JPH104978A - シロイヌナズナの根毛形成開始を制御するｃｐｃ遺伝子及びそれを導入した植物 - Google Patents
シロイヌナズナの根毛形成開始を制御するｃｐｃ遺伝子及びそれを導入した植物Info
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- JPH104978A JPH104978A JP9028877A JP2887797A JPH104978A JP H104978 A JPH104978 A JP H104978A JP 9028877 A JP9028877 A JP 9028877A JP 2887797 A JP2887797 A JP 2887797A JP H104978 A JPH104978 A JP H104978A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列、又
は配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一な
アミノ酸配列をコードするＣＰＣ遺伝子、及び該遺伝子
を導入した植物。 【効果】 根毛数の増加した新規な植物を提供する。
は配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一な
アミノ酸配列をコードするＣＰＣ遺伝子、及び該遺伝子
を導入した植物。 【効果】 根毛数の増加した新規な植物を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物の根毛の形成
を促進する新規な遺伝子、及びそれを導入したトランス
ジェニック植物に関する。
を促進する新規な遺伝子、及びそれを導入したトランス
ジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物の根毛に関する突然変異体として
は、根毛の数が多くなっている ttg（transparent test
a glabra）、 gl2（glabrous2 ）（Galway,M.E.ら(199
4) Dev.Biol. 166 740-754、Rerie,W.G.ら(1994) Gnes
& Development 8 1388-1399 ）、根毛の形が異常になっ
ているrhd1、rhd2、rhd3、rhd4などが知られている（Sc
hiefelbein,J. & Somerville,C.(1990) Plant Cell 2 2
35-243）。また、根毛の数が少なくなっている突然変異
体として、rhd6が知られているが、これはオーキシン等
の植物ホルモンによってその変異が相補されるものであ
り（Masucci,J.D. &Schiefelbein,J.W.(1994) Plant Ph
ysiol. 106 1335-1346 ）、植物ホルモンによって相補
されない突然変異体、即ち、根毛をつくるシグナル伝達
系そのものが異常となっている突然変異体は、従来全く
知られていなかった。
は、根毛の数が多くなっている ttg（transparent test
a glabra）、 gl2（glabrous2 ）（Galway,M.E.ら(199
4) Dev.Biol. 166 740-754、Rerie,W.G.ら(1994) Gnes
& Development 8 1388-1399 ）、根毛の形が異常になっ
ているrhd1、rhd2、rhd3、rhd4などが知られている（Sc
hiefelbein,J. & Somerville,C.(1990) Plant Cell 2 2
35-243）。また、根毛の数が少なくなっている突然変異
体として、rhd6が知られているが、これはオーキシン等
の植物ホルモンによってその変異が相補されるものであ
り（Masucci,J.D. &Schiefelbein,J.W.(1994) Plant Ph
ysiol. 106 1335-1346 ）、植物ホルモンによって相補
されない突然変異体、即ち、根毛をつくるシグナル伝達
系そのものが異常となっている突然変異体は、従来全く
知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】根毛をつくるシグナル
伝達系の異常により根毛の数が少なくなった突然変異体
を分離できれば、その異常が生じた部位を調べることに
より、根毛形成に関与する遺伝子を特定することができ
る。
伝達系の異常により根毛の数が少なくなった突然変異体
を分離できれば、その異常が生じた部位を調べることに
より、根毛形成に関与する遺伝子を特定することができ
る。
【０００４】本発明は、このような技術的背景に基づき
なされたものであり、その目的は、植物の根毛の形成を
促進する新規な遺伝子を単離し、これを導入したトラン
スジェニック植物を提供することにある。
なされたものであり、その目的は、植物の根毛の形成を
促進する新規な遺伝子を単離し、これを導入したトラン
スジェニック植物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、根毛の数が少なく
なった突然変異シロイヌナズナを分離し、該植物よりそ
の突然変異に関与する遺伝子をクローニングし、更に、
これを野性型のシロイヌナズナに導入し、発現させるこ
とに成功し、これらの知見に基づき本発明を完成した。
解決するため鋭意検討を重ねた結果、根毛の数が少なく
なった突然変異シロイヌナズナを分離し、該植物よりそ
の突然変異に関与する遺伝子をクローニングし、更に、
これを野性型のシロイヌナズナに導入し、発現させるこ
とに成功し、これらの知見に基づき本発明を完成した。
【０００６】即ち、本発明は、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一なアミノ酸配列をコードする新規な遺伝子
である。また、本発明は、上記記載の遺伝子を導入した
植物である。
ミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一なアミノ酸配列をコードする新規な遺伝子
である。また、本発明は、上記記載の遺伝子を導入した
植物である。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配
列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミ
ノ酸配列を有する。ここで、「配列番号１で表されるア
ミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列
番号１で表されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基
について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であ
って、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一な作用
効果、即ち、植物の根毛形成促進効果を有するアミノ酸
配列をいう。幾つかのアミノ酸残基について欠失、置
換、付加等の変化を起こさせることは、本願の出願時に
おいて常用されている技術、例えば、部位特異的変異誘
発法（Nucleic AcidResearch, Vol.10, No.20, p6487-6
500 (1982) ）により行うことができる。
遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配
列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミ
ノ酸配列を有する。ここで、「配列番号１で表されるア
ミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列
番号１で表されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基
について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であ
って、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一な作用
効果、即ち、植物の根毛形成促進効果を有するアミノ酸
配列をいう。幾つかのアミノ酸残基について欠失、置
換、付加等の変化を起こさせることは、本願の出願時に
おいて常用されている技術、例えば、部位特異的変異誘
発法（Nucleic AcidResearch, Vol.10, No.20, p6487-6
500 (1982) ）により行うことができる。
【０００８】本発明の遺伝子は、根毛の形成を促進する
という機能を有する。これは、この遺伝子が破壊された
突然変異体が、根毛数の減少という性質を示すことから
わかる。根毛が少なくなる突然変異体としては、従来の
技術で述べたようにrhd6などが既に知られているが、本
発明の遺伝子に起因する突然変異体は、植物ホルモンに
よっては相補されないという点でrhd6とは異なってい
る。従って、この突然変異体は、従来全く知られていな
かったものである。なお、本発明者は、この突然変異体
の根毛が出たり出なかったりすることから、その名称を
「caprice （日本語で「気紛れ」という意味）」とし、
この突然変異体に関与する遺伝子を「ＣＰＣ」とした。
という機能を有する。これは、この遺伝子が破壊された
突然変異体が、根毛数の減少という性質を示すことから
わかる。根毛が少なくなる突然変異体としては、従来の
技術で述べたようにrhd6などが既に知られているが、本
発明の遺伝子に起因する突然変異体は、植物ホルモンに
よっては相補されないという点でrhd6とは異なってい
る。従って、この突然変異体は、従来全く知られていな
かったものである。なお、本発明者は、この突然変異体
の根毛が出たり出なかったりすることから、その名称を
「caprice （日本語で「気紛れ」という意味）」とし、
この突然変異体に関与する遺伝子を「ＣＰＣ」とした。
【０００９】ＣＰＣ遺伝子は、例えば、以下のような方
法によりクローニングすることができる。まず、シロイ
ヌナズナから単離したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で
切断し、断片化されたＤＮＡを適当なベクターにつな
ぎ、この組換えベタクーで宿主となる微生物を形質転換
し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作成する。ＤＮＡの単
離は、塩化セシウム及びエチジウムブロマイドなどを用
いた常法に従って行うことができる。制限酵素は、特別
なものを用いる必要はなく、例えば、Sau3AIなどを用い
ることができる。ベクターも特別のものを用いる必要は
なく、例えば、λDASH IIなどを用いることができる。
宿主とする微生物は、用いたベクターに応じて決めれば
よく、例えば、λ DASH IIをベクターとした場合は、大
腸菌XL-1 Blue MRA(P2) などを用いることができる。
法によりクローニングすることができる。まず、シロイ
ヌナズナから単離したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で
切断し、断片化されたＤＮＡを適当なベクターにつな
ぎ、この組換えベタクーで宿主となる微生物を形質転換
し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作成する。ＤＮＡの単
離は、塩化セシウム及びエチジウムブロマイドなどを用
いた常法に従って行うことができる。制限酵素は、特別
なものを用いる必要はなく、例えば、Sau3AIなどを用い
ることができる。ベクターも特別のものを用いる必要は
なく、例えば、λDASH IIなどを用いることができる。
宿主とする微生物は、用いたベクターに応じて決めれば
よく、例えば、λ DASH IIをベクターとした場合は、大
腸菌XL-1 Blue MRA(P2) などを用いることができる。
【００１０】次に、上記のゲノムＤＮＡライブラリーに
ついてスクリーニングを行う。プローブとしては、突然
変異体caprice のＴ−ＤＮＡ近傍付近のＤＮＡを使用す
る。caprice は、Ｔ−ＤＮＡの挿入によりＣＰＣ遺伝子
が破壊されているのだから、Ｔ−ＤＮＡの近傍付近のＤ
ＮＡには、ＣＰＣ遺伝子の一部が含まれているからであ
る。
ついてスクリーニングを行う。プローブとしては、突然
変異体caprice のＴ−ＤＮＡ近傍付近のＤＮＡを使用す
る。caprice は、Ｔ−ＤＮＡの挿入によりＣＰＣ遺伝子
が破壊されているのだから、Ｔ−ＤＮＡの近傍付近のＤ
ＮＡには、ＣＰＣ遺伝子の一部が含まれているからであ
る。
【００１１】上記のプローブにより選抜された陽性クロ
ーンから、ベクターを取り出し、これから得られたＤＮ
Ａ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングを行う。ｃＤＮＡライブラリーは、常法に従っ
て作成することができる。即ち、植物体より全ＲＮＡを
単離し、これからオリゴ（ｄＴ）等を用いてｍＲＮＡを
単離し、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤ
ＮＡを合成する。このｃＤＮＡを適当なベクターにつな
ぎ、この組換えベクターで宿主となる微生物を形質転換
する。このスクリーニングにより選抜される陽性クロー
ン中に含まれる組換えベクターが本発明のＣＰＣ遺伝子
を含む。
ーンから、ベクターを取り出し、これから得られたＤＮ
Ａ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングを行う。ｃＤＮＡライブラリーは、常法に従っ
て作成することができる。即ち、植物体より全ＲＮＡを
単離し、これからオリゴ（ｄＴ）等を用いてｍＲＮＡを
単離し、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤ
ＮＡを合成する。このｃＤＮＡを適当なベクターにつな
ぎ、この組換えベクターで宿主となる微生物を形質転換
する。このスクリーニングにより選抜される陽性クロー
ン中に含まれる組換えベクターが本発明のＣＰＣ遺伝子
を含む。
【００１２】ＣＰＣ遺伝子を植物中で発現させること
は、ＣＰＣ遺伝子を適当な植物発現ベクターに挿入し、
この組換えベクターを植物に導入することにより行うこ
とができる。ここで用いる植物発現ベクターとしては、
植物中で機能し得るプロモーターとマーカー遺伝子を有
するものであればどのようなものでもよいが、広範な種
類の植物中で機能し得るカリフラワーモザイク・ウイル
スの３５Ｓプロモーターを有するベクターが好ましい。
このようなベクターとしては、実施例で使用したpMAT13
7-Hmを挙げることができるが、これ以外にもpBI121（CL
ONTECH社製）などを例示することができる。ベクターを
植物に導入することは、アグロバクテリウム菌を用いて
行うのが好ましいが、これに限定されることなく、エレ
クトロポレーション法、パーティクルガンを用いる方法
によっても行うことができる。ＣＰＣ遺伝子を発現させ
る植物については、特に制限はないが、バラ、タバコ、
トマト、イネ、トウモロコシ、ペテュニア、アブラナな
どを好ましい植物として例示することができる。
は、ＣＰＣ遺伝子を適当な植物発現ベクターに挿入し、
この組換えベクターを植物に導入することにより行うこ
とができる。ここで用いる植物発現ベクターとしては、
植物中で機能し得るプロモーターとマーカー遺伝子を有
するものであればどのようなものでもよいが、広範な種
類の植物中で機能し得るカリフラワーモザイク・ウイル
スの３５Ｓプロモーターを有するベクターが好ましい。
このようなベクターとしては、実施例で使用したpMAT13
7-Hmを挙げることができるが、これ以外にもpBI121（CL
ONTECH社製）などを例示することができる。ベクターを
植物に導入することは、アグロバクテリウム菌を用いて
行うのが好ましいが、これに限定されることなく、エレ
クトロポレーション法、パーティクルガンを用いる方法
によっても行うことができる。ＣＰＣ遺伝子を発現させ
る植物については、特に制限はないが、バラ、タバコ、
トマト、イネ、トウモロコシ、ペテュニア、アブラナな
どを好ましい植物として例示することができる。
【００１３】本発明のＣＰＣ遺伝子は、以下の機能を有
する。 １）植物の根毛形成を促進するはたらきを持つ。従っ
て、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、通常の
植物より根毛の多い植物を作出することができる。この
ような植物は、水分吸収能が高いので、通常の植物より
も乾燥に強いと考えられる。
する。 １）植物の根毛形成を促進するはたらきを持つ。従っ
て、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、通常の
植物より根毛の多い植物を作出することができる。この
ような植物は、水分吸収能が高いので、通常の植物より
も乾燥に強いと考えられる。
【００１４】２）葉や茎のトライコームを減少させるは
たらきを持つ。従って、ＣＰＣ遺伝子をバラのような刺
を持つ植物に導入し、過剰発現させれば、刺の少ない植
物を作出することができる。 ３）植物の開花時期を早めるはたらきを持つ。従って、
ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、花を早く咲
かせることが期待できる。
たらきを持つ。従って、ＣＰＣ遺伝子をバラのような刺
を持つ植物に導入し、過剰発現させれば、刺の少ない植
物を作出することができる。 ３）植物の開花時期を早めるはたらきを持つ。従って、
ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、花を早く咲
かせることが期待できる。
【００１５】４）葉中のアントシアニンの蓄積量を減少
させるはたらきを持つ。即ち、シロイヌナズナを16℃く
らいの低い温度で生育させると葉などにアントシアニン
色素が蓄積して赤紫色に着色する。ところが、ＣＰＣ遺
伝子を過剰発現させた植物体では、アントシアニンが蓄
積しにくくなり、16℃で生育させても葉の色が緑色のま
まである。一般に花の赤い色などはアントシアニン系の
色素によって着色されているので、花に色のついた植物
体に、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、花の
色を変えることが期待できる。
させるはたらきを持つ。即ち、シロイヌナズナを16℃く
らいの低い温度で生育させると葉などにアントシアニン
色素が蓄積して赤紫色に着色する。ところが、ＣＰＣ遺
伝子を過剰発現させた植物体では、アントシアニンが蓄
積しにくくなり、16℃で生育させても葉の色が緑色のま
まである。一般に花の赤い色などはアントシアニン系の
色素によって着色されているので、花に色のついた植物
体に、ＣＰＣ遺伝子を導入し、過剰発現させれば、花の
色を変えることが期待できる。
【００１６】
【００１７】
〔実施例１〕 トランスジェニック植物の作出 シロイヌナズナ（品種：Wassilewskija 〔ＷＳ〕）の種
子を滅菌した後、寒天培地に播き培養を行った。播種か
ら２〜４日は、休眠を打破し発芽をそろえ、かつ早く花
を咲かせるため、遮光した状態で４℃で培養し、その後
は、22℃、連続光の下で培養した。滅菌は、種子を1.5m
l のエッペンチューブに入れ、そこに10％のハイター
（花王）、0.02% のTriton X-100を含む滅菌蒸留水を0.
5ml 加え、ボルテックスで攪拌した後、３〜５分室温で
放置し、次いで、種子を滅菌蒸留水で５回洗うことによ
り行った。寒天培地は、シロイヌナズナ用の栄養塩溶液
〔蒸留水または脱イオン水985ml 、1M KNO3 5ml 、1M M
gSO4 2ml 、1M Ca(NO3)2 2ml、 20mM Fe-EDTA 2.5ml 、
微量要素液 1ml、K-PO4緩衝液液(pH5.5) 2.5ml 〕（白
石英秋ら、(1991) 現代化学 増刊 20 植物バイオテク
ノロジーII、38頁）を蒸留水で1/2 に希釈したものに、
寒天末（ナカライ製、特級）を1.5 ％の濃度になるよう
に加え、オートクレーブ後シャーレに注いで固化させた
ものを用いた。なお、この濃度の寒天培地を用いれば、
シロイヌナズナの根は寒天表面を這って成長し、培地中
に入り込むことがないので、後述する根の形態観察が容
易になる。光源としては、市販の40kwの白色蛍光灯２本
と植物育成用の蛍光灯（ナショナル、ホモルクス）１本
を用い、約30cm離して、光を照射した。この光源の明る
さは、約3000lux である。
子を滅菌した後、寒天培地に播き培養を行った。播種か
ら２〜４日は、休眠を打破し発芽をそろえ、かつ早く花
を咲かせるため、遮光した状態で４℃で培養し、その後
は、22℃、連続光の下で培養した。滅菌は、種子を1.5m
l のエッペンチューブに入れ、そこに10％のハイター
（花王）、0.02% のTriton X-100を含む滅菌蒸留水を0.
5ml 加え、ボルテックスで攪拌した後、３〜５分室温で
放置し、次いで、種子を滅菌蒸留水で５回洗うことによ
り行った。寒天培地は、シロイヌナズナ用の栄養塩溶液
〔蒸留水または脱イオン水985ml 、1M KNO3 5ml 、1M M
gSO4 2ml 、1M Ca(NO3)2 2ml、 20mM Fe-EDTA 2.5ml 、
微量要素液 1ml、K-PO4緩衝液液(pH5.5) 2.5ml 〕（白
石英秋ら、(1991) 現代化学 増刊 20 植物バイオテク
ノロジーII、38頁）を蒸留水で1/2 に希釈したものに、
寒天末（ナカライ製、特級）を1.5 ％の濃度になるよう
に加え、オートクレーブ後シャーレに注いで固化させた
ものを用いた。なお、この濃度の寒天培地を用いれば、
シロイヌナズナの根は寒天表面を這って成長し、培地中
に入り込むことがないので、後述する根の形態観察が容
易になる。光源としては、市販の40kwの白色蛍光灯２本
と植物育成用の蛍光灯（ナショナル、ホモルクス）１本
を用い、約30cm離して、光を照射した。この光源の明る
さは、約3000lux である。
【００１８】播種から３週間後に40個体のシロイヌナズ
ナにアグロバクテリウム菌を接種した。アグロバクテリ
ウム菌の接種は、シロイヌナズナの花茎に傷をつけて、
アグロバクテリウム菌を感染させるin planta 法を改良
した方法（Chang ら(1994)、Plant J.,5 551-558）によ
り行った。アグロバクテリウム菌としては、Velten,J.
らより入手したAgrobacterium tumefaciens C58C1Rif株
（Velten,J. and Schell,J (1985) Nucl.Acids Res.13,
6981-6998 ）を用いた。この菌株には、中間系ベクター
のpGV3850HPTが入っており、ライトボーダーとレフトボ
ーダーの間には植物の選択マーカーとしてハイグロマイ
シントランスフェラーゼ遺伝子がカリフラワーモザイク
ウイルス35Ｓプロモーターの下流におかれている。
ナにアグロバクテリウム菌を接種した。アグロバクテリ
ウム菌の接種は、シロイヌナズナの花茎に傷をつけて、
アグロバクテリウム菌を感染させるin planta 法を改良
した方法（Chang ら(1994)、Plant J.,5 551-558）によ
り行った。アグロバクテリウム菌としては、Velten,J.
らより入手したAgrobacterium tumefaciens C58C1Rif株
（Velten,J. and Schell,J (1985) Nucl.Acids Res.13,
6981-6998 ）を用いた。この菌株には、中間系ベクター
のpGV3850HPTが入っており、ライトボーダーとレフトボ
ーダーの間には植物の選択マーカーとしてハイグロマイ
シントランスフェラーゼ遺伝子がカリフラワーモザイク
ウイルス35Ｓプロモーターの下流におかれている。
【００１９】アグロバクテリウム菌の接種後、シロイヌ
ナズナをバーミュキュライトとパーライトを１：１で混
合した培養土に移植した。移植から１カ月半から２カ月
後に、種子（Ｔ２種子）を収穫した。得られた種子を前
記と同様に滅菌し、ハイグロマシン含有培地（１Ｘガン
ボーグＢ５培地用混合塩、1%ショ糖、0.8%寒天、10mg/l
ハイグロマイシンＢ）に播いて培養し、ハイグロマイシ
ンに耐性を示す個体だけを選び出し、培養土に移植し
た。培養土は前記と同様のものを用いた。移植から１カ
月半から２カ月後に自家受粉により得られた種子（Ｔ３
種子）を収穫した。
ナズナをバーミュキュライトとパーライトを１：１で混
合した培養土に移植した。移植から１カ月半から２カ月
後に、種子（Ｔ２種子）を収穫した。得られた種子を前
記と同様に滅菌し、ハイグロマシン含有培地（１Ｘガン
ボーグＢ５培地用混合塩、1%ショ糖、0.8%寒天、10mg/l
ハイグロマイシンＢ）に播いて培養し、ハイグロマイシ
ンに耐性を示す個体だけを選び出し、培養土に移植し
た。培養土は前記と同様のものを用いた。移植から１カ
月半から２カ月後に自家受粉により得られた種子（Ｔ３
種子）を収穫した。
【００２０】〔実施例２〕 根の突然変異体のスクリー
ニング 実施例１で得られたＴ３種子を滅菌した後、寒天培地に
播き、培養を行った。滅菌の方法、及び寒天培地は上記
と同様のものを使用した。なお、根の形態観察を容易に
するため、寒天培地は、透明なプラスチックシャーレ
（栄研器材株式会社、２号角シャーレ〔14cm×10cm〕）
に入れた。
ニング 実施例１で得られたＴ３種子を滅菌した後、寒天培地に
播き、培養を行った。滅菌の方法、及び寒天培地は上記
と同様のものを使用した。なお、根の形態観察を容易に
するため、寒天培地は、透明なプラスチックシャーレ
（栄研器材株式会社、２号角シャーレ〔14cm×10cm〕）
に入れた。
【００２１】根の形態は、実態顕微鏡OLYMPUS SZH-IDDL
によって透過光で観察した。約３００ラインのトランス
ジェニックシロイヌナズナの根の形態を観察し、それら
の中から根毛が少なくなっている一系統の突然変異体を
単離した。この突然変異体の根の形態を図１に示す。右
側がこの突然変異体であり、左側が野性型である。図１
に示すようにこの突然変異体は野性型に比べ、根毛の本
数が明らかに少なくなっているが、その長さは野性型と
変わらない。
によって透過光で観察した。約３００ラインのトランス
ジェニックシロイヌナズナの根の形態を観察し、それら
の中から根毛が少なくなっている一系統の突然変異体を
単離した。この突然変異体の根の形態を図１に示す。右
側がこの突然変異体であり、左側が野性型である。図１
に示すようにこの突然変異体は野性型に比べ、根毛の本
数が明らかに少なくなっているが、その長さは野性型と
変わらない。
【００２２】〔実施例３〕 ｃａｐｒｉｃｅ の遺伝学
的検討 caprice の変異がどのようなものであるかを調べため
に、シロイヌナズナの野性型のＷＳ株と戻し交雑を行っ
た。caprice とＷＳ株との交雑は、岡田らの記述に従っ
て行った。即ち、雄しべのやくが開裂していないcapric
e のつぼみをピンセット（A.Dumonte Fils社製、DUMOXE
L 5 番）で開き、雌しべ以外のものを削除し、雌親とし
た。ピンセット及び指先は、花粉の混入を防ぐため、予
め９５％のエタノールで消毒した。この処理から約２日
後にめしべの先端の柱頭毛に花粉がついていないことを
確認してから、花が展開したＷＳ株から採取した花粉
を、caprice の柱頭につけた。この戻し交雑の結果、14
個体のＦ１世代が得られた。これらの表現型はすべて野
性型であった。
的検討 caprice の変異がどのようなものであるかを調べため
に、シロイヌナズナの野性型のＷＳ株と戻し交雑を行っ
た。caprice とＷＳ株との交雑は、岡田らの記述に従っ
て行った。即ち、雄しべのやくが開裂していないcapric
e のつぼみをピンセット（A.Dumonte Fils社製、DUMOXE
L 5 番）で開き、雌しべ以外のものを削除し、雌親とし
た。ピンセット及び指先は、花粉の混入を防ぐため、予
め９５％のエタノールで消毒した。この処理から約２日
後にめしべの先端の柱頭毛に花粉がついていないことを
確認してから、花が展開したＷＳ株から採取した花粉
を、caprice の柱頭につけた。この戻し交雑の結果、14
個体のＦ１世代が得られた。これらの表現型はすべて野
性型であった。
【００２３】次に、上記14個体について自家受粉を行
い、Ｆ２世代を得た。Ｆ２世代の表現型は、257 個体が
野性型で、67個体がcaprice 型であった。野性型：capr
ice 型の比が３：１であることから、 capriceは劣性の
１遺伝子の変異によって起こったと考えられる。
い、Ｆ２世代を得た。Ｆ２世代の表現型は、257 個体が
野性型で、67個体がcaprice 型であった。野性型：capr
ice 型の比が３：１であることから、 capriceは劣性の
１遺伝子の変異によって起こったと考えられる。
【００２４】〔実施例４〕 トランスジニックシロイヌ
ナズナのゲノムＤＮＡの単離 シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの単離法は、Doyle とDo
yle （(1990)Isolation of plant DNA from fresh tiss
ue Focus 12,13-15 ）の記述に従った。
ナズナのゲノムＤＮＡの単離 シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの単離法は、Doyle とDo
yle （(1990)Isolation of plant DNA from fresh tiss
ue Focus 12,13-15 ）の記述に従った。
【００２５】発芽後３〜４週間のシロイヌナズナ（capr
ice ）の展開したロゼッタ葉を２〜３枚、ピンセットで
1.5ml のエッペンチューブにとり、200ml のＣＴＡＢバ
ッファー〔 3% セチルメチルアンモニウムブロミド、1.
4M NaCl 、 0.2% ２−メルカプトエタノール、 20mM Ｅ
ＤＴＡ 100mM Tris-HCl（pH 8.0）〕を加え、pelletpe
stle （Kontes社製）で粉砕した。さらに300ml のＣＴ
ＡＢバッファーを加え、60℃で30分保温した。その後ク
ロロホルムを加えて、上清を回収して、イソプロパノー
ル沈殿を行った。ＲＮase 処理、フェノール処理、エタ
ノール沈殿を行った後、最終的に10〜25mlのTris−ＥＤ
ＴＡ（10mM Tris-HCl(pH8.0)、ＥＤＴＡ-Na2 (pH8.0)）
に溶かした。
ice ）の展開したロゼッタ葉を２〜３枚、ピンセットで
1.5ml のエッペンチューブにとり、200ml のＣＴＡＢバ
ッファー〔 3% セチルメチルアンモニウムブロミド、1.
4M NaCl 、 0.2% ２−メルカプトエタノール、 20mM Ｅ
ＤＴＡ 100mM Tris-HCl（pH 8.0）〕を加え、pelletpe
stle （Kontes社製）で粉砕した。さらに300ml のＣＴ
ＡＢバッファーを加え、60℃で30分保温した。その後ク
ロロホルムを加えて、上清を回収して、イソプロパノー
ル沈殿を行った。ＲＮase 処理、フェノール処理、エタ
ノール沈殿を行った後、最終的に10〜25mlのTris−ＥＤ
ＴＡ（10mM Tris-HCl(pH8.0)、ＥＤＴＡ-Na2 (pH8.0)）
に溶かした。
【００２６】〔実施例５〕 トランスジェニックシロイ
ヌナズナのゲノムＤＮＡのサザン解析 実施例４で得られたcaprice シロイヌナズナのゲノムＤ
ＮＡをサザンブロッティングにより解析した。サザン解
析は、Current Protocol（Ausbelら(1987)）の方法に従
った。
ヌナズナのゲノムＤＮＡのサザン解析 実施例４で得られたcaprice シロイヌナズナのゲノムＤ
ＮＡをサザンブロッティングにより解析した。サザン解
析は、Current Protocol（Ausbelら(1987)）の方法に従
った。
【００２７】caprice より得られたＤＮＡ 0.5〜１μg
をHindIII で切断し、アガロース電気泳動を行った。泳
動後、ゲルを0.25 M塩酸に浸し、10分間振盪した後、変
性溶液（1.5M NaCl 、0.5M NaOH ）で30分間、１回、中
和溶液（1.5M NaCl 、0.5M Tris-HCl pH7.2 、1mM ＥＤ
ＴＡ）で20分間、２回振盪した。振盪後、ゲルの上に、
Hybond N（Amersham社製）を置き、ＵＶstratalinker 2
400 （Stratagene社製）によりＵＶを照射して、ＤＮＡ
を固定した。
をHindIII で切断し、アガロース電気泳動を行った。泳
動後、ゲルを0.25 M塩酸に浸し、10分間振盪した後、変
性溶液（1.5M NaCl 、0.5M NaOH ）で30分間、１回、中
和溶液（1.5M NaCl 、0.5M Tris-HCl pH7.2 、1mM ＥＤ
ＴＡ）で20分間、２回振盪した。振盪後、ゲルの上に、
Hybond N（Amersham社製）を置き、ＵＶstratalinker 2
400 （Stratagene社製）によりＵＶを照射して、ＤＮＡ
を固定した。
【００２８】一方、pGV3850HPTのレフトボーダ領域を切
り出し、Random primer labellingkit （宝酒造社製）
を使って〔a-32P 〕ｄＣＴＰで標識してプローブを作成
し、このプローブを含むハイブリダイゼーション溶液
（5XSSC 、 0.1% Ｎ−ラウロイルスクロシン、0.02% Ｓ
ＤＳ、 1% ブロッキング試薬（Boehringer社製））に上
記 Hybond N を一晩浸し、ハイブリダイゼーションを行
った。その結果、後述する図３と同様に4.9kb の位置に
一本だけバンドが現れた。
り出し、Random primer labellingkit （宝酒造社製）
を使って〔a-32P 〕ｄＣＴＰで標識してプローブを作成
し、このプローブを含むハイブリダイゼーション溶液
（5XSSC 、 0.1% Ｎ−ラウロイルスクロシン、0.02% Ｓ
ＤＳ、 1% ブロッキング試薬（Boehringer社製））に上
記 Hybond N を一晩浸し、ハイブリダイゼーションを行
った。その結果、後述する図３と同様に4.9kb の位置に
一本だけバンドが現れた。
【００２９】〔実施例６〕 Ｔ−ＤＮＡ近傍のシロイヌ
ナズナのゲノムＤＮＡの単離 実施例５より、caprice のゲノムＤＮＡに挿入されてい
るＴ−ＤＮＡは一箇所に一本だけであると考えられるの
で、inverse ＰＣＲ法でＴ−ＤＮＡ近傍のゲノムＤＮＡ
の分離を試みた。inverse ＰＣＲ法は、Dengらの方法
（(1992) Cell 71791-801）に従った。
ナズナのゲノムＤＮＡの単離 実施例５より、caprice のゲノムＤＮＡに挿入されてい
るＴ−ＤＮＡは一箇所に一本だけであると考えられるの
で、inverse ＰＣＲ法でＴ−ＤＮＡ近傍のゲノムＤＮＡ
の分離を試みた。inverse ＰＣＲ法は、Dengらの方法
（(1992) Cell 71791-801）に従った。
【００３０】実施例４で得られたcaprice のＤＮＡを、
HindIII （宝酒造製）で切断し、１％のアガロースゲル
に泳動した後、４kb〜６kbに相当する部分のゲルを切り
出し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡにＤＮＡライゲー
ス（宝酒造製）を加え、セルフ・ライゲーションを行っ
た後、レフト・ボーダーを外向きに増幅させる下記のプ
ライマー（ＬＢ１、ＬＢ２）を用いＰＣＲを行った。
HindIII （宝酒造製）で切断し、１％のアガロースゲル
に泳動した後、４kb〜６kbに相当する部分のゲルを切り
出し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡにＤＮＡライゲー
ス（宝酒造製）を加え、セルフ・ライゲーションを行っ
た後、レフト・ボーダーを外向きに増幅させる下記のプ
ライマー（ＬＢ１、ＬＢ２）を用いＰＣＲを行った。
【００３１】ＬＢ１：CAC GCC ATC GAT GTA ATA ATT GT
C ATT GTC ATT AGA TTG T ＬＢ２：GAG CTA TTG GCA CAC GAA GAA TGG T
C ATT GTC ATT AGA TTG T ＬＢ２：GAG CTA TTG GCA CAC GAA GAA TGG T
【００３２】ＰＣＲは、GeneAmp PCR system 9600 （Pe
rkin Elmer社製）を用い、94℃×30秒、60℃×30秒、72
℃×30秒の反応を35サイクル行った。この結果、約２kb
の断片が増幅された。
rkin Elmer社製）を用い、94℃×30秒、60℃×30秒、72
℃×30秒の反応を35サイクル行った。この結果、約２kb
の断片が増幅された。
【００３３】次に、この断片をプローブとして、capric
e 及び野性型ＷＳ株のそれぞれから単離し、HindIII で
切断したＤＮＡについてサザンブロッテイングを行っ
た。サザンブロッテイングは実施例５と同様にして行っ
た。この結果を図２に示す。図中のｗｔが野性型ＷＳで
あり、１〜11がcaprice である。図２が示すように、ca
price ではレフト・ボーダーをプローブとした時と同様
に4.9kb の位置に、野性型ＷＳ株では約11kbの位置にバ
ンドが検出された。
e 及び野性型ＷＳ株のそれぞれから単離し、HindIII で
切断したＤＮＡについてサザンブロッテイングを行っ
た。サザンブロッテイングは実施例５と同様にして行っ
た。この結果を図２に示す。図中のｗｔが野性型ＷＳで
あり、１〜11がcaprice である。図２が示すように、ca
price ではレフト・ボーダーをプローブとした時と同様
に4.9kb の位置に、野性型ＷＳ株では約11kbの位置にバ
ンドが検出された。
【００３４】このように、両系統でバンドの位置が異な
るのは、ゲノムＤＮＡに挿入されるレフト・ボーダー内
にHindIII 切断部位があるからである。図３に示すよう
に、レフト・ボーダーが挿入されていない野性型の場
合、ゲノムＤＮＡ内に元々存在する２箇所の切断部位の
みで切断されるが、レフト・ボーダーが挿入されている
caprice の場合、レフト・ボーダー内の切断部位でも切
断されるため、より短い断片が検出される。
るのは、ゲノムＤＮＡに挿入されるレフト・ボーダー内
にHindIII 切断部位があるからである。図３に示すよう
に、レフト・ボーダーが挿入されていない野性型の場
合、ゲノムＤＮＡ内に元々存在する２箇所の切断部位の
みで切断されるが、レフト・ボーダーが挿入されている
caprice の場合、レフト・ボーダー内の切断部位でも切
断されるため、より短い断片が検出される。
【００３５】〔実施例７〕 ＣＰＣ遺伝子のクローニン
グ ＷＳ株の地上部を集め、液体窒素で凍らせながら乳鉢で
組織をつぶし、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを
使って、ＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡをSau3AI
（宝酒造製）で部分分解し、ショ糖密度勾配遠心により
15〜20kbの断片が入った画分を集め、このゲノムＤＮＡ
とBamHI （宝酒造製）で切断したλDASH II とのライゲ
ーションを行った。得られた組換えベクターは、Gigapa
ck II Packaging Extract （Stratagene社製）によりin
vitroパッケージングをした。パッケージングをしたフ
ァージ約10万個を、大腸菌XL1-Blue MRA(P2)を含むＬＢ
プレート（脱イオン水 1 L 、バクトトリプトン 10g、
バクトイースト抽出物 5g 、NaCl 10g、寒天 1.2% ）に
まき、シロイヌナズナのゲノムライブラリーを作成し、
実施例６で単離された約２kbのＤＮＡ断片をプローブと
して、スクリーニングを行った。この結果、４種類の陽
性クローンを単離した。これらのファージクローンを、
EcoRI とXbaIで切断し、前記した約２kbのＤＮＡ断片を
プローブとしてサザンブロットを行った。プローブがハ
イブリダイズした断片の中からEcoRI で切断した4.4kb
、XbaIで切断した7.3kb と５kbの３種類の断片をプラ
スミドベクターBluescript SK+（Stratagene社製）にク
ローニングした。
グ ＷＳ株の地上部を集め、液体窒素で凍らせながら乳鉢で
組織をつぶし、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを
使って、ＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡをSau3AI
（宝酒造製）で部分分解し、ショ糖密度勾配遠心により
15〜20kbの断片が入った画分を集め、このゲノムＤＮＡ
とBamHI （宝酒造製）で切断したλDASH II とのライゲ
ーションを行った。得られた組換えベクターは、Gigapa
ck II Packaging Extract （Stratagene社製）によりin
vitroパッケージングをした。パッケージングをしたフ
ァージ約10万個を、大腸菌XL1-Blue MRA(P2)を含むＬＢ
プレート（脱イオン水 1 L 、バクトトリプトン 10g、
バクトイースト抽出物 5g 、NaCl 10g、寒天 1.2% ）に
まき、シロイヌナズナのゲノムライブラリーを作成し、
実施例６で単離された約２kbのＤＮＡ断片をプローブと
して、スクリーニングを行った。この結果、４種類の陽
性クローンを単離した。これらのファージクローンを、
EcoRI とXbaIで切断し、前記した約２kbのＤＮＡ断片を
プローブとしてサザンブロットを行った。プローブがハ
イブリダイズした断片の中からEcoRI で切断した4.4kb
、XbaIで切断した7.3kb と５kbの３種類の断片をプラ
スミドベクターBluescript SK+（Stratagene社製）にク
ローニングした。
【００３６】次に、Current Protocolの記載に従って、
シロイヌナズナの根から全ＲＮＡを単離した。シロイヌ
ナズナの根の組織２〜４g を液体窒素で凍らせながら乳
鉢中でつぶし、グアニジンチオシナネートを含んだバッ
ファー中に攪拌し、超遠心（22000 rpm ×16時間）を行
うことによってＲＮＡを沈殿させ、組織再懸濁液（5mM
ＥＤＴＡ、 0.5% サルコシル、 5% ２−メルカプトエタ
ノール）に懸濁して回収した。得られた全ＲＮＡからOl
igotex-dT30[Super]（日本ロッシュ）を用いてpoly (A)
+ ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡに対して0.5 〜１% の範
囲でpoly (A)+ＲＮＡを回収できた。回収した根のpoly
(A)+ ＲＮＡ（ 5μg ）に3'末端にXhoI切断部位のつい
てオリゴdTプライマーをアニールさせて、逆転写酵素
（Strata Script reverse transcriptase, Stratagene
社製）を用いて、２本鎖のｃＤＮＡを合成した。この２
本鎖ｃＤＮＡの5'末端にはEcoRI 、3'末端にはXhoIの部
位がついているので、EcoRI とXhoIで切断したZAPII ベ
クター（Stratagene社製）にクローニングした。得られ
た組換えベクターは、Gigapack II Packaging Extract
（Stratagene社製）によりin vitroパッケージングをし
た。パッケージングをしたファージ約30万個を、大腸菌
XL1-Blue MRF' を含むＬＢプレートにまき、シロイヌナ
ズナのｃＤＮＡライブラリーを作成し、前記のXbaIで切
断した５kbの断片をプローブとしてスクリーニングを行
った。この結果、４個の陽性クローンを分離した。得ら
れたクローンに含まれるｃＤＮＡの中から最も長いｃＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。シークエンス反応は、Dye
primer cycle sequencing FS kit及びDye terminator c
ycle sequencing FS ready reaction kit （Perkin ele
mer 社製）を用いて行い、蛍光自動シークエンサー（AB
I, Model 370A ）により塩基配列を決定した。決定した
配列を配列番号２に示す。このｃＤＮＡの全長は５８４
bpであり、一番長いＯＦＲを翻訳すると94アミノ酸で分
子量は11kDであった。配列番号２が示すように、翻訳開
始点の上流には２つの終止コドンが存在した。
シロイヌナズナの根から全ＲＮＡを単離した。シロイヌ
ナズナの根の組織２〜４g を液体窒素で凍らせながら乳
鉢中でつぶし、グアニジンチオシナネートを含んだバッ
ファー中に攪拌し、超遠心（22000 rpm ×16時間）を行
うことによってＲＮＡを沈殿させ、組織再懸濁液（5mM
ＥＤＴＡ、 0.5% サルコシル、 5% ２−メルカプトエタ
ノール）に懸濁して回収した。得られた全ＲＮＡからOl
igotex-dT30[Super]（日本ロッシュ）を用いてpoly (A)
+ ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡに対して0.5 〜１% の範
囲でpoly (A)+ＲＮＡを回収できた。回収した根のpoly
(A)+ ＲＮＡ（ 5μg ）に3'末端にXhoI切断部位のつい
てオリゴdTプライマーをアニールさせて、逆転写酵素
（Strata Script reverse transcriptase, Stratagene
社製）を用いて、２本鎖のｃＤＮＡを合成した。この２
本鎖ｃＤＮＡの5'末端にはEcoRI 、3'末端にはXhoIの部
位がついているので、EcoRI とXhoIで切断したZAPII ベ
クター（Stratagene社製）にクローニングした。得られ
た組換えベクターは、Gigapack II Packaging Extract
（Stratagene社製）によりin vitroパッケージングをし
た。パッケージングをしたファージ約30万個を、大腸菌
XL1-Blue MRF' を含むＬＢプレートにまき、シロイヌナ
ズナのｃＤＮＡライブラリーを作成し、前記のXbaIで切
断した５kbの断片をプローブとしてスクリーニングを行
った。この結果、４個の陽性クローンを分離した。得ら
れたクローンに含まれるｃＤＮＡの中から最も長いｃＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。シークエンス反応は、Dye
primer cycle sequencing FS kit及びDye terminator c
ycle sequencing FS ready reaction kit （Perkin ele
mer 社製）を用いて行い、蛍光自動シークエンサー（AB
I, Model 370A ）により塩基配列を決定した。決定した
配列を配列番号２に示す。このｃＤＮＡの全長は５８４
bpであり、一番長いＯＦＲを翻訳すると94アミノ酸で分
子量は11kDであった。配列番号２が示すように、翻訳開
始点の上流には２つの終止コドンが存在した。
【００３７】〔実施例８〕 ＣＰＣ遺伝子を過剰発現さ
せた植物の作成 pMAT137-Hm（Matsuoka,K.and Nakamura,K.(1991)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 88,834-838 、名古屋大学農学部応用
生物化学科の松岡健博士から分与）を制限酵素XbaI（宝
酒造社製）とKpnI（宝酒造社製）で切断した。このベク
ターには、カリフラワーモザイク・ウイルスの３５Ｓプ
ロモーターが３つtandemに連結されており、その下流に
マルチクローニングサイトがあって任意の遺伝子をクロ
ーニングできるようになっている。また、薬剤耐性遺伝
子としてハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子が
別の３５Ｓプロモーターと連結されていて、大腸菌、ア
グロバクテリウム菌、植物で薬剤耐性遺伝子として働く
ことができる。
せた植物の作成 pMAT137-Hm（Matsuoka,K.and Nakamura,K.(1991)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 88,834-838 、名古屋大学農学部応用
生物化学科の松岡健博士から分与）を制限酵素XbaI（宝
酒造社製）とKpnI（宝酒造社製）で切断した。このベク
ターには、カリフラワーモザイク・ウイルスの３５Ｓプ
ロモーターが３つtandemに連結されており、その下流に
マルチクローニングサイトがあって任意の遺伝子をクロ
ーニングできるようになっている。また、薬剤耐性遺伝
子としてハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子が
別の３５Ｓプロモーターと連結されていて、大腸菌、ア
グロバクテリウム菌、植物で薬剤耐性遺伝子として働く
ことができる。
【００３８】Bluescript SK+ベクター（Stratagene社
製）にクローニングされたＣＰＣ遺伝子を上記と同様に
制限酵素XbaI（宝酒造社製）とKpnI（宝酒造社製）で切
断し、ＤＮＡLigation Kit Ver.2（宝酒造社製）を使っ
て、pMAT137-Hmとライゲーション反応を行った。このプ
ラスミド（以下、「pMAT137-Hm+CPC」という）をGene P
ulser （Biorad社製）によって大腸菌JM109 （宝酒造社
製）に導入し、50mg/lの濃度のハイグロマイシンＢ（和
光純薬社製）を含んだＬＢ培地（1%バクトトリプトン、
0.5%バクトイーストイクストラクト、1%ＮａＣｌ、1.2%
寒天末）で形質転換された大腸菌を選抜した。
製）にクローニングされたＣＰＣ遺伝子を上記と同様に
制限酵素XbaI（宝酒造社製）とKpnI（宝酒造社製）で切
断し、ＤＮＡLigation Kit Ver.2（宝酒造社製）を使っ
て、pMAT137-Hmとライゲーション反応を行った。このプ
ラスミド（以下、「pMAT137-Hm+CPC」という）をGene P
ulser （Biorad社製）によって大腸菌JM109 （宝酒造社
製）に導入し、50mg/lの濃度のハイグロマイシンＢ（和
光純薬社製）を含んだＬＢ培地（1%バクトトリプトン、
0.5%バクトイーストイクストラクト、1%ＮａＣｌ、1.2%
寒天末）で形質転換された大腸菌を選抜した。
【００３９】形質転換された大腸菌よりＤＮＡ自動分離
装置PI100 Σ（倉敷紡績社製）でプラスミドを抽出し
た。このプラスミドpMAT137-Hm+CPCをGene Pulser （Bi
orad社製）でAgrobacterium tumefaciens C58C1Rif株に
導入した。
装置PI100 Σ（倉敷紡績社製）でプラスミドを抽出し
た。このプラスミドpMAT137-Hm+CPCをGene Pulser （Bi
orad社製）でAgrobacterium tumefaciens C58C1Rif株に
導入した。
【００４０】シロイヌナズナ（学名Arabidopsis thalia
na）ＷＳ株を、vacum infiltration法（Bechtold,Nら(1
993)C.R.Acad.Sci.Paris,Life Sciences 316,1194-119
9）によってＬＢ培地で液体振とう培養したアグロバク
テリウム菌で形質転換した。形質転換植物体を培養土に
植えかえ、種子を収穫してハイグロマイシンの入った培
地（１ＸガンボーグＢ５培地用混合塩（和光純薬社
製）、1%ショ糖、0.8%寒天末、10mg/ml ハイグロマイシ
ンＢ（和光純薬社製））で薬剤耐性の組み換え体の選抜
を行った。その結果、２個体の形質転換体を得た。この
植物体を培養土に植え換えて生育させ、種子を収穫し
た。
na）ＷＳ株を、vacum infiltration法（Bechtold,Nら(1
993)C.R.Acad.Sci.Paris,Life Sciences 316,1194-119
9）によってＬＢ培地で液体振とう培養したアグロバク
テリウム菌で形質転換した。形質転換植物体を培養土に
植えかえ、種子を収穫してハイグロマイシンの入った培
地（１ＸガンボーグＢ５培地用混合塩（和光純薬社
製）、1%ショ糖、0.8%寒天末、10mg/ml ハイグロマイシ
ンＢ（和光純薬社製））で薬剤耐性の組み換え体の選抜
を行った。その結果、２個体の形質転換体を得た。この
植物体を培養土に植え換えて生育させ、種子を収穫し
た。
【００４１】収穫した種子のうちプラスミドpMAT137-Hm
+CPCがゲノム中に挿入された植物体の根毛数（根毛１mm
あたりの本数）を計測した。根毛数の計測は、実体顕微
鏡で観察して行い、各系統ごとに20個体ずつ計測した。
各系統の根毛数の平均値±標準誤差を表１に示す。ま
た、シロイヌナズナの根の実体顕微鏡写真を図４に示
す。図４中、Ａが野性型、Ｂが突然変異体「caprice
」、ＣがＣＰＣ遺伝子過剰発現植物である。
+CPCがゲノム中に挿入された植物体の根毛数（根毛１mm
あたりの本数）を計測した。根毛数の計測は、実体顕微
鏡で観察して行い、各系統ごとに20個体ずつ計測した。
各系統の根毛数の平均値±標準誤差を表１に示す。ま
た、シロイヌナズナの根の実体顕微鏡写真を図４に示
す。図４中、Ａが野性型、Ｂが突然変異体「caprice
」、ＣがＣＰＣ遺伝子過剰発現植物である。
【００４２】
【表１】
【００４３】表１が示すように、プラスミドpMAT137-Hm
+CPCがゲノム中に挿入された植物体では、野性型に比べ
て２〜３倍根毛の数が多くなっていた（系統♯１で野性
型の3.1 倍、系統♯２で2.3 倍までに増加してい
た。）。つまり、ＣＰＣ遺伝子をシロイヌナズナで過剰
発現させると根毛の数が増大し、逆にＣＰＣ遺伝子がつ
ぶれた突然変異体「caprice 」では根毛の数が減少す
る。
+CPCがゲノム中に挿入された植物体では、野性型に比べ
て２〜３倍根毛の数が多くなっていた（系統♯１で野性
型の3.1 倍、系統♯２で2.3 倍までに増加してい
た。）。つまり、ＣＰＣ遺伝子をシロイヌナズナで過剰
発現させると根毛の数が増大し、逆にＣＰＣ遺伝子がつ
ぶれた突然変異体「caprice 」では根毛の数が減少す
る。
【００４４】pMAT137-Hm+CPCがゲノム中に挿入された植
物体では葉及び茎のトライコームの数が減少していた。
トライコームとは、葉や茎などの地上部の表皮細胞の一
端が伸長したものであり、葉のトライコームは先端が３
つに分枝している。ＣＰＣ遺伝子を過剰発現させた植物
の葉の写真を図４Ｂに、茎の写真を図５Ｂに示す。ま
た、野性型の葉の写真を図４Ａに、茎の写真を図５Ａに
示す。以上のことをまとめると、ＣＰＣ遺伝子を過剰発
現させた植物では根毛（地上部）の毛の数は増加する
が、葉や茎（地上部）の毛の数は減少する。
物体では葉及び茎のトライコームの数が減少していた。
トライコームとは、葉や茎などの地上部の表皮細胞の一
端が伸長したものであり、葉のトライコームは先端が３
つに分枝している。ＣＰＣ遺伝子を過剰発現させた植物
の葉の写真を図４Ｂに、茎の写真を図５Ｂに示す。ま
た、野性型の葉の写真を図４Ａに、茎の写真を図５Ａに
示す。以上のことをまとめると、ＣＰＣ遺伝子を過剰発
現させた植物では根毛（地上部）の毛の数は増加する
が、葉や茎（地上部）の毛の数は減少する。
【００４５】シロイヌナズナでは、既に根毛の数が多く
なった突然変異体として ttg、gl2が同定されている（
Galawayら,1994 ； Massuciら,1996 ）。これら２つの
突然変異体は元々葉のトライコームの突然変異体として
分離されたものである（Koorneefら,1982 ；Hulskamp
ら,1984,図５）。ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の根毛とト
ライコームの表現型は、ttg 及びgl2 突然変異体と同じ
である。
なった突然変異体として ttg、gl2が同定されている（
Galawayら,1994 ； Massuciら,1996 ）。これら２つの
突然変異体は元々葉のトライコームの突然変異体として
分離されたものである（Koorneefら,1982 ；Hulskamp
ら,1984,図５）。ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の根毛とト
ライコームの表現型は、ttg 及びgl2 突然変異体と同じ
である。
【００４６】〔実施例９〕根毛の二重突然変異体の作製 caprice とgl2 、caprice とttg をそれぞれ交配し、ca
price とgl2 の二重突然変異体及びcaprice とttg の二
重突然変異体を作製した。
price とgl2 の二重突然変異体及びcaprice とttg の二
重突然変異体を作製した。
【００４７】caprice とgl2 の二重突然変異体の根毛に
関する表現型は、gl2 と類似したものであった（表
１）。このことから、ＣＰＣ遺伝子は gl2 に関係する
遺伝子よりも上流で働いていることが示唆された。
関する表現型は、gl2 と類似したものであった（表
１）。このことから、ＣＰＣ遺伝子は gl2 に関係する
遺伝子よりも上流で働いていることが示唆された。
【００４８】caprice とttg の二重突然変異体の根毛に
関する表現型は、それぞれの突然変異体の中間型であっ
た（表１）。このことから、ＣＰＣ遺伝子とttg に関係
する遺伝子は、なんらかの形で相互作用をし、根毛形成
に関与していることが示唆された。
関する表現型は、それぞれの突然変異体の中間型であっ
た（表１）。このことから、ＣＰＣ遺伝子とttg に関係
する遺伝子は、なんらかの形で相互作用をし、根毛形成
に関与していることが示唆された。
【００４９】
【発明の効果】本発明は、植物の根毛形成を促進する新
規な遺伝子であるＣＰＣ遺伝子を提供する。この遺伝子
を他の植物に導入して発現させることにより、当該植物
の根毛の形成を促進し、葉及び茎のトライコームを減少
させることができる。
規な遺伝子であるＣＰＣ遺伝子を提供する。この遺伝子
を他の植物に導入して発現させることにより、当該植物
の根毛の形成を促進し、葉及び茎のトライコームを減少
させることができる。
【００５０】
配列番号１ 配列の長さ：９４ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：アミノ酸 起源 生物名 ：シロイヌナズナ 配列 Met Phe Arg Ser Asp Lys Ala Glu Lys Met Asp Lys Arg Arg Arg Arg Gln Ser Lys Ala Lys Ala Ser Cys Ser Glu Glu Val Ser Ser Ile Glu Trp Glu Ala Val Lys Met Ser Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ser Arg Met Tyr Lys Leu Val Gly Asp Arg Trp Glu Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Tyr Trp Leu Met Lys His Gly Val Val Phe Ala Asn Arg Arg Arg Asp Phe Phe Arg Lys
【００５１】配列番号２ 配列の長さ：５８４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名 ：シロイヌナズナ 配列 ATG TTT CGT TCA GAC AAG GCG GAA AAA ATG GAT AAA CGA CGA CGG AGA CAG AGC AAA GCC AAG GCT TCT TGT TCC GAA GAG GTG AGT AGT ATC GAA TGG GAA GCT GTG AAG ATG TCA GAA GAA GAA GAA GAT CTC ATT TCT CGG ATG TAT AAA CTC GTT GGC GAC AGG TGG GAG TTG ATC GCC GGA AGG ATC CCG GGA CGG ACG CCG GAG GAG ATA GAG AGA TAT TGG CTT ATG AAA CAC GGC GTC GTT TTT GCC AAC AGA CGA AGA GAC TTT TTT AGG AAA
【図１】caprice の根の写真（生物の形態写真）
【図２】caprice 及び野性型のサザンブロッティングを
表す図
表す図
【図３】caprice 及び野性型のHindIII の切断部位を示
す図
す図
【図４】ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の根の写真（生物の
形態写真）
形態写真）
【図５】ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の葉の写真（生物の
形態写真）
形態写真）
【図６】ＣＰＣ遺伝子過剰発現植物の茎の写真（生物の
形態写真）
形態写真）
【図７】ttg 、gl1 、gl2 の葉の写真（生物の形態写
真）
真）
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年２月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列、又
は配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一な
アミノ酸配列をコードするＣＰＣ遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載のＣＰＣ遺伝子を導入した
植物。
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|---|---|---|---|
| JP02887797A JP4051719B2 (ja) | 1996-04-26 | 1997-02-13 | シロイヌナズナの根毛形成開始を制御するｃｐｃ遺伝子及びそれを導入した植物 |
| CA002199582A CA2199582A1 (en) | 1996-04-26 | 1997-03-10 | Cpc gene for regulating initiation of root hair formation for arabidopsis (thaliana), and transgenic (arabidopsis) plant overexpressing the cpc gene |
| US08/814,030 US5831060A (en) | 1996-04-26 | 1997-03-10 | CPC gene for regulating initiation of root hair formation for arabidopsis (thaliana) and transgenic (arabidopsis), plant overexpressing the CPC gene |
| DE69721892T DE69721892T2 (de) | 1996-04-26 | 1997-03-13 | CPC-Gen zur Regulierung der Initiation von der Wurzelhaarbildung bei Arabidopsis (thaliana), und diese überexprimierende transgene (Arabidopsis) Pflanzen |
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| JP10740996 | 1996-04-26 | ||
| JP02887797A JP4051719B2 (ja) | 1996-04-26 | 1997-02-13 | シロイヌナズナの根毛形成開始を制御するｃｐｃ遺伝子及びそれを導入した植物 |
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Cited By (1)
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| US7193129B2 (en) * | 2001-04-18 | 2007-03-20 | Mendel Biotechnology, Inc. | Stress-related polynucleotides and polypeptides in plants |
| US7223904B2 (en) * | 1999-02-18 | 2007-05-29 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant gene sequences II |
| US8633353B2 (en) | 1999-03-23 | 2014-01-21 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plants with improved water deficit and cold tolerance |
| EP1229781B1 (en) * | 1999-11-17 | 2013-01-02 | Mendel Biotechnology, Inc. | Seed trait genes |
| EP1330517B1 (en) | 2000-10-30 | 2008-09-10 | Exelixis Plant Sciences, Inc. | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ant1) in tomato |
| US7939715B2 (en) * | 2000-11-16 | 2011-05-10 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plants with improved yield and stress tolerance |
| US7304207B2 (en) * | 2001-10-29 | 2007-12-04 | Exelixis, Inc. | Identification and characterization of an Anthocyanin mutant (ANT1) in tomato |
| US8426678B2 (en) | 2002-09-18 | 2013-04-23 | Mendel Biotechnology, Inc. | Polynucleotides and polypeptides in plants |
| US20040006797A1 (en) * | 2002-04-05 | 2004-01-08 | Lifang Shi | MYB transcription factors and uses for crop improvement |
| EP1618186A2 (en) * | 2003-04-25 | 2006-01-25 | Exelixis Plant Sciences, Inc. | Genes upregulated in a tomato plant having an increased anthocyanin content phenotype |
| CN101679981A (zh) * | 2006-10-12 | 2010-03-24 | 独立行政法人理化学研究所 | 突变植物及其生产方法 |
| GB0709835D0 (en) * | 2007-05-22 | 2007-07-04 | Plant Bioscience Ltd | Composition and method for modulating plant root hair development |
| CN109112124B (zh) * | 2018-09-26 | 2021-05-21 | 华中农业大学 | 一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1994010831A1 (en) * | 1992-11-06 | 1994-05-26 | Washington University | Induction of dwarfing and early flowering using group 3 lea proteins |
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- 1997-02-13 JP JP02887797A patent/JP4051719B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 1997-03-10 US US08/814,030 patent/US5831060A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-13 DE DE69721892T patent/DE69721892T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-13 EP EP97301700A patent/EP0803572B1/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|---|
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