DE69721892T2

DE69721892T2 - CPC-Gen zur Regulierung der Initiation von der Wurzelhaarbildung bei Arabidopsis (thaliana), und diese überexprimierende transgene (Arabidopsis) Pflanzen

Info

Publication number: DE69721892T2
Application number: DE69721892T
Authority: DE
Inventors: Takuji Suita-shi Wada; Kiyotaka Uji-shi Okada
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-03-13
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2017-03-14
Also published as: US5831060A; EP0803572B1; JP4051719B2; EP0803572A3; CA2199582A1; EP0803572A2; JPH104978A; DE69721892D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gen zur Förderung der Bildung von Pflanzen-Wurzelhärchen sowie transgene Pflanzen, die dieses Gen überexprimieren.
Hintergrund der Erfindung.
Bekannte Mutanten bezüglich Wurzelhärchen einer Pflanze umfassen solche mit einer erhöhten Anzahl an Wurzelhärchen, wie ttg (Transparenz-Test-Gabra), g12 (glabrous2) (Galway, M. E. et al., Dev. Biol. 166, 740–754 (1964); Rerie, W. G. Genes & Development, 8, 1388–1399 (1994)) und solche mit Wurzelhärchen abnormer Formen, wie rhd1, rhd2, rhd3 und rhd4 (Schiefelbein, J & Somerville, C., Plant Cell 2, 235–243 (1990). Bekannte Mutanten mit einer geringeren Anzahl an Wurzelhärchen umfassen rhd6 und diese Mutanten sind komplementiert mit einem Pflanzenhormon wie Auxin (Masucci, J. D. & Schiefelbein, J. W., Plant Physiol. 106, 1335–1346 (1994)), aber eine Mutante, die nicht mit einem Pflanzenhormon, wie Auxin, komplementiert ist, d. h. eine Mutante mit Abnormalität in ihrem Signal-Transmissions-System zur Bildung von Wurzelhärchen war nicht bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Wenn eine Mutante, die dazu kommt, aufgrund einer Abnormalität in ihrem Signal-Transmissions-System zur Bildung von Wurzelhärchen, eine geringere Anzahl an Wurzelhärchen zu bilden, abgetrennt werden kann, könnte ein Gen, das an der Bildung von Wurzelhärchen beteiligt ist, identifiziert werden durch Untersuchen der Stelle mit dieser Abnormalität.
Die vorliegende Erfindung wurde vor diesem technischen Hintergrund entwickelt, und das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Gen zu isolieren, um die Bildung von Wurzelhärchen von Pflanzen zu fördern und transgene Pflanzen zur Verfügung zu stellen, in die das Gen eingefügt ist.
Als Ergebnis angestrengter Untersuchungen wurde erfolgreich mutierte Arabidopsis mit einer geringeren Anzahl an Wurzelhärchen isoliert, ein Gen, das an dieser Mutation in der Pflanze beteiligt ist, geklont werden, ferner wurde das Gen in Wildtyp Arabidopsis eingeführt, um es zu exprimieren, und auf der Grundlage dieser Feststellungen wurde die vorliegende Erfindung entwickelt.
D. h. die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gen, das für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 im wesentlichen identisch ist, kodiert.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Polynucleotid, das für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder ein Fragment dieser Aminosäuresequenz kodiert, das die Bildung von Pflanzen-Wurzelhärchen beschleunigt.
Sie betrifft auch:

– ein isoliertes DNA-Fragment, umfassend einen Promotor, der operabel an eine DNA-Sequenz nach der Erfindung gebunden ist;
– einen Vektor, der ein isoliertes DNA-Fragment nach der Erfindung umfaßt;
– eine Pflanzenzelle, die mit einem isolierten DNA-Fragment nach der Erfindung oder einem Vektor nach der Erfindung transformiert ist;
– eine transgene Pflanze, die aus einer Pflanzenzelle nach der Erfindung regeneriert worden ist;
– eine transgene Pflanze, umfassend Zellen nach der Erfindung:
– Samen, der von einer transgenen Pflanze nach der Erfindung erhalten worden sind;
– ein Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze, wobei das Verfahren umfaßt:
(i) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6;
(ii) Regenerieren einer Pflanze aus der transformierten Zelle und
(iii) gegebenenfalls biologisches Vermehren der so gebildeten Pflanze.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Fotografie einer Wurzel von Caprice.
2 zeigt das Southern Blotting von Caprice und des Wildtyps.
3 zeigt die HindIII-Spaltungsstellen von Caprice und dem Wildtyp.
4 ist eine Fotografie einer Wurzel einer Pflanze, die das CPC-Gen überexprimiert.
5 ist eine Fotografie eines Blattes einer Pflanze, die das CPC-Gen überexprimiert.
6 ist eine Fotografie eines Stiels einer Pflanze, die das CPC-Gen überexprimiert.
7 ist eine Fotografie von Blättern von ttg, gl1 bzw. gl2.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Das erfindungsgemäße Gen kodiert die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 im wesentlichen identisch ist. Das für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 kodierende Polynucleotid kann eine DNA-Sequenz sein. Die DNA-Sequenz kann die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 2 sein, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 kodiert. Die „Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 im wesentlichen identisch ist" bezeichnet, wie der Ausdruck hier verwendet wird, eine durch SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz , wobei einige Aminosäuren weggelassen, ersetzt, hinzugefügt usw. sind, und mit der selben Wirkungsweise wie diejenige der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, d.h. mit der Wirkung, die Bildung von Pflanzen-Wurzelhärchen zu fördern. Um einige Aminosäuren wegzulassen, zu ersetzen, hinzuzufügen usw. können bekannte Verfahren, z. B. ortsspezifische Mutagenese (Nucleic Acid Research, Bd. 10, Nr. 20, S. 6487–6500 (1982)) angewandt werden.
Das erfindungsgemäße Gen wirkt zur Förderung der Bildung von Wurzelhärchen. Das kann aus der Tatsache geschlossen werden, daß eine Mutante, bei der dieses Gen zerstört ist, eine geringere Anzahl an Wurzelhärchen aufweist. Obwohl bekannte Mutanten mit einer geringeren Anzahl an Wurzelhärchen rhd6 umfassen, wie unter „Stand der Technik" erwähnt, unterscheidet sich eine Mutante, die in dem erfindungsgemäßen Gen entsteht, von rhd6, indem sie nicht mit einem Pflanzenhormon kompensiert ist. Daher ist diese Mutante unbekannt. Diese Mutante wird als „Caprice" bezeichnet, da sie in einigen Fällen Wurzelhärchen bildet, aber in anderen Fällen nicht, und ein an dieser Mutation beteiligtes Gen wird als „CPG" bezeichnet.
Das CPC-Gen kann z. B. auf die folgende Weise geklont werden. Zunächst wird eine von Arabidopsis isolierte genomische DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten, die fragmentierte DNA wird an einen geeigneten Vektor gebunden und dieser Rekombinations-Vektor wird in einen Mikroorganismus als Wirt transformiert, um eine genomische DNA-Bibliothek zu erzeugen. Die Isolierung der DNA kann durchgeführt werden unter Verwendung von Cäsium-chlorid und Ethidium-bromid auf übliche Weise. Z. B. kann Sau3AI usw. verwendet werden. Es ist auch nicht erforderlich, daß der Vektor speziell ist. Z. B. kann λ-DASH II usw. angewandt werden. Der Vektor kann ein Plasmid sein. Der als Wirt zu verwendende Mikroorganismus kann je nach dem verwendeten Vektor ausgewählt werden. Wenn z. B. λ-DASH II als Vektor verwendet wird, kann E. coli XL-1 Blau MRA(P2) usw. angewandt werden.
Dann wird die oben angegebene genomische DNA-Bibliothek abgesucht. Die angewandte Sonde ist DNA, die nahe T-DNA in der Mutante Caprice lokalisiert ist. Da das CPC-Gen von Caprice durch Inssertieren von T-DNA zerstört worden ist, enthält DNA nahe T-DNA einen Teil des CPC-Gens.
Der Vektor wird von dem so mit der oben angegebenen Sonde selektierten Klon entfernt und ein von diesem Vektor erhaltenes DNA-Fragment wird als Sonde zum Absuchen einer cDNA-Bibliothek angewandt. Diese cDNA-Bibliothek kann auf übliche Weise hergestellt werden. D. h. Gesamt-RNA wird von der Pflanze isoliert, dann wird Oligo(dT) usw. angewandt, um mRNA von der Gesamt-RNA zu isolieren, und die mRNA wird angewandt, um cDNA durch Reverse Transcriptase herzustellen. Die cDNA wird an einen geeigneten Vektor gebunden, und der erhaltene Rekombinations-Vektor wird in einen Mikroorganismus als Wirt transformiert. Der in dem positiven Klon enthaltene Rekombinations-Vektor, der durch Absuchen selektiert worden ist, enthält das CPC-Gen nach der vorliegenden Erfindung.
Die Expression des CPC-Gens in Pflanzen kann erreicht werden durch Insertieren des CPC-Gens in einen geeigneten Pflanzen-Expressionsvektor und anschließendes Einfügen des erhaltenen Rekombinations-Vektors in Pflanzen. Der hier verwendete Pflanzen-Expressionsvektor ist nicht beschränkt, wenn er einen Promotor und ein Marker-Gen aufweist, die in Pflanzen wirken können. Vorzugsweise hat der Vektor einen 35S Promotor von Blumenkohl-Mosaikvirus, der in einer großen Vielfalt von Pflanzen wirken kann. Derartige Vektoren umfassen pBI121 (Clontech) usw. neben pMAT137-Hm, der in den Beispielen verwendet wird. Um den Vektor in Pflanzen einzuführen, wird vorzugsweise Agrobacterium angewandt, aber andere Mittel, wie Elektrophorese, Teilchenbeschuß usw. können ebenfalls angewandt werden. Pflanzen, die angewandt werden, um das CPC-Gen zu exprimieren, umfassen sind aber nicht beschränkt auf Rose, Tabak, Tomate, Reis, Mais, Petunie, Brassica usw. und diese Pflanzen werden bevorzugt verwendet.
Das CPC-Gen nach der Erfindung wirkt wie folgt:

(1) Es wirkt zur Förderung der Bildung von Wurzelhärchen von Pflanzen. Daher kann eine Pflanze mit mehr Wurzelhärchen als eine übliche erzeugt werden durch Einführen und übermäßige Expression des CPC-Gens.
Es wird erwartet, daß solche Pflanzen gegenüber Trockenheit resistenter sind, aufgrund ihrer hohen Fähigkeit, Wasser zu absorbieren.
(2) Es wirkt zur Verringerung von Trichomen in Blättern und Stielen. Daher kann eine Pflanze, wie eine Rose, durch Einführen und übermäßige Expression des CPC-Gens weniger Dornen besitzen.
(3) Es wirkt zur Beschleunigung der Blühzeit einer Pflanze. Daher wird erwartet, daß eine Pflanze durch Einführen und übermäßige Expression des CPC-Gens früher blüht.
(4) Es wirkt zur Verringerung einer Ansammlung von Anthocyanin in Blättern. D. h. wenn Arabidopsis bei niedriger Temperatur von etwa 16°C wächst, werden ihre Blätter usw., aufgrund der Ansammlung von Anthocyanin-Pigmenten rötlich-purpurfarben. Anthocyanin sammelt sich jedoch kaum in einer Pflanze an, in der das CPC-Gen übermäßig exprimiert ist, so bleibt die Farbe der Blätter grün, selbst wenn sie bei 16°C wächst. Da eine rote Färbung in Blumen im allgemeinen durch Pigmente vom Anthocyanin-Typ hervorgerufen wird, wird erwartet, daß eine Pflanze mit farbigen Blüten die Farbe ihrer Blüten durch Einführen und übermäßige Expression des CPC-Gens verändern kann.

Wirkung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert das CPC-Gen, das ein neues Gen ist zur Förderung der Bildung von Pflanzen-Wurzelhärchen ist. Das Einführen und die Expression dieses Gens in Pflanzen fördert die Bildung von Wurzelhärchen, während Trichome in Blättern und Stielen verringert werden können.
Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Beispiel 1. Erzeugung von transgenen Pflanzen
Samen von Arabidopsis thaliana (Varietät: Wassilewskija [WS]) wurden sterilisiert und in Agar-Medium ausgesät. Während zwei bis fünf Tagen nach dem Aussäen wurden die Sprößlinge im Dunklen kultiviert, um die Keinruhe abzubrechen und eine gleichför mige Keimung zu erreichen und früher zu blühen. Anschließend wurden sie bei 22°C unter ständiger Beleuchtung kultiviert. Zum Sterilisieren wurden die Samen in ein 1,5 ml Eppendorf Röhrchen eingebracht, und anschließend 0,5 ml sterilisiertes destilliertes Wasser, das 10% Highter^TM (Kao Corporation) enthielt, und 0,02% Triton X-100 zugegeben. Die Samen in dem Rohr wurden mit Boltex^TM gerührt, dann 3 bis 5 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen und fünfmal mit sterilisierten destilliertem Wasser gewaschen. Als Agar-Medium wurde eine Nährsalz-Lösung für Arabidopsis thaliana (985 ml destilliertes Wasser oder entionisiertes Wasser, 5 ml 1 M KNO₃, 2 ml 1 M MgSO₄, 2 ml 1 M Ca(NO₃)₂, 2,5 ml 20 mM Fe-EDTA, 1 ml Spurenelemente-Lösung, 2,5 ml KPO₄-Puffer (pH 5,5)) (Hideaki Shiraishi et al., „Gendai Kagaku" (Modern Chemistry) Extra Edition 20, Plant Biotechnology II, S. 38 (1991)) mit einem gleichen Volumen destilliertem Wasser verdünnt und anschließend Agar-Pulver (garantiertes Reagens, Nakarai K. K.) in einer Konzentration von 1,5% zugegeben und es wurde im Autoklaven behandelt und in ein Gefäß gegossen, um sich zu verfestigen. Da es diese Konzentration eines Agar-Mediums ermöglicht, daß die Wurzeln von Arabidopsis auf der Agar-Oberfläche wachsen, ohne in das Medium einzudringen, kann die Form der Wurzeln in der anschließenden Stufe leicht untersucht werden. Die angewandte Lichtquelle waren eine handelsübliche 40 kW weiße Fluoreszenz-Lampen und eine Fluoreszenz-Lampe für das Pflanzenwachstum (Homolux^TM, National) und die Samen wurden etwa 30 cm von der Lichtquelle entfernt bestrahlt. Die Helligkeit dieser Lichtquelle betrug etwa 3000 Lux.
Drei Wochen nach der Aussaat wurde Agrobacterium auf 40 Arabidopsis-Setzlinge aufgeimpft. Das Beimpfen mit Agrobacterium wurde durchgeführt durch Abschneiden eines Blütenstiels von Arabidopsis, um ihn mit Agrobacterium zu infizieren nach einer Modifikation des Verfahrens von Chang et al., (Plant J., 5, 551–558 (1994)). Das angewandte Agrobacterium war Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif, erhalten von Velten, J. et al., (Velten, J. und Schell, J., Nucl. Acids Res. 13, 6981–6998 (1985)). Dieser Stamm enthielt einen intermediären System-Vektor pGV3850HPT, in dem ein Hygromycin-Tranferase-Gen als pflanzenselektiver Marken zwischen ihrem rechten und linken Rand stromabwärts eines 35S-Promotors, der von Blumenkohl-Mosaikvirus stammte, lokalisiert war.
Nach dem Beimpfen mit Agrobacterium wurden die Arabidopsis in Kulturerde, bestehend aus einem Gemisch aus Vermiculit und Perlit (1 : 1) gepflanzt. 1,5 bis 2 Monate nach dem Pflanzen wurden ihre Samen (T2-Samen) geerntet. Diese Samen wurden auf die gleiche Weise wie oben sterilisiert, in einem Hygromycin enthaltendem Medium (gemischtes Salz für 1 X Ganborg B5 Medium, 1% Saccharose, 0,8% Agar, 10 mg/l Hygromycin B) ausgesät und kultiviert und die gegenüber Hygromycin resistenten wurden ausgewählt und in Kulturerde gepflanzt. Die Kulturerde war die gleiche wie oben beschrieben. 1,5 bis 2 Monate nach dem Auspflanzen wurden deren Samen (T3-Samen), die durch Selbstbestäubung erhalten worden waren, geerntet.
Beispiel 2. Absuchen von Wurzel-Mutanten
Die in Beispiel 1 erhaltenen T3-Samen wurden sterilisiert und in Agar-Medium ausgesät und kultiviert. Das Sterilisierungs-Verfahren und das Agar-Medium waren die gleichen wie oben beschrieben. Das Agar-Medium wurde in ein transparentes Kunststoffgefäß gegeben, so daß die Form der Wurzeln leicht beobachtet werden konnte (rechteckiges Gefäß Nr. 2 [14 × 10 cm], Eiken Kizai K. K.).
Die Form der Wurzeln wurde mit hindurchgehendem Licht unter einem stereoskopischen Mikroskop OLYMPUS SZH-IDDL untersucht. Es wurden Wurzeln von 300 Linien von transgener Arabidopsis untersucht, von denen eine Mutanten-Linie mit einer geringeren Anzahl an Wurzeln isoliert wurde. Die Wurzeln dieser Mutante sind in 1 gezeigt. Die Mutante ist rechts gezeigt und des Wildtyps links. Wie aus 1 hervorgeht, hat diese Mutante eine geringere Anzahl an Wurzelhärchen als der Wildtyp, aber es besteht zwischen den beiden kein Unterschied in der Länge ihrer Wurzelhärchen.
Beispiel 3. Genetische Untersuchung von Caprice
Um die Mutation von Caprice genetisch zu untersuchen, wurde Caprice mit dem WS-Stamm, d. h. einem Wildtyp-Stamm von Arabidopsis rückgekreuzt. Das Kreuzen von Caprice mit dem WS-Stamm wurde wie von Okada et al. beschrieben wie folgt durchgeführt. Eine Caprice-Knospe, deren Staubbeutelgefäße sich nicht öffneten wurde mit einer Pinzette (Dumoxel Nr. 5, erhältlich von A Dumaonte Fils) geöffnet und alles außer dem Stempel wurde entfernt und der verbliebene Stempel wurde als weiblicher Elternteil verwendet. Die Pinzette und Fingerspitzen wurden vorher mit 95%igem Ethanol sterilisiert, um eine Kontamination mit Pollen zu verhindern. Etwa zwei Tage nach dieser Behandlung wurde bestätigt, daß an der Narbe des Caprice-Stempels keine Pollen hafteten, und anschließend wurden Pollen von einer Blüte des WS-Stammes auf die Narbe des Caprice-Stempels aufgebracht. Dieses Rückkreuzen ergab 14 F1-Pflanzen. Sie zeigten alle den Phänotyp des Wildtyps.
Alle 14 Pflanzen wurden dann selbstbestäubt, um F2-Nachkommen zu erhalten. Von den F2-Nachkommen zeigten 257 den Phänotyp des Wildtyps und 67 Pflanzen zeigten den Phänotyp von Caprice. Da diese F2-Generation ein 3 : 1-Verhältnis von Wildtyp- zu Caprice-Phänotyp aufwies, wurde angenommen, daß Caprice durch eine Mutation an einem rezessiven Allel entstanden ist.
Beispiel 4 Isolierung von genomischer DNA von transgener Arabidopsis
Die Isolierung von genomischer DNA von Arabidopsis wurde wie von Doyle und Doyle beschrieben (Isolation of plant DNA from fresh tissue, Focus 12, 13–25 (1990)) wie folgt durchgeführt.
Drei bis vier Wochen nach der Keimung wurden zwei bis drei entwickelte Rosettenblätter von Arabidopsis (Caprice) mit einer Pinzette entfernt, in ein 1,5 ml Eppendorf Röhrchen gegeben und mit einem Pellet-Pistill (Kontes) in 200 ml CTAB-Puffer (3% Cetylmethyl-ammoniumbromid, 1,4 M NaCl, 0,2% 2-Mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)) zerrieben. Es wurden weitere 300 ml CTAB-Puffer zugegeben und 30 min. bei 60°C gehalten. Anschließend wurde Chloroform zugegeben und der Überstand wurde gewonnen und mit Isopropanol ausgefällt. Nach Behandlung mit RNase, Behandlung mit Phenol und Ausfällung mit Ethanol wurde die Probe in 10 bis 25 ml Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA-Na₂ (pH 8,0)) gelöst.
Beispiel 5 Southern Analyse von genomischer DNA von transgener Arabidopsis
Die in Beispiel 4 erhaltene genomische DNA von Arabidopsis (Caprice) wurde durch Southern Blotting analysiert. Das Southern Blotting wurde durchgeführt, wie in Current Protocol (Ausubel et al. (1987)) beschrieben.
0,5 bis 1 μg der von Caprice erhaltenen DNA wurden mit HindIII gespalten und der Agarose-Elektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 0,25 M Salzsäure getaucht und dann 10 min. geschüttelt. Das Gel wurde dann in einer denaturierenden Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) 30 min. und zweimal in einer neutralisierenden Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 mM EDTA) 20 min. geschüttelt. Nach dem Schütteln wurde Hybond N (Handelsname) (Amersham) auf das Gel gegeben und mit UV-Strahlung von UV-Stratalinker (Handelsname) 2400 (Stratagene) bestrahlt, um die DNA darauf zu fixieren.
Getrennt wurde eine Sonde hergestellt durch Entfernen eines linken Grenzbereichs von pGV3850HPT und Markieren mit [α-32P]dCTP durch ein Markierungs-Kit mit einem Primer mit Zufallssequenz (Takara Shuzo Co., Ltd.). Das oben angegebene Hybond N wurde über Nacht in eine Hybridisierungs-Lösung, die diese Sonde (5 X SSC, 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1% Blockierungs-Reagens (Boehringer)) enthielt, zur Hybridisierung eingetaucht. Als Ergebnis erschien nur eine einzige Bande in der Stellung von 4,9 kb, ähnlich der 3, wie unten beschrieben.
Beispiel 6. Isolierung von aenomischer DNA nahe T-DNA von Arabidopsis
Da aus Beispiel 5 geschlossen wurde, daß nur eine T-DNA in nur einer Stellung in der genomischen DNA von Caprice insertiert wurde, wurde die Isolierung von genomischer DNA nahe T-DNA versucht durch reverse PCR-Technik. Die reverse PCR-Technik folgte der Methode von Deng et al., (Cell 71, 791–801 (1992)).
Die in Beispiel 4 erhaltene Caprice-DNA wurde mit HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten und dann der Elektrophorese in 1% Agarosegel unterworfen und ein Gel-Anteil, der DNA mit 4 bis 6 kb enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und DNA extrahiert. Zu dieser DNA wurde DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Selbst-Ligasierung zugegeben und es wurde PCR mit den folgenden Primern (LB1 und LB2) durchgeführt, um den linken Rand in Richtung nach außen zu amplifizieren.
PCR wurde in 35 Zyklen durchgeführt, bestehend aus jeweils Reaktionen bei 94°C × 30 s, 60°C × 30 s und 72°C × 30 s in einem GeneAmp (Handelsname) PCR System 9600 (Perkin Elmer). Als Ergebnis wurde ein etwa 2 kb Fragment amplifiziert.
Dann wurde dieses Fragment als Sonde angewandt, um DNA von Caprice bzw. dem Wildtyp WS-Stamm zu isolieren, und die DNA wurde mit HindIII gespalten und dann Southern Blotting unterworfen. Das Southern Blotting wurde auf die gleiche weise wie in Beispiel 5 durchgeführt. Das Ergebnis ist in 2 gezeigt. In dieser Fotografie ist „wt" der Wildtyp WS und 1–11 sind Caprices. Wie in 2 gezeigt, zeigte die DNA von Caprice eine Bande an der Stelle von 4,9 kb, ähnlich dem Fall, wo der linke Rand als Sonde verwendet wurde, während die DNA von dem Wildtyp WS eine Bande an der Stelle von 11 kb zeigte.
Dieser Unterschied in der Stellung der Banden zwischen den 2 Stämmen ist dem Vorhandensein einer HindIII-Spaltstelle in dem linken Rand zuzuschreiben, die in die genomische DNA von Caprice insertiert wurde. Wie in 3 gezeigt, wird die Wildtyp-DNA, in die der linke Rand nicht insertiert wurde, nur an den 2 Spaltstellen gespalten, die dieser genomischen DNA inhärent sind. Andererseits wird die Caprice-DNA, in die der linke Rand insertiert wurde, außerdem an den Spaltstellen gespalten, die sich in dem linken Rand befinden, was zu dem kürzeren Fragment führt.
Beispiel 7 Klonen des CPC-Gens
Der Teil des WS-Stamms über dem Erdboden wurde gesammelt und das Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Mörser zerstoßen, und die DNA wurde mir Cäsium-chlorid und Ethidium-bromid isoliert. Die isolierte DNA wurde teilweise mit Sau3AI (Takara Shuzo Co., Ltd.) abgebaut und einer Zetrifugation mit einem Saccharose-Dichtegradienten unterworfen. Fraktionen, enthaltend 15 bis 20 kb Fragmente wurden gesammelt und diese genomische DNA wurde dann an γ-DASH II, das vorher mit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten worden war, gebunden. Der erhaltene Rekombinations-Vektor wurde in vitro mit Gigapack II Packing Extract (Stratagene) gepackt. Etwa 100000 so gepackte Phagen wurden auf einer LB-Platte (1 l entionisiertes Wasser, 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefe, 10 g NaCl und 1,2% Agar) verteilt, um eine genomische Bibliothek von Arabidopis aufzubauen. Diese Bibliothek wurde dann abgesucht, wobei das in Beispiel 6 isolierte etwa 2 kb DNA-Fragment als Sonde verwendet wurde. Als Ergebnis wurden 4 positive Klone isoliert. Diese Phagen-Klone wurden mit EcoRI und XbaI gespalten und dann einem Southern Blotting mit dem oben angegebenen 2 kb Fragment als Sonde unterworfen. Aus den Fragmenten, mit denen die Sonde hybridisiert war, wurden drei Fragmente, d. h. ein 4,4 kb Fragment, das mit EcoRI gespalten worden war, und 7,3 kb und 5 kb Fragmente, die mit XbaI gespalten worden waren, in Plasmid-Vektor Blueskript SK+ (Stratagene) geklont.
Dann wurde Gesamt-RNA, wie in Current Protocol beschrieben, aus Wurzeln von Arabidopsis isoliert. 2 bis 4 g Wurzelgewebe von Arabidopsis wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Mörser zerstoßen. Es wurde dann in einem Puffer, enthaltend Guanidin-thiocyanat, gerührt und ultrazentrifugiert (22000 UpM, während 16 h), um die RNA auszufällen. Der Niederschlag wurde in einer Lösung, enthaltend 5 mM EDTA, 0,5% Sarcosyl und 5% 2-Mercaptoethanol, suspendiert, um die RNA zu gewinnen. Aus der so erhaltenen Gesamt-RNA wurde Poly(A)⁺ RNA unter Verwendung von Oligotex-dT30 [Super]^TM (Nippon Roche K. K.) gewonnen. Die Poly(A)⁺ RNA konnte in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 1% der Gesamt-RNA gewonnen werden. Ein Oligo-dT-Primer mit einer XhoI-Spaltstelle an dem 3-Terminus wurde wieder mit der gewonnenen Poly(A)⁺ RNA (5 μg) verbunden und Reverse Transcriptase (Strata Script (Handelsname) Reverse Transcriptase von Stratagene) wurde angewandt, um daraus doppelsträngige cDNA zu synthetisieren. Da diese doppelsträngige cDNA die EcoRI und XhoI Spaltstellen an den 5'- bzw. 3'-Termini besaß, wurde sie in ZAPII-Vektor (Stratagene), der vorher mit EcoRI und XhoI gespalten worden war, geklont. Der erhaltene Rekombinations-Vektor wurde in vitro mit Gigapack II Packing Extract (Stratagene) gepackt. Etwa 300000 so gepackte Phagen wurden auf einer LB-Platte, enthaltend E. coli XLI-Blau MRF, verteilt, um eine cDNA Bibliothek von Arabidopis zu erzeugen und diese Bibliothek wurde mit dem oben angegebenen mit XbaI gespaltenen 5 kb Fragment abgesucht. Als Ergebnis wurden 4 positive Klone abgetrennt. Von der längsten cDNA, die in den erhaltenen Klonen enthalten war, wurde die Sequenz bestimmt. Diese Sequenzreaktion wurde mit Hilfe eines Farb-Primer-Zyklus-Sequenzbestimmungs-FS-Kits und eines Farb-Terminator-Zyklus-Sequenzbestimmungs-FS-Kits (Perkin Elmer) durchgeführt und die Nucleotidsequenz wurde mit einer automatischen Fluoreszenz-Sequenzbestimmungs-Vorrichtung (Modell 370A, ABI) durchgeführt. Die so bestimmte Sequenz ist als SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die Länge der cDNA betrug 584 bp und die Translation ihres längsten ORF ergab 94 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 11 kD. Wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, waren zwei Terminator-Codons stromaufwärts von dem Ursprung der Replikation vorhanden.
Beispiel 8 Erzeugung von Pflanzen mit übermäßiger Expression des CPC-Gens
pMAT137-Hm (erhalten von Dr. Ken Matsuoka, Applied Biological Chemistry, Agricultural Departement, Nagoya Universität, Japan; Matsuoka, K. und Nacamura, K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834–838 (1991)) wurde mit Restriktionsenzymen XbaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten. In diesem Vektor sind drei 35S-Promotoren von Blumenkohl-Mosaikvirus in Tandemanordnung verbunden und ein beliebiges Gen kann in einer Multiklonierungsstelle, die sich stromabwärts von den Promotoren befindet geklont werden. Ferner wird ein Hygromycin- Transferase-Gen als ein chemikalienresistentes Gen an einen anderen 35S-Promotor gebunden und kann als chemikalienresistentes Gen in E. coli, Agrobacterium und Pflanzen wirken.
Das in Blueskript SK+ Vektor (Stratagene) geklonte CPC-Gen wurde auf die gleiche Weise wie oben mit Restriktionsenzymen XbaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten und dann mit Hilfe eines DNA-Ligations-Kits Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) an pMAT137-Hm gebunden. Dieses Plasmid (im folgenden als „pMTA137-Hm + CPC" bezeichnet) in E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingeführt unter Anwendung eines Gen-Pulsers (BioRad), und das transformierte E. coli wurde in einem LB-Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefextrakt, 1% NaCl 1,2% Agar-Pulver), enthaltend 50 mg/l Hygromycin B (Wako Pure Chemistry Industries, Ltd.) abgesucht.
Das Plasmid wurde aus dem transformierten E. coli in einem automatischen DNA-Separator P1100Σ (Kurabo Industries Ltd.) extrahiert. Dieses Plasmid pMTA137-Hm + CPC wurde unter Anwendung eines Gen-Pulsers (BioRad) in Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif eingeführt.
Das Agrobacterium wurde unter Schütteln in einem LB-Medium kultiviert und nach dem Vakuum-Infiltrations-Verfahren (Bechtold, N. et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Life Science 316, 1194–1199 (1993)) zu dem WS-Stamm von Arabidopsis (wissenschaftlicher Name: Arabidopsis thaliana) transformiert. Die transformierte Pflanze wurde in Kulturerde gepflanzt und ihre Samen wurden geerntet und in einem Hygromycin enthaltenden Medium (gemischtes Salz für 1XGanborg B5-Medium (Wako Pure Chemistry Industries, Ltd.), 1% Saccharose, 0,8% Agar-Pulver, 10 mg/ml Hygromycin B (Wako Pure Chemistry Industries, Ltd.)) auf eine chemikalienresistente Rekombinante abgesucht. Als Ergebnis wurden zwei Transformanten erhalten. Diese Pflanzen wurden in Kulturerde gepflanzt und kultiviert und ihre Samen wurden geerntet.
Pflanzen aus den geernteten Samen, die das Plasmid pMTA137-Hm + CPC in ihrem Genom insertiert enthielten, wurden auf die Anzahl ihrer Wurzelhärchen (Anzahl der Wurzelhärchen/1 mm Wurzel) untersucht. Die Bestimmung der Wurzelhärchen wurde durch Untersuchung unter einem stereoskopischen Mikroskop durchgeführt und es wurden 20 Pflanzen für jede Linie untersucht. Die mittlere Anzahl an Wurzelhärchen ± Standardfehler ist in Tabelle 1 angegeben. Eine Fotografie von Wurzeln von Arabidopsis unter einem stereoskopischen Mikroskop ist in 4 gezeigt. In 4 zeigt „A" den Wildtyp, „B" die Mutante „Caprice" und „C" die Pflanze mit übermäßiger Expression des CPC-Gens.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, enthalten die Pflanzen, die das Plasmid pMTA137-Hm + CPC in ihrem Genom insertiert enthalten, 2- oder 3-mal so viele Wurzelhärchen wie solche vom Wildtyp (Pflanzen Nr. 1 und Nr. 2 haben 3,1- bzw. 2,3-mal so viele Wurzelhärchen wie der Wildtyp). D. h. die Anzahl der Wurzelhärchen ist erhöht bei übermäßiger Expression des CPC-Gens in Arabidopsis, während die Anzahl an Wurzelhärchen in der Mutante „Caprice", bei der das CPC-Gen zerstört ist, geringer ist.
Es trat eine Verringerung der Anzahl an Trichomen in Blättern und Stielen von Pflanzen auf, die das Plasmid pMTA137-Hm + CPC in ihrem Genom insertiert enthielten.
Trichome sind Auswüchse von Epidermis-Zellen in Blättern, Stielen usw. über dem Erdboden, und ein Trichom in einem Blatt ist in drei Zweige eingeteilt. 4B und 5B zeigen ein Blatt bzw. einen Stiel der Pflanze mit übermäßiger Expression des CPC-Gens. 4A bzw. 5A zeigen ein Blatt und einen Stiel vom Wildtyp.
Zusammenfassend hat die Pflanze mit übermäßiger Expression des CPC-Gens eine erhöhte Anzahl an Wurzelhärchen, während eine geringere Anzahl an Härchen auf ihren Blättern und Stielen, d. h. dem Teil über dem Erdboden, vorliegt.
Als andere Arabidopsis-Mutanten mit einer erhöhten Anzahl an Wurzelhärchen wurden ttg und g12 identifiziert (Galaway et al., 1994, Massuci et al., 1996). Diese beiden Mutanten wurden ursprünglich als Mutanten bezüglich Trichomen von Blättern abgetrennt (Koorneef et al., 1982, Hulskamp et al., 1984, 5).
Der Phänotyp der Pflanze mit übermäßiger Expression des CPC-Gens ist der gleiche wie derjenige von ttg und g12 in Bezug auf die Wurzelhärchen und Trichome.
Beispiel 9 Aufbau von Doppel-Mutanten bezüglich Wurzelhärchen
Caprice wurde mit g12 bzw. ttg gekreuzt zur Bildung einer Doppel-Mutante als Kreuzung zwischen Caprice und g12 und einer Doppel-Mutante zwischen Caprice und ttg.
Der Phänotyp bezüglich der Wurzelhärchen der Doppel-Mutante zwischen Caprice und g12 war demjenigen von g12 ähnlich (Tabelle 1). Das legt nahe, daß das CPC-Gen stromaufwärts von dem mit g12 zusammenhängenden Gen lokalisiert ist.
Der Phänotyp bezüglich der Wurzelhärchen der Doppel-Mutante zwischen Caprice und ttg war ein Zwischentyp zwischen den beiden Mutanten (Tabelle 1). Das legt nahe, daß das CPC-Gen und das mit ttg zusammenhängende Gen in gewisser Weise miteinander in Wechselwirkung treten und an der Bildung von Wurzelhärchen beteiligt sind.
Funktionelle Fragmente der Polypeptid-Sequenz SEQ ID NRO: 1 können durch ein erfindungsgemäßes Polynucleotid kodiert werden. Ein solches Fragment fördert die Bildung von Wurzelhärchen. So kann ein Fragment die folgenden Aktivitäten besitzen:

– Förderung der Bildung von Wurzelhärchen zur Erzeugung von Pflanzen mit mehr Wurzelhärchen als üblich, und/oder
– Verringerung der Anzahl an Trichomen in Blättern und Stielen und/oder
– Beschleunigung der Blühzeit einer Pflanze und/oder
- Verringerung der Ansammlung von Anthocyanin in Blättern.

Die Polypeptid-Sequenz SEQ ID NO: 2 liegt typischerweise in im wesentlichen isolierter Form vor. Sie kann gereinigt werden.
Pflanzenzellen von monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanzen können gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Monokotyledone Arten umfassen Gerste, Weizen, Mais und Reis. Dikotyledone Arten umfassen Tabak, Tomate, Sonnenblume, Petunie, Baumwolle, Zuckerrübe, Kartoffel, Salat, Melone, Sojabohne, Canola (Rapssaat) und Poplars.
Es kann eine transformierte Pflanzenzelle erhalten werden, die eine DNA-Kodierung für die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 1 oder eine im wesentlichen identische Aminosäure-Sequenz oder ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz beinhaltet. Die DNA ist operabel an einen geeigneten Promotor gebunden, d. h. einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression des kodierten Polypeptids oder Polypeptid-Fragments in der Pflanzenzelle anzutreiben. Diese DNA kann in Form einer nicht integrierten DNA oder einer DNA, die in ein Genom einer Pflanzenzelle integriert ist, vorliegen. Pflanzen können aus einer solchen Zelle, die diese DNA, z. B. in dem Pflanzenzellgenom integriert, enthält regeneriert werden.
SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

Isoliertes Polynucleotid, das für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder für ein Fragment dieser Aminosäuresequenz kodiert, das die Bildung von Pflanzenwurzelhärchen beschleunigt.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das eine DNA-Sequenz ist.
Polynucleotid nach Anspruch 2, das die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfaßt, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert.
Isoliertes DNA-Fragment, umfassend einen Promotor, der operabel an eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3 gebunden ist.
Vektor, der das isolierte DNA-Fragment nach Anspruch 4 umfaßt.
Vektor nach Anspruch 5, der ein Plasmid ist.
Pflanzenzelle, die mit dem isolierten DNA-Fragment nach Anspruch 4 oder dem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
Transgene Pflanze, die aus einer Pflanzenzelle nach Anspruch 7 regeneriert worden ist.
Transgene Pflanze, umfassend Zellen nach Anspruch 7.
Samen, der von einer transgenen Pflanze nah Anspruch 8 oder 9 erhalten worden ist.
Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze, wobei das Verfahren umfaßt: (i) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6; (ii) Regenerieren einer Pflanze aus der transformierten Zelle und (iii) gegebenenfalls biologisches Vermehren der erzeugten Pflanze.