WO2005026363A1 - 突然変異の検出法と誘発法 - Google Patents

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WO2005026363A1
WO2005026363A1 PCT/JP2004/014007 JP2004014007W WO2005026363A1 WO 2005026363 A1 WO2005026363 A1 WO 2005026363A1 JP 2004014007 W JP2004014007 W JP 2004014007W WO 2005026363 A1 WO2005026363 A1 WO 2005026363A1
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WO
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seq
transposable element
nucleotide sequence
sequence
gene
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PCT/JP2004/014007
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masaki Momose
Naoyuki Umemoto
Hiroshi Okawa
Original Assignee
Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector

Definitions

  • the present invention relates to a novel transposable element that induces a shoot bud mutation in a plant, a method for detecting a mutation using a transferase and a nucleotide sequence encoding the transferase, a method for inducing a mutation, a method for stabilizing the mutation, and a method for stabilizing a mutant gene.
  • the present invention relates to identification methods and selection of mutants in which gene expression is suppressed.
  • the shoot mutation in the present invention means that a mutation occurs at a gene level of a somatic cell in a part of a plant, and the sudden shoot mutant means the mutant.
  • crops such as flowers and fruit trees, which are vegetative breeding crops
  • uncrossed shoot mutations provide important genetic variation for breeding.
  • the molecular mechanism of the bud mutation is unknown and the cause is left to spontaneous occurrence.
  • spontaneous mutation occurs only with a probability of about 1 / 100,000, and radiation irradiation and chemical substances with mutagenic properties are used as methods to induce mutation to increase this efficiency.
  • the mutations are often included, and often accompanied by inferior traits in addition to the desired traits. The efficiency is low because it is necessary to search for the target from inside.
  • Transposable elements are mobile genetic elements that are translocated on the genome and are widely found in species from prokaryotes to eukaryotes. In plants, it is found in Arabidopsis thaliana, Chinese cabbage, etc. [Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-93034], and the kernels of corn (mays) and the petals of goldfish (Ant irrhinum ma jus)
  • Petunia Hybri da petals [The Plant Journal 13: 39-50 (1998)]
  • transposable elements that regulate the expression of anthocyanin pigment biosynthesis genes in petals of carnation are well known.
  • a transposable element is inserted into the gene for dihydroflavonol-14-reductase (DFR), one of the anthocyanin pigment biosynthetic enzymes.
  • DFR dihydroflavonol-14-reductase
  • the DFR gene is required for red pigment synthesis, but if a transposable element is inserted, the flower color will be white because the DFR gene will not function.
  • the function of the DFR gene is restored by the removal of the transposable element inserted at the time of petal formation, and a pattern with red spots is formed [Plant Cell Physiology. 43: 578- 585 (2002)].
  • transposable elements are eliminated in some cells in an individual and have sector-like mutations, the involvement of transposable elements in maize, kingfisher, morning glory, petunia, etc. has been molecularly elucidated. ing.
  • transposable elements are transmitted to progeny via germ cells.
  • the transposable element has been transposed during the germ cell formation stage, and a mutant by the transposable element is obtained in the progeny.
  • a method has been developed to introduce a known transposable element through gene transfer, etc., and to analyze the mutant obtained in the progeny using the introduced transposable element as an index to isolate the gene. It is called transposon tagging [The Plant Journal 7: 677-685 (1995)].
  • transposable elements as mutagens.However, current methods have not been able to obtain mutations by inserting transposable elements into genes in shoots, and Alternatively, they have only obtained mutants through crossing. It is known that the transposable element is translocated in some cells constituting an individual, and a case of a bud mutation caused by a retrotransposon has been reported [Science 304: 982].
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-93304
  • Non-Patent Document 1 Protein Nucleic Acid Enzyme 37 1047-1059 (1992) Natl. Acad. Sci. USA 97: 7016-7023 (2000)
  • Non-patent document 3 The Plant Journal 13: 39-50 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Plant Cel l Physiology. 43: 578-585 (2002)
  • Non-Patent Document 5 The Plant Journal 7: 677-685 (1995)
  • the present invention provides a novel transposable element of a plant that induces shoot mutation, a method for detecting the presence or absence of a novel transposable element, and a method for detecting whether or not it is eliminated.
  • An object of the present invention is to provide a method for inducing a sudden bud mutation by using a novel transposable element as a mutagen.
  • the number of mutated genes per cell is small, but ideally a shoot mutant can be obtained with high efficiency. Mutating method.
  • the presence of an indicator of a transposable element in the causative gene facilitates isolation of the causative gene.
  • DNA not present in carnation line 95SP was inserted into the genomic gene encoding flavonoid 3 'hydroxylase, which is an enzyme involved in anthocyanin biosynthesis of carnation line 97SPi.
  • the inserted base sequence had the typical characteristics of a transposable element. That is, it had an inverted repeat sequence of 13 bases shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 at both ends, and the same base sequence in the same direction of 8 bases was present on both sides of the position where the sequence was inserted.
  • the inverted repeat sequence is similar to that of AC, which is a transposable element of maize (Fig. 1), but no similarity was found in the internal nucleotide sequence of about 4 kb.
  • the nucleotide sequence has an open reading frame, and the sequence obtained by converting this nucleotide sequence into an amino acid has homology to the amino acid sequence of the transferase encoded by a Qualcomm-derived transposable element and a sorghum-derived transposable element. ( Figure 2).
  • the expression of this transferase can be detected by return PCR (hereinafter referred to as return PCR).
  • a DNA base sequence which is considered to be a non-autonomous transposable element having a 13 base inverted repeat sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 at both ends, but having no transferase gene inside was obtained.
  • This DNA sequence is also present in 95SP and the 97SP mutant 97SE, which has been inserted into a new genomic site that is not in 95SP in 97SE. The same base sequence existed. Since 97SE inserts into a genomic site different from 95SP, it was confirmed that the sequence was mobile.
  • a transposable element that translocates on the genome and induces a bud mutation is isolated and identified for the first time.
  • those that encode a transposable enzyme can control transposition by controlling the expression of the present enzyme.
  • the transposable elements of the present invention those which do not encode a transferase, it is possible to control the transposition by controlling the expression of the transferase of the transposable element encoding the transferase. is expected.
  • the transposable element of the present invention has a property of inducing a shoot mutation. Therefore, by giving specific environmental conditions such as a temperature that promotes transfer or by artificially expressing a transferase, it is useful that a shoot mutation can be efficiently induced. Bud mutants can be easily detected using the nucleotide sequence information of the transposable element revealed by the present invention.
  • the causative gene can be easily isolated.
  • transposable element By inserting a transposable element into a gene, it is possible to obtain a mutant in which gene expression is suppressed without using a gene recombination technique such as antisense.
  • a gene recombination technique such as antisense.
  • shoot mutations by transposable elements are useful.
  • the target gene-disrupted individuals can be easily screened from the mutations induced by this transposable element, and the expression of the gene can be suppressed without performing genetic recombination.
  • RNAi transferase
  • FIG. 1 shows a homology comparison of terminal inverted repeat sequences in transposable elements between various plants and the plant of the present invention (carnation line 97SPi).
  • cluster 1 means the type of transposable element.
  • Genetics 158 Prepared based on the description of 949-957 2001.
  • Fig. 2-1 shows a homology comparison at the amino acid level between the transferase of the plant (carnation line 97SPi) used in the present invention and the transferase of the Qualcomm transposable element Tam3.
  • a symbol such as R or Q between two sequences indicates that the amino acids are the same, and a symbol + indicates that the amino acids are similar.
  • L Since I, V and M are common in hydrophobic amino acids, they are denoted by this symbol.
  • Query shows the amino acid sequence of the transferase possessed by the transposable element of the present invention
  • Sbjct shows the amino acid sequence of the transferase possessed by the translocating factor Tam3 of Qualcomm.
  • Figure 2-2 is a continuation of Figure 2-1.
  • Fig. 3-1 shows the comparison of the 95SP flavonoid 3 'hydroxylase (F3'H) gene cDNA base sequence (Query) and the cDNA sequence of the F3'H gene described in GenBank AX028819 (Subject). I indicates a homologous base, and * indicates a different base.
  • F3'H 95SP flavonoid 3 'hydroxylase
  • Fig. 3-2 is a continuation of Fig. 3-1.
  • Figure 4 shows the presence or absence of transposable element elimination in various carnations.
  • Figure 5 shows the transfer expression of transferase in various carnations. Strain 95SP and
  • 97SPi Capella cDNA was prepared, and PCR was performed using primers CACTATGGATCCTAATTCTCAAA (23 bases: system IJ number 20) and GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23 bases: SEQ ID NO: 14).
  • Figure 6 shows the presence of transposable elements in various species of the genus Dianthus.
  • GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG 21 bases: SEQ ID NO: 16
  • CGCAAATACACTAAATTTATGCC 23 bases: SEQ ID NO: 17
  • the presence of the transposable factor of the present invention was investigated in plants of the genus Dianthus. It was clarified that it was also present in other varieties of carnation (lane 3) and in plants of the genus Dianthus other than carnation (lanes 4 and 5). Description of the lane: 1: Molecular weight marker (Hindlll)
  • Figure 7 shows the presence or absence of transposable elements (sprouts mutation) in various carnations.
  • inverse PCR was performed using primers CGAATACCGTGCTTTGGACG (20 bases: SEQ ID NO: 18) and CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23 bases: SEQ ID NO: 17) to evaluate the transfer of the transposable element of the present invention. A change was observed in each band pattern, and it was detected that the transposable element of the present invention had transposed.
  • Pink flower carnation 97SPi is a shoot mutant obtained from purple flower carnation 95SP.
  • Analysis of both flower color pigments by TLC revealed that the former had a bergonidine skeleton and the latter had a cyanidin skeleton. This suggested that the gene responsible for this bud mutation was flavonoid 3 'hydroxylase.
  • AAGCATATTGCNTAYAAYTAYCANGA 26 bases: SEQ ID NO: 5
  • CCATCTCTTGCDATNGCCCANAYRTT 26 bases: SEQ ID NO: 6
  • the 95SP flavone De 3 'hydroxylase cDNA sequence was obtained. Where base Y,
  • R and N indicate C or T, ⁇ or G, and any base (A or G or C or T), respectively. You. The same applies to the following embodiments.
  • inverse PCR was performed using the primers TAAACGGGTACCACATTCCCA (21 bases: SEQ ID NO: 7) and AAGTCGGAAAACCTCTTTGAT (21 bases: SEQ ID NO: 8) prepared based on the obtained cDNA sequence.
  • the primers AGCAGGAACAAAGCCAGTACA (21 bases: SEQ ID NO: 9) and GTTAACAATTCAATACTCAGTACA (24 bases: SEQ ID NO: 10) and primers AATGTCACCCTTAGAGGTAACTTTCTA (27 bases: SEQ ID NO: 11) and TAGCAAGGCCTTAATTTCTG (21 bases) : Primers of two combinations of SEQ ID NO: 12) were prepared, and the genomic nucleotide sequence of the flavonoid 3 'hydroxylase gene was determined by PCR.
  • a primer GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23 bases: SEQ ID NO: 14) prepared based on the base sequence of this DNA fragment and a base sequence of a flavonoid 3 'hydroxylase gene Using the primer TAACAACACGTAACCGAAAATATA (24 bases: SEQ ID NO: 15) created based on the above, PCR is performed and inserted into the genomic gene of the flavonoid 3 'hydroxylase of 97SP i. DNA was obtained and the nucleotide sequence was determined. This nucleotide sequence had the characteristics of a transposable element. That is, an inverted base sequence of 13 bases was present at both ends, and the same base sequence (AGTTAATT) of 8 bases in the same direction was present on both sides of the position where the sequence was inserted.
  • This nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4, and the corresponding amino acid sequence of the transferase portion is shown in SEQ ID NO: 3. Since this transposable element is classified as an hAT type autonomous transposable element, it has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 at the 5 'end and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 at the 3' end, Non-autonomous elements linked to the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 directly or via an arbitrary linker shorter than 400 bases can also be sprouts when transferase is supplied from outside. It is possible to induce a streak mutation.
  • PCR was performed using 97SPi genomic DNA as a type I primer, AGATCTAGAGCTGGCAAACCGGTGC (25 bases: SEQ ID NO: 23) and primer AGATCTAGAGCTGGCAAAAAAACGGGC (27 bases: SEQ ID NO: 24), which were created based on the base sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the obtained product was determined, and a non-autonomous element having no such naturally occurring transferase gene as shown in SEQ ID NO: 22 was obtained.
  • This non-autonomous element is also present in 95SP and 97SE, a mutant from 95SP, and it is clear that 97SE is mobile because it shows insertion at a genomic site that is not present in 95SP.
  • nucleotide sequence of the genomic site where the 97SE-specific insertion was observed was determined, an inversion of 13 bases each shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, which is homologous to a transposable element having a transferase gene at both ends. It had a repetitive sequence, and the same base sequence (GTTATATG) in the same direction of 8 bases was present on both sides of the position where the sequence was inserted.
  • Such a naturally occurring non-autonomous element is expected to be capable of inducing shoot mutation by the transferase of the transferase having the transferase gene of the present invention.
  • nucleotide sequence used in the present invention in addition to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 22,
  • the present invention also provides any one of the following polypeptides (1) to (2):
  • the operation of deletion, substitution, insertion or addition (at both ends) of the amino acid referred to in the above (2) is performed, for example, by DFMark et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 5662- Natl.Acad.Sci. USA 79 (1982) 3438-3441, W085 / 00817, RP Wharton et al, Nature 316 (1985) 601-605.
  • Those skilled in the art can easily implement the method by a mutation induction method or the like.
  • the polypeptide having the mutant amino acid sequence obtained here may have a transposition activity to induce bud streak mutation, and the presence or absence of the transposition activity can be determined by the method described in Examples below.
  • the degenerate isomer referred to in the above (4) means a nucleotide sequence that differs only in the degenerate codon and can encode the same polypeptide.
  • a codon corresponding to any of a certain amino acid with respect to a certain base sequence for example, a codon (AAC) corresponding to Asn, which is degenerated in a degenerate relation to, for example, AAT, is referred to as degenerate Shall be called body.
  • the stringent condition is, for example, when the sodium concentration is 10 mM.
  • a numerical value of the homology is calculated based on a sequence comparison program: for example, DNASIS-Mac v3.7 or BLAST: NCBI site (http: // www. Ncbi. Nlm. Using nih. gov / entrez /), the difference is calculated by the parameter of the differential stage.
  • the DNA containing the nucleotide sequence encoding the transferase or a mutant thereof may be any as long as it has a transfer activity, and the height of the activity is not particularly limited. It is preferable to have substantially the same activity as the transfer activity of that portion.
  • substantially having the activity means that in an actual use mode utilizing the activity, the activity is maintained to such an extent that the DNA or a portion thereof can be used in substantially the same manner under the same conditions. That is being done.
  • activity refers to, for example, an activity in a plant cell or a plant, preferably a dicot plant cell or a plant, more preferably an activity in a carnation cell or a plant.
  • the transposition activity can be determined, for example, by using a plasmid containing a transposable element that has lost autonomy due to the deletion according to the method described by Hashi da et al. [Plant Pysiol. 132: 1277-1212]. It can be measured by bombarding it into a cell, and observing the frequency of metastasis from plasmid.
  • transposable element is at least present in the genus Dianthus.
  • This transposable element is not limited to the genus Dianthus found in the present invention as long as it has the activity of a transferase and causes the above-mentioned transposition, and mutations such as flower color in a wide range of plants are included. Explain the phenomenon.
  • Examples of such plants include plants of the genus Dianthus, including the genus Dianthus, including the genus Dianthus, Rosaceae, Osylophila, Asteraceae, Convolvulaceae, Pseudomonaceae, and Solanaceae. May be found in a wide range of monocot and dicot plants, without limitation; ⁇
  • the design of the primers used for detecting the presence or absence of a transposable element is performed based on the base sequence of the transposable element, in which at least 8 consecutive nucleotides, preferably 16 or more nucleotides, more preferably 20 or more nucleotides, and still more preferably 20 to 30 nucleotides This can be done by arbitrarily selecting two parts.
  • the primer sequences used in the following examples are GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG (21 bases: SEQ ID NO: 16) and CGCAAATACACTAAATTTATGCC (21 bases: SEQ ID NO: 17), but other primers may be used.
  • the distance between the selected positions of the two primers can be preferably from 100 to 100 bases, more preferably from 300 to 600 bases.
  • Such primers need only amplify the target DNA fragment between the primers, and can be arbitrarily selected and used by using analysis software such as GENETYX-WIN VERSION 4.0. it can.
  • Such primers can be used in the present detection by a gene amplification method such as PCR as long as several types, preferably one type of amplification product can be obtained.
  • Examples of such a gene amplification method include the PCR method, but are not limited to the PCR method, and any amplification method using a specific primer can be used. The width can be easily determined by those skilled in the art with reference to PCR Method Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1990).
  • an adapter sequence can be added in addition to a specific portion designed from SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 22 (see Examples).
  • Examples of the PCR method to which such an adapter sequence is added include the PCR-AFLP method and the PCR-VECTORETTE method.However, the PCR-SSR method, which focuses on the number of CT repetitions, and the nucleotide sequence are not limited thereto.
  • PCR-SSCP method which focuses on differences in higher-order structure depending on the DNA
  • PCR-DGGE method which focuses on differences in the melting temperature of double-stranded DNA
  • the probe used to detect the presence or absence of a transposable element includes a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 22 or at least a continuous 100 bases or a complementary sequence thereof among the above bases (1) to (5). Can be used.
  • the probe can be labeled with a commonly used means, for example, a radiolabel (Amersham Megaprime method), a DIG label (Roche method compliant), or the like.
  • the removal of the transposable element can be confirmed as follows. For example, using the transposable element obtained by the present invention as a probe, Mutation by detecting the difference between the mutant and the individual from which the mutant is derived, by hybridization or by preparing primers based on the base sequence of the transposable element and performing inverse PCR. A part (fragment) of a gene (a gene into which a transposable element is inserted) can be isolated.
  • the entire mutant gene can be easily isolated.
  • the primer used to detect the presence or absence of transposable element if the present transposable element is inserted into the nucleotide sequence encoding the flower-color-expressing enzyme, the nucleotide sequence of the transposable element and the nucleotide encoding the flower-color-expressing enzyme From the sequence (here, the genomic nucleotide sequence of the flavonoid 3′-hydroxylase gene), each of the consecutive 8 or more bases, preferably 16 or more bases, more preferably 20 or more bases, and even more preferably 20 to 30 bases This can be done by arbitrarily selecting two parts.
  • the primer sequence used in the following examples is SEQ ID NO: 1.
  • primers need only amplify the target DNA fragment between the primers.
  • the primers can be arbitrarily selected and used by using an analysis software such as GENETYX-WIN VERSION 4.0. Can be.
  • Such primers can be used for the present detection by a gene amplification method such as PCR as long as several types, preferably one type of amplification product can be obtained.
  • a gene amplification method such as PCR as long as several types, preferably one type of amplification product can be obtained.
  • Examples of such a gene amplification method include a PCR method.However, the method is not limited to the PCR method, and any amplification method using a specific primer can be used.
  • the PCR method can be easily performed by those skilled in the art with reference to Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1990).
  • a DNA comprising a base sequence of any of the following (a) to (d), (f), and (g) or a degenerate isomer of (e):
  • a primer containing at least 8 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 22 and at least of the surrounding nucleotide sequence into which the present transposable element is inserted A transposable element having the base sequence of SEQ ID NO: 1 at the 5 'end and the base sequence of SEQ ID NO: 2 at the 3' end by the gene amplification method using a A method for detecting the presence or absence of the transposable element having the DNA described in [A] or the transposable element described in [B] is also included.
  • a primer is used at any position where at least 8 bases are continuous in the base sequence of SEQ ID NO: 4 and any position where at least 8 bases are continuous in the base sequence of SEQ ID NO: 19 Has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 at the 5 ′ end and the transfer factor having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 at the 3 ′ end or the DNA according to [A] above.
  • a method for detecting the presence or absence of a transposable element or the transposable element described in [B] is also included.
  • mutants can be identified by investigating differences from the original individual using techniques such as Southern hybridization, inverse PCR or transposon display. It can be easily detected.
  • mutation detection was performed using inverse PCR.
  • the restriction enzyme used here was Hindlll or Spel, and the primer was CGAATACCGTGCTTTGGACG (20 bases: SEQ ID NO: 18) and CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23 bases: SEQ ID NO: 17), but other than these may be used.
  • the restriction enzyme has no breakpoint between the 3 'end of one primer and the 5' end of the other primer and the 3 'end of the other primer, and transfers from the 3' end of one of the primers Any enzyme that does not have a breakpoint up to the 3 'end of the factor can be used for this detection.
  • the primer used for this detection should be a sequence consisting of at least 8 consecutive nucleotides, preferably at least 16 nucleotides, more preferably at least 20 nucleotides, more preferably at least 20 to 30 nucleotides in the nucleotide sequence of the present transposable element. It is possible by arbitrarily selecting the direction.
  • Such a primer may be any one that amplifies the target DNA fragment between the primers.
  • the primer may be arbitrarily selected and used by using analysis software such as Oligo 4.0. Can be.
  • transposable elements It is known that callus culture, ultraviolet irradiation, and radiation irradiation are used as environmental conditions that induce transposition of transposable elements (Plant Cell 1998; 10: 427-34). Temperature conditions such as low temperature (MGG 1987; 207: 82-89) and high temperature (JP-A-2003-93074) have also been reported as factors promoting the transfer. Thus, it has been clarified that metastasis is activated by various environmental or artificial factors. Exposure of plants to these conditions can promote transposition (mutagenesis) of transposable elements.
  • the transposable element having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 22 obtained by the present invention can actually be transposed. It was also revealed at the DNA level that the translocation of each induces bud mutation.
  • the transposable element inserted into the 97SPi flavonoid 3 ′ hydroxylase of 97SPi obtained according to the present invention is not limited, but at least, the transposable element is markedly transfected under low-temperature conditions, short-day conditions, or both conditions. Is promoted. In this way, it is possible to efficiently obtain shoot mutants with the promotion.
  • callus culture was performed using ultraviolet irradiation, irradiation, or pathogen infection (Plant Cell 1998; 10: 427-34) or high temperatures (Japanese 2003-93074) are also candidates for the conditions that promote the transposition of the transposable element of the present invention.
  • transposable elements involve the demethylation of transposable elements (plant growth regulation 2001; 36: 178-180). It is thought that transposition of transposable elements can be promoted by treating the expression of DNA methylase gene with a chemical substance such as 5-azacitidine to promote demethylation. In order to easily detect such transposable element activating (movable) conditions, it is also effective to investigate the transferase activity of plants under various conditions.
  • the shoot mutation can be efficiently carried out. Can be introduced.
  • the transfer amount of the transferase can be estimated by grasping it by Northern hybridization and return PCR, and it is possible to easily identify the factors that promote the transfer and determine the conditions for obtaining the shoot mutation. It is possible.
  • use of DNA polymorphism detection methods such as RFLP, AFLP, and CAPS using a methylation-sensitive restriction enzyme and a methylation-insensitive restriction enzyme (Nature (2001) 411: 212-214), or using a methylcytosine residue Easy conversion of transposable elements by chemically converting cytosine residues to peracyl without affecting the group and decoding the nucleotide sequence (Nucleic Acids Res (1994) 22: 2990-2997) The degree can be tested. Such evaluation can be easily performed by those skilled in the art.
  • transposable activity of the transposable elements By monitoring the amount of transcription of the transposases of these transposable elements and evaluating the degree of methylation of the transposable elements, it is possible to evaluate the transposable activity of the transposable elements, and to obtain conditions for facilitating transposition. be able to.
  • a host is transformed with the DNA according to claim 1 (the DNA: a gene is expressed) to produce a transformant, whereby a transferase is expressed and an autonomous factor or a non-autonomous factor is expressed.
  • a method for producing a shoot mutant by promoting the transposition of a transposable element that is, a method for inducing a shoot mutation is also included. Such a method will be described below in (2) to (4).
  • the power-reflection mosaic winnowless 35S promoter is exemplified, but the promoter is not limited to this as long as it functions in plants.
  • transfection can be promoted only under inducing conditions by binding to an inducible promoter and introducing it into a plant using a gene transfer technique.
  • transfer can be promoted by transiently expressing a gene encoding a transferase without genetic modification.
  • the inductive motor for example, a heat shock-inducing motor (Appl Microbiol Biotechnol. 1995 44: 466-472) can be used.
  • the promoter is not limited to the above promoter as long as it is inducible and functions in a plant cell or plant.
  • the above-mentioned promoter can be obtained by an amplification reaction by PCR using genomic DNA as a ⁇ type using primers designed based on the nucleotide sequence of DNA containing the promoter.
  • the promoter region of the heat shock protein gene (Mol Gen Genet (1989) 219: 365-372) (translation initiation of the heat shock protein gene)
  • the region of -678 from the point) can be obtained by carrying out the polymerase chain reaction (PCR) and amplifying it.
  • the type I DNA that can be used for PCR includes, for example, genomic DNA of Arabidopsis thaliana, but is not limited thereto.
  • mutant promoters can be used as long as the promoter has one activity, as in the case of the transposable element gene.
  • Such mutants can be prepared by those skilled in the art without particular difficulty by referring to the base sequences described in the literature relating to the above-mentioned various promoters in the same manner as in the description of the transposable element genes described above.
  • Whether the mutant obtained as described above has activity as a promoter Whether or not the DNA containing the promoter or the portion thereof substantially retains the promoter activity can be determined by connecting the transposable element gene and expressing it in the host cell. It can be confirmed by a method or by analysis of biological components such as visual observation and flower color analysis, and such a method can be easily performed by those skilled in the art.
  • a terminator that directs the termination of transcription can be linked downstream of the gene encoding the transferase.
  • terminator examples include terminators of 35S gene, nos gene and ocs gene (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44 (1993) 985-994, "Plant genetic a laboratory manual "), any terminator that is known to function in a plant cell or a plant body is not limited to these.
  • an intron sequence between the promoter sequence and the transposable element gene, which enhances gene expression for example, the introduction of alcohol dehydrogenase (Adhl) from corn. [Genes & Development 1: 1183-1200 (1987)] can be introduced.
  • DNA can further include components such as translation enhancers, translation termination codons, and the like.
  • translation enhancers and translation termination codons can be used in appropriate combination.
  • Examples of translation enhancers of viral origin include the sequences of tobacco mosaic virus, Alfalpha mosaic virus RNA 4, bromo mosaic vinoles RNA 3, potato vinoles X, tobacco etiwinores, etc. (Gallie et al., Nuc. Acids Res., 15 (1987) 8693-8711).
  • the above-mentioned DNA can be easily produced by those skilled in the art by using a technique commonly used in the field of genetic engineering. Further, the DNA of the present invention is not limited to one isolated from a natural source, and may be an artificial construct as long as it has the above structure.
  • the DNA can be obtained by synthesizing according to a well-known and commonly used method of nucleic acid synthesis.
  • a protein having an enzymatic activity as a transposable element By transforming a host with the above transposable element gene and cultivating or cultivating the resulting transformant, a protein having an enzymatic activity as a transposable element can be expressed. Mutants in which the activity of a gene encoding any enzyme is suppressed can be produced.
  • the transformed chains of the invention can be present in microorganisms (especially bacteria), phage particles or plants, inserted into plasmids, phages or genomic DNA.
  • microorganisms especially bacteria
  • phage particles or plants inserted into plasmids, phages or genomic DNA.
  • typical examples of the bacterium include Escherichia coli and Agrobacterium, but are not limited thereto.
  • the DNA of the present invention comprises a DNA, a translation enhancer, and a translation gene so that a structural gene for expressing a protein can be stably expressed in a plant cell or a plant.
  • a stop codon, and a terminator and the like bind to the body and are present in the plant in a form inserted into the genome.
  • Preferred examples of the host include monocotyledonous plants such as rice, wheat, corn, leek, lily, orchid, and dicotyledonous plants such as soybean, rapeseed, tomato, potato, chrysanthemum, rose, carnesion, petunia, kasumiso, and cyclamen.
  • Plant cells can be cited, and particularly preferred examples are the three major cut flowers, chrysanthemum, carnation and rose, which have high production and distribution consumption worldwide. Plant cells such as petunia.
  • Typical plant materials include, for example, growing point, shoot primordia, meristem, leaf pieces, stem pieces, root pieces, tuber pieces, petiole pieces, protoplasts, callus, anthers, pollen, pollen tubes, flower pieces, Flower stem pieces, petals, sepals and the like.
  • a biological method including a method using a virus, a plasmid of Ti plasmid, Ri plasmid, or the like as a vector, and a physical method including EL method.
  • a biological method including a method using a virus, a plasmid of Ti plasmid, Ri plasmid, or the like as a vector
  • a physical method including EL method.
  • the introduced gene is c such operations capable of producing a transformed plant expressing in the cells, plants from plant cells
  • a method for regenerating the body Regeneration from plant cells into plants can be easily performed by those skilled in the art by referring to literatures such as “Plant Cell Culture Manual, edited by Yasuyuki Yamada, Kodansha Scientific, 1984”. it can.
  • a gene introduced into a plant is integrated into the genome of the host plant, in which case a phenomenon called a position effect in which the expression of the transgene differs due to a difference in the location on the genome to be introduced. Can be seen.
  • a transformant in which the transgene is more strongly expressed can be selected by assaying the level of mRNA expressed in the host plant by the Northern method using a DNA fragment of the transgene as a probe.
  • DNA is extracted from these cells and tissues according to a conventional method, and a known PCR method or Southern hybridization is used. To detect introduced genes using It can be done by doing. Also, expression in transgenic plants is
  • the transposase encoded by the transposable element of the present invention is ligated to a promoter that functions in plants, and by transiently expressing the same, promotes transposable elements within a limited time to induce mutation. It is possible.
  • a transient expression a system using a virus such as PVX (Plant Cell (1995) 7: 249-257) is known, which is based on a bacterium (Plant J (2003) 33: 949-956.). However, it is not limited to these.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 22 a nucleotide sequence that hybridizes with SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 22 under stringent conditions, and the DNA of claim 5 as a host And to induce bud mutants by promoting transfer by supplying transferase.
  • introduction of DNA into a host can be easily performed by those skilled in the art.
  • the introduced DNA can be transferred by crossing with an individual having the DNA described in claim 1 (including the above-mentioned transformant) or by supplying a transferase by the above-mentioned technique such as transformation. It becomes possible. In this way, it is possible to induce a sudden mutation in shoots.
  • the present invention also includes a method for stabilizing a shoot bud mutant obtained by transposition of a transposable element, including the above transformant. Such a method will be described below.
  • reverted cells may be obtained by the removal of the transposable element from the gene at a higher frequency than the rate of spontaneous mutation, and this is called mutagenesis. 79 1992 Agriculture and horticulture, Seibundo Shinkosha). Mutability is a factor that reduces the stability of the quality of agricultural products. It is known that when a transposable element is eliminated, several DNA bases of the transposable element are randomly left in the existing gene. One in which the function of the gene is disrupted is obtained. In other words, it is possible to obtain a stable mutant by promoting the transposition of a transposable element and selecting one that has been eliminated from the gene. it can.
  • PCR is performed on individuals in which the transposable elements are eliminated from the mutant gene, using a part of the transposable element and a part of the mutant gene as primers.
  • screening can be performed by the method described above for detection of bud mutations. Screening can also be performed by performing Southern hybridization using a transposable element, a mutated gene, or a transposable element and a mutated gene as a probe.
  • the stabilization of bud mutation was confirmed, for example, by amplifying the region including the region by gene amplification and determining the base sequence directly. can do.
  • RNAi transferase
  • the present invention also includes a method for isolating a shoot mutant using the above transformant. Such a method will be described below.
  • the mutant and its individual By detecting the difference, a part of the mutant gene can be isolated. Using the DNA fragment thus obtained, the entire mutant gene can be easily isolated. In such a situation, the transposable element of the present invention can be used as a tool for gene isolation not only in the progeny but also in the present generation due to the characteristic of causing bud mutation.
  • mutant in which the expression of a certain gene is suppressed can be prepared by, for example, transposing a transposable element having a transposable element under low-temperature conditions or short-day conditions or both conditions to induce mutation. Then, it is possible to easily detect (select) those in which the transposable element is inserted into the target gene by PCR.
  • transposable elements of the present invention By performing Southern hybridization or PCR based on the gene of interest and the DNA of the transposable element from the mutant population induced by the transposable element, individuals with the transposable element inserted into the target gene can be selected. Easy. It should be noted that among the transposable elements of the present invention, those having a transposase inside can transfer themselves (autonomy). Generally, transposable elements are transposable even if the internal sequence is removed. It is known that metastasis occurs with the supply of [Plant Physiology 132: 1207-1216 (2003)]. For example, in the present document, even if 2260 bases at the TthHB81 site are deleted from the Bal site, transfer can be performed by supplying a transferase.
  • transposable element having no transferase activity By partially removing the inside of the transposable element, a transposable element having no transferase activity can be obtained.Since the obtained transposable element has no transferase, it can be transferred by itself. It is possible to transfer with the supply of a transferase.
  • a transposable element having no transferase therein obtained by the present invention is a transposable element which can be transferred under the supply of a naturally occurring transferase. It is known that such a transposable element that can be transferred under the supply of a transferase exists in nature, and is called a non-autonomous element [protein nucleic acid enzyme 37: 1047-1059 (1992)]. Whether a transposable element is autonomous or non-autonomous can be inferred by whether or not it has a transposable gene that can be expressed.
  • the above-described mutation is introduced by removing (deleting) all or a part of the nucleotide sequence encoding the transferase, or introducing a mutation such as substitution, insertion or addition (at both ends) of the nucleotide. It is easy for those skilled in the art to create such a transposable element in which a transferase does not work. Further, those skilled in the art can easily obtain those having homology with the transposable element of the present invention by Southern hybridization and PCR using the whole or a part of the DNA sequence of the transposable element of the present invention as a probe. It is possible.
  • transposable elements having homology to the transposable element of the present invention but which cannot transpose by themselves can be obtained by those skilled in the art. If so, it can be easily obtained. Since these can be transferred by the transferase of the present invention, a transposable element having no such transferase activity is used to detect shoot mutations and induce shoot mutations as described above. Mutation by promoting transposition of transposable elements, stabilization of shoot mutations, identification of transgene-induced mutations in shoot mutations, mutants in which transgene-induced gene expression is suppressed Can be used for selection.
  • the carnation lines 95SP, 97SPi, 97SE, 99SP5 and 99SP4 used in the following examples are stored in the Plant Development Laboratory of Kirin Brewery Co., Ltd., and can be ordered as experimental materials. .
  • Contact information ⁇ 3 2 9-1 4 1 4 337, Saotome-ji, Satsuki, Kisuregawa-cho, Shioya-gun, Tochigi, Japan (Phone; Country code: 8 1—2 8— 6 8 6—0 5 0 1 , Facsimile; country code 8 1—2 8—6 8 6—0 5 0 2).
  • 99SP5 and 99SP4 were obtained by the following methods and used as materials. According to a standard method, 1,000 indigo plants of 95SP with a plant height of about 5 cm and irradiated with X-ray 4KR were acclimated to a greenhouse, and the axillary buds were collected and raised, and then the axillary buds of the rooted individuals were collected and raised several times. Two individuals (99SP5, 99SP4) were obtained as ones with colored flowers (individuals having the same flower color as 97SPi).
  • Primers AAGCATATTGCNTAYAAYTAYCANGA (26 bases: SEQ ID NO: 5) and CCATCTCTTGCDATNGCCCANAYRTT (26 bases: SEQ ID NO: 6) were prepared with reference to the cDNA sequence of the F3'H gene described in GenBank AX028819. Using these primers, PCR (conditions: 95 ° C for 5 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 35 ° C for 35 minutes) was performed on the total cDNA fraction obtained from the petals of the carnation line 95SP in vitro using these primers. 30 seconds, ⁇ 2 ° C for 1 minute) 30 times, 72 ° C for 10 minutes).
  • the obtained amplification product of about 1.6 kb was subjected to TA cloning (PCR experiment No. edited by Taketoshi Tanilo, Yodosha (1997)) using pGEMT vector (manufactured by Puguchi Mega), and ABI310 (Applied Biotechnology). (Manufactured by Systems Inc.).
  • the nucleotide sequence obtained here was divided into two at the cleavage point of the restriction enzyme Ndel to obtain two types of nucleotide sequences.
  • PCR was performed on genomic DNA of carnation line 97SPi (conditions: 95 ° C for 5 minutes, (95 ° C3 0 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes) were performed 30 times, 72 ° C for 3 minutes.
  • the approximately 1.9 kb amplified product and the approximately 2.9 kb amplified product obtained in the same manner using the primers AATGTCACCCTTAGAGGTAACTTTCTA (27 bases: SEQ ID NO: 11) and TAGCAAGGCCTTAATTTCTGTG (22 bases: SEQ ID NO: 12) were combined with a pGEM T vector (prome TA Kurojung (PCR Experiment Note, edited by Taketoshi Taniro, Yodosha (1997)) using ABI310 (Applied Biosystems), and the nucleotide sequence was determined using ABI310 (Applied Biosystems).
  • Example 4 (1) cDNA sequence, Example 4 (2) Two kinds of DNA sequences obtained from about 1.6 kb DNA fragment by inverse PCR, Example 4 (2) About 1.9 kb DNA fragment by PCR
  • DNA sequence and Example 4 DNA sequence of approximately 2.9 kb DNA fragment by PCR, total 5 types 5743 bases of the genomic DNA base sequence of the carnation! ⁇ 'H gene were determined by combining the base sequences of SEQ ID NO: 1 and removing the overlapping portion (SEQ ID NO: 19). Also, it is expected that two F3'H genes are present as alleles in 97SPi, but in 97SPi, G is inserted after the 2527th base A of SEQ ID NO: 19 to cause a frame shift. It was clear that this was happening.
  • Inverse PCR was performed according to the Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 2 Plant PCR Experiment Protocol (1995) 69-72. Genomic DNA was prepared from the kernel lines 95SP and 97SPi by the method described in Example 2 and digested with the restriction enzyme Hindlll. Using these degradation products as materials, primers CACACGATTCGTTTGCGACC (20 bases: SEQ ID NO: 13) and TAAACGGGTACCACATTCCCA (21 bases: SEQ ID NO: 7) prepared based on the DNA sequence of 848 bases obtained in Example 4 (1) were used. Inverse PCR (conditions: 95 ° C for 2 minutes, (95 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes) 30 times, 72 ° C
  • a carnation strain using GAGACTCATAGTGGTTATATACA 23 bases: SEQ ID NO: 14
  • the primer TAACAACACGTAACCGAAAATATA 24 bases: SEQ ID NO: 15
  • DNA base sequence (SEQ ID NO: 4) of the transposable element of the present invention was obtained.
  • the open reading frame (0RF) was 2442 bases from the base A at the 106th base to the T at the 3497 base.
  • the primer makes it possible to amplify from the inside of the transposable element of the present invention to the portion of the flavonoid 3 ′ hydroxylase using PCR.
  • PCR using these two types of primers with 95SP, 97SPi DNA and flower petal DNA partially reverted to purple flower from 97SPi individuals using these two primers (Condition: 95 ° C for 2 minutes, (95 ° C C 30 seconds, 56.
  • nucleotide sequence related to the expression of flower color of 97SPi revealed in Example 4 was inserted after the nucleotide A at position 2527 in SEQ ID NO: 19)
  • transposable element of the present invention and the base sequences of both sides following the base sequence (SEQ ID NO: 4) of the present transposable element, It was evident that both sides of the transposable element overlapped the eight bases AGTTAATT from the 3901st to the 3908th in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
  • AGATCTAGAGCTGGCAAAAAAACGGGC 27 bases: SEQ ID NO: 24
  • PCR of 97SPi genomic DNA with two primers (Conditions: 95 ° C for 2 minutes, (95 ° C for 30 seconds, 56 ° C) C
  • Inverse PCR is a cell engineering separate volume. Plant cell engineering series 2.
  • genomic DNA of 95SP and 97SE was subjected to PCR (conditions: 95 ° C for 2 minutes, (95 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds). Sec, 72 ° C
  • the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 22 is identical to the 8th base (GTTATATG) from the 114th C to the 121st C in the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 Existed while overlapping in the direction. That is, the 8-base portion was GTTATATG ⁇ GTTATATG, and the sequence of SEQ ID NO: 22 was inserted at ' ⁇ '. This clearly indicates that the non-autonomous factor shown in SEQ ID NO: 22 is mobile and translocated at or after the time when 97SE was mutated from 95SP.
  • the method of evaluating transposition by inverse PCR shown here is one of the effective methods for detecting mutation together with the example of the method for detecting mutation described in Example 8.
  • CDNA was prepared from carnation lines 95SP and 97SPi by the method described in Example 3, and PCR was performed using primers CACTATGGATCCTAATTCTCAAA (23 bases: SEQ ID NO: 20) and GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23 bases: SEQ ID NO: 14) (conditions: 9 The test was performed 30 times at 5 ° C for 2 minutes (95 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes) at 72 ° C for 3 minutes.
  • primers TTCTTCACTTGAATTCGAACAAG 23 bases: SEQ ID NO: 21
  • PCR was similarly performed using CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23 bases: SEQ ID NO: 17).
  • the obtained amplification product was separated by electrophoresis at 100 V for 20 minutes using a 1% agarose gel, and visualized by ethidium bromide staining.
  • amplifications of the expected sizes (about 1.9 kb and about 1.1 kb, respectively) were detected (FIG. 5).
  • PCR condition: 95 ° C was performed using two primers, GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG (21 bases: SEQ ID NO: 16) and CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23 bases: SEQ ID NO: 17). 30 minutes (95 ° C 30 seconds, 56 ° C 30 seconds, 7.2 ° C 30 seconds) and 72 ° C 3 minutes were performed for 2 minutes.
  • the amplification products were separated by electrophoresis at 100 V for 20 minutes on a 1% agarose gel, and visualized by ethidium promide staining.
  • Example 5 The inverse PCR described in Example 5 was carried out in accordance with the protocol for PCR experiments on plants (Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 2) (1995) 69-72. Carnation system
  • the elimination of the transposable element to be inserted into the 97SPi flavonoid 3 'hydroxylase of 97SPi obtained by the present invention can be detected as a phenotype when the flower color changes from pink to purple.
  • 97SPi planted seedlings approximately 5 cm long
  • purple spots appear at the time of flowering.
  • the presence or absence was tested. The first was a glass greenhouse with a daytime temperature of 25-33 ° C and a nighttime temperature of 23-30 ° C. Natural daylength (13-12 hours).
  • the second condition was to adjust the day temperature to 20 degrees, the night temperature to 10 degrees, and the eight-hour daylength using an artificial meteorological device, Cotron (made by Koito Seisakusho).
  • Cotron made by Koito Seisakusho
  • purple spots were observed in three of the 45 flowers that bloomed under the first condition (6.7%), while 35 out of 51 flowers that bloomed under the second condition. Purple spots (68.6%). From this, it is clear that low-temperature or short-day or low-temperature and short-day conditions promote the elimination of transposable elements to be inserted into the 97SPi flavonoid 3 'hydroxylase.
  • the transferase expression level of the bud streak transposable element found for the first time in the present invention was Efficiently identify environmental conditions that cause bud mutations or perform bud mutations by detecting them by turn PCR and assessing the degree of methylation of this transposable element. Individuals can be selected.
  • the use of the transferase gene of the transposable element genetically enables the efficient production of shoot mutants. It provides an ideal mutation method that solves the problems of the conventional methods, which are frequently performed, and enables efficient breeding of fruit trees and flowers where mutation breeding is important. Furthermore, if the cause of an individual showing susceptibility to agriculture is a transposable factor, stabilization can be achieved by promoting the transposition of the transposable element. In addition, it is possible to stably produce agriculture by avoiding the environmental conditions that cause translocation or by suppressing the expression of the transferase gene by genetic engineering. From the obtained shoot mutants, it is possible to easily identify and isolate the causative gene of the mutation.

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Abstract

芽条突然変異を誘発する新規植物転移因子およびその転移酵素とその転移効率の向上による効率的な芽条突然変異誘発方法を提供する。　下記の塩基配列を有する末端逆位反復配列（配列番号１および配列番号２）を有する新規転移因子をカーネーション(Dianthuscaryophyllus)より初めて単離し、塩基配列を決定した。この転移因子は、その配列中にその転移酵素をコードする遺伝子を含んでいた。この転移因子は遺伝子に挿入することにより芽条突然変異を誘発し、環境ストレスにより転移頻度が上昇する。TAGAGCTGGCAAA-----------TTTGCCAGCTCTA

Description

明 細 書 突然変異の検出法と誘発法
技術分野
本発明は、 植物の芽条突然変異を誘発する新規の転移因子、 転移酵素および転 移酵素をコードする塩基配列を用いた突然変異の検出方法、 誘発方法、 安定化方 法や突然変異遺伝子の同定方法および遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜に 関する。 背景技術
突然変異は作物の品種改良や分子遺伝学的研究に重要であり、 自然に発生する 芽条突然変異や人為的な突然変異が利用される。 本発明でいう芽条突然変異とは 植物体の一部に体細胞の遺伝子レベルでの突然変異が生じることを指し、 芽条突 然変異体とは該突然変異体のことを指す。 栄養繁殖作物である花きや果樹などの 作物では、 交雑を経ない芽条突然変異は品種育成に重要な遺伝変異を提供する。 しかし、 芽条突然変異による変異の分子的なメカニズムについては、 その原因は 不明であり自然発生に任せている。 また、 自然突然変異は 1 0 0万分の 1程度の 確率でしか起こらないとされており、 この効率をあげるために突然変異を誘発さ せる手法として放射線照射や変異原性をもつ化学物質などが利用されるが、 変異 出現率を増加させようとすると望ましい変異の他にも変異が入ってしまい目的の 形質に加えて劣悪な形質を伴う場合が多く、 非常に多くの個体からなる変異集団 の中から目的のものを探す必要があり効率が低い。
転移因子 （トランスポゾンともいう） は原核生物から真核生物にいたる生物種 に広く見出される、 ゲノム上を転移する可動性遺伝因子である。 植物ではシロイ ヌナズナ、 ハクサイなどで見出されており [特開 2 0 0 3— 9 3 0 7 4号公報]、 またトウモロコシ（ mays)の穀粒やキンギョ ソゥ (Ant irrhinum ma jus)の花弁
[蛋白質 核酸 酵素 37 1047-1059 (1992) ]、 アサガオ（Pharbi t i s ni l)の花弁
[ Proc. Natl . Acad. Sc i . USA 97： 7016-7023 (2000) ]、 ペチュニア（Petunia hybri da)の花弁 [The Plant Journal 13： 39-50 (1998) ]、 およびカーネーショ ン (Dianthus caryophyl lus)の花弁におけるアントシァニン色素生合成系遺伝子の 発現を制御する転移因子がよく知られている。
例えば白色花弁に赤い斑の入るカーネーション品種では、 アントシァニン色素 生合成酵素のひとつであるジヒ ドロフラボノール一 4—リダクターゼ（以下、 DFR という）遺伝子内に転移因子が挿入している。 DFR遺伝子は赤色色素合成に必要で あるが、 転移因子が挿入していると DFR遺伝子が機能しないため花色は白色とな る。 ところが、 花弁形成時に挿入している転移因子が脱離することにより DFR遺 伝子の機能が回復し、 赤い斑の入った模様ができることが解明された [Plant Cel l Phys iology. 43： 578-585 (2002) ]。 このように個体内の一部の細胞におい て転移因子が脱離しセクタ一状の変異を有する事例において、 トウモロコシ、 キ ンギヨソゥ、 アサガオ、 ペチュニアなどでは転移因子の関与が分子遺伝学的に解 明されている。
また、 転移因子による変異は生殖細胞を経て後代へ伝達されることも明らかと なっている。 この場合転移因子は生殖細胞の形成期に転移したものであり、 後代 に転移因子による突然変異体が得られる。 この事象を利用して、 既知の転移因子 を遺伝子導入などによりに導入し、 その後代で得られた変異体を、 導入した転移 因子を指標に解析することにより遺伝子を単離する手法が開発されトランスポゾ ンタギングと呼ばれている [The Plant Journal 7 : 677-685 (1995) ]。
このように転移因子を変異原とする試みが行われるようになったが、 現在の手 法は芽条での転移因子の遺伝子への挿入による変異を得るにいたつておらず、 も つばら交配あるいは交雑を経由した変異体の取得にとどまっている。 このように 転移因子が個体を構成する一部の細胞で転移する事例は知られており、 レトロ ト ランスポゾンによる芽条突然変異の例も報告されている [Sc i ence 304： 982
(2004) ]。 しかしながら、芽条突然変異のような栄養繁殖による変異の固定が可能 な突然変異がレトロ トランスポゾン以外の転移因子により引き起こされている例 は報告がない。
特許文献 1特開 2 0 0 3— 9 3 0 7 4号公報
非特許文献 1 蛋白質 核酸 酵素 37 1047-1059 (1992) 非特許文献 2 Proc. Natl . Acad. Sc i. USA 97： 7016-7023 (2000) 非特許文献 3 The Plant Journal 13： 39-50 (1998)
非特許文献 4 Plant Cel l Physiology. 43： 578-585 (2002)
非特許文献 5 The Plant Journal 7 : 677-685 (1995)
非特許文献 6 Sc i ence 304： 982 (2004) 発明の開示
従来、 発生頻度の非常に低い自然突然変異と、 目的とする変異に加え目的とし ない変異が伴ってしまう放射線や化学物質による人為的な突然変異を利用し芽条 突然変異体が得られていた。 このような技術下では多数の個体を扱い、 その中か ら目的とする変異体を選抜する必要があり、 効率が非常に低かった。 また、 従来 の方法により得られた突然変異体は変異した遺伝子を特定するために多くの労力 を必要とする。 これらの課題を解決するために、 本発明は芽条突然変異を誘発す る植物の新規転移因子を提供すること、 新規転移因子の有無や脱離の有無を検出 する方法を提供すること、 この新規転移因子を変異原として利用して芽条突然変 異を誘発する手法を提供することを目的とする。
芽条突然変異を誘発する転移因子を突然変異原として利用しこの転移を人為的 に促すことにより、 1細胞あたりの変異する遺伝子が少数であるが効率高く芽条 突然変異体が得られる理想的な突然変異方法となる。 また、 前述のとおり原因遺 伝子に転移因子という指標が存在することになり、 原因遺伝子の単離が容易にな る。
前記の課題を解決するために発明者は研究を重ね、 紫花色を示すカーネーショ ン系統 95SP (ミセスパープル、 日本国での種苗法に基づく品種登録番号 7 2 9 1 号、 キリ ンビール社）、その芽条突然変異体であるピンク花色を示すカーネーショ ン系統 97SPi (ミセスピンクロサリオ、 日本国での種苗法に基づく品種登録番号
8 9 7 6号、 キリンビール社）、 濃赤花色を示す 97SE (ミセスエレガント、 日本 国での種苗法に基づく品種登録番号 9 2 4 7号、 キリンビール社）、 カーネ一ショ ン品種カリー （バルブレ&ブラン社）、 Dianthus chinens i s, Dianthus barbatus , ピンク花色を示すカーネーション系統 99SP4、 およびピンク花色を示すカーネー ション系統 99SP5を用い以下の知見を見出した。
すなわち、 カーネーション系統 97SPiのアントシァニン生合成に関与する酵素 であるフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素をコードするゲノミック遺伝子にはカーネー ション系統 95SPにはない DNAが挿入していた。挿入している塩基配列は転移因子 が有する典型的な特徴を備えていた。 すなわち、 両端に配列番号 1および配列番 号 2に示す 13 塩基の逆位反復配列を有し、 該配列が挿入した位置の両側には 8 塩基の同一方向の同一塩基配列が存在していた。 また、 逆位反復配列はトウモロ コシの転移因子である ACのそれに類似しているが （図 1 )、 内部の約 4kbにわた る塩基配列には類似性は認められなかった。 該塩基配列にはオープンリーディン グフレームが存在し、 この塩基配列をアミノ酸に変換した配列は、 キンギヨソゥ 由来の転移因子およびトゥモロコシ由来の転移因子にそれぞれコードされる転移 酵素のァミノ酸配列と相同性を示した（図 2)。この転移酵素の発現をリターン PCR (以下リターン PCRとレ、う） により検出することが可能である。
さらに 97SPiから先祖返りをおこした紫花色を示す個体の花弁では挿入してい た塩基配列が脱離しており、 97SPi が生成した後もこの塩基配列が転移する能力 を有していることが明らかである。
また、 97SPiから両端に配列番号 1および配列番号 2に示す 13塩基の逆位反復 配列を有するが、 内部に転移酵素遺伝子をもたない非自律性転移因子と考えられ る DNA塩基配列を得た。この DNA配列は 95SPおよび 95SPの突然変異体である 97SE にも存在し、 97SEでは 95SPにはない新たなゲノム部位に挿入しており、 該配列 が挿入した位置の両側には 8塩基の同一方向の同一塩基配列が存在していた。 97SEでは 95SP とは異なるゲノム部位に揷入していることから該配列は可動であ ることが確認された。
本発明は、 ゲノム上を転移し芽条突然変異を誘発する転移因子を初めて単離、 同定したものである。 また、 ダイアンサス属の染色体 DNAに由来する転移因子で ある本発明の転移因子のうち転移酵素をコードしているものは、 本酵素の発現を 制御することにより転移を制御することを可能とする。 また、 本発明の転移因子 のうち転移酵素をコードしていないものについても、 転移酵素をコードする転移 因子の転移酵素の発現を制御することにより転移を制御することを可能とすると 予想される。
本発明の転移因子は、 芽条突然変異を誘発する性質を有する。 したがって転移 を促す温度等の特定の環境条件を与えること、 あるいは転移酵素を人為的に発現 することにより、 効率よく芽条突然変異を誘発することが可能となるという有用 性がある。 芽条突然変異体は本発明により明らかとなった転移因子の塩基配列情 報を利用して容易に検出することが可能となる。
また、 本転移因子により誘発された突然変異を解析することにより容易に原因 となる遺伝子を単離することが可能となる。
さらに、 転移因子の遺伝子への挿入により、 アンチセンスといった遺伝子組換 え技術を用いることなく遺伝子の発現が抑制された変異体を得ることができる力 遺伝子が破壊された芽条を得ることが重要な遺伝的にヘテロな個体や生殖および 種子形成に関与する遺伝子の場合、 転移因子による芽条突然変異が有用である。 本転移因子により誘発された突然変異の中から目的とする遺伝子破壊個体を容易 にスクリーニングすることが可能であり、 遺伝子組み換えを行うことなしに、 遺 伝子の発現の抑制が可能となる。
また、逆に温度等の環境条件への暴露を控えたり RNAiなどの手法を用い人為的 に転移酵素の発現を抑制することによって芽条突然変異を安定化することも可能 となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003-323428号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 各種植物と本発明の植物 （カーネーション系統 97SPi ) における転移 因子中の末端逆位反復配列の相同性比較。 ここで、 クラスタ一は転移因子のタイ プを意味する。 Genet ics 158： 949-957 2001の記載を基に作成した。
図 2 - 1は、 本発明で用いた植物 （カーネーション系統 97SPi) における転移酵 素とキンギョソゥ転移因子 Tam3の転移酵素とのァミノ酸レベルでの相同性比較。 ここで、 R, Q 等の記号が 2配列間に示されたものは、 当該アミノ酸同士が同一で あり、 +で示されたものは当該アミノ酸同士が類似であることを示す。 例えば L と I と Vと Mは疎水性のァミノ酸において共通しているのでこの記号を付す。 ま た、 Query は本発明の転移因子が有する転移酵素のアミノ酸配列を示し、 Sbjct はキンギヨソゥの転移因子 Tam3が有する転移酵素のァミノ酸配列を示す。
図 2— 2は、 図 2— 1のつづき。
図 3 — 1は、 95SPのフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素 （F3 ' H) 遺伝子 cDNA塩基配 列（Query)と GenBank AX028819 に記載されている F3 ' H 遺伝子の c DNA 配列 (Subject)の比較。 Iは相同な塩基、 *は相違する塩基を表す。
図 3— 2は、 図 3— 1のつづき。
図 4 は、 各種カ ーネーシ ョ ンでの転移因子脱離の有無確認。
GTTAACAATTCAATACTCAGTACA ( 2 4 塩 基 ： 配 歹 IJ 番 号 1 0 ) お よ び
GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG ( 2 1塩基：配列番号 1 6 ) 2種のプライマーを用い、 系 統 95SP、 97SPiの DNAおよび 97SPiの個体から部分的に紫花色に先祖返りをおこ した花の花弁の DNAを铸型に PCRを行った。 95SP (レーン 3 )のフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子には 97SPiに存在する位置に本発明の転移因子は存在しない。 さらに、 紫花色に先祖返りをおこした花の花弁 （レーン 2 0、 2 1 ) では本発明 の転移因子はフラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子から脱離しており、 本発明の転 移因子が転移能を有することは明らかである。 レーンの説明； 1 : 分子量マーカ 一（え Hindlll) 2： 97SP1 3 : 95SP 4-19： 97SPi 20-21 : 97SPi の個体から部 分的に紫花色へ先祖返りをおこした花の花弁
図 5は、 各種カーネーションでの転移酵素の転写発現確認。 系統 95SP および
97SPiカゝら c DNAを調整し、 プライマー CACTATGGATCCTAATTCTCAAA (23塩基：配歹 IJ 番号 2 0 ) および GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23塩基：配列番号 1 4 ) を用い PCR
(条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2 °C 3分） を 3 0回、 7
2 °C 3分） を行った（ィ）。 また、 プライマー TTCTTCACTTGAATTCGAACAAG (23塩基： 配列番号 2 1 ) および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) を用 い同様に PCRを行った（口）。 このような手法により、 転移酵素の発現を評価する ことが可能である。 レーンの説明 ； 1 : 分子量マーカー（え Hindlll) 2： 97SPi ィ 3 : 95SPィ 4 : 97SPi 口 5 : 95SP口
図 6 は、 各種ダイ ア ンサス 属植物での転移因子の有無確認。 GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG (21塩基：配列番号 1 6 )および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) という 2種のプライマ一を用い PCRを行い本発明の転 移因子の存在をダイアンサス属植物で調査したところ、 カーネーションの他品種 (レーン 3 ) やカーネーション以外のダイアンサス属植物 （レーン 4、 5 ) にも 存在することが明らかとなった。レーンの説明； 1 : 分子量マーカー（え Hindlll)
2 : 97SPi 3： カーネーション品種カジ一 4： Dianthus chinensi s 5： Dianthus barbatus
図 7は、 各種カーネーションでの転移因子の転移 （芽条突然変異） の有無の確 認。 系統 95SP、 97SP1および 95SPからの芽条突然変異体である系統 99SP4、 99SP5 のゲノム DNAを制限酵素 Hindlll あるいは Spelにより分解した （それぞれ図 7 一 Aと 7— B )。 これら分解産物を材料にプライマー CGAATACCGTGCTTTGGACG (20 塩基：配列番号 1 8 ) および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) を用いインバース P C Rを行い、 本発明の転移因子の転移を評価した。 それぞれ バンドパターンに変化がみられ、本発明の転移因子が転移したことが検出された。 レーンの説明 ； A Hindlll 1： 97SPi 2： 95SP 3： 99SP5 4 : 99SP4 5： 分子 量マーカー（^ Hindlll) レーンの説明 ； B Spel 1 : 分子量マーカー ( λ Hindlll) 2： 97SPi 3： 95SP 4 : 99SP5 5： 99SP4 発明を実施するための最良の形態
芽条突然変異を誘発する転移因子
ピンク花色カーネーション 97SPiは紫花色カーネーション 95SPより得られた芽 条突然変異体である。 両者の花色色素を TLCにより分析し、 前者の花色色素はべ ラルゴニジン骨格をもち、 後者はシァニジン骨格をもつことを明らかにした。 こ のことによりこの芽条突然変異の原因遺伝子は、 フラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素で ある と考えられた。 フラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素の c DNA 配列 （GenBank AX028819) をもとに作成したプライマー AAGCATATTGCNTAYAAYTAYCANGA (26塩基： 配列番号 5 ) および CCATCTCTTGCDATNGCCCANAYRTT (26塩基：配列番号 6 ) を用レヽ PCRにより、 95SPのフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素 c DNA配列を得た。ここで塩基 Y、
R、 Nはそれぞれ、 C又は T、 Α又は G、 任意の塩基 （A又は G又は C又は T) を指 す。 以下の実施例も同様である。 次に得られた c DNA 配列をもとに作成したプラ イ マ 一 TAAACGGGTACCACATTCCCA ( 21 塩 基 ： 配 列 番 号 7 ) お よ び AAGTCGGAAAACCTCTTTGAT (21塩基：配列番号 8 ) を用いィンバース PCRを行い、 ここまでに明らかとなった塩基配列をもとにプライマー AGCAGGAACAAAGCCAGTACA (21塩基：配列番号 9 ) と GTTAACAATTCAATACTCAGTACA (24塩基：配列番号 1 0 ) およびプライマー AATGTCACCCTTAGAGGTAACTTTCTA ( 27 塩基 ： 配列番号 1 1 ) と TAGCAAGGCCTTAATTTCTGTG (22 塩基：配列番号 1 2 )、 2組み合わせのプライマー を作成し PCRによりフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列を明ら かにした。 さらにここまでに明らかとなったフラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子 のゲノム塩基配列をもとに設計したプライマー CACACGATTCGTTTGCGACC (20塩基： 配列番号 1 3 ) および TAAACGGGTACCACATTCCCA (21塩基：配列番号 7 ) を用い、 ゲノム DNAを铸型にィンバース PCRを行い、 97SPi および 95SP の産物を比較し 97SPiに特異的に存在する DNA断片を得た。
さ ら に こ の DNA 断片 の塩基配列 を も と に作成 し た プ ラ イ マ ー GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23 塩基：配列番号 1 4 ) およびフラボノイ ド 3 ' 水 酸 化 酵 素 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を も と に 作 成 し た プ ラ イ マ ー TAACAACACGTAACCGAAAATATA (24塩基：配列番号 1 5 ) を用レ、 PCRを行い 97SP iの フラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素のゲノミック遺伝子に挿入する 95SP にはない DNA を得、塩基配列を決定した。この塩基配列は転移因子が有する特徴を備えていた。 すなわち、両端に 13塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側に は 8塩基の同一方向の同一塩基配列 （AGTTAATT) が存在していた。
また、 該塩基配列にはオープンリーディングフレームが存在し、 この配列の相 同性を検索すると塩基レベルでは相同性は検出されないものの、 この配列をァミ ノ酸に変換した配列ではキンギヨソゥ由来の転移因子およびトゥモロコシ由来の 転移因子にそれぞれコードされる転移酵素のァミノ酸配列と相同性を示した。 こ のうちキンギヨソゥの Tam3 とのアミノ酸レベルで相同性比較を図 2に示す。 BLAST検索により解析したところ、 両者間の相同性は 2 9 %であった。
さらに 97SPiの個体から部分的に先祖返りをおこした紫花色を示す花の花弁か ら単離した DNAを PCRにより検定すると、 挿入していた塩基配列が脱離しており 97SPi が生成した後もこの塩基配列が転移する能力を有していることが明らかと なった。
この塩基配列を配列番号 4に、 対応する転移酵素部分のァミノ酸配列を配列番 号 3に示す。 この転移因子は、 hAT 型の自律性転移因子に分類されることから、 5 ' 末端に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す 塩基配列を有し、 配列番号 1及び配列番号 2に示す配列を直接に、 又は 4 0 0 0 塩基より短い任意のリンカーを介し、 連結された非自律性因子も転移酵素が外部 から供給されることによ り、 芽条突然変異を誘発することが可能である。 97SPi のゲノム DNAを铸型に、 配列番号 4の塩基配列をもとに作成したプライマ 一 AGATCTAGAGCTGGCAAACCGGTGC ( 25 塩基 ： 配列番号 2 3 ) およびプライマー AGATCTAGAGCTGGCAAAAAAACGGGC (27塩基：配列番号 2 4 ) を用い PCRを行い、 得 られた産物の塩基配列を決定し、 配列番号 2 2に示す自然に存在するこのような 転移酵素遺伝子をもたない非自律性因子を得た。 本非自律性因子は、 95SPおよび 95SPからの突然変異体である 97SEにも存在し、 97SEでは 95SPには存在しないゲ ノム部位に挿入が見られることから、 可動であることが明らかである。 さらに、 97SE特異的に挿入が見られるゲノム部位の塩基配列を決定したところ、両端に転 移酵素遺伝子を有する転移因子と相同な配列番号 1および配列番号 2に示すそれ ぞれ 13塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には 8塩基の同 一方向の同一塩基配列 （GTTATATG) が存在していた。
このような自然に存在する非自律性因子も、 本発明の転移酵素遺伝子をもつ転 移因子の転移酵素が供給されることにより、 芽条突然変異を誘発することが可能 であると予想される。
本発明で用いられる塩基配列には配列番号 4および配列番号 2 2の塩基配列以 外に、
( 1 ) 配列番号 3のァミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列
( 2 ) 配列番号 3のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入又は （両端に） 付加されたものであり、 かつ転移活性を有するポリペプチド をコードする塩基配列
( 3 ) 配列番号 4に示す塩基配列のうち 1 0 5 6番目の Aから 3 4 9 7番目の T までである塩基配列
(4) 配列番号 4に示す塩基配列の縮重異性体
(5) 上記 （1 ) 〜 （3) いずれかに記載の塩基配列または上記（4)に記載の縮 重異性体又は配列番号 4とス トリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつ コードされるポリべプチドが転移活性を有する塩基配列および配列番号 2 2とス トリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列も含まれる。
また本発明には、 以下の （1 ) 〜 （2) のいずれかのポリペプチド
( 1 ) 配列番号 3のアミノ酸配列を有するポリべプチド
( 2) 配列番号 3のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は （両端に） 付加されたものであり、 かつ転移酵素活性有するポリべプチ ド、 も含まれる。
ここで上記 （2) でいうアミノ酸の欠失、 置換、 揷入又は （両端に） 付加の操 作は、 例えば、 D. F.Mark et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 5662- 5666、 S. Inouye et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 3438- 3441、 W085/00817, R.P.Wharton et al, Nature 316 (1985) 601-605に記載されている部位特定突然変 異誘発法等により当業者であれば容易に実施することができる。 ここで得られた 変異型アミノ酸配列を有するポリべプチドは芽条突然変異を誘発する転移活性を 有すればよく、 当該転移活性の有無は以下の実施例で述べる方法により判断でき る。
上記 （4) でいう縮重異性体とは、 縮重コ ドンにおいてのみ異なっていて同一 のポリべプチドをコ一ドすることのできる塩基配列を意味する。 たとえばある塩 基配列に対してあるアミノ酸のどれかに対応するコ ドン、 例えば Asnに対応する コ ドン （AAC) 、 これと縮重関係にある例えば AATに変わったものを本発明は縮 重異性体と呼ぶものとする。
上記（5) でいぅス トリンジェントな条件とは、例えばナトリ ゥム濃度が、 10mM
〜300mM、 好ましくは 20〜100mMであり、 温度が 25°C〜70°C、 好ましくは 42°C〜
55°Cでの条件をいう [Molecular Cloning (Sambrook ら編集（1989) Cold Spring
Harbor Lab. Press, New ork ]。
さらに、 本発明で用いられる塩基配列には、 転移する能力を有する限り、 上記 の配列番号 4あるいは配列番号 2 2の塩基配列と 8 0 %以上、 好ましくは 9 0 % 以上、 より好ましくは 9 4 %以上、 最も好ましくは 9 9 %以上の相同性を有する 塩基配列、 も含まれる。 ここで、 このような相同性の数値は、 塩基配列比較用プ ロ グ ラ ム ： 例 え ば DNASIS- Mac v3. 7 や BLAST ： NCBI の サ イ ト (http : //www. ncbi . nlm. nih. gov/entrez/) を用レヽて、 デフ才ノレ卜 （ネ刀期 の パラメータ一により算出されるものである。
転移酵素をコードする塩基配列を含む D N A又はその部分の変異体は、 転移活 性を有していればよく、 その活性の高さは特に限定されないが、 それぞれ、 該塩 基配列を含む D N A又はその部分の転移活性と同等の活性を実質的に有すること が好ましい。 ここで、 「当該活性を実質的に有する」 とは、 該活性を利用した実際 の使用態様において、 これらの D N A又はその部分と、 同一の条件でほぼ同様の 利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。 また、 ここでいう当該活 性とは、 例えば植物細胞や植物体、 好ましくは双子葉植物の細胞や植物体におけ る活性、 より好ましくはカーネーションの細胞や植物体における活性をいう。 こ こで転移活性は、 例えば、 Hashi daらの報告 [Plant Pys iol. 132： 1 2 0 7 - 1 2 1 6 ] の方法に従って、 欠失で自律性を失った転移因子を含むプラスミ ドを作成 し、 これを bombardmentにより細胞内に打ち込んで、 プラスミ ドから転移する頻 度を見ることにより測定することができる。
さらに、 得られた転移因子の塩基配列のうち配列番号 4をもとにプライマーを 作成し PCR を行ったところ、 カーネーションの品種カリーのみならず Dianthus chinens i sおよび Dianthus barbatusでも予想、される大きさの増幅産物が得られ たので、 この転移因子は少なく ともダイアンサス属に存在することが明らかであ る。 なお、 この転移因子は転移酵素の活性を有し上記のような転移を起こすもの であれば、 本発明で見出されたダイアンサス属に限らず含まれ、 幅広い植物での 花色などの突然変異現象を説明できる。 そのような植物としてダイアンサス属以 外に例えばダイアンサス属が含まれるナデシコ科、 バラ科、 オシロイバナ科、 キ ク科、 ヒルガオ科、 ッリフネソゥ科やナス科の植物が挙げられるが何等これらの 植物に限定されることなく、 幅広く単子葉、 双子葉の植物でも見出される可能性 ； ^ある。 転移因子有無の検出に用いるプライマーの設計は転移因子の塩基配列のうち、 連続する 8塩基以上、 望ましくは 16塩基以上、 更に望ましくは 2 0塩基以上、 更 に好適には 2 0〜 3 0塩基の部分を 2ケ所任意に選ぶことにより可能である。 以 下の実施例で用いたプライマー配列は GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG (21塩基：配列番 号 1 6 ) および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (21塩基：配列番号 1 7 ) であるが、 これ以外のものでも構わない。 2つのプライマーの選択位置の間の距離を、 好適 には、 1 0 0から 1 0 0 0塩基、 更に好適には、 3 0 0から 6 0 0塩基とするこ とができる。 このようなプライマーは、 プライマー間の目的とする DNA断片を増 幅するものであればよく、 例えば GENETYX- WIN vers ion 4. 0などの解析ソフトを 利用することにより任意に選んで使用することができる。 このようなプライマー は、 数種類、 望ましくは 1種の増幅産物が得られるようなものであれば PCR等の 遺伝子増幅法による本検出に用いることができる。 このような遺伝子増幅法とし ては、 P C R法を挙げることができるが、 P C R法に限定されず、 特定的プライ マーを使用する増幅法であれば、 用いることができ、 例えば P C R法は遺伝子増 幅 PCR法共立出版株式会社（1990)を参照すれば、当業者であれば容易に行い得る。 プライマーには、配列番号 4および配列番号 2 2から設計される特異的部分（実 施例参照） に加え、 アダプター配列を付加することもできる。 このようなァダプ ター配列を付加した PCR法として、 PCR- AFLP法や PCR-VECTORETTE法が挙げられ るが、 これらに限られることなく他に C Tの繰り返し数に着目した PCR-SSR法、 塩基配列に依存した高次構造の相違に着目した PCR-SSCP法、 2本鎖 DNAの融解温 度の相違に着目した PCR-DGGE法等も適宜用いることができる。このような手法は 当業者であれば、 容易に選択し行うことができる。
転移因子の有無の検出に用いるプローブには、 配列番号 4あるいは配列番号 2 2の塩基配列又は上記 （1 ) 〜 （5 ) の塩基のうち少なく とも連続した 1 0 0塩 基又はその相補的配列を有する 1 0 0塩基を含むプローブを用いることができる。 プローブには、 通常用いられる手段、 例えば、 放射線標識 （アマシャム社メガプ ライム法）、 DIG標識 （ロシュ社方法準拠） 等で標識することができる。
また転移因子が挿入された遺伝子が同定できれば、 転移因子の脱離を次のよう にして確認できる。 例えば、 本発明により得られた転移因子をプロ一ブとしサザ ンハイプリダイゼーションにより、 又は転移因子の塩基配列をもとにプライマー を作成しィンバース PCRを行うことにより、 変異体と変異体が由来するもととな る個体の相違を検出することにより、変異遺伝子（転移因子が挿入された遺伝子） の一部 （断片） を単離することができる。
このようにして得られた DNA断片を用い変異遺伝子全体を容易に単離することが できる。
転移因子の脱離有無の検出に用いるプライマーの設計は、 本転移因子が花色発 現酵素をコードする塩基配列に挿入されている場合は、 転移因子の塩基配列と花 色発現酵素をコードする塩基配列 （ここではフラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子 のゲノム塩基配列）から、それぞれ連続する 8塩基以上、望ましくは 16塩基以上、 更に望ましくは 20塩基以上、更に好適には 2 0〜 3 0塩基の部分を 2ケ所任意に 選ぶことにより可能である。 以下の実施例で用いたプライマー配列は配列番号 1
9および配列番号 4に示す塩基配列から、 それぞれ GTTAACAATTCAATACTCAGTACA (24塩基：配列番号 1 0 ) および GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG (21塩基：配列番号 1
6 ) であるが、 これ以外のものでも構わない。 このようなプライマーは、 プライ マー間の目的とする DNA断片を増幅するものであればよく、 例えば GENETYX- WIN vers ion 4. 0 などの解析ソフ トを利用することにより任意に選んで使用すること ができる。
このようなプライマーは、 数種類、 望ましくは 1種の増幅産物が得られるような ものであれば PCR等の遺伝子増幅法による本検出に用いることができる。 このよ うな遺伝子増幅法としては、 P C R法を挙げることができるが、 P C R法に限定 されず、 特定的プライマ一を使用する増幅法であれば、 用いることができ、 例え ば P C R法は遺伝子増幅 PCR法 共立出版株式会社（1990)を参照すれば、 当業者 であれば容易に行い得る。
また本発明には、
( 1 ) 配列番号 4あるいは配列番号 2 2の塩基配列のうち少なく とも連続した 8 塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、 5 '末端に配列番号 1に示 す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を有する転移因子 又は以下の [A]に記載の D N A若しくは [B]に記載の転移因子塩基配列を検出する ことを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法、
[A] ： 以下の （a) 〜 （d)、 （ f )、 (g) のいずれかの塩基配列又は（e )の縮 重異性体を含んでなる D N A。
(a) 配列番号 3のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列
(b) 配列番号 3のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿 入又は （両端に） 付加されたものであり、 かつ転移酵素活性を有するポリべプチ ドをコ一ドする塩基配列
(c) 配列番号 4の塩基配列
(d)配列番号 4の塩基配列のうち 1 05 6番目の Aカゝら 349 7番目の Tまでで ある塩基配列
(e) 配列番号 4の塩基配列の縮重異性体
(f) 上記 （a) 〜 （d) いずれかに記載の塩基配列又は上記（e)に記載の縮重異性 体とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつコードされるポリぺプ チドが転移活性を有する塩基配列
(g) 以下の （i) 〜 （ii) のいずれかの塩基配列
(1) 配列番号 22の塩基配列
(ii) 上記 （i) に記載の塩基配列とストリンジユントな条件下でハイブリダィズ する塩基配列；
[B] : 5 '末端に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列 番号 2に示す塩基配列を有し、 配列番号 1及び配列番号 2に示す配列を直接に、 又は 4000塩基より短い任意のリンカーを介し、 連結された非自律性の転移因 子。
(2) 配列番号 4あるいは配列番号 22の塩基配列のうち少なく とも連続した 8 塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、 5 '末端に配列番号 1に示 す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を有する転移因子 又は上記 [A] に記載の DNA を有する転移因子若しくは [B]に記載の転移因子の有 無を検出する方法、
(3) 配列番号 4あるいは配列番号 22の塩基配列のうち少なく とも連続した 8 塩基を含むプライマーと本転移因子が挿入している周囲の塩基配列のうち少なく とも連続した 8塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、 5 '末端に 配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を 有する転移因子又は上記 [A] に記載の DNA を有する転移因子若しくは [B]に記载 の転移因子の脱離有無を検出する方法、 も含まれる。
より具体的には、 配列番号 4の塩基配列のうち少なく とも 8塩基の塩基が連続 した任意の場所と配列番号 1 9の塩基配列のうち少なく とも 8塩基の塩基が連続 した任意の場所をプライマーとして利用した PCR法により、 5 '末端に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を有する転 移因子又は上記 [A] に記載の DNA を有する転移因子若しくは [B]に記載の転移因 子の脱離有無を検出する方法、 も含まれる。
( 4 ) 配列番号 4あるいは配列番号 2 2の塩基配列のうち少なく とも連続した 1 0 0塩基又はその相補的配列を有する 1 0 0塩基を含むプローブを利用した、 5 '末端に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す 塩基配列を有する転移因子又は上記 [A]に記載の DNA を有する転移因子若しくは [B]に記載の塩基配列を検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出す る方法、
( 5 ) 配列番号 4あるいは配列番号 2 2の塩基配列のうち少なく とも連続する 1 0 0塩基又はその相補的配列を有する 1 0 0塩基を含むプローブを利用した、 5 '末端に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す 塩基配列を有する転移因子又は上記 [A] に記載の DNAを有する転移因子若しくは [B]に記載の転移因子の有無を検出する方法も含まれる。
これら （1 ) 〜 （5 ) の検出法に係る説明は、 以下の通りである。
芽条突然変異の検出
本発明の転移因子の塩基配列を利用することによりサザンハイプリダイゼーシ ョン、ィンバース PCRあるいはトランスポゾンディスプレイなどの手法を用いて、 もととなる個体との相違を調査することにより突然変異体を容易に検出すること ができる。
以下の実施例ではィンバース PCRを用い突然変異の検出を行った。 ここで用い た制限酵素は Hindll lあるいは Spelであり、プライマーは CGAATACCGTGCTTTGGACG (20塩基：配列番号 1 8 ) および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) であるが、 これ以外のものでも構わない。 制限酵素は設定したひとつのプ ライマーの 3 ' 末端から 5 ' 末端側へもうひとつのプライマーの 3 ' 末端までの間 に切断点をもたず、 かついずれかひとつのプライマーの 3 ' 末端から転移因子の 3 ' 末端までの間に切断点をもたなレ、酵素であれば、本検出に用いることができる。 本検出に用いるプライマーは本転移因子の塩基配列のうち、連続する 8塩基以上、 望ましくは 16塩基以上、 更に望ましくは 20塩基以上、 更に好適には 2 0〜 3 0 塩基の部分を 2ケ所逆方向に任意に選ぶことにより可能である。 このようなブラ イマ一は、 プライマ一間の目的とする DNA断片を増幅するものであればよく、 例 えば Ol igo 4. 0などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用するこ とができる。
芽条突然変異を誘発する転移因子の転移促進による突然変異
( 1 ) 転移因子の利用法 転移因子の転移を誘発する環境条件としてカルス培養 ·紫外線照射 ·放射線照 射 '病原菌の感染などが知られている （Plant Cel l 1998； 10 : 427-34)。 また、 低温 （MGG 1987 ; 207 : 82- 89) や高温（特開 2003- 93074号公報）など温度条件も転 移を促進する要因として報告されている。 このように種々の環境的あるいは人為 的な要因により転移が活性化されることが明らかとなっている。 これらの条件に 植物を暴露することにより、 転移因子の転移 （突然変異誘発） を促進することが 可能である。
本発明で得られた配列番号 4および配列番号 2 2に示す塩基配列を有する転移 因子は、 実際に転移することが可能である。 また、 それぞれが転移することによ り芽条突然変異を誘発することが DNAレベルで明らかとなった。 本発明で得られ た 97SPiのフラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素に挿入している転移因子は、 限定される ものではないが、 少なく とも低温あるいは短日あるいはそれら両方の条件下にお いて顕著に転移が促進される。 このように当該促進に伴って芽条突然変異体を効 率よく得ることが可能となる。 また、 すでに述べたようにカルス培養 '紫外線照 射 ·放射線照射 ·病原菌の感染（Plant Cel l 1998； 10 : 427- 34)あるいは高温（特開 2003-93074 号公報）などの条件も、 本発明の転移因子の転移を促進する条件の候 補である。
また、 転移因子の転移の促進には転移因子自身の脱メチル化が関与することが知 られている （植物の生長調節 2001 ; 36： 178-180)。 DNAメチル化酵素遺伝子の発 現抑制や、 脱メチル化を促すために 5—ァザシチジンなどの化学物質処理を行う ことにより転移因子の転移を促進することが可能であると考えられる。 このよう な転移因子の活性化 （可動） 条件を容易に検出するには種々の条件においた植物 の転移酵素活性を調査することも有効である。
そこで、 予め転移因子の存在する個体をスクリーニングし、 転移因子の存在が 確認された植物について、 上記の転移を誘発する条件に曝したり、 化学処理をす ることにより、 芽条突然変異を効率よく導入できる。
転移酵素の転写量はノーザンハイブリダイゼーションゃリターン PCRにより把 握することにより推定することが可能であり、 容易に転移を促す要因の特定がで き、 芽条突然変異を得る条件を決定することが可能である。 また、 メチレーショ ン感受性の制限酵素とメチレーシヨン非感受性の制限酵素を用い RFLP、 AFLP、 CAPSなどの DNA多型検出方法を用いること（Nature (2001) 411 : 212-214)、 ある いはメチルシトシン残基に影響をおよぼさずにシトシン残基を化学的にゥラシル へ変換し塩基配列を解読する こ と によ り （Nucleic Acids Res (1994) 22 : 2990 - 2997) 容易に転移因子のメチレーション程度を検定することができる。 このような評価は当業者であれば容易に行うことができる。
これら転移因子がもつ転移酵素の転写量を監視することおよぴ転移因子のメチ レーション程度を評価することにより、 転移因子の転移活性を評価することが可 能となり容易に転移を促す条件を得ることができる。
本発明には、 請求項 1記載の DNAを用いて宿主を形質転換し （当該 DNA：遺伝 子が発現した） 形質転換体を作出することにより転移酵素を発現し自律性因子、 非自律性因子を問わず転移因子の転移を促進することにより芽条突然変異体を作 出する方法、 即ち芽条突然変異の誘発法も含まれる。 このような方法につき、 以 下 （2 ) 〜 （4 ) に説明する。
( 2 ) 転移酵素をコードする遺伝子を含む DNA 転移酵素をコードする遺伝子を転移酵素をコードする遺伝子自身のプロモータ 一のみならず力リフラワーモザィクウィルス 35Sプロモーターなど植物での機能 がみとめられるプロモーターと交換し、 遺伝子導入の手法を用い植物に導入し、 請求項 1 ( 1 ) 〜 （ 4 )、 （6 )、 ( 7 ) に記載のいずれかの塩基配列又は請求項 1 ( 5 ) に記載の縮重異性体又は請求項 5に記載される転移因子のいずれかを転移 させることにより芽条突然変異を促すことが可能である。
ここでプロモーターとして力リフラヮーモザィクウイノレス 35Sプロモーターを 例示したが、植物で機能するものであれば、何等これに限定されるものではない。 また、 誘導性プロモーターに結合し遺伝子導入の手法を用い植物に導入するこ とにより、 誘導条件下でのみ転移を促すことができる。 また、 遺伝子組み換えを 経ずとも一過的に転移酵素をコードする遺伝子を発現することにより転移を促進 することもできる。
ここで誘導性プ口モーターと して、 例えばヒー トショ ック誘導性 （Appl Microbiol Biotechnol. 1995 44 : 466-472) のものを用いることができる。 但し、 誘導性であり、 且つ植物細胞や植物体内で機能するものであれば、 上記プロモー ターに限定されるものではない。
なお、 上述のプロモーターは、 該プロモーターを含む DNAの塩基配列に基づい て設計したプライマーを用いて、 ゲノム DNAを铸型として、 PCRによる増幅反応 によって得ることができる。 具体的には、 誘導性プロモーターの場合このような 遺伝子の 1 つである ヒ ー トショ ック蛋白遺伝子 （ Mol Gen Genet (1989) 219：365-372) のプロモーター領域（ヒートショック蛋白遺伝子の翻訳開始点から -678の領域）を、 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を行い、 増幅することにより得るこ とができる。 ここで PCRに用いることができる铸型 DNAとしては、 例えばシロイ ヌナズナのゲノム DNAが挙げられるが、 何等これに限定されるものではない。 このようなプロモーターについても上記の転移因子の遺伝子同様、 プロモータ 一活性を有する限りにおいて種々の変異体のものを用いることが出来る。 該変異 体の作成は、 上記の転移因子の遺伝子の記載と同様、 上記各種プロモーターに関 わる文献に記載の塩基配列を参照すれば、 当業者であれば格別の困難性なしに実 施できる。 上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか 否か、 さらには、 プロモーターを含む D N A又はその部分のプロモーター活性を 実質的に保持するか否かは、 転移因子の遺伝子を繋いで宿主細胞内で発現させる ことにより、 上記の芽条突然変異検出法あるいは目視、 花色分析など生体成分の 分析により確かめることができ、 このような方法は当業者であれば容易に行うこ とができる。
また、 必要に応じて転写終結を指令するターミネータ一を転移酵素をコードす る遺伝子の下流に連結することもできる。
ターミネータ一としては、 例えば、 35S遺伝子、 nos遺伝子や ocs遺伝子のター ミネ一ターなどが挙げられる （Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol. Biol . , 44 (1993) 985-994、 "Plant genet ic transformat ion and gene express ion ; a laboratory manual ") 、 植物細胞内や植物体内で機能することが知られている ターミネータ一であればこれらに限定されるものではない。
また、 必要に応じてプロモーター配列と転移因子の遺伝子との間に、 遺伝子の 発現を増強させる機能を持つィントロン配列、 例えばトゥモロコシのアルコール デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ （Adhl) の イ ン ト ロ ン [Genes & Development 1 : 1183- 1200 (1987) ]を導入することができる。
D N Aはさらに、 翻訳ェンハンサー、 翻訳終止コ ドン等の構成要素を含むこと ができる。 翻訳ェンハンサ一及び翻訳終止コ ドンとしては、 公知のものを適宜組 み合わせて用いることができる。 ウィルス起源の翻訳ェンハンサ一としては、 例 えば、 タバコモザイクウィルス、 アルフアルファモザイクウィルス R N A 4、 ブ ロモモザイクウイノレス R N A 3、 ポテトウイノレス X、 タバコエツチウイノレスなど の配列が挙げられる （Gal l i e ら、 Nuc. Aci ds Res.， 15 ( 1987) 8693-8711)。 ま た、植物起源の翻訳ェンハンサ一として、ダイズの ]3— 1 , 3ダルカナーゼ（Glu) 由来の配列 （石田功、 三沢典彦著、 講談社サイェンティフイク編、 細胞工学実験 操作入門、 講談社、 p. 119、 1992) やタバコのフェレドキシン結合性サブュニッ ト
(PsaD b ) 由来の配列 （Yamamotoら、 J. Biol. Chem. , 270 (1995) 12466-12470) などが挙げられる。 翻訳終止コ ドンとしては ΤΑΑ, TAG, TGAなどの配列が挙げら れる [Molecular Cloning 前出等の記載]。 また、 プロモーター中の転写ェンハン サ一として、 35S 遺伝子のェンハンサ一部分が同定され、 それらを複数個並べて 繋げることにより、 活性を高めることが報告されており （Plant Cell, 1 (1989) 141 - 150)、 この部分を D N Aの一部として用いることも可能である。 これらの各 種構成要素は、 その性質に応じて、 それぞれが機能し得る形で D N A鎖中に組み 込まれることが好ましい。 そのような操作は、 当業者であれば適切に行うことが できる。
上記 D N Aは、 遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、 当業者であれば容易に製造することができる。 また、 本発明の D N Aは、 天然の 供給源から単離されたものに限定されるものではなく、 上記のような構造を有す るものであれば、 人工的な構築物であってもよい。 該 D N Aは、 周知慣用されて いる核酸合成の方法に従って合成する事により、 得ることができる。
( 3 ) 形質転換と遺伝子発現個体の確認
上記の転移因子の遺伝子によって宿主を形質転換し、 得られる形質転換体を培 養又は栽培することにより、 転移因子としての酵素活性を有するタンパク質を発 現することができ、 転移因子の転移挿入により任意の酵素をコードする遺伝子の 活性発現が抑制された突然変異体を作製することができる。
形質転換後の本発明の鎖は、 プラスミ ド、 ファージ又はゲノム D N Aの中に挿 入された形で、 微生物 （特に細菌）、 ファージ粒子又は植物の中に存在することが できる。 ここで、 細菌としては、 典型的には、 大腸菌、 ァグロバタテリ ゥム等が 挙げられるが、 これらに限定されるものではなレ、。
本発明の好ましい実施形態では、 本発明の D N Aは、 タンパク質を発現させよ うとしている構造遺伝子が、 植物細胞内や植物体内で安定に発現し得るように、 本発明の D N A、 翻訳ェンハンサー、 翻訳終止コ ドン、 及びターミネータ一等と がー体に結合して、 これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
宿主の好ましい例としては、 イネ、 ムギ、 トウモロコシ、 ネギ、 ユリ、 ラン等 の単子葉植物やダイズ、 ナタネ、 トマト、 バレイショ、 キク、 バラ、 カーネーシ ヨン、 ペチュニア、 カスミソゥ、 シクラメン等の双子葉植物といった植物細胞が 挙げられ、 特に好ましい具体例としては、 世界での生産流通消費数量が多い 3大 切花であるキク、 カーネーション、 バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費 量が飛躍的に伸びているペチュニア等の植物細胞などが挙げられる。 また、 具体 的な植物材料としては、 例えば、 生長点、 苗条原基、 分裂組織、 葉片、 茎片、 根 片、 塊茎片、 葉柄片、 プロ トプラス ト、 カルス、 葯、 花粉、 花粉管、 花柄片、 花 茎片、 花弁、 がく片等が挙げられる。
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々 の方法を適宜利用することができる。 その好ましい例として、 例えば、 生物学的 方法としては、 ウィルス、 ァグロパクテリゥムの T iプラスミ ド、 R iプラスミ ド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、 物理学的方法としては、 エレク ト 口ポレーシヨ ン、 ポリエチレングリ コー^/、 パーテイクノレガン、 マイクロインジ ェクンヨン ( Plant genet ic transformat ion and gene express ion ; a laboratory manual "前出）、 シリ コン二 ト リ ドウイスカー、 シリ コンカーバイ ドゥイスカー (Euphyti ca 85 ( 1995) 75-80、 In Vi tro Cel l. Dev. Biol . 31 (1995) 101-104, Plant Sci ence 132 (1998) 31-43) によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。 当該 導入方法については、 当業者であれば適宜選択し、 使用することができる。
さらに、 本発明の D N Aで形質転換された植物細胞を再生させることにより、 導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作製することができる c このような操作は、 植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られてい る方法により、 当業者であれば容易に行うことができる。 植物細胞から植物体へ の再生については、 例えば、 「植物細胞培養マニュアル、 山田康之編著、 講談社サ イエンティフイク、 1984」 等の文献を参照することにより、 当業者であれば容易 に行うことができる。
一般に、 植物に導入した遺伝子は、 宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、 そ の場合、 導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異 なるポジションイフェク 卜と呼ばれる現象が見られる。 導入遺伝子がより強く発 現している形質転換体は、 導入遺伝子の DNA断片をプローブとして用いるノーザ ン法により宿主植物中に発現している mRNA レベルを検定することによって選抜 することができる。
本発明に用いる遺伝子を導入した形質転換植物に目的の遺伝子が組み込まれて いることの確認は、 これらの細胞及び組織から常法に従って DNAを抽出し、 公知 の PCR法又はサザンハイブリダィゼーシヨンを用いて導入した遺伝子を検出する ことにより行うことができる。 また、 形質転換植物での発現は、 例えばリターン
P C Rにより容易に行うことができる。
( 4 ) 一過的発現
本発明の転移因子にコードされる転移酵素を植物で機能するプロモーターに結 合し、 一過的に発現することにより、 限られた時間内でのみ転移因子の転移を促 し突然変異を誘発することが可能である。 一過的発現としては PVXなどウィルス を使ったもの（Plant Cel l (1995) 7： 249-257)ゃァグロバクテリ ゥム （Plant J (2003) 33：949-956. ) による系が知られているが、 これらに限定されるものでは ない。
さらに本発明には、 配列番号 4あるいは配列番号 2 2の塩基配列、 および配列 番号 4あるいは配列番号 2 2 とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする 塩基配列、 および請求項 5に記載の DNAを宿主に導入し、 転移酵素を供給するこ とにより転移を促すことにより芽条突然変異体を誘発することも含む。
前述した形質転換と同様に DNAの宿主への導入は当業者であれば容易に行うこ とができる。 導入された DNAは、 請求項 1に記載した DNAを有する個体 （前述し た形質転換体を含む） と交配すること、 あるいは前述した形質転換などの手法に より転移酵素を供給することにより転移が可能となる。 このようにして芽条突然 変異を誘発することも可能である。
本発明には、 上記形質転換体を含め転移因子の転移により得られた芽条突然変 異体の安定化方法も含まれる。 このような方法につき、 以下に説明する。
芽条突然変異の安定化
転移因子を遺伝子内に有する個体では、 自然突然変異の発生率より大きな頻度 でこの遺伝子から転移因子が脱離することによる復帰細胞が得られることがあり、 易変性と呼ばれる （バイオホルティ 7 75 - 79 1992 農耕と園芸編 誠文堂新光 社）。易変性は農業生産物の品質の安定性を低下させる要因である。転移因子が脱 離する際には、 存在した遺伝子に転移因子の DNA塩基を数塩基ランダムに残して いくことが知られており、 この現象を利用すれば転移因子が脱離したにも関わら ず遺伝子の機能が破壊されているものが得られる。 つまり、 転移因子の転移を促 しその遺伝子から脱離したものを選抜することにより安定な変異体を得ることが できる。 ここで、 芽条突然変異を誘発する転移因子で述べたように転移因子が変 異遺伝子から脱離した個体を、 転移因子の一部および変異遺伝子の一部をプライ マーとして PCRを行うこと、 あるいは前出の芽条突然変異の検出で述べた方法に よりスクリーニングすることが可能である。 また、 転移因子あるいは変異遺伝子 もしくは転移因子と変異遺伝子をプローブにサザンハイブリダイゼーションを行 うことによってもスクリ一二ングが可能である。 上記転移因子離脱後の転移因子 に由来する数塩基の残存有無については、 例えばその領域を含む部分を遺伝子増 幅法で増幅し直接塩基配列を決定することにより芽条突然変異の安定化を確認す ることができる。
また、 逆に転移を助長する温度等の環境条件への暴露を控えたり、 RNAiなどの 手法を用い人為的に転移酵素の発現を抑制することによって芽条突然変異誘発を 安定化することも可能となる。
本発明には、上記形質転換体を利用した芽条突然変異体の単離方法も含まれる。 このような方法につき、 以下に説明する。
転移因子により誘発された芽条突然変異の変異遺伝子の単離
本発明により得られた転移因子をプローブとしサザンハイブリダィゼーション を行うことあるいは転移因子の塩基配列をもとにプライマーを作成しィンバース PCR を行うことにより、 変異体とそのもととなる個体の相違を検出することによ り変異遺伝子の一部を単離することができる。 このようにして得られた DNA断片 を用い変異遺伝子全体を容易に単離することができる。 本発明の転移因子はこの ような場面で、 芽条突然変異を起こすという特徴から後代のみならず当代におい ても遺伝子単離の道具となり得る。
転移因子により誘発された遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜
ある遺伝子の機能を抑制しようとする場合、 アンチセンス技術などを用い遺伝 子組み換えにより達成することが行われているが、 本発明の転移因子の転移によ りこのような遺伝子の発現を抑制された変異体を遺伝子組み換えを利用すること なく作り出すことが可能となる。 即ち、 例えば低温あるいは短日あるいはそれら 両方の条件により転移因子を有する植物の転移因子を転移させ突然変異を誘発す ることにより、 ある遺伝子の発現が抑制された変異体を作成することができる。 そして、 目的の遺伝子に転移因子が挿入しているものを PCR法により容易に検出 (選抜） することが可能である。
転移因子により誘発された変異集団の中から目的とする遺伝子および転移因子 の DNAをもとにサザンハイブリダイゼーションあるいは PCRを行うことにより、 目的とする遺伝子に転移因子が挿入した個体を選抜することが容易にできる。 なお、 本発明の転移因子のうち内部に転移酵素を有しているものは自ら転移す ることが可能である （自律性） 力 一般的に転移因子は内部の配列を除去しても 転移酵素の供給があれば転移することが知られている [Plant Physiology 132： 1207-1216 (2003) ]。 例えば、 本文献では Bal l部位から TthHB81部位の 2260塩基 が欠落しても、 転移酵素の供給により転移することができる。 このように転移因 子の内部を一部欠落させることにより転移酵素活性をもたない転移因子を得るこ とができ、 得られた転移因子は転移酵素を有していないので自らのみでは転移す ることができないが、 転移酵素の供給下で転移することが可能である。 本発明で 得られた内部に転移酵素をもたないものは、 自然界に存在する転移酵素の供給下 で転移可能な転移因子である。 このような転移酵素供給下で転移可能な転移因子 が自然界に存在することは知られており、 非自律性因子と呼ばれている [蛋白質 核酸 酵素 37 : 1047-1059 (1992) ]。 転移因子が自律性か非自律性かは、 発現可 能な転移酵素遺伝子を有するか否かによって推察することができる。
本発明の転移因子においても転移酵素をコードする塩基配列の全部あるいは一 部を除去 （欠失） するまたは塩基の置換、 挿入又は （両端に） 付加するといつた 変異を導入することにより、 上述したような転移酵素が働かない転移因子を作成 することは当業者であれば容易である。 また、 本発明の転移因子の DNA配列の全 部あるいは一部をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション法ゃ PCR法によ り当業者であれば容易に本発明の転移因子と相同性を有するものを得ることが可 能である。 得られた DNA断片の塩基配列を解析することによりそれらの中から転 移酵素部分に変異があり、 かつ上述したような転移酵素が働かない転移因子を作 成するあるいは見出すことは当業者であれば容易である。
このように人為的に作成、 あるいは自然界から選抜することにより、 本発明の 転移因子と相同性を有するが自身では転移することができない転移因子を当業者 であれば容易に得ることが可能である。 これらは本発明の転移酵素により転移す ることが可能であるので、 このような転移酵素活性をもたない転移因子を上述し たような芽条突然変異の検出、 芽条突然変異を誘発する転移因子の転移促進によ る突然変異、 芽条突然変異の安定化、 転移因子により誘発された芽条突然変異の 変異遺伝子の同定、 転移因子により誘発された遺伝子の発現が抑制された変異体 の選抜に用いることができる。
以下、 本発明の実施例を詳細に説明するが、 本発明は、 何等実施例に限られる ものではない。また、以下の実施例で用いられたカーネーション系統 95SP、97SPi、 97SE、 99SP5および 99SP4は、 麒麟麦酒株式会社の植物開発研究所内にて保存さ れており、 実験材料として分譲要請に応じることができる。 連絡先は、 〒 3 2 9 - 1 4 1 4 日本国栃木県塩谷郡喜連川町大字早乙女字申塚 3 3 7 7番地 （電話； 国番号 8 1— 2 8— 6 8 6— 0 5 0 1、 ファクシミ リ ； 国番号 8 1— 2 8— 6 8 6— 0 5 0 2 ) である。
実施例 1
カーネーションの花弁色素の分析
カーネーションの花弁の色素分析は山ロ雅篤の方法 （南九州大学園芸学部研究 報告（1988) '第 1 9号 1— 7 8頁： カーネーション (Dianthus car卿 hyl lus L. ) の花色育種に関する基礎的研究） によった。 系統 95SPと 97SPiの花弁を 5 %酢酸 5 0 %エタノールでそれぞれ抽出した後、 TLC (酢酸：塩酸：水 = 15 : 3 : 82) で展 開した。 それらの展開像を既知のシァニジン 3ダルコシド 5ダルコシド （Cy3G5G) の色素を持つカーネーション花弁 （品種バーバラ ： ヒルベルダ社） から抽出した ものとペラルゴ二ジン 3ダルコシド 5グルコシドグルコシド （Pg3G5G) の色素を 持つカーネーション花弁 （品種ライラック ： シリー ブラザーズ社） から抽出し たものと比較することにより、 95SPはシァニジン骨格をもつ色素、 97SPiはペラ ルゴ二ジン骨格をもつ色素を主要に含むことが推定できた。
実施例 2
カーネーションのゲノム DNAの調整
カーネーション系統 95SP、カーネ一ション系統 97SPi、カーネーション系統 97SE、 カーネーション系統 99SP5および 99SP4の D N Aの調整は、 インビト口の葉片を 材料に Nucleon PhytoPure (アマシャム社） を用い添付のプロ トコ一ノレに従って 行った。
なお、 99SP5及び 99SP4 は以下の手法により得、 材料とした。 定法に従って X 線 4KRを照射した 95SPの草丈約 5cm長のインビト口植物 1000個体を温室に馴化 し、 腋芽を採り育成しそれから発根した個体の腋芽を採り育成することを数回繰 り返しピンク色の花をつけるもの（97SPiと同じ花色の個体）として 2個体（99SP5、 99SP4) を得た。
実施例 3
カーネーションの cDNAの調整
カーネーション系統 95SPの cDNAの調整は、細胞工学別冊 植物細胞工学シリ ーズ 2 植物の PCR実験プロ トコール（1995) 42-43に記載の方法に従い、 花弁 を材料に単離した RNAをもとに、 タカラ社の cDNA合成キッ トを用い添付のプロ トコールに従いキッ トに添付されている 18塩基の dTプライマーを用いて行った c 実施例 4
フラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素 （F3' H) 遺伝子のクローン化と塩基配列の決定
(1)カーネーション系統 95SPの F3' H遺伝子のクローン化と cDNA塩基配列の決
GenBank AX028819に記載されている F3 ' H遺伝子の c DNA配列を参考にしプラ イ マ一 AAGCATATTGCNTAYAAYTAYCANGA ( 26 塩基 ： 配列番号 5 ) お よ び CCATCTCTTGCDATNGCCCANAYRTT (26塩基：配列番号 6 ) を作成した。 これらのプラ イマ一を用いインビトロのカーネーション系統 95SP の花弁から得られた全 c D N A画分に対し、 P CR (条件： 9 5°C 5分、 （9 5°C3 0秒、 3 5°C 3 0秒、 Ί 2 °C 1分）を 3 0回、 7 2°C 1 0分）を行った。得られた増幅産物を pGEM T vector (プロメガ社製）を用いて TAクローニング（P CR実験ノート， 谷ロ武利編著， 羊 土社 （1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて 848塩基 の塩基配列を決定した。 得られた塩基配列を上記 GenBank AX028819に記載され ている F3' H遺伝子の cDNA配列と比較すると 5ケ所の塩基置換と 1 ケ所の 3塩 基の挿入がみられた （図 3)。
(2)カーネーション系統 97SPiの F3， H遺伝子のクローン化とゲノム DNA塩基配列 の決定
次に、 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 2 植物の PCR実験プロ トコール (1995) 69- 72に従い、 カーネーション系統 97SPiのゲノム DNAを制限酵素 Ndel で分解し、その分解産物を材料に前記カーネーション系統 95SPで得られた F3' H 遺伝子塩基配列をもとに作成したプライマー TAAACGGGTACCACATTCCCA (21 塩基： 配列番号 7) および AAGTCGGAAAACCTCTTTGAT (21塩基：配列番号 8) を用いイン バース PCR (条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2。C 2分） を 3 0回、 7 2°C3分）を行った。得られた約 1.6kbの増幅産物を pGEMT vector (プ 口メガ社製）を用いて TAクロ一ニング （P CR実験ノー 谷ロ武利編著， 羊土 社 （1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて塩基配列を 決定した。ここで得られた塩基配列を制限酵素 Ndelの切断点で 2つに分割し 2種 の塩基配列を得た。
さらに GenBank AX028819に記載されている cDNA配列と実施例 4 (1)で明らか となったカーネーション系統 95SPの F3 ' H遺伝子 c DNA配列および前段落で明ら かとなつたカーネーション系統 97SPiの F3' H遺伝子の一部分のゲノム DNA塩基 配列をもとに以下のプライマーを作成した。 プライマ一 AGCAGGAACAAAGCCAGTACA (21塩基：配列番号 9) および GTTAACAATTCAATACTCAGTACA (24塩基：配列番号 1 0) を用い、 カーネーション系統 97SPiのゲノム DNAに対し P CR (条件： 9 5°C5分、 （9 5°C 3 0秒、 5 6°C 3 0秒、 7 2°C 3分） を 3 0回、 7 2 °C 3分） を行った。 この約 1.9kbの增幅産物と、 プライマー AATGTCACCCTTAGAGGTAACTTTCTA (27塩基：配列番号 1 1 ) および TAGCAAGGCCTTAATTTCTGTG (22塩基：配列番号 1 2) により同様にして得られた約 2.9kb の増幅産物を pGEM T vector (プロメ ガ社製）を用いて TA クローユング （P CR実験ノート， 谷ロ武利編著， 羊土社 (1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて塩基配列を決 定した。
(3)カーネーションの F3' H遺伝子のゲノム DNA塩基配列
実施例 4 ( 1 ) の c DNA配列、 実施例 4 ( 2 ) ィンバース PCRによる約 1.6kbDNA 断片から得られた 2種の DNA配列、 実施例 4 (2) PCRによる約 1.9kbDNA断片の
DNA配列および実施例 4 ( 2) PCRによる約 2.9kbDNA断片の DNA配列、 合計 5種 の塩基配列を結合し重複部分を除くことにより、 カーネーション!^ ' H遺伝子の ゲノム DNA塩基配列 5743塩基を決定した（配列番号 1 9 )。 また、 97SPiには対立 遺伝子として 2つの F3 ' H遺伝子が存在することが予想されるが、 97SPi では配 列番号 1 9の 2 5 2 7番目の塩基 Aのあとに Gが挿入されフレームシフトを起こ していることが明らかとなった。
実施例 5
カーネーション系統 97SPiからの転移因子のクローン化と塩基配列の決定
インバース PCRは、 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 2 植物の PCR実験 プロ トコール（1995) 69- 72 に従い行った。 実施例 2に記載した方法によりカー ネ一シヨン系統 95SPおよび 97SPi よりゲノム DNA を調整し、 制限酵素 Hindlll で分解した。これら分解産物を材料に実施例 4 (1)で得られた 848塩基の DNA配列 をもとに作成したプライマー CACACGATTCGTTTGCGACC (20塩基：配列番号 1 3 ) お よび TAAACGGGTACCACATTCCCA (21塩基：配列番号 7 ) を用いインバース PCR (条 件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2 °C 2分） を 3 0回、 7 2 °C
3分） を行った。 得られた増幅産物を 1 %ァガロースゲルを用い 1 0 O V で 2 0 分間電気泳動することにより分離し、 ェチジゥムブ口マイ ド染色により可視化し た。 この結果、 97SPi に特異的に存在する約 2. 5kbの増幅産物が得られた。 これ を pGEM T vector (プロメガ社製）を用いて TAクローニング （P C R実験ノート， 谷ロ武利編著， 羊土社 （1997) ) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて塩基配列を決定した。 この塩基配列を内部に存在する制限酵素 Hindlll の切断点で分割し 2種の塩基配列としたところ、 約 300塩基の 1種は実施例 4で 得られた DNA塩基配列 （配列番号 1 9 ) の一部と全長にわたり一致した。
次に前段落で明らかとなった約 2. 5kbの DNA配列をもとに作成したプライマー
GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23塩基：配列番号 1 4 ) および実施例 4 (2)で得られ た約 1. 9kbの DNA配列をもとに作成したプライマー TAACAACACGTAACCGAAAATATA (24 塩基：配列番号 1 5 ) を用い、 カーネーション系統 97SPiのゲノム DNAを材料に
PCR (条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5。C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2 °C 3分） を 3 0回、
7 2 °C 3分） を行った。 得られた約 3kbの増幅産物を pGEM T vector (プロメガ 社製）を用いて TA クローニング （P C R実験ノート， 谷ロ武利編著， 羊土社 (1997) ) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて塩基配列を決 定した。
本実施例で得られた 3種の DNA塩基配列のうち実施例 4で得られた塩基配列と 一致した 1種を除いた 2種の塩基配列を結合し重複した部分を除外し、 さらに両 末端に存在する実施例 4で得られたフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素（F3 ' H)遺伝子 のゲノム DNA塩基配列（配列番号 1 9 )と相同な 40塩基および 931塩基の部分を除 外することにより本発明の転移因子の DNA塩基配列 （配列番号 4 ) を得た。 ここ で DNASIS- Mac v3. 7による解析によりオープンリーディングフレーム （0RF) は、 1 0 5 6番目の塩基 A力 ら 3 4 9 7番目の Tまでの 2 4 4 2塩基であった。
次に配列番号 1 9 お よ び配列番号 4 に示す DNA 塩基配列か ら GTTAACAATTCAATACTCAGTACA ( 2 4 塩 基 ： 配 列 番 号 1 0 ) お よ び GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG ( 2 1塩基：配列番号 1 6 ) 2種のプライマーにより、 本 発明の転移因子の内部からフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素の部分までを PCRを用い 増幅することが可能となる。 95SP、 97SPiの DNAおよび 97SPiの個体から部分的 に紫花色に先祖返りをおこした花の花弁 DNAを鎵型にこれら 2種のプライマーを 用い PCR (条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6。C 3 0秒、 7 2 °C 3分） を 3 0回、 7 2 °C 3分） を行ったところ、 95SP (レーン 3 ) や紫色に先祖返りをおこ した花の花弁 （レーン 2 0、 2 1 ) では、 増幅産物が得られず本発明の転移因子 はフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子より脱離をおこしていることが明らかとな つた （図 4 )。 このことより本発明の転移因子が転移能を有することは明らかであ る。
また、 実施例 4で明らかとなった 97SPiの花色発現に係る塩基配列 （フラボノ イ ド 3 ' 水酸化酵素遺伝子、 配列番号 1 9の 2 5 2 7番目の塩基 Aのあとに Gが 挿入されているもの） と本発明の転移因子の塩基配列 （配列番号 4 ) に続く両側 の塩基配列を比較することにより、 本発明の転移因子は配列番号 1 9の 3 9 0 8 番目の塩基 Tの後ろに挿入し、 転移因子の両側で、 配列番号 1 9の塩基配列中 3 9 0 1番目から 3 9 0 8番目までの AGTTAATTという 8塩基を重複していることが 明ら力 こなった。
つづいて、 配列番号 4に示す明らかとなつた転移因子の塩基配列から AGATCTAGAGCTGGCAAACCGGTGC ( 2 5 塩 基 ： 配 列 番 号 2 3 ) お よ び
AGATCTAGAGCTGGCAAAAAAACGGGC ( 2 7塩基：配列番号 2 4) 2種のプライマーによ り、 97SPiのゲノム DNAを錶型に PCR (条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C
3 0秒、 7 2 °C 2分） を 3 0回、 7 2°C 3分） を行い増幅産物を得た。 これを pGEM
T vector (プロメガ社製）を用いて TAクローユング （P CR実験ノート， 谷ロ武 利編著， 羊土社 （1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用い て塩基配列を決定した。 得られた増幅産物のうち約 0.7kbのものを、 配列番号 2
2に示す。 この塩基配列は両端約 0.2kbにわたりそれぞれ配列番号 4に示す転移 因子とほぼ相同であるが、 オープンリーディングフレームはなく、 内部に転移酵 素遺伝子をもたない非自律性転移因子であると判断した。
ィンバース PCRにより 95SPと 97SEの相違を検討した。 すなわちカーネーショ ン系統 95SPおよび 95SPからの芽条突然変異体である 97SEのゲノム DNAを実施例
2に記載の方法で調整し、 制限酵素 EcoRIにより分解した。 これら分解産物を材 料にプライマー CGAATACCGTGCTTTGGACG (20 塩基 ： 配列番号 1 8 ) および
TCGTGCCGTGCACCGGTTT (19塩基：配列番号 2 5) を用いィンバース PCR (条件： 9
5°C2分、 （9 5°C3 0秒、 5 6°C 3 0秒、 7 2 °C 3分） を 3 0回、 7 2°C3分） を行った。 インバース PCRは、 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 2 植物の
PCR実験プロ トコール（1995) 69-72に従い行った。得られた増幅産物を 1 %ァガ ロースゲルを用い 1 0 0V で 6 0分間電気泳動することにより分離し、 ェチジゥ ムブロマイ ド染色により可視化した。 この結果、 95SP には存在しないが、 97SE に存在する約 4.5kb の増幅産物が得られた。 この増幅産物を pGEM T vector (プ 口メガ社製）を用いて TAクローニング （P CR実験ノート， 谷ロ武利編著， 羊土 社 （1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて部分的に塩 基配列を決定 した。 得 られた塩基配列か ら 作成 したプラ イ マ ー
TATACGGAGTACCACAATCAGA ( 2 2 塩 基 ： 配 列 番 号 2 6 ) お よ び
CTAGTATGCTAGTCTGAAGGC ( 2 1塩基：配列番号 2 7) を用い 95SPおよび 97SEのゲ ノム DNAを鎵型に PCR (条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2 °C
2分） を 3 0.回、 7 2°C3分） を行った後に、 1 %ァガロースゲルを用い 1 0 0V で 3 0分間電気泳動することにより分離し、 ェチジゥムブ口マイ ド染色により可 視化した。 得られた増幅産物のうち 95SPに存在せず 97SEに存在する約 1.3kbの 増幅産物を pGEM T vector (プロメガ社製）を用いて TA クローニング （P CR実 験ノート， 谷ロ武利編著， 羊土社 （1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステ ムズ社製） を用いて塩基配列を決定した。 この結果、 この増幅産物には配列番号 2 2に示す DNA配列が、 配列番号 2 8に示す塩基配列の第 1 1 4番目の Cから第 1 2 1番目の Cの 8塩基 （GTTATATG) を同一方向に重複した間に存在していた。 即ち、 当該 8塩基の部分が GTTATATG · · · · GTTATATGとなり、 ' · · ' の所に配 列番号 2 2の配列が挿入していた。 このことから配列番号 2 2に示す非自律性因 子が可動であり 97SEが 95SPから突然変異により得られた時点あるいはそれ以降 に転移したことが明らかである。
ここで示したィンバース PCRによる転移の評価方法は、 実施例 8で述べる突然 変異の検出法の実施例とともに突然変異の検出に有効な方法の 1つである。
実施例 6
リターン PCRによる転移酵素発現の評価
実施例 3に記載した方法によりカーネーション系統 95SPおよび 97SPi から c DNAを調整し、 プライマー CACTATGGATCCTAATTCTCAAA (23塩基：配列番号 2 0) お よび GAGACTCATAGTGGTTATATACA (23塩基：配列番号 1 4) を用い PCR (条件： 9 5°C 2分、 （9 5。C3 0秒、 5 6°C 3 0秒、 7 2°C3分） を 3 0回、 7 2 °C 3分） を行った。
また、 プライマー TTCTTCACTTGAATTCGAACAAG (23 塩基：配列番号 2 1 ) および
CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) を用い同様に PCRを行った。 得られた増幅産物を 1 %ァガロースゲルを用い 1 0 0V で 2 0分間電気泳動する ことにより分離し、 ェチジゥムブロマイ ド染色により可視化した。 この結果、 予 想される大きさ（それぞれ約 1.9kbおよび約 1. lkb)の増幅が検出された（図 5)。 これらの産物のうち系統 97SPi より得られたものについて pGEM T vector (プロ メガ社製）を用いて TAクローニング （P CR実験ノート， 谷ロ武利編著， 羊土社
(1997)) し、 ABI310 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて部分的に塩基 配列を決定したところ、 本発明の転移因子が有する転移酵素をコードする遺伝子 の一部と相同であった。 このようにリターン PCRにより転移酵素の転写発現を容 易に検出することが可能であった。
実施例 7
他のダイアンサス属植物での転移因子の存在の調査
カーネーション品種力リ一、 Dianthus chinensis (一般の花種子販売業者で購 入） および Dianthus barbatus (一般の花種子販売業者で購入）、 ポジティブコン トロールとして 97SPiからの DNAの調整は、 実施例 2と同様に行った。 ただし力 一ネーション品種力リ一は温室で育成した植物の葉を材料に DNAを調整した。 他 の 2種は水分を含むろ紙上に播種し 6 日後に発芽した子葉と胚軸から DNAを調整 した。 これらの DNAを鎵型に下記の PCRを行った。
明らかとなった本発明の転移因子塩基配列から、 GGTCTAGTTAGTCAGCTACGG (21 塩基：配列番号 1 6 ) および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) という 2種のプライマーを用い、 P C R (条件： 9 5 °C 2分、 （9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7. 2 °C 3 0秒） を 3 0回、 7 2 °C 3分） を行った。 増幅産物は 1 % ァガロースゲルを用い 1 0 0 V で 2 0分間電気泳動することにより分離し、 ェチ ジゥムプロマイ ド染色により可視化した。
この結果、 ポジティブコントロールの 97SPi と同様に、 カーネーション品種力 リー 、レーン 3 )、 Dianthus chinensis (レ—ン 4 ) および Dianthus barbatus (レ ーン 5 ) いずれからも予想される約 4 6 0塩基の増幅産物が得られ、 これらの植 物にも本発明の転移因子が存在することが明らかとなった（図 6 )。
実施例 8
突然変異の検出
実施例 5で述べたィンバース PCRは、 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 2 植物の PCR実験プロ トコール（1995) 69-72に従い行った。 カーネーショ ン系統
95SP、 97SPiおよび 95SPからの芽条突然変異体である系統 99SP4、 99SP5のゲノ ム DNAを実施例 2に記載の方法で調整し、制限酵素 Hindlllあるいは Spelにより 分解した。 これら分解産物を材料にプライマー CGAATACCGTGCTTTGGACG (20塩基： 配列番号 1 8 ) および CGCAAATACACTAAATTTATGCC (23塩基：配列番号 1 7 ) を用 ぃィンバース PCR (条件： 9 5 °C 2分、 （ 9 5 °C 3 0秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2 °C 5 分） を 3 0回、 7 2 °C 3分） を行った。 得られた増幅産物を 1 %ァガロースゲル を用い 5 O V で 1 2 0分間電気泳動することにより分離し、 ェチジゥムブ口マイ ド染色により可視化した。 この結果、 それぞれ複数種の増幅産物を分離すること が可能であり、 用いた 4系統それぞれに特異的に得られる増幅産物が検出され、 これらは転移因子の転移によると考えられた。 このように転移因子が転移するこ とにより誘発されたゲノム DNA上の変異を検出することが可能であった （図 7 )。
また、 インバース PCRの増幅産物の一部について ABI310 (アプライ ドバイオ システムズ社製） を用いて部分的に塩基配列を決定し、 本発明の転移因子に含ま れる予想される配列と相同であることを確認した。 このことより本実施例の増幅 産物は本発明の転移因子を含む目的とする増幅産物であることが明らかである。 実施例 9
環境による転移因子の転移促進
本発明で得られた 97SPiのフラボノィ ド 3 ' 水酸化酵素に挿入する転移因子の 脱離は、 花色がピンクから紫になることで表現型として検出することが可能であ る。 97SPiの定植苗 （約 5 cm長） を 2種の条件下の温室内で定法に従い 2ヶ月間 (2003年 9月 4日から 2003年 10月 31 日） 育成したのち、 開花時に紫色の斑の 有無を検定した。 第 1は、 ガラス温室で昼温 2 5 _ 3 3 °C ·夜温 2 3— 3 0 °C . 自然日長 （1 3— 1 2時間） の条件とした。 第 2は、 人工気象器コィ ト トロン （小 糸製作所製） を用いて昼温 2 0度 ·夜温 1 0度 · 8時間日長に調整した条件とし た。 この結果、 第 1の条件で開花した 4 5花のうち 3花に紫の斑が見られたのに 対し （6 . 7 %)、 第 2の条件では開花した 5 1花のうち 3 5花に紫の斑が見られ た （6 8 . 6 % )。 このことから、 低温、 あるいは短日、 あるいは低温および短日 の条件が、 97SPi のフラボノイ ド 3 ' 水酸化酵素に挿入する転移因子の脱離を促 進することが明らかである。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明で初めて見出された芽条突然変異誘発型転移因子の転移酵素発現量をリ ターン PCRによつて検出することおよびこの転移因子のメチレーション程度を評 価することにより、 効率的に芽条突然変異を起こしゃすい環境条件を特定するあ るいは芽条突然変異をおこしゃすい個体を選抜することができる。
また、 当該転移因子の転移を突然変異の検出方法に述べた手法により検出する ことにより、 芽条変異をおこす環境条件を特定するあるいは芽条突然変異をおこ しゃすい個体を選抜することができる。
このようにして得られた環境条件および個体を利用して効率的に芽条突然変異 を誘発することが可能となる。 また、 当該転移因子の転移酵素遺伝子を遺伝子ェ 学的に利用することにより芽条突然変異体を効率よく作り出すことが可能となる このようにして一細胞あたりの変異箇所が少ないにもかかわらず変異する頻度の 高い、 従来の手法の問題を解決する理想的な突然変異方法を提供し、 突然変異育 種が重要である果樹や花卉などの育種を効率よく進展させることが可能となる。 さらに、 農業生産上問題となる易変性を示す個体において原因が転移因子によ るものであれば、転移因子の転移を促すことにより安定化することが可能となる。 また、 転移をおこしゃすい環境条件を避けることあるいは転移酵素遺伝子の発現 を遺伝子工学的に抑制することにより安定に農業生産を行うことが可能となる。 得られた芽条突然変異体から突然変異の原因遺伝子を容易に同定 ·単離するこ とが可能となる。 また、 目的の遺伝子に当該転移因子が挿入しているものを PCR などの手法により容易に検出 （選抜） することが可能となり、 遺伝子の発現が抑 制された変異体を効率よく得ることができる。 このような技術は植物分子遺伝学 研究を加速させ得る。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （1) 〜 （4) (6) (7) のいずれかの塩基配列又は （5) の縮 重異性体を含んでなる D N A。
(1) 配列番号 3のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列
(2) 配列番号 3のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は （両端に） 付加されたものであり、 かつ転移酵素活性を有するポリぺプ チドをコードする塩基配列
(3) 配列番号 4の塩基配列
( 4 ) 配列番号 4の塩基配列のうち 1 056番目の Aカゝら 349 7番目の了まで である塩基配列
(5) 配列番号 4の塩基配列の縮重異性体
(6) 上記 （1) 〜 （4) いずれかに記載の塩基配列又は上記（5)に記載の縮重異 性体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつコードされるポリべ プチドが転移活性を有する塩基配列
(7) 以下の （ィ） 〜 （口） のいずれかの塩基配列。
(ィ） 配列番号 22の塩基配列
(口） 上記 （ィ） に記載の塩基配列とス ト リ ンジユントな条件下でハイプリダイ ズする塩基配列
2. 配列番号 4又は配列番号 22の塩基配列のうち少なく とも連続した 8塩 基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、 5 '末端に配列番号 1に示 す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を有する転移因子 又は請求項 1に記載の DNAを検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検 出する方法。
3. 配列番号 4又は配列番号 2 2の塩基配列のうち少なく とも連続する 8塩 基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、 5 '末端に配列番号 1に示 す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を有する転移因子 又は請求項 1に記載の DNAを有する転移因子の有無を検出する方法。
4. 配列番号 4又は配列番号 22の塩基配列のうち少なく とも連続した 8塩 基を含むプライマーと本転移因子が挿入されている周囲の塩基配列のうち少なく とも連続する 8塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、 5 '末端 に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列 を有する転移因子又は請求項 1に記載の DNAを有する転移因子の脱離有無を検出 する方法。
5. 5 '末端に配列番号 1に示す塩基配列を有し、 かつ 3 ' 末端に配列番号 2に示す塩基配列を有し、 配列番号 1及び配列番号 2に示す配列を直接に、 又は 4000塩基より短い任意のリンカーを介し、 連結された非自律性の転移因子。
6. 以下の （1) 〜 （2) のいずれかのポリペプチド。
(1) 配列番号 3のアミノ酸配列を有するポリべプチド
(2) 配列番号 3のアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入又は （両端に） 付加されたものであり、 かつ転移酵素活性を有するポリぺプ チド
7. 請求項 1 (1) 〜 （4)、 （6)、 (7) に記載のいずれかの塩基配列又は請 求項 1 (5) に記載の縮重異性体又は請求項 5に記載の転移因子のいずれかを含 んでなる DN Aの転移を促進することにより芽条突然変異を誘発する方法。
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