DE4444460A1 - Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen - Google Patents

Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ertragsteigerung bei Pflanzen sowie ein Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen, wobei die Ertragsteigerung bzw. die Veränderung des Blühverhaltens dadurch erreicht wird, daß in Zellen transgener Pflanzen Proteine exprimiert werden, die aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität zur Erzeugung von leicht mobilisierbaren Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole führen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, die aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität zur Erzeugung von leicht mobilisierbaren Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole führen, zur Expression in pflanzlichen Zellen.
Um die Versorgung der ständig wachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln zu gewährleisten, ist es erforderlich, sich um eine Steigerung des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen.
In den letzten Jahrzehnten war es möglich, die Erträge der Kulturpflanzen aufgrund der Industrialisierung der Landwirtschaft kontinuierlich zu steigern. Dazu trugen insbesondere die Mechanisierung der Landwirtschaft, die modernisierte Pflanzenzüchtung, der Pflanzenschutz, aber auch die verbesserte Pflanzenernährung durch den Einsatz verschiedener Düngemittel bei.
Eine Steigerung der Erträge durch eine Verbesserung der obengenannten Maßnahmen ist momentan kaum noch zu erreichen. Beispielsweise ist die Versorgung der Pflanzen mit das Wachstum von Pflanzen begrenzenden Nährstoffen in der Biosphäre, z. B. Stickstoff und Phosphor, heutzutage in der Regel gewährleistet. Das bedeutet, daß auch eine weitere Düngung zu keiner Ertragsteigerung mehr führt. Die Entwicklung neuer Pflanzensorten mit höherem Ertrag durch die Verfahren der Pflanzenzüchtung ist sehr zeitaufwendig und häufig werden negative Eigenschaften der resultierenden Pflanzensorten, beispielsweise eine geringere Krankheitsresistenz, in Kauf genommen. Dies hat wiederum den verstärkten Einsatz von Pflanzenschutzmitteln zur Folge.
Eine Möglichkeit zur Erzeugung von Pflanzensorten mit einem erhöhten Ertrag besteht in der gezielten gentechnischen Veränderung von Pflanzen.
Beschrieben ist beispielsweise die Expression einer prokaryontischen Asparaginsynthetase in pflanzlichen Zellen, wodurch es bei den Pflanzen unter anderem zu einer Steigerung der Biomasseproduktion kommt (EP 0 511 979).
In anderen Verfahren wird versucht, die Expression von Genen zu verändern, deren Produkte eine Funktion in Speicherstoffsynthesewegen in Pflanzen besitzen, oder es wird versucht, die Verteilung der im Laufe der Photosynthese gebildeten Photoassimilate derart zu verändern, daß bevorzugt "sink"-Organe, insbesondere Speicherorgane, mit Photoassimilaten versorgt werden. Hierbei wird zum einen versucht, die Aufnahmefähigkeit der "sink"-Organe für die jeweilige Transportform der Photoassimilate, in der Regel Saccharose, zu verbessern, oder den Transport direkt zu beeinflussen.
In der EP 0 442 592 wird z. B. die Expression einer Invertase in Kartoffelpflanzen beschrieben, die zur Veränderung des Ertrages in derartig manipulierten Pflanzen führt.
Auch die Verwendung des Saccharosetransporters (Riesmeier et al, 1994, EMBO J. 13 : 1-7) zur Beeinflussung des Saccharosetransportes wird erwogen (WO 94/00574).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere allgemein bei Pflanzen anwendbare gentechnische Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion bzw. des Ertrages zur Verfügung zu stellen.
Es wurde überraschend gefunden, daß durch die Expression von DNA- Sequenzen, die für Proteine kodieren, deren enzymatische Aktivität zur Erzeugung von Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole in transgenen pflanzlichen Zellen führt, eine Erhöhung der Biomasseproduktion und somit eine Ertragsteigerung bei derartigen transgenen Pflanzen erreicht werden kann.
Unter dem Begriff Phosphat-Pool wird im Rahmen dieser Erfindung jeweils eine Klasse von Molekülen verstanden, die Phosphat kovalent gebunden enthalten, und aus denen Phosphat durch in der Regel reversible enzymatische Reaktionen leicht mobilisiert, d. h. freigesetzt oder auf andere Moleküle übertragen werden kann. Dies erhöht die Verfügbarkeit von Phosphat in den Zellen für verschiedene Phosphat-abhängige Reaktionen. Unter dem Begriff "leicht mobilisierbar" wird verstanden, daß das Phosphat schneller im Cytosol der Zelle verfügbar ist, als es gewöhnlicherweise durch den Transport von Phosphat aus der Vakuole in das Cytosol möglich ist. Die Freisetzung von Phosphat aus der Vakuole in das Cytosol im Fall einer Phosphatdefizienz im Cytosol erfolgt in der Regel im Bereich mehrerer Stunden (Woodrow et al, 1984, Planta 161, 525-530).
Unter Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen wird im Rahmen dieser Erfindung eine Erhöhung der Biomasse der gesamten Pflanze (gemessen als Trockengewicht) und/oder einzelner Teile im Vergleich zu Wildtyppflanzen verstanden, vorzugsweise eine Steigerung um mindestens 5% und insbesondere eine Steigerung um mehr als 10%.
Die Steigerung der Biomasseproduktion umfaßt somit auch die Steigerung des Ertrages von landwirtschaftlich nutzbaren Teilen von Pflanzen, beispielsweise von Speicherorganen, wie Kartoffelknollen, Rüben, Samen, Früchten, oder von Blättern, Stämmen etc., in Pflanzen, in denen Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole erzeugt wurden, im Vergleich zu Wildtyppflanzen, vorzugsweise um mindestens 5% und insbesondere um mehr als 10%.
Derartige Steigerungen übertreffen Steigerungen, die durch herkömmliche Züchtungsverfahren in der Regel erreicht werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion bzw. des Ertrags in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht mobilisierbare Phosphat- Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit von Phosphat gewährleisten.
Bei den Phosphat-Pools handelt es sich vorzugsweise um Phosphat-Pools, die die für metabolische Prozesse notwendige cytosolische Homöostase bezüglich der Phosphatkonzentration nicht beeinträchtigen, aber aus denen Phosphat leicht freigesetzt oder auf andere Moleküle übertragen werden kann.
Hierfür besonders geeignet sind phosphathaltige Verbindungen, die normalerweise nicht in höheren Pflanzen vorkommen. Dazu gehören Polyphosphat (Wood, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57 : 235-260), eine Verbindung, die von den meisten Organismen, außer höheren Pflanzen, als Speicherstoff für Phosphat synthetisiert wird, und z. B. auch Acetylphosphat, das in Bakterien zur ATP-Regenerierung verwandt wird (siehe z. B. Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580).
Die Erzeugung derartiger Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole erfolgt dabei vorzugsweise dadurch, daß in pflanzliche Zellen DNA-Sequenzen eingeführt und zur Expression gebracht werden, die für Proteine kodieren, deren enzymatische Aktivität zur Erzeugung von Phosphat-Pools, insbesondere von Polyphosphat oder Acetylphosphat, in transgenen pflanzlichen Zellen führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche Zellen mindestens eine DNA-Sequenz eingeführt und zur Expression gebracht wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den transformierten Zellen führt.
Ein derartiges Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen umfaßt dabei vorzugsweise folgende Schritte:
  • a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
    • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
    • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl­ phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
    • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Weiterhin wurde überraschend gefunden, daß die Expression von DNA- Sequenzen, die für Proteine kodieren, deren enzymatische Aktivität zur Erzeugung von Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole in den Zellen transgener Pflanzen führt, in diesen Pflanzen eine Veränderung des Blühverhaltens, insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung bewirkt.
Unter einer Veränderung des Blühverhaltens bzw. einer vorzeitigen Blütenbildung wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, daß transformierte Pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen mindestens einige Tage, vorzugsweise eine bis mehrere Wochen, insbesondere 1-2 Wochen früher blühen.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht mobilisierbare Phosphat-Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit von Phosphat gewährleisten.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine DNA-Sequenz in pflanzliche Zellen eingeführt und zur Expression gebracht wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den transformierten Zellen führt.
Ein derartiges Verfahren umfaßt in der Regel folgende Schritte:
  • a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
    • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
    • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl­ phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
    • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Für den in den erfindungsgemäßen Verfahren unter i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Die Expression der besagten DNA-Sequenzen kann generell in jedem Gewebe einer transformierten Pflanze und zu jedem Zeitpunkt stattfinden. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al, 1985, Nature 313 : 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen, vorzugsweise in photosynthetisch aktivem Gewebe (siehe z. B. Stockhaus et al, 1989, EMBO J. 8 : 2245-2251) oder nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279).
Bei den in den erfindungsgemäßen Verfahren unter Verfahrensschritt a)ii) genannten DNA-Sequenzen handelt es sich vorzugsweise um DNA-Sequenzen, die für Proteine mit den enzymatischen Eigenschaften einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren.
Polyphosphatkinasen (ATP : Polyphosphatphosphotransferase) katalysieren die Reaktion:
Polyphosphatn + ATP ⇄ Polyphosphatn+1 + ADP
Das Produkt dieser reversiblen Reaktion ist ein lineares Polymer von Orthophosphatresten. Die Länge der Polymere kann dabei im Bereich von 3 bis zu über 1000 Phosphatresten reichen. Das Enzym wurde bereits in verschiedenen Organismen beschrieben, u. a. E. coli (Ahn und Kornberg, 1990, J. Biol. Chem. 265 : 11 734-11 739; Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22 556-22 561), Klebsiella aerogenes (Kato et al, 1993, Gene 137 : 237-242), S. cerevisiae (Felter und Stahl, 1997, Biochemie 55 : 245-251), Propionibacterium shermanii (Robinson und Wood, 1986, J. Biol. Chem. 261 : 4481-4485; Robinson et al, 1987, J. Biol. Chem. 262 : 5216-5222), Corynebacterium xerosis (Muhammed, 1961, Biochim. Biophys. Acta 54 : 121-132) und Arthobacterium atrocyaneus (Levinson et al, 1975, J. Gen. Microbiol. 88 : 65-74).
Acetatkinasen (ATP: Acetat Phosphotransferase; E.C. 2.7.2.1.) katalysieren die Reaktion:
Acetat + ATP ⇄ Acetylphosphat + ADP
Das Enzym ist in einer ganzen Reihe von Mikroorganismen identifiziert worden, und DNA-Sequenzen, die für Acetatkinasen kodieren, sind ebenfalls isoliert worden, beispielsweise das ack-Gen aus E. coli K-12 (Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580) und das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Phosphotransacetylasen (Acetyl-CoA: Orthophosphat Acetyltransferase; E.C. 2.3.1.8.) katalysieren die folgende Reaktion:
Acetyl-CoenzymA + Orthophosphat ⇄ Acetylphosphat + CoenzymA
DNA-Sequenzen, die für dieses Enzym kodieren, sind ebenfalls beschrieben, z. B. das pta-Gen aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Bei den DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, deren enzymatische Aktivität zur Bildung von Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole führt, insbesondere für Proteine mit der enzymatischen Eigenschaft einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase, kann es sich um genomische oder um cDNA-Sequenzen prokaryontischen oder eukaryontischen Ursprungs handeln. Die DNA-Sequenzen können mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden aus Zellen isoliert oder auf synthetischem Wege hergestellt worden sein.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt DNA- Sequenzen verwendet, die für Proteine kodieren, die die enzymatische Eigenschaft einer Polyphosphatkinase besitzen und einen niedrigen Km-Wert für ADP und einen hohen Km-Wert für ATP aufweisen. Diese Enzyme werden in ihrer Aktivität in der Regel durch das Verhältnis von ATP zu ADP beeinflußt. Das bedeutet, daß eine Neubildung eines Phosphat-Pools nur erfolgt, wenn ATP im Überschuß gegenüber ADP vorliegt. Dies führt zu einer Verarmung der cytosolischen Phosphatkonzentration unter Bedingungen, die die ATP-Bildung bevorzugen, und zu einem stetigen Rückfluß von Phosphat aus der Vakuole. Diese neugebildeten Pools besitzen gegenüber dem vakuolären Phosphatpool den Vorteil, daß sie leichter mobilisierbar sind. Die Freisetzung von Phosphat aus der Vakuole in das Cytosol im Fall einer Phosphatdefizienz im Cytosol erfolgt in der Regel im Bereich mehrerer Stunden (Woodrow et al., 1984, Planta 161, 525-530). Insbesondere bedeutet dies, daß diese pflanzenfremden Verbindungen aufgrund der enzymatischen Eigenschaften der obenbeschriebenen Enzyme relativ schnell abgebaut werden können und somit Phosphat mobilisiert werden kann, wenn das Verhältnis von ATP zu ADP absinkt.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren sehen die Verwendung prokaryontischer DNA-Sequenzen vor, vorzugsweise von DNA-Sequenzen aus E. coli oder Klebsiella aerogenes, die für eine Polyphosphatkinase kodieren, und insbesondere des ppk-Gens aus E. coli (Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22 556-22 561) oder des ppk-Gens aus Klebsiella aerogenes (Kato et al, 1993, Gene 137 : 237-242), oder von DNA-Sequenzen aus Methanosarcina thermophila oder E. coli, die für eine Acetatkinase oder eine Phosphotransacetylase kodieren, insbesondere des ack-Gens aus E. coli K-12 (Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580), des ack-Gens aus Methanosarcina thermophila oder des pta-Gens aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren sieht vor, daß in pflanzliche Zellen gleichzeitig eine DNA-Sequenz eingeführt wird, die für ein Protein kodiert, das zur Synthese von Polyphosphat führt, sowie eine Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Acetatkinase kodiert, und eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Phosphotransacetylase kodiert. Die enzymatischen Aktivitäten der Acetatkinase und der Phosphotransacetylase führen zur Umsetzung von Acetyl-CoenzymA und ADP zu Acetat und ATP. Das entstehende ATP kann anschließend von der Polyphosphatkinase zur Synthese von Polyphosphat verwendet werden.
Die Mobilisierung der durch die erfindungsgemäßen Verfahren in den Zellen außerhalb der Vakuole gebildeten Phosphat-Pools, insbesondere Polyphosphat, kann neben den Enzymen, die die obenbeschriebenen reversiblen Reaktionen katalysieren, auch durch andere Enzyme erfolgen. Enzyme, die Polyphosphat als Substrat verwenden, sind bekannt. DNA-Sequenzen, die für derartige Enzyme kodieren, müssen dann ebenfalls in die pflanzlichen Zellen eingebracht und exprimiert werden. Bekannt ist beispielsweise die Polyphosphat-Glucokinase, die bereits in einer Reihe von Mikroorganismen beschrieben wurde, beispielsweise in Mycobacterium phlei (Szymona, 1956, Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Sci. Biol. 5 : 379- 381; Szymona und Ostrowski, 1964, Biochim. Biophys. Acta 85 : 283-295), Propionibacterium shermanii (Pepin und Wood, 1986, J. Biol. Chem. 261 : 4476-4480), Corynebacterium xerosis (Dirheimer und Ebel, 1968, Bull. Soc. Chim. Biol. 50 : 1 933- 1947) und Mycobacterium tuberculosis (Szymona et al, 1977, Acta Biochim. Pol. 24 : 133-42). Weitere Enzyme, die Polyphosphat als Substrat verwenden und daher für die Mobilisierung von Polyphosphat geeignet sind, sind z. B. auch die Polyphosphat: AMP-Phosphotransferase (Bonting et al, 1991, J. Bacteriol. 173 : 6484- 6488; Dirheimer und Ebel, 1965, C.R. Acad. Sci. Paris 260 : 3787-3790), die 1,3- Diphosphoglycerat: Polyphosphat-Phosphotransferase (Kulaev et al, 1968, Biokhimiya 33 : 419-434; Wood und Goss, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 312- 315), die Polyphosphat-abhängige NAD-Kinase (Murata et al, 1980, Agric. Biol. Chem. 44 : 61-68), die Exopolyphosphatase (siehe z. B. Akiyama et al, 1993, J. Biol. Chem. 268 : 633-639; Wurst und Kornberg, 1994, J. Biol. Chem. 269 : 10 996-11 001) und die Endopolyphosphatase (E.C. 3.6.1.10.; siehe z. B. Kowalczyk und Phillips, 1993, Analyt. Biochem. 212 : 194-205).
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das in der transgenen Pflanzenzelle exprimierte Protein, das aufgrund seiner enzymatischen Aktivität die Bildung eines Phosphat-Pools außerhalb der Vakuole bewirkt, insbesondere von Polyphosphat oder Acetylphopsphat, in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die kodierende Region mit DNA- Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Protein im Cytosol, den Plastiden oder den Mitochondrien lokalisiert sein. Für die Lokalisation im Cytosol ist keine spezielle Signalsequenz erforderlich. Bei der Verwendung prokaryontischer Sequenzen ist darauf zu achten, daß diese keine Signalsequenzen aufweisen, die eine Sekretion des zu exprimierenden Proteins bewirken. Signalsequenzen, die die Lokalisation beispielsweise in den Mitochondrien oder den Plastiden gewährleisten, sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., 1992, EMBO J. 11 : 3219-3227; Wolter et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 846-850).
Die Terminationssequenz dient der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al, 1989, EMBO J. 8 : 23- 29) und sind beliebig austauschbar.
Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Expressionskassette ist vorzugsweise auf einem Plasmid lokalisiert, insbesondere auf den Plasmiden p35S-PPK (Fig. 1) oder p35S-ACK (Fig. 3), und wird vorzugsweise unter Verwendung eines Plasmids, das für die Transformation pflanzlicher Zellen geeignet ist, in pflanzliche Zellen eingeführt. In den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung wurde der binäre Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66 : 221-230) verwendet. Bei diesem Vektor handelt es sich um ein Derivat des binären Vektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12 : 8711-8721), der kommerziell erhältlich ist (Clontech Laboratories, Inc., USA). Es ist jedoch auch jeder andere Pflanzentransformationsvektor geeignet, in den eine Expressionskassette inseriert werden kann, und der die Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom gewährleistet.
Zur Transformation gemäß den Verfahrensschritten b) mit der gemäß Verfahrensschritt a) konstruierten Expressionskassette kommen grundsätzlich Zellen aller Pflanzenspezies in Frage. Bevorzugt werden in dem Verfahren Zellen landwirtschaftlicher Nutzpflanzen verwendet, insbesondere von Getreidearten, Kartoffel, Mais, Raps, Erbse, Zuckerrübe Sojabohne, Tomate etc., oder Zellen von Zierpflanzen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die aus den erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden transgenen Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen. Die transgenen Pflanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß es in Zellen dieser Pflanzen aufgrund der Einführung und der stabilen Integration einer gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren konstruierten Expressionskassette in das Genom zur Expression eines Proteins kommt, das aufgrund seiner enzymatischen Aktivität die Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den transgenen Zellen bewirkt.
Insbesondere betrifft die Erfindung transgene Pflanzen enthaltend mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodiert, wobei diese DNA-Sequenz mit regulatorischen DNA-Bereichen für die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen verknüpft ist, stabil in das Genom integriert ist und es aufgrund der Expression der besagten DNA-Sequenz zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in Zellen der Pflanze kommt. Bevorzugt handelt es sich bei den transgenen Pflanzen um Zierpflanzen oder um Nutzpflanzen, insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen, wie z. B. Getreide, Mais, Kartoffel, Tomate, Raps, Zuckerrübe etc.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von DNA- Sequenzen, die für Proteine kodieren, die aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität zur Bildung von leicht mobilisierbaren Phosphat-Pools, insbesondere von Polyphosphat oder Acetylphosphat, außerhalb der Vakuole führen, zur Erzeugung derartiger Phosphat-Pools in pflanzlichen Zellen, sowie zur Transformation pflanzlicher Zellen und zur Expression in pflanzlichen Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren, zur Expression in pflanzlichen Zellen sowie zur Erzeugung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in pflanzlichen Zellen. Zu diesen Sequenzen gehören insbesondere Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren, insbesondere Sequenzen aus E. coli oder Klebsiella aerogenes, die für eine Polyphosphatkinase kodieren, z. B. das ppk-Gen aus E. coli (Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22556-22561) oder das ppk-Gen aus Klebsiella aerogenes (Kato et al., 1993, Gene 137 : 237-242), oder DNA-Sequenzen aus Methanosarcina thermophila oder E. coli, die für eine Acetatkinase oder eine Phosphotransacetylase kodieren, z. B. das ack-Gen aus E. coli K-12 (Matsuyama et al, 1989, J. Bacteriol. 171 : 577-580), das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila oder das pta-Gen aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829).
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA- Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA- Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T- DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al (1978) Mol. Gen. Genet. 163 : 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al, Crit. Rev. Plant. Sci., 4 : 1-46 und An et al (1985) EMBO J. 4 : 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Verwendete Medien und Lösungen
20 × SSC
175.3 g NaCl
88.2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH
10 × MEN
200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0
NSEB-Puffer
0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
7% SDS 1 mM EDTA
1% BSA (w/v)
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 zeigt das Plasmid p35S-PPK.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
B = Fragment B: DNA-Fragment aus Escherichia coli kodierend für Polyphosphatkinase;
Nukleotide 187-2253 des Polyphosphatkinase (ppk)-Gens (Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 1992, 267 : 22 556-22 561);
Orientierung zum Promotor: sense.
Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ppk-Gens an.
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Fig. 2 zeigt das Plasmid pACK.
Die dünne Linie entspricht dem Plasmid pUC19, die starke Linie repräsentiert eine DNA-Insertion, die die kodierende Region des ack-Gens aus Methanosarcina thermophila (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829) umfaßt. Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ack- Gens an.
Fig. 3 zeigt das Plasmid p35S-ACK.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
B = Fragment B: DNA-Fragment aus Methanosarcina thermophila kodierend für Acetatkinase;
Nukleotide 1314-2748 des Acetatkinase (ack)-Gens (Latimer und Ferry, 1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-829);
Orientierung zum Promotor: sense.
Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung des ack-Gens an.
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Fig. 4 zeigt den Knollenertrag in g/Pflanze von Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-PPK transformiert wurden, im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen (Wildtyp).
Untersucht wurden Pflanzen, die im Gewächshaus kultiviert wurden, der Linien JP1 16, JP1 26, JP1 29, JP1 31, JP1 33, JP1 34 und JP1 35 sowie Wildtyppflanzen der Kartoffelvarietät Desir´e. Die Ernte der Kartoffeln erfolgte 11 Wochen nach dem Aussetzen der Pflanzen.
n = Anzahl der zur Analyse verwendeten Pflanzen
g/Pflanze = durchschnittliches Knollengewicht/ Pflanze
Fig. 5a und b illustriert die vorzeitige Blütenbildung von Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-PPK transformiert wurden, im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen (Wildtyp).
Transformierte Kartoffelpflanzen der Linien JP1 16, JP1 26, JP1 29, JP1 31, JP1 33, JP1 34 und JP1 35 sowie Wildtyppflanzen der Kartoffelvarietät Desir´e wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Fig. 5a zeigt den prozentualen Anteil der untersuchten Pflanzen jeder Linie bzw. der Wildtyppflanzen, die nach 80 Tagen nach dem Aussetzen der Pflanzen blühten. Fig. 5b zeigt den prozentualen Anteil der untersuchten Pflanzen jeder Linie bzw. der Wildtyppflanzen, die nach 84 Tagen nach dem Aussetzen der Pflanzen blühten.
n = Anzahl analysierten Pflanzen
% Pflanzen = prozentualer Anteil der Pflanzen, die blühen
Fig. 6 zeigt transformierte Kartoffelpflanzen im Vergleich mit nicht­ transformierten Kartoffelpflanzen.
Drei Pflanzen der Kartoffellinie JP1 35, die mit dem Plasmid p35S-PPK transformiert wurden (hinten), sind im Vergleich gezeigt mit zwei nicht- transformierten Kartoffelpflanzen (vorne). Die Pflanzen sind ca. 84 Tage alt und wurden im Gewächshaus gehalten.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Expression einer prokaryontischen Polyphosphatkinase sowie einer prokaryontischen Acetatkinase im Cytosol transgener Kartoffelpflanzen und die Auswirkungen dieser Expression auf den Ertrag der Pflanzen sowie auf das Blühverhalten der Pflanzen beschrieben wird. Analog zu den dargestellten Beispielen können auch andere DNA-Sequenzen, die für Enzyme, die zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat in den Zellen führen, kodieren, verwendet werden und auch andere Pflanzen, insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Zuckerrübe, Mais, Getreidearten, Sojabohne, Raps, Sojabohne, Tomate etc. verändert werden.
In den folgenden Ausführungsbeispielen wurden folgende Standardtechniken angewendet:
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung in E. coli wurde der Vektor pUC19 verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66 : 221-230) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für den pUC19-Vektor und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 durchgeführt (Rocha-Sosa et al (1989) EMBO J. 8 : 23-29).
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16 : 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7 : 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Transformation von Kartoffeln
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15 : 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens- Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l Hygromycin B und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B und 0.80% Bacto Agar gelegt.
5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA- Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
6. Northern Blot-Analyse
RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN- Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken.
Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.
7. Pflanzenhaltung
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode
14 h bei 1300 Lux und 25°C
Dunkelperiode 10 h bei 20 °C
Luftfeuchte 60%
Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1 Konstruktion des Plasmids p35S-PPK und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Für die Konstruktion des Plasmids p35S-PPK wurde zunächst ein DNA- Fragment, das für die Polyphosphatkinase aus E. coli kodiert, mit Hilfe der PCR- Technik ("Polymerase Chain Reaction") amplifiziert. Hierzu wurde genomische DNA aus E. coli-Zellen des Stamms DH5α nach Standardmethoden isoliert (siehe z. B. Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY). Unter Verwendung der beiden Oligonukleotide
Oligo 1
5′-AAGGATCCAGGAACCCGGGCCATGGGTCAGGAAAAG-3′
und
Oligo 2
5′-GGGGATCCCGGGCCATGGGTTATTCAGGTTG-3′
wurde durch die PCR-Reaktion ein ca. 2,1 kb langes DNA-Fragment amplifiziert, das die Nukleotide 187 bis 2253 der in Akiyama et al (1992, J. Biol. Chem. 267, Seite 22 558) dargestellten DNA-Sequenz (ppk-Gen), die für Polyphosphatkinase aus E. coli kodiert, umfaßt. Durch das Oligonukleotid 1, das teilweise zu dem 5′- Ende des ppk-Gens komplementär ist, werden am 5′-Ende des amplifizierten DNA-Fragmentes Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsendonukleasen BamH I und eine Sma I eingeführt. Durch das Oligonukleotid 2, das teilweise zu dem 3′-Ende des ppk-Gens komplementär ist, werden am 3′-Ende des Fragmentes Schnittstellen für BamH I, Sma I und Nco I eingeführt. Das aus der PCR-Reaktion resultierende DNA-Fragment wurde mit BamH I geschnitten und in den mit BamH l geschnittenen binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66 : 221-230) ligiert. Bei diesem handelt es sich um ein Derivat des binären Vektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12 : 8711-8721). pBinAR wurde folgendermaßen konstruiert:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Cauliflowermosaic-Virus umfaßt (Franck et al, 1980, Cell 21 : 285-294), wurde als EcoR I/Kpn I-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al, Nucl. Acids Res. 14 : 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoR I- und die Kpn I-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.
Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al, Nature 303 : 209-213) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen Pvu II und Hind III ein 192 bp langes Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al, EMBO J. 3 : 835-846) umfaßt (Nukleotide 11 749- 11 939). Nach Addition von Sph I-Linkern an die Pvu I-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die Sph I- und Hind III-Schnittstellen pBin19-A ligiert. Dabei entstand pBinAR.
Mit Hilfe von Restriktions- und Sequenzanalysen wurden rekombinante Vektoren identifiziert, bei denen das amplifizierte DNA-Fragment derart in den Vektor inseriert ist, daß die kodierende Region für die Polyphosphatkinase aus E. coli in sense-Orientierung mit dem 35S-Promotor verknüpft ist. Das resultierende Plasmid, p35S-PPK, ist in Fig. 1 dargestellt.
Durch die Insertion des amplifizierten DNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist:
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
Das Fragment B enthält die kodierende Region für Polyphosphatkinase aus E. coli. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 187-2253 des Polyphosphatkinase-Gens (Akiyama et al, 1992, J. Biol. Chem. 267 : 22556-22561). Diese kodierende Region wurde in sense-Orientierung an den 35S-Promotor ligiert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHs (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-PPK beträgt ca. 13 kb.
Da die verwendete kodierende Region des Gens für Polyphosphatkinase aus E. coli keine Signalsequenz umfaßte, sollte das exprimierte Protein im Cytoplasma transformierter Zellen vorliegen.
Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Zellen von Kartoffelpflanzen transferiert wie oben beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Auf diese Weise wurden 40 Linien transformierter Pflanzen erzeugt, von denen 7 Linien, insbesondere die Linien JP1 16, JP1 26, JP1 29, JP1 31, JP1 33, JP1 34 und JP1 35, näher analysiert wurden.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffelpflanzen die Expression des Gens für die Polyphosphatkinase aus E. coli. Die Expression wurde mit Hilfe von Nothern-Blot-Analysen nachgewiesen. Dazu wurde RNA aus Gewebe von transgenen Pflanzen isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der radioaktiv markierten kodierenden Region des ppk-Gens aus E. coli hybridisiert. Von den obengenannten 7 transgenen Kartoffellinien wurde jeweils eine Pflanze im Hinblick auf die Expression des ppk-Gens untersucht. Alle zeigten eine deutliche Expression des ppk-Gens aus E. coli. In Wildtyppflanzen konnten dagegen keine Transkripte dieses Gens nachgewiesen werden.
Die Pflanzen zeigten im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen wesentlich höheren Ertrag pro Pflanze (gemessen als g Knollen/Pflanze) (Fig. 4). Die transformierten Pflanzen bildeten im Vergleich zu Wildtyppflanzen nicht mehr, dafür aber wesentlich größere Knollen.
Der Stärkegehalt der Knollen transformierter Pflanzen entsprach dem Stärkegehalt von Knollen von Wildtyppflanzen (Messung durch Bestimmung der Dichte der Knollen).
Weiterhin zeigten die transformierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyppflanzen eine vorzeitige Blütenbildung (Fig. 5 und 6). Bei transformierten Pflanzen setzte die Blüte durchschnittlich 1-2 Wochen früher ein als bei Wildtyppflanzen, die unter den gleichen Bedingungen gehalten wurden.
Ausführungsbeispiel 2 Konstruktion des Plasmids p35S-ACK und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Für die Konstruktion des Plasmids p35S-ACK wurde zunächst ein DNA- Fragment, das für die Acetatkinase aus Methanosarcina thermophila kodiert (ack- Gen), isoliert. Das Gen ist in der Sma I-Schnittstelle eines pUC19-Plasmids inseriert. Die Konstruktion dieses pUC-Plasmides ist ausführlich in Latimer und Ferry (1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829; siehe Seite 6823, rechte Spalte) beschrieben.
Das verwendete Plasmid, das im Rahmen dieser Erfindung pACK genannt wird, ist in Fig. 2 dargestellt.
Aus diesem Plasmid wurde durch Restriktionsverdau mit den Restriktionsendonukleasen Asp718 und BamH I ein ca. 1,45 kb großes DNA- Fragment isoliert und in den mit Asp718 und BamH I geschnittenen binären Vektor pBinAR ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit p35S-ACK bezeichnet und ist in Fig. 3 dargestellt.
Durch die Insertion des isolierten Asp718/BamH I-DNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist:
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al (1980) Cell 21 : 285-294).
Das Fragment B enthält die kodierende Region für Acetatkinase aus Methanosarcina thermophila. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 1314-2748 der in Latimer und Ferry (1993, J. Bacteriol. 175 : 6822-6829) dargestellten Sequenz (Acetylkinase (ack)-Gen). Diese kodierende Region wurde in sense-Orientierung an den 35S-Promotor ligiert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHs (Gielen et al (1984) EMBO J. 3 : 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-ACK beträgt ca. 12,5 kb.
Das Plasmid wurde wie oben beschrieben mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Zellen von Kartoffelpflanzen transferiert. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffelpflanzen die Expression der Acetatkinase aus Methanosarcina thermophila im Cytosol der Zellen.

Claims (21)

1. Verfahren zur Steigerung der Biomasseproduktion in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht mobilisierbare Phosphat-Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit von Phosphat gewährleisten.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche Zellen mindestens eine DNA-Sequenz eingeführt und zur Expression gebracht wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den transformierten Zellen führt.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
  • a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
    • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
    • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl­ phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
    • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
4. Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens in Pflanzen dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzlichen Zellen außerhalb der Vakuole leicht mobilisierbare Phosphat-Pools erzeugt werden, die eine erhöhte Verfügbarkeit von Phosphat gewährleisten.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche Zellen mindestens eine DNA-Sequenz eingeführt und zur Expression gebracht wird, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in den transformierten Zellen führt.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 und 5 dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
  • a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
    • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
    • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetyl­ phosphat in transformierten Zellen führt, und die in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
    • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat in transformierten Zellen führt, um eine DNA-Sequenz prokaryontischen Ursprungs handelt.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5, und 6 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat in transformierten Zellen führt, um eine DNA-Sequenz handelt, die für eine Polyphosphatkinase, eine Acetatkinase oder eine Phosphotransacetylase handelt.
9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Polyphosphat in transformierten Zellen führt, um das ppk-Gen aus E. coli oder um das ppk-Gen aus Klebsiella aerogenes handelt.
10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2, 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität zur Bildung von Acetylphosphat in transformierten Zellen führt, um das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila, um das ack-Gen aus E. coli oder um das pta-Gen aus Methanosarcina thermophila handelt.
11. Transgene Pflanzenzellen enthaltend mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, dessen enzymatische Aktivität die Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat in den Zellen bewirkt, wobei diese DNA- Sequenz mit regulatorischen DNA-Sequenzen für die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen verknüpft ist.
12. Transgene Pflanzenzellen gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei der besagten DNA Sequenz um das ppk-Gen aus E. coli, das ppk-Gen aus Klebsiella aerogenes, das ack-Gen aus E. coli, das ack-Gen aus Methanosarcina thermophila oder das pta-Gen aus Methanosarcina thermophila handelt.
13. Transgene Pflanzenzellen gemäß den Ansprüchen 11 und 12, wobei es sich um photosynthetisch aktive Zellen handelt.
14. Transgene Pflanzenzellen gemäß den Ansprüchen 11 und 12 dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen einer Nutzpflanze handelt.
15. Transgene Pflanzenzelle gemäß den Ansprüchen 11 und 12 dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen einer Kartoffelpflanze handelt.
16. Transgene Pflanzen enthaltend mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodiert, wobei diese DNA- Sequenz mit regulatorischen DNA-Bereichen für die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen verknüpft ist, stabil in das Genom integriert ist, und es aufgrund der Expression der besagten DNA-Sequenz zur Bildung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in Zellen der Pflanze kommt.
17. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Nutzpflanze handelt.
18. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Kartoffelpflanze handelt.
19. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren, zur Expression in pflanzlichen Zellen.
20. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Polyphosphatkinase, einer Acetatkinase oder einer Phosphotransacetylase kodieren zur Erzeugung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in pflanzlichen Zellen.
21. Verwendung des ppk-Gens aus E. coli, des ppk-Gens aus Klebsiella aerogenes, des ack-Gens aus E. coli, des ack-Gens aus Methanosarcina thermophila oder des pta-Gens aus Methanosarcina thermophila zur Erzeugung von Polyphosphat oder Acetylphosphat außerhalb der Vakuole in pflanzlichen Zellen.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997044471A2 (de) * 1996-05-17 1997-11-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Kartoffelpflanzen mit einer verringerten aktivität der cytosolischen stärkephosphorylase und einem veränderten keimungsverhalten
WO1998004725A1 (en) * 1996-07-31 1998-02-05 Yale University Methods for altering the rate of plant development and plants obtained therefrom

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19529696A1 (de) * 1995-08-11 1997-02-13 Inst Genbiologische Forschung Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Glykolyserate
IN1997CH00924A (en) 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
WO1998036084A2 (en) * 1997-02-14 1998-08-20 Agricola Technologies, Inc. Enhancing plant growth using genes encoding for carbonic anhydrase, calcium binding protein, metal binding protein or biomineralization protein
WO1998050561A1 (en) * 1997-05-02 1998-11-12 Mogen International N.V. Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate by inhibiting endogenous trehalase levels
WO1999023225A1 (en) * 1997-10-30 1999-05-14 Mogen International N.V. Novel high-fermenting microorganisms
WO1999024558A2 (en) * 1997-10-30 1999-05-20 Mogen International N.V. Novel high-fermenting microorganisms
ZA989782B (en) 1997-10-30 1999-05-04 Mogen Int Pre-and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds
US6476293B1 (en) 1999-10-01 2002-11-05 University Of Kentucky Research Foundation Use of bacterial acetate kinase and their genes for protection of plants against different pathogens
WO2002034925A1 (en) * 2000-10-20 2002-05-02 University Of Kentucky Research Foundation Use of bacterial acetate kinase and their genes for protection of plants against different pathogens
CN101680035B (zh) 2007-03-28 2017-05-31 孟山都技术有限公司 与主要大豆植物成熟期和生长习性基因组区域相关的snp标记的效用
WO2009035852A2 (en) 2007-09-11 2009-03-19 Monsanto Technology Llc Increased alpha-prime beta-conglycinin soybeans
KR101370283B1 (ko) * 2012-09-19 2014-03-06 전남대학교산학협력단 애기장대의 유래의 AtRBP1 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 생육촉진 및 종자수량이 증진된 식물체의 제조방법
CN109609542A (zh) * 2018-12-28 2019-04-12 博域环保技术研究院(南京)有限公司 多聚磷酸盐激酶基因ppk1在水稻中的基因工程应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644619B2 (en) * 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
US5422254A (en) * 1992-02-14 1995-06-06 Oy Alko Ab Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase
DE4220758A1 (de) * 1992-06-24 1994-01-05 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenz und Plasmide zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration
CN1131315C (zh) * 1993-06-30 2003-12-17 辛根塔莫根有限公司 植物中海藻糖的产生

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997044471A2 (de) * 1996-05-17 1997-11-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Kartoffelpflanzen mit einer verringerten aktivität der cytosolischen stärkephosphorylase und einem veränderten keimungsverhalten
WO1997044471A3 (de) * 1996-05-17 1997-12-24 Max Planck Gesellschaft Kartoffelpflanzen mit einer verringerten aktivität der cytosolischen stärkephosphorylase und einem veränderten keimungsverhalten
WO1998004725A1 (en) * 1996-07-31 1998-02-05 Yale University Methods for altering the rate of plant development and plants obtained therefrom

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