DE4220758A1 - DNA-Sequenz und Plasmide zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration - Google Patents

DNA-Sequenz und Plasmide zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz aus Solanum tuberosum und Plasmide, enthaltend diese DNA-Sequenz, die bei Integration in ein pflanzliches Genom die Aktivität der Saccharose-Phosphat-Synthase (SPS) der Pflanze verändert und so in den Zuckermetabolismus der Pflanze eingreift. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA- Sequenz Veränderungen der Aktivität der Saccharose-Phosphat- Synthase hervorgerufen werden.
Saccharose ist von zentraler Bedeutung für die Pflanze und dient vielfältigen Funktionen.
Für den Langstreckentransport von Photoassimilaten bzw. Energie zwischen verschiedenen Organen in Pflanzen, wird fast ausschließlich Saccharose verwendet. Die Saccharose, die in ein bestimmtes heterotrophes Organ transportiert wird, determiniert das Wachstum und die Entwicklung dieses Organs. So ist z. B. aus der EP 442 592 bekannt, daß transgene Pflanzen, bei denen der Abtransport der Saccharose aus den exportierenden Blättern durch Expression einer apoplastischen Invertase inhibiert wird, eine starke Reduktion des Wachstums von z. B. Wurzeln oder Knollen Fall von Kartoffelpflanzen zeigen. Für Tabak-Pflanzen ist die prinzipielle Bedeutung der Saccharose als zentrale Funktion für den Langstreckentransport von Energieträgern innerhalb der Pflanze beschrieben. (von Schaewen et al, 1990, EMBO J 9: 3033-3044).
Während es klar nachgewiesen ist, daß eine Verringerung der Menge der in die heterotrophen Organe wie Knolle und Samen importierten Saccharose zu einem Ertragsverlust führt, ist nicht bekannt, ob eine Erhöhung der Saccharosemenge in den photosynthetisch aktiven Teilen der Pflanze, also primär den Blättern, zu einer verbesserten Versorgung der heterotrophen Organe und damit zu einer Erhöhung des Ertrags führt.
Eine zweite zentrale Rolle besitzen Saccharose bzw. die von der Saccharose abgeleiteten Hexosen Glukose und Fruktose beim Schutz von Pflanzen gegen Frostschäden bei niedrigen Temperaturen. Schäden durch Frost stellen in der nördlichen Hemisphäre einen der begrenzenden Faktoren landwirtschaftlicher Produktivität dar. Temperaturen unterhalb des Gefrierpunkts führen zur Bildung von Eiskristallen. Da die wachsenden Eiskristalle aus reinem Wasser bestehen, wird den Zellen bei sinkenden Temperaturen Wasser entzogen. Diese Dehydratation hat mindestens zwei potentiell schädliche Folgen:
  • - Alle gelösten Stoffe innerhalb einer Zelle werden stark konzentriert und die Zelle kontrahiert sich infolge des Wasserverlustes. Hochkonzentrierte Salze und organische Säuren führen zu Membranschädigungen.
  • - Bei der Rehydratation beim Tauen expandiert die vorher kontrahierte Zelle wieder. Die Zellmembranen dehnen sich wieder aus. Die Volumenexpansion stellt eine große mechanische Belastung der Membranen dar.
Es ist also offensichtlich, daß ein Gefrier/Tau Zyklus zu einer starken Membranschädigung der Zellen führen kann und somit zu einer Schädigung der Pflanze.
Es erscheint von daher erstrebenswert, das Gefrieren zu verhindern. Eine der möglichen Strategien ist die verstärkte Bildung von osmotisch aktiven Substanzen im Cytosol pflanzlicher Zellen. Dies sollte zu einer Erniedrigung des Gefrierpunktes führen. Osmotisch aktive Substanzen sind u. a. Saccharose bzw. die beiden aus der Saccharose abgeleiteten Hexosen.
Die vermehrte Bildung von Saccharose bzw. den beiden Hexosen bei niedrigen Temperaturen ist in der wachsenden Pflanze erwünscht. Eine andere Situation kann bei geernteten Teilen einer Pflanze, insbesondere bei deren Lagerung vorliegen. Als Beispiel sei angeführt, daß Knollen von Kartoffeln, die bei 4-8°C gelagert werden, damit beginnen, Hexosen (Glukose) zu akkumulieren. Es erscheint sinnvoll, dies als Antwort auf eine Erniedrigung der Temperatur anzusehen ("cold-sweetening").
Die Anhäufung der Saccharose und Glukose hat im Fall der Kartoffelknolle wirtschaftlich unerwünschte Folgen. So führt das vermehrte Auftreten von reduzierenden Zuckern wie der Glukose bei der Chips- und Pommes-Frites Herstellung zu unerwünschten Bräunungsreaktionen auf Grund der Maillard Reaktion. Chips und Pommes-Frites mit einer stark braunen Färbung werden in der Regel vom Konsumenten nicht akzeptiert. Ferner hängt die Kochfestigkeit, die ein wesentliches Qualitätsmerkmal von Kartoffeln ausmacht, stark vom Gehalt an Stärke bzw. deren Spaltprodukten ab.
In bezug auf wirtschaftliche Aspekte besitzt die Saccharose demnach drei besonders wichtige Funktionen:
  • - die Funktion als Transportform für den Ferntransport von Photoassimilaten,
  • - die Funktion als osmotisch aktive Substanz mit der erwünschten Wirkung einer Gefrierpunktserniedrigung in der intakten, wachsenden Pflanze sowie
  • - die Funktion bei der unerwünschten Bildung von reduzierenden Zuckern in gelagerten Ernteteilen einer Pflanze, wie z. B. der Knolle einer Kartoffelpflanze, als Resultat einer niedrigen Temperatur.
Die Biosynthesewege zur Bildung von Saccharose entweder aus den primären Photosyntheseprodukten (im Blatt) oder über den Abbau von Stärke (in Speicherorganen wie z. B. der Kartoffel) sind bekannt. Ein Enzym im Saccharosemetabolismus ist die Saccharosephosphat­ synthase (SPS). Sie bildet Saccharose-6-Phosphat aus den Vorstufen UDP-Glukose und Fruktose-6-Phosphat, welche dann in einem zweiten Schritt in Saccharose umgewandelt werden.
Die Isolation von SPS aus Mais und die Klonierung einer cDNA von Boten-Ribonukleinsäure aus Mais-Geweben ist bekannt (EP 466 995). In dieser Anmeldung werden Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins wie Zentrifugation von Homogenaten, differentielle Fällung und Chromatographie beschrieben. Eine 300fache Anreicherung von SPS aus pflanzlichen Geweben beschreiben Salerno und Pontis (Planta 142: 41-48, 1978).
Angesichts der Bedeutung der SPS für den Kohlenhydratmetabolismus ist fraglich, ob Pflanzen eine Reduktion der SPS-Aktivität in allen oder in bestimmten Organen tolerieren. insbesondere ist nicht bekannt, ob es möglich ist, transgene Pflanzen mit einer reduzierten SPS-Aktivität herzustellen. Auch über eine Verwendung von SPS zur Modifikation der Funktionen von Saccharose für eine Gefrierpunktserniedrigung in intakten Pflanzen und für die Bildung von reduzierenden Zuckern in Ernteteilen ist nichts bekannt.
Für die Herstellung von Pflanzen mit reduzierter SPS-Aktivität, d. h. Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration, ist es notwendig, SPS-Kodierregionen von solchen Pflanzenspezies zur Verfügung zu stellen, für die Verfahren beschrieben sind, mit denen transgene Pflanzen in großer Zahl erzeugt werden können. Sofern eine Reduktion der SPS-Aktivität erreicht werden kann, besteht bei Auswahl aus einer großen Menge die Möglichkeit, Pflanzen mit einem derartigen Phänotyp zu erhalten. Ferner sollen für die Pflanzenspezies organspezifische Promotoren der Genexpression vorliegen, mit deren Hilfe die Möglichkeit einer organspezifischen Reduktion der SPS-Aktivität untersucht werden kann.
Eine Spezies, die die besagten Anforderungen erfüllt, ist Solanum tuberosum. Die genetische Veränderung von S. tuberosum durch Agrobakterien vermittelten Gentransfer ist ausreichend beschrieben (Fraley et al., 1985, Crit Rev Plant Sci 4: 1-46). Promotoren für blattspezifische (Stockhaus et al., 1989, Plant Cell 1: 805-813), knollenspezifische (EP 375 092) und verwundungsinduzierte (EP 375 091) Genexpression sind bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt nun eine DNA-Sequenz zur Verfügung, mit der Veränderungen der SPS-Aktivität tatsächlich und nachweislich möglich ist und mit der in der Pflanze die Saccharose-Konzentration verändert werden kann. Es handelt sich dabei um die Sequenz mit der kodierenden Region der Saccharose- Phosphat-Synthase (SPS) aus Solanum tuberosum, mit der folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID No: 1):
Die DNA-Sequenz dann in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für Expression in eukaryontischen Zellen kombiniert werden. Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions- Terminatoren.
Jedes Plasmid umfaßt
  • a) einen geeigneten Promotor, der sicherstellt, daß die kodierende Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt bzw. in einem bestimmten Entwicklungszustand in der transgenen Pflanze oder in bestimmten Geweben von transgenen Pflanzen abgelesen wird,
  • b) eine kodierende Sequenz, die
    • i) so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Protein translatierbaren RNA erlaubt wird, wobei das Protein eine enzymatische Aktivität aufweist, die zu einer Veränderung der Saccharosekonzentration in der Pflanze führt oder
    • ii) die so an den Promotor gekoppelt ist, daß der nicht­ kodierende Strang abgelesen wird, was zur Bildung einer sog. "anti-sense" RNA führt, die die Bildung des von einem endogenen Gen in der Pflanze kodierten Proteins, das in der Saccharosebiosynthese involviert ist, unterdrückt und
  • c) eine nicht-kodierende Terminations-Sequenz, die in der Regel die Signale zur Termination des Transkriptes über eine Poly- Adenylierung enthält.
Der Promotor soll sicherstellen, daß das fremde Gen in der Pflanze exprimiert wird. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt erfolgt. Der Promotor kann homolog oder heterolog in Bezug auf die Pflanze sein. Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower-Mosaik Virus, der Patatin-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J 8: 23-29) oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt. Weitere Promotoren können verwendet werden, die eine Expression lediglich in bestimmten Organen wie Wurzel, Rübe, Knolle, Samen, Stamm oder bestimmten Zelltypen wie Mesophyll, Epidermis Geleitzellen u.ä. sicherstellen. Zur Verhinderung des cold sweetening sind solche Promotoren sinnvoll, die eine Aktivierung der Transkription in gelagerten Ernteteilen der Pflanzen sicherstellen. Hierfür kommen kälteinduzierte Promotoren oder solche Promotoren in Frage, die beim Übergang einer Knolle von der Speicherstoffe einlagernden in die Speicherstoffe abgebende Phase aktiv werden.
Die kodierende Sequenz enthält die Information zur Bildung einer Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) für die Saccharose-Phosphat-Synthase oder zur Bildung einer anti-sense Ribonukleinsäure zur SPS. Ob eine translatierbare Boten-Ribonukleinsäure oder eine anti-sense Nukleinsäure gebildet wird, hängt von der Orientierung der kodierenden Sequenz, bezogen auf den Promotor ab. Wenn das 3′ Ende der kodierenden Sequenz an das 3′ Ende des Promotors fusioniert wird, entsteht eine anti-sense RNA, bei Fusion des 5′ Endes der Kodierregion an das 3′ Ende des Promotors entsteht eine translatierbare RNA. Letzteres führt zu einer Steigerung der SPS- Aktivität in der Zelle, ersteres zu einer Absenkung der SPS- Aktivität in der Zelle. Eine Absenkung der SPS-Aktivität ist insbesondere im Hinblick auf die unerwünschte Bildung von Saccharose bzw. reduzierenden Zuckern als Ergebnis der Kältelagerung von Ernteorganen von Bedeutung.
Die kodierende Sequenz für SPS kann derjenigen entsprechen, die in dieser Erfindung beschrieben wird, oder durch Veränderungen aus der beschriebenen Sequenz hervorgehen. Dabei ist insbesondere an Veränderungen der Sequenz zu denken, die zu einer Umgehung der pflanzeneigenen Regulationsmechanismen führen.
Die Terminationssequenz dient der korrekten Beendigung der Transkription und der Anheftung eines Poly-Adenylrestes an die Ribonukleinsäure. Dieser Poly-Adenylrest hat eine wichtige Funktion bei der Stabilisierung von RNA-Molekülen in der Zelle.
Mit den Plasmiden, die die erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthalten, können Pflanzen transformiert werden mit dem Ziel der Erhöhung bzw. Verringerung der SPS Aktivität bzw. der Veränderung der Saccharose-Konzentration.
Plasmide die verwendet werden können, sind z. B. p35S-anti-pot-SPS (DSM 7125) und pB33-anti-pot-SPS (DSM 7124). Mit dem auf dem Plasmid p 35S-anti-pot-SPS lokalisierten Gen 35S-anti-pot-SPS kann z. B. die mRNA-Konzentration für das SPS-Protein und die enzymatische Aktivität verringert werden. Mit dem auf dem Plasmid pB33-anti-pot-SPS lokalisierten Gen B33S-anti-pot-SPS kann z. B. die mRNA-Konzentration für das SPS-Protein und die enzymatische Aktivität spezifisch in der Kartoffelknolle reduziert werden.
In der Pflanze ist die SPS einer Aktivitätskontrolle durch Phosphorylierung unterworfen. Dies erlaubt der Pflanze, die Aktivität des Enzyms innerhalb eines gewissen Rahmens unabhängig von der Proteinmenge der SPS zu regulieren. Wenn eine von außen hervorgerufene Veränderung der Aktivität der SPS erreicht werden soll, ist eine Umgehung der pflanzeneigenen Regulationsmechanismen notwendig. Daher ist die Veränderung der Phosphorylierungsmöglichkeiten ein wichtiges Ziel zur Beeinflussung der SPS-Aktivität und damit des Saccharosehaushalts der Pflanze.
Es ist nicht bekannt, an welchen Positionen im SPS-Protein zielgerichtete Veränderungen der Kodierregionen erreicht werden können, die dem Ziel dienen, SPS-Aktivitäten, die keiner pflanzeneigenen Kontrolle unterworfen sind. In die Pflanze einzuführen.
Die hier beschriebene DNA-Sequenz, die die kodierende Region für SPS aus Solanum tuberosum enthält, erlaubt die Identifikation der Orte der Proteinphosphorylierung der SPS. Mit Hilfe von Standard- Verfahren (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) ist unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen eine Lokalisierung der Phosphorylierungsstellen von SPS möglich. Sind diese bekannt, kann unter Ausnutzung der mit dem SPS-Sequenz versehenen Plasmide eine zielgerichtete Mutagenese (Sambrook et al, 1989) der Kodierregion der SPS bzw. eine nicht-zielgerichtete Mutagenese (Sambrook et al, 1989) und anschließende Sondierung erwünschter Mutationen der Kodierregion der SPS vorgenommen werden. Es können Derivate der Kodierregion mit Hilfe dieser Plasmide hergestellt werden, deren abgeleitete Proteine nicht den pflanzeneigenen Regulationsmechanismen unterworfen sind.
Zur Vorbereitung der Einführung der SPS Sequenz in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184; EMBL 3 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekama, In: The Binary Plant Vektor System, Offset-drukkerÿ Kanters B.V. Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten.
Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine Pflanze stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Hinterlegungen
Am 12.06.1992 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid p35S-anti-pot-SPS (DSM 7125)
Plasmid pB33-anti-pot-SPS (DSM 7124)
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1: Aufbau des 35S-anti-pot-SPS Gens
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294)
B = Fragment B: Saccharose Phosphat Synthase, EcoRV Fragment (nt 1 bis 2011), ca. 2000 bp, Orientierung: anti-sense,
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA das Ti-Plasmids pTiACH5
Gielen et al., 1984, EMBO J 3: 835-846).
Fig. 2: Aufbau des B33-anti-pot-SPS Gens
A = Fragment A: B33-Promotor des Patatin Gens aus S. Tuberosum, (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J 8: 23-29), ca. 530 bp
B = Fragment B: Saccharose Phosphat Synthase (s. Fig. 2), EcoRV Fragment (nt 2011 bis 1), ca. 2000 bp, Orientierung: anti­ sense
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5
(Gielen et al., 1984, EMBO J 3 : 835-846).
Fig. 3: Zeigt das Ergebnis der Transformation transgener Kartoffelpflanzen.
Control = Wildtyp-Pflanzen
1-75 = Einzelne transgene Pflanzen.
Fig. 4: Zeigt das Ergebnis der Transformation von Kartoffelpflanzen
Control = Wildtyp-Pflanzen
3-20 = Einzelne transgene Pflanzen.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC 18/19 und M13mp10 Serien (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-119) verwendet, sowie der Vektor EMBL 3 (Frischauf et al. (1983) J Mol Biol 170: 827-842).
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN 19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die pUC- und M13mp-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71- 18 (Messing et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci 24: 6342-6346) oder TB1 benutzt.
Für den Vektor BIN 19 wurde ausschließlich der E. coli-Stamm TB1 benutzt. TB1 ist ein rekombinationsnegatives, Tetracyclin­ resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F′(traD36, proAB, LacI, LaczoM15), δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1::Tn10(TcR).
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobakterium tumefaciens
Bei BIN 19 Derivaten erfolgt der Tranfer der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (1978) (Mol Gen Genet 163: 181-187). Die Plasmid- DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979) (Nucl Acids Res 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Pflanzentransformation
Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobakteriun tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg,/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 3% Bacto Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
5. SPS-Aktivitätstest
Die SPS-Aktivität wurde nach Siegel und Stitt (1990, Plant Scienc 66: 205-210) in einer zweistufigen Analyse bestimmt. Zu einem Volumen von 180 µl einer Lösung von 50 mM HEPES/KOH (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 5 mM Fruktose-6-phosphat, 25 mM Glukose-6-phosphat und 6 mM Uridin-5′-diphosphoglukose werden 20 µl Probe gegeben und für 10 Minuten bei 25°C inkubiert. Für 3 Minuten wird auf 95°C erhitzt, um die Reaktion zu beenden. Nach Zentrifugation wird der Überstand spektroskopisch bezüglich der Freisetzung von Uridin-5′- diphosphat analysiert, wobei eine mit Pyruvat-Kinase gekoppelte Enzymreaktion ausgenutzt wird. Ansätze ohne Hexosephosphat sowie die Messung der Rückgewinnung zugesetzten Uridin-5′-diphosphats dienen als Kontrollen.
Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1 Klonierung der Saccharose-Phosphat-Synthase aus Kartoffel
Aus großen Blättern von im Gewächshaus gewachsenen Spinatpflanzen sowie im Gewächshaus gewachsenen Kartoffelpflanzen wurde poly-A+- RNA isoliert. Ausgehend von der poly-A+-RNA wurde eine cDNA- Bibliothek im Expressionsvektor Lambda Zap II angelegt. 100,000 Plaques beider Banken wurden mit einem gegen gereinigtes SPS- Protein aus Spinat (Sonnewald et al., 1992, im Druck) gerichteten Antiserum aus Kaninchen bezüglich immunologisch kreuzreagierender Proteine sondiert. Aus der Kartoffelbank wurden positiv reagierende Klone erhalten. Diese Klone wurden nach Standardverfahren weiter gereinigt, und bei in vivo Excision wurden Plasmide erhalten, die eine doppelsträngige cDNA als Insertion tragen. Nach Überprüfung der Größe der Insertionen wurden einzelne Klone durch Bestimmung der Primärsequenz analysiert.
Ausführungsbeispiel 2 Bestimmung der Nukleotidsequenz der die SPS aus Kartoffel kodierenden cDNA sowie die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz
Die Nukleotidsequenz wurde nach Standardverfahren mittels der Dideoxymethode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467) bestimmt. Die Nukleotidsequenz (Seq. ID No. 1) ist oben beschrieben. Die aus der Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz ist ebenfalls angegeben.
Ausführungsbeispiel 3 Konstruktion des Plasmids p35s-anti-pot-sps und Insertion des Gens 35s-anti-pot-sps in das Genom von Kartoffelpflanzen
Das Gen 35s-anti-pot-SPS besteht aus den drei Fragmenten A,B und C (s. Fig. 1).
Das Plasmid wurde wie folgt hergestellt:
Aus dem pBluescript-Plasmid mit der gesamten Insertion wurde durch EcoRV Schnitt ein etwa 2 kb großes Fragment präpariert, das in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pBinAR (Höfgen & Willmitzer, 1990, Plant Sci., 66, 221-230) kloniert wurde. Der Vektor pBinAR ist ein Derivat vom binären Vektor BIN 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721) und wurde mittels Agrobacterium tumefaciens vermittelter Transformation in Kartoffel transferiert. Intakte, fertile Pflanzen wurden aus den transformierten Zellen regeneriert.
Als Ergebnis der Transformation wiesen einige transgene Kartoffelpflanzen eine verringerte Menge der für die Kartoffel-SPS kodierenden RNA auf (s. Fig. 3). Es wurden 50 µg Gesamt-RNA in einem Northern blot Experiment mit der Sonde für SPS aus Kartoffel hybridisiert.
Ferner weisen die Pflanzen eine Verringerung der SPS-Aktivität auf (s. Tabelle I).
Durch den Transfer und die Expression des Gens 35s-anti-pot-sps in Kartoffelpflanzen konnte also die Menge an gebildeter mRNA für das SPS-Protein sowie an vorhandener enzymatischer Aktivität signifikant verringert werden.
Ausführungsbeispiel 4 Konstruktion des Plasmids pB33-anti-pot-sps und Insertion des Gens B33-anti-pot-SPS in das Genom von Kartoffelpflanzen
Das Gen B33-anti-pot-sps besteht aus den drei Fragmenten A, B und C (s. Fig. 4).
Das Plasmid wurde analog dem in Ausführungsbeispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei jedoch als Ausgangsvektor ein pBin 19-Derivat verwendet wurde, das den B33- Promotor des Patatin Gens aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) anstelle des 35S-Promotors von pBinAR enthält.
Das Gen B33-anti-pot-sps wurde mittels Agrobacterium tumefaciens vermittelter Transformation in Kartoffel transferiert. Intakte, fertile Pflanzen wurden aus den transformierten Zellen regeneriert.
Als Ergebnis der Transformation wiesen die transgenen Kartoffelpflanzen eine verringerte Menge der für die Kartoffel-SPS kodierende RNA spezifisch in den Knollen auf (s. Fig. 4). Es wurden 50 µg Gesamt-RNA in einem Northern blot Experiment mit der Sonde für SPS aus Kartoffel hybridisiert. Ferner weisen die Pflanzen eine Verringerung der SPS-Aktivität ebenfalls nur in den Knollen auf.
Durch den Transfer und die Expression des Gens B33-anti-pot-sps in Kartoffelpflanzen konnte also die Menge an gebildeter mRNA für das SPS-Protein sowie an vorhandener enzymatischer Aktivität signifikant verringert werden, und zwar spezifisch nur in der Kartoffelknolle.
Tabelle 1
Ergebnis der Transformation von Kartoffelpflanzen

Claims (12)

1. DNA-Sequenz mit der kodierenden Region für Saccharose-Phosphat- Synthase (SPS) aus Solanum tuberosum zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenz die folgende Nukleotidabfolge (Seq. IDNo. 1 hat:
2. Plasmide enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.
3. Plasmid p35S-anti-pot-SPS (DSM 7125).
4. Plasmid pB33-anti-pot-SPS (DSM 7124).
5. Verwendung der Plasmide gemäß den Ansprüchen 2-4 zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration.
6. Verwendung des Plasmids p35S-anti-pot-SPS zur Herstellung von Pflanzen mit verringerter mRNA-Konzentration für das SPS-Protein und verringerter enzymatischer Aktivität.
7. Verwendung des Plasmids pB33-anti-pot-SPS zur Herstellung von Kartoffelpflanzen mit verringerter mRNA-Konzentration für das SPS- Protein und verringerter enzymatischer Aktivität spezifisch in der Knolle.
8. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Derivaten durch zielgerichtete oder nicht-zielgerichtete Mutagenese.
9. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Derivaten, deren pflanzeneigene Regulationsmechanismen unterbunden sind.
10. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Derivaten, deren pflanzeneigene Regulationsmechanismen durch den Eingriff in die Phosphorylierung unterbunden sind.
11. Pflanze enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.
12. Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kartoffel ist.
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