DE4444460A1 - Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen - Google Patents
Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei PflanzenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ertragsteigerung bei
Pflanzen sowie ein Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen,
wobei die Ertragsteigerung bzw. die Veränderung des Blühverhaltens dadurch
erreicht wird, daß in Zellen transgener Pflanzen Proteine exprimiert werden, die
aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität zur Erzeugung von leicht
mobilisierbaren Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole führen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für
Proteine kodieren, die aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität zur Erzeugung
von leicht mobilisierbaren Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole führen, zur
Expression in pflanzlichen Zellen.
Um die Versorgung der ständig wachsenden Weltbevölkerung mit
Nahrungsmitteln zu gewährleisten, ist es erforderlich, sich um eine Steigerung
des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen.
In den letzten Jahrzehnten war es möglich, die Erträge der Kulturpflanzen
aufgrund der Industrialisierung der Landwirtschaft kontinuierlich zu steigern.
Dazu trugen insbesondere die Mechanisierung der Landwirtschaft, die
modernisierte Pflanzenzüchtung, der Pflanzenschutz, aber auch die verbesserte
Pflanzenernährung durch den Einsatz verschiedener Düngemittel bei.
Eine Steigerung der Erträge durch eine Verbesserung der obengenannten
Maßnahmen ist momentan kaum noch zu erreichen. Beispielsweise ist die
Versorgung der Pflanzen mit das Wachstum von Pflanzen begrenzenden
Nährstoffen in der Biosphäre, z. B. Stickstoff und Phosphor, heutzutage in der
Regel gewährleistet. Das bedeutet, daß auch eine weitere Düngung zu keiner
Ertragsteigerung mehr führt. Die Entwicklung neuer Pflanzensorten mit
höherem Ertrag durch die Verfahren der Pflanzenzüchtung ist sehr
zeitaufwendig und häufig werden negative Eigenschaften der resultierenden
Pflanzensorten, beispielsweise eine geringere Krankheitsresistenz, in Kauf
genommen. Dies hat wiederum den verstärkten Einsatz von
Pflanzenschutzmitteln zur Folge.
Eine Möglichkeit zur Erzeugung von Pflanzensorten mit einem erhöhten Ertrag
besteht in der gezielten gentechnischen Veränderung von Pflanzen.
Beschrieben ist beispielsweise die Expression einer prokaryontischen
Asparaginsynthetase in pflanzlichen Zellen, wodurch es bei den Pflanzen unter
anderem zu einer Steigerung der Biomasseproduktion kommt (EP 0 511 979).
In anderen Verfahren wird versucht, die Expression von Genen zu verändern,
deren Produkte eine Funktion in Speicherstoffsynthesewegen in Pflanzen
besitzen, oder es wird versucht, die Verteilung der im Laufe der Photosynthese
gebildeten Photoassimilate derart zu verändern, daß bevorzugt "sink"-Organe,
insbesondere Speicherorgane, mit Photoassimilaten versorgt werden. Hierbei
wird zum einen versucht, die Aufnahmefähigkeit der "sink"-Organe für die
jeweilige Transportform der Photoassimilate, in der Regel Saccharose, zu
verbessern, oder den Transport direkt zu beeinflussen.
In der EP 0 442 592 wird z. B. die Expression einer Invertase in Kartoffelpflanzen
beschrieben, die zur Veränderung des Ertrages in derartig manipulierten
Pflanzen führt.
Auch die Verwendung des Saccharosetransporters (Riesmeier et al, 1994, EMBO
J. 13 : 1-7) zur Beeinflussung des Saccharosetransportes wird erwogen (WO
94/00574).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere allgemein bei Pflanzen
anwendbare gentechnische Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion
bzw. des Ertrages zur Verfügung zu stellen.
Es wurde überraschend gefunden, daß durch die Expression von DNA-
Sequenzen, die für Proteine kodieren, deren enzymatische Aktivität zur
Erzeugung von Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole in transgenen
pflanzlichen Zellen führt, eine Erhöhung der Biomasseproduktion und somit
eine Ertragsteigerung bei derartigen transgenen Pflanzen erreicht werden kann.
Unter dem Begriff Phosphat-Pool wird im Rahmen dieser Erfindung jeweils eine
Klasse von Molekülen verstanden, die Phosphat kovalent gebunden enthalten,
und aus denen Phosphat durch in der Regel reversible enzymatische Reaktionen
leicht mobilisiert, d. h. freigesetzt oder auf andere Moleküle übertragen werden
kann. Dies erhöht die Verfügbarkeit von Phosphat in den Zellen für
verschiedene Phosphat-abhängige Reaktionen. Unter dem Begriff "leicht
mobilisierbar" wird verstanden, daß das Phosphat schneller im Cytosol der Zelle
verfügbar ist, als es gewöhnlicherweise durch den Transport von Phosphat aus
der Vakuole in das Cytosol möglich ist. Die Freisetzung von Phosphat aus der
Vakuole in das Cytosol im Fall einer Phosphatdefizienz im Cytosol erfolgt in der
Regel im Bereich mehrerer Stunden (Woodrow et al, 1984, Planta 161, 525-530).
Unter Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen wird im Rahmen dieser
Erfindung eine Erhöhung der Biomasse der gesamten Pflanze (gemessen als
Trockengewicht) und/oder einzelner Teile im Vergleich zu Wildtyppflanzen
verstanden, vorzugsweise eine Steigerung um mindestens 5% und insbesondere
eine Steigerung um mehr als 10%.
Die Steigerung der Biomasseproduktion umfaßt somit auch die Steigerung des
Ertrages von landwirtschaftlich nutzbaren Teilen von Pflanzen, beispielsweise
von Speicherorganen, wie Kartoffelknollen, Rüben, Samen, Früchten, oder von
Blättern, Stämmen etc., in Pflanzen, in denen Phosphat-Pools außerhalb der
Vakuole erzeugt wurden, im Vergleich zu Wildtyppflanzen, vorzugsweise um
mindestens 5% und insbesondere um mehr als 10%.
Derartige Steigerungen übertreffen Steigerungen, die durch herkömmliche
Züchtungsverfahren in der Regel erreicht werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Steigerung der
Biomasseproduktion bzw. des Ertrags in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß
in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht mobilisierbare Phosphat-
Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit von Phosphat
gewährleisten.
Bei den Phosphat-Pools handelt es sich vorzugsweise um Phosphat-Pools, die die
für metabolische Prozesse notwendige cytosolische Homöostase bezüglich der
Phosphatkonzentration nicht beeinträchtigen, aber aus denen Phosphat leicht
freigesetzt oder auf andere Moleküle übertragen werden kann.
Hierfür besonders geeignet sind phosphathaltige Verbindungen, die
normalerweise nicht in höheren Pflanzen vorkommen. Dazu gehören
Polyphosphat (Wood, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57 : 235-260), eine Verbindung,
die von den meisten Organismen, außer höheren Pflanzen, als Speicherstoff für
Phosphat synthetisiert wird, und z. B. auch Acetylphosphat, das in Bakterien zur
ATP-Regenerierung verwandt wird (siehe z. B. Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol.
171 : 577-580).
Die Erzeugung derartiger Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole erfolgt dabei
vorzugsweise dadurch, daß in pflanzliche Zellen DNA-Sequenzen eingeführt
und zur Expression gebracht werden, die für Proteine kodieren, deren
enzymatische Aktivität zur Erzeugung von Phosphat-Pools, insbesondere von
Polyphosphat oder Acetylphosphat, in transgenen pflanzlichen Zellen führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren zur
Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in
pflanzliche Zellen mindestens eine DNA-Sequenz eingeführt und zur
Expression gebracht wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische
Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der
Vakuole in den transformierten Zellen führt.
Ein derartiges Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen
umfaßt dabei vorzugsweise folgende Schritte:
- a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
- iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
- b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
- c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Weiterhin wurde überraschend gefunden, daß die Expression von DNA-
Sequenzen, die für Proteine kodieren, deren enzymatische Aktivität zur
Erzeugung von Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole in den Zellen transgener
Pflanzen führt, in diesen Pflanzen eine Veränderung des Blühverhaltens,
insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung bewirkt.
Unter einer Veränderung des Blühverhaltens bzw. einer vorzeitigen
Blütenbildung wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, daß
transformierte Pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen
mindestens einige Tage, vorzugsweise eine bis mehrere Wochen, insbesondere 1-2
Wochen früher blühen.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Veränderung des
Blühverhaltens in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen
außerhalb der Vakuole leicht mobilisierbare Phosphat-Pools erzeugt werden, die
eine erhöhte Verfügbarkeit von Phosphat gewährleisten.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Veränderung
des Blühverhaltens bei Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine
DNA-Sequenz in pflanzliche Zellen eingeführt und zur Expression gebracht
wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von
Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den
transformierten Zellen führt.
Ein derartiges Verfahren umfaßt in der Regel folgende Schritte:
- a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
- iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
- b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
- c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Für den in den erfindungsgemäßen Verfahren unter i) genannten Promotor
kommt im Prinzip jeder in Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Die
Expression der besagten DNA-Sequenzen kann generell in jedem Gewebe einer
transformierten Pflanze und zu jedem Zeitpunkt stattfinden. Geeignet ist
beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al, 1985,
Nature 313 : 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer
Pflanze gewährleistet. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden,
die in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression
nachgeschalteter Sequenzen führen, vorzugsweise in photosynthetisch aktivem
Gewebe (siehe z. B. Stockhaus et al, 1989, EMBO J. 8 : 2245-2251) oder nur zu einem
durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise
WO/9307279).
Bei den in den erfindungsgemäßen Verfahren unter Verfahrensschritt a)ii)
genannten DNA-Sequenzen handelt es sich vorzugsweise um DNA-Sequenzen,
die für Proteine mit den enzymatischen Eigenschaften einer Polyphosphatkinase,
einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren.
Polyphosphatkinasen (ATP : Polyphosphatphosphotransferase) katalysieren die
Reaktion:
Polyphosphatn + ATP ⇄ Polyphosphatn+1 + ADP
Das Produkt dieser reversiblen Reaktion ist ein lineares Polymer von
Orthophosphatresten. Die Länge der Polymere kann dabei im Bereich von 3 bis
zu über 1000 Phosphatresten reichen. Das Enzym wurde bereits in verschiedenen
Organismen beschrieben, u. a. E. coli (Ahn und Kornberg, 1990, J. Biol. Chem.
265 : 11 734-11 739; Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22 556-22 561), Klebsiella
aerogenes (Kato et al, 1993, Gene 137 : 237-242), S. cerevisiae (Felter und Stahl, 1997,
Biochemie 55 : 245-251), Propionibacterium shermanii (Robinson und Wood, 1986, J.
Biol. Chem. 261 : 4481-4485; Robinson et al, 1987, J. Biol. Chem. 262 : 5216-5222),
Corynebacterium xerosis (Muhammed, 1961, Biochim. Biophys. Acta 54 : 121-132)
und Arthobacterium atrocyaneus (Levinson et al, 1975, J. Gen. Microbiol. 88 : 65-74).
Acetatkinasen (ATP: Acetat Phosphotransferase; E.C. 2.7.2.1.) katalysieren die
Reaktion:
Acetat + ATP ⇄ Acetylphosphat + ADP
Das Enzym ist in einer ganzen Reihe von Mikroorganismen identifiziert
worden, und DNA-Sequenzen, die für Acetatkinasen kodieren, sind ebenfalls
isoliert worden, beispielsweise das ack-Gen aus E. coli K-12 (Matsuyama et al,
1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580) und das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila
(Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Phosphotransacetylasen (Acetyl-CoA: Orthophosphat Acetyltransferase; E.C.
2.3.1.8.) katalysieren die folgende Reaktion:
Acetyl-CoenzymA + Orthophosphat ⇄ Acetylphosphat + CoenzymA
DNA-Sequenzen, die für dieses Enzym kodieren, sind ebenfalls beschrieben, z. B.
das pta-Gen aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol.
175 : 6822-6829).
Bei den DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, deren enzymatische
Aktivität zur Bildung von Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole führt,
insbesondere für Proteine mit der enzymatischen Eigenschaft einer
Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase, kann
es sich um genomische oder um cDNA-Sequenzen prokaryontischen oder
eukaryontischen Ursprungs handeln. Die DNA-Sequenzen können mit Hilfe
gängiger molekularbiologischer Methoden aus Zellen isoliert oder auf
synthetischem Wege hergestellt worden sein.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt DNA-
Sequenzen verwendet, die für Proteine kodieren, die die enzymatische
Eigenschaft einer Polyphosphatkinase besitzen und einen niedrigen Km-Wert
für ADP und einen hohen Km-Wert für ATP aufweisen.
Diese Enzyme werden in ihrer Aktivität in der Regel durch das Verhältnis von
ATP zu ADP beeinflußt. Das bedeutet, daß eine Neubildung eines Phosphat-Pools
nur erfolgt, wenn ATP im Überschuß gegenüber ADP vorliegt. Dies führt zu
einer Verarmung der cytosolischen Phosphatkonzentration unter Bedingungen,
die die ATP-Bildung bevorzugen, und zu einem stetigen Rückfluß von Phosphat
aus der Vakuole. Diese neugebildeten Pools besitzen gegenüber dem vakuolären
Phosphatpool den Vorteil, daß sie leichter mobilisierbar sind. Die Freisetzung
von Phosphat aus der Vakuole in das Cytosol im Fall einer Phosphatdefizienz im
Cytosol erfolgt in der Regel im Bereich mehrerer Stunden (Woodrow et al., 1984,
Planta 161, 525-530). Insbesondere bedeutet dies, daß diese pflanzenfremden
Verbindungen aufgrund der enzymatischen Eigenschaften der
obenbeschriebenen Enzyme relativ schnell abgebaut werden können und somit
Phosphat mobilisiert werden kann, wenn das Verhältnis von ATP zu ADP
absinkt.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren
sehen die Verwendung prokaryontischer DNA-Sequenzen vor, vorzugsweise
von DNA-Sequenzen aus E. coli oder Klebsiella aerogenes, die für eine
Polyphosphatkinase kodieren, und insbesondere des ppk-Gens aus E. coli
(Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22 556-22 561) oder des ppk-Gens aus
Klebsiella aerogenes (Kato et al, 1993, Gene 137 : 237-242), oder von DNA-Sequenzen
aus Methanosarcina thermophila oder E. coli, die für eine Acetatkinase oder eine
Phosphotransacetylase kodieren, insbesondere des ack-Gens aus E. coli K-12
(Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580), des ack-Gens aus Methanosarcina
thermophila oder des pta-Gens aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry,
1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren
sieht vor, daß in pflanzliche Zellen gleichzeitig eine DNA-Sequenz eingeführt
wird, die für ein Protein kodiert, das zur Synthese von Polyphosphat führt, sowie
eine Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Acetatkinase kodiert, und eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer Phosphotransacetylase kodiert.
Die enzymatischen Aktivitäten der Acetatkinase und der Phosphotransacetylase
führen zur Umsetzung von Acetyl-CoenzymA und ADP zu Acetat und ATP. Das
entstehende ATP kann anschließend von der Polyphosphatkinase zur Synthese
von Polyphosphat verwendet werden.
Die Mobilisierung der durch die erfindungsgemäßen Verfahren in den Zellen
außerhalb der Vakuole gebildeten Phosphat-Pools, insbesondere Polyphosphat,
kann neben den Enzymen, die die obenbeschriebenen reversiblen Reaktionen
katalysieren, auch durch andere Enzyme erfolgen. Enzyme, die Polyphosphat als
Substrat verwenden, sind bekannt. DNA-Sequenzen, die für derartige Enzyme
kodieren, müssen dann ebenfalls in die pflanzlichen Zellen eingebracht und
exprimiert werden. Bekannt ist beispielsweise die Polyphosphat-Glucokinase, die
bereits in einer Reihe von Mikroorganismen beschrieben wurde, beispielsweise
in Mycobacterium phlei (Szymona, 1956, Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Sci. Biol. 5 : 379-
381; Szymona und Ostrowski, 1964, Biochim. Biophys. Acta 85 : 283-295),
Propionibacterium shermanii (Pepin und Wood, 1986, J. Biol. Chem. 261 : 4476-4480),
Corynebacterium xerosis (Dirheimer und Ebel, 1968, Bull. Soc. Chim. Biol. 50 : 1 933-
1947) und Mycobacterium tuberculosis (Szymona et al, 1977, Acta Biochim. Pol.
24 : 133-42). Weitere Enzyme, die Polyphosphat als Substrat verwenden und daher
für die Mobilisierung von Polyphosphat geeignet sind, sind z. B. auch die
Polyphosphat: AMP-Phosphotransferase (Bonting et al, 1991, J. Bacteriol. 173 : 6484-
6488; Dirheimer und Ebel, 1965, C.R. Acad. Sci. Paris 260 : 3787-3790), die 1,3-
Diphosphoglycerat: Polyphosphat-Phosphotransferase (Kulaev et al, 1968,
Biokhimiya 33 : 419-434; Wood und Goss, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 312-
315), die Polyphosphat-abhängige NAD-Kinase (Murata et al, 1980, Agric. Biol.
Chem. 44 : 61-68), die Exopolyphosphatase (siehe z. B. Akiyama et al, 1993, J. Biol.
Chem. 268 : 633-639; Wurst und Kornberg, 1994, J. Biol. Chem. 269 : 10 996-11 001)
und die Endopolyphosphatase (E.C. 3.6.1.10.; siehe z. B. Kowalczyk und Phillips,
1993, Analyt. Biochem. 212 : 194-205).
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das in der transgenen Pflanzenzelle
exprimierte Protein, das aufgrund seiner enzymatischen Aktivität die Bildung
eines Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole bewirkt, insbesondere von
Polyphosphat oder Acetylphopsphat, in jedem beliebigen Kompartiment der
pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem
bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die kodierende Region mit DNA-
Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen
Kompartiment gewährleisten. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Protein
im Cytosol, den Plastiden oder den Mitochondrien lokalisiert sein. Für die
Lokalisation im Cytosol ist keine spezielle Signalsequenz erforderlich. Bei der
Verwendung prokaryontischer Sequenzen ist darauf zu achten, daß diese keine
Signalsequenzen aufweisen, die eine Sekretion des zu exprimierenden Proteins
bewirken. Signalsequenzen, die die Lokalisation beispielsweise in den
Mitochondrien oder den Plastiden gewährleisten, sind bekannt (siehe
beispielsweise Braun et al., 1992, EMBO J. 11 : 3219-3227; Wolter et al, 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85 : 846-850).
Die Terminationssequenz dient der korrekten Beendigung der Transkription
sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine
Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige
Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al, 1989, EMBO J. 8 : 23-
29) und sind beliebig austauschbar.
Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Expressionskassette ist
vorzugsweise auf einem Plasmid lokalisiert, insbesondere auf den Plasmiden
p35S-PPK (Fig. 1) oder p35S-ACK (Fig. 3), und wird vorzugsweise unter
Verwendung eines Plasmids, das für die Transformation pflanzlicher Zellen
geeignet ist, in pflanzliche Zellen eingeführt. In den Ausführungsbeispielen der
vorliegenden Erfindung wurde der binäre Vektor pBinAR (Höfgen und
Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66 : 221-230) verwendet. Bei diesem Vektor handelt es
sich um ein Derivat des binären Vektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res.
12 : 8711-8721), der kommerziell erhältlich ist (Clontech Laboratories, Inc., USA).
Es ist jedoch auch jeder andere Pflanzentransformationsvektor geeignet, in den
eine Expressionskassette inseriert werden kann, und der die Integration der
Expressionskassette in das pflanzliche Genom gewährleistet.
Zur Transformation gemäß den Verfahrensschritten b) mit der gemäß
Verfahrensschritt a) konstruierten Expressionskassette kommen grundsätzlich
Zellen aller Pflanzenspezies in Frage. Bevorzugt werden in dem Verfahren
Zellen landwirtschaftlicher Nutzpflanzen verwendet, insbesondere von
Getreidearten, Kartoffel, Mais, Raps, Erbse, Zuckerrübe Sojabohne, Tomate etc.,
oder Zellen von Zierpflanzen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die aus den erfindungsgemäßen
Verfahren resultierenden transgenen Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen.
Die transgenen Pflanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß es in Zellen dieser
Pflanzen aufgrund der Einführung und der stabilen Integration einer gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren konstruierten Expressionskassette in das Genom
zur Expression eines Proteins kommt, das aufgrund seiner enzymatischen
Aktivität die Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der
Vakuole in den transgenen Zellen bewirkt.
Insbesondere betrifft die Erfindung transgene Pflanzen enthaltend mindestens
eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase
kodiert, wobei diese DNA-Sequenz mit regulatorischen DNA-Bereichen für die
Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen verknüpft ist, stabil in das
Genom integriert ist und es aufgrund der Expression der besagten DNA-Sequenz
zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in
Zellen der Pflanze kommt. Bevorzugt handelt es sich bei den transgenen
Pflanzen um Zierpflanzen oder um Nutzpflanzen, insbesondere
landwirtschaftliche Nutzpflanzen, wie z. B. Getreide, Mais, Kartoffel, Tomate,
Raps, Zuckerrübe etc.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von DNA-
Sequenzen, die für Proteine kodieren, die aufgrund ihrer enzymatischen
Aktivität zur Bildung von leicht mobilisierbaren Phosphat-Pools, insbesondere
von Polyphosphat oder Acetylphosphat, außerhalb der Vakuole führen, zur
Erzeugung derartiger Phosphat-Pools in pflanzlichen Zellen, sowie zur
Transformation pflanzlicher Zellen und zur Expression in pflanzlichen Zellen.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die
für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer
Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren, zur Expression in
pflanzlichen Zellen sowie zur Erzeugung von Polyphosphat oder Acetylphosphat
außerhalb der Vakuole in pflanzlichen Zellen. Zu diesen Sequenzen gehören
insbesondere Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer
Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase
kodieren, insbesondere Sequenzen aus E. coli oder Klebsiella aerogenes, die für eine
Polyphosphatkinase kodieren, z. B. das ppk-Gen aus E. coli (Akiyama et al, 1992, J.
Biol. Chem. 267 : 22556-22561) oder das ppk-Gen aus Klebsiella aerogenes (Kato et al.,
1993, Gene 137 : 237-242), oder DNA-Sequenzen aus Methanosarcina thermophila
oder E. coli, die für eine Acetatkinase oder eine Phosphotransacetylase kodieren,
z. B. das ack-Gen aus E. coli K-12 (Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580),
das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila oder das pta-Gen aus Methanosarcina
thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine
große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein
Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter
Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-
Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer
passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das
erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet.
Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet,
anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als
Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden
im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere
biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder
Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-
Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-
Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl
von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation
pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens
oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von
Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von
DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an
sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es
können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber
aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die
Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können
weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation
der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die
rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und
Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen
verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die
einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder
in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären
Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-
DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der
Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer
der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in
Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre
Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre
Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie
enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von
der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können
direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al (1978) Mol. Gen.
Genet. 163 : 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid,
das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA
in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das
derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von
Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist
intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary
Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter
V; Fraley et al, Crit. Rev. Plant. Sci., 4 : 1-46 und An et al (1985) EMBO J. 4 : 277-287
beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate
zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes
kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke,
Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte
Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika
oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze
Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf
Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie
dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich
transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen
Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber
einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin,
Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte
Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen
die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise
(siehe auch McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84). Die resultierenden
Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche
transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die
daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden
phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um
sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt
wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der
entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
20 × SSC
175.3 g NaCl
88.2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH
175.3 g NaCl
88.2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH
10 × MEN
200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0
200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0
NSEB-Puffer
0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
7% SDS 1 mM EDTA
1% BSA (w/v)
0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
7% SDS 1 mM EDTA
1% BSA (w/v)
Fig. 1 zeigt das Plasmid p35S-PPK.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
B = Fragment B: DNA-Fragment aus Escherichia coli kodierend für Polyphosphatkinase;
Nukleotide 187-2253 des Polyphosphatkinase (ppk)-Gens (Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 1992, 267 : 22 556-22 561);
Orientierung zum Promotor: sense.
Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ppk-Gens an.
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
B = Fragment B: DNA-Fragment aus Escherichia coli kodierend für Polyphosphatkinase;
Nukleotide 187-2253 des Polyphosphatkinase (ppk)-Gens (Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 1992, 267 : 22 556-22 561);
Orientierung zum Promotor: sense.
Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ppk-Gens an.
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Fig. 2 zeigt das Plasmid pACK.
Die dünne Linie entspricht dem Plasmid pUC19, die starke Linie repräsentiert eine DNA-Insertion, die die kodierende Region des ack-Gens aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829) umfaßt. Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ack- Gens an.
Die dünne Linie entspricht dem Plasmid pUC19, die starke Linie repräsentiert eine DNA-Insertion, die die kodierende Region des ack-Gens aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829) umfaßt. Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ack- Gens an.
Fig. 3 zeigt das Plasmid p35S-ACK.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
B = Fragment B: DNA-Fragment aus Methanosarcina thermophila kodierend für Acetatkinase;
Nukleotide 1314-2748 des Acetatkinase (ack)-Gens (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-829);
Orientierung zum Promotor: sense.
Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ack-Gens an.
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
B = Fragment B: DNA-Fragment aus Methanosarcina thermophila kodierend für Acetatkinase;
Nukleotide 1314-2748 des Acetatkinase (ack)-Gens (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-829);
Orientierung zum Promotor: sense.
Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ack-Gens an.
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Fig. 4 zeigt den Knollenertrag in g/Pflanze von Pflanzen, die mit dem Plasmid
p35S-PPK transformiert wurden, im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen
(Wildtyp).
Untersucht wurden Pflanzen, die im Gewächshaus kultiviert wurden, der Linien
JP1 16, JP1 26, JP1 29, JP1 31, JP1 33, JP1 34 und JP1 35 sowie Wildtyppflanzen der
Kartoffelvarietät Desir´e. Die Ernte der Kartoffeln erfolgte 11 Wochen nach dem
Aussetzen der Pflanzen.
n = Anzahl der zur Analyse verwendeten Pflanzen
g/Pflanze = durchschnittliches Knollengewicht/ Pflanze
g/Pflanze = durchschnittliches Knollengewicht/ Pflanze
Fig. 5a und b illustriert die vorzeitige Blütenbildung von Pflanzen, die mit dem
Plasmid p35S-PPK transformiert wurden, im Vergleich zu nicht-transformierten
Pflanzen (Wildtyp).
Transformierte Kartoffelpflanzen der Linien JP1 16, JP1 26, JP1 29, JP1 31, JP1 33,
JP1 34 und JP1 35 sowie Wildtyppflanzen der Kartoffelvarietät Desir´e wurden
unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Fig. 5a zeigt den prozentualen
Anteil der untersuchten Pflanzen jeder Linie bzw. der Wildtyppflanzen, die nach
80 Tagen nach dem Aussetzen der Pflanzen blühten. Fig. 5b zeigt den
prozentualen Anteil der untersuchten Pflanzen jeder Linie bzw. der
Wildtyppflanzen, die nach 84 Tagen nach dem Aussetzen der Pflanzen blühten.
n = Anzahl analysierten Pflanzen
% Pflanzen = prozentualer Anteil der Pflanzen, die blühen
% Pflanzen = prozentualer Anteil der Pflanzen, die blühen
Fig. 6 zeigt transformierte Kartoffelpflanzen im Vergleich mit nicht
transformierten Kartoffelpflanzen.
Drei Pflanzen der Kartoffellinie JP1 35, die mit dem Plasmid p35S-PPK
transformiert wurden (hinten), sind im Vergleich gezeigt mit zwei nicht-
transformierten Kartoffelpflanzen (vorne). Die Pflanzen sind ca. 84 Tage alt und
wurden im Gewächshaus gehalten.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der
Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Expression einer
prokaryontischen Polyphosphatkinase sowie einer prokaryontischen Acetatkinase
im Cytosol transgener Kartoffelpflanzen und die Auswirkungen dieser
Expression auf den Ertrag der Pflanzen sowie auf das Blühverhalten der Pflanzen
beschrieben wird. Analog zu den dargestellten Beispielen können auch andere
DNA-Sequenzen, die für Enzyme, die zur Bildung von Polyphosphat oder
Acetylphosphat in den Zellen führen, kodieren, verwendet werden und auch
andere Pflanzen, insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Zuckerrübe,
Mais, Getreidearten, Sojabohne, Raps, Sojabohne, Tomate etc. verändert werden.
In den folgenden Ausführungsbeispielen wurden folgende Standardtechniken
angewendet:
Zur Klonierung in E. coli wurde der Vektor pUC19 verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären
Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66 : 221-230) kloniert.
Für den pUC19-Vektor und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm
DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des
Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 durchgeführt (Rocha-Sosa et al (1989)
EMBO J. 8 : 23-29).
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode
von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16 : 9877). Die Plasmid-DNA
transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly
(1979, Nucleic Acids Res. 7 : 1513-1523) isoliert und nach geeigneter
Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur
(Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium
(Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15 : 473) mit 2% Saccharose gelegt,
welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-
Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine
weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur
Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure,
0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l
Hygromycin B und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei
25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit
1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l
Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin
B und 0.80% Bacto Agar gelegt.
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-
Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den
Angaben des Herstellers durchgeführt.
RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50
µg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN-
Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser
gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Kapillarblot auf eine
Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die Membran
wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken.
Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybridisiert und
anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv
markierten Probe hybridisiert.
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen
gehalten:
Lichtperiode | |
14 h bei 1300 Lux und 25°C | |
Dunkelperiode | 10 h bei 20 °C |
Luftfeuchte | 60% |
Für die Konstruktion des Plasmids p35S-PPK wurde zunächst ein DNA-
Fragment, das für die Polyphosphatkinase aus E. coli kodiert, mit Hilfe der PCR-
Technik ("Polymerase Chain Reaction") amplifiziert. Hierzu wurde genomische
DNA aus E. coli-Zellen des Stamms DH5α nach Standardmethoden isoliert (siehe
z. B. Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY). Unter Verwendung
der beiden Oligonukleotide
Oligo 1
Oligo 1
5′-AAGGATCCAGGAACCCGGGCCATGGGTCAGGAAAAG-3′
und
Oligo 2
5′-GGGGATCCCGGGCCATGGGTTATTCAGGTTG-3′
wurde durch die PCR-Reaktion ein ca. 2,1 kb langes DNA-Fragment amplifiziert,
das die Nukleotide 187 bis 2253 der in Akiyama et al (1992, J. Biol. Chem. 267,
Seite 22 558) dargestellten DNA-Sequenz (ppk-Gen), die für Polyphosphatkinase
aus E. coli kodiert, umfaßt. Durch das Oligonukleotid 1, das teilweise zu dem 5′-
Ende des ppk-Gens komplementär ist, werden am 5′-Ende des amplifizierten
DNA-Fragmentes Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsendonukleasen
BamH I und eine Sma I eingeführt. Durch das Oligonukleotid 2, das teilweise zu
dem 3′-Ende des ppk-Gens komplementär ist, werden am 3′-Ende des Fragmentes
Schnittstellen für BamH I, Sma I und Nco I eingeführt. Das aus der PCR-Reaktion
resultierende DNA-Fragment wurde mit BamH I geschnitten und in den mit
BamH l geschnittenen binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990,
Plant Sci. 66 : 221-230) ligiert. Bei diesem handelt es sich um ein Derivat des
binären Vektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12 : 8711-8721). pBinAR
wurde folgendermaßen konstruiert:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Cauliflowermosaic-Virus umfaßt (Franck et al, 1980, Cell 21 : 285-294), wurde als EcoR I/Kpn I-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al, Nucl. Acids Res. 14 : 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoR I- und die Kpn I-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Cauliflowermosaic-Virus umfaßt (Franck et al, 1980, Cell 21 : 285-294), wurde als EcoR I/Kpn I-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al, Nucl. Acids Res. 14 : 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoR I- und die Kpn I-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.
Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al, Nature 303 : 209-213) wurde mit
Hilfe der Restriktionsendonukleasen Pvu II und Hind III ein 192 bp langes
Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-
Plasmids pTiACH5 (Gielen et al, EMBO J. 3 : 835-846) umfaßt (Nukleotide 11 749-
11 939). Nach Addition von Sph I-Linkern an die Pvu I-Schnittstelle wurde das
Fragment zwischen die Sph I- und Hind III-Schnittstellen pBin19-A ligiert. Dabei
entstand pBinAR.
Mit Hilfe von Restriktions- und Sequenzanalysen wurden rekombinante
Vektoren identifiziert, bei denen das amplifizierte DNA-Fragment derart in den
Vektor inseriert ist, daß die kodierende Region für die Polyphosphatkinase aus E.
coli in sense-Orientierung mit dem 35S-Promotor verknüpft ist. Das resultierende
Plasmid, p35S-PPK, ist in Fig. 1 dargestellt.
Durch die Insertion des amplifizierten DNA-Fragmentes entsteht eine
Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C
aufgebaut ist:
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-
Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
(Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
Das Fragment B enthält die kodierende Region für Polyphosphatkinase aus E.
coli. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 187-2253 des Polyphosphatkinase-Gens
(Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22556-22561). Diese kodierende Region
wurde in sense-Orientierung an den 35S-Promotor ligiert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA
des Ti-Plasmids pTiACHs (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-PPK beträgt ca. 13 kb.
Da die verwendete kodierende Region des Gens für Polyphosphatkinase aus E.
coli keine Signalsequenz umfaßte, sollte das exprimierte Protein im Cytoplasma
transformierter Zellen vorliegen.
Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in
Zellen von Kartoffelpflanzen transferiert wie oben beschrieben. Aus den
transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Auf diese Weise
wurden 40 Linien transformierter Pflanzen erzeugt, von denen 7 Linien,
insbesondere die Linien JP1 16, JP1 26, JP1 29, JP1 31, JP1 33, JP1 34 und JP1 35,
näher analysiert wurden.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffelpflanzen die
Expression des Gens für die Polyphosphatkinase aus E. coli. Die Expression wurde
mit Hilfe von Nothern-Blot-Analysen nachgewiesen. Dazu wurde RNA aus
Gewebe von transgenen Pflanzen isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf
eine Nylonmembran transferiert und mit der radioaktiv markierten
kodierenden Region des ppk-Gens aus E. coli hybridisiert. Von den
obengenannten 7 transgenen Kartoffellinien wurde jeweils eine Pflanze im
Hinblick auf die Expression des ppk-Gens untersucht. Alle zeigten eine deutliche
Expression des ppk-Gens aus E. coli. In Wildtyppflanzen konnten dagegen keine
Transkripte dieses Gens nachgewiesen werden.
Die Pflanzen zeigten im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen wesentlich
höheren Ertrag pro Pflanze (gemessen als g Knollen/Pflanze) (Fig. 4). Die
transformierten Pflanzen bildeten im Vergleich zu Wildtyppflanzen nicht mehr,
dafür aber wesentlich größere Knollen.
Der Stärkegehalt der Knollen transformierter Pflanzen entsprach dem
Stärkegehalt von Knollen von Wildtyppflanzen (Messung durch Bestimmung
der Dichte der Knollen).
Weiterhin zeigten die transformierten Pflanzen im Vergleich zu
Wildtyppflanzen eine vorzeitige Blütenbildung (Fig. 5 und 6). Bei
transformierten Pflanzen setzte die Blüte durchschnittlich 1-2 Wochen früher
ein als bei Wildtyppflanzen, die unter den gleichen Bedingungen gehalten
wurden.
Für die Konstruktion des Plasmids p35S-ACK wurde zunächst ein DNA-
Fragment, das für die Acetatkinase aus Methanosarcina thermophila kodiert (ack-
Gen), isoliert. Das Gen ist in der Sma I-Schnittstelle eines pUC19-Plasmids
inseriert. Die Konstruktion dieses pUC-Plasmides ist ausführlich in Latimer und
Ferry (1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829; siehe Seite 6823, rechte Spalte) beschrieben.
Das verwendete Plasmid, das im Rahmen dieser Erfindung pACK genannt wird,
ist in Fig. 2 dargestellt.
Aus diesem Plasmid wurde durch Restriktionsverdau mit den
Restriktionsendonukleasen Asp718 und BamH I ein ca. 1,45 kb großes DNA-
Fragment isoliert und in den mit Asp718 und BamH I geschnittenen binären
Vektor pBinAR ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit p35S-ACK
bezeichnet und ist in Fig. 3 dargestellt.
Durch die Insertion des isolierten Asp718/BamH I-DNA-Fragmentes entsteht eine
Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C
aufgebaut ist:
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
Das Fragment B enthält die kodierende Region für Acetatkinase aus
Methanosarcina thermophila. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 1314-2748 der in
Latimer und Ferry (1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829) dargestellten Sequenz
(Acetylkinase (ack)-Gen). Diese kodierende Region wurde in sense-Orientierung
an den 35S-Promotor ligiert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA
des Ti-Plasmids pTiACHs (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-ACK beträgt ca. 12,5 kb.
Das Plasmid wurde wie oben beschrieben mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter
Transformation in Zellen von Kartoffelpflanzen transferiert. Aus den
transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffelpflanzen die
Expression der Acetatkinase aus Methanosarcina thermophila im Cytosol der
Zellen.
Claims (21)
1. Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen dadurch
gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht
mobilisierbare Phosphat-Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit
von Phosphat gewährleisten.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche
Zellen mindestens eine DNA-Sequenz eingeführt und zur Expression gebracht
wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von
Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den
transformierten Zellen führt.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß es
folgende Schritte umfaßt:
- a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
- iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
- b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
- c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
4. Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens in Pflanzen dadurch
gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht
mobilisierbare Phosphat-Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit
von Phosphat gewährleisten.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche
Zellen mindestens eine DNA-Sequenz eingeführt und zur Expression gebracht
wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von
Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den
transformierten Zellen führt.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 und 5 dadurch gekennzeichnet, daß es
folgende Schritte umfaßt:
- a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
- iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
- b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
- c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische
Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat in transformierten
Zellen führt, um eine DNA-Sequenz prokaryontischen Ursprungs handelt.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5, und 6 dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische
Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat in transformierten
Zellen führt, um eine DNA-Sequenz handelt, die für eine Polyphosphatkinase,
eine Acetatkinase oder eine Phosphotransacetylase handelt.
9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische
Aktivität zur Bildung von Polyphosphat in transformierten Zellen führt, um das
ppk-Gen aus E. coli oder um das ppk-Gen aus Klebsiella aerogenes handelt.
10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische
Aktivität zur Bildung von Acetylphosphat in transformierten Zellen führt, um
das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila, um das ack-Gen aus E. coli oder um
das pta-Gen aus Methanosarcina thermophila handelt.
11. Transgene Pflanzenzellen enthaltend mindestens eine DNA-Sequenz, die für
ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität die Bildung von
Polyphosphat oder Acetylphosphat in den Zellen bewirkt, wobei diese DNA-
Sequenz mit regulatorischen DNA-Sequenzen für die Transkription und
Translation in pflanzlichen Zellen verknüpft ist.
12. Transgene Pflanzenzellen gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei der besagten
DNA Sequenz um das ppk-Gen aus E. coli, das ppk-Gen aus Klebsiella aerogenes, das
ack-Gen aus E. coli, das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila oder das pta-Gen
aus Methanosarcina thermophila handelt.
13. Transgene Pflanzenzellen gemäß den Ansprüchen 11 und 12, wobei es sich
um photosynthetisch aktive Zellen handelt.
14. Transgene Pflanzenzellen gemäß den Ansprüchen 11 und 12 dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um Zellen einer Nutzpflanze handelt.
15. Transgene Pflanzenzelle gemäß den Ansprüchen 11 und 12 dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um Zellen einer Kartoffelpflanze handelt.
16. Transgene Pflanzen enthaltend mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein
Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer
Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodiert, wobei diese DNA-
Sequenz mit regulatorischen DNA-Bereichen für die Transkription und
Translation in pflanzlichen Zellen verknüpft ist, stabil in das Genom integriert
ist, und es aufgrund der Expression der besagten DNA-Sequenz zur Bildung von
Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in Zellen der Pflanze
kommt.
17. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
um eine Nutzpflanze handelt.
18. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
um eine Kartoffelpflanze handelt.
19. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen
Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer
Phosphotransacetylase kodieren, zur Expression in pflanzlichen Zellen.
20. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen
Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer
Phosphotransacetylase kodieren zur Erzeugung von Polyphosphat oder
Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in pflanzlichen Zellen.
21. Verwendung des ppk-Gens aus E. coli, des ppk-Gens aus Klebsiella aerogenes, des
ack-Gens aus E. coli, des ack-Gens aus Methanosarcina thermophila oder des pta-Gens
aus Methanosarcina thermophila zur Erzeugung von Polyphosphat oder
Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in pflanzlichen Zellen.
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