2.1.39 (Kombrink et al., 1988, Pr Ntl Acad. Sci. USA, 85, 982-986 et Pegg et al., 1981, Physiol. Plant. Pathol. 19,371-382). Cette induction peut être artificiel lement déclenchée sous l'effet d'éliciteurs, c'est-à-dire de composés d'origine biologique capables d'induire dans une plante saine les réactions de défense qu'elle déploie naturellement lors d'une infection par des agents pathogènes, ou d'un déséqui libre hormonal provoqué par l'auxine, les cytokinines ou l'éthylène (Abeles et al., 1971, Plant Physiol. 47,129-134 et de Loose et al., 1988, Gène, 70,13-23).
Les β-1,3-glucanes sont des polymères linéaires polysaccharidiques constitués d'unités de glucose associées par des liaisons β-1,3 présentant parfois des ramifications de type β-1,4 ou β-1,6 (Farka 1982, in "Fungal protoplasts", Peberdy et Ferencry éditions Dekker Inc). Ces polysaccharides constituent un composant typique du squelette de la paroi de la plupart des champignons et notamment des champignons phytopathogènes. Les β-1,3-glucanases sont capables de les dégrader par fragmentation des chaînes de β-1,3-glucane. La plupart des β-1,3-glucanases végétales connues sont de type endo.
Il est connu d'autre part que les progrès récents des technologies dites d'ADN recombinant et de la transformation des cellules végétales ainsi que de la régénération de plantes entières à partir de ces dernières, permettent l'introduction d'un gène d'intérêt dans des cellules végétales, une plante ou une partie de plante, de façon à obtenir un phénotype avantageux.
Des séquences d'ADN codant pour plusieurs β-1,3- glucanases végétales, notamment une β-1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (De Loose et al., 1988, Gène, 70,13-23) et une β-1,3-glucanase de soja (Takeuchi et al., 1990, Plant Physiol, 93,673-682) ont été isolées, clonées et déterminées. La demande de brevet EP-A-0 353 191 décrit l'isolement et le clonage de différents fragments d'ADN complémentaire dont l'assemblage permet de déduire la séquence d'ADN complémentaire codant pour une β-1,3-glucanase de tabac, ainsi que de la séquence d'ADN génomique codant pour cette enzyme. Le document EP-0 392225 divulgue notamment la construction d'un gène chimérique codant pour cette β-1,3-glucanase de tabac, la transformation du tabac par ce dernier et la vérification par Western Blot et révélation à l'aide d'anticorps polyclonaux, de la surexpression de cette protéine endogène dans les plantes transformées. Cette demande de brevet ne montre pas que la β-1,3-glucanase de tabac recombinante est active biologiquement ni a fortiori qu'elle confère une résistance desdites plantes transformées aux agents pathogènes.
On sait, par ailleurs, que les β-1,3-glucanases, telles que par exemple la β-1,3-glucanase de Bacillus subtilis, sont des enzymes utiles dans la conversion de la biomasse, notamment dans certains secteurs de l'industrie papetiere et dans l'industrie agroalimentai re, en particulier la brasserie (Headen, 1986, Brewers Gardian, 115, 7 et MacQueen, octobre 1987, New Scientist, 66).
Il est connu enfin que de nombreuses protéines recombinantes peuvent être produites par des cellules eucaryotes et des bactéries, suite à l'introduction dans celles-ci de gènes codant pour lesdites protéines à l'aide des techniques classiques de génie génétique.
La présente invention concerne un nouvel ADN recombinant caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité β-1,3-glucanase ou pour un précurseur de cette dernière, cette protéine à activité β-1,3-glucanase comprenant la séquence d'acides aminés
(a.) suivante : Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ser Ala Asn Asp
Val Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Ile Lys Arg Met Arg Leu Tyr Asp
Pro Asn Gln Ala Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ser Gly Ile Glu Leu Ile
Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Gly Leu Ala Thr Asn Pro Asp Thr
Ser Arg Gln Trp Val Gln Lys Asn Val Leu Asn Phe Trp Pro Ser Val Lys Ile Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Val Gly Gly Ser Ser
Ser Val Ala Gln Tyr Val Leu Pro Ala Ile Gln Asn Val Tyr Gln Ala Ile
Arg Ala Gln Gly Leu His Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ser Ile Asp Met
Thr Leu Ile Gly Asn Ser Phe Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg Gly Asp
Val Arg Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Ile Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Asn Ala Pro Leu Leu Val Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Arg
Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ala Pro Asn Val Val Val Trp
Asp Gly Gln Tyr Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Val
His Ala Ala Ile Asp Asn Thr Lys Ile Gly Tyr Val Glu Val Val Val Ser
Glu Ser Gly Trp Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ala Ala Thr Tyr Asp Asn Ala Arg Val Tyr Leu Asp Asn Leu Val Arg Arg Ala Asn Arg Gly Ser Pro Arg
Arg Pro Ser Lys Pro Thr Glu Thr Tyr Ile Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn
Gln Lys Asn Pro Glu Ile Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Asn Pro Asn Lys Gln Lys Lys ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1).
Un degré d'homologie élevé signifie ici une homologie
(rapport entre les acides aminés identiques et le nombre total d'acides aminés) d'au moins 80 %, et de préférence d'au moins 90 %, des séquences d'acides aminés, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - option GAP.
La séquence peptidique déjà connue la plus proche de celle de la séquence (a.) de 307 acides aminés est celle de la protéine de 369 acides aminés déduite de l'ADN complémentaire d'une β- 1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (cf. la banque de données Swissprot réf. Gub$Nipl. et De Loose et al., 1988, Gène, 70,13-23). Une comparaison de ces deux séquences à l'aide de la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48,443-453, montre que 213 acides aminés sont identiques sur 307, soit une homologie d'environ 69 %. Cette méthode algorithmique, qui considère tous les alignements possibles et crée un alignement, représenté sur la figure 7, dans lequel le plus possible d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignées est minimal, est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - option GAP.
Ce nouvel ADN recombinant peut servir à l'expression de cette protéine à activité β-1,3-glucanase, soit pour conférer à une plante ou une partie de plante qui exprime celle-là, une résistance accrue aux agents pathogènes, soit pour produire cette protéine à l'aide de cellules eucaryotes, notamment les ascomycètes, tels que la levure ou les champignons filamenteux, par exemple, Cryphonectria parasitica ou les cellules végétales, ou de micro-organismes procaryotes, tels que par exemple Escherichia coli.
Cet ADN recombinant peut comporter immédiatement en aval de la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a 1) la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a,) ci-après :
Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Gly Lys Arg Leu Gly Lys Val Val Ile Asp Asp Phe Asn Ala Thr Thr Ser Ile Lys Ser Asp Val tronquée dans sa partie carboxyterminale de 0 à 27 acides aminés. Il est avantageux que cet ADN recombinant comporte immédiatement en amont de la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1), un codon pour le Gln.
Un ADN de ce type apprécié est celui qui code pour une protéine à activité β-1,3-glucanase ou pour un précurseur de cette protéine, qui comporte la séquence (a5) suivante :
Gln Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ser Ala Asn Asp Val Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Ile Lys Arg Met Arg Leu Tyr Asp Pro Asn Gln Ala Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ser Gly Ile Glu Leu Ile Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Gly Leu Ala Thr Asn Pro Asp Thr Ser Arg Gln Trp Val Gln Lys Asn Val Leu Asn Phe Trp Pro Ser Val Lys Ile Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Val Gly Gly Ser Ser Ser Val Ala Gln Tyr Val Leu Pro Ala Ile Gln Asn Val Tyr Gln Ala Ile Arg Ala Gln Gly Leu His Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ser Ile Asp Met Thr Leu Ile Gly Asn Ser Phe Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg Gly Asp Val Arg Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Ile Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Asn Ala Pro Leu Leu Val Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Arg Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ala Pro Asn Val Val Val Trp Asp Gly Gln Tyr Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Val His Ala Ala Ile Asp Asn Thr Lys Ile Gly Tyr Val Glu Val Val Val Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ala Ala Thr Tyr Asp Asn Ala Arg Val Tyr Leu Asp Asn Leu Val Arg Arg Ala Asn Arg Gly Ser Pro Arg Arg Pro Ser Lys Pro Thr Glu Thr Tyr Ile Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys Asn Pro Glu Ile Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Asn Pro Asn Lys Gln Lys Lys Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Gly Lys Arg Leu Gly Lys Val Val Ile Asp Asp Phe Asn Ala Thr Thr Ser Ile Lys Ser Asp Val
Cet ADN recombinant comporte de préférence en amont de la séquence codant pour la séquence (a.) précédée éventuellement d'un codon pour Gln une séquence signal, choisie en fonction de la cellule hôte, qui a pour fonction de permettre l'exportation de la protéine hors du cytoplasme.
Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, tels que par exemple Escherichia coli, cette séquence signal peut être, soit une séquence dérivée d'une séquence codant pour un précurseur naturel d'une protéine exportée par un micro- organisme procaryote, par exemple le peptide signal OmpA (Ghrayeb et al., 1984, EMBO Journal, 3, 2437-2442) ou un précurseur de la phosphatase alcaline (J. Bact. 1983, 154, 366-3747), soit une séquence non endogène provenant d'une séquence codant pour précurseur eucaryote (par exemple le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine), soit une séquence codant pour un peptide signal synthétique (par exemple celui décrit dans la demande de brevet FR n 2 636 643, de séquence :
Met Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Pro Ser Trp Asn Ala Gly Ala . Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que les ascomycètes, par exemple la levure Saccharomyces cerevisiae ou le champignon filamenteux Cryphonectria parasitica, cette séquence signal est de préférence une séquence dérivée d'une séquence codant pour un précurseur naturel d'une protéine sécrétée par ces cellules, par exemple pour la levure le précurseur de l'invertase (demande de brevet EP-0 123 289) ou le précurseur de la séquence prépro de la phéromone alpha (demande de brevet DK 2484/84), ou pour Cryphonectria parasitica. le précurseur de la séquence prépro de l'endothiapepsine, de séquence suivante, décrite dans la demande de brevet FR-2 666590 :
Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly
Ala Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn Ala Ser
Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg Asn Pro Asn Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly
Val Pro Ile Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln Asn Ser Thr Ser Gly Leu Ala Glu Arg
Pour une expression dans les cellules végétales, on utilise comme séquence signal, soit une séquence codant pour le peptide signal d'une protéine de cellule végétale connue pour être exportée, par exemple, la séquence suivante décrite dans la demande de brevet FR 2 665 177 : Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu Thr Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala soit une séquence signal codant pour le peptide signal de séquence
(a2) suivante
Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Asn Leu Arg Met Ala Asp Ala
Les séquences d'acides aminés (a1), (a2) et (a4) peuvent, par exemple, être codées par les séquences nucléotidiques (Na1), (Na2) et (Na4) ci-après :
(Na1) : ATTGGTGTGT GTTATGGCAT GCTGGGCAAC AATCTACCGT CAGCAAACGA TGTTATAGGT
CTTTATAGAT CAAATAACAT AAAGAGAATG AGACTCTATG ATCCTAATCA AGCTGCTCTA
GAAGCACTTA GAAATTCTGG CATTGAACTC ATTCTTGGGG TGCCAAACTC TGACCTTCAA
GGCCTTGCCA CCAATCCTGA CACTTCTCGT CAATGGGTGC AAAAAAACGT GTTGAACTTT
TGGCCTAGTG TCAAAATCAA GTACGTGGCA GTTGGAAATG AAGTGAGTCC CGTTGGAGGC TCTTCTTCGG TAGCCCAATA TGTTCTACCT GCCATCCAAA ATGTATACCA AGCAATAAGA
GCTCAAGGCC TTCATGATCA AATCAAGGTT TCAACATCTA TTGACATGAC CCTAATAGGA
AACTCTTTCC CTCCATCGCA AGGTTCCTTC AGGGGTGATG TGAGATCATA CCTAGATCCC
ATAATTGGGT ACTTGGTATA TGCAAATGCA CCATTACTAG TCAATGTGTA CCCTTATTTT
AGTTACACTG GTAACCCCCG TGACATATCA CTTCCCTATG CTCTTTTCAC AGCACCAAAT GTTGTGGTAT GGGATGGTCA ATATGGGTAC CAAAATTTGT TTGATGCTAT GTTGGATTCA
GTACATGCAG CCATTGATAA CACTAAGATT GGTTATGTGG AGGTTGTTGT ATCCGAGAGT
GGGTGGCCAT CAGATGGAGG ATTTGCTGCC ACTTATGACA ACGCACGCGT GTACTTAGAC
AATTTGGTTC GTCGTGCTAA TAGAGGAAGC CCAAGAAGGC CTTCGAAGCC CACTGAGACT
TATATATTTG CCATGTTCGA TGAAAATCAA AAAAATCCAG AGATAGAGAA ACATTTTGGG CTCTTCAATC CCAACAAACA AAAAAAA (Na2)
ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG GAACTATTGA CAGGAAACCT TCGCATGGCA GATGCT
(Na4) :
TACC CATTTGGGTT TGGAGGAAAG AGGCTAGGGA AAGTTGTTAT TGACGACTTC AATGCAACAA CTTCCATTAA GAGTGATGTG
L'invention concerne aussi, une unité d'expression de l'ADN recombinant défini précédemment, portée avantageusement par un vecteur, dit vecteur d'expression.
Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, en particulier dans Escherichia coli, l'ADN recombinant doit être inséré dans une unité d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de transcription efficace en aval du gène à exprimer. Cette unité doit également comporter un marqueur de sélection ou être introduite dans la cellule hôte en même temps qu'une unité d'expression d'un marqueur de sélection (par exemple à l'aide d'un vecteur d'expression qui porte ces deux unités). Toutes ces séquences doivent être choisies en fonction de la cellule hôte.
Pour une expression dans les cellules eucaryotes, telles que les ascomycètes, l'unité d'expression selon l'invention comprend l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression.
Pour une expression dans les cellules ascomycètes, telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insérer l'ADN recombinant entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription. L'unité d'expression porte un marqueur de sélection ou est introduite dans la cellule hôte en même temps qu'un marqueur de sélection. De préférence, ce marqueur de sélection est un marqueur auxotrophe (qui complemente une mutation des cellules réceptrices) qui permet la sélection des cellules qui ont intégré l'ADN recombinant en un nombre de copies élevé, soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie. Pour une expression dans les cellules ascomycètes, telles que celles des champignons filamenteux, par exemple ceux des genres Aspergillus, Neurospora, Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, l'unité d'expression selon l'invention porte l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, et éventuellement un marqueur de sélection et/ou des séquences télomériques. Il est en effet possible de sélectionner les transformants ayant intégré un ADN d'intérêt à l'aide d'un marqueur de sélection situé soit sur la même unité que l'ADN d'intérêt, soit sur une autre unité, ces deux unités étant alors introduites par cotransformation. L'ADN recombinant de l'invention peut être soit intégré au génome des champignons filamenteux, soit conservé sous forme extrachromosomique grâce à des séquences permettant la réplication et la partition de cet ADN.
Pour une expression dans les cellules végétales, il convient d'insérer l'ADN recombinant défini précédemment entre un promoteur et un terminateur efficaces dans les végétaux.
Le promoteur est de préférence un promoteur constitutif fort, par exemple le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ou un promoteur commandant une expression tissu - ou organe - spécifique comme le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase-oxygénase qui s'exprime préférentiel lement dans les feuilles et tout particulièrement les tissus du mésophylle (Kuhlemeier et al., 1987, Ann Rev Plant Physiol 38 : 221-257). On peut également utiliser un promoteur spécifique commandant par exemple une expression dans les graines ou au cours d'un stade précis du developpement de la plante, ou un promoteur inductible à la suite d'un choc thermique, d'une blessure ou de l'interaction entre la plante et des parasites (Kuhlemeier et al., 1987 référence citée ci-dessus), si une expression de l'ADN recombinant est recherchée dans ces situations.
On utilise la séquence terminatrice, comportant des sites de polyadenylation pouvant être isolée de gènes végétaux ou de gènes s'exprimant dans les végétaux, comme par exemple le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens.
L'invention concerne également une bactérie, par exemple de l'espèce E. coli, qui contient l'ADN recombinant défini précédemment, avec les moyens nécessaires à sa répli cation et son expression. Cette bactérie peut être utilisée dans la préparation d'une protéine à activité β-1,3-glucanase.
L'invention a également trait à une bactérie, par exemple de l'espèce E. coli, qui contient l'ADN recombinant défini ci- dessus avec les moyens permettant sa repli cation, laquelle donc peut servir au clonage de cet ADN recombinant et ainsi qu'à une bactérie susceptible d'infecter une plante avec transfert de matériel génétique, par exemple de l'une des espèces Agrobacterium rhizogenes et Agrobacterium tumefaciens, qui contient cet ADN dans un contexte permettant sa repli cation et donc peut servir à transformer des cellules végétales. La transformation des cellules végétales par l'ADN recombinant ci-dessus peut également être effectuée par une autre méthode biologique telle que la voie du tube pollinique (Zhong-xun Luo et al., Plant Molec. Biol. Rep., 1988, 6, 165-176) et la transformation directe de graines en germination (Toepfer R. et al., 1989, The Plant Cell., 1, 133-139), ou par une méthode physique telle que l'utilisation de polyéthylèneglycol, l'électroporation (Christou P. et al-, 1987, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 84, 3662-3699) et le bombardement à l'aide de microprojecti les (Klein T.M. et al., 1988, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 85, 8502-8505).
L'invention concerne également une cellule végétale caractérisée en ce qu'elle est transformée par l'ADN recombinant défini précédemment, avec les moyens nécessaires à son expression. Cette cellule végétale peut provenir d'une espèce de grande culture, telle que par exemple le maïs, le soja, la betterave, le blé, l'orge, le pavot, le colza, le tournesol, la luzerne et le sorgho, d'une espèce florale telle que le rosier, l'oeillet, le gerbera ou d'une espèce potagère telle αue la carotte, la tomate, la salade, la chicorée, le poivron, le melon et le chou. Des espèces particulièrement appréciées sont le colza Brassica napus, le tournesol Helianthus annuus et le tabac Nicotiana tabacum.
L'étape de transformation qui concerne une ou quelques cellules est suivie d'une étape de multiplication de ces cellules transformées de façon à obtenir des cals. lesquels peuvent donner naissance à des plantes transformées, par des processus d'organogénèse ou d'embryogenèse.
L'invention concerne donc aussi une plante ou une partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment. Une partie de plante particulièrement appréciée est la partie apte à former une nouvelle plante complète, notamment après semis, enfouissement ou repiquage, ou à produire des semences. Une telle partie est par exemple un grain, une graine, une semence, une bouture, une marcotte, etc. Ces plantes peuvent être l'une quelconque des espèces ci-dessus et plus particulièrement des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.
L'invention a également trait à un procédé pour obtenir des plantes résistantes aux parasites, tels que les champignons phytopathogènes, qui comprend une étape de transformation de cellules végétales par cet ADN recombinant, suivie d'une étape de multiplication des cellules transformées et d'une étape de régénération des plantes.
De préférence, l'étape de transformation des cellules végétales est effectuée in vitro à l'aide d'une agrobactérie (c'est-à-dire d'une bactérie du genre Agrobacterium) ayant intégré l'ADN recombinant d'intérêt.
L'invention concerne aussi les plantes résistantes aux agents pathogènes susceptibles d'être obtenues à l'aide du procédé défini ci-dessus.
L'invention a également trait à l'utilisation d'une plante contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment, comme géniteur dans un programme de sélection pour créer de nouvelles variétés végétales.
L'invention concerne aussi une nouvelle protéine à activité β-1,3-glucanase, qui comprend la séquence (a1) éventuellement immédiatement suivie de la séquence (a4) tronquée dans sa partie carboxyterminale de 0 à 27 acides aminés, et une nouvelle protéine qui comprend la séquence (a5).
Cette protéine présente de préférence une masse moléculaire apparente de 36 ± 3, 37 ± 3 ou 39 ± 3 kDa.
Cette protéine présente un intérêt comme enzyme de conversion de la biomasse qui contient des β-1,3-g lucanes, notamment dans certains secteurs de l'industrie papetiere et dans l'industrie agroalimentaire, en particulier la brasserie.
L'invention a également trait à un procédé de préparation de cette protéine qui comprend la mise en culture de bactéries, cellules végétales, cals végétaux, de plantes ou de parties de plantes contenant l'ADN recombinant défini précédemment, la lyse de ceux-ci. l'isolement et la purification de cette protéine.
L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ciaprès, divisé en sections, qui comprend des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certaines de ces sections concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention et d'autres des exemples de réalisation de l'invention donnés bien sûr à titre purement illustratif.
Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook et al. : "Molecular cloning : a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2e édition).
La description ci-après sera mieux comprise en se reportant aux figures 1 à 7.
La figure 1 représente une carte de restriction du fragment HindIII-EcoRI contenu dans le plasmide pBR1310 et contenant l'ADN complémentaire codant pour la β-1,3-glucanase de soja.
La figure 2 représente la séquence nucléotidique de l'insert HindIII-HindIII, partie de l'ADN complémentaire de la β1,3-glucanase de soja, les sites de restriction utilisés pour le clonage dans M13mp19 et pour les constructions ultérieures étant indiqués par des flèches, ainsi que la séquence peptidique déduite de cet ADN complémentaire. La figure 3 représente la séquence nucléotidique du fragment HindIII-HindIII de l'ADN complémentaire de la β-1,3-glucanase de soja, après mutagénèse (à l'issue de la section 6c), les sites de restriction utilisés pour le clonage dans M13mp19 et pour les constructions ultérieures étant indiqués par des flèches, ainsi que la séquence peptidique de la protéine traduite.
La figure 4 représente la séquence nucléotidique du fragment Ndel-HindIII de la partie codante du plasmide pBR59, plasmide d'expression dans E. coli, encadrée par les sites de restriction Ndel et HindIII et la séquence peptidique de la protéine traduite.
La figure 5 représente la séquence nucléotidique du gène recombinant complet et la séquence peptidique de la protéine traduite.
La figure 6 représente la séquence peptidique de la partie commune des protéines traduites dans E. coli et dans le tabac.
La figure 7 représente un alignement d'après la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453, de la séquence peptidique déduite de l'ADN complémentaire de la β-1,3- glucanase de soja (cf. figure 2) et de la séquence peptidique connue la plus proche, celle déduite de l'ADN complémentaire de la β-1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (banque de données Swissprot réf. Gub$-Nipl). Section 1 : Préparation d'anticorps polyclonaux contre la β-1,3- glucanase de tabac a) Purification de la β-1,3-glucanase de tabac.
Une β-1,3-glucanase de tabac a été purifiée jusqu'à homogénéité à partir de cals de tabac comme décrit ci-après. Des cals de tabac ont été cultivés in vitro sur un milieu de Murashige et Skoog (Murashige T. et Skoog F., 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497). Des extraits cellulaires sont obtenus par broyage du matériel végétal dans une solution tampon Tris-HCl 50mM pH 8,4 contenant 15 mM de β-mercaptoéthanol et 5 % de polyvinylpolypyrrolidone. La protéine est purifiée à partir de cet extrait par précipitati on au su lfate d ' ammonium, chromatog raphi e en phase l iqui de sur une colonne échangeuse de cations à base de polymère synthétique, et chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé selon le protocole décrit ci-après :
Etape 1 :
L'extrait proteique est traité par le sulfate d'ammonium (43 % de saturation). Les protéines ayant précipité sont recueillies par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solubilisées dans une solution tampon (acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2) et dialysées pendant une nuit à 4 C contre une solution tampon acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2.
Extemporanément, la concentration en acétate de la solution tampon de l'extrait proteique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à l'emploi (PD10 Pharmacia).
Etape 2 :
L'extrait proteique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions à base de polymère synthétique (colonne Mono-S de Pharmacia) selon la technique FPLC de Pharmacia.
L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient linéaire de 10 à 500 mM d'acétate d'ammonium.
A chaque étape, la β-1,3-glucanase est identifiée par son poids moléculaire (Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS - révélation à l'argent) et son activité est mesurée par une méthode colorimétrique (cf. section 8, ci-après) utilisant la laminarine (β-1,3-glucane extrait de Laminaria digitata - Sigma - réf. L9634) comme substrat. b) Préparation d'anticorps polyclonaux.
On a ensuite injecté à des lapins 25 μg de β-1,3-glucanase de tabac dans 500 μl d'adjuvant complet de Freund.
Trois injections de rappel de 25 μg dans l'adjuvant incomplet de Freund (500 μl) ont été réalisées à 3 semaines d'intervalle. L'immunsérum a été prélevé 3 semaines après la dernière injection.
Cet immunsérum reconnaît la β-1,3-glucanase de tabac, il reconnaît également la β-1,3-glucanase de soja. On a en effet vérifié qu'il permet de révéler cette dernière protéine par la technique de Western Blot (décrite dans la section 13 ci-après) à partir d'un extrait des protéines totales de soja (Glycine max cv Mandarin). Section 2 : Construction d'une banque phagique d'ADN complémentaire à partir d'ARN messagers de cultures cellulaires de soja. a) Préparation d'ARN messagers de cellules de soja.
Les ARN totaux de cellules de soja âgées de 5 jours
(Glycine max cv Mandarin), cultivées in vitro en absence d'auxine selon la méthode décrite par Leguay et al., 1987, Develop. Genetics 8 : 351-364, ont été extraits selon la méthode décrite par Jouanneau et al., 1984 Plant Physiol 74 ; 663-668, résumée ci-après. Les cellules préalablement lavées dans une solution saline sont broyées dans l'azote liquide ; l'homogénéisât est ensuite extrait par un mélange de phénol redistillé et de chloroforme. Après une étape de précipitation éthanolique, les ARN totaux sont dissous dans une solution tamponnée à pH 7,6.
La fraction poly (A) des ARN messagers (ARNm) a été isolée après 2 cycles de chromatographie d'affinité sur une colonne d'oligo (dT) cellulose comme décrit dans Sambrook et al. ("Molecular cloning : A Laboratory manual", second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory 1989). La quantification des ARN messagers est réalisée par spectrophotométrie selon un protocole bien connu de l'homme de l'art. b) Synthèse des ADN complémentaires.
Les ADN complémentaires (ADNc) ont été synthétisés selon la méthode décrite par Gϋbler et Hoffman, 1983 (Gène, 25 : 263- 269), méthode qui favorise la synthèse et le clonage d'ADNc complets : 7 μg d'ARNm ont ainsi été traités pour la fabrication du premier brin d'ADNc à l'aide du kit "Protoclone GT System" de Promega (réf. P3010). c) Clonage des ADN complémentaires.
L'ADNc double brin synthétisé est ensuite méthylé à l'aide de la méthylase EcoRI dans les conditions décrites dans l'ouvrage de référence Sambrook et al. (op cité). Cette enzyme permet de protéger les sites éventuels EcoRI de l'ADNc contre une coupure par l'endonucléase EcoRI, cette protection disparaissant pour les répliques de l'ADNc (qui ne sont pas méthylées).
Des linkers synthétiques EcoRI (fragments d'ADN double brin contenant le site EcoRI) sont alors rajoutés par ligation aux extrémités de l'ADNc. Après coupure par l'endonucléase EcoRI et élimination des linkers par chromatographie sur une colonne de tamis moléculaire G50 (Pharmacia), l'ADNc est ligué à l'aide de la
T4 DNA ligase dans le phage lambda gt11, vecteur de clonage et d'expression décrit par Huynh et al., "DNA cloning : a practical approach" IRL Press, D.M. Glover 1985, p. 49, selon le protocole
"lambda gt11 System", de Promega (réf-T3011), l'ADN phagique étant préalablement ouvert par l'endonucléase de restriction EcoRI et déphosphorylé. Des parties aliquotes du milieu de ligation sont ensuite empaquetées dans des particules phagiques en utilisant le kit commercialisé par Amersham ("In vitro packaging System for lambda DNA", réf. N334).
Le nombre de recombinants est ensuite estimé par comptage des plages de lyse obtenues sur un tapis bactérien de la souche E. coli Y1090 (Sambrook, et al., réf. ci-dessus, op. cité). Environ 10 clones ont été obtenus. L'étalement d'une partie aliquote de la suspension phagique sur un tapis bactérien en présence de X-gal(bromo-5-chloro-4-indolyl-3-β-D-galactoside) et d' isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG), selon la technique décrite par Huynh et al., réf. ci-dessus, à permis de déterminer que 81 % de ces phages ont intégré un ADNc de soja. Section 3 : Criblage immunologique de la banque phagique d'ADN complémentaire construite à partir des ARN messagers de cellules de soja. La réalisation d'une banque dans le vecteur lambda gt11 permet de réaliser l'expression des ADNc clones, c'est-à-dire de faire synthétiser les protéines codées par les ARN messagers qui ont servi à construire cette banque. Cette synthèse se fait après induction par l'IPTG (isopropy Ithio-β-D-galactoside) ; les protéines synthétisées peuvent alors être reconnues par les anticorps obtenus contre la β-1,3-glucanase de tabac (cf. section 1). Les clones produisant ces protéines peuvent ensuite être repérés et isolés selon un protocole connu de l'homme de l'art et décrit par exemple dans Sambrook et al. (op. cité).
10 phages de la banque d'ADNc de soja sont étalés sur des boîtes de Pétri et des plages de lyse sont obtenues au bout de 2 h 30 min d'incubation à 42ºC. Un filtre de nitrocellulose (Schleicher et Schϋll, BA 85) imprégné d'IPTG est déposé sur la surface des boîtes et laissé en contact avec le milieu gélose pendant 4 h à la température de 37ºC, puis remplacé par un second filtre qui est laissé pendant 6 h sur le même milieu.
Les filtres retirés de la boîte sont ensuite immergés pendant 30 min dans une solution, appelée solution TNT, composée de 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % du détergent Tween 20, puis pendant 30 min dans un tampon appelé tampon de blocage, composé de gélatine en solution à 1 % dans la solution TNT. Les filtres sont alors traités pendant 3 h dans une solution renfermant les anticorps polyclonaux anti β-1,3-glucanase obtenus précédemment (cf. section 1), dilués dans le tampon de blocage. Ils ont ensuite été immergés pendant 10 min successivement dans chacune des solutions suivantes :
. Solution TNT + 0,1 % BSA (albumine de sérum bovin) .
. Solution TNT + 0,1 % BSA + 0,1 % de détergent Nonidet P40 (Sigma) . Solution TNT + 0,1 % BSA. Le complexe antigène-anticorps formé est ensuite révélé à l'aide d'anticorps secondaires conjugués par couplage avec une peroxydase ("Immuno conjugate GAR/IgG (H+L)/Po" de Nordic Immunology, Tilburg, Pays-Bas). La réaction chimique de révélation utilise le chloro-4 naphtol-1 comme substrat chromogène (donnant un précipité bleu). Les plages de lyse positives, c'est-à-dire correspondant à des clones qui synthétisent la β-1,3-glucanase, sont alors repérées sur la boîte de Pétri et les bactériophages sont prélevés pour être purifiés grâce à un criblage immunologique secondaire, conduit de façon strictement identique au criblage primaire. Un de ces clones a été retenu pour la suite de l'étude.
Section 4 : Caractérisation partielle de l'ADN phagique du clone de β-1,3-glucanase du soja. a) Préparation de l'ADN phagique.
Le clone phagique retenu est amplifié et son ADN est extrait selon le protocole décrit dans le kit d'Amersham "cDNA cloning system GT11" (réf. RPN 1280), résumé ci-après. Les phages sont prélevés par carottage et transférés dans une culture de la souche E. coli Y1090 ; au bout de 15 min, 5 ml de milieu Luria (Gibco) contenant 5 mM de CaCl2 et 50 μg/ml d'ampici lline sont rajoutés. Après une incubation pendant 4 h à 43ºC sous agitation, la culture est centrifugée à 3 000 tr/min pendant 10 min. L'ADN des particules phagiques présentes dans le surnageant est ensuite extrait et purifié par traitement au polyéthylèneglycol et chlorure du sodium NaCl, centrifugation, traitement à la protéinase K et précipitation. b) Analyse de l'ADN phagique des clones sélectionnés
L'ADN des clones de β-1,3-glucanase a été hydrolyse par l'enzyme de restriction EcoRI. On obtient ainsi un seul fragment EcoRI-EcoRI de 2300 pb environ par coupure au niveau des sites de clonage. Il n'y a donc pas de site EcoRI dans l'ADN complémentaire.
L'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments obtenus par l'action de plusieurs endonucléases sur le frag ment EcoRI-EcoRI d'environ 2 300 pb a permis de montrer que celui-ci contient un site PvuII à quelques paires de bases d'un des sites EcoRI. Section 5 : Construction du plasmide pBR1310, isolement de l'insert d'ADN complémentaire codant pour la β-1,3-glucanase de soja et détermination de sa séquence. a) Clonage dans le plasmide pGEM-3Z
Par hydrolyse du clone retenu à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et PvuII, le fragment EcoRI-PvuII d'environ 2 300 pb contenant l'ADNc de β-1,3-glucanase de soja a été isolé, après une électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion.
Le plasmide pGEM-3Z (Promega, Madison, Wi, E.U.A.) a été ouvert à l'aide des endonucléases de restriction EcoRI et Smal, puis purifié et isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion. Ce plasmide comprend un "polylinker" (multisite de clonage) comportant successivement les sites de restriction EcoRI, Smal et HindIII.
La ligation à l'aide de l'ADN ligase T4 dans ce plasmide ainsi ouvert du fragment EcoRI-PvuII d'environ 2 300 pb contenant l'ADNc codant pour la β-1,3-glucanase de soja permet d'obtenir un plasmide, appelé plasmide pBR1310 (ligation des extrémités franches Smal et PvuII avec disparition de ces sites) qui est cloné dans la bactérie E. coli souche JM109 (Sambrook et al., op. cité). Le vecteur obtenu a ensuite été extrait et purifié par la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, dans Sambrook et al., op. cité).
L'utilisation de plusieurs enzymes de restriction a. permis d'établir la carte de restriction du fragment HindIII-EcoRI contenu dans le plasmide pBR1310 et contenant l'ADNc codant pour la β-1,3-glucanase, représentée sur la figure 1.
Le fragment HindIII-HindIII (de 1490 pb environ), a été préparé par digestion du fragment HindIII-EcoRI par l'endonucléase HindIII, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion et isolé. Ce fragment a été clone dans l'ADN de la forme réplicative du phage simple brin M13mp19 (Pharmacia) ouvert au site de restriction HindIII. Le vecteur M13 renfermant l'insert HindIII- HindIII de 1490 pb est appelé M13BR137. La séquence de cet insert a été déterminée selon la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et al., PNAS-USA, 14, 5463-5467, 1977). b) Analyse de la séquence de l'ADNc de la β-1,3-glucanase de soja.
La description ci-après sera mieux comprise à l'aide de la figure 2.
Cette séquence renferme une seule phase de lecture ouverte (non interrompue par un codon stop) compatible avec le poids moléculaire apparent observé par électrophorèse sur gel d'agarose : la séquence commençant par un codon ATG en position 114 et terminée par le codon stop TAA en position 1224-1226 codant pour une protéine de 370 acides aminés.
Le logiciel UWGCG de l'Université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl.Ac.Res., 12, 8711-8721- option : Recherche de peptide-signal d'après la méthode de G. von Heijne, 1986, Nucl.Ac.Res., 14, 483-490, prévoit dans cette séquence une seule partie codant pour un peptide signal pour une expression dans les cellules eucaryotes, la séquence suivante (Na2) appelée séquence pré (commençant au nucléotide 114 et se terminant au nucléotide 209) : ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG GAACTATTGA CAGGAAACCT TCGCATGGCA GATGCT codant pour le peptide-signal de 32 acides aminés de séquence (a2) suivante :
Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Asn Leu Arg Met Ala Asp Ala
Un peptide-signal est attendu par l'homme de l'art car les β-1,3-glucanases sont des protéines qui peuvent être naturelle ment, soit accumulées dans les vacuoles de cellules végétales, soit sécrétées, ce qui exige la présence d'un peptide-signal.
La β-1,3-glucanase mature (c'est-à-dire clivée de son peptide signal) prévue comprend donc 338 acides aminés.
Ce logiciel prévoit pour une expression dans les cellules procaryotes une partie codant pour un peptide-signal, la même séquence (Na2) codant pour le même peptide signal de 32 acides aminés.
La séquence peptidique déjà connue la plus proche de celle de la protéine de 370 acides aminés déduite de l'ADN complémentaire de la β-1,3-glucanase de soja est celle de la protéine de 369 aminés déduite de l'ADN complémentaire d'une β-1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifolia (cf. la banque de données Swissprot réf. Gub$Nipl. et De Loose et al., 1988, Gène, 70, 13-23).
Une comparaison de ces deux séquences à l'aide de la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol, 48,443-453, mise en oeuvre dans le logiciel UWGCG de l'université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl.Ac.Res. 12,8711-8721, option GAP, montre que 224 acides aminés sont identiques, soit une homologie d'environ 60 %. Cette méthode algorithmique considère tous les alignements possibles et crée un alignement, représenté sur la figure 7, dans lequel le plus possible d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignées est minimal.
Comparaison de la région aminoterminale de la β-1,3-glucanase de soja mature prévue aux séquences aminoterminales publiées de β-1,3-glucanases
On connaît, à ce jour, quatre β-1,3-glucanases végétales dont les séquences aminoterminales ont été déterminées expérimentalement. Il s'agit des β-1,3-glucanases de tabac Nicotiana tabacum (H. Shinshi et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5541-5545), de Nicotiana plumbaginifolia (M. De Loose et al., 1988, Gène, 70, 13-23), de haricot Phaseolus vulgaris (B.V. Edington et al., 1991, Plant Molecular Biology, 16, 81-94) et d'orge Hordeum vulgare (P.B. Hoj et al., 1988, Febs Lett., 230, 67-71). Leurs séquences aminoterminales présentent une forte homologie de l'ordre de 80 % pour les 15 acides aminés aminoterminaux. S'agïssant des dicotylédones (Nicotiana tabacum, Nicotiana plumbaginifolia et Phaseolus vulgaris) elles commencent toutes par un Gln, suivi, après un Ser éventuel, de la séquence Ile Gly Val Cys Tyr Gly. On peut remarquer que la séquence de β-1,3- glucanase de soja (dicotylédone) mature prévue par le logiciel ci-dessus commence aussi par la séquence Gln Ile Gly Val Cys Tyr Gly
Section 6 : Construction d'un vecteur d'expression dans E. coli :
le plasmide pBR59. a) Mutagénèse silencieuse de la partie codante pour éliminer le site de restriction Sacl (en position 575) de la partie codante.
La séquence GAG CTC du site de restriction Sacl situé en position 575 du vecteur M13BR137, est remplacée par mutagénèse dirigée comme décrit ci-après, par la séquence GAG CAC. Le codon
GCT, correspondant à un résidu alanine dans la séquence initiale d'ADNc, est donc remplacé par le codon GCA correspondant également à un résidu alanine (mutation silencieuse).
La forme simple brin du vecteur M13BR137 est isolée selon le protocole décrit par Sambrook et al., op cité à partir d'une culture de la souche bactérienne E. coli DH5αF' (Gibco-BRL) préalablement transformée par ce vecteur selon le protocole préconisé par le fabricant. Sur cette matrice simple brin, la mutagénèse est effectuée suivant le protocole du kit "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system" (Amersham-réf. RPN 1523-version 2), à l'aide d'un oligonucléotide synthétisé chimiquement sur le synthétiseur d'ADN Biosearch 8700 de Millipore, dont la séquence est représentée ci-dessous :
GATCATGAAG GCCTTGTGCT CTTATTGCTT GG La technique de mutagénèse dirigée décrite en détail dans le livret accompagnant ce kit et résumée ci-après, consiste à hybrider l'oligonucléotide ci-dessus avec la forme simple brin du vecteur M13BR137, puis à faire agir la polymérase de Klenow et l'ADN ligase T4 en présence de thionucléotide dCTP-α-S (oc-thiodésoxycytidine triphosphate) de façon à obtenir une forme circulaire double brin du phage recombinant, dont l'un des brins porte la mutation souhaitée et est protégé vis-à-vis de la coupure par l'endonucléase Ncil et de la dégradation par l 'exonucléase III. On induit alors sur l'autre brin (ayant servi de matrice) une césure à l'aide de l'endonucléase Ncil, puis ce brin est éliminé par l'action ultérieure de l 'exonucléase III.
Le vecteur résultant, appelé vecteur M13BR138, a été clone dans la souche E. coli DH5αF' et séquence ; il présente, comme attendu, une séquence mutée par remplacement d'un codon GCT par un codon GCA, lequel a supprimé le site de restriction Sacl de la partie codante. b) Mutagénèse de la partie 5' de l'insert codant pour la β-1,3- glucanase de soja pour introduire les sites de restriction Ndel et BamHi.
La forme simple brin du vecteur M13BR138 est isolée comme décrit plus haut, une mutagénèse dirigée est ensuite réalisée dans les mêmes conditions que précédemment en utilisant l'oligonucléotide synthétisé chimiquement et dont la séquence est reportée ci-après :
GAGAAGGCAT GGATCCAAAC ATATGAATAC ACCAC
Le vecteur issu de cette mutagénèse, appelé vecteur
M13BR139, est clone dans la souche bactérienne E. coli DH5αF' ; il a été séquence, ce qui a confirmé l'introduction en amont du codon ATG d'initiation de la traduction, des sites de restriction Ndel et
BamHI. c) Mutagénèse de la partie 3' de l'insert du vecteur M13BR139 pour introduire les sites de restriction HindIII et Sacl.
La forme simple brin du vecteur M13BR139 est isolée, une mutagénèse dirigée est ensuite réalisée sur la partie 3' de l'insert à l'aide de l'oligonucléotide de séquence suivante et dans les conditions déjà décrites :
CAGAGATTTT GAAGCTTAGG AGCTCAACCT TACACATC
Le vecteur résultant de cette mutagénèse appelé vecteur
M13BR140, est clone dans la souche bactérienne E. coli DH5αF'. Sa séquence a été déterminée, ce qui a confirmé la création en aval du codon stop TAA des sites de restriction HindIII et Sacl. Cette séquence est représentée sur la figure 3. d) Construction du plasmide pBR141.
La forme réplicative du vecteur M13BR140 est isolée et purifiée selon le protocole de Birnboim et Doly décrit dans Sambrook et al., op. cité. L'insert Ndel-HindIII renfermant la partie codante de la β-1,3-glucanase a été isolé par digestion par les enzymes de restriction Ndel et HindIII et purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et électroélution (Sambrook et al., op. cité). Cet insert est ensuite ligué à l'aide de T4 DNA ligase dans le grand fragment Ndel-HindIII du plasmide p373,2, dont la construction et les éléments constitutifs sont décrits dans la demande de brevet EP-A-0360641 (la figure 3 de ce document représente la carte de restriction de ce plasmide), préalablement ouvert par digestion avec les enzymes de restriction Ndel et HindIII. Ce grand fragment contient notamment, successivement de l'extrémité Ndel à l'extrémité HindIII, un promoteur analogue du promoteur "tac" (Sambrook et al., op. cité) inductible par l' isopropyl-β-D-galactoside, un gène codant pour la β-lactamase (conférant la résistance à l'ampicilline) dans un contexte permettant son expression, une origine de réplication dans E. coli et un terminateur de transcription dérivé du phage fd. Le vecteur obtenu, appelé plasmide pBR141 est cloné dans la souche E. coli RR1. La structure du plasmide est vérifiée par la réalisation d ' une carte de rest ri ct ion . e) Construction du plasmide pBR59
L'ADN plasmidique du clone contenant le plasmide pBR141 est extrait selon le protocole de Birnboim et Doly (Sambrook et al., op. cité).
L'élimination de la séquence pré-procaryote prévue (cf. section 5) de la β-1,3-glucanase de soja est réalisée par élimination de la séquence comprise entre les sites de restriction Ndel et SphI et remplacement de cette séquence par le linker synthétique de séquence donnée ci-après :
TATGATTGGT GTGTGTTATG GCATGACTAA CCACACACAA TACC de façon à reconstituer la séquence codant pour la protéine dépourvue du peptide-signal prévu dans les cellules procaryotes, le premier acide aminé de cette dernière : le résidu glutamine (susceptible de se cycliser en pyroglutamate, ce qui rend impossible la détermination de la séquence amino-terminale) étant remplacé par un résidu méthionine initiateur de traduction.
La ligation de ce linker à l'aide de T4 DNA ligase permet d'obtenir un plasmide, appelé plasmide pBR59, lequel est clone dans la souche bactérienne E. coli RR1. Dans ce vecteur, la β-1,3-glucanase est sous le contrôle d'un promoteur (décrit dans la demande de brevet EP-A-0360641 ) analogue du promoteur "tac" (Sambrook et al., op. cité) inductible par l'isopropylthio-β-D- galactoside (IPTG). La séquence de la partie codante du plasmide pBR59, encadrée par les sites Ndel et HindIII, est représentée sur la figure 4.
Section 7 : Expression de la β-1,3-glucanase de soja dans E. coli.
La souche de E. coli RR1 contenant le vecteur d'expression pBR59 et une souche E. coli RR1 contenant le plasmide p373,2 sont cultivées dans le milieu Luria (Gibco) contenant 100 mg/l de l'antibiotique ampicilline pendant une nuit à 37ºC. Après une dilution de la culture au 1/100ème dans le même milieu, les bactéries sont remises en culture durant 1 heure à 37ºC, puis de l'IPTG est ajouté à une concentration finale 1 mM. La culture est alors pour suivie pendant 3 heures et les bactéries sont récoltées par centrifugation.
Les bactéries sont remises en suspension dans un tampon, appelé tampon de charge de composition suivante :
- 0,125 M Tris-HCl pH 6,8
- 4 % dodécyl sulfate de sodium
- 20 % glycérol
- 0,02 % bleu de bromophénol
- 10 % β-mercaptoéthanol puis le mélange est porté à 100ºC pendant 10 min. (Ce qui provoque la lyse des bactéries et la dénaturation des protéines.) 10 μg de protéines solubilisées sont déposés sur un gel d'électrophorese de polyacrylamide selon le protocole décrit par Laemmli (U.K. Laemmli, Nature 227, 1970, 680-685). Après l'électrophorèse, le gel est coloré à l'aide de bleu de Coomassie. On constate pour le clone de β-1,3-glucanase la présence de trois bandes surnuméraires absentes pour la souche témoin.
Section 8 : Mesure de l'activité enzymatique de la β-1,3-glucanase recombinante de soja exprimée dans E. coli, isolement et purification de trois formes de cette protéine et détermination de leurs séquences amino-terminales.
1. Mesure de l'activité enzymatique de la β-1,3-glucanase recombinante.
L'activité de la β-1,3-glucanase est mesurée par une méthode colorimétrique permettant d'estimer la quantité de monomères ou d'oligomeres libérés par l'enzyme à partir d'un substrat (la laminarine) en déterminant le pouvoir réducteur des sucres ainsi libérés. Cette méthode, décrite par G. Ashwell, 1957, dans "Methods in Enzymology III", 73-105, S.P. Colowick et N.U. Kaplan Eds. est résumée ci-après.
A une solution contenant une concentration de β-1,3-glucanase choisie pour se situer dans une gamme de réponse linéaire, on ajoute 50 μl d'une solution contenant 50 mg/ml de laminarine (β-1,3-glucane extrait de Laminaria digitata-Sigmaréf.L9634). Le volume du mélange réactionnel est ajusté à 500 μl à l'aide d'une solution tampon acétate de sodium 0,2 M, pH 5,0. Après une heure d'incubation à 40 C, une partie aliquote de 200 μl est ajoutée à 200 μl de réactif de Somogyi (mélange de 25 ml de la solution aqueuse comprenant 2,5 % de Na2 CO3, 2,5 % de KNaC4H4O6, 4H2O, 2 % de NaHCO3, 20 % de Na2SO4 et de 1 ml de solution aqueuse contenant 15 % de CuSO4, 5H2O), puis portée à 100°C pendant 45 min. Les tubes sont alors refroidis dans la glace avant d'ajouter 200 μl du réactif de Nelson (solution aqueuse de 5,5 % de molybdate d'ammonium, de 4,6 % d'acide sulfurique concentré et 12 % de Na2SO4,7H2O).
Le volume du mélange est ajusté à 5 ml avec de l'eau distillée et son absorbance est mesurée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 500 nm.
La quantité de sucres réducteurs libérée est estimée par comparaison avec les valeurs d'absorbance obtenues avec une gamme étalon établie à l'aide d'une solution de glucose. L'activité enzymatique de la β-1,3-glucanase est exprimée en nanomoles d'équivalent glucose libérées par minute, dans les conditions de l'essai enzymatique décrit ci-dessus.
2. Isolement et purification de trois formes de la β-1,3-glucanase recombinante : a) Méthode
Les différentes formes de la protéine recombinante ont été isolées et purifiées à partir du centrifugat obtenu dans la section 7 (fin du premier paragraphe). L'isolement et la purification comprennent des étapes d'extraction, de précipitation au sulfate d'ammonium, de chromatographie en phase liquide FPLC sur une colonne echangeuse de cations à base de polymère synthétique et de chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé, selon le protocole décrit ci-après : ETAPE 1 :
Le culot bactérien est traité sous agitation à 4ºC par une solution tampon pH 8 (Tris 30 mM, EDTA 1 mM) . Après centrifugation (15 000 g, 30 min) le surnageant recueilli (lysat) constitue l'extrait brut.
ETAPE 2 :
L'extrait proteique est précipité par le sulfate d'ammonium (60 % de saturation). Les protéines ayant précipité sont recueillies par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solubilisées dans une solution tampon (acétate d'ammonium 100 mM, pH 5,2) et dialysées pendant une nuit à 4ºC contre une solution tampon d'acétate d'ammonium 100 mM, pH 5,2.
Extemporanément, la concentration de la solution tampon de l'extrait proteique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à l'emploi (PD 10 Pharmacia).
ETAPE 3 :
L'extrait proteique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions sur une colonne à base de polymère synthétique (colonne Mono-S de Pharmacia) selon la technique FPLC de Pharmacia.
L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM, pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient linéaire de 10 à 500 mM d'acétate d'ammonium.
ETAPE 4 :
Les fractions contenant une activité β-1,3-glucanase sont concentrées par ultrafi Itration sur une cartouche de concentration Centricon 10 (Amicron). La purification de la protéine est poursuivie par chromatographie (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé (colonne Superose 12 Pharmacia). L'élution est réalisée par une solution tampon d'acétate d'ammonium 500 mM, pH 5,2.
A chaque étape, les différentes formes de la β-1,3-glucanase recombinante sont identifiées par leur poids moléculaire (Electrophorèse sur gel de polyacry lamide en présence de SDS - révélation à l'argent), par leurs activités mesurées par la méthode colorimétrique décrite précédemment et par leurs réactions positives avec les anticorps polyclonaux dirigés contre la β-1,3-glucanase de tabac préparés dans la section 1. b) Résultats
On isole et purifie ainsi trois formes de la protéine recombinante présentant une activité β-1,3-glucanase de poids moléculaires apparents de 36 ± 3, 37 ± 3 et 39 ± 3 kDa. (Le poids moléculaire de la protéine déduite de la séquence codante est de 37 387 Da.) Leurs activités spécifiques respectives mesurées sont de 1,65, 1,75 et 1,76 nanomoles d'équivalent glucose libéré par minute par microgramme de protéines, valeurs non différentes significativement.
3. Détermination de la séquence amino-terminale des trois formes de la β-1,3-glucanase recombinate.
Le séquençage des extrémités amino-terminales des trois formes de la β-1,3-glucanase recombinante a été réalisé. Les échantillons à traiter sont portés à la surface d'un filtre PVDF ("polyvinylidénedif luoride" : difluorure de polyvinylidène) qui est introduit dans un séquenceur de protéines (Modèle 470 A, commercialisé par la Société Applied Biosystems E.U.A.) équipé d'un chromatographe (Modèle 430 d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phénylthiohydantoïques formés, après chaque cycle de dégradation.
Les séquences amino-terminales respectives déterminées sont représentées ci-après, le symbole X représentant un acide aminé non déterminé :
Met Ile Gly Val X Tyr Gly Met Leu
Met Ile Gly Val X Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro
Met Ile Gly Val X Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ces séquences correspondent à la séquence déduite de la partie codante du plasmide pBR59 (cf. figure 4). Il n'y a donc pas de maturation post-traductionnelle de la partie amino-terminale. Les différences observées de poids moléculaires pour une activité spécifique voisine sont donc probablement le résultat d'une maturation carboxy-terminale post-traductionnelle. Celle-ci a lieu sur environ 27 acides aminés.
Section 9 : Construction d'un vecteur d'expression dans les cellules végétales : le vecteur binaire pBR60. a) Préparation d'un gène recombinant complet de la β-1,3-glucanase de soja et clonage de celui-ci dans le vecteur binaire pBIN19.
L'ADN portant la séquence codante a été obtenu par coupure du vecteur M13BR140, obtenu dans la section 6c) (cf. figure 3), à l'aide des enzymes de restriction BamHI et Sacl, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion. Cet ADN a été inséré entre une séquence promotrice comprenant le promoteur dit 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (35S CaMV) et une séquence terminatrice comprenant le terminateur de la nopaline synthase d' Agrobacterium tumefaciens. b) Préparation de la séquence promotrice comprenant le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.
A partir du plasmide pBI121 (Clontech) par coupure à l'aide des endonucléases HindIII et BamHI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment HindIII-BamHI d'environ 900 pb contenant le promoteur 35S est isolé. Ce fragment est recoupé par HindII. Le fragment d'environ 410 pb, portant le site BamHI, est traité par l'ADN ligase T4 en présence d'un linker HindIII (séquence synthétique contenant un site HindIII). Après coupure par l'endonucléase HindIII et électrophorèse sur gel d'agarose. le fragment HindIIIBamHI résultant (d'environ 420 pb) est isolé et purifié. c) Préparation de la séquence terminatrice comprenant le terminateur de la nopaline synthase (NOS) d'Agrobacterium tumefaciens.
A partir du plasmide pBI121 (Clontech) par coupure à l'aide des enzymes de restriction Sacl et EcoRI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, un fragment de 250 pb environ, renfermant le terminateur de la nopaline synthase, a été isolé.
On a ligué à l'aide de l'ADN ligase T4 la séquence promotrice, la séquence codante de l'ADN complémentaire de la β-1,3-glucanase et la séquence terminatrice dans le vecteur binaire pBINl9 ouvert à l'aide des endonucléases HindIII et EcoRI. Ce vecteur porte deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet (cf. Bevan, 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721) pouvant être transféré aux cellules végétales. Le gène de résistance à la kanamycine servira de marqueur de sélection au cours des étapes de transformation et d'analyse de la descendance des plantes transformées.
Le vecteur obtenu est appelé plasmide pBR60. La séquence nucléotidique du gène recombinant complet, vérifiée par séquençage, ainsi que la séquence peptidique déduite sont représentée sur la figure 5. Le plasmide est clone dans la souche E. coli MC1061 (Clontech).
Section 10 : Transfert dans Agrobacterium tumefaciens du plasmide pBR60 contenant le gène recombinant de β-1,3-glucanase a) Transfert dans Agrobacterium tumefaciens.
Ce transfert est réalisé comme décrit ci-après par conjugaison triparentale entre la souche E. coli MC1061 contenant le vecteur pBR60 et la souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech) à l'aide de la souche E. coli HB101 contenant le plasmide mobilisateur pRK2013 (D.M. Figurski et al., 1979, Pro. Ntl. Ac. Sci. USA, 76, 1648-1652).
La souc he E . co l i MC1061 contenant le plasmide pBR60 et une souche E. coli HB101 (Clontech) contenant le plasmide mobilisa teur pRK2013 sont cultivées à 37ºC dans du milieu Luria (Gibco) en présence de 25 mg/l de kanamycine.
La souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 est cultivée à 28 C dans du milieu Luria (Gibco) en présence de 100 mg/l de rifampicine (elle est résistante à cet antibiotique) ; 200 μl de chacune des trois cultures sont mélangés, étalés sur du milieu Luria gélose (Gibco) et incubés toute la nuit à 28ºC. Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans 5 ml de milieu Luria et des parties aliquotes sont étalées sur des boîtes de Pétri contenant un milieu minimum gélose (décrit dans "Plant Molecular Biology Manual" Gelvin et al., Kluwer Académie Press, 1988) en présence de 100 mg/l de rifampicine et 25 mg/l de kanamycine. Dans ces conditions, seules poussent les colonies d'Agrobacterium tumefaciens ayant intégré le plasmide pBR60 (les souches d'E. coli ne peuvent pas pousser dans ces conditions). Celles-ci contiennent le gène recombinant de β-1,3-glucanase dans un contexte permettant sa repli cation.
La résistance aux deux antibiotiques des colonies sélectionnées est vérifiée en repiquant celles-ci sur le même milieu de sélection deux fois de suite. La présence du gène recombinant de β-1,3-glucanase dans Agrobacterium tumefaciens est vérifiée par la méthode de Southern Blot sur une préparation d'ADN total (Lyse des cellules, purification de l'ADN par extraction à l'aide du mélange phénol/chloroforme, selon le protocole décrit par Gelvin dans l'ouvrage cité ci-dessus, coupure de l'ADN purifié à l'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur membrane et hybridation selon les techniques bien connues de l'homme de l'art). b) Transfert dans Agrobacterium rhizogenes
Ce transfert est réalisé de la même façon que le transfert dans Agrobacterium tumefaciens décrit en a), avec la souche Acrobacterium rhizogenes A4 décrite par GUERCHE et al., (1987) Mol. gen. genêt. 206, 382. Section 11 : Obtention de plantes de tabac transformées
Le tabac Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pBR60 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de l'homme du métier (Horsch R.B. et al., 1985, Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après.
Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac N. tabacum (variété Wisconsin Havana 38 sensible aux champignons pathogènes) sont incubés dans une culture d'A. tumefaciens hébergéant le plasmide pBR60. Les disques égouttés sur papier Whatman ont été transférés sur des milieux de culture en boîtes de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals, puis produire des bourgeons en présence de céfotaxime (500 μg/ml) destinée à éliminer Agrobacterium tumefaciens et de kanamycine (100 μg/ml).
Les bourgeons résistants à la kanamycine ont été ensuite transférés sur un milieu permettant l'induction des racines en présence de céfotaxime et de kanamycine. Les plantules sont ensuite repiquées en terrines dans un substrat composé de tourbe et de terreau et mises à croître en serre. Toutes les plantes transformées (génération R0) ayant survécu aux étapes de régénération et d'acclimatation en serre se sont révélées morphologiquement normales et fertiles. Elles ont été autofécondées et ont donné des graines (génération R1).
Section 12 : Analyse de l'ADN génomique des plantes de tabac transformées (génération R0) selon la technique de Southern Blot.
L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été isolé à partir de feuilles matures de plantes transgéniques de la génération R0 selon la méthode d'extraction à l'aide de bromure de cétyltriméthylammonium et de purification par précipitation, décrite dans l'ouvrage "Plant Molecular Biology Manual" déjà cité.
10 μg de cet ADN génomique ont été digérés pendant une nuit à 37ºC avec 20 unités des enzymes de restriction HindIII et EcoRI. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (1 %). L'ADN a été transféré selon la méthode de Southern Blot sur un filtre de Nylon (Hybond N+ Amersham), et hybride avec une sonde nucléotidique comprenant une partie de la séquence du gène recombinant, marqué par couplage à la peroxydase (kit ECL, Amersham). Les membranes sont ensuite lavées et révélées selon le protocole recommandé par Amersham.
L'analyse des films permet ce tirer les conclusions suivantes :
- certaines plantes ne possèdent pas de copies du gène recombinant transféré (absence de signal),
- la plupart des plantes testées contiennent au moins une copie sans réarrangement de la construction : promoteur 35S CaMV - séquence codante de l'ADN complémentaire de β-1,3-glucanase - terminateur NOS,
- certains profils suggèrent qu'il existe des réarrangements internes dans la construction, mais ces événements sont rares.
Section 13 : Mise en évidence de l'expression de la β-1,3-glucanase de soja dans les plantes de tabac transformées (de la génération R0). a) Préparation des extraits bruts de protéines de plantes de tabac transformées (génération R0).
Les extraits bruts de protéines ont été préparés à partir de différents tissus de la plante (racine, tige, feuille, etc.). Les fragments de tissus ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20ºC. La poudre a été extraite à 4ºC en présence d'un tampon acétate d'ammonium 0,1 M, pH 5,2 et soumise à une centrifugation à 10000 g. La concentration des protéines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines, en suivant la technique de Bradford (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254). b) Mise en évidence par immuno-empreinte (Western Blot).
On soumet les extraits bruts de protéines de différentes plantes transformées et des plantes non transformées (témoins) à un Western Blot, technique bien connue de l'homme de l'art et décrite notamment par H. Towbin et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1972, 4350-4354, qui comprend les étapes suivantes :
- dénaturation par chauffage à 100 C pendant 10 min dans un tampon, dénommé tampon de charge constitué de Tris HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS
4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, glycérol 20 %, β-mercaptoéthanol 10 % (selon le protocole décrit par Laemmli, U.K. Laemmli Nature, 227, 1970, 680-685) ;
- séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisât selon le protocole décrit par Laemmli (réf. ci-dessus) ;
- électrotransfert desdites protéines contenues dans le gel sur une membrane en PVDF (selon la technique de H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1979, 4350-4354).
L'immunodétection est réalisée selon un protocole qui comprend les étapes suivantes :
- saturation de la membrane PVDF sur laquelle les protéines ont été transférées par incubation pendant au minimum 2 heures à 37ºC dans une solution de gélatine à 3 %,
- 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % du détergent Tween 20,
- incubation (pendant 1 heure à 37ºC) en présence de l'immunsérum préparé précédemment (contenant les anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine recombinante) dilué au 1/10 000 dans du tampon phosphate salin,
- 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % du détergent Tween 20. Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidi ne-bi ot i ne conj ugué à l a phosphatase a l ca l i ne avec le k i t RPN 23 d'Amersham ("Blotting détection kit"), utilisé selon les indications du fabricant.
L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine d'environ 37 ± 3 kDa pour les plantes transformées, absente des plantes témoins (la protéine déduite de la séquence de l'ADNc, clivée de son peptide signal supposé pour une expression dans les cellules eucaryotes, a un poids moléculaire de 38 156 Da).
L'analyse selon la technique de Western Blot a été effectuée sur 30 plantes transformées (répondant positivement au Southern Blot). 28 plantes ont montré une expression de la β-1,3- glucanase recombinante en Western Blot. c) Comparaison des migrations électrophorétiques des β-1,3- glucanases de soja (protéines recombinantes et protéine naturelie).
Le poids moléculaire apparent obtenu pour la protéine recombinante exprimée dans les plantes de tabac transformées a été comparé à celui obtenu pour la protéine naturelle présente dans un extrait de cellules de soja (cf. section 1) et la β-1,3-glucanase naturelle de tabac présente dans un extrait de cellules de tabac (cf. section 1), par migration électrophorétique sur des pistes parallèles selon le protocole décrit par Laemmli (UK. Laemmli, Nature 227, 1970, 680-685). Les tailles de ces protéines ont été comparées à celles de protéines de masses moléculaires connues (marqueurs de poids moléculaires compris entre 14 000 et 97400 Da de Bio-Rad- réf. 61-0304).
Les empreintes obtenues après Western Blot montrent que la β-1,3-glucanase de soja synthétisée dans le tabac présente le même poids moléculaire apparent que celui de la protéine naturelle de soja : 37 ± 3 kDa. La maturation post-traductionnelle de cette protéine est donc effectuée de la même façon dans un autre végétal que le soja. Ce poids moléculaire apparent de la β-1,3-glucanase de soja est supérieur d'environ 3 kDa à celui de la β-1,3-glucanase de tabac dont le poids moléculaire est de 34 969 Da. (H. Shinshi et al., 1988, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 85, 5541-5545). Le poids moléculaire de la β-1,3-glucanase de soja est donc voisin de 38 kDa, ce qui est très proche du poids moléculaire prévu dans la section 5 pour la protéine mature de 338 acides aminés prévu dans la section 5, lequel est de 38 156 Da. Section 14 : Mesure de la résistance aux champignons pathogènes de plantes de tabac transformées (génération R1)
Les tabacs régénérés (génération R0) en présence de kanamycine ont été autopollinisés. Les graines matures (génération R1) sont semées sur milieu de Murashige et Skoog complemente de 100 μg/ml de kanamycine.
Les plantules de la génération R1 résistantes à la kanamycine issues des 13 plantes transformées choisies, d'une plante Nicotiana tabacum var. Wisconsin Havana 38 sensible au champignon Chalara elegans (également appelé Thielaviopsis basicola), abrégée W38, ont été transférées en serre pour évaluation de leur résistance à ce champignon. Ce dernier a été choisi car il est représentatif des champignons pathogènes du tabac possédant des β-1,3-glucanes dans leur paroi. L'étude a porté sur des effectifs de plantules variant de 16 à 25 selon les descendances des plantes transformées. Le protocole choisi dans cette étude est décrit ci-après :
Les plantules sont cultivées en godets (3 × 3 cm). A l'apparition de la 5ème feuille, les plantes sont inoculées en déposant au niveau du collet une suspension de 5 × 10 endoconidies de ce champignon.
Les endoconidies sont prélevées sur des cultures mycéliennes de ce champignon entretenues sur le milieu "potato dextrose agar" (Difco) à 22ºC et à l'obscurité. On évalue la résistance à Chalara elegans 45 jours après l'inoculation.
Les plantes sont notées selon les symptômes d'infection et selon leur niveau de développement végétatif.
Deux notations sont effectuées :
- Mesure du poids (en grammes) de l'appareil aérien des plantes - Mesure d'un indice de résistance tenant compte de l'impact de la maladie sur l'ensemble de la plante.
Les classes sont définies selon les critères suivants : Note 0 : plante morte
Note 1 : bourgeon terminal encore vert, système racinaire détruit Note 2 : développement des plantes ne dépassant pas 25 % de celui du témoin, système racinaire entièrement nécrosé Note 3 : développement des plantes atteignant 50 % du développement du témoin, système racinaire présentant des parties saines Note 4 : développement des plantes identiques au témoin.
L'indice de résistance de la descendance d'une plante transformée représente la moyenne des notes effectuées sur les plantules issues de cette plante.
Le tableau ci-après rassemble les principaux résultats obtenus :
On constate à la lecture du tableau ci-dessus que 12/13 des descendances de plantes de tabac transformées ont un indice de résistance et un poids de l'appareil aérien supérieurs à ceux de la descendance de la plante non transformée W38.
La transformation du tabac avec l'ADN recombinant de l'invention confère donc à sa descendance une résistance accrue aux champignons pathogènes.
Section 15 : Purification de la β-1,3-glucanase recombinante des feuilles de tabac transformées (génération R1) et détermination de sa séquence aminoterminale
1) Purification de la β-1,3~glucanase recombinante
La protéine recombinante a été purifiée à partir des extraits bruts de protéines de feuilles de tabac transformées, par précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie en phase liquide FPLC sur une colonne echangeuse de cations à base de polymère synthétique sur un agarose réticulé, selon le protocole décrit ci-après :
Protocole de purification de la β-1,3-glucanase recombinante
Etape 1 :
L'extrait proteique est précipité par le sulfate d'ammonium (60 % de saturation). Les protéines ayant précipité sont récupérées par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solubilisées dans une solution tampon (acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2) et dialysées une nuit à 4°C contre une solution tampon d'acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2.
Extemporanément, la concentration de la solution tampon de l'extrait proteique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à l'emploi (PD10. Pharmacia).
Etape 2 :
L'extrait proteique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions à base de polymère synthétique (colonne Mono-S Pharmacia) à l'aide d'une technique FPLC (Pharmacia).
L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium 10 mM pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient linéaire de 10 a 500 mM d'acétate d'ammonium.
A chaque étape, la β-1,3-glucanase de soja est identifiée par son poids moléculaire (Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS-révélation à l'argent), par son immuno-empreinte
(cf. section 13b)) et son activité, mesurée par la méthode colorimétrique décrite dans la section 8.1).
2) Essai de détermination de la séquence aminoterminale de la β-1,3- glucanase recombinante
Après purification de la β-1,3-glucanase recombinante selon le protocole décrit ci-dessus, le séquençage de l'extrémité aminoterminale a été réalisé. Les échantillons à traiter sont portés à la surface d'un filtre PVDF (polyvinylidenedifluoride) par électrotransfert selon la méthode décrite par H. TOWBIN et al. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA (1979), 4350-4354, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le filtre est introduit dans un séquenceur de protéines (modèle 470 A commercialisé par la société Applied Biosystems (E.U.A.)) équipé d'un chromotographe (modèle 430 d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phénylthiohydantoïques formés, après chaque cycle de dégradation.
Aucune séquence aminoterminale n'a pu être déterminée, malgré le bon fonctionnement du séquenceur, vérifié par la détermination de la séquence aminoterminale d'une protéine témoin : la lactoglobuline.
II est donc probable que la séquence aminoterminale de la β-1,3-glucanase recombinante commence par un Gin, comme prévu par comparaison avec les séquences aminoterminales de dicotylédones déjà déterminées (voir Section 5). Il a en effet déjà été démontré que le Gln aminoterminal était bloqué pour une autre β-1,3-glucanase de soja (TAKEUCHI et al., 1990, Plant Physiol. 93, 673-682). Section 16 : Obtention de plantes de colza transformées.
La transformation est réalisée selon le protocole de P. Guerche et al. (P. Guerche et al., 1987, Mol. Gen. Genêt., 206, 382). Les différents milieux de culture sont ceux décrits par Pelletier et al. (Pelletier et al., 1983, Mol. Gen. Genêt., 191, 244). Leur composition sera explicitée par la suite (tableau 1). a) Obtention de racines transformées.
Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité apicale de plantes de colza (Brassica napus : variétés de printemps Brutor et Westar et variété d'hiver) de 1 m de haut environ. Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A.
L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhizogenes contenant le plasmide pBR60.
Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélose (15 g/l) et complemente par 500 μ g de céfotaxime/ml. b) Régénération de plantes transformées.
Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours sur le milieu D contenant 3 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, puis placés sur le milieu RCC d'induction de bourgeons.
Des plantes racinées sont ensuite obtenues par passage des bourgeons sur les milieux F et G.
Section 17 : Mise en évidence de l'expression de la β-1,3-glucanase de soja dans les plantes de colza transformées. a) préparation des extraits bruts de protéines de plantes de colza transformées (génération R0)
Les extraits bruts de protéines ont été préparés à partir de feuilles de la plante. Ces extraits ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20ºC. La poudre a été extraite à 4ºC en présence d'un tampon acétate d'ammonium 0,1 M, pH 5,2 et soumise à une centrifugation de 10 000 g. La concentration des protéines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines, en suivant la technique de Bradford (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254). b) Mise en évidence par immuno-empreintes (Western Blot)
On soumet les extraits bruts de protéines de différentes plantes transformées et des plantes non transformées (témoins) à un Western Blot, technique bien connue de l'homme de l'art et décrite précédemment.
Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d'Amersham ("Blotting détection kit"), utilisé selon les indications du fabricant.
L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine d'environ 37±3 kDa pour les plantes transformées, absente des plantes témoins.
L'analyse selon la technique de Western Blot a été effectuée sur 50 plantes transformées (répondant positivement au Southern Blot). 38 plantes ont montré une expression de la β-1,3-glucanase recombinante en Western Blot.

Claims

REVENDICATIONS
1. ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité 0-1 ,3-glucanase ou pour un précurseur de cette dernière qui comprend la séquence (a.) suivante :
Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ser Ala Asn Asp
Val Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Ile Lys Arg Met Arg Leu Tyr Asp
Pro Asn Gln Ala Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ser Gly Ile Glu Leu Ile
Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Gly Leu Ala Thr Asn Pro Asp Thr
Ser Arg Gln Trp Val Gln Lys Asn Val Leu Asn Phe Trp Pro Ser Val Lys
Ile Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Val Gly Gly Ser Ser
Ser Val Ala Gln Tyr Val Leu Pro Ala Ile Gln Asn Val Tyr Gln Ala Ile
Arg Ala Gln Gly Leu His Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ser Ile Asp Met
Thr Leu Ile Gly Asn Ser Phe Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg Gly Asp
Val Arg Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Ile Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Asn Ala
Pro Leu Leu Val Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Arg
Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ala Pro Asn Val Val Val Trp
Asp Gly Gln Tyr Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Val
His Ala Ala Ile Asp Asn Thr Lys Ile Gly Tyr Val Glu Val Val Val Ser
Glu Ser Gly Trp Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ala Ala Thr Tyr Asp Asn Ala
Arg Val Tyr Leu Asp Asn Leu Val Arg Arg Ala Asn Arg Gly Ser Pro Arg
Arg Pro Ser Lys Pro Thr Glu Thr Tyr Ile Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn
Gln Lys Asn Pro Glu Ile Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Asn Pro Asn Lys
Gln Lys Lys
ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a1).
2. ADN recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend immédiatement en aval de la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1) la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a4) ci-après :
Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Gly Lys Arg Leu Gly Lys Val Val Ile Asp Asp Phe Asn Ala Thr Thr Ser Ile Lys Ser Asp Val tronquée dans sa partie carboxy-terminale de 0 à 27 acides aminés.
3. ADN recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte, immédiatement en amont de la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1), un codon pour Gln.
4. ADN recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité β-1,3-glucanase ou pour un précurseur de cette protéine qui comprend la séquence (a5) suivante : Gln
Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met Leu Gly Asn Asn Leu Pro Ser Ala Asn Asp
Val Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Ile Lys Arg Met Arg Leu Tyr Asp
Pro Asn Gln Ala Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ser Gly Ile Glu Leu Ile
Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Gly Leu Ala Thr Asn Pro Asp Thr Ser Arg Gln Trp Val Gln Lys Asn Val Leu Asn Phe Trp Pro Ser Val Lys
Ile Lys Tyr Val Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Val Gly Gly Ser Ser
Ser Val Ala Gln Tyr Val Leu Pro Ala Ile Gln Asn Val Tyr Gln Ala Ile
Arg Ala Gln Gly Leu His Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ser Ile Asp Met
Thr Leu Ile Gly Asn Ser Phe Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg Gly Asp Val Arg Ser Tyr Leu Asp Pro Ile I le Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Asn Ala
Pro Leu Leu Val Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Arg
Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ala Pro Asn Val Val Val Trp
Asp Gly Gln Tyr Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Leu Asp Ser Val
His Ala Ala Ile Asp Asn Thr Lys Ile Gly Tyr Val Glu Val Val Val Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ala Ala Thr Tyr Asp Asn Ala
Arg Val Tyr Leu Asp Asn Leu Val Arg Arg Ala Asn Arg Gly Ser Pro Arg
Arg Pro Ser Lys Pro Thr Glu Thr Tyr Ile Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn
Gln Lys Asn Pro Glu Ile Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Asn Pro Asn Lys Gln Lys Lys Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Gly Lys Arg Leu Gly Lys Val Val Ile Asp Asp Phe Asn Ala Thr Thr Ser Ile Lys Ser Asp Val
5. ADN recombinant selon l'une des revendications 3 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte, en amont du codon pour Gln précédant la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1), une séquence signal.
6. ADN recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence signal est une séquence codant pour le peptide signal de séquence (a2) suivante : Met Pro Ser Leu Phe Ala Arg Asn Gln Arg Phe Ser Leu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Asn Leu Arg Met Ala Asp Ala
7. ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a1) est la séquence (Na1) suivante :
ATTGGTGTGT GTTATGGCAT GCTGGGCAAC AATCTACCGT CAGCAAACGA TGTTATAGGT CTTTATAGAT CAAATAACAT AAAGAGAATG AGACTCTATG ATCCTAATCA AGCTGCTCTA GAAGCACTTA GAAATTCTGG CATTGAACTC ATTCTTGGGG TGCCAAACTC TGACCTTCAA GGCCTTGCCA CCAATCCTGA CACTTCTCGT CAATGGGTGC AAAAAAACGT GTTGAACTTT TGGCCTAGTG TCAAAATCAA GTACGTGGCA GTTGGAAATG AAGTGAGTCC CGTTGGAGGC TCTTCTTCGG TAGCCCAATA TGTTCTACCT GCCATCCAAA ATGTATACCA AGCAATAAGA GCTCAAGGCC TTCATGATCA AATCAAGGTT TCAACATCTA TTGACATGAC CCTAATAGGA AACTCTTTCC CTCCATCGCA AGGTTCCTTC AGGGGTGATG TGAGATCATA CCTAGATCCC ATAATTGGGT ACTTGGTATA TGCAAATGCA CCATTACTAG TCAATGTGTA CCCTTATTTT AGTTACACTG GTAACCCCCG TGACATATCA CTTCCCTATG CTCTTTTCAC AGCACCAAAT GTTGTGGTAT GGGATGGTCA ATATGGGTAC CAAAATTTGT TTGATGCTAT GTTGGATTCA GTACATGCAG CCATTGATAA CACTAAGATT GGTTATGTGG AGGTTGTTGT ATCCGAGAGT GGGTGGCCAT CAGATGGAGG ATTTGCTGCC ACTTATGACA ACGCACGCGT GTACTTAGAC AATTTGGTTC GTCGTGCTAA TAGAGGAAGC CCAAGAAGGC CTTCGAAGCC CACTGAGACT TATATATTTG CCATGTTCGA TGAAAATCAA AAAAATCCAG AGATAGAGAA ACATTTTGGG CTCTTCAATC CCAACAAACA AAAAAAA
8. ADN recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a2) est la séquence (Na2) suivante :
ATGCCTTCTC TCTTCGCTAG AAACCAGAGG TTCTCATTGG CTACTCTCCT GCTTCTTCTG GAACTATTGA CAGGAAACCT TCGCATGGCA GATGCT
9. ADN recombinant selon l'une des revendications 2 à 5, ccaractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a4) est la séquence (Na4) suivante : TACC CATTTGGGTT TGGAGGAAAG AGGCTAGGGA AAGTTGTTAT TGACGACTTC
AATGCAACAA CTTCCATTAA GAGTGATGTG
10. Bactérie caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expression, l'ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 2.
11. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9, avec les moyens nécessaires à son expression.
12. Cellule végétale selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.
13. Plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9, avec les moyens nécessaires à son expression.
14. Plante ou partie de plante selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.
15. Partie de plante selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisée en ce qu'elle est apte à former une nouvelle plante complète ou à produire des semences.
16. Partie de plante selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est une semence.
17. Protéine à activité β-1,3-glucanase, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence (a1).
18. Protéine selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comporte immédiatement en aval de la séquence (a1) la séquence d'acides aminés (a4) tronquée dans sa partie carboxyterminale de 0 à 27 acides aminés.
19. Protéine à activité β-1,3-glucanase, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence (a5).
20. Protéine selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 36 ± 3 kDa.
21. Protéine selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 37 ± 3 kDa.
22. Protéine selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisée en ce qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 39 ± 3 kDa.
23. Procédé pour préparer la protéine selon l'une des revendications 17 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de bactéries, de cellules végétales, de cals végétaux, de plantes, ou de parties de plantes contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9, la lyse de ceux-ci, l'isolement et la purification de cette protéine.
EP92908870A 1991-03-25 1992-03-25 Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta-1,3-glucanase de soja Withdrawn EP0536364A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9103588 1991-03-25
FR919103588A FR2674538B1 (fr) 1991-03-25 1991-03-25 Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta 1,3-glucanase bacteries contenant cet adn, cellules vegetales et plantes transformees.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0536364A1 true EP0536364A1 (fr) 1993-04-14

Family

ID=9411086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP92908870A Withdrawn EP0536364A1 (fr) 1991-03-25 1992-03-25 Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta-1,3-glucanase de soja

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5477001A (fr)
EP (1) EP0536364A1 (fr)
JP (1) JPH06500237A (fr)
AU (1) AU662139B2 (fr)
CA (1) CA2083837C (fr)
FR (1) FR2674538B1 (fr)
NZ (1) NZ242125A (fr)
WO (1) WO1992016632A1 (fr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4234131C2 (de) 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
USRE39238E1 (en) 1992-10-09 2006-08-15 Max-Planck-Gesellschaft zür Forderung der Wissenschaften e.V. Transgenic pathogen-resistant organism
US5530187A (en) * 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5919688A (en) * 1994-10-14 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Enzyme with B-1, 3-glucanase activity
US5637745A (en) * 1995-01-30 1997-06-10 Elf Atochem North America, Inc. Organometallic compounds and polymers made therefrom
US5952548A (en) * 1997-11-04 1999-09-14 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean glucanases, compounds which encode therefor and related methods
KR100510430B1 (ko) * 2002-07-02 2005-08-26 제노마인(주) Ｋａｐａ 신타제 효소 기능을 갖는 식물의 신규폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 발현을 저해하여 식물생장 억제 및 치사를 유발하는 방법
DE60320278T2 (de) * 2002-08-07 2009-05-20 Vim Technologies Ltd. Lithographische druckglieder und verfahren und system zur herstellung lithographischer druckglieder
US7148052B2 (en) 2003-08-26 2006-12-12 Chao-Ying Chen Nucleic acid encoding β-1,3-glucanase from lily
WO2014127852A1 (fr) 2013-02-21 2014-08-28 Direvo Industrial Biotechnology Gmbh Produit prébiotique destiné à l'alimentation animale
DK2655644T3 (en) 2010-12-22 2019-03-04 Direvo Ind Biotechnology Gmbh IMPROVEMENT OF FERMENTATION PROCESSES AND BY-PRODUCTS
DK2958438T3 (en) 2013-02-21 2019-02-25 Direvo Ind Biotechnology Gmbh Mycotoxin binders
WO2014184054A1 (fr) 2013-05-16 2014-11-20 Direvo Industrial Biotechnology Gmbh Produit alimentaire d'animal pour animaux monogastriques
JP2015185323A (ja) * 2014-03-24 2015-10-22 日立金属株式会社 プローブケーブル及びそれを用いたハーネス

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE241699T1 (de) * 1989-03-24 2003-06-15 Syngenta Participations Ag Krankheitsresistente transgene pflanze

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9216632A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ242125A (en) 1993-08-26
CA2083837A1 (fr) 1992-09-26
US5477001A (en) 1995-12-19
AU662139B2 (en) 1995-08-24
WO1992016632A1 (fr) 1992-10-01
FR2674538A1 (fr) 1992-10-02
CA2083837C (fr) 2003-11-25
FR2674538B1 (fr) 1994-11-18
JPH06500237A (ja) 1994-01-13
AU1646792A (en) 1992-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2759135B2 (ja) 除草剤抵抗性植物のアセトラクテートシンターゼを暗号化する核酸断片
US9181310B2 (en) Use of bacteriophage outer membrane breaching proteins expressed in plants for the control of gram-negative bacteria
WO1992016632A1 (fr) Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta-1,3-glucanase de soja
AU718274B2 (en) Antifungal proteins, DNA coding therefore, and hosts incorporating same
EP0412912B1 (fr) Plantes transgéniques appartenant à l'espèce Cucumis melo
AU5111793A (en) Antifungal chitin binding proteins and dna coding therefor
EP0531218B1 (fr) ADN recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase
EP0672124B1 (fr) Utilisation d'une sequence d'adn codant pour une proteine susceptible de degrader l'acide oxalique a titre de gene de selection
EP0493581B1 (fr) Gene recombinant codant pour une proteine a activite endochitinase
EP0689595A1 (fr) Promoteur vegetal, microorganismes et cellules vegetales contenant une unite d'expression d'une proteine d'interet comprenant ledit promoteur
US10378024B2 (en) Optimized thionin protects plants against bacterial infections
WO2001029074A1 (fr) Gene chimere codant pour un facteur de transcription myb30 et expression dans les plantes
EP1121451B1 (fr) Procede d'obtention de plantes transgeniques exprimant une proteine a activite productrice de peroxyde d'hydrogene par transformation par agrobacterium rhizogenes
RU2333220C2 (ru) Белки, индуцирующие множественную устойчивость растений к фитопатогенам и вредителям
EP1392834A2 (fr) Sur-expression d'une lipoxygenase dans les plantes et diminution de la sensibilite des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogenes
WO2000008188A1 (fr) Cellule vegetale transformee avec au moins la partie codante du gene codant pour la fibrilline
JP2000325081A (ja) 根冠特異的タンパク質とその遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LI LU NL SE

17P Request for examination filed

Effective date: 19930311

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: SOCIETE NATIONALE ELF AQUITAINE

Owner name: SANOFI

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: ELF AQUITAINE

Owner name: SANOFI

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: RUSTICA PROGRAIN GENETIQUE

17Q First examination report despatched

Effective date: 19990301

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20021114