EP0789773A1 - Verfahren zur veränderung des blühverhaltens bei pflanzen - Google Patents

Verfahren zur veränderung des blühverhaltens bei pflanzen

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Publication number
EP0789773A1
EP0789773A1 EP95938378A EP95938378A EP0789773A1 EP 0789773 A1 EP0789773 A1 EP 0789773A1 EP 95938378 A EP95938378 A EP 95938378A EP 95938378 A EP95938378 A EP 95938378A EP 0789773 A1 EP0789773 A1 EP 0789773A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plants
sucrose transporter
flowering
plant
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95938378A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Georg Leggewie
Jörg Riesmeier
Wolf-Bernd Frommer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Hoechst Schering Agrevo GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Schering Agrevo GmbH filed Critical Hoechst Schering Agrevo GmbH
Publication of EP0789773A1 publication Critical patent/EP0789773A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to processes for the production of plants with a different flowering behavior compared to wild-type plants, in particular premature flowering and increased flowering, and to the plants obtainable from the process. Such plants are produced by increasing the sucrose transporter activity in the plants.
  • the invention further relates to the use of DNA molecules which encode sucrose transporters to change the flowering behavior in plants.
  • flowers in plants are a prerequisite for sexual reproduction and is therefore essential for the multiplication of plants which cannot be propagated vegetatively, and for the formation of seeds and fruits.
  • the point in time at which plants pass from purely vegetative growth to flower formation is of central importance, for example in agriculture, gardening and plant breeding.
  • the number of flowers is often of economic interest, e.g. in the case of various useful plants (tomato, cucumber, zucchini, cotton, etc.) in which a higher number of flowers may mean a higher yield, or in the production of ornamental plants and cut flowers.
  • early flowering of the plants is advantageous.
  • early flowering of various crop plants would allow a shortening of the time between sowing and harvesting and thus the spreading of two sowings per year or an extension of the period between flowering and harvesting, which may result in an increase in yield .
  • Can also be used in plant breeding premature flower formation contributes to a considerable shortening of the breeding process and thus brings about an improvement in economy.
  • the economic benefits of early flowering are also evident for horticulture and ornamental plant production.
  • the efforts to date to elucidate the mechanisms which determine the time of flower formation in plants do not allow a clear conclusion to be drawn about the factors involved and the decisive factors.
  • This process therefore does not appear to be suitable for producing useful plants which have changed their flowering behavior.
  • the present invention is therefore based on the object of providing simple methods which make it possible to modify plants to the extent that their flowering behavior is changed, in particular in that they show premature flower formation and / or an increased flower set .
  • the invention therefore relates to the use of DNA molecules which encode proteins with the biological activity of a sucrose transporter to change the flowering behavior in plants.
  • sucrose transporters A function of sucrose transporters in regulating the flowering behavior had not previously been considered.
  • Sucrose has been discussed several times as a potential signal for flower induction in the apical meristem (Bernier et al., Plant Cell 5 (1993), 1147-1155; Lejeune et al., Planta 190 (1993), 71-74; Lejeune et al ., Plant Physiol. Biochem. 29 (1991), 153-157), however, an influence of a sucrose transporter on the flowering behavior as a result of an increased activity of this transporter has so far not been known and was also not to be expected for various reasons.
  • an increased activity of the sucrose transporter is understood to mean that the total sucrose transporter activity in the transgenic plants is increased, in particular by at least 30%, preferably by at least 50%, particularly preferably by, in comparison with non-transformed plants at least 100%, and in particular by at least 200%.
  • Sucrose transporters are understood to be proteins that are able to transport sucrose across biological membranes. The activity of such transporters can be according to the Riesmeier et al. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713) determine the method described.
  • a changed flowering behavior is understood in the context of this application that premature flowering and flowering take place in transformed plants compared to non-transformed plants a), prematurely meaning that the transformed plants compared to wild-type plants at least a few days , preferably form and bloom flowers one to several weeks, in particular 1-2 weeks earlier, and / or b) show an increased flower set, which means that, compared to wild-type plants, the transformed plants produce on average more flowers per plant, generally use at least 5% more flowers, in particular 10-100% and preferably 10-40% more flowers.
  • sucrose transporter activity compared to wild-type plants can be achieved by introducing DNA molecules into plants which encode a sucrose transporter. This leads to additional synthesis of proteins with sucrose in the transgenic cells sea transporter activity. As a result of this, transformed tissues in which the introduced DNA molecule is expressed have an increased sucrose transporter activity compared to non-transformed cells.
  • the coding region of a DNA sequence which codes for a sucrose transporter is preferably linked to DNA sequences which are required for transcription in plant cells, and in Plant cells introduced.
  • the regulatory sequences required for the transcription are, on the one hand, promoters and possibly enhancer elements which are responsible for the initiation of the transcription.
  • termination signals which lead to the termination of the transcription and to the addition of a poly-A tail to the resulting transcript, can optionally be added.
  • sequences are linked to one another in such a way that the coding region of a sucrose transporter gene is connected in sense orientation to the 3 'end of the promoter, so that an mRNA is synthesized which converts into a protein with the activity of a sucrose transporter can be translated, and the termination signal is connected to the 3 'end of the coding region.
  • the coding region can be linked to sequences which increase translation in plant cells, as described in the examples.
  • the DNA molecules which code for a sucrose transporter can originate from any organism which contains such sequences, in particular from any prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the DNA molecules come from plants, fungi or bacteria. In plants, higher plants, in particular monocotyledonous or dicotyledonous plants, are preferred.
  • DNA molecules that are saccharo- Coding transporters are already known from various organisms and are given below. These are preferably used in the context of the invention.
  • the invention also relates to a method for changing the flowering behavior in plants, in which the changed flowering behavior is brought about by increasing the activity of the sucrose transporter in plants.
  • transgenic plants which have a different flowering behavior compared to non-transformed plants, in particular a premature flower formation and / or an increased flower set, is preferably carried out by a process which comprises the following steps: a) producing an expression cassette which comprises the following DNA sequences: i) a promoter which is functional in plant cells and which ensures the transcription of a subsequent DNA sequence, ii) at least one DNA sequence which codes a sucrose transporter and is sent to the 3 'in sense orientation End of the promoter is coupled, and iii) optionally a termination signal for the termination of the transcription and the addition of a poly-A tail to the resulting transcript which is coupled to the 3 'end of the coding region, b) transformation plant cells with the expression cassette produced in step a) and stable integration of the expressi on cassette in the plant genome, and c) regeneration of whole, intact plants from the transformed plant cells.
  • an expression cassette which comprises the following DNA sequences: i) a promoter which is functional in plant cells and which ensures the transcription
  • any promoter which is functional in plants is suitable for the promoter mentioned under i).
  • the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812) is suitable, which ensures constitutive expression in all tissues of a plant and that in WO / 9401571 described promoter con structure.
  • promoters can also be used which lead to an expression of subsequent sequences only at a point in time determined by external influences (see, for example, WO / 9307279) or in a certain tissue of the plant (see, for example, Hadash et al., Plant Cell 4 (1992), 149-159, Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251).
  • the DNA molecules which comprise a coding region for a sucrose transporter, can be of either native or homologous origin as well as foreign or heterologous origin with respect to the plant species to be transformed. Both DNA molecules derived from prokaryotic organisms and those derived from eukaryotic organisms, in particular plants, can be used. Prokaryotic sequences are known, for example, from E. coli (Bookman et al., Mol. Gen. Genet. 235 (1992), 22-32; EMBL library: accession number X63740). DNA molecules which encode vegetable sucrose transporters are preferably used.
  • RNA or DNA sequences from Arabidopsis thaliana (suc 1 and suc 2 genes; EMBL library: accession numbers X75365 and X75382, as well as H36128, H36415, R64756, T76707 and T42333), Solanum tuberosum (Riesmeier et al ., Plant Cell 5 (1993), 1591-1598; EMBL genebank: accession numbers X69165 and WO 94/00547), Plantago major (EMBL genebank: accession numbers X75764 and X84379), L.
  • EMBL genebank access ⁇ number X82275
  • Nicotiana tabacum EMBL gene bank: access numbers X82276 and X82277
  • R. co munis EMBL gene bank: access number Z31561
  • B. vulgaris EMBL gene bank: accession number X83850
  • rice EMBL library: accession numbers D40522 and D40515), which encode sucrose transporters.
  • a particular embodiment of the present invention provides for the use of a DNA molecule from Spinacia oleracea which encodes a sucrose transporter (see also Riesmeier et al., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713 and WO 94/00547).
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention provides that DNA molecules are used which encode sucrose transporters with the lowest possible I ⁇ value.
  • a transporter activity is known, for example, from Candida albicans (Williamson et al., Biochem. J. 291 (1993), 765-771).
  • the molecules which encode sucrose transporters can be cDNA molecules as well as genomic sequences.
  • the DNA molecules can be isolated from the corresponding organisms using the common techniques known to the person skilled in the art, for example hybridization or polymerase chain reaction, or they can be prepared synthetically.
  • termination signals for transcription in plant cells mentioned under iii) are described and can be interchanged as desired.
  • the termination sequence of the nopaline synthase gene from AgroJbac ⁇ eriLim tumefaciens can be used (see e.g. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29).
  • the expression cassette described can also contain DNA sequences which enhance the translation of the coding region in plant cells.
  • the method according to the invention can in principle be applied to any flower-forming plant species. It is preferably applied to the plants specified below.
  • the invention further relates to transgenic plants which, owing to the increased activity of the sucrose transporter, have a different flowering behavior compared to wild-type plants, in particular premature flowering and flowering and / or an increased flower set.
  • transgenic plants are preferably obtainable by the process described above. This means that the increase in the sucrose transport Interactivity preferably on the fact that DNA molecules which encode a saccharose transporter are introduced and expressed in the plants. These are preferably DNA molecules that come from plants, fungi or bacteria.
  • the plants according to the invention are preferably monocotyledonous or dicotyledonous crops, for example cereals (such as barley, oats, rye, wheat etc.), maize, rice, vegetable plants (such as tomato, melon, zucchini etc.) , Cotton, rapeseed, soybean, types of fruit (such as plum, apple, pear etc.), ornamental plants or cut flowers.
  • cereals such as barley, oats, rye, wheat etc.
  • maize such as tomato, melon, zucchini etc.
  • vegetable plants such as tomato, melon, zucchini etc.
  • Cotton rapeseed
  • soybean types of fruit (such as plum, apple, pear etc.), ornamental plants or cut flowers.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, Ml3mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained.
  • the plasmid DNA can be cleaved and linked to other DNA sequences.
  • Each plasmid DNA sequence can be cloned in the same or other plasmids.
  • Plasmids are preferably used to transform plant cells using the expression cassette described in the method.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and other possibilities.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, no special requirements are made of the plasmids used. Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA as the flank region, must be linked to the genes to be introduced .
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector. Because of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA, the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. The intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens by means of a helper plasmid (conjugation). Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to be a plasmid which carries a vir region.
  • the vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA can be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficient in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset- drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4 (1985), 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants obtained in this way can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygroycin or phosphinotricin and others. mediated.
  • the individually chosen marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al., Plant '' Cell Reports 5 (1986), 8-1-84).
  • the resulting plants can are normally grown and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties. Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • Fig. 1 shows the plasmid p ⁇ A7DE-S21-Myc8.
  • A Fragment A: CaMV 35S promoter, nt 6909-7437 (Franck et al., 1980, Cell 21, 285-294). In the 5 'region of the promoter, two 35S enhancer elements (330 bp HincII / EcoRV fragment) were inserted into the Nco I interface.
  • fragment C DNA fragment approx. 1600 bp long, which encodes nucleotides 70 to 1644 of the cDNA encoding the sucrose transporter from spinach (Riesmeier et al., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713), includes
  • fragment D fragment D: 33 bp long DNA fragment which encodes the amino acid sequence EQKLISEEDLN-COOH
  • E fragment E: termination sequence of the octopine synthase gene; nt 11748-11939 the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)
  • Fragments A, B, C, D and E are in the vector pUC18.
  • the plasmid has a size of approximately 5700 bp.
  • Fig. 2 shows the plasmid p ⁇ -S21.
  • A Fragment A: CaMV 35S promoter, nt 6909-7437 (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294). In the 5 'region of the promoter, two 35S enhancer elements (330 bp HincII / EcoRV fragment) were inserted into the Nco I interface.
  • B fragment B: 73 bp Nco I / Asp 718 fragment (TMV-Ul) with the translation enhancer from the tobacco mosaic virus
  • fragment C DNA fragment approx. 1600 bp long, which encodes nucleotides 70 to 1644 of the cDNA encoding the sucrose transporter from spinach (Riesmeier et al., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713), includes
  • fragment D fragment D: 33 bp long DNA fragment which encodes the amino acid sequence EQKLISEEDLN-COOH
  • E fragment E: termination sequence of the octopine synthase gene; nt 11748-11939 the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)
  • the plasmid has a size of approximately 12.6 kb
  • Fig. 3 shows the plasmid p35 S- ⁇ -OCS
  • 5 shows as a bar graph the average number of days between the transfer of the plants from the tissue culture into soil until the opening of the first flower. In each case 12 plants per genotype were grown in a plant growth chamber under the following light conditions. 7- 9 a.m. 300 ⁇ mol quantum m 2 sec -1
  • FIG. 6 shows as a bar chart the average number of days between the transfer of the plants from the tissue culture into soil until the opening of the first flower. In each case 12 plants per genotype were grown in a plant growth chamber under the following light conditions. Lines 32, 12, 5 and 1 are 4 independent transgenic lines which had been transformed with the plasmid p ⁇ -S21. 7 am-11pm 400-500 ⁇ mol quantum m "2 sec _1
  • Fig. 7 shows a bar chart of the average number of leaf attachments until the flowers are formed. For experimental conditions, see FIG. 6.
  • NSEB buffer 0.25 M sodium phosphate buffer pH 7.2
  • the vector pUCl ⁇ was used for cloning in E. coli.
  • the gene constructions were cloned into the binary vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230).
  • E.coli strain DH5 ⁇ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) was used for the pUC vectors and for the pBinAR constructs.
  • the transformation of the plasmids into the tobacco plants was carried out using the Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 pGV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777-4788).
  • the DNA was transferred by direct transformation according to the method of Höfgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877).
  • the plasmid DNA of transformed agrobacteria was isolated according to the method of Birnboim & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) and analyzed by gel electrophoresis after suitable restriction cleavage. 4. Transformation of tobacco
  • the leaf pieces for shoot induction on MS medium (0.7% agar) with 1.6% glucose, 1 mg / 1 6-benzylaminopurine, 0.2 mg / 1 naphthylacetic acid, 500 mg / 1 claforan and 50 mg / 1 kanamycin.
  • the medium was changed every 7 to 10 days.
  • the leaf pieces were transferred to glass jars containing the same medium. Resulting shoots were cut off and placed on MS medium + 2% sucrose + 250 mg / 1 claforan and whole plants were regenerated from them.
  • the radiocative labeling of DNA fragments was carried out using a DNA random primer labeling kit from Boehringer (Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • sucrose transporter from spinach in the extracts of transgenic tobacco plants was identified using a "blotting detection kit for rabbit antibodies" (Amersham UK) according to the manufacturer's instructions.
  • the monoclonal antibody from mouse 9E10 (Kolodziej and Young, In: Methods in Enzy ology 194 (1991), 508-519), which is directed against the myc epitope shown as fragment D in FIG. 1, was used as the primary antibody .
  • telomere sequence With the help of PCR technology an approximately 1600 bp long DNA fragment was amplified, which contained nucleotides 70 to 1644 of the Riesmeier et al. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713) comprises the sequence of the clone pS21.
  • the oligonucleotide (1) introduced a Pst I and a Noc I interface at the 5 'end of the coding region.
  • the coding region was extended by the oligonucleotide (2) by an 11 amino acid long sequence (EQKLISEEDLN-COOH (Seq ID No. 3)) at the C-terminus and a Pst I site was also introduced.
  • This sequence originates from the c-Myc gene and represents the recognition epitope for the monoclonal antibody from mouse 9E10 (Kolodziej and Young, In: Methods in Enzymology 194 (1991), 508-519; commercially available from Dianova, Hamburg).
  • the resulting PCR product was cut with the restriction enduclease Pst I and ligated into a pUCl ⁇ vector cut with Pst I.
  • the resulting plasmid was named p-S21-Myc8.
  • An approximately 1600 bp fragment containing the PCR product was isolated from this by Nco I / Pst I partial digestion and ligated into the vector p35SDE- ⁇ -OCS cut with Nco I and Pst I.
  • the vector p35SDE- ⁇ -OCS was produced as follows: A 530 bp EcoR I / Asp718 fragment (nucleotides 6909-7439 (Franck et al.
  • the resulting plasmid was named p35SDE.
  • the 35S promoter contained in this fragment with two additional Hinc II / EcoR V fragments was designated 35SDE.
  • Another pUC plasmid was constructed, which is constructed as shown in FIG. 3. The following DNA fragments were inserted between the EcoR I and the Hind HI sites of the polylinker of a pUC18 vector:
  • This plasmid was called p35S- ⁇ -OCS.
  • the plasmid p35S- ⁇ -OCS was cut with EcoR I / Asp718, whereby the 35S promoter was removed. This was replaced by the promoter 35SDE isolated with EcoR I and Asp718 from the plasmid p35SDE. The resulting plasmid was named p35SDE- ⁇ -OCS.
  • This plasmid was cut with Nco I and Pst I in the polylinker.
  • the approximately 1600 bp fragment which contains the PCR product described above and was isolated from the plasmid p-S21-Myc8 by partial digestion with Nco I and Pst I was ligated into the interfaces. This resulted in the plasmid p ⁇ A7DE-S21-Myc8.
  • This plasmid is shown in Figure 1.
  • Plasmid p ⁇ A7DE-S21-Myc8 was digested with EcoR I and Hind III and the entire expression cassette comprising the promoter 35SDE, the translation enhancer, the region coding for the saccharose transporter from spinach, with the sequence containing the c-Myc epitope coded, and the termination sequence isolated.
  • the plasmid p ⁇ -S21 was used for the transformation of tobacco plants with the aid of the agrobacterium-mediated gene transfer.
  • RNA was isolated from leaf tissue of transgenic and non-transformed plants. 50 ⁇ g of this RNA were separated on an agarose gel, transferred to a nylon membrane and hybridized with the radioactively labeled cDNA, which encodes the sucrose transporter from spinach.
  • Such a Northern blot analysis showed that out of three transformants (transformants No. 5, 12 and 32) two transformants (No. 12 and No. 32) have a high expression of the sucrose transporter from spinach, one In comparison, transformants (No. 5) showed only a relatively low expression of the sucrose transporter from spinach, and no transcripts could be found in non-transformed potato plants which encoded the sucrose transporter from spinach.
  • the tobacco plants transformed with the plasmid p ⁇ -S21 had a different flowering behavior compared to non-transformed tobacco plants.
  • transformants 12 and 32 which showed a strong expression of the spinach-sucrose transporter, premature flower formation and a slightly increased flower set were observed.
  • Table I shows how many leaf batches, approximately 128-day-old transformed or non-transformed tobacco plants which were kept in the phytotron, had on average before the apical meristem was differentiated into inflorescences.
  • FIGS. 4a and b show transformed tobacco plants of line 12 (FIG. 4a) and line 32 (FIG. 4b) kept in the phytron in comparison to non-transformed tobacco plants. Under the same cultivation conditions, the flowering and flowering of untransformed tobacco plants started significantly later, on average approx. 14 days for plants kept in the phytotron.
  • the transformed plants In addition to the premature flower formation, the transformed plants have more flowers in comparison to wild-type plants. This is shown in Table II.
  • GAGACTGCAG TCAGTTGAGG TCTTCTTCGG AGATTAGTTT TTGTTCATGA CCACCCATGG 60

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Abstract

Es werden Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einem im Vergleich zu Wildtyppflanzen veränderten Blühverhalten, insbesondere einer vorzeitigen Blütenbildung und einem verstärkten Blütenansatz, und die daraus resultierenden Pflanzen beschrieben. Weiterhin wird die Verwendung von DNA-Molekülen, die Saccharosetransporter codieren, zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen beschrieben.

Description

Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einem im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen ver¬ änderten Blühverhalten, insbesondere einer vorzeitigen Blü¬ tenbildung und einem verstärkten Blütenansatz, sowie die aus dem Verfahren erhältlichen Pflanzen. Die Herstellung derar¬ tiger Pflanzen erfolgt hierbei durch die Steigerung der Saccharosentransporteraktivität in den Pflanzen. Die Erfin¬ dung betrifft ferner die Verwendung von DNA-Molekülen, die Saccharosetransporter codieren, zur Veränderung des Blühver¬ haltens bei Pflanzen.
Die Blütenbildung ist in Pflanzen eine Voraussetzung für die sexuelle Fortpflanzung und ist daher essentiell für die Ver¬ mehrung von Pflanzen, die nicht auf vegetativem Wege ver¬ mehrt werden können, sowie für die Bildung von Samen und Früchten. Der Zeitpunkt, zu dem Pflanzen vom rein vegeta¬ tiven Wachstum zur Blütenbildung übergehen, ist von zentra¬ ler Bedeutung beispielsweise in der Landwirtschaft, dem Gar¬ tenbau und der Pflanzenzüchtung. Ebenso ist die Anzahl der Blüten häufig von wirtschaftlichem Interesse, z.B. bei ver¬ schiedenen Nutzpflanzen (Tomate, Gurke, Zucchini, Baumwolle etc.), bei denen eine höhere Anzahl der Blüten unter Umstän¬ den einen höheren Ertrag bedeutet, oder bei der Herstellung von Zierpflanzen und Schnittblumen.
In vielen Anwendungsbereichen ist eine sehr frühzeitige Blü¬ tenbildung der Pflanzen von Vorteil. In der Landwirtschaft beispielsweise würde bei verschiedenen Nutzpflanzen eine vorzeitige Blüte eine Verkürzung der Zeit zwischen Aussaat und Ernte und so das Ausbringen von zwei Aussaaten pro Jahr ermöglichen bzw. eine Verlängerung des Zeitraums zwischen Blüte und Ernte, wodurch unter Umständen eine Ertragssteige¬ rung erreicht werden kann. Auch in der Pflanzenzüchtung kann eine vorzeitige Blütenbildung zu einer erheblichen Verkür¬ zung der Züchtungsverfahren beitragen und so eine Verbesse¬ rung der Wirtschaftlichkeit bewirken. Der wirtschaftliche Nutzen einer vorzeitigen Blüte ist auch für den Gartenbau und die Zierpflanzenproduktion offensichtlich. Die bisherigen Bemühungen zur Aufklärung der Mechanismen, die den Zeitpunkt der Blütenbildung in Pflanzen bestimmen, lassen keinen eindeutigen Schluß auf die beteiligten und ausschlaggebenden Faktoren zu. Für eine Reihe von Pflanzen ist bekannt, daß Umwelteinflüsse den Übergang zwischen vege¬ tativem Wachstum und Blütenbildung bestimmen, z.B. Licht/Dunkel-Rhythmen, Temperatur und Wasserangebot. Wie diese Reize von der Pflanze aufgenommen und in physiologi¬ sche Signale umgesetzt werden, die im apikalen Meristem die Blütenbildung induzieren, ist weitgehend unbekannt. Es wer¬ den verschiedene Theorien diskutiert und eine ganze Reihe von möglichen Faktoren in Betracht gezogen, wie beispiels¬ weise Blühhormone (Florigen/Antiflorigen) , Kohlenhydrate, Cytokinine, Auxin, Polyamine und Calcium-Ionen (Bernier et al., Plant Cell 5 (1993), 1147-1155).
Die Kontrolle des Zeitpunktes der Blütenbildung durch Regu¬ lation exogener Reize, wie beispielsweise Licht/Dunkel- Rhythmus, Temperatur oder Wasserangebot, läßt sich in der Praxis nur in begrenztem Umfang umsetzen, beispielsweise in Gewächshäusern. Um eine vorzeitige Blütenbildung in Pflanzen zu erreichen, die unter Freilandbedingungen wachsen, ist es daher notwendig, Pflanzen zu verwenden, die eine vorzeitige Blütenbildung unabhängig von exogenen Reizen zeigen. Mög¬ lichkeiten, derartige Pflanzen zu erzeugen, bestehen zum einen in Mutageneseverfahren, die jedoch nicht für alle Spe¬ zies anwendbar .sind, in züchterischen Verfahren, die jedoch sehr zeitintensiv sind und für jede Pflanzenspezies geson¬ dert durchgeführt werden müssen, oder in gentechnischen Ver¬ fahren. Voraussetzung für die Anwendbarkeit eines gentechni¬ schen Verfahrens ist jedoch, daß zum einen Genloci identifi¬ ziert sind, die einen wesentlichen Einfluß auf den BlühZeit- punkt haben, und daß DNA-Sequenzen zur Verfügung stehen, die die relevanten Produkte codieren. Dies ist bisher jedoch nicht der Fall.
Für die Spezies Arabidopsis thaliana, an der bisher die mei¬ sten Untersuchungen zur Regulation des Blühzeitpunktes durchgeführt wurden, wurden zwar verschiedene Mutanten be¬ schrieben, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen vorzeitig blühen (siehe Referenzen in Lee et al., Plant Cell 6 (1994), 75-83) , jedoch konnten diese Mutanten bisher nicht näher charakterisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Ur¬ sachen, die zu der vorzeitigen Blütenbildung führt, gelang bisher ebenfalls nicht.
Bell et al. , Plant Mol. Biol. 23 (1993), 445-451) beschrei¬ ben Tabakpflanzen, die mit der cdc2S-cDNA aus Schizo- saccharomyces porπbe transformiert wurden und die als Folge der Expression dieses Mitose-induzierenden Proteins eine vorzeitige Blütenbildung und eine stark erhöhte Anzahl der Blüten zeigen. Diese Pflanzen weisen jedoch den Nachteil auf, daß es zu starken Veränderungen in der Blattmorphologie kommt. Insbesondere sind die Blätter dieser Pflanzen ge¬ rollt.
Dieses Verfahren scheint daher nicht geeignet zu sein, um Nutzpflanzen herzustellen, die in ihrem Blühverhalten verän¬ dert sind.
Zur Herstellung von intakten Pflanzen mit einer höheren An¬ zahl an Blüten pro Pflanze bzw. einer vorzeitigen Blütenbil¬ dung ist man daher heute nach wie vor auf die klassischen Züchtungsverfahren oder Mutageneseverfahren angewiesen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einfache Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es ermögli¬ chen, Pflanzen .dahingehend zu verändern, daß sie in ihrem Blühverhalten verändert sind, insbesondere dahingehend daß sie eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz zeigen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in de ' Pa¬ tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst. Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von DNA- Molekülen, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Saccharosetransporters codieren, zur Veränderung des Blüh¬ verhaltens bei Pflanzen.
In der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 94/00574 werden DNA-Sequenzen beschrieben, die Saccharosetransporter aus Spinat und Kartoffel codieren. In dieser Anmeldung wird auch die Möglichkeit erwähnt, diese Sequenzen in Verbindung mit DNA-Sequenzen für die Regulation der Transkription in Pflanzen einzubringen mit dem Ziel der Überexpression derar¬ tiger Saccharosetransporter. Die Verwendung von DNA-Sequen¬ zen, die Saccharosetransporter codieren, zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen wurde jedoch nicht beschrieben. Von dem Saccharosetransporter wird angenommen, daß er eine zentrale Rolle bei dem Transport von Saccharose, der wich¬ tigsten Transportform der durch Photosynthese gebildeten Photoassimilate, aus den photosynthetisch aktiven Geweben in das Phloem spielt. In welchem Ausmaß er auch bei dem Trans¬ port von Saccharose aus dem Phloem in photosynthetisch nicht aktive Gewebe, die auf den Import von Photoassimilaten ange¬ wiesen sind (sogenannte "sink"-Organe) eine Rolle spielt, ist bisher umstritten (Riesmeier et al., Plant Cell 5 (1993), 1591-1598; Riesmeier et al. , EMBO J. 13 (1994), 1- 7) .
Eine Funktion von Saccharosetransportern bei der Regulation des Blühverhaltens war bisher nicht in Erwägung gezogen wor¬ den. Zwar wurde Saccharose bereits mehrfach als potentielles Signal für die Blühinduktion im apikalen Meristem diskutiert (Bernier et al., Plant Cell 5 (1993), 1147-1155; Lejeune et al., Planta 190 (1993), 71-74; Lejeune et al. , Plant Physiol. Biochem. 29 (1991), 153-157), einen Einfluß eines Saccharosetransporters auf das Blühverhalten als Folge einer erhöhten Aktivität dieses Transporters ist bisher jedoch we- der bekannt und war auch aus verschiedenen Gründen nicht zu erwarten. Es wurde überraschend gefunden, daß bei transgenen Pflanzen, in denen die Aktivität des Saccharosetransporters in den Ge¬ weben gesteigert war im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen, ein verändertes Blühverhalten beobachtet werden kann. Unter einer gesteigerten Aktivität des Saccharose¬ transporters wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, daß in den transgenen Pflanzen die Saccharosetransporteraktivi¬ tät im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen insgesamt erhöht ist, insbesondere um mindestens 30 %, vorzugsweise um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 100 %, und insbesondere um mindestens 200 %. Unter Saccharosetrans- portern werden Proteine verstanden, die in der Lage sind, Saccharose über biologische Membranen zu transportieren. Die Aktivität derartiger Transporter läßt sich nach der in Riesmeier et al. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713) beschriebe¬ nen Methode bestimmen. Unter einem veränderten Blühverhalten wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, daß bei trans¬ formierten Pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen a) eine vorzeitige Blütenbildung und Blüte erfolgt, wobei vorzeitig bedeutet, daß die transformierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen mindestens einige Tage, vorzugsweise eine bis mehrere Wochen, insbesondere 1-2 Wochen früher Blüten bilden und blühen, und/oder b) einen verstärkten Blütenansatz zeigen, was bedeutet, daß die transformierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp- Pflanzen durchschnittlich mehr Blüten pro Pflanze anset¬ zen, in der Regel mindestens 5 % mehr Blüten ansetzten, insbesondere 10-100 % und vorzugsweise 10-40 % mehr Blü¬ ten ansetzen.
Eine im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen gesteigerte Saccharo- seransporteraktivität kann dadurch erreicht werden, daß in Pflanzen DNA-Moleküle eingeführt werden, die einen Saccharo- setransporter codieren. Dadurch kommt es in den transgenen Zellen zur zusätzlichen Synthese von Proteinen mit Saccharo- setransporteraktivität. Als Folge davon haben transformierte Gewebe, in denen das eingeführte DNA-Molekül exprimiert wird, eine im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen ge¬ steigerte Saccharosetransporteraktivität.
Um eine Steigerung der Saccharosetransporteraktivität in den Geweben von Pflanzen zu erreichen, wird vorzugsweise die co¬ dierende Region einer DNA-Sequenz, die einen Saccharose¬ transporter codiert, mit DNA-Sequenzen verknüpft, die für die Transkription in pflanzlichen Zellen erforderlich sind, und in Pflanzenzellen eingebracht. Bei den Regulationsse¬ quenzen, die für die Transkription erforderlich sind, han¬ delt es sich zum einen um Promotoren und gegebenenfalls Enhancer-Elemente, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind. Ferner können gegebenenfalls Termina- tionssignale, die zur Termination der Transkription sowie zur Addition eines Poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript führen angefügt werden. Diese Sequenzen sind der¬ art miteinander verknüpft, daß sich an das 3 ' -Ende des Pro¬ motors die codierende Region eines Saccharosetransporter- Gens in sense-Orientierung anschließt, so daß eine mRNA syn¬ thetisiert wird, die in ein Protein mit der Aktivität eines Saccharosetransporters translatiert werden kann, und sich an das 3' -Ende der codierenden Region das Terminationssignal anschließt.
Ferner kann die codierende Region mit Sequenzen verknüpft sein, die die Translation in pflanzlichen Zellen steigern, wie in den Beispielen beschrieben.
Die DNA-Moleküle, die einen Saccharosetransporter codieren, können aus jedem beliebigen Organismus stammen, der derar¬ tige Sequenzen enthält, insbesondere aus jedem beliebigen prokaryontisehen oder eukaryontischen Organismus. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die DNA-Moleküle aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien. Bei Pflanzen kommen wie¬ derum vorzugsweise höhere Pflanzen, insbesondere monokotyle oder dicotyle Pflanzen in Frage. DNA-Moleküle, die Saccharo- setransporter codieren, sind bereits aus verschiedenen Orga¬ nismen bekannt und sind weiter unten angegeben. Diese werden bevorzugt im Rahmen der Erfindung verwendet.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Verände¬ rung des Blühverhaltens bei Pflanzen, bei dem das veränderte Blühverhalten dadurch bewirkt wird, daß in Pflanzen die Ak¬ tivität des Saccharosetransporters erhöht wird.
Die Herstellung transgener Pflanzen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen ein verändertes Blühverhalten aufweisen, insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz, erfolgt dabei vor¬ zugsweise durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt: a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA- Sequenzen umfaßt: i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Se¬ quenz gewährleistet, ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die einen Saccharose¬ transporter codiert und in sense-Orientierung an das 3 ' -Ende des Promotors gekoppelt ist, und iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termi- nation der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3'-Ende der codierenden Region gekoppelt ist, b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transfor¬ mierten Pflanzenzellen.
Für den unter i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985) ,810-812) , der eine konsti- tutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährlei¬ stet und das in der WO/9401571 beschriebene Promotorkon- strukt. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeit¬ punkt (siehe beispielsweise WO/9307279) oder in einem be¬ stimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachfolgen¬ der Sequenzen führen (sieh z. B. Hadash et al. , Plant Cell 4 (1992), 149-159, Stockhaus et al. , EMBO J. 8 (1989) , 2245- 2251) .
Die DNA-Moleküle, die eine codierende Region für einen Saccharosetransporter umfassen, können sowohl nativen bzw. homologen Ursprungs als auch fremden bzw. heterologen Ur¬ sprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies sein. Es können sowohl DNA-Moleküle verwendet werden, die aus prokaryontischen Organismen stammen, als auch solche, die aus eukaryontischen Organismen, insbesondere Pflanzen, stammen. Prokaryontische Sequenzen sind beispielsweise be¬ kannt aus E. coli (Bookman et al., Mol. Gen. Genet . 235 (1992) , 22-32; EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X63740) . Vorzugsweise werden DNA-Moleküle verwendet, die pflanzliche Saccharosetransporter codieren. Bekannt sind beispielsweise RNA bzw. DNA-Sequenzen aus Arabidopsis thaliana (suc 1- und suc 2-Gene; EMBL-Genbank: Zugriffsnummern X75365 bzw. X75382, sowie H36128, H36415, R64756, T76707 und T42333) , Solanum tuberosum (Riesmeier et al., Plant Cell 5 (1993), 1591-1598; EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X69165 und WO 94/00547) , Plantago major (EMBL-Genbank: Zugriffsnummern X75764 bzw. X84379) , L. esculentum (EMBL-Genbank: Zugriffs¬ nummer X82275) , Nicotiana tabacum (EMBL-Genbank: Zugriffs¬ nummern X82276 und X82277) , R. co munis (EMBL-Genbank: Zugriffsnummer Z31561) , B . vulgaris (EMBL-Genbank: Zugriffs¬ nummer X83850). und Reis (EMBL-Genbank: Zugriffsnummern D40522 und D40515) , die Saccharosetransporter codieren. Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung eines DNA-Moleküls aus Spinacia oleracea vor, das einen Saccharosetransporter codiert (siehe auch Riesmeier et al. , EMBO J. 11 (1992), 4705-4713 und WO 94/00547) . Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens sieht vor, daß DNA-Moleküle verwendet wer¬ den, die Saccharosetransporter mit einem möglichst niedrigen I^-Wert codieren. Eine derartiger Transporteraktivität ist beispielsweise aus Candida albicans (Williamson et al. , Biochem. J. 291 (1993), 765-771) bekannt.
Bei den Molekülen, die Saccharosetransporter codieren, kann es sich sowohl um cDNA-Moleküle, als auch um genomische Se¬ quenzen handeln. Die DNA-Moleküle können aus den entspre¬ chenden Organismen mittels der gängigen Techniken isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Hybri¬ disierung oder Polymerasekettenreaktion, oder sie können auf synthetischem Wege hergestellt werden.
Die unter iii) genannten Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander austauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Terminationssequenz des Nopalinsyn- thase-Gens aus AgroJbacεeriLim tumefaciens (siehe z.B. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29). Die beschriebene Expres¬ sionskassette kann ebenfalls DNA-Sequenzen enthalten, die die Translation der codierenden Region in pflanzlichen Zel¬ len verstärken.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf jede blü¬ tenbildende Pflanzenspezies angewendet werden. Vorzugsweise wird es auf die weiter unten angegebenen Pflanzen angewen¬ det.
Gegenstand der Erfindung sind ferner transgene Pflanzen, die aufgrund der gesteigerten Aktivität des Saccharosetranspor¬ ters, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen ein verändertes Blüh¬ verhalten aufweisen, insbesondere eine vorzeitige Blütenbil¬ dung und Blüte und/oder einen verstärkten Blütenansatz. Derartige transgene Pflanzen sind vorzugsweise durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich. Das heißt, bei die¬ sen Pflanzen beruht die Steigerung der Saccharosetranspor- teraktivität vorzugsweise darauf, daß in die Pflanzen DNA- Moleküle eingeführt und exprimiert werden, die einen Saccha¬ rosetransporter codieren. Dabei handelt es sich vorzugsweise um DNA-Moleküle, die aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien stammen.
Bei den erfindungsgemäßen Pflanzen handelt es sich vorzugs¬ weise um monokotyle oder dikotyle Nutzpflanzen, beispiels¬ weise Getreidesorten (wie z.B. Gerste, Hafer, Roggen, Weizen etc.), Mais, Reis, Gemüsepflanzen (wie z.B. Tomate, Melone, Zucchini etc.), Baumwolle, Raps, Sojabohne, Obstarten (wie z.B. Pflaume, Apfel, Birne etc.), Zierpflanzen oder Schnitt¬ blumen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen ent¬ halten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, Ml3mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wieder¬ gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der ge¬ wonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsana¬ lysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekular¬ biologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den glei¬ chen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Zur Transformation pflanzlicher Zellen mit der in dem Ver¬ fahren beschriebenen Expressionskassette werden vorzugsweise Plasmide verwendet.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. TJiese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen¬ zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der¬ artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer¬ den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen¬ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begren¬ zung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführen¬ den Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können auf¬ grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plas¬ mid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Re- gion. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der interme¬ diäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selek- tions arker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. , Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzli¬ che T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflan¬ zenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset- drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4 (1985), 1-46 und An et al., EMBO J. 4 (1985) , 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan¬ zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert wer¬ den. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus- pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se¬ lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön¬ nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions- marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge¬ genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygro ycin oder Phosphinotricin u.a. ver¬ mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant''Cell Reports 5 (1986) , 8-1-84) . Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypisehen Eigenschaften. Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Fig. 1 zeigt das Plasmid pΩA7DE-S21-Myc8.
A= Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Im 5' -Bereich des Promo¬ tors wurden in die Nco I-Schnittstelle zwei 35S-Enhan- cerelemente (330 bp HincII/EcoRV-Fragment) inseriert.
B= Fragment B: 73 bp langes Nco I/Asp 718-Fragment (TMV- Ul) mit dem Translationsenhancer aus dem Tabakmosaik- Virus
C= Fragment C: ca. 1600 bp langes DNA-Fragment, das die Nucleotide 70 bis 1644 der cDNA, die den Saccharose¬ transporter aus Spinat codiert (Riesmeier et al. , EMBO J. 11 (1992), 4705-4713), umfaßt
D= Fragment D: 33 bp langes DNA-Fragment, das die Amino¬ säuresequenz EQKLISEEDLN-COOH codiert
E= Fragment E: Terminationssequenz des Octopinsynthase- Gens; nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)
Die Fragmente A, B, C, D und E befinden sich in dem Vektor pUC18. Das Plasmid hat eine Größe von ca. 5700 bp.
Fig. 2 zeigt das Plasmid pΩ-S21.
A= Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294). Im 5' -Bereich des Promo¬ tors wurden in die Nco I-Schnittstelle zwei 35S-Enhan- cerelemente (330 bp HincII/EcoRV-Fragment) inseriert. B= Fragment B: 73 bp langes Nco I/Asp 718-Fragment (TMV- Ul) mit dem Translationsenhancer aus dem Tabakmosaik- Virus
C= Fragment C: ca. 1600 bp langes DNA-Fragment, das die Nucleotide 70 bis 1644 der cDNA, die den Saccharose- transporter aus Spinat codiert (Riesmeier et al. , EMBO J. 11 (1992), 4705-4713), umfaßt
D= Fragment D: 33 bp langes DNA-Fragment, das die Amino¬ säuresequenz EQKLISEEDLN-COOH codiert
E= Fragment E: Terminationssequenz des Octopinsynthase- Gens; nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. , EMBO J. 3 (1984), 835-846)
Das Plasmid hat eine Größe von ca. 12,6 kb
Fig. 3 zeigt das Plasmid p35 S-Ω-OCS
Fig. 4 a und b zeigen transformierte Tabakpflanzen im Ver¬ gleich mit nicht-transformierten Tabakpflanzen.
a: Drei Pflanzen der Tabaklinie 12, die mit dem Plasmid pΩ- S21 transformiert worden waren, (hinten) sind im Vergleich gezeigt mit zwei nicht-transformierten Tabakpflanzen (vorne) . Die Pflanzen sind ca. 128 Tage alt und wurden im Phytotron gehalten.
b: Drei Pflanzen der Tabaklinie 32, die mit dem Plasmid pΩ- S21 transformiert worden waren, (hinten) sind im Vergleich gezeigt mit zwei nicht-transformierten Tabakpflanzen (vorne) . Die Pflanzen sind ca. 128 Tage alt und wurden im Phytotron gehalten.
Fig. 5 zeigt als Balkendiagramm die durchschnittliche Anzahl der Tage zwischen dem Transfer der Pflanzen aus der Gewebe¬ kultur in Erde bis zum Öffnen der ersten Blüte. Es wurden jeweils 12 Pflanzen pro Genotyp unter folgenden Lichtbedin¬ gungen in einer Pflanzenwuchskammer angezogen. 7- 9 Uhr 300 μmol Quanten m2sec-1
9-11 Uhr 600 μmol Quanten m2sec_1
11-13 Uhr 900 μmol Quanten m2sec_1
13-17 Uhr 1200 μmol Quanten m2sec_1
17-19 Uhr 900 μmol Quanten m2sec_1
19-21 Uhr 600 μmol Quanten m2sec_1
21-23 Uhr 300 μmol Quanten m2sec"1
Fig. 6 zeigt als Balkendiagramm die durchschnittliche Anzahl der Tage zwischen dem Transfer der Pflanzen aus der Gewebe¬ kultur in Erde bis zum Öffnen der ersten Blüte. Es wurden jeweils 12 Pflanzen pro Genotyp unter folgenden Lichtbedin¬ gungen in einer Pflanzenwuchskammer angezogen. Die Linien 32, 12, 5 und 1 sind 4 unabhängige transgene Linien, die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformiert worden waren. 7-23 Uhr 400-500 μmol Quanten m"2sec_1
Fig. 7 zeigt als Balkendiagramm die durchschnittliche Anzahl der Blattansätze bis zur Ausbildung der Blüten. Versuchsbe¬ dingungen siehe Fig. 6.
In den Beispielen verwendete Medien und Lösungen
20 x SSC 175.3 g NaCl
88.2 g Natrium-Citrat ad 1000 ml mit ddH20 pH 7,0 mit 10 N NaOH
10 x MEN 200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat .10 mM EDTA pH 7, 0
NSEB-Puffer 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
7 % SDS
1 mM EDTA ""*
1 % BSA (Gew./Vol.) 4 x Laemmli- uffer
200 mM Tris pH 6,8 8 % SDS
0.4 % Bromphenolblau 40 % Glycerin
In den Beispielen verwendete Methoden:
1. Clonierungsverfahren
Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pUClδ verwendet. Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230) cloniert.
2. Bakterienstämme
Für die pUC-Vektoren und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al. , Nucl. Acids Res. 13 (1985) , 4777-4788) .
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen&Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988) , 9877) . Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakte¬ rien wurde nach- der Methode von Birnboim&Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Re¬ striktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert. 4. Transformation von Tabak
Eine Übernachtkultur des entsprechenden Agrobacterium turne faciens-Clons wurde abzentrifugiert (6500 rpm; 3 min) und die Bakterien wurden in YEB-Medium resuspendiert. Tabakblätter einer Tabaksterilkultur (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurden in kleine ca. 1 cm2 große Stücke zer¬ schnitten und in der Bakteriensuspension gebadet. Die Blatt¬ stücke wurden anschließend auf MS-Medium (0,7 % Agar) gelegt und 2 Tage im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blattstücke zur Sproßinduktion auf MS-Medium (0,7 % Agar) mit 1,6 % Glukose, l mg/1 6-Benzylaminopurin, 0,2 mg/1 Naph- thylessigsäure, 500 mg/1 Claforan und 50 mg/1 Kanamycin ge¬ legt. Das Medium wurde alle 7 bis 10 Tage gewechselt. Wenn sich Sproße entwickelt hatten, wurden die Blattstücke in Glasgefäße, die dasselbe Medium, enthielten, überführt. Ent¬ stehende Sprosse wurden abgeschnitten und auf MS-Medium + 2 % Saccharose + 250 mg/1 Claforan gegeben und aus ihnen ganze Pflanzen regeneriert.
5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
6. Northern Blot-Analyse
RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 μg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5 % Agarose, 1 x MEN-Puffer, 16,6 % Formalde¬ hyd) . Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewa¬ schen. Die RNA wurde mit 20 x SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham UK) transfe¬ riert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken. Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybri¬ disiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.
7. Isolierung von Proteinen aus Blattgewebe und Western Blot-Analyse
Für die Isolierung von Proteinen aus Blattgewebe wurden 2 kreisrunde Blattstücke mit einem Durchmesser von ca. 5 mm aus Tabakblättern ausgestanzt und in 100 μl 4x Laemmli-Puf- fer, 5 % ß-Mercaptoethanol in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß zerkleinert. Die entstehende Suspension wurde kurz abzentri- fugiert. 10 μl des Überstandes wurden direkt auf ein "MighTy Small" SDS-Polyacrylamid-Gel der Firma Höfer (Trenngel 10 % Polyacrylamid; Sammelgel 3,5 % Polyacrylamid) aufgetragen und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine mit Hilfe der Semidry-Elektroblot-Methode auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Identifizierung des Saccharosetransporters aus Spinat in den Extrakten transgener Tabakpflanzen erfolgte unter Verwendung eines "Blotting detection kit- for rabbit antibodies" (Amersham UK) nach den Angaben des Herstellers. Als primärer Antikör¬ per wurde der monoclonale Antikörper aus Maus 9E10 (Kolodziej und Young, In: Methods in Enzy ology 194 (1991) , 508-519) verwendet, der gegen das in Fig. 1 als Fragment D gezeigte myc-Epitop gerichtet ist.
8. Pflanzenhaltung
Im Gewächshaus: Lichtperiode 14 h bei 1300 Lux und 25°C
.Dunkelperiode 10 h bei 20 °C
Luftfeuchte 60 % Im Phytotron: Lichtperiode 15 h bei 800 mEinstein/m2/sec bei 25 °C Dunkelperiode 9 h bei 22 °C
Luftfeuchte 80 %
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Konstruktion des Plasmides pΩ-S21 und Einführung des Plas- ids in das Genom von Tabakpflanzen
Zur Konstruktion eines Plasmides, das zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet ist und zur Überexpression eines Saccharosetransporters in pflanzlichen Zellen führt, wurde zunächst die codierende Region einer cDNA, die einen Saccharosetransporter aus Spinat codiert, isoliert. Hierfür wurde der Clon pS21 (beschrieben in Riesmeier et al. , EMBO J. 11 (1992) , 4705-4713) verwendet. Unter Verwendung der Oligonucleotide
(1) 5 ' -GAGACTGCAGCCATGGCAGGAAGAAATATATAAAAAATGGTG-3 '
(Seq ID No. 1) und
(2) 5• -GAGACTGCAGTCAGTTGAGGTCTTCTTCGGAGATTAGTTTTTGTTC
ATGACCACCCATGGACCCACCAATTTTAGC-3' (Seq ID No. 2)
wurde mit Hilfe der PCR-Technologie ein ca 1600 bp langes DNA-Fragment amplifiziert, das die Nucleotide 70 bis 1644 der in Riesmeier et al. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713) dar¬ gestellten Sequenz des Clons pS21 umfaßt. Durch das Oligo- nucleotid (1) wurden am 5' -Ende der codierenden Region eine Pst I- und eine Noc I-Schnittstelle eingeführt. Durch das Oligonucleotid (2) wurde die codierende Region um eine 11 Aminosäuren lange Sequenzen (EQKLISEEDLN-COOH (Seq ID No. 3) ) am C-Terminus verlängert und außerdem eine Pst I- Schnittstelle eingeführt. Diese Sequenz stammt aus dem c- Myc-Gen und stellt das Erkennungsepitop für den monoclonalen Antikörper aus Maus 9E10 (Kolodziej und Young, In: Methods in Enzymology 194 (1991), 508-519; kommerziell erhältlich bei Dianova, Hamburg) dar.
Das resultierende PCR-Produkt wurde mit der Restriktionsen- donuclease Pst I geschnitten und in einen mit Pst I ge¬ schnittenen pUClδ-Vektor ligiert. Das resultierende Plasmid wurde p-S21-Myc8 genannt. Aus diesem wurde durch Nco I/Pst I-Partialverdau ein ca. 1600 bp langes Fragment isoliert, das das PCR-Produkt enthält, und in den mit Nco I und Pst I geschnittenen Vektor p35SDE-Ω-OCS ligiert wurde. Der Vektor p35SDE-Ω-OCS wurde folgendermaßen hergestellt: Aus dem Promotorbereich des Cauliflower Mosaic Virus wurde ein 530 bp langes EcoR I/Asp718-Fragment (Nucleotide 6909- 7439 (Franck et al. Cell 21 (1980), 285-294)) isoliert und in einen mit EcoR I und Asp718 geschnittenen pUC18-Vektor ligiert. Das entstehende Plasmid wurde p35S genannt. An¬ schließend wurde aus dem EcoR I/Asp718-Promotorfragment durch Restriktionsverdau mit den Endonucleasen Hinc II und EcoR V ein ca. 330 bp langes Fragment isoliert. Dieses Frag¬ ment wurde anschließend in die aufgefüllte Nco I-Schnitt- stelle des 35S-Promotors in dem Plasmid p35S cloniert. Hier¬ bei entstand ein Konstrukt, bei dem zwei Hinc II/EcoR V- Fragmente hintereinander in reverser Orientierung in der Nco I-Schnittstelle inseriert waren, wobei die Anordnung fol¬ gende war:
EcoRI (NcoI)/(EcoRV) ---330bp (HincII)/ (EcoRV) ---
330bp (HincII)/(Ncol) 525 bp Asp718
Das resultierende Plasmid wurde p35SDE genannt. Der in die¬ sem Fragment enthaltene 35S-Promotor mit zwei zusätzlichen Hinc II/EcoR V-Fragmenten wurde mit 35SDE bezeichnet. Es wurde ein weiteres pUC-Plasmid konstruiert, das wie in Figur 3 gezeig aufgebaut ist. Zwischen die EcoR I und die Hind HI-Schnittstellen des Polylinkers eines pUC18-Vektors wurden folgende DNA-Fragmente inseriert:
1. EcoR I/Asp718-Fragment des 35S-Promotors (Nucleotide 6909-7439 (Franck et al. , Cell 21 (1980), 285-294))
2. Asp718/Nco I-Fragment (TMV-Ul) aus dem Ω-Translationsen- hancer des Tabakmosaik-Virus mit der folgenden Sequenz: 5' -GGTACCTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACAT TACAATTACTATTTACAATTACCATGG-3 ' (Seq ID No. 4)
3. ein Polylinker mit folgenden Restriktionsschnittstellen Nco I/Sac I/Xho I/Sma I/BamH I/Xba I/Sal I/Pst I/Sph I
4. eine Terminationssequenz aus dem Octopinsynthasegen (nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)
Dieses Plasmid wurde p35S-Ω-OCS genannt.
Das Plasmid p35S-Ω-OCS wurde mit EcoR I/Asp718 geschnitten, wodurch der 35S-Promotor entfernt wurde. Dieser wurde durch den mit EcoR I und Asp718 aus dem Plasmid p35SDE isolierten Promotor 35SDE ersetzt. Das resultierende Plasmid wurde p35SDE-Ω-OCS genannt.
Dieses Plasmid wurde mit Nco I und Pst I im Polylinker ge¬ schnitten. In die Schnittstellen wurde das aus dem Plasmid p-S21-Myc8 durch Partialverdau mit Nco I und Pst I isolierte ca. 1600 bp lange Fragment, das das obenbeschriebene PCR- Produkt enthält, ligiert. Dadurch entstand das Plasmid pΩA7DE-S21-Myc8. Dieses Plasmid ist in Figur 1 dargestellt.
Aus dem Plasmid pΩA7DE-S21-Myc8 wurde durch Verdau mit EcoR I und Hind III die gesamte Expressionskassette umfassend den Promotor 35SDE, den Translationsverstärker, die den Saccha¬ rosetransporter aus Spinat codierende Region mit der Se¬ quenz, die das c-Myc-Epitop codiert, und der Terminationsse¬ quenz isoliert.
Diese Sequenz wurde in den mit EcoR I und Hind III geschnit¬ tenen Vektor TCSAS (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Braunschweig, Deutschland, am 10. Au¬ gust 1994 unter der Hinterlegungsnummer DSM 9359) ligiert, aus dem zuvor durch den EcoR I/Hind III-Verdau die zwischen diesen beiden Restriktionsschnittstellen enthaltene Expres¬ sionskassette entfernt wurde. Das resultierende Plasmid wurde pΩ-S21 genannt und ist in Figur 2 dargestellt.
Beispiel 2 Transformation von Tabakpflanzen mit dem Plasmid pΩ-S21
Das Plasmid pΩ-S21 wurde für die Transformation von Tabak¬ pflanzen mit Hilfe des Agrobakterien-vermittelten Gentrans¬ fers verwendet.
Als Ergebnis der Transformation ließ sich in transgenen Ta¬ bakpflanzen in verschiedenen Mengen das den Saccharosetrans- porter aus Spinat codierende Transkript nachweisen. Der Nachweis erfolgte mit Hilfe einer Northern-Blot-Analyse. Hierfür wurde RNA aus Blattgewebe transgener und nicht- transformierter Pflanzen isoliert. 50 μg dieser RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der radioaktiv markierten cDNA, die den Saccharosetransporter aus Spinat codiert, hybridisiert. Eine derartige Northern-Blot-Analyse zeigte, daß von drei Trans- formanten (Transformanten Nr. 5, 12 und 32) zwei Transfor- manten (Nr. 12 und Nr. 32) eine hohe Expression des Saccha¬ rosetransporters aus Spinat aufweisen, eine Transformante (Nr. 5) im Vergleich dazu nur eine relativ geringe Expres¬ sion des Saccharosetransporters aus Spinat zeigt, und sich in nicht-transformierte Kartoffelpflanzen keine Transkripte nachweisen ließen, die den Saccharosetransporter aus Spinat codierten.
Um zu zeigen, daß das Transkript, das einen Saccharosetrans- porter aus Spinat codiert, in transgenen Tabakpflanzen zur Synthese eines Saccharosetransporters führt, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Dazu wurden aus Blattge¬ webe transgener Pflanzen Proteine isoliert, auf einem SDS- Gel aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transfe- riert. Der Nachweis des Spinat-Saccharosetransporters in transgenen Tabakpflanzen erfolgte mit Hilfe von monoclonalen Antikörpern, die gegen das Epitop des c-Myc-Gens gerichtet sind, das von dem 3 ' -Ende der codierenden Region in dem Plasmid pΩ-S21 codiert wird.
In derartigen Western Blot-Analysen ließ sich spezifisch in Proteinextrakten transgener Tabakpflanzen ein ca. 48 kD großes Protein nachweisen. Dies entspricht dem erwarteten Molekulargewicht des Saccharosetransporters aus Spinat.
Infolge der Expression des Saccharosetransporters aus Spinat wiesen die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformierten Tabak¬ pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten Tabakpflanzen ein verändertes Blühverhalten auf. Insbesondere war bei den Transformanden 12 und 32, die eine starke Expression des Spinat-Saccharosetransporters zeigten, eine vorzeitige Blü¬ tenbildung sowie ein leicht verstärkter Blütenansatz zu be¬ obachten.
Transformierte Tabakpflanzen zeigten im Vergleich zu nicht- transformierten Pflanzen deutlich weniger Blattansätze, be¬ vor die Induktion des apikalen Meristems zur Bildung der Blütenstände einsetzt. In Tabelle I ist dargestellt, wie¬ viele Blattansätze ca. 128 Tage alte transformierte bzw. nicht-transformierte Tabakpflanzen, die im Phytotron gehal¬ ten wurden, vor der Differenzierung des apikalen Meristems zu Blütenständen durchschnittlich aufwiesen.
Tabelle I
transformierte durchschnittliche Anzahl Tabaklinie Nr. der Blattansätze
5 17,8 12 18 32 17,3
nicht-transformierte 20,7 Pflanzen Durch die vorzeitige Induktion des Meristems zur Bildung von Blütenständen kommt es zur vorzeitigen Bildung von Knospen und zur vorzeitigen Blüte im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen. Dies veranschaulichen auch die Figuren 4a und b, die im Phy¬ totron gehaltene transformierte Tabakpflanzen der Linie 12 (Fig. 4a) bzw. der Linie 32 (Fig. 4b) im Vergleich zu nicht- transformierten Tabakpflanzen zeigen. Unter gleichen Kulti¬ vierungsbedingungen setzte bei nicht-transformierten Tabak¬ pflanzen die Blütenbildung und Blüte deutlich später ein, im Durchschnitt ca. 14 Tage bei im Phytotron gehaltenen Pflan¬ zen.
Neben der vorzeitigen Blütenbildung setzten die transfor¬ mierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen zahlen¬ mäßig mehr Blüten an. Dies ist in Tabelle II dargestellt.
Tabelle II
transformierte durchschnittliche Anzahl Tabaklinie Nr. der Blüten pro Pflanze
5 112 12 170 32 133
nicht-transformierte 103 Pflanzen
Die untersuchten Pflanzen waren ca. 128 Tage alt und waren im Phytotron gehalten worden.
Die oben beschriebenen Ergebnisse wurden in einem Wieder¬ holungsversuch bestätigt, bei dem Pflanzen der transfor¬ mierten Linien 32, 12, 5 und 1 untersucht wurden. Die Ergeb¬ nisse sind in den Figuren 5, 6 und 7 dargestellt. SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin
GmbH
(B) STRASSE: Ihnestr. 63
(C) ORT: Berlin
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 14195
(G) TELEFON: +49 30 8300070 (H) TELEFAX: +49 30 83000736
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Veraenderung des Bluehverhaltens bei Pflanzen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(v) DATEN DER JETZIGER ANMELDUNG: ANMELDENUMMER: DE P4439748.8
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(AI BESCHREIBUNG: /desc = "oligonucleotide"
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GAGACTGCAG CCATGGCAGG AAGAAATATA TAAAAAATGG TG 42 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 76 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "oligonucleotide"
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GAGACTGCAG TCAGTTGAGG TCTTCTTCGG AGATTAGTTT TTGTTCATGA CCACCCATGG 60
ACCCACCAAT TTTAGC 76
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: JA (iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 73 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "oligonucleotide"
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GGTACCTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA ATTACTATTT 60
ACAATTACCA TGG 73

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verwendung von DNA-Molekülen, die Proteine mit der bio¬ logischen Aktivität eines Saccharosetransporters codie¬ ren, zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Veränderung des Blühverhaltens auf einer Steigerung der Aktivität des Saccharosetransporters beruht.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Blühverhalten so verändert ist, daß eine vorzeitige Blütenbildung und Blüte erfolgt.
4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Blühverhal¬ ten so verändert ist, daß ein verstärkter Blütenansatz erfolgt.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Steigerung der Aktivität des Saccharosetransportes da¬ durch erfolgt, daß in Pflanzen DNA-Moleküle eingebracht und exprimiert werden, die einen Saccharosetransporter codieren.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das DNA-Molekül einen pflanzlichen Saccharosetransporter co¬ diert.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das DNA-Molekül einen Saccharosetransporter aus einem Pilz codiert.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das DNA-Molekül einen bakteriellen Saccharosetransporter co¬ diert.
9. Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflan¬ zen, dadurch gekennzeichnet, daß in Pflanzen die Aktivi¬ tät des Saccharosetransporters erhöht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Steigerung der Sac¬ charosetransporteraktivität dadurch erreicht wird, daß in Pflanzen DNA-Moleküle eingebracht und exprimiert wer¬ den, die einen Saccharosetransporter codieren.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das DNA-Molekül einen pflanzlichen Saccharosetransporter codiert.
12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das DNA-Molekül einen Saccharosetransporter aus einem Pilz codiert.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das DNA-Molekül einen bakteriellen Saccharosetransporter codiert.
14. Transgene Pflanze mit einem im Vergleich zur Wildtyp- Pflanze veränderten Blühverhalten, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Pflanze im Vergleich zur Wildtyp-Pflanze eine gesteigerte Saccharosetransporteraktivität auf¬ weist.
15. Transgene Pflanze nach Anspruch 14, bei der das Blühver¬ halten so verändert ist, daß es im Vergleich zur Wild¬ typ-Pflanze zu einer vorzeitigen Blütenbildung und Blüte kommt.
16. Transgene Pflanze nach Anspruch 14 oder 15, bei der das Blühverhalten derart verändert ist, daß es im Vergleich zur Wildtyp-Pflanze zu einem verstärkten Blütenansatz kommt.
17. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Steigerung der Saccharosetransporteraktivität durch Einführung und Expression von DNA-Molekülen er¬ zielt wird, die einen Saccharosetransporter codieren.
18. Transgene Pflanze nach Anspruch 17, wobei das DNA-Mole¬ kül einen pflanzlichen Saccharosetransporter codiert.
19. Transgene Pflanze nach Anspruch 17, wobei das DNA-Mole¬ kül einen Saccharosetransporter aus einem Pilz codiert.
20. Transgene Pflanze nach Anspruch 17, wobei das DNA-Mole¬ kül einen bakteriellen Saccharosetransporter codiert.
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