DE10045113A1 - Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels - Google Patents

Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, worin dem Pollen Saccharose entzogen wird. Besonders betrifft die Erfindung die Expression eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzenzellen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, und worin die DNA-Sequenz mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors operativ verbunden ist, so dass die DNA-Sequenz in Antheren oder Pollen exprimiert wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthalten und aufgrund der Expression der DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, männlich steril sind, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, worin sich entwickelnden Pollen Kohlenhydrate entzogen wird. Besonders betrifft die Erfindung die Expression eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharose­ isomerase in transgenen Pflanzenzellen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nuklein­ säuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, und worin die DNA-Sequenz mit regulato­ rischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors operativ verbunden ist, so dass die DNA-Sequenz in Antheren oder Pollen exprimiert wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Nuklein­ säuremolekül enthalten und aufgrund der Expression der DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, männlich steril sind, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen.
Pflanzen besitzen als Eukaryonten zwei oder mehr Kopien ihrer genetischen Information pro Zelle. Jedes Gen wird in der Regel durch zwei Allele, die im homozygoten Zustand identisch bzw. im heterozygoten unterschiedlich sein können, repräsentiert. Bei der Kreuzung von zwei ausgewählten Inzuchtlinien sind die in der ersten Generation gebildeten F1-Hybride, also heterozygote Individuen, häufig größer, robuster und auch ertragreicher als die homozygoten Eltern, vermutlich weil ihre beiden allelischen Genprodukte a) mit geringerer Wahrscheinlich­ keit inaktiviert werden oder b) eine größere Reaktionsbreite aufweisen. Dieser als Heterosis oder Hybridvitalität bezeichnete Effekt wird bereits seit vielen Jahrzehnten von Pflanzen­ züchtern zur Produktion von Hybrid-Sorten genutzt.
Die Züchtung solcher Hybridlinien erfolgt unter Nutzung der cytoplasmatischen männlichen Sterilität (CMS) oder der Selbst-Inkompatibilität (SI), den beiden wichtigsten genetischen Systemen zur Verhinderung der Selbstbefruchtung.
Die Möglichkeit, ein neues Gen mittels gentechnischer Methoden in das Genom einer Pflan­ zenzelle einzubauen, hat in den letzten Jahren eine dritte Möglichkeit zur Erzeugung von Hybridpflanzen eröffnet, nämlich die Nutzung eines synthetisch männlich sterilen Systems.
Gentechnisch erzeugte männliche Sterilität wurde bereits durch verschiedene Strategien realisiert. Zu diesen gehören u. a. die Expression einer Ribonuklease (RNase) aus Bacillus amyloliquefaciens im Tapetum (das Tapetum ist die Zellschicht, welche die Pollenzellen während ihrer Entwicklung mit Nährstoffen versorgt) von Tabakantheren (Mariani C. et al. (1990) Nature 347: 737-741; Mariani C. et al. (1992) Nature 357: 384-387), die Überexpres­ sion des rolC-Gens aus Agrobacterium rhizogenes in Tabak (Schmülling T. et al. (1988) EMBO J. 7: 2621-2629; Schmülling T. et al. (1993) Mol. Gen Genet. 237: 385-394) und in Kartoffel (Fladung M. (1990) Plant Breeding 104: 295-305) sowie die Expression einer Glucanase, durch deren Aktivität die Kallose-Zellwand der Microsporocyte frühzeitig zerstört wird (Worrall D. (1992) Plant Cell 4: 759-771). Weitere Ansätze zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen stehen in Zusammenhang mit der Veränderung der Pigmentzusammen­ setzung der Blüte auf der Grundlage der Isolierung und Manipulation der an der Flavonoid­ biosynthese beteiligten Gene. Dabei wird die Inhibition eines bestimmten Schritts der Flavonoidsynthese in der Regel durch die Antisense-Technik oder die Expression zusätzlicher Sense-Konstrukte erreicht (siehe z. B. von der Krol A. R. et al. (1988) Nature 333: 866-869; Napoli C. (1990) Plant Cell 2: 279-289; von der Meer I. M. et al. (1992) Plant Cell 4: 253-262; Taylor L. B. and Jorgenson R. (1992) J. Heredity 83: 11-17). Diese Arbeiten, von denen die meisten die trans-Inaktivierung der Chalkonsynthase betreffen, bestätigten die Vermutung, dass Flavonoide nicht nur die Blütenfarbe mitbestimmen, sondern auch eine essentielle Rolle in der Antheren- und Pollenentwicklung spielen.
Bei einem weiteren Ansatz zur Erzeugung männlicher Sterilität wird ein extern appliziertes Proherbizid durch das eingeführte Transgen in ein Herbizid umgewandelt. So führt bei transgenen Tabakpflanzen, welche das argE-Gen aus E. coli unter der Kontrolle des TA29- Promotors exprimieren, die Applikation der nicht-toxischen Substanz N-Acetyl-L-phosphino­ tricin während der Pollenentwicklung zu männlicher Sterilität (Knete et al. (1996) Plant J. 9: 809-818). Durch die Aktivität des argE-Gens wird das nicht-toxische Proherbizid deacety­ liert und in das cytotoxische L-Phosphinotricin umgewandelt.
Handelt es sich bei der erzeugten Hybridpflanze um eine Nutzpflanze, deren Samen, Früchte oder Blüten, also generative Organe, geerntet werden sollen, muss zusätzlich ein Restorer- System eingefügt werden, damit die F1-Pflanze wieder männlich fertil ist. Im Fall der oben erwähnten Expression einer Ribonuklease führt die Aktivität der Ribonuklease zur Zerstörung der Funktion des Tapetums mit der Konsequenz, dass der Pollen nicht mehr lebensfähig ist und männlich sterile Pflanzen entstehen. In diesem Fall wurde ein Restorer-System ent­ wickelt, das auf der Expression eines Ribonuklease-Inhibitor-Gens basiert, welches aus dem gleichen Bakterium (B. amyloliquefaciens), das die Ribonuklease selbst exprimiert, isoliert wurde.
F1-Hybridlinien kommt aber nicht nur wegen ihrer erhöhten Vitalität und Ertragsleistung eine besondere Bedeutung zu. Die Saatzuchtindustrie hat zusätzlich dadurch eine große kom­ merzielle Bedeutung erlangt, dass F1-Hybridsorten vom Landwirt nicht weiter vermehrt werden können, da in der F2-Generation eine Aufspaltung der positiven Eigenschaften erfolgt und Pflanzen, die aus dem Samen von F1-Hybriden entstehen eine viel geringere Wider­ stands- und Leistungskraft zeigen als die F1-Hybride. Der Landwirt muss somit für jede Aussaat beim Saatguthersteller neues Saatgut kaufen.
Obwohl an der Erzeugung von gentechnisch hergestellten Hybridlinien mit verbesserten agro­ nomischen Eigenschaften und geringerem Arbeitsaufwand (da die mechanische Kastration entfällt) intensiv geforscht wird, führen die bisher zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen zur Verfügung stehenden Verfahren jedoch in vielen Fällen nicht zu voll befriedi­ genden Ergebnissen. Darüber hinaus werden häufig Pflanzen mit einer erheblich gesteigerten Empfindlichkeit gegenüber Phytopathogenen erhalten, was ihre praktische Handhabung in einem hohen Maße erschwert. Es besteht somit ein starkes Bedürfnis nach weiteren Verfahren zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen, welche die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neue Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung und damit zur Herstellung männlich steriler Pflanzen sowie rekombinante DNA-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die zur Manipulation der Pollenentwicklung und hier insbesondere zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen eingesetzt werden kann.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patent­ ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass sich Gene, deren Expression in den Antheren zu einer Veränderung des Saccharosestoffwechsels führt und insbesondere bewirkt, dass sich entwickelnden Pollen Saccharose und andere Kohlenhydrate entzogen werden, für die Erzeugung männlich steriler Pflanzen eignen. Besonders nützlich sind dabei DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren.
Proteine mit Saccharoseisomerase-Aktivität katalysieren die Isomerisierung des Disaccharids Saccharose zu anderen Disacchariden. Dabei wird die zwischen den beiden Monosac­ charideinheiten der Saccharose bestehende α1→β2-glykosidische Bindung, nämlich die glykosidische Bindung zwischen Glucose und Fructose in eine andere glykosidische Bindung zwischen zwei Monosaccharideinheiten überführt. Insbesondere katalysieren Saccharoseiso­ merasen, auch Saccharosemutasen genannte, die Umlagerung in eine α1→6-Bindung oder/und eine α1→α1-Bindung. Dabei entsteht bei Isomerisierung zu einer α1→6-Bindung das Disaccharid Palatinose, während bei der Umlagerung zu einer α1→α1-Bindung das Disac­ charid Trehalulose entsteht.
Beispiele für Organismen, deren Zellen ein Protein mit Saccharoseisomerase-Aktivität kodie­ rende Nukleinsäuresequenzen enthalten, sind insbesondere Mikroorganismen der Gattungen Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium, Klebstella und Enterobacter. Insbesondere sind hier folgende Beispiele für solche Mikroorganismen zu nennen: Protaminobacter rubrum (CBS 547, 77), Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides NRRL B-521f (ATCC 10830a), Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 bzw. FERM BP 3619), Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397 bzw. FERM BP 3620), Klebstella subspezies und Enterobacter Spezies.
Es wurde jetzt überraschend beobachtet, dass transgene Pflanzen, in deren Antheren aufgrund der Expression gentechnisch eingeführter Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen Saccharose in Palatinose überführt wird, diese Expression von Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen zu einem männlich sterilen Phänotyp führt.
Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird derzeit folgende Erklärung für das jetzt beobachtete Phänomen angenommen. Sich entwickelnde Pollen werden durch speziali­ sierte Zellen der Antheren mit Assimilaten versorgt. Kohlenhydrate werden in Form des Di­ saccharids Saccharose in den Apoplasten transportiert. Zur Aufnahme der Zucker sekretieren die Pollen extrazelluläre Invertasen, die dafür sorgen, dass die Hexosen Glucose und Fructose entstehen. Diese Monosaccharide werden durch die verfügbaren Hexosetransporter aufge­ nommen und metabolisiert. Durch Expression einer Saccharoseisomerase in den Antheren entsteht aus Saccharose u. a. Palatinose. Das Disaccharid Palatinose kann allerdings nur von entsprechenden Hydrolasen, nicht aber durch die oben erwähnten Invertasen gespalten wer­ den. Dies führt dazu, dass die Pollen sich nicht entwickeln können, mit der Konsequenz der männlichen Sterilität.
Dieser Effekt kann auch durch andere Maßnahmen erreicht werden, die in einer Veränderung des Saccharosestoffwechsels, insbesondere einem Entzug von Saccharose und verwertbaren Hexosen, und somit in einer Unterversorgung der Pollen mit Kohlenhydraten resultieren. So lässt sich die Pollenentwicklung z. B. durch Hemmung von Invertasen, Hexosetransportern und Hexokinasen stören, was zum männlich sterilen Phänotyp der mit entsprechenden Nukleinsäuremolekülen transformierten Pflanzen führt. Die Entwicklung funktionsfähiger Pollen kann auch dadurch verhindert werden, dass in den Antheren osmotisch wirksame Substanzen produziert werden bzw. dort akkumulieren, was zur Austrocknung sich entwickelnder Pollen und somit zum männlich sterilen Phänotyp führt.
In den meisten Pflanzen wird die Kohlenstoffversorgung sich bildender Pollen durch Saccharose, die in photosynthetisch aktiven Blättern gebildet und in den Leitbahnen des Phloems transportiert wurde, gedeckt. Die Saccharose wird von Tapetumzellen in den Apoplasten sezerniert, durch apoplastische Invertasen zu Glukose und Fruktose hydrolysiert und mittels Hexosetransporter in die Pollen aufgenommen. Im Cytosol der Pollen werden die Hexosen mittels Hexokinasen phosphoryliert und somit dem Stoffwechsel zur Verfügung gestellt. Die Aufnahme der Hexosen erfolgt zusammen mit Protonen, die mittels ATPasen in den Apoplasten gepumpt wurden. Zur Unterbrechung der Kohlenhydratsversorgung der sich entwickelnden Pollen sind daher wie oben erwähnt verschiedene Ansätze, welche die Aufnahme und Verwertung der Monosaccharide verhindern, möglich.
Die Beobachtung, dass die Pollenentwicklung durch Einflussnahme auf den Saccharose­ stoffwechsel und hier insbesondere den Entzug verwertbarer Monosaccharide wirksam gehemmt werden kann, lässt sich in idealer Weise für die Erzeugung männlich steriler Nutzpflanzen einsetzen. Grundvoraussetzung für die Erzeugung solcher männlich steriler Nutzpflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transfor­ mationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Proto­ plasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten.
Eine weitere Voraussetzung für die Herstellung von Pflanzen, die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, in ihren Anthe­ ren, ihrem Tapetum bzw. ihren Pollen exprimieren und aufgrund dieser spezifischen Expression männlich steril sind, besteht darin, dass entsprechende DNA-Sequenzen zur Verfügung stehen.
Solche Sequenzen aus Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Enterobacter species SZ 62 und Pseudomonas mesoacidophila MX-45 sind in PCT/EP 95/00165 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen, sowohl hinsichtlich der offenbarten Sequenzen selbst, als auch im Hinblick auf die Auffindung und Charakterisierung dieser und weiterer Saccharoseisomerase kodierender Sequenzen aus anderen Quellen.
Weitere Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen kann der Fachmann der einschlä­ gigen Literatur und den Gendatenbanken unter Verwendung geeigneter Suchprofile und Com­ puterprogramme für das Screening nach homologen Sequenzen bzw. für Sequenzvergleiche entnehmen.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequen­ zen aus anderen Organismen mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann bspw. geeignete Hybridisierungssonden von den bekannten Saccharoseisomerase-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken des jeweils gewün­ schten Organismus, aus dem ein neues Saccharoseisomerase-Gen isoliert werden soll, ein­ setzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs- und Sequen­ zierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio- oder gentechnologischen Labor wohl be­ kannt und etabliert sind (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Der Fachmann kann natürlich auch anhand bekannter Sequenzen geeignete Oligonukleotid­ primer für PCR-Amplifikationen von Saccharoseisomerase-Sequenzen synthetisieren und einsetzen.
Gleiches gilt für andere Maßnahmen, die in einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten und insbesondere in einem Entzug verwertbarer Monosaccharide und damit männlich sterilen Pflanzen resultieren. Auch hier sind dem Fachmann die diversen Angriffspunkte wie Invertasen, Hexosetransporter und Hexokinasen aus der Literatur wohl bekannt, weshalb er in der Lage ist, die entsprechenden Proteine bspw. durch Übertragung von Antisense- oder Sense- bzw. Cosuppressionskonstrukten wirksam zu hemmen und so die Verwertung von Saccharose in den Antheren zu unterbrechen.
Als Targets sind hier, wie oben bereits erwähnt, zu nennen:
Zellwandgebundene Invertasen: Hier sind den einschlägigen Datenbanken und Veröffent­ lichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann mittels Routineverfahren ermöglichen, geeignete Konstrukte für die Hemmung der zellwand­ gebundenen Invertase zu erzeugen und auf Pflanzenzellen zu übertragen. Beispiele für geeignete Sequenzen sind: Arabidopsis (Schwebel-Dugue et al. (1994) Plant Physiol. 104, 809-810), Karotte (Ramloch-Lorenz et al. (1993) Plant J. 4, 545-554), Tabak, (Greiner et al. (1995) Plant Physiol. 108, 825-826), Tomate (Ohyama et al. (1998) Genes Genet. Syst. 73, 149-157), Vicia faba (Accession No. Z35163), Pisum sativum (Accession No. Z83339), Beta vulgaris (Accession No. X81795). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Invertasen in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Neben der Hemmung durch Antisense- bzw. Sensekonstrukte kann die Invertase-Aktivität durch Expression von Invertaseinhibitoren unterdrückt werden. Ein Beispiel ist der Invertaseinhibitor aus Tabak (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742). Überexpression eines Invertaseinhibitors in transgenen Pflanzen führte zur Hemmung der endogenen Invertaseaktivität in Kartoffelknollen (Greiner et al. (1999) Nat. BioTech. 17, 708-711).
Ein weiteres Target stellen Hexosetransporter (Monosaccharidtransporter) dar. Auch hier sind den Datenbanken und Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben, Konstrukte zur Hemmung Pollen-exprimierter Hexosetransporter zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Petunie (Ylstra et al. (1998) Plant Physiol. 118, 297-304), Arabidopsis (Truernit et al. (1999) Plant J. 17, 191-201), Tabak (Sauer und Stadler (1993) Plant J. 4, 601-610), Medicago sativa (Acc. No.: AJ248339), Ricinus communis (Acc. No.: L08191). Weitere Sequenzen sind durch Homolo­ gievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Hexosetransporter in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist. Hier ist anzumerken, dass die Kohlenhydrate die für die Versorgung des wachsenden Pollenschlauchs bei Befruchtung notwendig sind, ebenfalls über einen Hexosetransporter aufgenommen werden müssen. Dies bedeutet, dass die Hemmung der Transporter sowohl die Pollenbildung als auch die Vitalität der Pollen behindert.
Weiter kann eine Unterversorgung der Pollen mit Kohlenhydraten durch Hemmung von Protonen-ATPasen erreicht werden. Auch hier sind den Datenbanken und Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben, Konstrukte zur Hemmung der plasmamembrangebundenen Protonen-ATPase zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Vicia faba (Nakajima et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36, 919-924), Kartoffel (Harms et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26, 979-988), Reis (Ookura et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35, 1251-1256). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der plasmamembran­ gebundenen Protonen-ATPase in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Ansatzpunkt sind die oben erwähnten Hexokinasen. Hier gilt das gleiche wie für die anderen Targets, den Datenbanken und Veröffentlichungen sind eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben, Konstrukte zur Hemmung der Hexokinase zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Spinat (Wiese et al. (1999) FEBS Lett. 461, 13-18), Kartoffel (Veramendi et al. (1999) Plant Physiol. 121-134), Brassica napus (Accession No. AI352726), Capsicum annum (Accession No. AA840716), Arabidopsis (Acc. No.: U28215), weitere Sequenzen sind durch Homologiever­ gleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Hexokinase in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Neben Sense- und Antisensekonstrukten könnten auch Inhibitoren der entsprechenden Proteine eingesetzt werden. Beispiele hierfür wären die Überexpression von Invertasein­ hibitoren (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742) bzw. von Antikörper, die gegen bestimmte Proteine gerichtet sind. Beispiele für die erfolgreiche Expression von Antikörpern in Pflanzen sind in Whitelam und Cockburn (Trends in Plant Science (1996), 8, 268-272) zusammengefasst, weitere Beispiele sind der Fachliteratur zu entnehmen.
Weitere Ansätze liegen in der Kontrolle der Saccharoseisomerase-Aktivität. Die Saccharose­ isomerase-Aktivität führt, wie oben beschrieben, zur Bildung von Palatinose, was zu einer Unterversorgung der betroffenen Zellen mit Kohlenhydraten führt. Um Wachstumseinbussen zu vermeiden, wird die Saccharoseisomerase demzufolge bevorzugt zellspezifisch in den Zielzellen ausgeprägt werden. Alternativ kann die Aktivität der Saccharoseisomerase durch Expression von Inhibitoren kontrolliert werden. Für mit der Saccharoseisomerase vergleich­ bare Enzyme sind in der Natur Inhibitoren entstanden. Ein Beispiel wurde bereits oben erwähnt, die Invertase-Inhibitoren. Weitere Beispiele sind: Proteinase-Inhibitoren (z. B. in Gruden et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34, 317-323), Polygalacturonase-Inhibitoren (z. B. in Mahalingam et al. (1999) Plant Microb. Interact. 12, 490-498) und Amylase-Inhibitoren (z. B. in Grossi et al. (1997) Planta 203, 295-303). Alle diese Inhibitoren binden das Zielprotein und unterbinden dessen katalytische Aktivität. Weiterhin könnte die Saccharoseisomerase durch Antikörper kontrolliert werden, welche die Isomerase binden und damit deren Aktivität, da wo erwünscht, ausschalten.
Weiter bedarf es zur Ausführung der vorliegenden Erfindung lediglich geeigneter regulato­ rischer Sequenzen, die die Expression einer operativ verknüpfter Saccharoseisomerase-DNA- Sequenzen in den Antheren, im Tapetum und/oder in den Pollen der transformierten Pflanzen exprimieren. Auch hier kann der Fachmann geeignete Sequenzen problemlos dem Stand der Technik entnehmen. Einige für die Antheren- bzw. Pollen-spezifische Expression von kodierenden Sequenzen besonders geeignete Promotorsequenzen werden weiter unter beschrieben.
Diese gewebe- bzw. zellspezifischen Promotoren werden auch bevorzugt für Antisense- bzw. Sensekonstrukte eingesetzt, um Veränderungen des Kohlenhydratstoffwechsels mit dem Ziel, eine Unterversorgung der Pollen zu erreichen, ebenfalls auf die relevanten Gewebe zu beschränken.
Schließlich erfolgt die Herstellung chimärer Genkonstrukte, in denen Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen stehen, die eine Antheren/Tapetum/Pollen-spezifische Expression gewährleisten, mittels konventioneller Klonierungsmethoden (siehe bspw. Sambrook et al. (1989), supra).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend
  • a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
  • b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzyma­ tischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und
  • c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase ein Protein verstanden, das die Isomerisierung von Saccharose zu anderen Disacchariden katalysiert, wobei die α1→β2- glykosidische Bindung zwischen Glukose und Fruktose in der Saccharose in eine andere glykosidische Bindung zwischen zwei Monosaccharideinheiten überführt wird, insbesondere in eine α1→6-Bindung und/oder α1→α1-Bindung. Besonders bevorzugt wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase ein Protein verstanden, das zur Isomerisierung von Saccharose zu Palatinose und/oder Trehalulose befähigt ist. Dabei beträgt der Anteil von Palatinose und Trehalulose an den gesamten Disacchariden, die durch Isomerisierung von Saccharose gebildet werden ≧ 2% bevorzugt ≧ 20%, besonders bevorzugt ≧ 50% und am meisten bevorzugt ≧ 60%.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseiso­ merase kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach bekannten Verfahren synthe­ tisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989), supra) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und Saccharoseisomerase- DNA-Sequenz hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann mittels Routinetechniken falls erwünscht verschiedenartige Mutationen in die Saccharoseisomerase kodierende DNA- Sequenz einführen, wodurch es zu Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biolo­ gischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Weiterhin ist auch die Ein­ führung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Amino­ säuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regula­ tion oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen. Bevorzugt werden Mutanten hergestellt, die auf die Veränderung der enzyma­ tischen Eigenschaften abzielen, vorzugsweise auf eine Steigerung der Affinität zu Saccharose durch Erniedrigung des Km-Wertes.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
  • a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
  • b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 4 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
  • c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
  • d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
  • e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
Neben der in SEQ ID No. 4 angegebenen Saccharoseisomerase-Sequenz aus Erwinia rhapontici werden als bevorzugte DNA-Sequenzen solche eingesetzt, die eine besonders hohe Affinität zu Saccharose besitzen, also einen niedrigen Km-Wert aufweisen, z. B. die Saccharoseisomerase aus Pseudomonas mesacidophila (Km für Saccharose 19,2 mM, Nagai et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1789-1793) oder Serratia plymuthica (Km für Saccharose 63,5 mM; McAllister et al. (1990) Biotechnol. Lett. 12: 667-672).
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, supra) beschrieben sind.
DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivi­ tät einer Saccharoseisomerase kodieren, hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger DNA- Sequenzen kann dabei z. B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen erfolgen, die exakt oder im wesentlichen eine der oben erwähnten Saccharoseisomerase kodierenden Nukleotid­ sequenzen des Standes der Technik oder Teile dieser Sequenzen aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA-Sequenzen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), supra). Bei denen als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit einer der oben erwähnten DNA-Sequenzen für Saccharoseisomerase oder einem Teil einer dieser Sequenzen übereinstimmt. Die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen, deren Nukleotidsequenzen zu der einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen degeneriert ist. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u. a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA-Sequenz an die Codonpräferenz (codon usage) der Zielpflanze, also der aufgrund der spezifischen Expression der Saccharoseisomerase-DNA-Sequenz männlich sterilen Pflanze anzupassen und die Expression dadurch zu optimieren.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unter­ scheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 Prozent, insbesondere eine Identität von mindestens 60 Prozent, vorzugsweise über 80 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Deri­ vate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequen­ zen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Se­ quenzen aus anderen Organismen oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die beschriebene, für eine Saccha­ roseisomerase kodierende DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici (wie in SEQ ID No. 4 angegeben).
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend
  • a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
  • b) daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA-Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen-ATPase-Expression führt, und
  • c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Für die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen enthalte­ nen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Da die Saccharoseisomerase erfindungsgemäß in Antheren-, Tapetum- und/oder Pollengewebe zur Expression gelangen muss, kommt hier jeder Promotor in Frage, der die Expression in Antheren, Tapetum oder Pollen, sei es u. a. in Antheren, Tapetum oder Pollen oder ausschließlich in diesen Geweben, gewährleistet.
Dabei kann der Promotor so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in Antheren-, Tapetum- und/oder Pollen-spezifischem Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transfor­ mierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors kann eine zell- bzw. gewebespezifische Expression auch dadurch erreicht werden, dass die Genexpression in den Zellen bzw. Geweben, in denen sie nicht erwünscht ist, gehemmt wird, bspw. durch die Ausprägung von Antikörpern, die das Genprodukt binden und somit seine Enzymaktivität unterbinden, oder durch geeignete Inhibitoren.
Im Rahmen der Erfindung besonders geeignete Promotoren sind Antheren-, Tapetum- und/oder Pollen-spezifische Promotoren. Beispiele hierfür sind
  • - der Promotor des tap1-Gens aus Antirrhinum majus (Sommer et al. (1990) EMBO J. 9: 605-613; Sommer et al. (1991) Development, Suppl. 1: 169-176; z. B. als 2,2 kb EcoRI/BamHI-Restriktionsfragment);
  • - der Promotor des TA29-Gens (Mariani et al. (11990) Nature 347: 737-741; Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 3403; Genbank Acc. No. X52283);
  • - der Promotor des RA8-Gens aus Oryza sativa L. (Jeon et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 35-44, in dieser Veröffentlichung werden Expressionsstudien an RA8- Promotor/GUS-Konstrukten in transgenen Reispflanzen beschrieben);
  • - der Promotor des Bp19-Gens aus Brassica napus (Albani et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16: 501-513);
  • - die Promotoren der LAT52- und LAT56-Gene aus Tomate (Twell et al. (1990) Development 109: 705-713);
  • - der Promotor des BNA215-6-Gens aus Brassica campestris L. ssp. Pekinensis (Kim et al. (1997) Mol. Cells 7: 21-27, hier werden Promotor/GUS-Expressionsanalysen in transgenen Tabakpflanzen beschrieben);
  • - der Promotor des NeIF-4A8-Gens aus Nicotiaraa tabacum (Brander and Kuhlemeier (1995) Plant Mol. Biol. 27: 637-649, hier werden Promotor/GUS-Expressionsstudien beschrieben);
  • - der Promotor des Bgp1-Gens aus Brassica campestris (Xu et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 239: 58-65, hier werden Deletionskonstrukte und deren Analyse in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen beschrieben);
  • - der Promotor des APG-Gens aus A. thaliana (Roberts et al. (1993) Plant J. 3: 111-120;
  • - der Promotor des tap2-Gens aus Löwenmäulchen (Nacken et aj. (1991) FEBS Lett. 280: 155-158, die die molekulare Analyse dieses Antheren-spezifischen Gens beschreiben);
  • - die Promotoren der chiA- und chiB-Gene aus Petunie (von Tunen et al. (1990) Plant Cell 2: 393-401);
  • - der Pollen-spezifische Promotor des Bnm1-Gens aus Brassica napus (Treacy et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34: 603-611, in diesem Artikel werden Promotor/GUS- Expressionsanalysen in transgenen Rapspflanzen beschrieben);
  • - der Promotor des Bp4-Gens aus Brassica napus und der Promotor des NTM9-Gens aus Nicotiana tabacum (Custers et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35: 689-699) sind in den frühen Stadien der Pollenentwicklung aktive Promotoren; hier konnte mittels Promotor/Barnase-Fusionskonstrukten in transgenen Tabakpflanzen ein männlich steriler Phänotyp erzeugt werden;
  • - der Pollen-spezifische Promotor des ZM13-Gens aus Mais (Hamilton et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 663-669), hier wurden die zur Pollen-spezifischen Expression erforderlichen Sequenzbereiche durch Mutationsanalysen identifiziert und beschrieben;
  • - der Pollen-spezifische Promotor einer Invertase aus Kartoffel (Machray et al. (1999) "The role of invertases in plant carbohydrate partitioning and beyond", Abstracts Workshop Universität Regensburg, 3.-6. Okt. 1999; hier werden Promotor/GUS- Expressionsstudien beschrieben).
Weitere Antheren-spezifsche Gene bzw. Promotoren kann der Fachmann dem Stand der Technik, insbesondere den einschlägigen wissenschaftlichen Journalen und Gendatenbanken entnehmen. Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage mittels Routinemetho­ den weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z. B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA-Protein- Bindungsstudien, Antheren-spezifische regulatorische Nukleinsäurelemente identifizieren. Dabei wird z. B. in einem ersten Schritt aus Antherengewebe des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly(A)+-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA- Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus einem Nicht-Antherengewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondieren­ de poly(A)+-RNA-Moleküle lediglich in Antherengewebe akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Antheren- spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Antheren-spezifischer Promoto­ ren zur Verfügung. Gleiches gilt natürlich auch für Pollen- bzw. Tapetum-spezifische Promotoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antheren-spezifische Promotor der TA29- Promotor aus Tabak.
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendi­ gung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig austauschbar.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung männlich steriler Pflanzen ermöglicht. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst:
    • - regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
    • - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzyma­ tischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und
    • - operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können;
  • b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und
  • c) Regeneration transgener Pflanzen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst:
    • - regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
    • - daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA-Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen-ATPase-Expression führt, und
    • - operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können,
  • b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und
  • c) Regeneration von transgenen Pflanzen.
Des weiteren betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ moleküle, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodie­ ren, enthalten. Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfindungsgemäßes Nukle­ insäuremolekül enthalten. Die transgenen Pflanzen der Erfindung sind aufgrund der Einfüh­ rung und Expression einer eine Saccharoseisomerase kodierenden DNA-Sequenz in den Antheren männlich steril.
Sämtliche hier unter Bezugnahme auf rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, gemachten Ausführungen, sei es im Zusammenhang mit der Herstellung von Vektoren, Pflanzenzellen, Wirtszellen, transgenen Pflanzen etc. gelten auch für die anderen, oben beschriebenen Ansätze zur Veränderung des Saccharosestoffwechsels mit dem Effekt einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün­ schte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwen­ det. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und an­ schließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmetho­ de zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktions­ analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden ein­ gesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA- Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Tech­ niken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierig­ keiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen, wie bereits oben erwähnt, die Transfor­ mation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe­ ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesen­ heit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken­ bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert wer­ den, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die interme­ diären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplas­ mids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Kon­ jugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro­ bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor­ mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwen­ dung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentrans­ formation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan­ zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengel­ segmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzen­ zellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Genta­ mycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestat­ ten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selek­ tionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgenen Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach übli­ chen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, untersucht werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede belie­ bige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Raps, Getreide, Zuckerrübe, Mais, Sonnenblume und Sojabohne. Prinzipiell ist jede Nutzpflanze für die Umsetzung der Erfindung erstrebenswert, für die Hybridsysteme besonders nützlich und wertvoll sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungs­ gemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise. Die resul­ tierenden Pflanzen können normal angezogen werden. Phänotypisch unterscheiden sich die Pflanzen von Wildtyppflanzen durch den männlich sterilen Phänotyp.
Die spezifische Expression der Saccharoseisomerase in den Antheren der erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher mole­ kularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern Blot-Analyse zum Nachweise Saccharoseisomerase-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von Saccharoseisomerase-spezifischer RNA, eine Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von für Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen oder eine Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodierten Saccharose­ isomerase-Proteins. Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Saccharoseisomerase auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden.
Wie eingangs erwähnt ist neben einem System zur Erzeugung männlicher Sterilität in Pflan­ zen zusätzlich ein passendes Restorer-System wünschenswert. Im Fall der Erzeugung männ­ licher Sterilität durch Antheren-spezifische Expression von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, kann die männliche Fertilität auf folgende Weisen wiederhergestellt werden.
Zum einen können DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren, als Restorer-Gen eingesetzt werden. Die Palatinase, auch Palatinose- Hydrolase genannt, katalysiert die Spaltung des Disaccharids Palatinose in die Hexosen Fructose und Glucose. Zum anderen können zusätzlich oder alternativ zu den für eine Palatinase kodierenden DNA-Sequenzen Nukleinsäuresequenzen als Restorer-Gene eingesetzt werden, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren. Die Trehalulase, auch Trehalulose-Hydrolase genannt, katalysiert die Spaltung des Disaccharids Trehalulose ebenfalls in Fructose und Glucose.
So kann der männlich sterile Phänotyp durch die Kreuzung mit Pflanzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase exprimieren, überwunden bzw. aufgehoben werden und somit ein vollständiges Hybridsystem, einschließlich Restorer-Funktion realisiert werden.
Palatinase-Gene sind im Stand der Technik bekannt. So offenbart PCT/EP 95/00165 die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Protaminobacter rubrum sowie die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Pseudomonas mesoacidophila MX-45.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird jetzt erstmals eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici offenbart, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert. Diese Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 1 angegeben, die abge­ leitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 2 bzw. 3 angegeben.
Ferner wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici bereitgestellt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert. Die Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 7 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 8 bzw. 9 angegeben.
Im Zusammenhang mit Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen aus anderen Quellen und den Verfahren, mit denen der Fachmann solche Sequenzen isolieren bzw. herstellen kann, wird in vollem Umfang auf die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit Saccharoseisomerase- Sequenzen verwiesen. Gleiches gilt für die Herstellung von rekombinanten Nukleinsäure­ molekülen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren, für die Erzeugung von Pflanzen sowie für die Übertragung solcher Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzenzellen und die Regeneration transgener Pflanzen. Ebenso wird auf alle obigen Ausführungen zur Hybridi­ sierung, Homologie, zu Derivaten, Varianten und Fragmenten, regulatorischen Sequenzen etc. ausdrücklich Bezug genommen.
Die Erfindung betrifft somit auch die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 7 angegebenen Nukleotidsequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, sowie die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nuklein­ säuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert,
  • b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase, kodiert,
  • c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze,
wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
Für die Expression des Palatinase- bzw. Trehalulase-Gens sind natürlich die gleichen Promotoren geeignet, die für die Expression der Saccharoseisomerase nützlich sind. Die Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen können auch vorteilhaft unter Kontrolle konstitutiver Promotoren, wie bspw. dem 35S RNA-Promotor von CaMV, zur Expression gebracht werden. Sowohl die Palatinase- als auch die Trehalulase-Enzymaktivität haben per se keinen Einfluss auf die Pflanzenzellen und somit auch keinen Einfluss auf das Pflanzenwachstum, auch bei Expression in allen Geweben der transgenen Pflanze.
Bevorzugt werden solche Palatinase-DNA-Sequenzen eingesetzt, die für ein Enzym mit hoher Affinität zu Palatinose kodieren. Entsprechend werden vorzugsweise solche Trehalulase- DNA-Sequenzen eingesetzt, die für ein Enzym mit hoher Affinität zu Trehalulose kodieren.
Wie oben ausgeführt, erfordert die Bereitstellung eines Restorer-Systems, also die Wiederherstellung der Fruchtbarkeit einer transgenen männlich sterilen Pflanze, die Herstellung einer zweiten, sog. Restorer-Linie von transgenen Pflanzen. Bei dieser Restorer- Linie kann es sich also um eine Linie handeln, die eine für ein Protein mit der Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodierende DNA-Sequenz enthält. Daneben sind andere Ansätze zur Wiederherstellung der Fertilität möglich. So kann zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit in Saccharoseisomerase exprimierenden, männlich sterilen Pflanzen die Expression eines entsprechenden Saccharoseisomerase-Inhibitors in der Restorer-Linie dienen. Ein solcher Inhibitor kann z. B. ein gegen die Saccharoseisomerase gerichteter Antikörper sein, oder ein Inhibitor, wie er bspw. für Invertasen bekannt ist (Greiner et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 708-711).
In einem anderen Ansatz kann die Restorer-Linie ein gegen die Saccharoseisomerase-mRNA gerichtetes Ribozym exprimieren. Ribozyme können in der Weise hergestellt werden, dass sie eine gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonuclease-Aktivität besitzen (siehe z. B. Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11: 1525).
In einem ähnlichen Ansatz kann die Fertilität durch die Expression einer entsprechenden Antisense-RNA wiederhergestellt werden. Die Bindung der Antisense-RNA an die Ziel-RNA führt zur Inhibierung deren Translation (Paterson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4370). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung würde man also eine durch Expression der Saccharoseisomerase männlich sterile Pflanze mit einer Restorer-Linie kreuzen, in der die entsprechenden Saccharoseisomerase-Sequenzen in der Antisense- Orientierung unter Kontrolle geeigneter Promotoren stehen, so daß Antisense-Transkripte für Saccharoseisomerase entstehen. Hierdurch wird die Antheren-spezifische Sense-Expression, die den männlich sterilen Phänotyp herbeiführt, gehemmt bzw. aufgehoben, so dass männlich fertile Kreuzungsprodukte entstehen. Alternativ kann auch das Phänomen der Cosuppression in analoger Weise zur Antisense-Technik zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht die Expression der Antisense- oder Cosuppressions-RNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, dessen Aktivierung die gezielte Wiederherstellung der männlichen Fertilität erlaubt.
Eine weitere Alternative beinhaltet die Expression eines RNA-Transkriptes, welches die RNAse-P vermittelte Spaltung von Saccharoseisomerase-mRNA-Molekülen bewirkt. Bei diesem Ansatz wird eine externe Führungssequenz konstruiert, welche die endogene RNAse-P zur Saccharoseisomerase-mRNA geleitet und schließlich die Spaltung dieser mRNA vermittelt (Altman et al., US-Patent No. 5,168,053; Yuan et al. (1994) Science 263: 1269). Vorzugsweise beinhaltet die externe Führungssequenz 10 bis 15 zur Saccharoseisomerase komplementäre Nukleotide und eine 3'-NCCA-Nukleotid-Sequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die Transkripte der externen Führungssequenz binden an die Ziel-mRNA über die Ausbildung von Basenpaaren, was die Spaltung der mRNA durch die RNAse-P am Nukleotid 5' von der gepaarten Region ermöglicht.
Ein weitere Ansatz zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität sind transgene, männlich sterile Pflanzen, welche zusätzlich zu einem mit einer Promotorsequenz operativ verknüpften Saccharoseisomerase-Gen eine prokaryontische Kontrollregion in der selben Expressions­ kassette enthalten. Zusätzlich werden transgene, männlich fertile Pflanzen produziert, die ein prokaryontisches Polypeptid unter der Kontrolle eines entsprechenden Promotors exprimieren. In den F1-Hybriden bindet das prokaryontische Polypeptid an die prokaryontische Kontrollregion und reprimiert die Expression der Saccharoseisomerase. Konkret kann das LexA-Gen/LexA-Operatorsystem benutzt werden, um die Kontrolle der Genexpression zu erreichen (US-Patent No. 4,833,080; Wang et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13: 1805). Dies würde bedeuten, dass die Expressionskassette der männlich sterilen Linie die LexA-Operatorsequenz enthält, während die Expressionskassette der männlich fertilen Restorer-Linie die kodierende Region des LexA-Repressors enthält. In den F1-Hybriden bindet der LexA-Repressor an die LexA-Operatorregion und unterbindet dadurch die Transkription des Saccharoseisomerase-Gens. LexA-Operator-DNA-Moleküle können z. B. durch die Synthese von DNA-Fragmenten erhalten werden, welche dem Fachmann aus der Literatur wohl bekannte LexA-Operator-Sequenzen enthalten, so z. B. von Garriga et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 236: 125 beschrieben. DNA-Sequenzen, die für den LexA-Repressor kodieren, können z. B. durch Synthese solcher DNA-Moleküle erhalten werden oder durch DNA-Klonierungstechniken wie sie dem Fachmann bekannt sind und z. B. bei Garriga et al., vide supra, beschrieben sind. Alternativ können für den LexA-Repressor kodierende Sequenzen zum Beispiel von Plasmid pRB500 (ATTC 67758) entnommen werden.
Der im Zusammenhang mit dem LexA-Repressor/Operator-System erklärte Ansatz zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität lässt sich natürlich auch mit anderen Repressor/Operator-Systemen realisieren, wie sie dem Fachmann aus der Literatur in vielfältiger Weise bekannt sind, z. B. das Lac-Repressor/lac-Operator-System oder das trp- Repressor/trp-Operator-System.
Schließlich kann die Fertilität durch Applikation von chemischen Verbindungen oder Substanzen während der Pollenentwicklung wiederhergestellt werden, die die Saccharoseisomerase in ihrer Aktivität hemmen.
Die Erfindung basiert auf der erfolgreichen Herstellung neuer Pflanzen, die aufgrund der Ein­ führung und Expression einer für eine Saccharoseisomerase kodierende Nukleinsäuresequenz in den Antheren männlich steril sind, was in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Ver­ anschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert wird.
Beispiele
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
1. Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z. B.: Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose-Gelelek­ trophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden nach Sambrook et al. (1989, vide supra) durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobacterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al. (1975) Gen. Virol. 26: 33).
2. Erzeugung einer genomischen Bank von Erwinia rhapontici
Zur Herstellung einer genomischen Bank aus Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde chromo­ somale DNA aus den Zellen einer 50 ml-Übernachtkultur nach Standardprotokoll isoliert. Anschließend wurden ca. 300 µg der DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3A partialverdaut und auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt. Fragmente zwischen 5 und 12 kb wurden mittels Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden in BamHI-verdaute Lambda ZAP-Express-Arme (Stratagene, La Jolla, USA) ligiert und anschließend in vitro verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene, nach Herstellerangaben). E. coli-Bakterien des Stammes XL-MRF' (Stratagene) wurden mit rekombinanten Lambda-Phagen infiziert, der Titer der Bank bestimmt und schließlich die Bank amplifiziert.
3. Durchmusterung einer genomischen Bank
Zur Isolierung von genomischen Klonen wurden ca. 105 Phagen plattiert. Nach Transfer der Phagen auf Nylonfilter (Genescreen, NEN) wurden die Filter mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment hybridisiert. Positive Signale wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht und vereinzelt.
4. Bakterienstämme und Plasmide
E. coli (XL-1 Blue, XL-MRF' und XLOLR)-Bakterien wurden von der Firma Stratagene bezogen. Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikro­ organismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Deutschland) bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobacterium-Stamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan) wurde von Debleare et al. (1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777) beschrieben. Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR-Blunt (Invitrogen, Niederlande), pMAL-c2 (New England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gerne 33: 103-119) und Bin19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720) verwendet.
5. Tabaktransformation
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana taliacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentri­ fugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blatt­ scheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15: 473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1,6% Glukose und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
6. Nachweis von Palatinose in Pflanzenextrakten
Zum Nachweis von Saccharoseisomerase-Aktivität in Pflanzenextrakten wurden Blattscheiben mit einem Durchmesser von ca. 0,8 cm für 2 h bei 70°C mit 100 µl 80% Ethanol und 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) extrahiert. Für die Analyse eines Aliquots dieser Extrakte wurde ein HPLC-System der Firma Dionex verwendet, welches mit einer PA-1 (4 × 250 mm)-Säule und einem gepulsten elektrochemischen Detektor ausgestattet war. Vor der Injektion wurden die Proben für 2 Minuten bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Zucker wurden anschließend mit einem 10minütigen Gradienten von 17 bis 1 M Natriumacetat nach 4 Minuten bei 150 mM NaOH und einer Durchflussrate von 1 ml/min eluiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Zucker wurden die entsprechenden Standards der Firma Sigma verwendet.
Beispiel 1 PCR-Amplifikation eines Subfragments der Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung eines Subfragments der Saccharoseisomerase erfolgte mittels Polymerase- Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici (DSM 4484), die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 83 5'-GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und
  • - FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3',
die von einer Saccharoseisomerase-Sequenz des Standes der Technik abgeleitet wurden. Primer FB 83 umfaßt die Basen 109-127 und Primer FB 84 die Basen 1289-1306 der kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens von E. rhapontici. Das PCR-Reaktions­ gemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 µg), Primer FB 83 und FB 84 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffrr (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das amplifizierte Subfragment kann gut als Hybridisierungssonde für die Isolierung weiterer Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen aus anderen Organismen oder als Sonde bei der Analyse transgener Zellen und Pflanzen eingesetzt werden.
Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des Palatinose-Operons aus E. rhapontici
Zur Isolierung des Palatinose-Operons wurde eine genomische Bank mit einem Subfragment der Saccharoseisomerase (siehe Beispiel 1) durchmustert. Dabei wurden mehrere positive Klone isoliert. Durch vollständige Sequenzierung und Zusammensetzen dieser Klone konnten mehrere offene Leserahmen identifiziert werden, welche für Enzyme des Palatinose-Stoff­ wechsels kodieren (siehe unten stehende Übersicht der Gene des Palatinose-Operons und der dazugehörigen Genprodukte). Die untenstehende Skizze zeigt eine schematische Übersicht des klonierten Palatinose-Genclusters aus Erwinia rhapontici. Die Position der offenen Leserahmen und die Richtung der Transkription sind durch Pfeile dargestellt.
Gen
Funktion des Genprodukts
palI Saccharoseisomerase
palR Regulatorprotein der LysR-Familie
palE Palatinose-bindendes Protein, Bestandteil des ABC-Transportsystems zur Aufnahme von Palatinose in die Zelle
palF integrales Membranprotein, Permease, Bestandteil des ABC-Transportsystems
palG integrales Membranprotein, Permease, Bestandteil des ABC-Transportsystems
paHl vermutlich Hydrolaseaktivität
palK ATP-bindendes Protein, Bestandteil des ABC-Transportsystems, energetisiert Palatinose-Aufnahme in die Zelle
palQ Palatinase
palZ Trehalulase
Beispiel 3 PCR-Amplifikation einer Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des vollständingen offenen Leserasters der Saccharose-Isomerase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici (DSM 4484), die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 96 5'-GGATCCACAATGGCAACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und
  • - FB 97 5'-GTCGACCTACGTGATTAAGTTTATA-3'
für pCR-SucIso1. Primer FB 96 umfaßt die Basen 109-127 und beinhaltet zusätzlich ein Startkodon, Primer FB 97 die Basen 1786-1803 der kodierenden Region des Saccharose­ isomerase-Gens. Zur Herstellung des Konstruktes pCR-SucIso2 wurde als 5'-Primer FB 83 (5'-GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3'), welcher kein zusätzliches ATG enthält, verwendet. Zur Klonierung der amplifizierten DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 96 bzw. FB 83, BamHI; Primer FB 97, SalI. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien-DNA (1 µg), Primer FB 96 und FB 97 für pCR-SucIso1, bzw. Primer FB 83 und FB 97 für pCR-SucIso2 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das amplifizierte Saccharoseisomerase-Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR-SucIso1 (mit Translationsstart) bzw. pCR- SucIso2 (ohne Translationsstart) erhalten wurde (siehe
Abb.
1). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Saccharoseisomerase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 109-1803 des Saccharoseisomerase-Gens erstreckt. Die Nukleotidsequenz der verwendeten Primer wurde jeweils hervorgehoben. Die DNA-Sequenz ist unter SEQ ID No. 4 angegeben.
Beispiel 4 PCR-Amplifikation einer Palatinase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des vollständingen offenen Leserasters der Palatinase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 180 5'-GAGATCTTGCGCAGCACACCGCACTGG-3'
  • - FB 176 5'-GTCGACTCACAGCCTCTCAATAAG-3'
Primer FB 180 umfaßt die Basen 2-21, Primer FB 176 die Basen 1638-1656 der kodierenden Region des Palatinase-Gens. Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 180 BglII; Primer FB 176 SalI. Das PCR Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 µg), Primer FB 180 und FB 176 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR-PalQ erhalten wurde (Abb. 2). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Palatinase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 2-1656 des Palatinase- Gens erstreckt (siehe SEQ ID No. 1).
Beispiel 5 Herstellung von Plasmid p35S-cwIso
Eine DNA Sequenz, die für eine Saccharose-Isomerase kodiert, wurde aus dem Plasmid pCR- SucIso2 isoliert und mit dem 355-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzenzellen vermittelt, einem für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Gens (Proteinase-Inhibitor II-Gen aus Kartoffel (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650; Genbank Accession X04118), sowie einem pflanzlichen Terminationssignal verbunden. Dazu wurde das Saccharoseisomerase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-SucIso2 (siehe Abb. 1) über die Restriktionsschnittstellen BamHI und SalI herausgeschnitten und in einen BamHI/SalI-geöffneten pMA-Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66: 221-230) dar, welche den 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase-Inhibitors II aus Kartoffel, welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase Gens. Zwischen der Teilsequenz des Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, XbaI, SalI, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-Inhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (Abb. 3).
Das Fragment A beinhaltet den 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21: 285.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923-1059 eines Proteinase-Inhibitor II-Gens aus der Kartoffel (Keil et al., supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Saccharoseisomerase Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 109-1803 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das Endoplasma­ tische Retikulum (ER) notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Saccharoseisomerase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835), Nukleotide 11749-11939.
In p35S-cwIso (35S = 35S-Promotor, cw = Zellwand, Iso = Saccharoseisomerase) steht die kodierende Region der Saccharoseisomerase aus E. rhapontici unter konstitutiver Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Beispiel 6 Herstellung von Plasmid pTA29-cwIso
In analoger Weise wie unter Beispiel 5 beschrieben, jedoch mit der Modifikation, dass die Expression des Fusionsproteins aus Proteinase-Inhibitor-Signalpeptid und der Saccharose­ isomerase unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors TA29 aus Tabak gestellt ist, wurde das Plasmid pTA29-cwIso hergestellt. Die Funktionalität des Antheren­ spezifischen TA29-Promotors wurde bereits demonstriert (Mariani et al. (1990) Nature 347: 727-741). Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'-Ende der Polyadeny­ lierungsstelle des Octopin-Synthase-Gens. Das Plasmid pTA29-cwIso beinhaltet drei Fragmente A, B und C, die in die Schnittstellen für Restriktionsenzyme des Polylinkers von pUC18 kloniert wurden (siehe Abb. 3).
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 158 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und
  • - FB 159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3'.
Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB 158, EcoRI; Primer FB 159, Asp 718. Das PCR- Reaktionsgemisch (100µ1) enthielt genomische Tabak-DNA (2 µg), Primer FB 58 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRA und Asp 718 verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 bis 1059 eines Proteinase-Inhibitor II-Gens aus der Kartoffel (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650; Genbank Acc. No. X04118), welche über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA, TTG GG an das Saccharoseisomerase- Gen aus E. rhapontici, welches die Nukleotide 109 bis 1803 umfasst, fusioniert sind. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das ER notwendiges Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Saccharoseisomerase-Sequenz fusioniert. Das Fragment B wurde als Asp 718/SalI-Fragment aus denn oben beschriebenen Konstrukt p35S- cwIso (Beispiel 5) herausgeschnitten und zwischen die Restriktionsschnittstellen Asp 718 und SalI der Polylinkerregion von pUC 18 kloniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835), Nukleotide 11749-11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209) isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pLC 18 kloniert worden ist.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI/HindIII-Fragment zwischen die EcoRI- und HindIII-Schnittstelle des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711) kloniert.
In pTA29-cwIso (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, Iso = Saccharoseisomerase) steht die kodierende Region des Saccharoseisomerase-Gens aus E. rha­ pontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Tabakpflanzenzellen wurden wie oben beschrieben mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer mit dem Konstrukt pTA29-cwIso transformiert und ganze Tabakpflanzen wurden regeneriert. Die erhaltenen pTA29-cwIso-Transformanten zeigten einen männlich sterilen Phänotyp, ansonsten waren keine Unterschiede zum Wildtyp erkennbar.
Beispiel 7 Herstellung von Plasmid pTA29-cwPalQ
In analoger Weise wie unter Beispiel 6 beschrieben, wurde die kodierende Region der Palatinase aus E. rhapontici, fusioniert mit einem für die Aufnahme in das ER notwendigen Signalpeptid eines pflanzlichen Gens (Proteinase-Inhibitor II-Gen aus Kartoffel, Keil et al. (1986) vide supra), unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors des TA29-Gens aus Tabak gestellt. Das so erhaltene Konstrukt pTA29-cwPalQ besteht aus drei Fragmenten A, B und C (vgl. Abb. 5) und ermöglicht die Expression der Palatinase in der Zellwand von Tapetumzellen.
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 158 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und
  • - FB 159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3'.
Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB 158, EcoRI; Primer FB 159, Asp 718. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt genomische Tabak-.DNA (2 µg), Primer FB 158 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRA und Asp 718 verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923-1059 eines Proteinase-Inhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 2-1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N- terminal an die Palatinase Sequenz fusioniert.
Zur Klonierung von Fragment B wurde der Bereich des Proteinase-Inhibitor II Gens umfassend die Nukleotide 923 bis 1059 über die Restriktionsenzyme Asp 718 und BamHI aus dem pMA-Vektor isoliert und zwischen die entsprechenden Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert. Anschließend wurde das über BglII und SalI aus dem Konstrukt pCR-PalQ herausgeschnittene Palatinase-Fragment über die zu BglII kompatible BamHI-Schnittstelle mit der Sequenz des Proteinase-Inhibitors fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835), Nukleotide 11749-11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209) isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden ist.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI/HindIII-Fragment zwischen die EcoRI- und HindIII-Schnittstelle des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711) kloniert.
In pTA29-cwPalQ (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, PalQ = Palatinase) steht die kodierende Region des Palatinase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit pTA29-cwPalQ mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der pTA29-cwPalQ-Elternpflanzen.
Beispiel 8 Herstellung von Plasmid p35S-cwPalQ
Die DNA-Sequenz, die für eine Palatinase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S RNA-Promotors gebracht, wodurch das Plasmid p35S- cwpalQ entstand.
Dazu wurde das Palatinase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-palQ über die Restriktionsschnittstellen BglII und SalI herausgeschnitten und in einen BamHI/SalI geöffneten pMA-Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66: 221-230) dar, welche den 35S- Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase Inhibitors II aus Kartoffel (Keil et al. 1986, vide supra)), welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase-Gens. Zwischen der Teilsequenz der Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, XbaI, SalI, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-Inhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (siehe Abb. 5).
Das Fragment A beinhaltet den 35S RNA-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980)) Cell 21, 285.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923-1059 eines Proteinase Inhibitor II-Gens aus der Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 2-1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N- terminal an die Palatinase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939.
In p35S-cwPalQ (35S = 35S RNA-Promotor des CaMV, cw = Zellwand, PalQ = Palatinase) steht die kodierende Region des Palatinase-Gens aus E, rhapontici unter konstitutiver Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit p35S-cwPal mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der p35S­ cwPal-Elternpflanzen.
Beispiel 9 Herstellung des Plasmids pMAL-SucIso
Zur Herstellung des Plasmids pMAL-Suciso wurde das Saccharoseisomerase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-SucIso2 über die Restriktionsenzyme BamHI und SalI herausgeschnitten und in einen ebenfalls so geschnittenen pMAL-c2 Vektor (New England Biolabs) ligiert, wodurch das Konstrukt pMAL-SucIso (Abb. 4) erhalten wurde. Dieses ermöglicht eine Expression des Enzyms als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein unter der Kontrolle des durch IPTG induzierbaren tac-Promotors.
Fragment A beinhaltet den tac-Promotor, der eine durch IPTG induzierbare Genexpression ermöglicht.
Fragment B beinhaltet einen Teil des malE-Gens mit Translationsstart.
Fragment C beinhaltet die kodierende Region der Saccharoseisomerase.
Fragment D beinhaltet den rrnB-Terminator aus E. coli.
Mit pMAL-Suciso transformierte Bakterienzellen zeigen IPTG induzierbare Expression der Saccharoseisomerase aus E. rhapontici.
Beispiel 10 Funktioneller Nachweis der Saccharoseisomeraseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Saccharoseisomerase-Gens erfolgte durch Expression in E. coli. Dazu wurde das Plasmid pMAL-SucIso in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des Fusionsproteins zwischen dem Maltose-bindenden Protein und der Saccharoseisomerase erfolgte nach Herstellerangaben in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen wurde das Pellet in 1 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. Ein Aliquot des Rohextraktes wurden mit dem gleichen Volumen 600 mM Saccharose gemischt und für 24 Stunden bei 09994 00070 552 001000280000000200012000285910988300040 0002010045113 00004 0987530°C inkubiert. Zum Nachweis der entstandenen Palatinose wurde ein Aliquot des Ansatzes einer HPLC-Analyse unterzogen. Das Chromatogramm bestätigte die Produktion von Palatinose durch die rekombinante Saccharoseisomerase in E. coli.
Beispiel 11 In vivo-Nachweis der Saccharoseisomeraseaktivität in transgenen Pflanzen
Der Nachweis der in vivo-Funktionalität der Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzen wurde wie folgt durchgeführt: von 0,5 cm2 großen Blattscheiben von untransformierten Tabakpflanzen und den Transformanten 355-cwIso (aus Beispiel 5) wurden ethanolische Extrakte hergestellt und durch HPLC analysiert und die Zucker anhand der entsprechenden Standards identifiziert. Wie die Chromatogramme zeigten, führte die Expression der Saccharoseisomerase in der Zellwand zu einer substantiellen Akkumulation von Palatinose in den untersuchten p35S-cwIso-Pflanzen. Der Wildtyp enthält keine Palatinose, wie ebenfalls aus den Chromatogrammen deutlich zu erkennen war.
Beispiel 12 Funktioneller Nachweis und biochemische Charakterisierung der Palatinaseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Palatinase-Gens erfolgte durch Expression des rekombinanten Proteins in E. coli. Dazu wurde das Plasmid pQE-palQ in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden, Deutschland) in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation wurde das Pellet in 1 ml 30 mM HEPES (pH 7,5) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. 20 µl des Rohextraktes wurden mit 80 µl 100 mM Palatinose gemischt und für 40 Minuten bei 30°C inkubiert. Zum Nachweis der Palatinaseaktivität wurde in einem Aliquot des Ansatzes die freigesetzte Glucose durch einen gekoppelten optisch-enzymatischen Test bestimmt. Dabei konnte die Palatinaseaktivität des rekombinanten Enzyms eindeutig nachgewiesen werden.
In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß das Enzym seine höchste Aktivität bei einer Reaktionstemperatur von 30°C und einem pH von 7,0 entfaltet. Bei der Untersuchung der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration konnte ein Km- Wert für Palatinose von 10 mM und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 90 mM Palatinose bestimmt werden.
Beispiel 13 PCR-Amplifikation einer Trehalulase aus Erwinia rhapontici
Die Klonierung des vollständigen offenen Leserasters der Trehalulase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 184 5'-GGGATCCGTGCAAACTGGTt3GAAAGAG-3'
  • - FB 185 5'-GTCGACTTACCGCTGATAAATTTGTGC-3'
Die Primer FB 184 und FB 185 umfassen die Basen 4-23 bzw. 1638-1659 der kodierenden Region des Trehalulase-Gens.
Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB 96 bzw. FB 184: BamHI; Primer FB 185: SalI. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 µg), Primer FB 184 und FB 185 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit BamHI und SalI verdaut und das Fragment in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR-PalZ erhalten wurde (siehe Abb. 6). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Trehalulase aus E rhapontici, die sich von Nukleotid 4-1659 des Trehalulase Gens erstreckt.
Beispiel 14 Herstellung des Plasmids pTA29-cwPalZ
In analoger Verfahrensweise wie unter Beispiel 7 beschrieben, wurde die kodierende Region des Trehalulase-Gens aus Erwinia rhapontici, fusioniert mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase-Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. (1986), vide supra), unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors des TA-29 Gens aus Tabak gestellt. Das so erhaltene Konstrukt TA29-cwPalZ besteht aus drei Fragmenten A, B und C (siehe Abb. 3) und ermöglicht die Expression der Trehalulase in der Zellwand von Tapetumzellen.
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacam Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
  • - FB 158 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und
  • - FB 159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3'.
Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB 158, EcoRI, Primer FB 159, Asp 718. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 µl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 µg), Primer FB 158 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase Reaktionspuffer (10 µl, Stratagene), 200 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für S min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Asp 718 verdaut und in die entsprechenden Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 ligiert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923-1059 eines Proteinase-Inhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solarnum tuberosam) (Keil et al (1986), vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Trehalulase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 4-1659 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendiges Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Trehalulase-Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMB0 J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939, welches als PvuII-HindIII Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 209) isoliert worden ist und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen SphI-HindIII Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert war.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI-HindLII-Fragment zwischen die EcoRIHindIII-Schnittstellen des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucleic Acid Res. 12, 8711) kloniert.
In pTA29-cwPalZ (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, PalZ = Trehalulase) steht die kodierende Region des Trehalulase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit pTA29-cwPalZ mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der pTA29-cwPalZ-Elternpflanzen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (24)

1. Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung in transgenen Pflanzen durch Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels, insbesondere des Saccharosestoffwechsels, in den Antheren der transgenen Pflanzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels derart ist, dass es zu einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten, insbesondere Saccharose und Hexosen, kommt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Veränderung des Kohlenhydrat­ stoffwechsels zu einem männlich sterilen Phänotyp der transgenen Pflanzen führt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst:
    • - regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
    • - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzyma­ tischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und
    • - operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können;
  • b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und
  • c) Regeneration transgener Pflanzen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst:
    • - regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
    • - daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA-Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen-ATPase-Expression führt, und
    • - operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können,
  • a) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und
  • b) Regeneration transgener Pflanzen.
6. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend
  • a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors;
  • b) operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und
  • c) operativ damit verknüpft regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
7. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, worin die DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici stammt.
8. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 oder 7, worin der Promotor der T29-Promotor ist.
9. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
10. Mikroorganismus, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
11. Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 9 auf Pflanzenzellen.
12. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 11.
13. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 12 oder hergestellt nach Anspruch 11, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
14. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen.
15. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici oder Teile dieser DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren.
16. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, worin die DNA-Sequenz die in SEQ ID No. 1 angegebene ist.
17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
18. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici oder Teile dieser DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren.
19. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 18, worin die DNA-Sequenz die in SEQ ID No. 7 angegebene ist.
20. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
21. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert,
  • b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert,
  • c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze,
wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
22. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert,
  • b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Saccharoseisomerase-Inhibitors kodiert,
  • c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze,
wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
23. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert,
  • b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein gegen Saccharoseisomerase-mRNA gerichtetes Ribozym kodiert,
  • c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze,
wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
24. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert,
  • b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Saccharoseisomerase-Antisense- oder Sense-RNA kodiert,
  • c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze,
    wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
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