DE69333079T2

DE69333079T2 - Expressionskassette und plasmid für eine expression spezifisch für schliesszellen und ihre verwendung zur einführung in transgene pflanzenzellen und pflanzen

Info

Publication number: DE69333079T2
Application number: DE69333079T
Authority: DE
Inventors: Bernd Müller-Röber; Uwe Sonnewald; Lothar Willmitzer
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1993-03-03
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2013-03-04
Also published as: ES2197148T3; US5538879A; AU3630493A; HU9303138D0; WO1993018169A2; IL104933A0; DE4207358A1; ATE244764T1; WO1993018169A3; DE69333079D1; EP0584324B1; AU671099B2; EP0584324A1; HUT67084A; US20020090726A1; US20030093839A1; CA2112800A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionskassette und Plasmide enthaltend diese Expressionskassette. Die DNA-Sequenz der Expressionskassette enthält eine transkriptional regulatorische Starter-Region, die eine spezifische Genexpression in den Schließzellen der Blätter von Pflanzen sicherstellt, und keine Expression in Mesophyllzellen oder epidermalen Zellen der Blätter vermittelt. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die Sequenzen der Expressionskassette enthalten, sowie die Verwendung der Plasmide, enthaltend die Expressionskassette, zur Herstellung transgener Pflanzen.
Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf, der aus dem stetigen Wachstum der Weltbevölkerung resultiert, ist es in zunehmenden Maße Aufgabe der biotechnologischen Forschung, sich wegen der langfristig abzusehenden Limitation von Anbauflächen um die Produktion ertragreicher, ökologisch unbedenklicher Nutzpflanzen zu bemühen. Hierzu muss der Metabolismus der Pflanzen manipuliert werden. Dies kann u. a. durch die Veränderung der im Zellkern enthaltenen DNA hervorgerufen werden. Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. z. B. Fraley, R. T. (1989) Science 244: 1293–1299; und Potrykus (1991) Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42: 205–225).
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Transpirationsvorgänge und den Gasaustausch einer Pflanze im Hinblick auf eine Ertragssteigerung durch Manipulation von Genen, die spezifisch in Schließzellen exprimiert werden, zu beeinflussen. Dies ist unter Ausnutzung bekannter Expressionssysteme wegen der weitreichenden Konsequenzen einer nicht schließzellenspezifischen Genexpression für den Gesamtstoffwechsel der Pflanze nicht praktikabel. Eine Steigerung des Ertrags von Nutzpflanzen kann dadurch erreicht werden, dass die Photosyntheseleistung von Pflanzen verändert wird, oder der Wasserverbrauch verringert wird. Hierfür sind die Schließzellen der Epidermis von Blattgeweben ein günstiger Ansatzpunkt.
Schließzellen sind spezifische, bohnenförmige Zellen der Epidermen der oberirdischen, von Luft umgebenen grünen Teile höherer Pflanzen, die paarweise angeordnet sind und zwischen einander eine Lücke (einen Spalt) freilassen. Der Spalt unterbricht die sonst lückenlose Schicht der Epidermiszellen und stellt auf diese Weise die Verbindung zwischen der Außenluft und dem Intercellularensystem her. Bei den meisten Pflanzen nimmt das Porenareal bei geöffneten Spalten etwa 0,5 bis 1,5% der Blattfläche ein. Infolge ihres besonderen Baus können Schließzellen ihre Gestalt durch aktive Turgorveränderungen so regulieren, dass sich der Spalt zwischen ihnen schließt oder öffnet. Die Spaltöffnungen sind also Regulatoren des Gaswechsels, insbesondere der Transpiration. Die Schließzellen haben somit die Aufgabe, den Diffusionswiderstand so zu regulieren, dass der Wasserverlust durch die Transpiration und die CO₂-Aufnahme für die photosynthetische oder die Dunkel-CO₂-Fixierung in einem den jeweiligen Bedürfnissen angepassten Verhältnis stehen. Das Öffnen und Schließen der Schließzellen ist auf eine Veränderung des Turgors in den Schließzellen selbst und damit auf den Aufbau einer Differenz des Turgors in den Schließzellen zu den angrenzenden Epidermiszellen (Nebenzellen) zurückzuführen.
Schließzellen regulieren über den Gasaustausch Kohlendioxidaufnahme und Transpiration (Abgabe von Wasserdampf). Bestandteil des Regelkreises ist neben der Kohlendioxidkonzentration und den Phytohormonen die Konzentration an gelösten Stoffen, da diese über Turgorveränderungen zum Öffnen bzw. Schließen der Spalte führen. Da Veränderungen der Konzentration an gelösten Stoffen weitreichende Konsequenzen für den Metabolismus der Pflanze haben, wenn sie in allen Geweben oder Zellen geschehen, ist es wünschenswert, diese Veränderungen nur in Teilbereichen der Pflanze oder während eines bestimmten Zeitabschnitts im Pflanzenwachstumszyklus zu erlauben. Insbesondere sollte eine den Gasaustausch beeinflussende Veränderung des Kohlendioxid- oder auch des Gehalts an osmotisch aktiven Substanzen von Schließzellen unabhängig von der Konzentration dieser Substanzen in Mesophyllzellen möglich sein. Daher besteht ein großes Interesse an der Identifikation und der wirtschaftlichen Nutzbarkeit der für die spezifische Transkription in Schließzellen verantwortlichen regulatorischen DNA-Sequenzen des Pflanzengenoms.
Mit Hilfe schließzellenspezifischer regulatorischer Sequenzen kann durch Expression geeigneter, neu eingeführter Gene oder durch Modulation endogener Genprodukte ein permanentes Öffnen oder Schließen bzw. eine Verlängerung oder Verkürzung der Öffnungsperioden von Schließzellen herbeigeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein schließzellenspezifisches Expressionssystem zur Verfügung, mit dem derartige Eingriffe möglich sind.
Dauerndes Offenhalten der Schließzellen sollte wegen einer vermehrten Transpiration zu einem hohen Wasserverlust in den Pflanzen führen, kann aber beispielsweise in späten Phasen des Wachstumszyklus' zur Beschleunigung des Abreifens von Kulturpflanzen wünschenswert sein. Darüber hinaus kann an die Produktion stark transpirationsaktiver Pflanzen zum Zwecke einer kontrollierten Trockenlegung von Böden gedacht werden. Oberflächlich wurzelnde Pflanzen können dabei über eine Absenkung der Wärmekapazität des Bodens eine jahreszeitlich frühere Erwärmung der Nutzflächen bewirken und so eine frühere Ernte von temperaturempfindlichen Kulturpflanzen wie z. B. der Zuckerrübe ermöglichen. Da die zunächst eingebrachten genetisch veränderten Hilfspflanzen in den weiteren Phasen des Wachstumszyklus benachteiligt sind, führen sie nicht zu einer Behinderung der Entwicklung der Nutzpflanzen, sondern im Gegenteil durch eine Ausdehnung der Vegetationsphase zu einer Ertragssteigerung.
Ein weitgehendes Geschlossenhalten der Spaltöffnungen würde durch einen verminderten Gasaustausch ein verlangsamtes Wachstum und infolgedessen eine zeitliche Ausdehnung der Vegetationsphase bewirken. Dies kann bei Zierpflanzen von Interesse sein. Weiterhin können landwirtschaftliche Hilfspflanzen produziert werden, die als transpirationsschwache Bodendecker eine Erosion der Nutzfläche in Ruhephasen oder zu Beginn der Vegetationsphase von Kulturpflanzen verhindern.
Eine Veränderung der Öffnungsperioden der Spalten erweist sich bei Kulturpflanzen als günstig. Beispielsweise kann bei grün geernteten Arten, insbesondere bei Futterpflanzen, durch Rückhalten des Wassers die Austrocknung älteren Blattmaterials ver hindert und so der Ertrag gesteigert werden. Ferner ist an eine Adaption an Standorte mit erhöhter atmosphärischer Kohlendioxidkonzentration (z. B. CO₂-Begasung in Gewächshäusern) zu denken. Durch ein künstliches Verlängern der Öffnungsperiode können Effekte wie Mineralstoffunterversorgung bei reduziertem Transpirationsstrom infolge hoher Kohlendioxid-Partialdrücke in der Pflanze kompensiert werden.
Durch Kombination schließzellenspezifischer Regulatorelemente mit anderen Regelkreisen können weitere Anwendungsmöglichkeiten entstehen. Beispielsweise kann durch eine Koppelung an chemische Sensoren ein von außen induziertes Schließen der Spaltöffnungen bewirkt und so z. B. ein Wachstumsstop von bestimmten Nutzpflanzen, den sogenannten "landwirtschaftlichen Hilfspflanzen", zu jedem gewünschten Zeitpunkt ausgelöst werden.
Um regulatorische DNA-Sequenzen zu bestimmen, muss man zunächst nach Produkten suchen, die nur zu einer bestimmten Zeit im Zellwachstumszyklus oder in einem bestimmten Teil der Pflanze, wie hier in den Schließzellen, erscheinen. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine gründliche Untersuchung der Sequenz und vor allem die Identifikation und Isolation der gewünschten transkriptional regulatorischen Regionen erforderlich. Anschließend müssen geeignete Modelle erstellt werden, deren Validität durch Versuche nachgewiesen werden muss.
Es wird nun eine Expressionskassette bereitgestellt, enthaltend eine DNA-Sequenz mit einer transkriptional regulatorischen Starter-Region, die eine schließzellenspezifische Genexpression gemäß Anspruch 1 sicherstellt, die keine Expression in Mesophyllzellen oder Epidermiszellen der Blätter vermittelt. Mit der Expressionskassette wird eine Genmanipulation von Pflanzen möglich, die ein permanentes Öffnen oder Schließen der eine Verlän gerung oder Verkürzung der Öffnungsperiode der Schließzellen bewirkt.
Die DNA-Sequenz der Expressionskassette enthält die transkriptional regulatorische Starter-Region für eine schließzellenspezifische Genexpression.
Auf der Expressionskassette gemäß Anspruch 1 ist die DNA-Sequenz des schließzellenspezifischen Promotors mit der Sequenz (Seq. ID No. 1) lokalisiert:
Pflanzenzellen, die eine regulatorische Region für eine schließzellenspezifische Genexpression enthalten, können nach folgendem Verfahren hergestellt werden:

a) Isolation des Klons GS6-11 wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben. Der Klon enthält ein etwa 12 kb großes DNA-Fragment, das ein schließzellenspezifisches Regulatorelement enthält (vgl. 1).
b) Herstellung des Plasmids pSF-6 entsprechend Beispiel 3 unter Verwendung des etwa 12 kb großen SalI-Fragments des Klons GS6-11.
c) Herstellung des Plasmids pH 6-1 unter Verwendung des etwa 5,3 kb großen HincII-Fragments des Plasmids pSF-6 entsprechend Beispiel 3.
d) Herstellung des Plasmids pAS (DSM 6906), pAS-GUS (DSM 6907) und/oder pS1-D4GUS unter Verwendung des etwa 3,2 kb großen HincII/BglII-Fragments der regulatorischen Starter-Region des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens aus Solanum tuberosum aus dem Plasmid pH 6-1 (Beispiel 3). Das Plasmid pAS-GUS enthält zusätzlich zur Sequenz des Plasmids pAS die kodierende Region des β-Glucuronidase-Gens.
e) Transfer der T-DNA des Plasmids pAS (DSM 6906), pAS-GUS (DSM 6907) und/oder pS1-D4GUS in eine Pflanzenzelle.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion oder die Elektroporation von DNA etc.. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vekto ren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen linker oder polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181–187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Die Plasmide pAS und pAS-GUS haben eine Größe von etwa 13,3 bzw. etwa 15,2 kb und enthalten das etwa 2,0 kb große Kanamycinresistenz-Gen, das etwa 3,2 kb große HincII/BglII-Promotorfragment der regulatorischen Starter-Region des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 aus Solanum tuberosum, einen Linker und einen Transkriptions-Terminator des Nopalin-Synthase-Gens. Das Plasmid pAS-GUS enthält zusätzlich das etwa 2 kb große β-Glucuronidase-Gen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marken beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw.. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode werden im Allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, Elektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit einer anderen DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder unterschiedlichen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen verbunden werden.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516 ; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdruckerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277–287 beschrieben worden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält norma lerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind. Als Wirtspflanze für die schließzellenspezifische Expression sind alle Pflanzenspezies, insbesondere Kulturpflanzenspezies, geeignet.
Geeignete Kulturpflanzenspezies sind z. B. Kartoffel, Tabak, Tomate und Zuckerrübe, aber auch Spezies, die als landwirtschaftliche Hilfspflanzen verwendbar sind, z. B. stickstoffliefernde Kulturpflanzen.
Der in der erfindungsgemäßen Expressionskassette enthaltenen DNA-Sequenz können weitere DNA-Sequenzen nachgeschaltet werden, die die Information für die Bildung und mengenmäßige Verteilung endogener Produkte oder die Bildung heterologer Expressionsprodukte in Kulturpflanzen enthalten.
Endogene Expressionsprodukte sind z. B. Phytohormone, Kohlenhydrate oder andere Metabolite. Heterologe Produkte sind z. B. in Pflanzen natürlicherweise nicht gebildete Kohlenhydrate oder Enzyme zur Freisetzung von Substanzen mit Phytohormonwirkung aus Vorstufen, die in Pflanzen natürlicherweise nicht in Phytohormone umgesetzt werden.
Die DNA-Sequenzen, die der regulatorischen Sequenz der Expressionskassette nachgeschaltet werden können, dürfen alle möglichen offenen Leseraster für ein bevorzugtes Peptid sowie ein oder mehrere Introns enthalten. Als Beispiele seien genannt: Sequenzen für Enzyme, Sequenzen die komplementär

a) zu einer Genomsequenz sind, wobei die Genomsequenz ein offenes Leseraster sein darf;
b) zu einem Intron;
c) zu einer nicht kodierenden Leitsequenz;
d) zu jeder Sequenz, die, komplementär in das Genom integriert, die Transkription, mRNA-Verarbeitungen (z. B. Splicing) oder die Translation inhibiert.

Die gewünschte DNA-Sequenz kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im Allgemeinen werden synthetische DNA-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine DNA-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise sollten die Transkriptionsstart- und Terminations-Regionen in Transkriptionsrichtung durch einen Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im Allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der transkriptionale Startbereich kann sowohl nativ und/oder homolog als auch fremdartig und/oder heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung eine für die Pflanze repräsentative Region für die Transkriptionsinitiation, eine bevorzugte Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind vorzugsweise gegeneinander austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, durchgeführt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt-ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zur Durchführung der verschiedenen Stufen ist für eine Vergrößerung der DNA-Menge und für die DNA-Analyse, die der Sicherstellung der erwarteten Erfolge der Eingriffe dient, eine Klonierung erforderlich.
Für die Einführung fremder Gene in die Pflanze, unter Ausnutzung der schließzellenspezifischen regulatorischen Sequenz, steht eine Vielzahl von Möglichkeiten offen, besonders interessant ist jedoch die Expression von Genen, die die Regulation der Schließzellen in Bezug auf den Gasaustausch sowie die Abgabe von Wasserdampf (Transpiration) verändern.
Für die Expression derartiger Gene ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette besonders günstig.
Eine Modifikation der Schließzellen mit Auswirkungen auf den Öffnungszustand der Stomata lässt sich auf zwei Wegen erreichen: durch eine Modulation des Gehalts an endogenen, in den Schließzellen vorhandenen Proteinen, Enzymen, carriern, oder "Pumpen", die Metabolite durch Membranen transportieren; oder durch Transfer und Expression von Genen homologen oder heterologen oder synthetischen Ursprungs, die Proteine, Enzyme, carrier oder "Pumpen" kodieren, die nicht zur normalen Ausstattung einer Schließzelle gehören, aber deren Aktivität oder Vorhandensein den Zustand der Zelle bezüglich der Öffnung der Stomata beeinflussen.
An der Regulation der Transpiration sind drei Sensorsysteme beteiligt: Sensoren zur Messung der Kohlendioxidkonzentration, Phytohormonsensoren und ein Meßsystem für Turgorgradienten zwischen Schließzellen und angrenzenden Epidermiszellen. Turgoränderungen sind beispielsweise durch Beeinflussung der Aktiviträt von Enzymen oder Transportsystemen des Kohlenhydratmetabolismus möglich. Neben einer direkten Veränderung der Konzentration osmotisch aktiver Kohlenhydrate, z. B. mittels cytosolischer oder vakuolärer Invertasen oder des chloroplasitdären Triosephosphattranslokators, sind Konsequenzen für die Osmoregulation durch eine Anreicherung oder Reduktion von Vorläufern osmotisch aktiver Substanzen zu erwarten. Beispielsweise mit einer Modifikation der ADP-Glucose-Pyrophosphorylaseaktivität kann die Stärkesynthese beeinflusst und so die Menge an Substraten für Glykolyse und Citratzyklus verändert werden, wodurch letztlich die Kon zentration des Malats, einer bezüglich des Zellturgors wichtigen Substanz, betroffen wird. Eine Steigerung der apoplastischen Invertaseaktivität bei Schließzellen könnte über eine vermehrte Aufnahme von Hexosen die Stärkekonzentration erhöhen. Ein derartiger Eingriff muss schließzellenspezifisch erfolgen, da eine Erhöhung der apoplastischen Invertaseaktivität in den stark photosyntheseaktiven Mesophyllzellen zu einer Reduktion des Assimilattransports und damit zu einer hohen osmotischen Belastung des Gewebes führt (vgl. Schaewen et al. (1990) EMBO J. 9: 3033– 3044). Ferner kann an die Steigerung der Expression oder die Expression einer veränderten Phosphoenolpyruvatcarboxylase gedacht werden. Das Enzym katalysiert die Reaktion von Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat, das wiederum ein Vorläufer für Malat ist. Außerdem können Protonenpumpen (Protonen-ATPasen), die über die Bereitstellung elektrochemischer Gradienten Ionentransportprozesse ermöglichen, zu einer Veränderung des osmotischen Potentials beitragen.
Weitere Zugriffsmöglichkeiten ergeben sich bei der Aktivität der Carbonat-Dehydratase, die das Gleichgewicht zwischen gelöstem Kohlendioxid und Carbonat einstellt, insofern also die zelluläre Kohlendioxidkonzentration beeinflusst; aber auch beispielsweise bei der Fruktosebisphosphatase, die als Enzym aus dem regenerativen Abschnitt des Calvinzyklus an der Fixierung des Kohlendioxids beteiligt ist.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette lässt sich auch zur schließzellenspezifischen Expression von Genen nutzen, die den Phytohormonspiegel der Pflanze regulieren.
Lokale Änderungen des Phytohormonspiegels sind zur Beeinflussung der Eigenschaften von Schließzellen besonders interessant: während z. B. Auxine ein Öffnen der Spalten bewirken, führt Applikation von Abscisinsäure zu einem raschen Spaltenschluss. Zahlrei che Gene, deren Produkte in den Hormonhaushalt der Pflanze eingreifen, sind bereits kloniert worden (vgl. u. a. Klee, H. & Estelle, M. (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 529–551). Die Gene 1 und 2 der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens kodieren für Auxinsynthese-Enzyme, während die Indolacetat-Lysin-Synthetase (Romano et al. (1991) Genes & Development 5: 438–446) die Inaktivierung von Auxinen katalysiert. Cytokinine werden durch eine vom rol c Gen der T-DNA von Agrobacterium rhizogenes kodierte Glukosidase freigesetzt (Estruch et al. (1991) EMBO J 10: 3125–3128); das Genprodukt des T-DNA Gens 6b von A. tumefaciens reduziert Cytokininaktivität (Spanier et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 219: 209–216). Ethylenproduktion kann in Pflanzen durch Expression der Aminocyclopropancarboxylat-Synthase angeregt werden (Huang et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Science 88: 7021–7025); eine Inhibition der Aminocyclopropancarboxylat-Oxidase durch Expression von antisense-RNA senkt dagegen die Ethylenfreisetzung.
Wegen der weitreichenden Konsequenzen der Hormonwirkungen für die Pflanze ist eine Beeinflussung der Schließzellenaktivität auf dem beschriebenen Weg nur unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette für eine schließzellenspezifische Genexpression durchführbar.
Verfahren zur Verringerung der Aktivität und/oder der Menge eines bestimmten Enzyms sind gängiger Stand der Technik. Hierzu wird ein in der Regel chimäres Gen in die Pflanze eingeführt. Es besteht aus einem in der Pflanze aktiven Promotor, einer in der antisense-Richtung an den Promotor angehefteten kodierenden Sequenz des Enzyms, dessen Aktivität zu verringern ist (3'-Ende der kodierenden Sequenz am 3'-Ende des Promotors), und einem in Pflanzen funktionalen Terminationssignal für die Transkription. Zur Einführung derartiger Gene in Pflanzenzellen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Aus den transformierten Zel len können intakte transgene Pflanzen regeneriert werden, unter denen solche mit dem gewünschten Phänotyp (Verringerung der Aktivität des Zielenzyms) ermittelt werden müssen.
Die Identifikation brauchbarer transkriptionaler Startbereiche kann auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden. Man bedient sich hier in der Regel der mRNA, die aus bestimmten Teilen der Pflanze (hier Schließzellen) isoliert worden ist (s. auch Beispiel 1). Zur zusätzlichen Konzentrationssteigerung der für das Gewebe oder den pflanzlichen Zustand charakteristischen mRNA kann cDNA präpariert werden, wobei unspezifische cDNA an der mRNA oder der DNA aus anderen Geweben (Mesophyllzellen) oder Pflanzenzuständen angeheftet werden kann. Die restliche cDNA kann dann für die Sondierung des Genoms der Komplementärsequenzen, unter Benutzung einer geeigneten Pflanzen-DNA-Bibliothek, verwendet werden.
Wo ein in spezifischen Zell- oder Gewebetypen auftretendes Protein isoliert ist oder isoliert wird, kann es partiell sequenziert werden, so dass eine Sonde zur direkten Identifikation der entsprechenden Sequenzen in einer Pflanzen-DNA-Bibliothek hergestellt werden kann (vgl. Beispiel 2). Anschließend können die Sequenzen, die mit der Sonde hybridisieren, isoliert und manipuliert werden. Ferner kann der nicht translatierte 5'-Bereich, der mit dem kodierenden Bereich assoziiert ist, isoliert und in Expressionskassetten auf transkriptionale Aktivität hin untersucht werden.
Die gewonnenen Expressionskassetten, die die nicht übersetzte 5'-Region verwenden, können in Pflanzen transformiert werden (siehe oben), wo ihre Funktionalität als transkriptionale Regulatoren in Verbindung mit einem heterologen Strukturgen (anders als das offene Leseraster des Wildtypgens, das mit der nicht übersetzten 5'-Region assoziiert ist), sowie die Schließzel lenspezifität überprüft werden kann. Auf diese Weise können Sequenzen, die für die schließzellenspezifische Transkription notwendig sind, identifiziert werden.
Am 13.02.1992 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid pAS (DSM 6906);
Plasmid pAS-GUS (DSM 6907).
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Restriktionskarte des genomischen Klons GS6-11, der die S-Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum kodiert. Über der Restriktionskarte sind die Bezeichnungen der Gene des Phagen Lambda angegeben sowie ein Maßstab zur Beurteilung der Länge der DNA-Sequenz in Kilo-Basen (kb).
2 zeigt die Promotor-GUS-Fusion des Plasmids pAS-GUS, das die Nukleinsäuresequenz eines Teils der für die transkriptionale Regulation wichtigen Bereiche des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 enthält, die auch im Plasmid pAS enthalten ist. ATG bezeichnet den Translationsstart für die β-Glucuronidase. Die BglII Schnittstelle, an der der Klon pH 6-1 gespalten und mit dem an der SmaI Schnittstelle linearisierten Plasmid puc 19 verbunden wurde, ist angegeben. Die Sequenz bis zur BamHI Schnittstelle stammt aus dem Polylinker von pUC 19, die folgenden Nukleotide aus dem Plasmid pBI101.1 (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387–405). Hervorgehoben ist der mit der cDNA korrespondierende Bereich (fett). Die beiden ersten Codons der β-Glucuronidase sind eingerahmt. Eine Sequenz, die möglicherweise eine Hogness-Box darstellt, ist unterstrichen.
3 zeigt das etwa 13,2 kb große Plasmid pAS. Es enthält das etwa 2,0 kb große Kanamycin-Resistenz-Gen als Bestandteil des Ausgangsvektors pBIN 19 (Bevan, M. (1984) Nucl. Acid Res. 12: 8711–8721), den etwa 3,2 kb großen regulatorischen Bereich für eine schließzellenspezifische Genexpression aus dem ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gen von Solanum tuberosum aus dem Klon GS6-11 (A), insertiert zwischen Nukleotidposition (nt) 2525 und 2544 von pBIN 19 sowie den Transkriptionsterminator aus dem Nopalinsynthase-Gen (C), insertiert bei nt 2494 von pBIN 19.
A = Fragment A (etwa 3,2 kb) enthält:
nt 400–414 aus pUC 19
etwa 3,2 kb aus GS6-11
nt 415–421 aus pUC 19
C = Fragment C (192 pb): enthält nt 11749–11939 aus pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835–846).
4 zeigt das etwa 15,2 kb große Plasmid pAS-GUS, das ein Derivat von pBI101.1 (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387–405) ist. Das Plasmid pBI101.1 wiederum ist ein Derivat von pBIN 19, das an nt 2534 eine Insertion von 1,87 kb der kodierenden Region der β-Glucuronidase enthält (B). Plasmid pAS-GUS unterscheidet sich von pAS durch eben diese Insertion. Im Einzelnen enthält pAS-GUS folgende Fragmente:
A = Fragment A (etwa 3,2 kb), enthält:
nt 400–414 aus pUC 19
etwa 3,2 kb aus GS6-11
nt 415–421 aus pUC
B = Fragment B (1,87 kb): kodierende Region der β-Glucuronidase
C = Fragment C (192 bp), enthält: nt 11749–11939 aus pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835–846).
5 zeigt die Expression der β-Glucuronidase im Blatt von mit dem Plasmid pAS-GUS transformierten transgenen Kartoffelpflanzen. Es ist eindeutig zu ersehen, dass keine Expression in den Mesophyllzellen und den Epidermiszellen nachweisbar ist, aber eine spezifische Expression in den Schließzellen.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrunde liegenden Beispiele wird vorab eine Aufstellung aller für die Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben.
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC 18/19 und M13mp10 Serien (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103–119) verwendet, sowie der Vektor EMBL 3 (Frischauf et al. (1983) J. Mol. Biol. 170: 827–842).
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN 19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8720) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die pUC- und M13 mP-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 24: 6342–6346) oder TB1 benutzt.
Für den Vektor BIN 19 wurde ausschließlich der E. coli-Stamm TB1 benutzt. TB1 ist ein rekombinations-negatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103–119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F'(traD36, proAB, LacI, LacZΔM15), Δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1::Tn10(TcR).
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacteriem tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8720; BIN 19 Derivat) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobacteriem tumefaciens
Bei BIN 19-Derivaten erfolgte der Transfer der DNA in die Agrobacterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978), 163: 181– 187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobacterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7: 1513–1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Pflanzentransformation
Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30–50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacteriem tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3–5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
Die Isolation genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers & Bendich (Plant Mol. Biol. (1985) 5: 69–76). Mit Hilfe von "Southern Blot"-Analysen wurden 10–20 μg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung auf Integration der einzuführenden DNA-Sequenzen hin untersucht.
6. β-Glucuronidase-Aktivitätstest (GUS-Assay)
Die β-Glucuronidase ist ein bakterielles Enzym, das β-Glucuronide hydrolysiert und sowohl quantitativen als auch histochemischen Aktivitätsbestimmungen zugänglich ist. Aktivitätsmessungen wurden nach Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901–3907 durchgeführt. Gewebeproben wurden in 1 mM X-Gluc, 50 mM Na-Phosphat pH 7,0 und 0,1% Tween 20 bis zu gewünschter Intensität der Blaufärbung inkubiert.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Expressionskassette, deren DNA-Sequenz eine regulatorische Sequenz für eine schließzellenspezifische Genexpression enthält. Ferner wird die Einführung der Sequenz in ein Plasmid erläutert, mit dem eine Transformation von Pflanzenzellen möglich ist, sowie die Transformation von Pflanzenzellen, die Regeneration von transgenen Pflanzen und die Untersuchung der Funktion der Expressionskassette in transgenen Pflanzen.
Beispiel 1
Klonierung und Strukturanalyse eines ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens aus Solanum tuberosum
cDNA-Klone, die für die S-Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase der Kartoffel kodieren, wurden aus der Kartoffel-Varietät "Desiree" isoliert und sequenziert (Müller-Röber et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 136–146; EP 455 316 ). Diese cDNA-Klone dienten dazu, einen homologen, genomischen ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Klon aus der Kartoffel-Varietät AM 80/5793 (Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln) zu isolieren.
Beispiel 2
Klonierung, Identifikation und Primärstrutkur eines ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens als Fragment genomischer DNA von Solanum tuberosum
Eine genomische Bibliothek der nukleären DNA aus der Kartoffel-Varietät AM 80/5793, die im vom Lambda-Phagen abgeleiteten Vektor EMBL 3 etabliert worden war, wurde mit Hilfe der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase cDNA S25-1 (vgl. Beispiel 1) sondiert. Mehrere unabhängige Klone wurden erhalten, von denen der Klon GS6-11 für die weiteren Arbeiten verwendet wurde. Die Restriktionskarte des Klons GS6-11 ist in 1 wiedergegeben. Ein Teil des Gens wurde sequenziert, die Sequenz ist in 2 wiedergegeben.
Beispiel 3
Identifikation der für die schließzellenspezifische Expression des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens verantwortlichen regulatorischen Bereiche
Die mehr als 12 kbp große SalI-Insertion des genomischen Klons GS6-11 wurde in die SalI-Schnittstelle des Vektors pUC 19 kloniert und ergab das Plasmid SF-6. Ein etwa 5,3 kbp langes HincII-Fragment des Plasmids SF-6 wurde in die HincII-Schnittstelle des Vektors pUC 19 subkloniert und ergab das Plasmid pH6-1. Das etwa 3,2 kpb lange HincII/BglII des Plasmids ph6-1 wurde nach Auffüllen der BglII-Schnittstelle in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pUC 19 kloniert. Dabei wurde das 5'-Ende zur EcoRI-Schnittstelle des Polylinkers hin orientiert, wobei das Plasmid pSA erhalten wurde. Anschließend wurde das EcoRI/BamHI-Fragment aus dem pUC 19 Derivat pSA heraus geschnitten und nach Auffüllen der EcoRI-Schnittstelle in den Vektor pBI101.1 (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387–405) gesetzt, wobei pAS-GUS erhalten wurde (vgl. 4). Der Vektor pBI101.1 war vorher mit HindIII/BamHI geschnitten und die HindIII-Schnittstelle aufgefüllt worden. Der Vektor pBI101.1 enthält die kodierende Region des β-Glucuronidase-Gens als Reportergen. Die β-Glucuronidase ist einer histologischen Bestimmung ihrer Aktivität zugänglich und kann daher zur Analyse der Zellspezifität einer zu prüfenden regulatorischen Region eines Exgressionssystems eingesetzt werden. Parallel zur Klonierung von pAS-GUS wurde der Expressionsvektor pAS hergestellt, der zwischen dem Promotorfragment der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase und dem Terminator des Octopinsynthase-Gens einen Polylinker enthält (vgl. 3). Mit Hilfe dieses Plasmids ist eine Expression von beliebigen Genen unter Kontrolle des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Promotors möglich.
Das Konstrukt pAS-GUS mit der kodierenden Region der β-Glucuronidase als Reportergen wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Bevon, M. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721) transferiert, und die das chimäre ADP-Glucose-Pyrophosphorylase/β-Glucuronidase-Gen enthaltenden Agrobakterien zur Transformation von Kartoffel- und Tabakblättern eingesetzt.
Von zehn unabhängig erhaltenen Transformanden, in denen die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären ADP-Glucose-Pyrophosphorylase/β-Glucuronidase-Gens mit Hilfe von "Southern Blot"-Analysen nachgewiesen worden war, wurden Blätter, Stämme, Knollen und Wurzeln auf die Aktivität der β-Glucuronidase hin untersucht. Die Ergebnisse sind in 5 wiedergegeben. Aus diesen Daten ergibt sich eindeutig, dass das HincII-Fragment des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens, welches mit dem β-Glucuronidase-Gen fusioniert worden war, im Blatt eine schließzellenspezifische Aktivität der β-Glucuronidase bewirkt. Diese Aktivität ist nicht nachweisbar in den Mesophyll- und Epidermiszellen.
Beispiel 4
Weitere Konzentration der für die schließzellenspezifische Expression des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens verantwortlichen regulatorischen Bereiche
Das 0,35 kbp lange HindIII/BamHI-Fragment wurde aus dem in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid pSA isoliert und in den Vektor pBI101.1, der mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII linearisiert worden war, eingefügt. Das erhaltene Plasmid trägt die Bezeichnung pS1-D4GUS. Die 0,35 kbp lange HindIII/BamHI-Insertion des Plasmids ist in 2 und in Seq ID No 1 dargestellt. Der Vektor pBI101.1 enthält die Kodierregion des β-Glucuronidase-Gens als Reportergen. Die β-Glucuronidase ist einer histologischen Bestimmung ihrer Aktivität zugänglich und kann daher zur Analyse der Zellspezifität einer zu prüfenden regulatorischen Region eines Expressionssystems eingesetzt werden. Das Konstrukt pS1-D4GUS mit der kodierenden Region der β-Glucuronidase als Reportergen wurde in den Agrobakterienstamm LBA 4404 (Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721) transferiert, und die das chimäre ADP-Glucose-Pyrophosphorylase/β-Glucuronidase-Gen enthaltenden Agrobakterien zur Transformation von Kartoffel- und Tabakblättern eingesetzt.
Von zehn unabhängig erhaltenen Transformanden, in denen die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären ADP-Glucose-Pyrophosphorylase/β-Glucuronidase-Gens mit Hilfe von "Southern Blot"-Analysen nachgewiesen worden war, wurden Blätter, Stämme, Knollen und Wurzeln auf die Aktivität der β-Glucuronidase hin untersucht. Es wurde gezeigt, dass das 0,35 kbp lange HindIII/ BamHI-Promotorfragment des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens eine vergleichbare Aktivität mit dem EcoRI/BamHI-Promotorfragment des Plasmids pSA (vgl. 5) in den Schließzellen von Blättern aufweist, während für vaskuläre Gewebe, Wurzeln und Stolon von Kartoffelpflanzen und -wurzeln keine Aktivität beobachtet werden konnte.

Claims

Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA-Sequenz mit einer transkriptionalen regulatorischen Starterregion enthält, die eine schließzellenspezifische Genexpression in den Schließzellen der Blätter von Pflanzen sicherstellt, und keine Expression in Mesophyllzellen oder epidermalen Zellen von Blättern, enthaltend die Seq. ID No. 1:
Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein etwa 3,2 kb großes HincII/BglII-Promotorfragment des Plasmids pAS (DSM 6906) enthält.
Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die darin enthaltene DNA-Sequenz, die mit geeigneten kodierenden DNA-Sequenzen fusioniert ist, die pflanzlichen Schließzellen so verändert, dass ein permanentes Öffnen oder Schließen oder eine Verlängerung oder Verkürzung der Öffnungsperioden dieser Zellen ermöglicht wird.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine nach der transkriptionalen regulatorischen Starterregion für die schließzellenspezifische Genexpression insertierte DNA-Sequenz enthält, die die Information zur Bildung endogener Produkte oder zur Bildung heterologer Expressionsprodukte in Kulturpflanzen enthält.
Plasmid, enthaltend die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Plasmid, enthaltend die DNA-Sequenz Seq. ID No. 1.
Plasmid pAS (DSM 6906) gemäß Anspruch 6, bestehend aus einer etwa 13,2 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 2,0 kb großes Kanamycin-Resistenzgen, und ein etwa 3,2 kb großes HincII/BglII-Promotorfragment der regulatorischen Starterregion des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 aus Solanum tuberosum, ein Polylinker und der Transkriptionsterminator des Nopalinsynthasegens enthalten sind.
Plasmid pAS-GUS (DSM 6907) gemäß Anspruch 6, bestehend aus einer etwa 15,2 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 2,0 kb großes Kanamycin-Resistenzgen, ein etwa 3,2 kb großes HincII/BglII-Promotorfragment der regulatorischen Starterregion des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 aus Solanum tuberosum, die etwa 2 kb große für beta-Glucuronidase kodierende Re gion und der Transkriptionsterminator des Nopalinsynthasegens enthalten sind.
Verfahren zur genetischen Veränderung (Manipulation) einer Pflanzenzelle, umfassend die Einführung einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Pflanzenzelle.
Pflanzenzelle, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9, enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Pflanze oder pflanzliches Gewebe, regeneriert aus einer Pflanzenzelle gemäß Anspruch 10.
Verwendung einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression von Genen in Schließzellen, die die Regulation von Gasaustausch und Transpiration verändern.
Verwendung einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression homologer oder heterologer Gene in Schließzellen transformierter Pflanzen.
Verwendung einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression von Genen in Schließzellen, die eine lokale Veränderung des Phytohormonspiegels bewirken.
Verwendung des Plasmids pAS (DSM 6906) oder pAS-GUS (DSM 6907) zur Transformation von Kulturpflanzen.
Verwendung des Plasmids pAS (DSM 6906) oder pAS-GUS (DSM 6907) zur Regulierung der schließzellenspezifischen Genexpression oder zur Herstellung heterogener Produkte in Kulturpflanzen.
Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Tabakpflanze ist.
Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kartoffelpflanze ist.
Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Tomatenpflanze ist.
Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zuckerrübenpflanze ist.