HU221005B1 - Eljárás növények virágzási tulajdonságainak befolyásolására - Google Patents
Eljárás növények virágzási tulajdonságainak befolyásolására Download PDFInfo
- Publication number
- HU221005B1 HU221005B1 HU9800239A HU9800239A HU221005B1 HU 221005 B1 HU221005 B1 HU 221005B1 HU 9800239 A HU9800239 A HU 9800239A HU 9800239 A HU9800239 A HU 9800239A HU 221005 B1 HU221005 B1 HU 221005B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plants
- sucrose
- flowering
- plant
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Description
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 6 lap ábra)
HU 221 005 Bl
A jelen találmány tárgya eljárás olyan növények előállítására, amelyeknek a virágzási tulajdonságai módosultak a vad típusú növényekhez viszonyítva, pontosabban olyan növények előállítása, amelyek korán és fokozott mértékben virágzanak. A találmány tárgyát képezik továbbá az ebből az eljárásból származó növények. Ilyen növényeket úgy lehet létrehozni, hogy fokozzuk a szacharózhordozó aktivitást a növényekben. A találmány tárgyát képezik továbbá a szacharózhordozókat kódoló DNS-molekulák alkalmazása, azzal a céllal, hogy módosítsuk a növény virágzási tulajdonságait.
A virág kialakulása előfeltétele a növények szexuális szaporodásának, és ennek következtében főleg azoknál a növényeknél lényeges, amelyeket nem lehet vegetatív úton szaporítani, valamint fontos a magvak és gyümölcsök kialakulásához. Az az időpont, amikor a növények pusztán vegetatív szaporodása átmegy virágképződésbe, rendkívül lényeges például a mezőgazdaságban, a dísznövénytermesztésben és a növénynemesítésben. Emellett gyakran van gazdasági jelentősége a virágok számának is, azaz például a különböző haszonnövények esetében (paradicsom, uborka, cukkini, gyapot stb.), ahol is a nagyobb számú virág nagyobb termést eredményez, vagy a dísznövények és vágott virágok esetében.
Számos alkalmazási területen előnyös, ha a növények korán virágzanak. A mezőgazdaságban például a korai virágzás számos haszonnövény esetében azt jelenti, hogy a vetés és betakarítás közötti idő lerövidül, és ezért lehetséges évi két betakarítás, valamint jelentheti azt is, hogy megnő a virágzás és a betakarítás közötti idő, és így nagyobb termés érhető el. Emellett a növénynemesítés területén a korai virágzás hozzájárulhat a nemesítés! folyamatok jelentős lerövidítéséhez, és ezzel fokozza a gazdaságosságot. Az nyilvánvaló, hogy a korai virágzás gazdaságilag hasznos a dísznövények termesztése esetében is.
A korábban, annak a mechanizmusnak a vizsgálatára végzett kísérleti munka, amely meghatározza a növények virágképződési időpontját, nem hozott egyértelmű eredményeket ana vonatkozóan, hogy milyen faktorok játszanak szerepet, és melyek a meghatározó faktorok. Számos növény esetében ismert, hogy környezeti hatások határozzák meg a vegetatív növekedésből a virágképződésbe való átmenet időpontját, azaz például a világosság-sötétség ritmusa, a hőmérséklet és a vízellátás. Az azonban alig ismert, hogy ezeket az ingereket hogyan veszi fel a növény, és hogyan alakítja fiziológiai jelekké, amelyek az apikális merisztémában indukálják a virágképződést. Számos különböző elméletet vitattak meg és számos lehetséges faktort vettek figyelembe, mint például a virágzási hormonokat (florigen/antiflorigen), szénhidrátokat, citokinineket, az auxint, a poliaminokat és a kalciumiont [Bemier és munkatársai: Plánt Cell 5 1147-1155 (1993)].
A virágképződés időpontjának külső tényezőkkel való szabályozását (ilyen lehet például a megvilágítási ciklus, a hőmérséklet és a vízellátás) a gyakorlatban csak korlátozott mértékben lehet alkalmazni, például üvegházakban. Ahhoz, hogy a szabadban növesztett növények korai virágzását elérjük, ahhoz az kell, hogy a külső befolyásoktól függetlenül korán virágzó növényeket használjunk. Az ilyen növények szaporítására alkalmazhatjuk a mutagenezisfolyamatokat, amiket azonban nem használhatunk minden fajra, a nemesítési folyamatokat, amik azonban nagyon időigényesek, és külön kell elvégezni minden növényfaj esetében, vagy génsebészeti beavatkozással. A génsebészet alkalmazásának azonban az az előfeltétele, hogy azonosítva legyen az a genetikai lokusz, amelynek jelentős befolyása van a virágzás időpontjára, és hogy legyenek olyan DNS-szekvenciák, amelyek a megfelelő termékeket kódolják. Ez azonban nem az az eset.
Az Arabidopsis thaliana fajnál, amit leginkább használnak a virágzás időpontjának kutatásában, számos olyan mutánst leírtak, amelyek a vad típusú növényekkel összehasonlítva korán virágzanak [Lee és munkatársai: Plánt Cell 6, 75-83 (1994)], azonban ezeket a mutánsokat nem vizsgálták tovább. Emellett a korai virágzást eredményező biokémiai faktorok kimutatása sem vezetett sikerre.
Bell és munkatársai leírtak olyan dohánynövényeket, amiket a Schizoaccharomyces pombéből származó cdc25-cDNS-sel transzformáltak, és ennek a mitózist indukáló fehérjének az expressziója következtében korai virágzást mutattak, és jelentősen megnőtt a virágok száma [Bell és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 23, 445-451 (1993)]. Ezeknek a növényeknek azonban megvan az a hátrányuk, hogy komoly változásokat szenvedtek a leveleik morfológiájában. Pontosabban, ezeknek a növényeknek a levelei összepöndörödnek.
Ennek következtében ez az eljárás nem tűnik alkalmasnak olyan haszonnövények termesztésére, amelyeknek a virágzási tulajdonságait megváltoztatták.
Emiatt az olyan ép növények szaporítása, amelyeken megnőtt a virágok száma, vagy amelyek korábban virágzanak, még mindig a szokványos növénynemesítési eljárásoktól vagy mutageneziseljárasoktól függ.
Tehát a jelen találmány technikai problémája a növények oly módon való módosítása, hogy virágzási tulajdonságai módosuljanak, oly módon, hogy korábban hozzanak virágot és/vagy több virágot hozzanak.
Erre a problémára a jelen találmány igénypontjaiban megfogalmazott megoldásokat adjuk.
Tehát a jelen találmány tárgya olyan DNS-molekulák alkalmazása, amelyek szacharózhordozó biológiai aktivitással rendelkeznek, azzal a céllal, hogy módosítsuk a növények virágzási tulajdonságait.
A WO 94/00574 számú, publikált PCT szabadalmi bejelentésben olyan DNS-szekvenciákat ismertetnek, amelyek spenótból és burgonyából származó szacharózhordozókat kódolnak. Ebben a bejelentésben megemlítik annak lehetőségét, hogy ezeket a szekvenciákat transzkripciót szabályozó szekvenciákkal együtt juttatják be növényekbe, azzal a céllal, hogy ezeket a szacharózhordozókat túlexpresszálják. Azonban nem írták le a szacharózhordozó DNS-szekvenciáknak a növények virágzási tulajdonságai módosítása érdekében való alkalmazását.
Feltételezzük, hogy a szacharózhordozók fontos szerepet játszanak a szacharóznak - azaz a fotoszintézis során keletkező legfontosabb fotoasszimilátumnak - a
HU 221 005 Bl fotoszintetikusán aktív szövetekből a háncsrészbe való transzportjában. Annak megítélése ellentmondásos volt, hogy a szacharózhordozó milyen mértékben játszik szerepet a szacharóznak a háncsrészből a fotoszintetikusán nem aktív szövetekbe való transzportjában (,,elnyelő”-szervek) [Riesmeyer és munkatársai: Plánt Cell J, 1591-1598 (1993); Riesmeier és munkatársai: EMBO Journal 13, 1-7 (1994)].
A szacharózhordozóknak a virágzási tulajdonságok szabályozásában játszott szerepét eddig még nem vették figyelembe. A szacharózról többször említették, hogy az apikális merisztémában lehet a virágzás indukálásának egy lehetséges jelzése [Bemier és munkatársai: Plánt Cell 5, 1147-1155 (1993); Lejeune és munkatársai: Planta 190, 71-74 (1993); Lejeune és munkatársai: Plánt Physiol. Biochem. 29, 153-157 (1991)], azonban a szacharózhordozónak a virágzási tulajdonságokra gyakorolt hatása, ami ennek a hordozónak a fokozott aktivitásának eredménye, nem volt ismert, és ezt különböző okok miatt nem is várták.
Meglepő felfedezés volt, hogy transzgenikus növényekben, amelyeknek a szöveteiben a szacharózhordozó aktivitása megnőtt a nem transzformált növényekhez viszonyítva, változás volt megfigyelhető a virágzási tulajdonságaikban. A jelen találmány szövegében a szacharózhordozó fokozott aktivitása azt jelenti, hogy a transzgenikus növényekben a nem transzformált növényekhez viszonyítva az össz-szacharóz-aktivitás megnőtt, pontosabban legalább 39%-kal, előnyösen legalább 50%-kal, különösen előnyösen legalább 100%kal, de az a legjobb, ha legalább 200%-kal. A szacharózhordozókról ismert, hogy olyan fehérjék, amelyek képesek a szacharóz különböző biológiai membránokon való átjuttatására. Ezeknek a hordozóknak az aktivitását a Riesmeier és munkatársai által ismertetett módszerrel lehet meghatározni [Riesmeyer és munkatársai: EMBO Journal 11, 4705-4713 (1992)]. A jelen találmány szövegében a módosított virágzási tulajdonságok alatt azt értjük, hogy a transzformált növényekben a nem transzformált növényekkel összehasonlítva:
a) a növények korán virágzanak, és „korán” alatt azt értjük, hogy a transzformált növények a vad típusú növényekkel összehasonlítva néhány nappal, előnyösen egytől néhány hétig terjedő időtartammal korábban virágzanak, pontosabban egy-két héttel korábban, és/vagy
b) fokozott mértékben virágzanak, ami azt jelenti, hogy a transzformált növények a vad típusú növényekkel összehasonlítva általában növényenként több virágot hoznak, általában 5%-kal több virágot, főleg 10-40%-kal, előnyösen 10-40%-kal több virágot.
A vad típusú növénnyel összehasonlítva egy megnövekedett szacharózhordozó-aktivitást úgy érhetünk el, hogy olyan DNS-molekulákat juttatunk be a növényekbe, amelyek szacharózhordozókat kódolnak. Ily módon még több szacharózhordozó-aktivitással rendelkező fehérje szintetizálódik a transzgenikus sejtekben. Ennek eredményeképpen a transzformált szövetekben, amelyekben a bevitt DNS-molekula expresszálódik, a nem transzformált sejtekkel összehasonlítva megnövekedett szacharózhordozó-aktivitással rendelkezik.
Ahhoz, hogy a növények szöveteiben megnövekedett szacharózhordozó-aktivitást érjünk el, a DNS-szekvenciának előnyösen azt a részét, amely egy szacharózhordozót kódol, egy olyan DNS-szekvenciához kapcsoljuk, amely a növényi sejtekben való transzkripcióhoz szükséges, és ezeket bejuttatjuk a növényi sejtekbe. A szabályozószekvenciák, amelyek a transzkripcióhoz szükségesek, azok a promoterek, illetve adott esetben fokozóelemek, amelyek a transzkripció iniciálásáért felelősek. Emellett hozzáadhatok terminációs jelek is, amelyek a transzkripció leállításához, valamint a keletkező transzkriptumhoz poli-A-farok hozzáadásához vezetnek, ha szükséges. Ezek a szekvenciák úgy kapcsolódnak, hogy a szacharózhordozó gén kódolórégiója a promoter 3’ végéhez kapcsolódik értelmes orientációban, és így mRNS szintetizálódik, ami szacharózhordozó-aktivitással rendelkező fehérjévé fordítható le, és a kódolórégió 3’ végét követi a terminációs szignál.
Emellett a kódolórégió kapcsolható olyan szekvenciákhoz, amelyek fokozzák a transzlációt a növényi sejtekben, amint azt a példákban ismertetjük.
A szacharózhordozót kódoló DNS-molekulák bármilyen, ilyen szekvenciát tartalmazó szervezetből származhatnak, főleg bármilyen prokarióta- vagy eukariótaszervezetből. Egy megvalósítási mód szerint a DNSmolekulák növényekből, gombákból vagy baktériumokból származnak. A növények esetében a magasabb rendű növényeket részesítjük előnyben, pontosabban az egyszikű vagy kétszikű növényeket. A szacharózhordozókat kódoló DNS-molekulák származhatnak különböző szervezetekből, és az alábbiakban említjük ezeket. Előnyösen ezeket alkalmazzuk ebben a találmányban.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy, a növények virágzási tulajdonságainak befolyásolására alkalmas eljárás, és a virágzási tulajdonságokat úgy befolyásoljuk, hogy növeljük a szacharózhordozó aktivitását a növényekben.
A transzgenikus növényeket, amelyek módosított virágzási tulajdonságokkal rendelkeznek a nem transzformáit növényekkel összehasonlítva, ami főleg abban nyilvánul meg, hogy korábban virágzanak és/vagy több virágot hoznak, az alábbi lépéseket tartalmazó eljárással állítjuk elő:
a) készítünk egy expressziós kazettát, amely az alábbi
DNS-szekvenciákat tartalmazza:
i) egy növényi sejtekben működőképes promoter, amely garantálja a keletkező DNS-szekvencia transzkripcióját, ii) legalább egy olyan DNS-szekvencia, amely egy szacharózhordozót kódol, és ami a promoter 3’ végéhez kapcsolódik értelmes orientációban, és iii) ha szükséges, akkor egy terminációs szignál a transzkripció leállítására, valamint egy poli-Afarok hozzáadása a keletkező transzkriptumhoz, ami a kódolórégió 3’ végéhez kapcsolódik;
b) a növényi sejtek transzformációja az a) lépésben készített expressziós kazettával és az expressziós kazetta stabil integrációja a növényi genomba, és
HU 221 005 Bl
c) komplett, érintetlen növények regenerálása a transzformáit növényi sejtekből.
Az i) pontban említett promoter elvileg lehet bármelyik, növényekben működőképes promoter. Alkalmas lehet például a karfiol-mozaikvírus [Odell és munkatársai: Natúré 313, 810-812 (1985)], ami konstitutív expressziót biztosít egy növény összes szövetében, valamint a WO/9401571-es szabadalmi bejelentésben ismertetett promoterkonstrukció. Azonban olyan promoterek is használhatók, amelyek csak külső behatások által meghatározott időpontokban működnek (lásd például a WO/9307279 számú szabadalmi bejelentést), vagy csak a növények bizonyos szöveteiben működnek és expresszálják a hozzájuk kapcsolt szekvenciákat [Hadash és munkatársai: Plánt Cell 4, 149-159 (1992); Stockhaus és munkatársai: EMBO Journal 8, 2245-2251 (1989)].
Egy szacharózhordozót kódoló régiót tartalmazó DNS-molekula lehet természetes, azaz homológ eredetű, és lehet idegen, azaz heterológ eredetű is, a transzformálandó növényfaj szempontjából. Mind prokarióta-, mind eukarióta-szervezetekből (főleg növényekből) származó DNS-molekulák használhatók. A prokarióta-szekvenciák például Escherichia coliból ismertek [Bockman és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 235, 22-32 (1992); EMBL génbank, letéti szám X63740],
Egy előnyös megvalósítási mód szerint növényi szacharózhordozókat kódoló DNS-molekulákat használunk. Ismertek RNS- és DNS-szekvenciák például Arabidopsis thalianábói (suc-1 és suc-2 gének, EMBL génbank: letéti szám X75365 és X75382, valamint a H36128, H36415, R64756, T6707 és T42333), a Solanum tuberosumból [Riesmeier és munkatársai: Plánt Cell 5, 1591-1598 (1993), EMBL génbank: letéti szám X69165 és WO 94/00547), Plantago majorból (EMBL génbank: letéti szám X75764 és X84379), L. esculentumból (EMBL génbank: letéti szám X82275), Nicotiana tabacumból (EMBL génbank: letéti szám X82276 és X82277), R. communisból (EMBL génbank: letéti szám Z31561), B. vulgárisból (EMBL génbank: letéti szám X83850) és rizsből (EMBL génbank: letéti szám D40522 és D40515), amelyek szacharózhordozókat kódolnak. A jelen találmány tárgya egy Spinacia oleraciából származó DNS-molekula alkalmazása, amely egy szacharózhordozót kódol [Riesmeier és munkatársai: EMBO Journal 11, 4705-4713 (1992), és WO 94/00547],
A jelen találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módja továbbá az olyan DNS-molekulák alkalmazása, amelyek a lehető legkisebb Κ,,,-értékkel rendelkező szacharózhordozókat kódolnak. Ilyen hordozóaktivitás ismert például Candida albicansból [Williamson és munkatársai: Biochem. J. 291, 765-771 (1993)].
A szacharózhordozókat kódoló molekulák lehetnek mind cDNS-molekulák, mind genomiális szekvenciák. A DNS-molekulákat a szakterületen jártas szakember számára ismert szokványos módszerekkel izolálhatjuk a megfelelő szervezetekből, például hibridizálással vagy polimeráz láncreakcióval, de előállíthatok szintetikus módszerekkel is.
A növényi sejtek transzkripciójának az iii) pontban említett terminációs szignáljai ismertek, és egymással felcserélhetők. Azaz például az Agrobacterium tumefaciens nopalin-szintetáz génjének terminációs szekvenciája [Gielen és munkatársai: EMBO Journal 8, 23-29 (1989)] használható. Az ismertetett expressziós kazetta tartalmazhat olyan DNS-szekvenciákat, amelyek fokozzák a növényi sejtekben a transzlációt.
A találmány szerinti módszer elméletben bármelyik virágot hozó növényfajra alkalmazható, előnyösen az alábbiakban említett növényekre.
A találmány tárgyát képezik továbbá a transzgenikus növények, amelyek a szacharózhordozó megnövekedett aktivitása következtében a vad típusú növényekhez viszonyítva módosult virágzási tulajdonságokkal rendelkeznek, főleg a korábbi virágzás miatt és/vagy a megnőtt számú virágok miatt.
Az ilyen transzgenikus növényeket előnyösen az előzőekben ismertetett eljárással állíthatjuk elő. Ez azt jelenti, hogy ezekben a növényekben a szacharózhordoζό-aktivitás növekedése előnyösen a szacharózhordozókat kódoló DNS-molekulák növényekbe való bejuttatásának és expressziójának következménye. A DNSmolekulák előnyösen növényekből, gombákból és baktériumokból származhatnak.
A találmány szerinti növények előnyösen egyszikű vagy kétszikű haszonnövények, azaz például gabonafélék (árpa, zab, rozs, búza stb.), kukorica, rizs, zöldségfélék (azaz például paradicsom, dinnye, cukkini stb.), gyapot, repce, szójabab, gyümölcsök (azaz például szilva, alma, barack), dísznövények vagy vágott virágok.
Az idegen gének magasabb rendű növényekbe való bejuttatásához számos különböző klónozó vektor használható, amelyek tartalmaznak egy Escherichia coli replikációs origót valamint egy marker gént, a transzformáit baktériumsejtek szelektálására. Ilyen vektor lehet például a pBR322, a pUC sorozat, az M13mp sorozat, a pACYC 184 stb. A szükséges szekvenciát a megfelelő restrikciós hasítási helyeknél lehet bejuttatni a vektorba. A kapott plazmidot Escherichia colisejtek transzformálására használjuk. A transzformált Escherichia co/Z-sejteket megfelelő táptalajon szaporítjuk, majd összegyűjtjük és lizáltatjuk. A plazmidot kinyerjük. A kinyert plazmid-DNS elemzésére általában restrikciós elemzést, gélelektroforézist és ezeken felül molekuláris biológiai módszereket alkalmazunk. Minden manipulálás után a plazmid-DNS elhasítható, majd más DNS-szekvenciákhoz kapcsolható. Mindegyik plazmid-DNS-szekvencia klónozható ugyanabba vagy egy másik plazmidba.
A növényi sejteknek az ismertetett expressziós kazettával való transzformálásához előnyösen plazmidokat lehet használni.
A DNS-nek egy növényi gazdasejtbe való bejuttatásához számos különböző módszer használható. A módszerek abból állnak, hogy a növényi sejteket T-DNSsel transzformáljuk, Agrobacterium tumefacienst vagy Agrobacterium rhizogenest használva transzformálóeszközként protoplasztfúziót végzünk, injektálunk, a DNS-t elektroporációval juttatjuk be, a DNS-t bioliszti4
HU 221 005 Bl kus módszerrel juttatjuk be, valamint léteznek egyéb lehetőségek is.
A használt plazmidoknak speciális feltételeknek kell megfelelniük a DNS növényi sejtekbe való injekciózásához és elektroporációjához. Egyszerű plazmidok, azaz például pUC-származékok használhatók. Ha azonban teljes növényeket kell regenerálni az ilyen transzformáit sejtekből, akkor szükség van a szelekciós markerek jelenlétére.
A kívánt génnek a növényi sejtekbe való bejuttatására használt módszertől függően további DNS-szekvenciákra lehet szükség. Ha például Ti- vagy Ri-plazmidokat használunk a növényi sejt transzformálására, akkor a Ti- vagy Ri-plazmid T-DNS-nek legalább a jobb karját, gyakran azonban mind a jobb, mind a bal karját hozzá kell kapcsolni a bejuttatandó génekhez határoló régióként.
Ha a transzformáláshoz Agrobacteriumokai használunk, akkor a bejuttatandó DNS-t speciális plazmidokba kell klónozni, azaz vagy egy intermedier vektorba, vagy egy bináris vektorba. Az intermedier vektorok, a T-DNS-ben levő szekvenciákkal homológ szekvenciák következtében homológ rekombinációval integrálódhatnak az Agrobacteriumok Ti- vagy Ri-plazmidjába. A Ti- vagy Ri-plazmid emellett tartalmazza a vir régiót, ami a T-DNS átviteléhez szükséges. Az intermedier vektorok nem képesek replikálódni az Agrobacteriumókban. Egy segítő plazmid révén az intermedier vektor átvihető az Agrobacterium tumefaciensbe (konjugáció). A bináris vektorok mind Escherichia coliban, mind Agrobacteriumban képesek szaporodni. Tartalmaznak egy szelekciós marker gént, valamint egy linkért vagy polilinkert, ami a T-DNS bal és jobb oldali határoló régióját határolja. Ezek közvetlenül transzformálhatok az Agrobacteriumokba [Holsters és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 (1978)]. AzAgrobacterium, amely gazdasejtként szolgál, egy vir régiót tartalmazó plazmiddal kell hogy rendelkezzen. A vir régió szükséges a T-DNS-nek a növényi sejtbe való átviteléhez. További T-DNS is lehet jelen. Az így transzformált Agrobacteriumot használják azután a növényi sejtek transzformálására.
Intenzív kutatómunkát végeztek a T-DNS-nek a növényi sejtek transzformálásában való felhasználására, ezt kielégítően ismertetik a szakirodalomban [EP120516; Hoekema: „The Binary Plánt Vector System”, Offsetdrukkerij Kanters Β. V., Alblassersam, V. fejezet; Fraley és munkatársai: Crit. Rév. Plánt Sci. 4, 1-46 (1985); An és munkatársai: EMBO Journal 4, 277-287 (1985)].
A DNS-nek a növényi sejtbe való bejuttatásához megfelel, ha a növényi explantumokat együtt tenyésztjük az Agrobacterium tumefacienssel vagy az Agrobacterium rhizogenessek A megfertőzött növényi anyagból (azaz például levélexplantumokból, szárszegmensekből, gyökérrészekből, de protoplasztokból vagy tenyésztett növényi sejtek szuszpenziójából is) teljes növények regenerálhatok egy megfelelő közegben, amely tartalmaz antibiotikumokat vagy biocidokat a transzformált sejtek szelektálására. Az ily módon kapott növényekben azután vizsgálható a bejuttatott DNS jelenléte.
Ha a bejuttatott DNS egyszer már integrálódott a növényi sejt genomjába, akkor az ott általában stabil, és benne van az eredetileg transzformált sejt utódaiban is. Általában tartalmaz egy szelekciós markert, ami a transzformált növényi sejtet egy biociddal vagy egy antibiotikummal, azaz például kanamicinnel, G418-cal, bleomicinnel, higromicinnel vagy foszfinotricinnel szemben rezisztenssé teszi. Ennek következtében az alkalmanként megválasztott marker lehetővé teszi, hogy a transzformált sejteket szelektáljuk azok mellől a sejtek mellől, amelyekben nincs meg a bejuttatott DNS.
A transzformált sejtek a szokott módon szaporodnak a növényben [McCormick és munkatársai: Plánt Cell Reports 5, 81-84 (1986)]. A keletkező növényeket normális módon szaporíthatjuk, majd keresztezhetjük olyan növényekkel, amelyek ugyanazzal a genetikai információval, vagy más genetikai információval rendelkeznek. Az ezekből származó hibrid egyedek a megfelelő fenotípussal rendelkeznek.
Két vagy több generációt kell szaporítani ahhoz, hogy biztosak legyünk abban, hogy a fenotípus tulajdonság stabilan fennmaradt és átvihető. Magokat kell gyűjteni, hogy biztosítsuk, hogy a megfelelő fenotípus vagy az egyéb tulajdonságok fennmaradnak.
Az alábbiakban ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán a pQA7DE-S21-Myc8 plazmidot látjuk. A= A fragmens: CaMV 35S promoter, 6909-7437-es nukleotidok [Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294 (1980)]. A promoter 5’ régiójába két 35S elemet építettünk be (330 bázispár méretű
HincI/EcoRV fragmens) az Ncol hasítási helyre. B= B fragmens: Ncol/Asp 718 fragmens, amelynek mérete 73 bázispár, és a dohánymozaik-vírus transzlációs fokozószekvenciáját tartalmazza.
C= C fragmens: körülbelül 1600 bázispár méretű
DNS-fragmens, a spenótszacharóz-hordozót kódoló cDNS 70-1644-es nukleotidjait tartalmazza [Riesmeier és munkatársai: EMBO Journal 11, 4705-4713 (1992)].
D= D fragmens: 33 bázispár méretű DNS-fragmens, amely az EQKLISEEDLN-COOH aminosavszekvenciát kódolja.
E= Az oktopin szintetázgén terminációs szekvenciája, a pTiACH5 plazmid T-DNS-ének 11 748-11 939es nukleotidjai [Gielen és munkatársai: EMBO Journal 3, 835-846 (1984)].
Az A, B, C, D és E fragmens a pUC18 vektorban találhatók. A plazmid mérete körülbelül 5700 bázispár.
A 2. ábrán a pQ-S21 plazmid látható.
A= A fragmens: CaMV 35S promoter, 6909-7437-es nukleotidok [Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294, (1980)]. A promoter 5’ régiójába két 35S fokozó elemet építettünk be (330 bázispár méretű HincII/EcoRV fragmens) az Ncol hasítási helyre.
B= B fragmens: Ncol/Asp 718 fragmens (TMV-U1), hossza 73 bázispár, és a dohánymozaik-vírus transzlációs fokozószekvenciáját tartalmazza.
HU 221 005 Bl
C= C fragmens: körülbelül 1600 bázispár méretű DNS-ftagmens, amely a spenótszacharóz-hordozót kódoló cDNS 70-1644-es nukleotidjait tartalmazza [Riesmeier és munkatársai: EMBO Journal 11, 4705-4713 (1992)].
D= D fragmens: 33 bázispár méretű DNS-fragmens, amely az EQKLISEEDLN-COOH aminosavszekvenciát kódolja.
E= Az oktopin szintetázgén terminációs szekvenciája, a pTiACH5 plazmid T-DNS-ének 11 748-11 939es nukleotidjai [Gielen és munkatársai: EMBO Journal 3, 835-846 (1984)].
A plazmid mérete körülbelül 12,6 kilobázis.
A 3. ábrán a p35 S-Q-OCS plazmidot láthatjuk.
A 4a. és 4b. ábrákon a transzformált és nem transzformáit dohánynövényeket hasonlítjuk össze, a: három, a 12-es dohányvonalba tartozó növényt mutatunk be, amelyeket a pQ-S21 (előtér) plazmiddal transzformáltunk, összehasonlítva két nem transzformáit dohánynövénnyel (háttér). A növények körülbelül 128 naposak, és fitotronban tartottuk őket.
b: három, a 32-es dohányvonalba tartozó növényt mutatunk be, amelyeket a pQ-S21 (előtér) plazmiddal transzformáltunk, összehasonlítva két nem transzformáit dohánynövénnyel (háttér). A növények körülbelül 128 naposak, és fitotronban tartottuk őket. Az 5. ábra egy oszlopdiagram, amely a növényeknek a szövettenyészetből a talajba jutása és az első virág kinyílása között eltelt napok átlagát mutatja. Genotípusonként 12 növényt szaporítunk egy fitotronban, az alábbi megvilágítási körülmények között:
7-9 de. 300 pmol quanta m2 mp-1 9-11 de. 600 pmol quanta m2 mp-1 11 de. -1 du. 900 pmol quanta m2 mp-1
-5 du. 1200 pmol quanta m2 mp-1
5-7 de. 900 pmol quanta m2 mp-1
7-9 du. 600 mmol quanta m2 mp-1 9-11 du. 300 pmol quanta m2 mp-1
A 6. ábra egy oszlopdiagram, amely a növényeknek a szövettenyészetből a talajba jutása és az első virág kinyílása között eltelt napok átlagát mutatja. Genotípusonként 12 növényt szaporítunk egy fitotronban, az alábbi megvilágítási körülmények között. A 32-es, 12es, 5-ös és 1-es vonal négy egymástól független transzgenikus vonal, amelyeket a pQ-S21 plazmiddal transzformáltunk.
de.-11 du. 400-500 pmol quanta m2 mp-1
A 7. ábra egy oszlopdiagram, amely a levélalapok átlagos számát mutatja a virág kialakulásáig. A vizsgálati körülmények a 6. ábrán láthatók.
A példákban alkalmazott táptalajok és oldatok az alábbiak:
χ SSC 175,3 nátrium-klorid 88,2 g nátrium-citrát 1000 ml-re feltöltve desztillált vízzel pH=7,0,10 mol/1 nátrium-hidroxiddal χ MÉN 200 mmol/1 MOPS mmol/1 nátrium-acetát 10 mmol/1 EDTA pH=7,0
NSEB-puffer 0,25 mol/1 nátrium-foszfát-puffer, pH=7,2 7% SDS 1 mmol/1 EDTA 1% BSA (tömeg/térfogat) χ Laemmli-puffer 200 mmol/1 TRIS, pH=6,8 8% SDS
0,4% brómfenolkék 40% glicerin
A példákban alkalmazott módszerek:
1. Klónozási eljárás
Az Escherichia coliban való klónozáshoz pUC18 vektort használunk.
A növény transzformálásához a génkonstrukciókat a pBinAR bináris vektorba klónozzuk [Höfgen és Willmitzer: Plánt Sci. 66, 221-230 (1990)].
2. Baktériumtörzsek
A pUC vektorokhoz és a pBinAR konstrukciókhoz az Escherichia coli DH5a törzset használjuk (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA).
A plazmidoknak a dohánynövényekbe való transzformálását az Agrobacterium tumefaciens C58C1 pGV2260 törzzsel végezzük [Debleare és munkatársai: Nucleic Acids Research 13, 4777-4788 (1985)].
3. Az Agrobacterium tumefaciens transzformálása
A DNS átvitelét közvetlen transzformációval végezzük, Höfgen és Willmitzer módszerét alkalmazva [Höfgen és Willmitzer: Nucleic Acids Research 16, 9877 (1988)]. A transzformált Agrobacteriumok plazmidDNS-ét Bimbóim és Doly módszerével izoláljuk [Bimbóim és Doly: Nucleic Acids Research 7, 1513-1523 (1979)], majd a megfelelő restrikciós enzimes hasítás után gélelektroforézissel elemezzük.
4. A dohány transzformálása
A megfelelő Agrobacterium tumefaciens-klón éjszakán át szaporított tenyészetét centrifugáljuk (6500/perc; 3 perc), majd a baktériumokat YEB közegben újra szuszpendáljuk. Egy dohány-steriltenyészet (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) dohányleveleit kis darabokra (körülbelül 1 cm2) vágjuk, majd egy baktériumszuszpenzióba áztatjuk. A levéldarabokat azután MS-közegbe tesszük (0,7% agar), majd 2 napig sötétben inkubáljuk. A levéldarabokat azután MS-közegbe tesszük (0,7% agar) a hajtás indukálásához, amely 1,6% glükózt, 1 mg/1 6-benzüaminopurint, 0,2 mg/1 naffilecetsavat, 500 mg/1 claforant és 50 mg/1 kanamicint tartalmaz. A közeget minden
7-10. napon cseréljük. A hajtás indukálódása után a levéldarabokat ugyanilyen táptalajt tartalmazó üvegedényekbe tesszük át. A formálódó hajtásokat levágjuk, majd 2% szacharózt és 250 mg/1 claforant tartalmazó MS-közegre tesszük, majd ezekből teljes növényeket regenerálunk.
5. DNS-fragmensek radioaktív jelzése
A DNS-fragmensek radioaktív jelölését DNS random primer kittel végezzük (Boehringer, Németország), a gyártó előírásai szerint.
HU 221 005 Bl
6. Northem-blot-elemzés
Standardeljárások alkalmazásával RNS-t izolálunk növények levélszövetéből. 50 pg RNS-t szétválasztunk (1,5% agaróz, 1 χ MEN-puffer, 16,6% formaldehid). A gélt futás után röviden mossuk vízben. Az RNS-t Hybond N nejlonmembránra visszük át (Amersham UK) 20xSSC-vel, biotolást alkalmazva. A membránra azután rásütjük az RNS-t (2 óra, csökkentett nyomás, 80 °C). A membránt 2 óra hosszat 68 °C-on NSEB-pufferben előhibridizáljuk, majd ezt követően éjszakán át hibridizáljuk a radioaktív próba jelenlétében, 68 °C-on, NSEB-pufferben.
7. Fehérjék izolálása levélszövetből és
Western-blot-elemzés
Fehérjék levélszövetből való izolálásához két, körülbelül 5 mm átmérőjű, tökéletesen kerek levélexplantumot vágunk ki dohánylevelekből, majd 10 μΐ 4 χ Laemmli-puffer plusz 5% β-merkaptoetanol összetételű oldatba tesszük egy Eppendorf-csőben. A kapott szuszpenziót röviden centrifugáljuk. A felülúszóból 10 μΐ-t közvetlenül a Höfer cég egy „MighTy Small” SDS-poliakrilamid géljére visszük (elválasztógél: 10% poliakrilamid; gyűjtőgél: 3,5% poliakrilamid), majd gélelektroforézissel választjuk el. A fehérjéket azután nitrocellulóz membránra visszük át, félszáraz elektroblot-módszerrel. A spenótból való szacharózhordozó transzgenikus dohánynövények kivonataiból való azonosítását egy „blotolási kimutató kit nyúl ellenanyagokhoz” kit felhasználásával végezzük (Amersham,
UK), a gyártó előírásai szerint. Primer ellenanyagként a
9E10 egér monoklonális ellenanyagot használjuk [Kolodziej és Young: Methods in Enzymology 194,
508-519 (1991)], ami közvetlenül az 1. ábrán D fragmensként jelzett myc epitóp ellen készült.
8. A növények fenntartása
Üvegházban: megvilágítási periódus 14 óra, 1300 lux,
25°C sötét periódus 10 óra 20 °C nedvesség 60%
Fitotronban: megvilágítási periódus 15 óra,
800 mEinstein/m1 2/mp 25 °C-on sötét periódus 9 óra 22 °C nedvesség 80%
Az alábbiakban példákkal illusztráljuk a találmányt.
1. példa
A p£l-S21 plazmid készítése és a plazmid bejuttatása a dohánynövények genomjába Egy olyan plazmid készítéséhez, amely alkalmas növénysejtek transzformálására, és amely egy szacharózhordozó túlexpresszióját biztosítja növénysejtek25 ben, először spenótból izoláljuk a szacharózhordozót kódoló cDNS-t. Erre a célra a pS21 ki ónt használjuk [Riesmeier és munkatársai: EMBO Journal 11, 4705-4713 (1992)], az alábbi oligonukleotidok felhasználásával :
(1) 5’-GAGACTGCAAGCCATGGCAGGAAGAAATATATAAAAAATGGTG-3’ (1. számú szekvencia) és (2) 5’-GAGACTGCAGTCAGTTGAGGTCTTCTTCGGAGATTAGTTTTTTGTTCATGACCACCCATGGACCC
ACCAATTTTAGC-3’ (2. számú szekvencia) egy körülbelül 1600 bázispár méretű, és a pS21 klón szekvenciájának 70-1644-es nukleotidjait tartalmazó DNS-fragmenst [Riesmeier és munkatársai: EMBO Journal 11, 4705-4713 (1992)] amplifikálunk PCR technológiával. Az 1-es oligonukleotiddal egy PstI és egy Noel hasítási helyet juttatunk be a kódolórégió 5’ végébe. A 2-es oligonukleotiddal egy 11 aminosavból álló szekvenciát [EQKLISEEDLNCOOH (3. számú szekvencia)] adunk a C-terminális kódolórégiójához, és emellett egy PstI hasítási helyet is beépítünk. Ez a szekvencia a cMyc génből származik, és a 9E10 egér monoklonális ellenanyag felismerési helyét képviseli [Kolodziej és Young: Methods in Enzymology 194, 508-519 (1991), kereskedelmi forgalomba hozza a Dianova, Hamburg].
A kapott PCR terméket PstI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd Pstl-gyel emésztett pUC vektorral ligáljuk. A keletkező plazmid neve p-S21-Myc8. Ebből a fragmensből egy, körülbelül 1660 bázispár méretű fragmenst izolálunk NcoI/PstI részleges emésztéssel.
Ez a fragmens tartalmazza PCR terméket, és ebbe van ligáivá az Ncol és PstI enzimekkel emésztett p35SDEΩ-OCS vektor.
A p35SDE-Q-OCS vektort az alábbiak szerint állítjuk elő:
A karfiolmozaik-vírus promoter régiójából egy 530 bázispár méretű EcoRI/Asp718 fragmenst [6909-7439-es nukleotidok; Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294 (1980)] izolálunk, majd EcoRI és Asp718 restrikciós enzimekkel emésztett pUC18 vektorba ligáljuk. A kapott plazmid jele p35S. Ezután egy, körülbelül 330 bázispár méretű fragmenst izolálunk az EcoRI/Asp718 promoter fragmensből, HincII és EcoRV endonukleázokkal végzett emésztéssel. Ezt a fragmenst azután a pS35 plazmidban levő 35S promoter Ncol hasítási helyét feltöltve klónozzuk a pS35 plazmidba. így egy olyan konstrukciót kapunk, amelyben két HincII/EcoR V-I fragmens van egymás után, fordított orientációban beépítve az Ncol hasítási helyre, az alábbi elrendezésben:
EcoRI---(NcoI)/(EcoRV)---330bp---(HincII)/(EcoRV)---330bp---(HincII)/(NcoI)---525bp---Asp718.
A kapott plazmid jelzése p35SDE. Az ebben a fragmensben levő, további két HincII/EcoRV fragmenst tartalmazó 35S promoter jelzése 35SDE.
Még további pUC plazmidot készítünk, amelynek struktúrája a 3. ábrán látható. A következő DNS-fragmenseket illesztjük be egy pUC18 vektor polilinkeré50 nek EcoRI és Hindlll hasítási helyére:
HU 221 005 Bl
1. A 35S promoter EcoRI/Asp718 fragmense 2. A dohánymozaik-vírus Ω transzlációs fokozójá[6909-7439-es nukleotidok; Franck és munkatársai: nak Asp718/Ncol fragmense (TMV-U1), az alábbi
Cell 21, 285-294 (1980)]; szekvenciával:
5’-GGTACCTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA CCATGG-3’ (4. számú szekvencia);
3. Egy polilinker az alábbi restrikciós hasítási helyekkel : NcoI/SacI/XhoI/Smal/BamHI/Xbal/Sall/Pstl/Sphl;
4. Egy terminációs szekvencia az oktopin szinte- 10 tázgénből (a pTiACH5 Ti plazmid T-DNS-ének
748-11 939-es nukleotidjai) [Gielen és munkatársai: EMBO Journal 8, 835-846 (1984)]. Ennek a plazmidnak a jelzése p35S-Q-OCS.
A p35S-Q-OCS plazmidot EcoRI/Asp&18 restrik- 15 ciós endonukleázzal emésztjük, ezzel eltávolítjuk a 35S promotert. A 35S promotert a 35SDE promoterrel helyettesítjük, amit a p35SDE plazmidból izolálunk EcoRI és Asp718 restrikciós enzimes emésztéssel.
A kapott plazmid jele p35SDE-Q-OCS.
Ezt a plazmidot a polilinker régiójában Ncol és Pstl restrikciós enzimekkel emésztjük. A hasítási helyekre a p-S21-Myc8 plazmidból Ncol és Pstl enzimekkel végzett részleges emésztéssel keletkező, és abból izolált, körülbelül 1600 bázispár méretű fragmenst ligáljuk, 25 amely tartalmazza az előzőekben ismertetett PCR terméket. így kapjuk a pQA7DE-S21-Myc8 plazmidot.
A plazmid az 1. ábrán látható.
A pQA7DE-S21-Myc8 plazmidból EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázokkal végzett emésztés- 30 sel izoláljuk a komplett expressziós kazettát, amely tartalmazza a 35SDE promotert, a transzlációs fokozószekvenciát, a spenótból származó szacharózhordozót kódoló kódolórégiót a c-Myc epitópot kódoló szekvenciával, valamint a terminációs szekvenciával együtt. 35
Ezt a szekvenciát azután az EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázokkal emésztett TCSAS vektorba ligáljuk (1994. augusztus 10-én DSM 9359 számon letétbe helyezve a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturennél, Braunschweig, Németország), amiből előzőleg az említett két restrikciós hasítási hely között levő expressziós kazettát EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel eltávolítottuk.
A kapott plazmid jelzése pG-S21, a 2. ábrán mutat- 45 juk be.
2. példa
Dohánynövények transzformálása a pYí-S21 plazmiddal
A pQ-S21 plazmidot használjuk a dohánynövények transzformálására, az Agrobacteriumokkzá indukált géntranszfert használva erre a célra.
A transzformáció eredményeképpen a spenótból származó szacharózhordozót kódoló transzkriptum kü- 55 lönböző mennyiségben mutatható ki a transzgenikus dohánynövényekben. A kimutatást Northem-blotelemzéssel végezzük. Ehhez az elemzéshez RNS-t izolálunk a transzgenikus és nem transzgenikus növényekből. Ebből az RNS-ből 50 pg-ot agarózgélen elválasz- 60 tünk, nejlonmembránra visszük át, majd a spenótból származó, radioaktív izotóppal jelzett cDNS-sel hibridizáltatjuk. Ezzel a Northem-blot-elemzéssel ki lehetett mutatni, hogy három transzformáns (5., 12. és 32.) közül két transzformáns (a 12. és a 32.) erősen expresszálja a spenótból származó szacharózhordozót, a harmadik (5. számú) transzformáns viszonylag gyengébben expresszálja a spenótból származó szacharózhordozót, és a nem transzformált dohánynövényekben nem mutatható ki a spenótból származó szacharózhordozót kódoló transzkriptum.
Ahhoz, hogy kimutassuk, hogy egy spenótból szár20 mazó szacharózhordozót kódoló transzkriptum a transzgenikus dohánynövényekben a szacharózhordozó szintézisét eredményezi, Westem-blot-elemzést végeztünk. Ebből a célból a növények levélszövetéből fehéijéket izoláltunk, majd nitrocellulóz membránra vittük át. A transzgenikus dohánynövényekben a spenótszacharóz-hordozó kimutatását olyan monoklonális ellenanyagokkal végezzük, amelyek felismerik a c-Myc gén epitópját, ami a pQ-S21 plazmid kódolórégiójának 3’ végén kódolódik.
Az ilyen Westem-blotokkal egy, körülbelül 48 kDa méretű fehérje mutatható ki specifikusan transzgenikus dohánynövények fehérjekivonataiból. Ez megfelel a spenótból származó szacharózhordozó várt molekulaméretének.
A spenót eredetű szacharózhordozó expressziójának következtében a pQ-S21-gyel transzformált dohánynövények a nem transzformált dohánynövényekkel összehasonlítva módosult virágzási tulajdonságokkal rendelkeznek. Különösen a 12-es és 32-es transzfor40 mánsoknál, amelyekben a spenóteredetű szacharózhordozó erősen expresszálódik, korai virágzás és a virágzás enyhén megnövekedett mértéke figyelhető meg.
A transzformált dohánynövények a nem transzformáit dohánynövényekkel összehasonlítva kevesebb levélalapot mutatnak az apikális merisztéma virágképződésre való indukálása előtt. Az 1. táblázatból látható, hogy a 128 napos, transzformált és nem transzformált dohánynövényeknek átlagosan hány levélalapja maradt meg a fitotronban az apikális merisztéma virágzásra 50 való indukálódása előtt.
1. táblázat
| Γ A transzformált dohánynövény | A levélalapok átlagos |
| sorszáma | száma |
| 5. | 17,8 |
| 12. | 18 |
| 32. | 17,3 |
| 1 Nem transzformált növények | 20,7 |
HU 221 005 Bl
A vad típusú növényekkel összehasonlítva a virágzatok képződéséhez a merisztéma korai indukciója miatt a bimbók és virágok korábban alakulnak ki.
Ezt a 4a. és 4b. ábrák is illusztrálják, amik a 12-es (4a. ábra) és a 32-es (4b. ábra) vonalfitotronban tartott transzformált dohánynövényeit mutatják, nem transzformáit dohánynövényekkel összehasonlítva. Azonos tenyésztési körülmények között a nem transzformált dohánynövényeknél a virágzás lényegesen később, átlagban 14 nappal később játszódik le.
Eltekintve a korábbi virágzástól, a transzformált nö5 vények több virágot hoznak a vad típusú növényekkel összehasonlítva. Ezt láthatjuk a 11. táblázatban.
11. táblázat
| A transzformált dohánynövény sorszáma | A levélalapok átlagos száma |
| 5. | 112 |
| 12. | 170 |
| 32. | 133 |
| Nem transzformált növények | 103 |
A megvizsgált növények körülbelül 128 naposak voltak, és fitotronban tartottuk őket.
Az előzőekben ismertetett eredményeket ismételt kísérletekkel megerősítettük, amelyekben a transzformált
32-es, 12-es, 5-ös és 1-es transzformált vonalakat használtuk. Az eredményeket az 5., 6. és 7. ábrán mutatjuk be.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányban 20 említett szekvenciákat.
A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BENYÚJTÓ:
(A) NÉV: Hoechst Schering AgrEvo GmbH (B) UTCA: Miraustr. 54 (C) VÁROS: Berlin (E) ORSZÁG: Németország (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Eljárás növények virágzási tulajdonságainak módosítására (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4 (v) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:
(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC KOMPATIBILIS (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MSDOS (D) PROGRAM: PATENTIN RELEASE #1.0, VERSION #1.30 (EPA) (vi) A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI: 25 (A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA:
PCT/EP95/04257
1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 42 bázispár (B) Típus: nukleotid (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: egyéb nukleinsav (A) Leírás: /desc=„oligonukleotid” (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia
GAGACTGCAG CCATGGCAGG AAGAAATATA TAAAAAATGG TG 42
2. számú szekvenciavázlat (ii) A molekula típusa: egyéb nukleinsav (i) A szekvencia jellemzői: (A) Leírás:/desc=„oligonukleotid” (A) Hossz: 76 bázispár (iii) Elméleti: igen (B) Típus: nukleotid (iv) Antiszensz: nem (C) Száltípus: egyszálú (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia (D) Topológia: lineáris
GAGACTGCAG TCAGTTGAGG TCTTCTTCGG AGATTAGTTT TTGTTCATGA CCACCCATGG 60 ACCCACCAAT TTTAGC 76
3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 11 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú
Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu 1 5 (D) Topológia: lineáris 55 (ii) A molekula típusa: peptid (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
Asp Leu Asn 10
HU 221 005 Bl
4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 73 bázispár (B) Típus: nukleotid (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: egyéb nukleinsav (A) Leírás: /desc=„oligonukleotid” (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia
GGTACCTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA ATTACTATTT 60 ACAATTACCA TGG 73
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás szacharózhordozó biológiai aktivitással rendelkező fehérjéket kódoló DNS-molekulák alkalma- 15 zására növények virágzási tulajdonságainak befolyásolása céljából.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított virágzási tulajdonság a megnövekedett szacharózhordozó-aktivitáson alapul.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a virágzási tulajdonságok módosítása korábbi virágzást és virágképződést eredményez.
- 4. A 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a virágzási tulajdonságok 25 módosítása több virág képződését eredményezi.
- 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szacharózhordozó-aktivitás növelését úgy érjük el, hogy szacharózhordozót kódoló DNS-molekulákat juttatunk be a növényekbe és exp- 30 resszáljuk őket.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula egy növényi szacharózhordozót kódol.
- 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 35 azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula egy gombaeredetű szacharózhordozót kódol.
- 8. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula egy baktériumeredetű szacharózhordozót kódol.
- 9. Eljárás egy növény virágzási tulajdonságainak módosítására, azzal jellemezve, hogy növeljük a növényben a szacharózhordozó-aktivitást.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szacharózhordozó-aktivitást úgy növeljük, hogy a növényekbe egy szacharózhordozót kódoló DNS-molekulákat juttatunk be, és expresszáljuk őket.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezze ve, hogy a DNS-molekula egy növényi szacharózhordozót kódol.
- 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula egy gombaeredetű szacharózhordozót kódol.
- 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula egy baktériumeredetű szacharózhordozót kódol.
- 14. A vad típussal összehasonlítva módosított virágzási tulajdonságokkal rendelkező transzgenikus növény, amelyben a vad típussal összehasonlítva megnőtt a szacharózhordozó-aktivitás, annak következtében, hogy egy baktérium vagy gombaeredetű szacharózhordozót kódoló DNS-molekula integrálódott és expresszálódik.
- 15. A 14. igénypont szerinti transzgenikus növény, amelyben a virágzási tulajdonságok módosítása korábbi virágképződést és virágzást jelent.
- 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti transzgenikus növény, amelyben a virágzási tulajdonságok módosítása a vad típussal összehasonlítva több virág kialakulá40 sát jelenti.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4439748A DE4439748A1 (de) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen |
| PCT/EP1995/004257 WO1996013595A1 (de) | 1994-10-31 | 1995-10-30 | Verfahren zur veränderung des blühverhaltens bei pflanzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT77471A HUT77471A (hu) | 1998-05-28 |
| HU221005B1 true HU221005B1 (hu) | 2002-07-29 |
Family
ID=6532697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9800239A HU221005B1 (hu) | 1994-10-31 | 1995-10-30 | Eljárás növények virágzási tulajdonságainak befolyásolására |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6025544A (hu) |
| EP (1) | EP0789773A1 (hu) |
| JP (1) | JPH10507920A (hu) |
| AU (1) | AU701718B2 (hu) |
| CA (1) | CA2204023A1 (hu) |
| DE (1) | DE4439748A1 (hu) |
| HU (1) | HU221005B1 (hu) |
| WO (1) | WO1996013595A1 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997025433A1 (en) * | 1996-01-09 | 1997-07-17 | Eidg. Technische Hochschule Zürich Ethz | Regulation of flowering in plants |
| WO1999053068A2 (en) | 1998-04-09 | 1999-10-21 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Sucrose transporters from plants |
| DE19857654A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Max Planck Gesellschaft | Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine |
| EP1268831A2 (de) * | 2000-03-31 | 2003-01-02 | Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung | Verfahren zur herstellung von leguminosen mit erhöhtem proteingehalt bei verlängerter samenfüllungsdauer |
| JP2002153283A (ja) * | 2000-11-24 | 2002-05-28 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物の開花を誘導する遺伝子Ｈｄ３ａおよびその利用 |
| CN103880935B (zh) * | 2012-12-19 | 2017-02-08 | 中国科学院植物研究所 | 蔗糖转运蛋白AtSUT2在培育高产转基因植物中的应用 |
| CN105624171B (zh) * | 2015-06-08 | 2020-12-15 | 南京农业大学 | 梨蔗糖转运蛋白基因PbSUT2及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4220759A1 (de) * | 1992-06-24 | 1994-01-05 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen für Oligosaccharid-Transporter, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend einen Transporter sowie Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen zur Identifikation des Transporteers |
| DE4343527A1 (de) * | 1993-12-16 | 1995-06-22 | Schering Ag | Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit potentieller herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung mittels pflanzlicher Transporterproteine, Verwendung der Transporterproteine sowie Substanzen mit herbizider und wachstumsregulatorischer Wirkung |
-
1994
- 1994-10-31 DE DE4439748A patent/DE4439748A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-10-30 HU HU9800239A patent/HU221005B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-10-30 WO PCT/EP1995/004257 patent/WO1996013595A1/de not_active Application Discontinuation
- 1995-10-30 JP JP8514322A patent/JPH10507920A/ja active Pending
- 1995-10-30 EP EP95938378A patent/EP0789773A1/de not_active Withdrawn
- 1995-10-30 CA CA002204023A patent/CA2204023A1/en not_active Abandoned
- 1995-10-30 AU AU39794/95A patent/AU701718B2/en not_active Ceased
- 1995-10-30 US US08/836,337 patent/US6025544A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10507920A (ja) | 1998-08-04 |
| US6025544A (en) | 2000-02-15 |
| DE4439748A1 (de) | 1996-05-02 |
| EP0789773A1 (de) | 1997-08-20 |
| CA2204023A1 (en) | 1996-05-09 |
| WO1996013595A1 (de) | 1996-05-09 |
| AU3979495A (en) | 1996-05-23 |
| AU701718B2 (en) | 1999-02-04 |
| HUT77471A (hu) | 1998-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sundberg et al. | ALBINO3, an Arabidopsis nuclear gene essential for chloroplast differentiation, encodes a chloroplast protein that shows homology to proteins present in bacterial membranes and yeast mitochondria. | |
| Smigocki | Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene | |
| US5965791A (en) | Vector for introducing a gene into a plant, and methods for producing transgenic plants and multitudinously introducing genes into a plant using the vector | |
| US5436394A (en) | Plasmid for the preparation of transgenic plants with a change in habit and yield | |
| EP1859044B1 (en) | Resistance against parasitic weeds | |
| CN107722125B (zh) | 一种人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用 | |
| US7732678B1 (en) | Cotton fiber transcriptional factors | |
| WO1992012249A1 (en) | Control of fruit ripening and senescence in plants | |
| JP3183407B2 (ja) | エチレンに対する修正された応答をもつ植物 | |
| TWI484907B (zh) | 使用經修飾的啟動子之植物老化操縱技術 | |
| CA2205849A1 (en) | Transgenic plants with improved biomass production | |
| HU221005B1 (hu) | Eljárás növények virágzási tulajdonságainak befolyásolására | |
| US5917127A (en) | Plasmids useful for and methods of preparing transgenic plants with modifications of habit and yield | |
| CA2258571A1 (en) | Plant sterol reductases and uses thereof | |
| EP2314702B1 (en) | Plant having resistance to low-temperature stress and method of production thereof | |
| US6630616B1 (en) | Arabidopsis MPC1 gene and methods for controlling flowering time | |
| EP1263971A1 (de) | Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels | |
| KR101987663B1 (ko) | 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법 | |
| AU733324B2 (en) | Genetic control of polar auxin transport in plants and manipulation of plant growth, architecture and morphogenesis | |
| CA2354987A1 (en) | Means and methods for influencing the flowering behaviour of plants | |
| CA2380955C (en) | Plants having modified response to ethylene | |
| JP2004016201A (ja) | 花芽形成抑制遺伝子及び早期開花性が付与された植物 | |
| JP2002142766A (ja) | 酸性フォスファターゼ遺伝子プロモーター | |
| WO1999023200A2 (en) | The uridine diphosphate glucose dehydrogenase gene and its role in altering plant growth and plant characteristics | |
| JP2001258558A (ja) | 植物プロモーター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |