EP1263971A1 - Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels - Google Patents
Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechselsInfo
- Publication number
- EP1263971A1 EP1263971A1 EP01907515A EP01907515A EP1263971A1 EP 1263971 A1 EP1263971 A1 EP 1263971A1 EP 01907515 A EP01907515 A EP 01907515A EP 01907515 A EP01907515 A EP 01907515A EP 1263971 A1 EP1263971 A1 EP 1263971A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- plant
- nucleic acid
- protein
- acid molecule
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims abstract description 37
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 title claims abstract description 37
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 108010047540 sucrose isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 73
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 91
- 108010025855 palatinase Proteins 0.000 claims description 53
- 241000556426 Erwinia rhapontici Species 0.000 claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 21
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 19
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 13
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 12
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000001573 invertase Substances 0.000 claims description 12
- 102000005455 Monosaccharide Transport Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010006769 Monosaccharide Transport Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims description 9
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 claims description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 229940118465 Isomerase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 239000003394 isomerase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 178
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 64
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 47
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 44
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 31
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- PVXPPJIGRGXGCY-DJHAAKORSA-N 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-alpha-D-fructofuranose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](O)(CO)O1 PVXPPJIGRGXGCY-DJHAAKORSA-N 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 19
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 19
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 15
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 8
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 7
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- SVBWNHOBPFJIRU-UHFFFAOYSA-N 1-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-fructose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1(O)C(O)C(O)C(O)CO1 SVBWNHOBPFJIRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 6
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 5
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 5
- 101710196632 LexA repressor Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 241001622809 Serratia plymuthica Species 0.000 description 5
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- NMXLJRHBJVMYPD-IPFGBZKGSA-N trehalulose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(O)CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMXLJRHBJVMYPD-IPFGBZKGSA-N 0.000 description 5
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 4
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 241000083686 [Pseudomonas] mesoacidophila Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 3
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 3
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 2
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 2
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 2
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940088530 claforan Drugs 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMKJJVNCRCSYDT-UHFFFAOYSA-N 1-benzylpurin-2-amine Chemical compound NC1=NC2=NC=NC2=CN1CC1=CC=CC=C1 NMKJJVNCRCSYDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150114578 APG gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000207875 Antirrhinum Species 0.000 description 1
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- RWCLSUOSKWTXLA-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RWCLSUOSKWTXLA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N Asn-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- QCLHLXDWRKOHRR-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QCLHLXDWRKOHRR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000018 Callose Polymers 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 101100406840 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) palF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- QVXWAFZDWRLXTI-NWLDYVSISA-N Glu-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QVXWAFZDWRLXTI-NWLDYVSISA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- UWSMZKRTOZEGDD-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UWSMZKRTOZEGDD-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- 102000005385 Intramolecular Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010031311 Intramolecular Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710132674 Monosaccharide transporter Proteins 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000586779 Protaminobacter Species 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 description 1
- 240000005481 Salvia hispanica Species 0.000 description 1
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 description 1
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100020617 Solanum lycopersicum LAT52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100083698 Solanum lycopersicum LAT56 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 101150085122 TA-29 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108050004197 Trp repressor Proteins 0.000 description 1
- BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N Val-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008848 allosteric regulation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 101150082190 chiB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 101150106875 malE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 101150041450 palH gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 101150114322 ro gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
Definitions
- tissue- or cell-specific promoters are also preferably used for antisense or sense constructs in order to restrict changes in the carbohydrate metabolism with the aim of undersupplying the pollen to the relevant tissues.
- the present invention thus relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising a) regulatory sequences of a promoter active in anthers, in tapetum and / or in pollen; b) operatively linked to a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase; and c) operatively linked regulatory sequences which can serve as transcription, termination and or polyadenylation signals in plant cells.
- the DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase is selected from the group consisting of a) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which has the sequence shown in SEQ ID NO. 6 encode the given amino acid sequence or fragments thereof, b) DNA sequences which contain the sequence shown in SEQ ID No.
- the invention further relates to vectors and microorganisms which contain nucleic acid molecules according to the invention and whose use enables the production of male-sterile plants.
- the vectors are in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors commonly used in genetic engineering.
- the microorganisms are primarily bacteria, viruses, fungi, yeasts and algae.
- the invention further relates to a method for producing male-sterile plants, comprising the following steps: a) Production of a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: regulatory sequences of one in anthers. promoters active in the tapetum and / or pollen; operatively linked to it a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase; and operatively linked to regulatory sequences that can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells; b) transfer of the nucleic acid molecule from a) to plant cells and c) regeneration of transgenic plants.
- a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: regulatory sequences of one in anthers. promoters active in the tapetum and / or pollen; operatively linked to it a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase; and operatively linked to regulatory sequences
- palatinase DNA sequences which code for an enzyme with high affinity for palatinose are preferably used. Accordingly, those trehalulase DNA sequences are preferably used which code for an enzyme with high affinity for trehalulose.
- LexA repressor binds hybrids to the LexA operator region and thereby prevents the transcription of the sucrose isomerase gene.
- LexA operator DNA molecules can be obtained, for example, by the synthesis of DNA fragments, which contain LexA operator sequences well known to those skilled in the literature, for example by Garriga et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 236: 125.
- DNA sequences which code for the LexA repressor can be obtained, for example, by synthesis of such DNA molecules or by DNA cloning techniques as are known to the person skilled in the art and are described, for example, by Garriga et al., Vide supra.
- sequences coding for the LexA repressor can be taken, for example, from plasmid pRB500 (ATTC 67758).
- Fragment A contains the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). It contains a fragment which comprises nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV (Franck (1980) Cell 21: 285.
- Fragment B contains nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Keil et al., Supra ), which is fused via a linker with the sequence ACC GAA TTG GG to the sucrose isomerase gene from Erwinia rhapontici, which comprises nucleotides 109-1803, thereby making a signal peptide necessary for the uptake of proteins into the endoplasmic reticulum (ER) vegetable protein N-terminally fused to the sucrose isomerase sequence.
- CaMV Cauliflower Mosaic Virus
- Termination signal includes the 3 'end of the polyadenylation site of the octopine synthase gene.
- the plasmid pTA29-cwIso contains three fragments A, B and C, which were cloned into the sites for restriction enzymes of the polylinker of pUC18 (see Figure 3).
- Fragment A contains the TA29 promoter from Nicotiana tabacum.
- the fragment contains the nucleotides -1477 to +57 relative to the transcription initiation site of the TA29 gene (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 3403). It was generated by PCR from genomic DNA from Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplified.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, worin dem Pollen Saccharose entzogen wird. Besonders betrifft die Erfindung die Expression eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzenzellen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, und worin die DNA-Sequenz mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors operativ verbunden ist, so dass die DNA-Sequenz in Antheren oder Pollen exprimiert wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die das erfindungsgemässe Nukleinsäuremolekül enthalten und aufgrund der Expression der DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, männlich steril sind, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen.
Description
Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, worin sich entwickelnden Pollen Kohlenhydrate entzogen wird. Besonders betrifft die Erfindung die Expression eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzenzellen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle. die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, und worin die DNA-Sequenz mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors operativ verbunden ist, so dass die DNA-Sequenz in Antheren oder Pollen exprimiert wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Nukleinsauremolekul enthalten und aufgrund der Expression der DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, männlich steril sind, sowie Ernteprodukte und Vermehrungs- material der transgenen Pflanzen.
Pflanzen besitzen als Eukaryonten zwei oder mehr Kopien ihrer genetischen Information pro Zelle. Jedes Gen wird in der Regel durch zwei Allele, die im homozygoten Zustand identisch bzw. im heterozygoten unterschiedlich sein können, repräsentiert. Bei der Kreuzung von zwei ausgewählten Inzuchtlinien sind die in der ersten Generation gebildeten FI -Hybride, also heterozygote Individuen, häufig größer, robuster und auch ertragreicher als die homozygoten Eltern, vermutlich weil ihre beiden allelischen Genprodukte a) mit geringerer Wahrscheinlichkeit inaktiviert werden oder b) eine größere Reaktionsbreite aufweisen. Dieser als Heterosis oder Hybridvitalität bezeichnete Effekt wird bereits seit vielen Jahrzehnten von Pflanzenzüchtern zur Produktion von Hybrid-Sorten genutzt.
Die Züchtung solcher Hybridlinien erfolgt unter Nutzung der cytoplasmatischen männlichen Sterilität (CMS) oder der Selbst-Inkompatibilität (SI), den beiden wichtigsten genetischen Systemen zur Verhinderung der Selbstbefruchtung.
Die Möglichkeit, ein neues Gen mittels gentechnischer Methoden in das Genom einer Pflanzenzelle einzubauen, hat in den letzten Jahren eine dritte Möglichkeit zur Erzeugung von Hybridpflanzen eröffnet, nämlich die Nutzung eines synthetisch männlich-sterilen Systems.
Gentechnisch erzeugte männliche Sterilität wurde bereits durch verschiedene Strategien realisiert. Zu diesen gehören u.a. die Expression einer Ribonuklease (RNase) aus Bacillus amyloliquefaciens im Tapetum (das Tapetum ist die Zellschicht, welche die Pollenzellen während ihrer Entwicklung mit Nährstoffen versorgt) von Tabakantheren (Mariani C. et al. (1990) Nature 347:737-741 ; Mariani C. et al. (1992) Nature 357:384-387), die Überexpression des ro/C-Gens aus Agrobacterium rhizogenes in Tabak (Schmülling T. et al. (1988) EMBO J. 7:2621- 2629; Schmülling T. et al. (1993) Mol. Gen Genet. 237:385-394) und in Kartoffel (Fladung M. (1990) Plant Breeding 104:295-305) sowie die Expression einer Glucanase, durch deren Aktivität die Kallose-Zellwand der Microsporocyte frühzeitig zerstört wird (Worrall D. (1992) Plant Cell 4:759-771). Weitere Ansätze zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen stehen in Zusammenhang mit der Veränderung der Pigmentzusammensetzung der Blüte auf der Grundlage der Isolierung und Manipulation der an der Flavonoidbiosynthese beteiligten Gene. Dabei wird die Inhibition eines bestimmten Schritts der Flavonoidsynthese in der Regel durch die Antisense-Technik oder die Expression zusätzlicher Sense-Konstrukte erreicht (siehe z.B. van der Krol A.R. et al. (1988) Nature 333:866-869; Napoli C. (1990) Plant Cell 2:279-289; van der Meer I.M. et al. (1992) Plant Cell 4:253-262; Taylor L.B. and
- _>
Jorgenson R. (1992) J. Heredity 83: 11-17). Diese Arbeiten, von denen die meisten die trans-Inaktivierung der Chalkonsynthase betreffen, bestätigten die Vermutung, dass Flavonoide nicht nur die Blütenfarbe mitbestimmen, sondern auch eine essentielle Rolle in der Antheren- und Pollenentwicklung spielen.
Bei einem weiteren Ansatz zur Erzeugung männlicher Sterilität wird ein extern appliziertes Proherbizid durch das eingeführte Transgen in ein Herbizid umgewandelt. So fuhrt bei transgenen Tabakpflanzen, welche das αrgE-Gen aus E. coli unter der Kontrolle des TA29-Promotors exprimieren, die Applikation der nicht- toxischen Substanz N- Acetyl-L-phosphinotricin während der Pollenentwicklung zu männlicher Sterilität (Kriete et al. (1996) Plant J. 9:809-818). Durch die Aktivität des αrgE-Gens wird das nicht-toxische Proherbizid deacetyliert und in das cytotoxische L-Phosphinotricin umgewandelt.
Handelt es sich bei der erzeugten Hybridpflanze um eine Nutzpflanze, deren Samen, Früchte oder Blüten, also generative Organe, geerntet werden sollen, muss zusätzlich ein Restorer-System eingefügt werden, damit die FI -Pflanze wieder männlich fertil ist. Im Fall der oben erwähnten Expression einer Ribonuklease führt die Aktivität der Ribonuklease zur Zerstörung der Funktion des Tapetums mit der Konsequenz, dass der Pollen nicht mehr lebensfähig ist und männlich sterile Pflanzen entstehen. In diesem Fall wurde ein Restorer-System entwickelt, das auf der Expression eines Ribonuklease-Inhibitor-Gens basiert, welches aus dem gleichen Bakterium (B. amyloliquefaciens), das die Ribonuklease selbst exprimiert, isoliert wurde.
F 1 -Hybridlinien kommt aber nicht nur wegen ihrer erhöhten Vitalität und Ertragsleistung eine besondere Bedeutung zu. Die Saatzuchtindustrie hat zusätzlich dadurch eine große kommerzielle Bedeutung erlangt, dass FI -Hybridsorten vom Landwirt nicht weiter vermehrt werden können, da in der F2-Generation eine Aufspaltung der
positiven Eigenschaften erfolgt und Pflanzen, die aus dem Samen von FI -Hybriden entstehen eine viel geringere Widerstands- und Leistungskraft zeigen als die Fl- Hybride. Der Landwirt muss somit für jede Aussaat beim Saatguthersteller neues Saatgut kaufen.
Obwohl an der Erzeugung von gentechnisch hergestellten Hybridlinien mit verbesserten agronomischen Eigenschaften und geringerem Arbeitsaufwand (da die mechanische Kastration entfallt) intensiv geforscht wird, führen die bisher zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen zur Verfugung stehenden Verfahren jedoch in vielen Fällen nicht zu voll befriedigenden Ergebnissen. Darüber hinaus werden häufig Pflanzen mit einer erheblich gesteigerten Empfindlichkeit gegenüber Phytopathogenen erhalten, was ihre praktische Handhabung in einem hohen Maße erschwert. Es besteht somit ein starkes Bedürfnis nach weiteren Verfahren zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen, welche die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neue Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung und damit zur Herstellung männlich steriler Pflanzen sowie rekombinante DNA-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die zur Manipulation der Pollenentwicklung und hier insbesondere zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen eingesetzt werden kann.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausfuhrungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass sich Gene, deren Expression in den Antheren zu einer Veränderung des Saccharosestoffwechsels führt und insbesondere bewirkt, dass sich entwickelnden Pollen Saccharose und andere
Kohlenhydrate entzogen werden, für die Erzeugung männlich steriler Pflanzen eignen. Besonders nützlich sind dabei DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren.
Proteine mit Saccharoseisomerase- Aktivität katalysieren die Isomerisierung des Disaccharids Saccharose zu anderen Disacchariden. Dabei wird die zwischen den beiden Monosaccharideinheiten der Saccharose bestehende αl— . ß2-g_ykosidische Bindung, nämlich die glykosidische Bindung zwischen Glucose und Fructose in eine andere glykosidische Bindung zwischen zwei Monosaccharideinheiten überfuhrt. Insbesondere katalysieren Saccharoseisomerasen, auch Saccharosemutasen genannte, die Umlagerung in eine αl— . 6-Bindung oder/ und eine αl— . αl -Bindung. Dabei entsteht bei Isomerisierung zu einer αl— . 6-Bindung das Disaccharid Palatinose, während bei der Umlagerung zu einer αl— κxl -Bindung das Disaccharid Trehalulose entsteht.
Beispiele für Organismen, deren Zellen ein Protein mit Saccharoseisomerase- Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten, sind insbesondere Mikroorganismen der Gattungen Protaminobacter, Erwinia. Serratia. Leuconostoc. Pseudomonas, Agrobacterium, Klebsieila und Enterobacter. Insbesondere sind hier folgende Beispiele für solche Mikroorganismen zu nennen: Protaminobacter rubrum (CBS 547, 77). Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 521f (ATCC 10830a), Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 bzw. FERM BP 3619), Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397 bzw. FERM BP 3620), Klebsieila Subspezies und Enterobacter spezies.
Es wurde jetzt überraschend beobachtet, dass transgene Pflanzen, in deren Antheren aufgrund der Expression gentechnisch eingeführter Saccharoseisomerase-DNA-
Sequenzen Saccharose in Palatinose überfuhrt wird, diese Expression von Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen zu einem männlich sterilen Phänotyp führt.
Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird derzeit folgende Erklärung für das jetzt beobachtete Phänomen angenommen. Sich entwickelnde Pollen werden durch spezialisierte Zellen der Antheren mit Assimilaten versorgt. Kohlenhydrate werden in Form des Disaccharids Saccharose in den Apoplasten transportiert. Zur Aufnahme der Zucker sekretieren die Pollen extrazelluläre Invertasen, die dafür sorgen, dass die Hexosen Glucose und Fructose entstehen. Diese Monosaccharide werden durch die verfügbaren Hexosetransporter aufgenommen und metabolisiert. Durch Expression einer Saccharoseisomerase in den Antheren entsteht aus Saccharose u.a. Palatinose. Das Disaccharid Palatinose kann allerdings nur von entsprechenden Hydrolasen, nicht aber durch die oben erwähnten Invertasen gespalten werden. Dies führt dazu, dass die Pollen sich nicht entwickeln können, mit der Konsequenz der männlichen Sterilität.
Dieser Effekt kann auch durch andere Maßnahmen erreicht werden, die in einer Veränderung des Saccharosestoffwechsels, insbesondere einem Entzug von Saccharose und verwertbaren Hexosen. und somit in einer Unterversorgung der Pollen mit Kohlenhydraten resultieren. So lässt sich die Pollenentwicklung z.B. durch Hemmung von Invertasen, Hexosetransportern und Hexokinasen stören, was zum männlich sterilen Phänotyp der mit entsprechenden Nukleinsäuremolekülen transformierten Pflanzen führt. Die Entwicklung funktionsfähiger Pollen kann auch dadurch verhindert werden, dass in den Antheren osmotisch wirksame Substanzen produziert werden bzw. dort akkumulieren, was zur Austrocknung sich entwickelnder Pollen und somit zum männlich sterilen Phänotyp führt.
In den meisten Pflanzen wird die Kohlenstoffversorgung sich bildender Pollen durch Saccharose, die in photosynthetisch aktiven Blättern gebildet und in den Leitbahnen des Phloems transportiert wurde, gedeckt. Die Saccharose wird von Tapetumzellen in den Apoplasten sezerniert, durch apoplastische Invertasen zu Glukose und Fruktose hydrolysiert und mittels Hexosetransporter in die Pollen aufgenommen. Im Cytosol der Pollen werden die Hexosen mittels Hexokinasen phosphoryliert und somit dem Stoffwechsel zur Verfügung gestellt. Die Aufnahme der Hexosen erfolgt zusammen mit Protonen, die mittels ATPasen in den Apoplasten gepumpt wurden. Zur Unterbrechung der Kohlenhydratsversorgung der sich entwickelnden Pollen sind daher wie oben erwähnt verschiedene Ansätze, welche die Aufnahme und Verwertung der Monosaccharide verhindern, möglich.
Die Beobachtung, dass die Pollenentwicklung durch Einflussnahme auf den Saccharosestoffwechsel und hier insbesondere den Entzug verwertbarer
Monosaccharide wirksam gehemmt werden kann, lässt sich in idealer Weise für die Erzeugung männlich steriler Nutzpflanzen einsetzen. Grundvoraussetzung für die Erzeugung solcher männlich steriler Nutzpflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten.
Eine weitere Voraussetzung für die Herstellung von Pflanzen, die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, in ihren Antheren, ihrem Tapetum bzw. ihren Pollen exprimieren und aufgrund dieser spezifischen Expression männlich steril sind, besteht darin, dass entsprechende DNA-Sequenzen zur Verfügung stehen.
Solche Sequenzen aus Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Enterobacter species SZ 62 und Pseudomonas mesoacidophila MX-45 sind in PCT/EP 95/00165 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen, sowohl hinsichtlich der offenbarten Sequenzen selbst, als auch im Hinblick auf die Auffindung und Charakterisierung dieser und weiterer Saccharoseisomerase kodierender Sequenzen aus anderen Quellen.
Weitere Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen kann der Fachmann der einschlägigen Literatur und den Gendatenbanken unter Verwendung geeigneter
Suchprofile und Computerprogramme für das Screening nach homologen Sequenzen bzw. für Sequenzvergleiche entnehmen.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere Saccharoseisomerase kodierende DNA- Sequenzen aus anderen Organismen mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann bspw. geeignete Hybridisierungssonden von den bekannten Saccharoseisomerase-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/ oder genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, aus dem ein neues Saccharoseisomerase-Gen isoliert werden soll, einsetzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs- und Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio- oder gentechnologischen Labor wohl bekannt und etabliert sind (siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Der Fachmann kann natürlich auch anhand bekannter Sequenzen geeignete Oligonukleotidprimer für PCR-Amplifikationen von Saccharoseisomerase-Sequenzen synthetisieren und einsetzen.
Gleiches gilt für andere Maßnahmen, die in einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten und insbesondere in einem Entzug verwertbarer Monosaccharide und damit männlich sterilen Pflanzen resultieren. Auch hier sind dem Fachmann die diversen Angriffspunkte wie Invertasen, Hexosetransporter und Hexokinasen aus der Literatur wohl bekannt, weshalb er in der Lage ist, die entsprechenden Proteine bspw. durch Übertragung von Antisense- oder Sense- bzw. Cosuppressionskonstrukten wirksam zu hemmen und so die Verwertung von Saccharose in den Antheren zu unterbrechen.
Als Targets sind hier, wie oben bereits erwähnt, zu nennen:
Zellwandgebundene Invertasen: Hier sind den einschlägigen Datenbanken und Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA- Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann mittels Routineverfahren ermöglichen, geeignete Konstrukte für die Hemmung der zellwandgebundenen Invertase zu erzeugen und auf Pflanzenzellen zu übertragen. Beispiele für geeignete Sequenzen sind: Arabidopsis (Schwebel-Dugue et al. (1994) Plant Physiol. 104, 809-810), Karotte (Ramloch- Lorenz et al. (1993) Plant J. 4, 545-554), Tabak, (Greiner et al. (1995) Plant Physiol. 108, 825-826), Tomate (Ohyama et al. (1998) Genes Genet. Syst. 73, 149-157), Vicia faba (Accession No. Z35163), Pisum sativum (Accession No. Z83339), Beta vulgaris (Accession No. X81795). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Invertasen in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Neben der Hemmung durch Antisense- bzw. Sensekonstrukte kann die Invertase- Aktivität durch Expression von Invertaseinhibitoren unterdrückt werden. Ein Beispiel ist der Invertaseinhibitor aus Tabak (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742). Überexpression eines Invertaseinhibitors in transgenen Pflanzen führte zur Hemmung der endogenen Invertaseaktivität in Kartoffelknollen (Greiner et al. (1999) Nat. BioTech. 17, 708-71 1).
Ein weiteres Target stellen Hexosetransporter (Monosaccharidtransporter) dar. Auch hier sind den Datenbanken und Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben, Konstrukte zur Hemmung Pollen-exprimierter Hexosetransporter zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Petunie (Ylstra et al. (1998) Plant Physiol. 118, 297- 304), Arabidopsis (Truernit et al. (1999) Plant J. 17, 191-201), Tabak (Sauer und Stadler (1993) Plant J. 4. 601-610), Medicago sativa (Acc. No.: AJ248339), Ricinus cornmunis (Acc. No.: L08191). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Hexosetransporter in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist. Hier ist anzumerken, dass die Kohlenhydrate die für die Versorgung des wachsenden Pollenschlauchs bei Befruchtung notwendig sind, ebenfalls über einen Hexosetransporter aufgenommen werden müssen. Dies bedeutet, dass die Hemmung der Transporter sowohl die Pollenbildung als auch die Vitalität der Pollen behindert.
Weiter kann eine Unterversorgung der Pollen mit Kohlenhydraten durch Hemmung von Protonen-ATPasen erreicht werden. Auch hier sind den Datenbanken und
Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben. Konstrukte zur Hemmung der plasmamembran- gebundenen Protonen- ATPase zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen
sind: Vicia faba (Nakajima et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36, 919-924), Kartoffel (Harms et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26, 979-988), Reis (Ookura et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35, 1251-1256). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der plasmamembrangebundenen Protonen-ATPase in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Ansatzpunkt sind die oben erwähnten Hexokinasen. Hier gilt das gleiche wie für die anderen Targets, den Datenbanken und Veröffentlichungen sind eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben. Konstrukte zur Hemmung der Hexokinase zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Spinat (Wiese et al. (1999) FEBS Lett. 461, 13-18), Kartoffel (Veramendi et al. (1999) Plant Physiol. 121-134), Brassica napus (Accession No. AI352726), Capsicum annum (Accession No. AA840716), Arabidopsis (Acc. No.: U28215), weitere Sequenzen sind durch Homologiever- gleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Hexokinase in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Neben Sense- und Antisensekonstrukten könnten auch Inhibitoren der entsprechenden Proteine eingesetzt werden. Beispiele hierfür wären die Überexpression von Invertaseinhibitoren (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742) bzw. von Antikörper, die gegen bestimmte Proteine gerichtet sind. Beispiele für die erfolgreiche Expression von Antikörpern in Pflanzen sind in Whitelam und Cockburn (Trends in Plant Science (1996), 8, 268-272) zusammengefasst, weitere Beispiele sind der Fachliteratur zu entnehmen.
Weitere Ansätze liegen in der Kontrolle der Saccharoseisomerase-Aktivität. Die Saccharoseisomerase-Aktivität führt, wie oben beschrieben, zur Bildung von Palatinose, was zu einer Unterversorgung der betroffenen Zellen mit Kohlenhydraten
führt. Um Wachstumseinbussen zu vermeiden, wird die Saccharoseisomerase demzufolge bevorzugt zellspezifisch in den Zielzellen ausgeprägt werden. Alternativ kann die Aktivität der Saccharoseisomerase durch Expression von Inhibitoren kontrolliert werden. Für mit der Saccharoseisomerase vergleichbare Enzyme sind in der Natur Inhibitoren entstanden. Ein Beispiel wurde bereits oben erwähnt, die
Invertase-Inhibitoren. Weitere Beispiele sind: Proteinase-Inhibitoren (z.B. in Gruden et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34, 317-323), Polygalacturonase-Inhibitoren (z.B. in Mahalingam et al. (1999) Plant Microb. Interact. 12, 490-498) und Amylase- Inhibitoren (z.B. in Grossi et al. (1997) Planta 203, 295-303). Alle diese Inhibitoren binden das Zielprotein und unterbinden dessen katalytische Aktivität. Weiterhin könnte die Saccharoseisomerase durch Antikörper kontrolliert werden, welche die Isomerase binden und damit deren Aktivität, da wo erwünscht, ausschalten.
Weiter bedarf es zur Ausführung der vorliegenden Erfindung lediglich geeigneter regulatorischer Sequenzen, die die Expression einer operativ verknüpfter
Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen in den Antheren, im Tapetum und/oder in den Pollen der transformierten Pflanzen exprimieren. Auch hier kann der Fachmann geeignete Sequenzen problemlos dem Stand der Technik entnehmen. Einige für die Antheren- bzw. Pollen-spezifische Expression von kodierenden Sequenzen besonders geeignete Promotorsequenzen werden weiter unter beschrieben.
Diese gewebe- bzw. zellspezifischen Promotoren werden auch bevorzugt für Antisense- bzw. Sensekonstrukte eingesetzt, um Veränderungen des Kohlenhydratstoffwechsels mit dem Ziel, eine Unterversorgung der Pollen zu erreichen, ebenfalls auf die relevanten Gewebe zu beschränken.
Schließlich erfolgt die Herstellung chimärer Genkonstrukte. in denen Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen unter Kontrolle von
regulatorischen Sequenzen stehen, die eine Antheren/Tapetum Pollen-spezifische Expression gewährleisten, mittels konventioneller Klonierungsmethoden (siehe bspw. Sambrook et al. (1989), supra).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsauremolekul umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase ein Protein verstanden, das die Isomerisierung von Saccharose zu anderen Disacchariden katalysiert, wobei die αl — . ß2-glykosidische Bindung zwischen Glukose und Fruktose in der Saccharose in eine andere glykosidische Bindung zwischen zwei Monosaccharideinheiten überführt wird, insbesondere in eine αl- 6-Bindung und oder αl— . αl -Bindung. Besonders bevorzugt wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase ein Protein verstanden, das zur Isomerisierung von Saccharose zu Palatinose und/oder Trehalulose befähigt ist. Dabei beträgt der Anteil von Palatinose und Trehalulose an den gesamten Disacchariden, die durch Isomerisierung von Saccharose gebildet werden > 2%, bevorzugt > 20%, besonders bevorzugt > 50% und am meisten bevorzugt > 60%.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989), supra) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und Saccharoseisomerase- DNA-Sequenz hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann mittels Routinetechniken falls erwünscht verschiedenartige Mutationen in die Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zu Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen. Bevorzugt werden Mutanten hergestellt, die auf die
Veränderung der enzymatischen Eigenschaften abzielen, vorzugsweise auf eine Steigerung der Affinität zu Saccharose durch Erniedrigung des Km- Wertes.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 4 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat. Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
Neben der in SEQ ID No. 4 angegebenen Saccharoseisomerase-Sequenz aus Erwinia rhapontici werden als bevorzugte DNA-Sequenzen solche eingesetzt, die eine besonders hohe Affinität zu Saccharose besitzen, also einen niedrigen Km- Wert aufweisen, z.B. die Saccharoseisomerase aus Pseudomonas mesacidophila (Km für Saccharose 19,2 mM, Nagai et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:1789-1793) oder Serratia plymuthica (Km für Saccharose 63,5 mM; McAllister et al. (1990) Biotechnol. Lett. 12:667-672).
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen. vorzugsweise
unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, supra) beschrieben sind.
DNA-Sequenzen, die mit den DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Sequenzen kann dabei z.B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen erfolgen, die exakt oder im wesentlichen eine der oben erwähnten Saccharoseisomerase kodierenden Nukleotidsequenzen des Standes der Technik oder Teile dieser Sequenzen aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA- Sequenzen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), supra). Bei denen als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit einer der oben erwähnten DNA-Sequenzen für Saccharoseisomerase oder einem Teil einer dieser Sequenzen übereinstimmt. Die DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen, deren Nukleotidsequenzen zu der einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen degeneriert ist. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u.a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA- Sequenz an die Codonpräferenz (codon usage) der Zielpflanze, also der aufgrund der spezifischen Expression der Saccharoseisomerase-DNA-Sequenz männlich sterilen Pflanze anzupassen und die Expression dadurch zu optimieren.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der
beschriebenen Proteine zu kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA- Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 Prozent, insbesondere eine Identität von mindestens 60 Prozent, vorzugsweise über 80 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion. Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Derivate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenzen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform stammt die beschriebene, für eine Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici (wie in SEQ ID No. 4 angegeben).
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein rekombinantes Nukleinsauremolekul umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; b) daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA- Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen
Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen- ATPase-Expression führt, und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Für die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen enthaltenen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Da die Saccharoseisomerase erfindungsgemäß in Antheren-, Tapetum- und/oder Pollengewebe zur Expression gelangen muss, kommt hier jeder Promotor in Frage, der die Expression in Antheren, Tapetum oder Pollen, sei es u.a. in Antheren, Tapetum oder Pollen oder ausschließlich in diesen Geweben, gewährleistet.
Dabei kann der Promotor so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in Antheren-, Tapetum- und/oder Pollen-spezifischem Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere
Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors kann eine zell- bzw. gewebespezifische Expression auch dadurch erreicht werden, dass die Genexpression in den Zellen bzw. Geweben, in denen sie nicht erwünscht ist, gehemmt wird, bspw. durch die Ausprägung von Antikörpern, die das Genprodukt binden und somit seine Enzymaktivität unterbinden, oder durch geeignete Inhibitoren.
Im Rahmen der Erfindung besonders geeignete Promotoren sind Antheren-, Tapetum-und/ oder Pollen-spezifische Promotoren. Beispiele hierfür sind der Promotor des tapl-Gens aus Antirrhinum majus (Sommer et al. (1990)
EMBO J. 9:605-613; Sommer et al. (1991) Development, Suppl. 1 :169-176; z.B. als 2,2 kb EcoRI/ RαmHI-Restriktionsfragment); - der Promotor des TA29-Gens (Mariani et al. (1990) Nature 347:737-741 ;
Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3403; Genbank Acc. No.
X52283); der Promotor des RA8-Gens aus Oryza sativa L. (Jeon et al. (1999) Plant
Mol. Biol. 39:35-44, in dieser Veröffentlichung werden Εxpressionsstudien an RA8-Promotor/GUS-Konstrukten in transgenen Reispflanzen beschrieben);
- der Promotor des Bpl9-Gens aus Brassica napus (Albani et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:501-513);
- die Promotoren der LAT52- und LAT56-Gene aus Tomate (Twell et al. (1990) Development 109:705-713);
- der Promotor des BNA215-6-Gens aus Brassica campestris L. ssp. Pekinensis (Kim et al. (1997) Mol. Cells 7:21-27, hier werden
Promotor/GUS-Expressionsanalysen in transgenen Tabakpflanzen beschrieben);
- der Promotor des NeIF-4A8-Gens aus Nicotiana tabacum (Brander and Kuhlemeier (1995) Plant Mol. Biol. 27:637-649, hier werden Promotor/ GUS- Expressionsstudien beschrieben);
- der Promotor des Bgpl-Gens aus Brassica campestris (Xu et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 239:58-65, hier werden Deletionskonstrukte und deren Analyse in transgenen Arabidopsis thaliana-ΫiΛanzen beschrieben);
- der Promotor des APG-Gens aus A. thαliαnα (Roberts et αl. (1993) Plant J. 3:111-120;
- der Promotor des tap2-Gens aus Löwenmäulchen (Nacken et αj. (1991) FEBS Lett. 280:155-158, die die molekulare Analyse dieses Antheren-spezifischen Gens beschreiben); die Promotoren der chiA- und chiB-Gene aus Petunie (van Tunen et αl. (1990) Plant Cell 2:393-401); der Pollen-spezifische Promotor des Bnml-Gens aus Brassica napus (Treacy et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:603-61 1, in diesem Artikel werden Promotor/GUS-Expressionsanalysen in transgenen Rapspflanzen beschrieben); - der Promotor des Bp4-Gens aus Brassica napus und der Promotor des
NTM9-Gens aus Nicotiana tabacum (Custers et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:689-699) sind in den frühen Stadien der Pollenentwicklung aktive Promotoren; hier konnte mittels Promotor/Barnase-Fusionskonstrukten in transgenen Tabakpflanzen ein männlich steriler Phänotyp erzeugt werden; - der Pollen-spezifische Promotor des ZM13-Gens aus Mais (Hamilton et al.
(1998) Plant Mol. Biol. 38:663-669), hier wurden die zur Pollen-spezifischen Expression erforderlichen Sequenzbereiche durch Mutationsanalysen identifiziert und beschrieben;
der Pollen-spezifische Promotor einer Invertase aus Kartoffel (Machray et al. (1999) „The role of invertases in plant carbohydrate partitioning and beyond", Abstracts Workshop Universität Regensburg, 3.-6. Okt. 1999; hier werden Promotor/GUS-Expressionsstudien beschrieben).
Weitere Antheren-spezifische Gene bzw. Promotoren kann der Fachmann dem Stand der Technik, insbesondere den einschlägigen wissenschaftlichen Journalen und Gendatenbanken entnehmen. Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage mittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z.B.
Hybridisierungsexperimenten oder DNA-Protein-Bindungsstudien, Antheren- spezifische regulatorische Nukleinsäurelemente identifizieren. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt aus Antherengewebe des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly(A)+-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus einem Nicht- Antherengewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)+-RNA-Moleküle lediglich in Antherengewebe akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Antheren-spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Antheren-spezifischer Promotoren zur Verfügung. Gleiches gilt natürlich auch für Pollen- bzw. Tapetum-spezifische Promotoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antheren-spezifische Promotor der TA29-Promotor aus Tabak.
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig austauschbar.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung männlich steriler Pflanzen ermöglicht. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Antheren. im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration transgener Pflanzen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: - regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und oder in
Pollen aktiven Promotors; daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA- Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen- ATPase-Expression führt, und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können, b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration von transgenen Pflanzen.
Des weiteren betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, enthalten. Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul enthalten. Die transgenen Pflanzen der Erfindung sind aufgrund der Einführung und Expression einer eine Saccharoseisomerase kodierenden DNA-Sequenz in den Antheren männlich steril.
Sämtliche hier unter Bezugnahme auf rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, gemachten Ausführungen, sei es im Zusammenhang mit der Herstellung von Vektoren,
Pflanzenzellen, Wirtszellen, transgenen Pflanzen etc. gelten auch für die anderen, oben beschriebenen Ansätze zur Veränderung des Saccharosestoffwechsels mit dem Effekt einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-ZeXXen verwendet. Transformierte E. coli-ZeXXen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen, wie bereits oben erwähnt, die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die
Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen
Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro-
bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke. Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418. Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screening- bedarf einhergeht. Falls markerfreie transgenen Pflanzen erwünscht sind, stehen dem
Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z.B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, untersucht werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Raps, Getreide, Zuckerrübe, Mais, Sonnenblume und Sojabohne. Prinzipiell ist jede Nutzpflanze für die Umsetzung der Erfindung erstrebenswert, für die Hybridsysteme besonders nützlich und wertvoll sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise. Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden. Phänotypisch unterscheiden sich die Pflanzen von Wildtyppflanzen durch den männlich sterilen Phänotyp.
Die spezifische Expression der Saccharoseisomerase in den Antheren der erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern Blot- Analyse zum Nachweise Saccharoseisomerase- spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von Saccharoseisomerase-spezifischer RNA, eine Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von für Saccharoseisomerase-kodierende DNA-Sequenzen oder eine Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen kodierten Saccharoseisomerase-Proteins. Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Saccharoseisomerase auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden.
Wie eingangs erwähnt ist neben einem System zur Erzeugung männlicher Sterilität in Pflanzen zusätzlich ein passendes Restorer-System wünschenswert. Im Fall der Erzeugung männlicher Sterilität durch Antheren-spezifische Expression von DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, kann die männliche Fertilität auf folgende Weisen wiederhergestellt werden.
Zum einen können DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren, als Restorer-Gen eingesetzt werden. Die Palatinase, auch Palatinose-Hydrolase genannt, katalysiert die Spaltung des Disaccharids Palatinose in die Hexosen Fructose und Glucose. Zum anderen können zusätzlich oder alternativ zu den für eine Palatinase kodierenden DNA-Sequenzen Nukleinsäuresequenzen als Restorer-Gene eingesetzt werden, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren. Die Trehalulase, auch
Trehalulose-Hydrolase genannt, katalysiert die Spaltung des Disaccharids Trehalulose ebenfalls in Fructose und Glucose.
So kann der männlich sterile Phänotyp durch die Kreuzung mit Pflanzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase exprimieren, überwunden bzw. aufgehoben werden und somit ein vollständiges Hybridsystem, einschließlich Restorer-Funktion realisiert werden.
Palatinase-Gene sind im Stand der Technik bekannt. So offenbart PCT/EP 95/00165 die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Protaminobacter rubrum sowie die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Pseudomonas mesoacidophila MX-45.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird jetzt erstmals eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici offenbart, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert. Diese Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 1 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 2 bzw. 3 angegeben.
Ferner wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici bereitgestellt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert. Die Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 7 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 8 bzw. 9 angegeben.
Im Zusammenhang mit Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen aus anderen Quellen und den Verfahren, mit denen der Fachmann solche Sequenzen isolieren bzw.
herstellen kann, wird in vollem Umfang auf die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit Saccharoseisomerase-Sequenzen verwiesen. Gleiches gilt für die Herstellung von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren, für die Erzeugung von Pflanzen sowie für die Übertragung solcher Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzenzellen und die Regeneration transgener Pflanzen. Ebenso wird auf alle obigen Ausführungen zur Hybridisierung, Homologie, zu Derivaten, Varianten und Fragmenten, regulatorischen Sequenzen etc. ausdrücklich Bezug genommen.
Die Erfindung betrifft somit auch die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 7 angegebenen Nukleotidsequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, sowie die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein
Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase. kodiert,
c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
Für die Expression des Palatinase- bzw. Trehalulase-Gens sind natürlich die gleichen Promotoren geeignet, die für die Expression der Saccharoseisomerase nützlich sind. Die Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen können auch vorteilhaft unter Kontrolle konstitutiver Promotoren, wie bspw. dem 35S RNA-Promotor von CaMV, zur Expression gebracht werden. Sowohl die Palatinase- als auch die Trehalulase- Enzymaktivität habender se keinen Einfluss auf die Pflanzenzellen und somit auch keinen Einfluss auf das Pflanzenwachstum, auch bei Expression in allen Geweben der transgenen Pflanze.
Bevorzugt werden solche Palatinase-DNA-Sequenzen eingesetzt, die für ein Enzym mit hoher Affinität zu Palatinose kodieren. Entsprechend werden vorzugsweise solche Trehalulase-DNA-Sequenzen eingesetzt, die für ein Enzym mit hoher Affinität zu Trehalulose kodieren.
Wie oben ausgeführt, erfordert die Bereitstellung eines Restorer-Systems, also die Wiederherstellung der Fruchtbarkeit einer transgenen männlich sterilen Pflanze, die Herstellung einer zweiten, sog. Restorer-Linie von transgenen Pflanzen. Bei dieser Restorer-Linie kann es sich also um eine Linie handeln, die eine für ein Protein mit der Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodierende DNA-Sequenz enthält. Daneben sind andere Ansätze zur Wiederherstellung der Fertilität möglich. So kann zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit in Saccharoseisomerase exprimierenden. männlich sterilen Pflanzen die Expression eines entsprechenden Saccharoseisomerase-Inhibitors in der Restorer-Linie dienen. Ein solcher Inhibitor kann z.B. ein gegen die Saccharoseisomerase gerichteter Antikörper sein, oder ein
Inhibitor, wie er bspw. für Invertasen bekannt ist (Greiner et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:708-711).
In einem anderen Ansatz kann die Restorer-Linie ein gegen die Saccharoseisomerase-mRNA gerichtetes Ribozym exprimieren. Ribozyme können in der Weise hergestellt werden, dass sie eine gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonuclease-Aktivität besitzen (siehe z.B. Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11 :1525).
In einem ähnlichen Ansatz kann die Fertilität durch die Expression einer entsprechenden Antisense-RNA wiederhergestellt werden. Die Bindung der Antisense-RNA an die Ziel-RNA führt zur Inhibierung deren Translation (Paterson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:4370). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung würde man also eine durch Expression der Saccharoseisomerase männlich sterile Pflanze mit einer Restorer-Linie kreuzen, in der die entsprechenden Saccharoseisomerase-Sequenzen in der Antisense- Orientierung unter Kontrolle geeigneter Promotoren stehen, so daß Antisense- Transkripte für Saccharoseisomerase entstehen. Hierdurch wird die Antheren- spezifische Sense-Expression, die den männlich sterilen Phänotyp herbeiführt, gehemmt bzw. aufgehoben, so dass männlich fertile Kreuzungsprodukte entstehen. Alternativ kann auch das Phänomen der Cosuppression in analoger Weise zur Antisense-Technik zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht die Expression der Antisense- oder Cosuppressions-RNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, dessen Aktivierung die gezielte Wiederherstellung der männlichen Fertilität erlaubt.
Eine weitere Alternative beinhaltet die Expression eines RNA-Transkriptes, welches die RNAse-P vermittelte Spaltung von Saccharoseisomerase-mRNA-Molekülen bewirkt. Bei diesem Ansatz wird eine externe Führungssequenz konstruiert, welche die endogene RNAse-P zur Saccharoseisomerase-mRNA geleitet und schließlich die Spaltung dieser mRNA vermittelt (Altman et al., US-Patent No. 5,168,053; Yuan et al. (1994) Science 263:1269). Vorzugsweise beinhaltet die externe Führungssequenz 10 bis 15 zur Saccharoseisomerase komplementäre Nukleotide und eine 3'-NCCA- Nukleotid-Sequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die Transkripte der externen Führungssequenz binden an die Ziel-mRNA über die Ausbildung von Basenpaaren, was die Spaltung der mRNA durch die RNAse-P am Nukleotid 5' von der gepaarten Region ermöglicht.
Ein weitere Ansatz zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität sind transgene, männlich sterile Pflanzen, welche zusätzlich zu einem mit einer Promotorsequenz operativ verknüpften Saccharoseisomerase-Gen eine prokaryontische Kontrollregion in der selben Expressionskassette enthalten. Zusätzlich werden transgene, männlich fertile Pflanzen produziert, die ein prokaryontisches Polypeptid unter der Kontrolle eines entsprechenden Promotors exprimieren. In den FI -Hybriden bindet das prokaryontische Polypeptid an die prokaryontische Kontrollregion und reprimiert die Expression der Saccharoseisomerase. Konkret kann das LexA-Gen/LexA-
Operatorsystem benutzt werden, um die Kontrolle der Genexpression zu erreichen (US-Patent No. 4,833,080; Wang et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13:1805). Dies würde bedeuten, dass die Expressionskassette der männlich sterilen Linie die LexA- Operatorsequenz enthält, während die Expressionskassette der männlich fertilen Restorer-Linie die kodierende Region des LexA-Repressors enthält. In den Fl-
Hybriden bindet der LexA-Repressor an die LexA-Operatorregion und unterbindet dadurch die Transkription des Saccharoseisomerase-Gens. LexA-Operator-DNA- Moleküle können z.B. durch die Synthese von DNA-Fragmenten erhalten werden,
welche dem Fachmann aus der Literatur wohl bekannte LexA-Operator-Sequenzen enthalten, so z.B. von Garriga et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 236: 125 beschrieben. DNA-Sequenzen, die für den LexA-Repressor kodieren, können z.B. durch Synthese solcher DNA-Moleküle erhalten werden oder durch DNA-Klonierungstechniken wie sie dem Fachmann bekannt sind und z.B. bei Garriga et al., vide supra, beschrieben sind. Alternativ können für den LexA-Repressor kodierende Sequenzen zum Beispiel von Plasmid pRB500 (ATTC 67758) entnommen werden.
Der im Zusammenhang mit dem LexA-Repressor/Operator-System erklärte Ansatz zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität lässt sich natürlich auch mit anderen Repressor/Operator-Systemen realisieren, wie sie dem Fachmann aus der Literatur in vielfaltiger Weise bekannt sind, z.B. das Lac-Repressor/lac-Operator-System oder das trp-Repressor/trp-Operator-System.
Schließlich kann die Fertilität durch Applikation von chemischen Verbindungen oder Substanzen während der Pollenentwicklung wiederhergestellt werden, die die Saccharoseisomerase in ihrer Aktivität hemmen.
Die Erfindung basiert auf der erfolgreichen Herstellung neuer Pflanzen, die aufgrund der Einführung und Expression einer für eine Saccharoseisomerase kodierende Nukleinsäuresequenz in den Antheren männlich steril sind, was in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert wird.
Beispiele
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
1. Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B.: Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen. Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien. Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden nach Sambrook et al. (1989, vide supra) durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16:9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobacterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al. (1975) Gen. Virol. 26:33).
2. Erzeugung einer genomischen Bank von Erwinia rhapontici Zur Herstellung einer genomischen Bank aus Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde chromosomale DNA aus den Zellen einer 50 ml-Übernachtkultur nach Standardprotokoll isoliert. Anschließend wurden ca. 300 μg der DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3A partialverdaut und auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt. Fragmente zwischen 5 und 12 kb wurden mittels Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Die so erhaltenen DNA- Fragmente wurden in BamHI-verdaute Lambda ZAP-Express-Arme (Stratagene, La Jolla, USA) ligiert und anschließend in vitro verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract. Stratagene, nach Herstellerangaben). E. co//-Bakterien des Stammes XL- MRF' (Stratagene) wurden mit rekombinanten Lambda-Phagen infiziert, der Titer der Bank bestimmt und schließlich die Bank amplifiziert.
3. Durchmusterung einer genomischen Bank
Zur Isolierung von genomischen Klonen wurden ca. 105 Phagen plattiert. Nach Transfer der Phagen auf Nylonfilter (Genescreen, NEN) wurden die Filter mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment hybridisiert. Positive Signale wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht und vereinzelt.
4. Bakterienstämme und Plasmide
E. coli (XL-1 Blue. XL-MRF' und XLOLR)-Bakterien wurden von der Firma
Stratagene bezogen. Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig,
Deutschland) bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobacterium-
Stamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan) wurde von Debleare et al. (1985,
Nucl. Acids Res. 13:4777) beschrieben.
Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR-Blunt (Invitrogen, Niederlande), pMAL- c2 (New England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gene 33:103-119) und
Binl9 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8720) verwendet.
5. Tabaktransformation
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von
Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/1 Kanamycin. 500 mg/1 Claforan, lmg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0,2mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1,6%
Glukose und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS- Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8%) Bacto-Agar überführt.
6. Nachweis von Palatinose in Pflanzenextrakten
Zum Nachweis von Saccharoseisomerase-Aktivität in Pflanzenextrakten wurden Blattscheiben mit einem Durchmesser von ca. 0,8 cm für 2 h bei 70 °C mit 100 μl 80 % Ethanol und 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) extrahiert. Für die Analyse eines Aliquots dieser Extrakte wurde ein HPLC-System der Firma Dionex verwendet, welches mit einer PA-1 (4 x 250 mm)-Säule und einem gepulsten elektrochemischen Detektor ausgestattet war. Vor der Injektion wurden die Proben für 2 Minuten bei 13.000 rpm abzentrif giert. Zucker wurden anschließend mit einem lOminütigen Gradienten von 0 bis 1 M Natriumacetat nach 4 Minuten bei 150 mM NaOH und einer Durchflussrate von 1 ml/min eluiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Zucker wurden die entsprechenden Standards der Firma Sigma verwendet.
Beispiel 1
PCR-Amplifikation eines Subfragments der Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung eines Subfragments der Saccharoseisomerase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici (DSM 4484), die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FB 83 5'-GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und
• FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3\
die von einer Saccharoseisomerase-Sequenz des Standes der Technik abgeleitet wurden. Primer FB 83 umfaßt die Basen 109 - 127 und Primer FB 84 die Basen 1289 - 1306 der kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens von E. rhapontici. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB 83 und FB 84 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das amplifizierte Subfragment kann gut als Hybridisierungssonde für die Isolierung weiterer Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen aus anderen Organismen oder als Sonde bei der Analyse transgener Zellen und Pflanzen eingesetzt werden.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des Palatinose-Operons aus E. rhapontici
Zur Isolierung des Palatinose-Operons wurde eine genomische Bank mit einem Subfragment der Saccharoseisomerase (siehe Beispiel 1) durchmustert. Dabei wurden mehrere positive Klone isoliert. Durch vollständige Sequenzierung und Zusammensetzen dieser Klone konnten mehrere offene Leserahmen identifiziert werden, welche für Enzyme des Palatinose-Stoffwechsels kodieren (siehe unten stehende Übersicht der Gene des Palatinose-Operons und der dazugehörigen
59135
39
Genprodukte). Die untenstehende Skizze zeigt eine schematische Übersicht des klonierten Palatinose-Genclusters aus Erwinia rhapontici. Die Position der offenen Leserahmen und die Richtung der Transkription sind durch Pfeile dargestellt.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 kb
1 I I I I I I I I I I I I I I 1
[<t_____ 4_ palZ palQ palK palH palG palF palE palR pall
Beispiel 3
PCR-Amplifikation einer Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des voUständingen offenen Leserasters der Saccharose-Isomerase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici (DSM 4484), die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer • FB 96 5'-GGATCCACAATGGCAACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und • FB 97 5'-GTCGACCTACGTGATTAAGTTTATA-3' für pCR-SucIsol . Primer FB 96 umfaßt die Basen 109 - 127 und beinhaltet zusätzlich ein Startkodon, Primer FB 97 die Basen 1786 - 1803 der kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens. Zur Herstellung des Konstruktes pCR- SucIso2 wurde als 5'-Primer FB 83 (5'-
GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3'), welcher kein zusätzliches ATG enthält, verwendet. Zur Klonierung der amplifizierten DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 96 bzw. FB 83, BamHI; Primer FB 97, Sall. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien-DNA (1 μg), Primer FB 96 und FB 97 für pCR-SucIsol, bzw. Primer FB 83 und FB 97 für pCR-Sudso2 (jeweils 250 ng), Pfu DNA- Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-
Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase- Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das amplifizierte Saccharoseisomerase-Fragment
wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR- Suclsol (mit Translationsstart) bzw. pCR-SucIso2 (ohne Translationsstart) erhalten wurde (siehe Abbildung 1). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Saccharoseisomerase aus E. rhapontici. die sich von Nukleotid 109 - 1803 des Saccharoseisomerase-Gens erstreckt. Die Nukleotidsequenz der verwendeten Primer wurde jeweils hervorgehoben. Die DNA-Sequenz ist unter SEQ ID No. 4 angegeben.
Beispiel 4
PCR-Amplifikation einer Palatinase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des voUständingen offenen Leserasters der Palatinase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 80 5'-GAGATCTTGCGCAGCACACCGCACTGG-3' • FBI 76 5 ' -GTCGACTC AC AGCCTCTC AATAAG-3 '
Primer FB 180 umfaßt die Basen 2 - 21, Primer FB 176 die Basen 1638 - 1656 der kodierenden Region des Palatinase-Gens. Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 180 Bglll; Primer FB 176 Sall. Das PCR Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB 180 und FB 176 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. wodurch das Plasmid pCR-PalQ erhalten wurde (Abb. 2). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Palatinase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 2 - 1656 des Palatinase-Gens erstreckt (siehe SEQ ID No. 1).
Beispiel 5
Herstellung von Plasmid p35S-cwIso
Eine DNA Sequenz, die für eine Saccharose-Isomerase kodiert, wurde aus dem Plasmid pCR-Sudso2 isoliert und mit dem 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzenzellen vermittelt, einem für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Gens (Proteinase-lnhibitor II-Gen aus Kartoffel (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; Genbank Accession X041 18), sowie einem pflanzlichen Terminationssignal verbunden. Dazu wurde das Saccharoseisomerase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-SucIso2 (siehe Abb. 1) über die Restriktionsschnittstellen BamHI und Sall herausgeschnitten und in einen BamHI/Sall-geöffneten pMA- Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sei. 66:221-230) dar, welche den 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des
Proteinase-Inhibitors II aus Kartoffel, welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3 '-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase Gens. Zwischen der Teilsequenz des Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, Xbal, Sall, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-lnhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (Abb.3).
Das Fragment A beinhaltet den 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21 :285. Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-lnhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Keil et al., supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Saccharoseisomerase Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 109 - 1803 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum (ER) notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Saccharoseisomerase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3:835), Nukleotide 1 1749 - 11939.
In p35S-cwIso (35S = 35S-Promotor, cw = Zellwand, Iso = Saccharoseisomerase) steht die kodierende Region der Saccharoseisomerase aus E. rhapontici unter konstitutiver Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Beispiel 6
Herstellung von Plasmid pTA29-cwIso
In analoger Weise wie unter Beispiel 5 beschrieben, jedoch mit der Modifikation, dass die Expression des Fusionsproteins aus Proteinase-Inhibitor-Signalpeptid und der Saccharoseisomerase unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors TA29 aus Tabak gestellt ist, wurde das Plasmid pTA29-cwIso hergestellt. Die Funktionalität des Antheren-spezifischen TA29-Promotors wurde bereits demonstriert (Mariani et al. (1990) Nature 347:727-741). Das pflanzliche
Terminationssignal beinhaltet das 3 '-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin- Synthase-Gens. Das Plasmid pTA29-cwIso beinhaltet drei Fragmente A, B und C, die in die Schnittstellen für Restriktionsenzyme des Polylinkers von pUC18 kloniert wurden (siehe Abbildung 3). Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18:3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer • FB158 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und • FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3'. Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB158, EcoRI; Primer FB159, Asp718. Das PCR-Reaktionsgemisch (lOOμl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 μg), Primer FB 158 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pf DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen)
wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRA und Asp718 verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 bis 1059 eines Proteinase-lnhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; Genbank Acc.No. X041 18), welche über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Saccharoseisomerase-Gen aus E. rhapontici. welches die Nukleotide 109 bis 1803 umfasst, fusioniert sind. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das ER notwendiges Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Saccharoseisomerase-Sequenz fusioniert. Das Fragment B wurde als Asp718/Sall- Fragment aus dem oben beschriebenen Konstrukt p35S-cwIso (Beispiel 5) herausgeschnitten und zwischen die Restriktionsschnittstellen Asp718 und Sall der Polylinkerregion von pUC 18 kloniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3:835), Nukleotide 11749 - 11939, welches als PvuII/Hindlll-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303 :209) isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und Hindill-Schnittstelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden ist.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI/ Hindlll-Fragment zwischen die EcoRI- und Hindlll-Schnittstelle des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711) kloniert.
In pTA29-cwIso (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, Iso = Saccharoseisomerase) steht die kodierende Region des Saccharoseisomerase-Gens
aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Tabakpflanzenzellen wurden wie oben beschrieben mittels Agrobacterium- vermitteltem Gentransfer mit dem Konstrukt pTA29-cwIso transformiert und ganze Tabakpflanzen wurden regeneriert. Die erhaltenen pTA29-cwIso-Transformanten zeigten einen männlich sterilen Phänotyp, ansonsten waren keine Unterschiede zum Wildtyp erkennbar.
Beispiel 7
Herstellung von Plasmid pTA29-cwPalQ
In analoger Weise wie unter Beispiel 6 beschrieben, wurde die kodierende Region der Palatinase aus E. rhapontici, fusioniert mit einem für die Aufnahme in das ER notwendigen Signalpeptid eines pflanzlichen Gens (Proteinase-lnhibitor II-Gen aus Kartoffel, Keil et al. (1986) vide supra), unter die Kontrolle des Antheren- spezifischen Promotors des TA29-Gens aus Tabak gestellt. Das so erhaltene Konstrukt pTA29-cwPalQ besteht aus drei Fragmenten A, B und C (vgl. Abbildung 5) und ermöglicht die Expression der Palatinase in der Zellwand von Tapetumzellen.
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18:3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 58 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und
• FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3\
Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB158, EcoRI; Primer FB159, Asp718. Das PCR- Reaktionsgemisch (lOOμl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 μg), Primer FB 158 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pf DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das
Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRA und Asp718 verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-lnhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solanum tuber sum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase Gen aus Erwinia rhapontici. welches die Nukleotide 2 - 1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Palatinase Sequenz fusioniert.
Zur Klonierung von Fragment B wurde der Bereich des Proteinase-lnhibitor II Gens umfassend die Nukleotide 923 bis 1059 über die Restriktionsenzyme Asp718 und BamHI aus dem pMA-Vektor isoliert und zwischen die entsprechenden
Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert. Anschließend wurde das über Bglll und Sall aus dem Konstrukt pCR-PalQ herausgeschnittene Palatinase-
Fragment über die zu Bglll kompatible BamHI-Schnittstelle mit der Sequenz des Proteinase-Inhibitors fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylienmgssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids PTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3:835), Nukleotide 11749 - 11939, welches als PvuII/ Hindill-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303:209) isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und Hindlll-Schnittstelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden ist. Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI/Hindlll-Fragment zwischen die EcoRI- und Hindlll-Schnittstelle des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711) kloniert.
In pTA29-cwPalQ (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, PalQ = Palatinase) steht die kodierende Region des Palatinase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit pTA29-cwPalQ mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der pTA29-cwPalQ-Elternpflanzen.
Beispiel 8
Herstellung von Plasmid p35S-cwPalQ
Die DNA-Sequenz, die für eine Palatinase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S RNA- Promotors gebracht, wodurch das Plasmid p35S-cwpalQ entstand.
Dazu wurde das Palatinase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-palQ über die Restriktionsschnittstellen Bglll und Sall herausgeschnitten und in einen BamHI/Sall geöffneten pMA-Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci.66: 221 - 230) dar, welche den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase Inhibitors II aus Kartoffel (Keil et al. 1986, vide supra)), welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'- Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase-Gens. Zwischen der Teilsequenz der Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, Xbal, Sall, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-lnhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (siehe Abbildung 5).
Das Fragment A beinhaltet den 35S RNA-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21, 285.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase Inhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 2 - 1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Palatinase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749 - 11939.
In p35S-cwPalQ (35S = 35S RNA-Promotor des CaMV, cw = Zellwand, PalQ = Palatinase) steht die kodierende Region des Palatinase-Gens aus E. rhapontici unter konstitutiver Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit p35S-cwPal mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der p35S-cwPal-Elternpflanzen.
Beispiel 9 Herstellung des Plasmids pMAL-SucIso
Zur Herstellung des Plasmids pMAL-Suciso wurde das Saccharoseisomerase- Fragment aus dem Konstrukt pCR-Suc!so2 über die Restriktionsenzyme BamHI und
Sall herausgeschnitten und in einen ebenfalls so geschnittenen pMAL-c2 Vektor (New England Biolabs) ligiert, wodurch das Konstrukt pMAL-SucIso (Abbildung 4) erhalten wurde. Dieses ermöglicht eine Expression des Enzyms als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein unter der Kontrolle des durch IPTG induzierbaren tac-Promotors.
Fragment A beinhaltet den tac-Promotor, der eine durch IPTG induzierbare Genexpression ermöglicht.
Fragment B beinhaltet einen Teil des malE-Gens mit Translationsstart. Fragment C beinhaltet die kodierende Region der Saccharoseisomerase. Fragment D beinhaltet den rrnR-Terminator aus E. coli.
Mit pMAL-Suciso transformierte Bakterienzellen zeigen IPTG-induzierbare Expression der Saccharoseisomerase aus E. rhapontici.
Beispiel 10
Funktioneller Nachweis der Saccharoseisomeraseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Saccharoseisomerase-Gens erfolgte durch Expression in E.coli. Dazu wurde das Plasmid pMAL-Suciso in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des Fusionsproteins zwischen dem Maltose-bindenden Protein und der Saccharoseisomerase erfolgte nach Herstellerangaben in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen wurde das Pellet in 1 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. Ein Aliquot des Rohextraktes wurden mit dem gleichen Volumen 600 mM Saccharose gemischt und für 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Zum Nachweis der entstandenen Palatinose
wurde ein Aliquot des Ansatzes einer HPLC-Analyse unterzogen. Das Chromatogramm bestätigte die Produktion von Palatinose durch die rekombinante Saccharoseisomerase in E. coli.
Beispiel 1 1
In vivo-Nachweis der Saccharoseisomeraseaktivität in transgenen Pflanzen
Der Nachweis der in vivo-Funktionalität der Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzen wurde wie folgt durchgeführt: von 0,5 cm2 großen Blattscheiben von untransformierten Tabakpflanzen und den Transformanten 35S-cwIso (aus Beispiel 5) wurden ethanolische Extrakte hergestellt und durch HPLC analysiert und die Zucker anhand der entsprechenden Standards identifiziert. Wie die Chromatogramme zeigten, führte die Expression der Saccharoseisomerase in der Zellwand zu einer substantiellen Akkumulation von Palatinose in den untersuchten p35S-cwIso-Pflanzen. Der Wildtyp enthält keine Palatinose, wie ebenfalls aus den Chromatogrammen deutlich zu erkennen war.
Beispiel 12
Funktioneller Nachweis und biochemische Charakterisierung der Palatinaseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Palatinase-Gens erfolgte durch Expression des rekombinanten Proteins in E. coli. Dazu wurde das Plasmid pQE-palO in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden, Deutschland) in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation wurde das
Pellet in 1 ml 30 mM HEPES (pH 7,5) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. 20 μl des Rohextraktes wurden mit 80 μl 100 mM Palatinose gemischt und für 40 Minuten bei 30 °C inkubiert. Zum Nachweis der Palatinaseaktivität wurde in einem Aliquot des Ansatzes die freigesetzte Glucose durch einen gekoppelten optisch-enzymatischen Test bestimmt. Dabei konnte die Palatinaseaktivität des rekombinanten Enzyms eindeutig nachgewiesen werden. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß das Enzym seine höchste Aktivität bei einer Reaktionstemperatur von 30 °C und einem pH von 7,0 entfaltet. Bei der Untersuchung der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration konnte ein Km-Wert für Palatinose von 10 mM und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 90 mM Palatinose bestimmt werden.
Beispiel 13
PCR-Amplifikation einer Trehalulase aus Erwinia rhapontici
Die Klonierung des vollständigen offenen Leserasters der Trehalulase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach
Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FB184 5'-GGGATCCGTGCAAACTGGTGGAAAGAG-3' • FB185 5'-GTCGACTTACCGCTGATAAATTTGTGC-3'
Die Primer FBI 84 und FBI 85 umfassen die Basen 4 - 23 bzw. 1638 - 1659 der kodierenden Region des Trehalulase-Gens.
Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB96 bzw. FBI 84: BamHI; Primer FBI 85: Sall. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB184 und FB185 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3- Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase- Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit BamHI und Sall verdaut und das Fragment in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR-PalZ erhalten wurde (siehe Abbildung 6). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Trehalulase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 4 - 1659 des Trehalulase Gens erstreckt.
Beispiel 14
Herstellung des Plasmids pTA29-cwPalZ
In analoger Verfahrensweise wie unter Beispiel 7 beschrieben, wurde die kodierende Region des Trehalulase-Gens aus Erwinia rhapontici, fusioniert mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase-lnhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. (1986), vide supra), unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors des TA-29 Gens aus Tabak gestellt. Das so erhaltene Konstrukt TA29-
53
cwPalZ besteht aus drei Fragmenten A, B und C (siehe Abbildung 3) und ermöglicht die Expression der Trehalulase in der Zellwand von Tapetumzellen.
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis + 57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacam Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 58 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und • FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3\
Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB158, EcoRI, Primer FB159, Asp 718. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 μg),
Primer FBI 58 und FBI 59 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase Reaktionspuffer (10 μl. Stratagene). 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP. dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3 -Thermocycler (Biometra) nach folgendem
Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Asp 718 verdaut und in die entsprechenden Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 ligiert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-lnhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solanum tuber osam) (Keil et al (1986), vide supra), welcher über
einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Trehalulase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 4 - 1659 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendiges Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Trehalulase- Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 1 1749 - 11939, welches als PvuII-Hindlll Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303, 209) isoliert worden ist und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen Sphl-Hindlll Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert war.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI-Hindlll-Fragment zwischen die EcoRIHindlll-Schnittstellen des Plasmids pBIN 19 (Bevan ( 1984) Nucleic Acid Res. 12. 871 1) kloniert.
In PTA29-cwPalZ (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, PalZ = Trehalulase) steht die kodierende Region des Trehalulase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit pTA29-cwPalZ mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der pTA29-cwPalZ-Elternpflanzen.
Beispiel 15
Ortsgerichtete Mutagenese der Palatinase aus E. rhapontici zur Optimierung der Palatinase-Expression in transgenen Pflanzen
Um eine Glykosylierung der Palatinase aus E. rhapontici in transgenen Pflanzen zu vermeiden wurden geeignete Aminosäuren im Bereich potentieller Glykosylierungsstellen durch ortsgerichtete Mutagenese ausgetauscht. Als Template diente das Plasmid pQE-palO. pQE-palO entspricht, was die Palatinase-Sequenz betrifft, pCR-palQ, ist aber für die Expression der Palatinase-Sequenz in E. coli geeignet. Der Reaktionsansatz (50 μl) zur PCR-gestützten Mutagenese war wie folgt zusammengesetzt: 50 ng pQE-palQ DNA, jeweils 250 ng 5'- bzw. 3'-Primer, Pfü- DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (5 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2.5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Polymerisierungsschritte (15 Zyklen) wurden in einem automatisierten T3- Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (30 Sekunden), Anlagerung der Primer bei 55 °C (1 Minute), Polymerasereaktion bei 72 °C (15 Minuten). Nach Beendigung der Reaktion wurde die parentale DNA mit 1 Einheit Dpnl-Restriktionsenzym für 1 Stunde bei 37 °C verdaut. Anschließend wurde 1 μl des Ansatzes zur Transformation von E. coli eingesetzt.
Für die Mutation 1 wurde Threonin an Position 105 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch das Plasmid pQE-palQ TI 05 A erzeugt wurde.
5'-Primer: SL 365'-CTG GTG GTC AAC CAT GCC TCT GAC GAA CAT CCC-
3'
3'-Primer: SL 375'-GGG ATG TTC GTC AGA GGC ATG GTT GAC CAC CAG-
3'
Für die Mutation 2 wurde Threonin an Position 248 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch das Plasmid pQE-palQ T248A entstand.
5'-Primer: SL 395'-GAG ACG TGG AGC GCA GCG CCA GAA GAC GCC CTG-
3'-Primer: SL 405'-CAG GGC GTC TTC TGG CGC TGC GCT CCA CGT CTC-3"
Für die Mutation 3 wurde Threonin an Position 502 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch Plasmid pQE-palQ T502A entstand.
5'-Primer: SL 425"-G GTG ATC AAT AAC TTC GCG CGA GAC GCT GTG ATG C-3' 3'-Primer: SL 435'-G CAT CAC AGC GTC TCG CGC GAA GTT ATT GAT CAC C-3'
Das Mutationsereignis wurde jeweils durch Sequenzierung des entsprechenden Bereiches der Palatinase- Sequenz verifiziert. Durch funktionelle Expression des mutagenisierten Enzyms in E. coli konnte in allen Fällen gezeigt werden, daß sich die jeweilige Aminosäure-Substitution nicht nachteilig auf die enzymatische Aktivität auswirkt. Anschließend wurden die Mutationen durch oben beschriebene Strategie mit einander kombiniert, so daß letztendlich eine Palatinase erzeugt wurde, welche keine putativen Glykosylierungsstellen mehr aufweist. Auch dieses Enzym wies nach Expression in E. coli keine nachteiligen katalytischen Eigenschaften auf.
(a) palQ Wildtyp 100 105 110 Aminosauresequenz Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro
Nucleotidsequenz CTG GTG GTC AAC CAT ACC TCT GAC GAA CAT CCC
(b) palQ T105A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotidsequenz GCC (c) /__/ρ Wildtyp 243 248 253
Amino acid sequence Glu Thr Trp Ser Ala Thr Pro Glu Asp Ala Leu
Nucleotide sequence GAG ACG TGG AGC GCA ACG CCA GAA GAC GCC CTG
(ά) palQ T248A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • • Nucleotide sequence GCG
(e)palO Wildtyp 497 502 507
Aminosauresequenz Val Ile Asn Asn Phe Thr Arg Asp Ala Val Met
Nucleotidsequenz GTG ATC AAT AAC TTC ACG CGA GAC GCT GTG ATG
(f) palQ T502A Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotidsequenz GCG
Die mutierte Palatmase-Sequenz wurde anschließend in einen Vektor für Pflanzentransformation umkloniert und in Pflanzen expπmiert.
Claims
1. Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung in transgenen Pflanzen durch Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels, insbesondere des Saccharosestoffwechsels, in den Antheren der transgenen Pflanzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels derart ist, dass es zu einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten, insbesondere Saccharose und Hexosen, kommt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels zu einem männlich sterilen Phänotyp der transgenen Pflanzen führt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in
Pollen aktiven Promotors; operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als
Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in
Pflanzenzellen dienen können; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration transgener Pflanzen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; - daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA-
Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen- ATPase-Expression führt, und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in
Pflanzenzellen dienen können, b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration transgener Pflanzen.
6. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; b) operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und c) operativ damit verknüpft regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
7. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 6. worin die DNA- Sequenz aus Erwinia rhapontici stammt.
8. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 6 oder 7, worin der Promotor der T29-Promotor ist.
9. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsauremolekul nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
10. Mikroorganismus, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsauremolekul oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
11. Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 9 auf Pflanzenzellen.
12. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsauremolekul oder einen Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 11.
13. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 12 oder hergestellt nach Anspruch 11 , sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen. Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
14. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen.
15. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, enthaltend eine DNA-Sequenz aus
Erwinia rhapontici oder Teile dieser DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren.
16. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 15, worin die DNA- Sequenz die in SEQ ID No. 1 angegebene ist.
17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
18. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, enthaltend eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici oder Teile dieser DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren.
19. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 18, worin die DNA-
Sequenz die in SEQ ID No. 7 angegebene ist.
20. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
21. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Palatinase und/oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
22. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul. das ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Saccharoseisomerase-Inhibitors kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
23. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein gegen Saccharoseisomerase-mRNA gerichtetes Ribozym kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
24. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das für eine Saccharoseisomerase- Antisense- oder Sense-RNA kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze. wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
25. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen nach
Anspruch 21, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase durch mindestens einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp-Protein eine Glykosylierungsstelle inaktiviert ist.
26. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspmch 17, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase durch einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp-Protein mindestens eine Glykosyliemngsstelle inaktiviert ist.
27. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspmch 15, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase durch mindestens einen Aminsosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp-Protein eine Glykosyliemngsstelle inaktiviert ist.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10006413 | 2000-02-14 | ||
| DE10006413 | 2000-02-14 | ||
| DE10045113A DE10045113A1 (de) | 2000-02-14 | 2000-09-13 | Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels |
| DE10045113 | 2000-09-13 | ||
| PCT/EP2001/001412 WO2001059135A1 (de) | 2000-02-14 | 2001-02-09 | Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EP1263971A1 true EP1263971A1 (de) | 2002-12-11 |
Family
ID=26004322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP01907515A Withdrawn EP1263971A1 (de) | 2000-02-14 | 2001-02-09 | Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030159181A1 (de) |
| EP (1) | EP1263971A1 (de) |
| AR (1) | AR027421A1 (de) |
| AU (1) | AU2001235460A1 (de) |
| WO (1) | WO2001059135A1 (de) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPQ976800A0 (en) | 2000-08-29 | 2000-09-21 | University Of Queensland, The | Novel polypeptides and polynucleotides and uses therefor |
| DE10047286B4 (de) * | 2000-09-20 | 2005-06-09 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Isomalt produzierende transgene Pflanze |
| WO2004005504A1 (de) * | 2002-07-04 | 2004-01-15 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen |
| US7572950B2 (en) | 2002-07-04 | 2009-08-11 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Methods for obtaining pathogen resistance in plants |
| AU2003902253A0 (en) | 2003-05-12 | 2003-05-29 | The University Of Queensland | Method for increasing product yield |
| EP1691600A4 (de) * | 2003-11-06 | 2007-09-05 | Arcadia Biosciences Inc | Tomaten mit veränderter saurer invertaseaktivität aufgrund von nichttransgenen veränderungen der sauren invertase-gene |
| AU2009253901B2 (en) | 2008-06-03 | 2014-08-07 | Nordsaat Saatzuchtgellschaft Mbh | Process of producing male sterile monocotyledonous plants |
| EP2423316B1 (de) | 2010-08-25 | 2016-11-16 | Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) | Methode zur Bestimmung der meiotischen Rekombinationsfrequenz in Pflanzen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| DE4447472C2 (de) * | 1994-01-19 | 1996-04-11 | Suedzucker Ag | Organismen mit reduziertem Palatinose- und Trehalulosestoffwechsel |
-
2001
- 2001-02-09 WO PCT/EP2001/001412 patent/WO2001059135A1/de not_active Application Discontinuation
- 2001-02-09 AU AU2001235460A patent/AU2001235460A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 EP EP01907515A patent/EP1263971A1/de not_active Withdrawn
- 2001-02-14 AR ARP010100655A patent/AR027421A1/es unknown
-
2002
- 2002-08-14 US US10/223,277 patent/US20030159181A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See references of WO0159135A1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR027421A1 (es) | 2003-03-26 |
| US20030159181A1 (en) | 2003-08-21 |
| AU2001235460A1 (en) | 2001-08-20 |
| WO2001059135A1 (de) | 2001-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0973921B1 (de) | 2-desoxyglucose-6-phosphat (2-dog-6-p) phosphatase dna-sequenzen als selektionsmarker in pflanzen | |
| DE60017781T2 (de) | Modulation der antwort einer pflanze auf abscisin säure | |
| DE69836267T2 (de) | Nukleinsäuren aus der artischocke (cynara scolymus), welche für ein enzym mit fruktosylpolymerase-aktivität kodieren | |
| EP1038014B1 (de) | PFLANZLICHE (GntI)-SEQUENZEN UND VERWENDUNG DERSELBEN ZUR GEWINNUNG VON PFLANZEN MIT VERMINDERTER ODER FEHLENDER N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE I (GnTI)-AKTIVITÄT | |
| CN101182523B (zh) | 植物花药特异性启动子及其应用 | |
| DE4447387A1 (de) | Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme | |
| DE4441408A1 (de) | DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum kodierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind, Plasmide, Bakterien, Pflanzenzellen und transgene Pflanzen enhaltend diese Sequenzen | |
| DE19509695A1 (de) | Verfahren zur Herstellung einer modifizieren Stärke in Pflanzen, sowie die aus den Pflanzen isolierbare modifizierte Stärke | |
| DE4035756A1 (de) | Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzen | |
| DE69434173T2 (de) | Herstellung von trehalose in pflanzen | |
| WO1996021030A1 (en) | Enhanced accumulation of trehalose in plants | |
| EP1263971A1 (de) | Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels | |
| AU697450B2 (en) | Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants | |
| EP1272645B1 (de) | Produktion nicht-kariogener zucker in transgenen pflanzen | |
| EP0909314A4 (de) | Pflanzliche zuckersensoren und deren verwendungen | |
| US6025544A (en) | Processes for modifying plant flowering behavior | |
| EP0967278A2 (de) | Blüten-regulierendes Gen und seine Verwendung | |
| DE10047286B4 (de) | Isomalt produzierende transgene Pflanze | |
| DE10045113A1 (de) | Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels | |
| DE10045182A1 (de) | Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen | |
| WO2001059131A2 (de) | Verwendung von palatinase- und trehalulase-sequenzen als nutritive marker in transformierten zellen | |
| WO2000060101A1 (de) | Metabolische selektionsmarker für pflanzen | |
| EP0979874A2 (de) | Protein und DNA-Sequenz der Pinosylvin-3-0-Methyltransferase (PMT) | |
| DE10050233A1 (de) | Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Pflanze | |
| JPWO2005001088A1 (ja) | 植物培養細胞で糖欠乏により働くプロモーターの有用タンパク質の分泌生産への適用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
| 17P | Request for examination filed |
Effective date: 20020905 |
|
| AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR |
|
| AX | Request for extension of the european patent |
Free format text: AL PAYMENT 20020905;LT PAYMENT 20020905;LV PAYMENT 20020905;MK PAYMENT 20020905;RO PAYMENT 20020905;SI PAYMENT 20020905 |
|
| GRAP | Despatch of communication of intention to grant a patent |
Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1 |
|
| STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
| 18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 20060328 |