JP2021191261A - 放射相称花を有するクサトベラ属（Ｓｃａｅｖｏｌａ）植物 - Google Patents

Abstract

【課題】 放射相称花を有するクサトベラ属（Scaevola）植物を提供する。【解決手段】 本発明は、以下：融合した又は一部融合した背側開裂、放射相称又はほぼ放射相称配置の花弁、及び遅延型老化の少なくとも１つを特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産するクサトベラ属（Scaevola）植物を提供する。この表現型は、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子若しくはタンパク質の発現又は活性の低減若しくは排除、及び／又はＦＵＳＥＤアレルと称される新規アレルの存在によってもたらされる。本発明はさらに、こうした植物の植物細胞、植物部分、零余子、種子及び組織培養物も提供する。本発明はさらに、このような植物、植物細胞、植物部分、零余子、種子及び組織培養物の生産方法及び選択方法も提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、園芸、植物育種及び植物遺伝子学に関する。

国際的な観賞植物市場は、大きく、多様であり、この市場には、顧客の満足度及び関心を高めるための新しく、革新的な製品及び改善に対するニーズが絶えず存在する。この市場で販売されている植物の人気の高い属の１つが、クサトベラ属（Scaevola）である。クサトベラ属（Scaevola）種の一般名としては、スカエボラ、ファンフラワー、ハーフフラワー、及びナウパカ（植物のハワイでの名称）がある。例えば、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）は、地被植物、花壇用植物、鉢植え植物又はハンギングバスケット植物として使用することができる観賞植物である。一般に、これは一年生と考えられているが、穏やかな気候では、短命の多年生として扱うことができる。スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）は、限られた範囲の花の色、主として青い色合いのものが市販されているが、白、ピンク及び淡黄色をしたものも市販されている。

クサトベラ属（Scaevola）の植物は、「五数性で、左右相称の花冠を有し、その背側開裂(dorsal slit)は、２つの背側花弁の間で融合した花弁基部の花筒を開いている」（Gardner, A.G., Fitz Gerald, J.N., Menz, J., Shepherd, K.A., Howarth, D.G., and Jabaily, R.S. Characterizing Floral Symmetry in the Core Goodeniaceae with Geometric Morphometrics. PLoS ONE 11(5), 2016）。花は、「向軸側で完全に開裂しており、５つの花弁は全て腹側を向き、扇（fan）に似ている」（Berger, B.A., Han, J., Sessa, E.B., Gardner, A.G., Shepherd, K.A., Ricigliano, V.A., Jabaily, R.S., and Howarth, D.G. The Unexpected Depths of Genome-Skimming Data: A Case Study Examining Goodeniaceae Floral Symmetry Genes, Applications in Plant Sciences, 5(10), 2017）。

背側の開裂の存在は、クサトベラ属（Scaevola）を識別する重要な特徴として一般に受け入れられている。例えば、商業生産におけるスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）品種は全て、左右相称の花冠を有する。この市場は、多くの育成者及び類似の製品であふれている。花の形態に多様性が欠如していることが、この観賞植物カテゴリーの革新を制限する１つの重要な要因である。

そのため、特徴的な花の形態を備えるクサトベラ属（Scaevola）植物及びそれらの生産方法を提供することが有益となり得る。

本発明の目的は、先行技術の欠陥の１つ若しくは複数を解消するクサトベラ属（Scaevola）植物、及びそれらの生産方法を提供すること、及び／又は少なくとも、有用な選択を人々に提供することである。

本発明は、放射相称、又はほぼ放射相称配置の花弁を有する花を生産するクサトベラ属（Scaevola）植物を提供する。このユニークな花表現型は、背側で開裂する花筒の部分的融合から、完全な融合までの結果である。加えて、これらの花は、遅延型老化も示す。本出願人は、綿密な先行技術の調査を実施した後、この表現型を呈示する他の商業的栽培品種又は野生型クサトベラ属（Scaevola）植物を一切認識していない。

さらに、本出願人は、新規表現型の遺伝的決定基の特性を明らかにし、これをＦＵＳＥＤアレルと名付けた。本出願人は、クサトベラ属（Scaevola）CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子の破壊(disruption)に関連する、ＦＵＳＥＤアレルの分子基礎を解明した。本発明のさらなる態様及び実施形態は、この解明に基づいている。

本発明はまた、植物部分及び零余子(propagule)（種子など）並びにこうした植物及び種子の生産のための方法も提供する。

新規の花表現型を有する植物
第１の態様では、本発明は、以下：
ａ）融合した、又は一部融合した背側開裂、
ｂ）花弁の放射相称、又はほぼ放射相称配置、及び
ｃ）遅延型老化
の少なくとも１つを特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産するクサトベラ属（Scaevola）植物を提供する。

一実施形態では、花表現型は、以下：
ａ）融合した、又は一部融合した背側開裂、及び
ｂ）花弁の放射相称、又はほぼ放射相称配置
の両方を特徴とする。

別の実施形態では、融合した、又は一部融合した背側開裂が、花弁の放射相称、又はほぼ放射相称配置をもたらす。

一実施形態では、花表現型は、以下：
ａ）融合した、又は一部融合した背側開裂、
ｂ）花弁の放射相称、又はほぼ放射相称配置、及び
ｃ）遅延型老化
の全てを特徴とする。

別の実施形態では、花表現型は、花当たりの花弁の数の増加を呈示しない。

別の実施形態では、花表現型は、花当たりの萼片の数の増加を呈示しない。

別の実施形態では、花表現型は、花当たりの雄蕊の数の増加を呈示しない。

別の実施形態では、花表現型は、花当たりの花弁、萼片、又は雄蕊の数の増加を呈示しない。

ＣＹＣ２タンパク質発現又は活性の低減若しくは排除
一実施形態では、植物は、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質の発現又は活性が低減若しくは排除されている。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性の低減若しくは排除によって、花表現型が得られる。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１、２及び３のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を含むアミノ酸配列を有する。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を含むアミノ酸配列を有する。

別の実施形態では、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質の発現又は活性の低減若しくは排除によって、花表現型が得られる。

一実施形態では、植物は、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するように、遺伝子操作されている。様々な遺伝子操作技術が当技術分野で公知であり、それらの例を本明細書に記載する。

一実施形態では、植物は、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するように、遺伝子編集されている。様々な遺伝子編集技術が当技術分野で公知であり、それらの例を本明細書に記載する。

さらなる実施形態では、植物は、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性の低減若しくは排除をもたらす突然変異を含む。

一実施形態では、突然変異は、自然発生突然変異である。

一実施形態では、突然変異は、人工的に誘導されたものである。

さらなる実施形態では、植物は、本質的に生物学的プロセスによって排他的に得られたものではない。

突然変異を誘導するための様々な技術が当技術分野で公知であり、それらの例を本明細書に記載する。

ＣＹＣ２遺伝子の発現の低減又は排除
一実施形態では、植物は、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子の発現又は活性が低減若しくは排除されている。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性の低減若しくは排除が、花表現型をもたらす。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子は、配列番号４〜６のいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７０％の同一性を有するコード配列を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性を有するコード配列を含む。

一実施形態では、植物は、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性を低減若しくは排除するように、遺伝子操作されている。

一実施形態では、植物は、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性を低減若しくは排除するように、遺伝子編集されている。

一実施形態では、植物は、配列番号４〜６のいずれか１つの配列の断片、又は断片の補体を含む構築物で、形質転換されている。

好ましくは、構築物は、配列番号４〜６のいずれか１つの配列に対応するか、又はそれを含む内在性配列をターゲティングするように設計される。

一実施形態では、構築物は、断片と作動可能に連結したプロモータを含む。好ましくは、プロモータは、断片に対して異種である。

一実施形態では、構築物は、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質若しくは遺伝子の発現又は活性の低減若しくは排除をもたらす。

一実施形態では、構築物は、アンチセンス構築物である。

一実施形態では、構築物は、ヘアピン構築物である。

さらなる実施形態では、構築物は、遺伝子編集構築物である。さらなる実施形態では、断片が、遺伝子編集構築物中のガイドＲＮＡをコードする。

さらなる実施形態では、植物は、ＣＹＣ遺伝子の発現又は活性の低減若しくは排除をもたらす突然変異を含む。

一実施形態では、突然変異は、ＣＹＣ２遺伝子中に未成熟終止コドンを生成する。

一実施形態では、突然変異は、ＣＹＣ２遺伝子の新たなアレルを生成する。

一実施形態では、アレルは、ヘテロ接合状態で存在する。

一実施形態では、アレルは、ホモ接合状態で存在する。

一実施形態では、アレルがヘテロ接合状態で存在する場合、植物は、植物に発生する最初のいくつかの花に花表現型を発現し、その後の花は、通常の（野生型）外観をしている。

別の実施形態では、アレルがヘテロ接合状態で存在する場合、植物は、植物に発生する最初の花、好ましくは最初の２つの花、好ましくは最初の３つの花、好ましくは最初の４つの花、好ましくは最初の５つの花に花表現型を発現し、その後の花は、通常の（野生型）外観をしている。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される全ての、又はほぼ全ての花に花表現型を発現する。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される花の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％に花表現型を発現する。

ＦＵＳＥＤアレル
一実施形態では、植物は、ＦＵＳＥＤアレルを含む。

一実施形態では、花表現型は、ＦＵＳＥＤアレルの存在によって生じる。

一実施形態では、花表現型は、ＦＵＳＥＤアレルを含む植物によって生じる。

一実施形態では、アレルがヘテロ接合状態で存在する場合、植物は、植物に発生する最初のいくつかの花に花表現型を発現し、その後の花は、通常の（野生型）外観をしている。

一実施形態において、「最初のいくつかの花」とは、植物に発生する、最初の１つ、より好ましくは最初の２つ、より好ましくは最初の３つ、より好ましくは最初の４つ、より好ましくは最初の５つ、より好ましくは最初の６つ、より好ましくは最初の７つ、より好ましくは最初の８つ、より好ましくは最初の９つ、より好ましくは最初の１０個の花を意味する。

別の実施形態では、「その後の花」は、「最初のいくつかの花」の後に発生するものである。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される全ての、又はほぼ全ての花に花表現型を発現する。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される花の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％に花表現型を発現する。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、ＣＹＣ２遺伝子のコード配列に未成熟終止コドンを含む。

一実施形態では、終止コドンは、ＦＵＳＥＤアレルからのＣＹＣ２タンパク質の生産の排除をもたらす。

別の実施形態では、終止コドンは、ＦＵＳＥＤアレルからの短縮ＣＹＣ２タンパク質の生産をもたらす。

一実施形態では、短縮ＣＹＣ２タンパク質は、完全長ＣＹＣ２タンパク質と比較して低減した活性を有する。

一実施形態では、短縮ＣＹＣ２タンパク質は、活性ではない。

一実施形態では、短縮ＣＹＣ２タンパク質は、完全長ＣＹＣ２タンパク質の機能を備えていない。

一実施形態では、短縮ＣＹＣ２タンパク質は、非機能性である。

別の実施形態では、本発明は、ＦＵＳＥＤアレルの少なくとも１つのコピーを含む植物を提供する。

一実施形態では、植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型である。

別の実施形態では、植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型である。

一実施形態では、アレルがヘテロ接合状態で存在する場合、植物は、植物に発生する最初のいくつかの花に花表現型を発現し、その後の花は、通常の（野生型）外観をしている。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される全ての、又はほぼ全ての花に花表現型を発現する。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される花の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％に花表現型を発現する。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７及び８のいずれか１つから選択される配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号８の配列を含む。

寄託された種子から生産される植物
別の実施形態では、本発明の植物は、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託された種子から生産される。

別の実施形態では、本発明は、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託された種子から生産される植物を提供する。

寄託された種子の遺伝的決定基
別の実施形態では、本発明の植物の花表現型は、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託された種子に存在する遺伝的決定基によるものである。

一実施形態では、遺伝的決定基は、ＦＵＳＥＤアレルである。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、以下：
ａ）配列番号７の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
ｂ）配列番号８の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
ｃ）配列番号２４の配列のヌクレオチド９９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在
の少なくとも１つを特徴とする。

好ましい実施形態では、アデニン（Ａ）は、対応する野生型配列中の同じ位置におけるシトシン（Ｃ）の置換である。

好ましい実施形態では：
ａ）配列番号４は、配列番号７に対応する野生型配列であり、
ｂ）配列番号５は、配列番号８に対応する野生型配列であり、
ｃ）配列番号２３は、配列番号２４に対応する野生型配列である。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７、配列番号８及び配列番号２４のいずれか１つから選択される配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号８の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号２４の配列を含む。

植物部分及び零余子
別の実施形態では、本発明は、本発明の植物の植物細胞、植物部分、零余子、切穂(cutting)、細胞培養物、組織培養物、又はカルスを提供する。

一実施形態では、組織、カルス、又は細胞は、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、葉、葯、子葉、胚軸、雌蕊、根、根端、花、種子、葉柄及び茎からなる群から選択される植物部分から生産される。

一実施形態では、植物細胞、植物部分、零余子、切穂、細胞培養物若しくは組織培養物、又はカルスは、本発明の植物を生産することができる。

一実施形態では、植物細胞、植物部分、零余子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスは、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性が低減若しくは排除されている。

一実施形態では、植物細胞、植物部分、零余子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスは、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性が低減若しくは排除されている。

一実施形態では、植物細胞、植物部分、零余子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスは、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性の低減若しくは排除を招く突然変異を有する。

一実施形態では、植物細胞、植物部分、零余子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスは、ＦＵＳＥＤアレルの少なくとも１つのコピーを含む。

一実施形態では、本発明は、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物、その植物細胞、植物部分、零余子、種子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスを提供し、ここで、植物、植物細胞、植物部分、零余子、種子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスは、ＦＵＳＥＤアレルを含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、ヘテロ接合状態である。

別の実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、ホモ接合状態である。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、以下：
ｄ）配列番号７の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
ｅ）配列番号８の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
ｆ）配列番号２４の配列のヌクレオチド９９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在
の少なくとも１つを特徴とする。

好ましい実施形態では、アデニン（Ａ）は、対応する野生型配列中の同じ位置におけるシトシン（Ｃ）の置換である。

好ましい実施形態では：
ｄ）配列番号４は、配列番号７に対応する野生型配列であり、
ｅ）配列番号５は、配列番号８に対応する野生型配列であり、
ｆ）配列番号２３は、配列番号２４に対応する野生型配列である。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７、配列番号８及び配列番号２４のいずれか１つから選択される配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号８の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号２４の配列を含む。

種子
一実施形態では、零余子は、種子である。

別の実施形態では、本発明は、本発明の植物を発生することができる種子を提供する。

一実施形態では、種子は、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託された種子から発生する植物により生産される。

別の実施形態では、本発明は、以下：
ａ）融合した、又は一部融合した背側開裂、
ｂ）花弁の放射相称、又はほぼ放射相称配置、及び
ｃ）遅延型老化
の少なくとも１つを特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産する少なくとも１つの劣性突然変異型アレルを含む、クサトベラ属（Scaevola）植物を提供し、
ここで、前記花を生産する突然変異型アレルを含むクサトベラ属（Scaevola）植物の代表的な種子のサンプルは、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託されている。

一実施形態では、花表現型は、突然変異型アレルの存在により賦与される。

別の実施形態では、突然変異型アレルは、本明細書に記載のＦＵＳＥＤアレルである。

別の実施形態では、本発明は、以下：
ａ）融合した、又は一部融合した背側開裂、
ｂ）花弁の放射相称、又はほぼ放射相称配置、及び
ｃ）遅延型老化
の少なくとも１つを特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産する、クサトベラ属（Scaevola）植物を提供し、
ここで、クサトベラ属（Scaevola）植物は、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９でＮＣＩＭＢに寄託されている種子から生長した植物由来の花表現型の遺伝子侵入によって得られる。

一実施形態では、植物は、花表現型について選択されている。

別の実施形態では、花表現型は、劣性突然変異型アレルの存在により賦与される。

別の実施形態では、突然変異型アレルは、本明細書に記載のＦＵＳＥＤアレルである。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、以下：
ｇ）配列番号７の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
ｈ）配列番号８の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
ｉ）配列番号２４の配列のヌクレオチド９９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在
の少なくとも１つを特徴とする。

好ましい実施形態では、アデニン（Ａ）は、対応する野生型配列中の同じ位置におけるシトシン（Ｃ）の置換である。

好ましい実施形態では：
ｇ）配列番号４は、配列番号７に対応する野生型配列であり、
ｈ）配列番号５は、配列番号８に対応する野生型配列であり、
ｉ）配列番号２３は、配列番号２４に対応する野生型配列である。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７、配列番号８及び配列番号２４のいずれか１つから選択される配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号８の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号２４の配列を含む。

新規花表現型を有するクサトベラ属（Scaevola）植物を生産する方法
別の態様において、本発明は、花表現型を有する少なくとも１つの花を含む、本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物を生産する方法を提供する。

ＣＹＣ２タンパク質発現又は活性の低減若しくは排除
一実施形態では、本方法は、植物におけるＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するステップを含む。

別の実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性の低減若しくは排除は、花表現型をもたらす。

一実施形態では、本方法は、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するように、植物を遺伝子操作するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するように、植物を遺伝子編集するステップを含む。

別の実施形態では、本方法は、ＣＹＣ２タンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するように、植物に突然変異を誘導するステップを含む。

ＣＹＣ２遺伝子発現又は活性の低減若しくは排除
一実施形態では、本方法は、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性を低減若しくは排除するステップを含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子は、配列番号４〜６のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７０％の同一性を有するコード配列を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７０％の同一性を有するコード配列を含む。

別の実施形態では、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性の低減若しくは排除が、花表現型をもたらす。

一実施形態では、本方法は、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性を低減若しくは排除するように、植物を遺伝子操作するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、ＣＹＣ２遺伝子の発現又は活性を低減若しくは排除するように、植物を遺伝子編集するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、配列番号４〜６のいずれか１つの配列の断片、又は断片の補体を含む構築物で、植物を形質転換するステップを含む。

好ましくは、構築物は、配列番号４〜６のいずれか１つの配列に対応するか、又はそれを含む内在性配列をターゲティングするように設計される。

一実施形態では、構築物は、断片と作動可能に連結したプロモータを含む。好ましくは、プロモータは、断片に対して異種である。

一実施形態では、構築物による植物の形質転換は、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質若しくは遺伝子の発現又は活性の低減若しくは排除をもたらす。

一実施形態では、構築物は、アンチセンス構築物である。

一実施形態では、構築物は、ヘアピン構築物である。

別の実施形態では、構築物は、遺伝子編集構築物である。別の実施形態では、断片が、遺伝子編集構築物中のガイドＲＮＡをコードする。

別の実施形態では、本方法は、ＣＹＣ遺伝子の発現又は活性を低減若しくは排除するように、植物に突然変異を誘導するステップを含む。

一実施形態では、突然変異は、ＣＹＣ２遺伝子中に未成熟終止コドンを生成する。

一実施形態では、突然変異は、ＣＹＣ２遺伝子の新たなアレルを生成する。

一実施形態では、アレルは、ヘテロ接合状態で存在する。

別の実施形態では、アレルは、ホモ接合状態で存在する。

一実施形態では、アレルがヘテロ接合状態で存在する場合、植物は、植物に発生する最初のいくつかの花に花表現型を発現し、その後の花は、通常の（野生型）外観をしている。

別の実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される全ての、又はほぼ全ての花に花表現型を発現する。

一実施形態では、「ほぼ全て」とは、生産される花の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％を意味する。

従って、一実施形態では、アレルがホモ接合状態で存在する場合、植物は、生産される花の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％に、花表現型を発現する。

本発明の植物を生産するための交配
一実施形態では、本方法は、花表現型を有する少なくとも１つの花を含むクサトベラ属（Scaevola）植物を生産するように、本発明の植物を別の植物と交配させるステップを含む。

一実施形態では、他の植物も、本発明の植物であってもよい。

別の実施形態では、以下：
ａ）ＣＹＣ２タンパク質発現又は活性の低減若しくは排除、
ｂ）ＣＹＣ２遺伝子発現又は活性の低減若しくは排除、
ｃ）ＣＹＣ２遺伝子発現を破壊する突然変異の存在、及び
ｄ）ＦＵＳＥＤアレルの存在
の少なくとも１つについて、交配の子孫を試験するステップを含み、
ここで、ａ）〜ｄ）のいずれか１つは、植物が、花表現型を有する少なくとも１つの花を生産することを示す。

本発明の植物の自家受粉
一実施形態では、本方法は、本発明の植物を自家受粉させるステップを含む。

別の実施形態では、本方法は、以下：
ａ）ＣＹＣ２タンパク質発現又は活性の低減若しくは排除、
ｂ）ＣＹＣ２遺伝子発現又は活性の低減若しくは排除、
ｃ）ＣＹＣ２遺伝子発現を破壊する突然変異の存在、及び
ｄ）ＦＵＳＥＤアレルの存在
の少なくとも１つについて、自家受粉の子孫を試験するステップを含み、
ここで、ａ）〜ｄ）のいずれか１つは、植物が、花表現型を有する少なくとも１つの花を生産することを示す。

ＦＵＳＥＤアレルの導入
一実施形態では、本方法は、花表現型を有する少なくとも１つの花を含む本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物を生産するように、ＦＵＳＥＤアレルを植物に導入するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、ＦＵＳＥＤアレルを含む本発明の植物を生産するように、ＦＵＳＥＤアレルを含む第１の植物を第２の植物と交配させることを含む。

一実施形態では、第１の植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型である。

別の実施形態では、第１の植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型である。

一実施形態では、第２の植物は、ＦＵＳＥＤアレルを含まない。

別の実施形態では、第２の植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型である。

別の実施形態では、第２の植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型である。

別の実施形態では、交配から得られた本発明の植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型である。

別の実施形態では、交配から得られた本発明の植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型である。

別の実施形態では、本方法は、交配から得られた本発明の植物中にＦＵＳＥＤアレルの存在を検出するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、ヘテロ接合状態のＦＵＳＥＤアレルの存在を検出するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、ホモ接合状態のＦＵＳＥＤアレルの存在を検出するステップを含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法によって検出される。

別の実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、切断増幅多型配列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)（ＣＡＰＳ）分子マーカシステムを用いて検出される。

栄養繋殖
別の実施形態では、本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物を栄養繋殖させることにより、植物を生産する。

一実施形態では、栄養繋殖方法は、以下：（ａ）本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物から繋殖させることができる組織を収集するステップ；（ｂ）前記組織を栽培して、繋殖したシュートを取得するステップ；（ｃ）前記繋殖したシュートを根付かせて、根付いた小植物(plantlet)を取得するステップを含む。

別の実施形態では、本発明は、ＦＵＳＥＤアレルを含む植物によって、花弁の放射相称配置を特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産するクサトベラ属（Scaevola）植物を生産する方法を提供し、ここで、本発明は、以下：
ａ）植物中にＦＵＳＥＤアレルを生成するように、植物を遺伝子操作すること、
ｂ）植物中にＦＵＳＥＤアレルを生成するように、植物を遺伝子編集すること、
ｃ）植物中にＦＵＳＥＤアレルを生成する突然変異を誘導すること、
ｄ）本発明の植物を別の植物と交配させること、
ｅ）本発明の植物を自家受粉させること、及び
ｆ）ＦＵＳＥＤアレルを植物に導入すること
の少なくとも１つを含む。

一実施形態では、本方法は、ＦＵＳＥＤアレルの存在について、生産された植物を試験するステップを含む。

本発明の方法により生産される植物
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法により生産される植物を提供する。

種子を生産する方法
別の態様では、本発明は、クサトベラ属（Scaevola）種子を生産する方法を提供し、本方法は、本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物を栽培して、得られた種子を回収するステップを含む。

別の態様では、本発明は、クサトベラ属（Scaevola）種子を生産する方法を提供し、本方法は、本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物を別のクサトベラ属（Scaevola）植物と交配させて、得られた種子を回収するステップを含む。

別の態様では、本発明は、クサトベラ属（Scaevola）種子を生産する方法を提供し、本方法は、本発明のクサトベラ属（Scaevola）植物を自家受粉させて、得られた種子を回収することを含む。

一実施形態では、本発明の植物は、ＦＵＳＥＤアレルを含む。

別の実施形態では、生産された種子は、ＦＵＳＥＤアレルを含む。

マーカ支援選択
別の態様では、本発明は、本発明の花表現型を示す遺伝子型を有するクサトベラ属（Scaevola）植物を識別する方法を提供し、本方法は、以下：
ａ）ＣＹＣ２タンパク質発現又は活性の低減若しくは排除、
ｂ）ＣＹＣ２遺伝子発現又は活性の低減若しくは排除、
ｃ）ＣＹＣ２遺伝子発現を破壊する突然変異の存在、
ｄ）ＦＵＳＥＤアレルの存在、及び
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれかに関連するマーカの存在
の少なくとも１つについて、植物を試験することを含み、
ここで、ａ）〜ｅ）のいずれか１つは、植物が、花表現型を有する少なくとも１つの花を生産することを示す。

クサトベラ属（Scaevola）植物において、以下：
ａ）ＣＹＣ２タンパク質発現又は活性の低減若しくは排除、
ｂ）ＣＹＣ２遺伝子発現又は活性の低減若しくは排除、
ｃ）ＣＹＣ２遺伝子発現を破壊する突然変異の存在、
ｄ）ＦＵＳＥＤアレルの存在、及び
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれかに関連するマーカの存在
の少なくとも１つを検出する方法。

一実施形態では、ａ）〜ｅ）のいずれか１つの検出は、植物が、本発明の花表現型を有する少なくとも１つの花を生産することを示す。

マーカ
別の態様では、本発明は、本発明の花表現型に関連するマーカを提供する。

別の実施形態では、マーカを用いて、本発明のＦＵＳＥＤアレルを検出することができる。

別の実施形態では、マーカを用いて、ＦＵＳＥＤアレルを含む植物と、含まない植物とを識別することができる。

別の実施形態では、マーカは、以下：
ａ）配列番号７又は８のヌクレオチド３９に相当する位置にアデニン（Ａ）を含む配列番号７又は８の配列の断片、
ｂ）ａ）の断片の補体、
ｃ）配列番号２４のヌクレオチド位置９９に相当する位置にアデニン（Ａ）を含む配列番号２４の配列の断片、
ｄ）ｃ）の断片の補体
の少なくとも１つを含む。

別の態様では、本発明は、本発明のＦＵＳＥＤアレルに関連するマーカを提供する。

好ましくは、マーカは、少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．４、より好ましくは少なくとも０．５のＤ’値で、ＦＵＳＥＤアレルと連鎖不均衡（ＬＤ）にある。

好ましくは、マーカは、少なくとも０．０５、より好ましくは少なくとも０．０７５、より好ましくは少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．４、より好ましくは少なくとも０．５のＲ^２値で、ＦＵＳＥＤアレルとＬＤにある。

種子から植物への栽培
別の実施形態は、本発明の種子を植え、栽培して、本発明の植物を生産することに関する。

一実施形態では、生産された植物は、ＦＵＳＥＤアレルの少なくとも１つのコピーを含む。

別の実施形態では、植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型である。

別の実施形態では、植物は、ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型である。

別の実施形態では、本発明は、本発明の方法により生産される植物を提供する。

発明の詳細な説明
本出願人は、その育種プログラムにおいて、新規の花表現型を有する花を生産する新規のクサトベラ属（Scaevola）植物を生産した。この表現型は、放射相称、又はほぼ放射相称配置の花弁を特徴とする。理論に縛られることは望まないが、本出願人は、この花弁の配列が、これらの花の花筒の融合又は部分的融合によるものであると考える。加えて、本出願人は、驚くことに、記載される花表現型を有する花が、さらに、野生型花と比較して遅延型老化も示すことも明らかにした。

本出願人は、新規の表現型が、ＦＵＳＥＤアレルと名付けた突然変異型劣性アレルにより制御されることを示した。本出願人は、さらに、ＦＵＳＥＤアレルの分子基礎も解明した。具体的には、本出願人は、ＦＵＳＥＤアレルが、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子のコード配列中の未成熟の終止コドンを特徴とすることを明らかにした。当業者であれば、クサトベラ属（Scaevola）のCYCLOIDEA2遺伝子／タンパク質に他の欠失又は破壊があれば、放射状の花の相称の同じ表現型発現を引き起こすことになると予想するであろう。本発明の様々な態様及び実施形態は、この解明に基づく。

花筒
クサトベラ属（Scaevola）花の花筒は、子房上方から花冠の基部まで延び、クサトベラ属（Scaevola）の全ての種で、これは背側開裂を有する。

背側開裂
本明細書で使用される場合、「背側開裂」という用語は、背側花弁の間のクサトベラ属（Scaevola）花の花筒において、花冠の端縁から子房に向かって延びる開口部を指す。

融合した背側開裂
本発明によれば、クサトベラ属（Scaevola）花の背側開裂が、融合しているか、又は一部融合している場合、これによって、それぞれ、放射相称、又は部分的な放射相称を特徴とする本発明の花表現型が得られる。

好ましい実施形態では、背側開裂は、融合している。

好ましい実施形態では、本発明の花表現型は、放射相称を特徴とする。

放射相称
放射相称花、又は放射相称を有する花は、複数の対称中心線を有する。

一実施形態では、本明細書で使用される放射相称は、CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子若しくはタンパク質の発現又は活性の低減若しくは排除によってもたらされるクサトベラ属（Scaevola）花の花弁の表現型配列である。

一実施形態では、本明細書で使用される放射相称は、ＦＵＳＥＤアレルの存在によってもたらされるクサトベラ属（Scaevola）花の花弁の表現型配列である。

背側開裂の部分的融合及び部分的放射相称
一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがホモ接合状態である場合、花表現型は、完全に融合した背側開裂を特徴とする。好ましくは、ＦＵＳＥＤアレルがホモ接合状態である場合、ほぼ全ての花がこの表現型を呈示する。好ましくは、ＦＵＳＥＤアレルがホモ接合状態である場合、全ての花がこの表現型を呈示する。

一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがホモ接合状態である場合、花表現型は、完全な放射相称を特徴とする。好ましくは、ＦＵＳＥＤアレルがホモ接合状態である場合、ほぼ全ての花がこの表現型を呈示する。好ましくは、ＦＵＳＥＤアレルがホモ接合状態である場合、全ての花がこの表現型を呈示する。

一部の実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがヘテロ接合状態である場合、花表現型は、一部融合した背側開裂を特徴とする。一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがヘテロ接合状態である場合、１つ又は複数の花が、この表現型を呈示する。一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがヘテロ接合状態である場合、最初のいくつかの花が、完全に融合した背側開裂を呈示し、その後の花は、一部融合した背側開裂を呈示する。

一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがヘテロ接合状態である場合、花表現型は、部分的放射相称を特徴とする。一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがヘテロ接合状態である場合、１つ又は複数の花が、この表現型を呈示する。一実施形態において、ＦＵＳＥＤアレルがヘテロ接合状態である場合、最初のいくつかの花が、完全な放射相称を呈示し、その後の花は、部分的放射相称を呈示する。

遅延型老化
本出願人は、本発明の放射相称花が、通常のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）花と比較して、遅延型老化を有することを示した。通常のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）花は、他花受粉から２４時間以内に老化する。本出願人は、本発明の花が、老化まで実質的により長時間にわたって持続することを示しており、これは、放射相称花の構造によるものであると主張する。具体的には、本出願人は、ユニークな花冠構造が、柱頭及び花粉への送粉者の進入を制限し、これによって他花受粉の機会を低減し、また、それにより製品の貯蔵寿命を延長すると主張する。この予想外の利点は、商業的観点から望ましいものである。

一実施形態では、本発明の花表現型を有する花の老化は、対照植物のそれと比較して、少なくとも３時間、好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１８時間、より好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも３６時間、より好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも６０時間、より好ましくは少なくとも７２時間、より好ましくは少なくとも８４時間、より好ましくは少なくとも９６時間、より好ましくは少なくとも１０８時間、１２０時間遅延される。

CYCLOIDEA（ＣＹＣ）
用語CYCLOIDEA及び略語ＣＹＣは、ＴＣＰファミリーに属し、左右相称花の花冠及び雄蘂群において背側同一性を明示する上で特定の役割を果たす転写因子遺伝子ファミリーメンバーを指す（Han, J., 2018. PhD Thesis: Duplications and expression of CYCLOIDEA-like genes in Goodeniaceae, St. John’s University, New York；Fambrini, M, Salvini, M, Basile, A, and Pugliesi, C. 2014. Transposon-dependent induction of Vincent van Gogh’s sunflowers: Exceptions revealed, Genesis 52:315-327）。

CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質
一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質は、配列番号１、２及び３又はその変異体のいずれか１つから選択される配列を有する。

好ましくは、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質は、配列番号１、２及び３のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を含む配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質は、配列番号１、又はその変異体の配列を有する。

好ましくは、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質は、配列番号１のタンパク質に対して少なくとも７０％の同一性を含む配列を有する。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、Chen, J., Shen, C, Guo, Y and Rao, G 2018, Patterning the Asteraceae capitulum: Duplications and differential expression of the flower symmetry CYC2-like genes. Frontiers in Plant Science, April 25, Volume 9, Article 551に記載されるように、モチーフ１〜１４の全てを含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、Chen, et al. 2018に記載されるように、モチーフ１、２及び４の全てを含む。これらのモチーフは、著者により記載される通り、キク目（Asterales）由来の全てのＣＹＣ２様タンパク質に存在する。

本出願人は、Chen, et al., 2018に記載のように、モチーフ１、３及び４に対応する、クサトベラ属（Scaevola）配列中のモチーフを同定した。

これらのモチーフは、配列の概要にまとめられ、図１４に表示される。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号９〜１４のいずれか１つから選択される配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号９の配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１０の配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１１の配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１２の配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１３の配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１４の配列を有するモチーフ１を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１５〜１９のいずれか１つから選択される配列を有するモチーフ２を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１５の配列を有するモチーフ２を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１６の配列を有するモチーフ２を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１７の配列を有するモチーフ２を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１８の配列を有するモチーフ２を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号１９の配列を有するモチーフ２を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号２０〜２２のいずれか１つから選択される配列を有するモチーフ４を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号２０の配列を有するモチーフ４を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号２１の配列を有するモチーフ４を含む。

一実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、配列番号２２の配列を有するモチーフ４を含む。

さらなる実施形態では、ＣＹＣ２タンパク質は、上記のものから選択されるモチーフ１、モチーフ２及びモチーフ４を含む。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質は、配列番号１、２及び３のいずれか１つから選択される配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）タンパク質は、配列番号１の配列を有する。

CYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）ＤＮＡ
一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号４、５及び６又はその変異体のいずれか１つから選択される配列を有する。

好ましくは、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号４、５及び６のいずれか１つから選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号４、又はその変異体の配列を有する。

好ましくは、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号４の配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号５、又はその変異体の配列を有する。

好ましくは、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号６、又はその変異体の配列を有する。

好ましくは、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号６の配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号４の配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号５の配列を有する。

一実施形態では、本発明のCYCLOIDEA2（ＣＹＣ２）遺伝子は、配列番号５の配列を有する。

ＦＵＳＥＤアレル
一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、ＣＹＣ２遺伝子のコード配列中の突然変異を特徴とする。

別の実施形態では、終止コドンによって、短縮ＣＹＣ２タンパク質の生産がもたらされる。

別の実施形態では、終止コドンは、ＣＹＣ２タンパク質の生産を排除する。

別の実施形態では、終止コドンは、ＣＹＣ２タンパク質の活性を排除する。

別の実施形態では、配列番号４のヌクレオチド位置３９に対応する位置におけるシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への置換によって、未成熟終止コドンが生成される。

別の実施形態では、終止コドンは、配列番号４における、それぞれ、ヌクレオチド位置３７、３８及び３９に対応する位置におけるチミジン、アデニン、アデニン（ＴＡＡ）終止コドンであり、ここで、第２のアデニン（Ａ）は、配列番号４におけるヌクレオチド位置３９に対応する位置におけるシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への置換によって生成される。

別の実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号４のヌクレオチド位置３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在を特徴とする。

別の実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルの配列は、図９に表示される通りである。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７、８及び２４から選択される配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号７の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号８の配列を含む。

一実施形態では、ＦＵＳＥＤアレルは、配列番号２４の配列を含む。

アレルを同定する方法
多型及び突然変異の存在を検出する方法は、当業者には周知である。こうした方法として、ＤＮＡシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法、アレル特異的ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションに基づく方法、オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション、制限断片長多型及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイが挙げられる（Ibrahim, A, Bakir, M, Khan, H and Shobrak, M. 2010, A Brief Review of Molecular Techniques to Assess Plant Diversity, International Journal of Molecular Sciences 11(5): 2079-2096。

ＣＡＰＳ法
Cleaved Amplified Polymorphic Sequences（ＣＡＰＳ）多型は、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより生成されるＰＣＲアンプリコン中の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成する又は消失させる突然変異に起因する制限断片長さの相違である。

本発明によれば、ＣＡＰＳ分子マーカ系を用いて、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型又はホモ接合型の植物を、アレルを含有しない植物から識別することができる（Agarwal, M, Shrivastava, N and Padh, H. 2008. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reports 27: 617-631）。

マーカ支援選択
マーカ支援選択（ＭＡＳ）は、特定の形質を備える植物を、その形質に関連する１つ又は複数の遺伝子マーカを用いて識別するのに度々使用するアプローチである。ＭＡＳは、育成者が、若芽期の植物を識別及び選択することを可能にすると考えられ、とりわけ、若芽期で測定することが難しい形質に関して役立つ。ＭＡＳについて最良のマーカは、原因となる突然変異であるが、それらが利用できない場合には、原因となる突然変異と強度の連鎖不均衡にあるマーカを使用することもできる。こうした情報を用いて、遺伝子獲得量を加速するか、又は形質測定コストを削減することができるため、そうした情報は、商業的育種プログラムに有用である。

マーカ支援選択方法は、当業者には周知であり、例えば、以下のものがある：（Collard, B.C.Y. and D.J. Mackill, 2008. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363(1491): p. 557-572.）。

マーカ
本発明の方法で使用されるマーカは、核酸マーカ、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、単純配列反復（ＳＳＲ又はマイクロサテライト）、挿入、置換、インデル及び欠失を含んでもよい。好ましくは、マーカは、花表現型と連鎖不均衡（ＬＤ）にある。

好ましくは、マーカは、少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．４、より好ましくは少なくとも０．５のＤ’値で、花表現型とＬＤにある。

好ましくは、マーカは、少なくとも０．０５、より好ましくは少なくとも０．０７５、より好ましくは少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．４、より好ましくは少なくとも０．５のＲ^２値で、花表現型とＬＤにある。

本明細書で用いられる用語「連鎖不均衡」又はＬＤは、２つの独立した遺伝子マーカの関連又は共起の強度の派生統計的尺度を指す。様々な統計方法を使用して、２つのマーカ間の連鎖不均衡（ＬＤ）を要約することができるが、実際には、Ｄ’及びＲ^２と呼ばれる２つだけが広く使用されている。

形質と関連するマーカは、任意のタイプのものであってよく、限定されないが、ＳＮＰ、置換、挿入、欠失、インデル又は単純配列反復（ＳＳＲ）が挙げられる。

クサトベラ属（Scaevola）
クサトベラ属（Scaevola）植物は、クサトベラ科（Goodeniaceae）に属する。クサトベラ科（Goodeniaceae）には、１２の承認された属と約４２０の種がある（Carolin R.C., Rajput M.T.M., Morrison P. Goodeniaceae. In: George AS, editor, Flora of Australia Volume 35. Canberra: Australian Government Publishing Service; 1992. pp. 4-300）。クサトベラ属（Scaevola）は、１２の属の１つであり、現在のところ約１００の種がこの属に列記されている。

一実施形態では、クサトベラ属（Scaevola）植物は、以下の種のいずれか１つから選択される：スカエボラ・アカシオイデス（Scaevola acacioides）、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）、スカエボラ・アルビダ（Scaevola albida）、スカエボラ・アンブリアンテラ（Scaevola amblyanthera）、スカエボラ・アンクシフォリア（Scaevola anchusifolia）、スカエボラ・アングラタ（Scaevola angulata）、スカエボラ・アングスタタ（Scaevola angustata）、スカエボラ・アルケリアナ（Scaevola archeriana）、スカエボラ・アルゲンテア（Scaevola argentea）、スカエボラ・アウリクラタ（Scaevola auriculata）、スカエボラ・バランサエ（Scaevola balansae）、スカエボラ・バラジュペンシス（Scaevola ballajupensis）、スカエボラ・バセドウィイ（Scaevola basedowii）、スカエボラ・ベキイ（Scaevola beckii）、スカエボラ・ブルーケアナ（Scaevola brookeana）、スカエボラ・ブロウィアナ（Scaevola browniana）、スカエボラ・ブルサリイフォリア（Scaevola bursariifolia）、スカエボラ・カレヅラセア（Scaevola calendulacea）、スカエボラ・カリプテラ（Scaevola calliptera）、スカエボラ・カネセンス（Scaevola canescens）、スカエボラ・カミソニアナ（Scaevola chamissoniana）、スカエボラ・カニイ（Scaevola chanii）、スカエボラ・クリソポゴン（Scaevola chrysopogon）、スカエボラ・コクシネア（Scaevola coccinea）、スカエボラ・コラリス（Scaevola collaris）、スカエボラ・コリナ（Scaevola collina）、スカエボラ・コリアセア（Scaevola coriacea）、スカエボラ・クラッシフォリア（Scaevola crassifolia）、スカエボラ・クネイフォルミス（Scaevola cuneiformis）、スカエボラ・カニングハミイ（Scaevola cunninghamii）、スカエボラ・シリンドリカ（Scaevola cylindrica）、スカエボラ・デンシフォリア（Scaevola densifolia）、スカエボラ・エナントフィラ（Scaevola enantophylla）、スカエボラ・エネアッバ（Scaevola eneabba）、スカエボラ・フロリブンダ（Scaevola floribunda）、スカエボラ・ガウディカウディアナ（Scaevola gaudichaudiana）、スカエボラ・ガウディカウディイ（Scaevola gaudichaudii）、スカエボラ・グラブラ（Scaevola glabra）、スカエボラ・グラブラタ（Scaevola glabrata）、スカエボラ・グランヅリフェラ（Scaevola glandulifera）、スカエボラ・グロボサ（Scaevola globosa）、スカエボラ・グロブリフェラ（Scaevola globulifera）、スカエボラ・グルティノサ（Scaevola glutinosa）、スカエボラ・グラシリス（Scaevola gracilis）、スカエボラ・グラミネア（Scaevola graminea）、スカエボラ・ハイナネンシス（Scaevola hainanensis）、スカエボラ・ハミルトニイ（Scaevola hamiltonii）、スカエボラ・ホブディイ（Scaevola hobdyi）、スカエボラ・フーケリ（Scaevola hookeri）、スカエボラ・フミフサ（Scaevola humifusa）、スカエボラ・フミリス（Scaevola humilis）、スカエボラ・カロフィラ（Scaevola kallophylla）、スカエボラ・キラウエアエ（Scaevola kilaueae）、スカエボラ・ラシニアタ（Scaevola laciniata）、スカエボラ・ランセオラタ（Scaevola lanceolata）、スカエボラ・リネアリス（Scaevola linearis）、スカエボラ・マクロフィラ（Scaevola macrophylla）、スカエボラ・マクロスタキア（Scaevola macrostachya）、スカエボラ・ミクロフィラ（Scaevola microphylla）、スカエボラ・ミクランタ（Scaevola micrantha）、スカエボラ・モリス（Scaevola mollis）、スカエボラ・モンタナ（Scaevola montana）、スカエボラ・ムルエンシス（Scaevola muluensis）、スカエボラ・ミルティフォリア（Scaevola myrtifolia）、スカエボラ・ニティダ（Scaevola nitida）、スカエボラ・ヌビゲナ（Scaevola nubigena）、スカエボラ・オボバタ（Scaevola obovata）、スカエボラ・オールドフィールディイ（Scaevola oldfieldii）、スカエボラ・オポジティフォリア（Scaevola oppositifolia）、スカエボラ・オバリフォリア（Scaevola ovalifolia）、スカエボラ・オキシクロナ（Scaevola oxyclona）、スカエボラ・ポルドーサ（Scaevola paludosa）、スカエボラ・パルビバルバタ（Scaevola parvibarbata）、スカエボラ・パルビフローラ（Scaevola parviflora）、スカエボラ・パルビフォリア（Scaevola parvifolia）、スカエボラ・フレボペタラ（Scaevola phlebopetala）、スカエボラ・ピローサ（Scaevola pilosa）、スカエボラ・プラティフィラ（Scaevola platyphylla）、スカエボラ・プルミエリ（Scaevola plumieri）、スカエボラ・ポロカリア（Scaevola porocarya）、スカエボラ・プロセラ（Scaevola procera）、スカエボラ・プルケラ（Scaevola pulchella）、スカエボラ・プルビナリス（Scaevola pulvinaris）、スカエボラ・ラモシシマ（Scaevola ramosissima）、スカエボラ・レペンス（Scaevola repens）、スカエボラ・レスチアセア（Scaevola restiacea）、スカエボラ・レボルタ（Scaevola revoluta）、スカエボラ・セリコフィラ（Scaevola sericophylla）、スカエボラ・ソコトラエンシス（Scaevola socotraensis）、スカエボラ・スピシゲラ（Scaevola spicigera）、スカエボラ・スピネセンス（Scaevola spinescens）、スカエボラ・ストリアータ（Scaevola striata）、スカエボラ・サブカピタータ（Scaevola subcapitata）、スカエボラ・タッカダ（Scaevola taccada）、スカエボラ・タヒテンシス（Scaevola tahitensis）、スカエボラ・テヌイフォリア（Scaevola tenuifolia）、スカエボラ・テシオイデス（Scaevola thesioides）、スカエボラ・トメントーサ（Scaevola tomentosa）、スカエボラ・トルツオーサ（Scaevola tortuosa）、スカエボラ・ベルティシラータ（Scaevola verticillata）、スカエボラ・ビルガータ（Scaevola virgata）、スカエボラ・ライティイ（Scaevola wrightii）。別の実施形態では、クサトベラ属（Scaevola）植物は、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）種のものである。別の実施形態では、クサトベラ属（Scaevola）植物は、上に挙げた種のいずれかのハイブリッドである。

クサトベラ属（Scaevola）の栽培及び植物の組織培養
スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）受粉及び種子発芽の方法は、当技術分野で公知である（Sweeney, K 1999. Application of in vitro breeding techniques for the improvement of the Australian native fan flower, Scaevola. Masters’ thesis, University of Melbourne；Howell, G. J. 1995. Reproductive biology and horticultural development of Scaevola. PhD thesis University of Melbourne；Luo, S, 2005. Genetic variation and interspecific hybridisation in the genus Scaevola. PhD thesis, University of Sydney, p69 and p72）。スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物は、容易に栽培することができ（Scaevola. Hamrick, D (Ed), 2003 Ball red Book, Volume 2, Ball Publishing）、組織培養しやすく（Wong, C. E. and Bhalla, P. L. 2010. Chapter 22, In vitro propagation of Australian native ornamental plant Scaevola, In: Jain S.M. and Ochatt, S.J. Protocols for In vitro propagation of ornamental plants, Methods in Molecular Biology vol.589）、その栽培、維持、繋殖及び生産のための方法は、文献及び当技術分野の最新技術において公知である。こうした情報は、育成者ウェブサイト（例えば、www.suntoryflowers.com、www.danzigeronline.com、www.syngentaflowers.eu）で容易に入手可能である。

対照植物
当業者であれば、何が好適な対照植物となるかがわかるであろう。好適な対照植物は、「試験」クサトベラ属（Scaevola）植物と同じ種又はその品種のものである。好適な対照植物としては、試験植物と同じ齢又は発育段階のクサトベラ属（Scaevola）植物が挙げられる。好適な植物は、野生型植物、本発明に従って遺伝子操作されていない植物、本発明に従って遺伝子編集されていない植物、対照構築物で形質転換された植物、空のベクター構築物で形質転換された植物、本発明に従って突然変異させていない植物、並びにＦＵＳＥＤアレルを含まない植物から選択され得る。

変異体
本明細書で使用される場合、用語「変異体」は、明確に同定された配列とは異なるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を指し、ここで、１つ若しくは複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されている。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体であっても、又は天然に存在しない変異体であってもよい。変異体は、同じ又は他の種に由来するものであってもよく、ホモログ、パラログ及びオーソログを包含し得る。特定の実施形態では、本発明のポリペプチド及びポリペプチドの変異体は、本発明のポリペプチド又はポリペプチドと同じか、若しくは類似する生物活性を有する。ポリペプチド及びポリペプチドに関して、用語「変異体」は、あらゆる形態のポリペプチド及び本明細書で定義されるポリペプチドを包含する。

タンパク質変異体−同一性パーセント
ポリペプチドに関して、用語「変異体」は、天然に存在するポリペプチド、組換え及び合成により生成されたポリペプチドを包含する。変異型ポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、より好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも６２％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６４％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも２０アミノ酸位置、好ましくは少なくとも５０アミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸位置の比較ウィンドウにわたって、最も好ましくは本発明のポリペプチドの全長にわたって見出される。

ポリペプチド配列同一性は、次のように決定することができる。ワールドワイドウェブ：ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/のＮＣＢＩウェブサイトから一般に入手可能なbl2seqのＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴプログラム集、バージョン２．２．５[Nov 2002]から）を用いて、対象ポリペプチド配列を候補ポリペプチド配列と比較する。低複雑性領域のフィルタリングをオフにする必要がある以外は、bl2seqのデフォルトパラメータを使用する。

また、ポリペプチド配列同一性は、グローバルシーケンスアラインメントプログラムを用いて、候補及び対象ポリヌクレオチド配列同士のオーバーラップの全長にわたって計算することもできる。上に論じたように、ＥＭＢＯＳＳ−ニードル（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/から入手可能）及びＧＡＰ（Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.）も、ポリペプチド配列同一性を計算する上で好適なグローバルシーケンスアラインメントプログラムである。

ポリペプチド配列同一性％を計算するための好ましい方法は、Clustal X （Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5.）を用いた、比較対象の配列のアラインメントに基づくものである。

ＤＮＡ変異体−同一性パーセント
ポリヌクレオチドに関して、用語「変異体」は、天然に存在するポリヌクレオチド、組換え及び合成により生成されたポリヌクレオチドを包含する。変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、本発明の配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、より好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも６２％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６４％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも２０ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、最も好ましくは本発明のポリヌクレオチドの全長にわたって見出される。

ポリヌクレオチド配列同一性は、次のように決定することができる。ワールドワイドウェブ：ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/のＮＣＢＩウェブサイトから一般に入手可能なbl2seqのＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴプログラム集、バージョン２．２．５[Nov 2002]から）（Tatusova, T. and Madden, T. 1999. Blast 2 sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, Federation of European Microbiological Societies, Microbiological Letters 174(2):247-250）を用いて、対象ポリヌクレオチド配列を候補ポリヌクレオチド配列と比較する。デフォルトパラメータを使用することができる。

また、ポリヌクレオチド配列同一性は、グローバルシーケンスアラインメントプログラム（例えば、Needleman, S. and Wunsch, C. 1970. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48(3), 443-453）を用いて、候補及び対象ポリヌクレオチド配列同士のオーバーラップの全長にわたって計算することもできる。Needleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズムの完全な実装は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ内のニードルプログラム（Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. 2000. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics, 16(6): 276-277）に見出され、これは、ワールドワイドウェブ：http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/から入手することができる。また、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）サーバも、http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/で、２つの配列間のＥＭＢＯＳＳ−ニードルグローバルアラインメントをオンラインで実施する手段を提供する。

或いは、ターミナルギャップペナルティの付与なしで、２つの配列の最適なグローバルアラインメントを計算するＧＡＰプログラムを用いてもよい。ＧＡＰは、下記の論文に記載されている：Huang, X., 1994. On Global Sequence Alignment. Bioinformatics 10(3): 227-235。

ポリヌクレオチド配列同一性％を計算するための好ましい方法は、Clustal X（Jeanmougin, F, Thompson, J, Gouy, M, Higgins, D and Gibson, T. 1998.Multiple sequence alignment with Clustal X. Trends in Biochemical Sciences 23(10): 403-405.）を用いた、比較しようとする配列のアラインメントに基づくものである。

ポリヌクレオチド変異体−ハイブリダイゼーション
或いは、本発明の、又は本発明の方法で使用される変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、指定ポリヌクレオチド配列、又はその補体とハイブリダイズする。

用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」、及びその文法的同等物は、ポリヌクレオチド分子が、規定された温度及び塩濃度の条件下で、標的ポリヌクレオチド分子（例えば、サザンブロット又はノーザンブロットなどのＤＮＡ又はＲＮＡブロット上に固定化された標的ポリヌクレオチド分子）とハイブリダイズする能力を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、初めに、より低いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その後、所望のストリンジェンシーまでストリンジェンシーを高めることにより決定することができる。

長さが約１００塩基を超えるポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然の二重らせんの融点（Ｔｍ）よりたった２５〜３０℃（例えば、１０℃）低い（概要については、Sambrook, J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F, Brent, R, Kingston, R, Moore, D, Seidman, J, Smith, J, Struhl, K (Eds). 1987. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingを参照されたい）。約１００塩基を超えるポリヌクレオチド分子のＴｍは、式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）により計算することができる（Sambrook 1989；Bolton, E and McCarthy, B, 1962. A general method for the isolation of RNA complementary to DNA. Proceedings of the National Academy of Science, USA 48(8):1390-1397）。長さが約１００塩基を超えるポリヌクレオチドに典型的なストリンジェントな条件は、例えば、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液で予洗し；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで一晩ハイブリダイズした後；６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで各々３０分２回の洗浄、並びに６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで各々３０分２回の洗浄のようなハイブリダイゼーション条件である。

定義
以下の説明及び表では、多くの用語を使用する。そうした用語に付与される範囲を含め、本明細書及び特許請求の範囲の明瞭で、一貫した理解を可能にするために、以下の定義を記載する。

アクセッション．本明細書で使用される場合、アクセッションは、商業化されていない専有の個々のユニークな植物遺伝子型（品種）を表すために用いられる用語である。

放射相称．本明細書で使用される場合、放射相称は、複数の対称面を有する、放射相称花を表すために用いられる用語である。

アレル．本明細書で使用される場合、アレルという用語は、ある遺伝子の１つ又は複数の別の形態のいずれかを意味する。

無性繋殖／無性生殖．本明細書で使用される場合、無性繋殖又は無性生殖という用語は、有性生殖による種子以外のあらゆるタイプの植物繋殖を意味する。無性繋殖の例として、限定されないが、切穂、接ぎ木、株分け、アポミクシス、又は組織培養での再生が挙げられる。

戻し交配．本明細書で使用される場合、戻し交配は、育成者が、親の１つ、例えば、Ｆ_１ハイブリッドの親遺伝子型の１つを有する第１世代ハイブリッドＦ_１に、ハイブリッド子孫を繰り返し戻して交配するプロセスである。

細胞．本明細書で使用される場合、細胞は、単離されている、組織培養中である、又は植物若しくは植物部分に組み込まれているかどうかにかかわらず、植物細胞を含む。

交配．本明細書で使用される場合、交配という用語は、植物の雌花の受粉を意味し、これによって、花からの種子の生産をもたらし得る。

他花受粉．本明細書で使用される場合、他花受粉という用語は、異なる植物からの２つの配偶子の統合による受精を意味する。

切穂．本明細書で使用される場合、切穂という用語は、発根又は接ぎ木のように、新たな植物を繋殖させるために植物から取り出された、茎、葉、若しくは根など、植物を起源とする部分を意味する。

優性遺伝．本明細書で使用される場合、優性遺伝という用語は、特定の特徴又は形質の表現型が、優性アレルにより決定される遺伝様式を指す。

Ｆ_２．本明細書で使用される場合、「Ｆ_２」の符号は、第１世代、即ちＦ_１世代のメンバーの自家受粉又は同胞交配から生じた子孫を示す。

配偶子．本明細書で使用される場合、配偶子という用語は、接合子を形成するための生殖融合に参加し得る細胞又は核を意味する。

遺伝子．本明細書で使用される場合、遺伝子は、プロモータ及びターミネータなどの調節エレメントをはじめとする、内在性ゲノムＤＮＡのセグメントを指す。

遺伝子形質転換．本明細書で使用される場合、遺伝子形質転換は、遺伝子修飾された生物を作製するために、植物にポリヌクレオチドを組み込むプロセスを指す。

遺伝子修飾生物（ＧＭＯ）．本明細書で使用される場合、ＧＭＯは、遺伝子形質転換を介して遺伝的に修飾された生物である。

ヘテロ接合型．本明細書で使用される場合、ヘテロ接合型は、特定の遺伝子座の対応するアレルが異なる遺伝的構成を指す。

ホモ接合型．本明細書で使用される場合、ホモ接合型は、特定の遺伝子座の対応するアレルが同一である遺伝的構成を指す。

近親交配．本明細書で使用される場合、近親交配という用語は、遺伝的に極めて近縁の配偶子の融合による子孫の生産を指す。

花序．本明細書で使用される場合、花序という用語は、花を指す。

遺伝子座．本明細書で使用される場合、遺伝子座という用語は、染色体での遺伝子の位置又は配置である。

分子マーカ．本明細書で使用される場合、分子マーカという用語は、植物の遺伝子座及び／又は形態学的若しくは他の特徴と密接に関連するＤＮＡ配列及び／又はセグメントを指し、これによって、そうしたセグメントを分子技術により検出し、視覚化することができる。

一遺伝子遺伝．本明細書で使用される場合、一遺伝子遺伝という用語は、特定の特徴又は形質の表現型が、一遺伝子により決定される遺伝様式を指す。

突然変異アレル．本明細書で使用される場合、突然変異アレルという用語は、突然変異の作用によって生じるアレルを指す。

突然変異．本明細書で使用される場合、突然変異は、細胞のゲノムのＤＮＡ配列の変化であり、例えば、放射線又は化学物質などの突然変異原、並びにＤＮＡ複製中に自然に発生するエラーを原因とする。

通常の花．本明細書で使用される場合、「通常の」、「典型的」、「標準の」、「通常の」、「手の形状をした」、「ファン（扇）の形状をした」、「野生型」及び「従来の」花という用語は、互換的に使用され、クサトベラ属（Scaevola）野生型植物及び市販の品種を指し、これらは全て、背側開裂を有する。

遠縁交配．異系交配(outcrossing)としても知られ、本明細書では、類縁関係の遠い配偶子の融合による子孫の生産として表現される。遠縁交配は、近親交配の反対語である。

ペロリック（Peloric）植物．本明細書で使用される場合、ペロリック植物という用語は、通常、左右相称を有する種において生じる、放射状の花の相称を有する稀有な植物を意味する。

表現型．表現型という用語は、花の色、花の形態、植物サイズなど、あらゆる観察可能な植物の特性及び特徴を指す。

植物．本明細書で使用される場合、植物という用語は、種子又は葯が除去された植物を含め、未成熟又は成熟した全植物を指示するものを含む。植物を生産する種子又は胚も植物とみなされる。

植物細胞．本明細書で使用される場合、植物細胞は、単離されているか、組織培養中であるか、又は植物若しくは植物部分に組み込まれているかどうかにかかわらず、植物細胞を含む。

植物ホルモン組成物．本明細書で使用される場合、植物ホルモン組成物は、植物の生長を調節する化学物質を指す。例えば、インドール−３−酪酸、Ｎ^６−ベンジルアデニン、及びジベレリン酸。

植物部分．本明細書で使用される場合、用語「植物部分」は、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌蕊、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、シュート、組織、葉柄、細胞及び分裂組織細胞などを含む。

受粉．本明細書で使用される場合、受粉という用語は、花粉が植物内に移入され、それによって受精及び有性生殖が可能になるプロセスである。

ポリヌクレオチド．本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さの、しかし好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの一本鎖若しくは二本鎖デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的な例として、遺伝子のコード及び非コード配列、センス及びアンチセンス配列補体、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離され精製された天然のＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡ及びＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー及び断片が挙げられる。

ポリヌクレオチド断片．本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、連続したヌクレオチドの部分配列である。

好ましくは、断片は、少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１１、より好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１７、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２１、より好ましくは少なくとも２２、より好ましくは少なくとも２３、より好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも２６、より好ましくは少なくとも２７、より好ましくは少なくとも２８、より好ましくは少なくとも２９、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも４５、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。

プローブ．「プローブ」という用語は、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイにおいて、プローブと相補性であるポリヌクレオチド配列を検出するために使用される短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの「断片」から構成されていてもよい。プローブは、さらに、プローブの検出のための標識を含んでもよい。好適な標識は、当業者には周知である。

プライマー．「プライマー」という用語は、鋳型とハイブリダイズされ、標的と相補性のポリヌクレオチドの重合をプライミングするために使用される、短いポリヌクレオチドを指し、通常、遊離３’ＯＨ基を有する。プライマーは、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの「断片」から構成されていてもよい。プライマーは、さらに、プライマーの検出のための標識を含んでもよい。好適な標識は、当業者には周知である。

子孫．本明細書で使用される場合、子孫は、２つのスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物の交配から生産されるＦ_１クサトベラ属（Scaevola）植物を含む。子孫はさらに、しかし限定されないが、親との、子孫同士の、又は無関係のクサトベラ属（Scaevola）植物との交配からの、後のＦ_２、Ｆ_３、Ｆ_４、Ｆ_５、Ｆ_６、Ｆ_７、Ｆ_８、Ｆ_９等々の世代交配を含む。

劣性遺伝．本明細書で使用される場合、劣性遺伝は、特定の特徴又は形質の表現型が、劣性アレルにより決定される遺伝様式を指す。

劣性突然変異．本明細書で使用される場合、劣性突然変異の表現型は、ホモ接合型遺伝子型でしか見ることができない。

自家受粉．本明細書で使用される場合、自家受粉という用語は、植物から花粉を収集して、その花粉を同じ植物の柱頭に適用する方法を指す。

有性繋殖／有性生殖．本明細書で使用される場合、有性繋殖／有性生殖という用語は、種子からの植物の繋殖を指す。

体細胞．本明細書で使用される場合、体細胞という用語は、胞子、配偶子、又はそれらの前駆体以外の植物のあらゆる細胞である。

終止コドン．遺伝子コードには３つの終止コドン−ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡがある。ｍＲＮＡの対応するコドンは、ＵＡＧ、ＵＡＡ、及びＵＧＡである。これらのコドンは、翻訳中のポリペプチド鎖の末端をシグナル伝達する。これらのコドンはまた、これらがアミノ酸をコードしないため、ナンセンスコドン又は終結コドンとしても知られる。一実施形態では、本発明の終止コドンは、ＴＡＡであり、これは、ＲＮＡ終止コドンＵＡＡと交換可能に使用することができる。

ＴＣＰドメイン．本明細書で使用される場合、ＴＣＰドメインという用語は、植物において、複数の発生プロセスに関与し、主として細胞発生及び生長に関する転写因子（活性化及び退行）、即ち、TEOSINTE BRANCHED 1（トウモロコシ（Zea mays））、CYCLOIDEA（キンギョソウ（Antirrhinum majus））、増殖細胞因子１及び２（PROLIFERATING CELL FACTOR 1 AND 2）（イネ（Oryza sativa））タンパク質＝ＴＣＰをコードする、比較的保存されたＤＮＡ配列を指す。（Danisman, S, 2016. TCP transcription factors at the interface between environmental challenges and the plants growth responses. Frontiers in Plant Sciences, Vol 7, p1-13；Fambrini, M, Salvini, M and Pugliesi, C. 2014. Transposon-dependent induction of Vincent van Gogh’s sunflowers: Exceptions revealed, Genesis 52:315-327）。

品種．本明細書で使用される場合、植物育種分野の当業者により用いられる品種という用語は、所与の遺伝子型又は遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現により定義することができる既知の最下級の単一植物分類群内の植物分類を意味し、これは、前記特徴の少なくとも１つの発現によりいずれか他の植物分類から識別され、不変に繁殖させるその適合性に関して、１単位とみなされる（以下に定義される通り：植物の新品種の保護に関する国際条約、第１章、第１条（International convention for the protection of new varieties of plants, Chapter 1, Article 1 ）(vi) https://www.upov.int/upovlex/en/conventions/1991/act1991.html#_1）。植物の品種は、商業化され、専有ではない（「アクセッション」という用語は、商業化されていない品種を表すために用いられる）。

左右相称．本明細書で使用される場合、左右相称という用語は、単一の対称面を有する左右相称の花を意味する。

一般的分子生物学及び植物分子生物学の方法
ポリヌクレオチドを単離又は生成するための方法
本発明のポリヌクレオチドは、当業者には周知の様々な技術を用いることにより単離することができる。例として、こうしたポリペプチドは、Mullis, K, Francois, F and Gibbs, R (Eds). 1994. The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して単離することができる。本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチド配列から誘導される、本明細書に記載のようなプライマーを用いて増幅することができる。

本発明のポリヌクレオチドを単離するためのさらなる方法は、ハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書に記載される配列を有するポリペプチドの全部、又は一部を使用することを含む。ニトロセルロースフィルタ又はナイロン膜などの固体支持体に固定化したポリヌクレオチドと、標識されたポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズするこの技術を用いて、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。例示的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、以下の通りである：５．０×ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、１×デンハルト溶液中６５℃で２０時間にわたるハイブリダイゼーション；１．０×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｗ）ドデシル硫酸ナトリウム中での洗浄（５５℃で各２０分の３回洗浄）、及び任意選択で、０．５×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｗ）ドデシル硫酸ナトリウム中６０℃で１回洗浄（２０分）。０．１×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｗ）ドデシル硫酸ナトリウム中、６０℃の条件下で、任意選択の追加洗浄（２０分）を行うことができる。

本発明のポリヌクレオチド断片は、制限エンドヌクレアーゼ消化、オリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲ増幅など、当技術分野で公知の技術により生成することもできる。

部分ポリヌクレオチド配列は、対応する完全長ポリヌクレオチド配列を同定するために当技術分野で公知の方法に用いることができる。こうした方法として、ＰＣＲに基づく方法、５’ＲＡＣＥ（Frohman MA, 1995, Rapid amplification of complimentary DNA ends for generation of full length complementary DNAs: Thermal RACE. In: Recombinant DNA Methodology - Selected Methods in Enzymology p655-671, Academic Press）及びハイブリダイゼーションに基づく方法、コンピュータ／データベースに基づく方法が挙げられる。さらに、例として、インバースＰＣＲによって、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列とフランキングし、既知の領域に基づくプライマーで開始する、未知の配列の獲得が可能になる（参照により本明細書に組み込まれる、Triglia et al., 1998, A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Research 16(16), 8186）。この方法は、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域内に好適な断片を生成する。次に、分子内ライゲーションにより断片を環状化し、これをＰＣＲ鋳型として使用する。分岐プライマーを既知領域から設計する。完全長クローンを物理的にアセンブリングするために、標準的分子生物学アプローチを使用することができる（Sambrook et al., 1989）。

変異体を同定する方法
物理的方法
変異型ポリペプチドは、ＰＣＲに基づく方法（Mullis et al., 1994)）を用いて同定することができる。典型的に、ＰＣＲによる本発明のポリヌクレオチド分子の変異体を増幅するために有用なプライマーのポリヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づくものであり得る。

或いは、当業者には周知であるライブラリースクリーニング方法を使用してもよい（Sambrook et al., 1989）。プローブ配列の変異体を同定する場合、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄ストリンジェンシーは、典型的に、厳密な配列一致を検索する場合と比較して低下されることになる。

ポリペプチド変異体はまた、物理的方法、例えば、本発明のポリペプチドに対して生産させた抗体を用いて、発現ライブラリーをスクリーニングすることにより（Sambrook et al., 1989）、又はそうした抗体を用いて、天然の供給源からポリペプチドを識別することによっても同定することができる。

コンピュータに基づく方法
ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体の両方を含め、本発明の変異型配列はまた、パブリックドメイン配列アラインメントアルゴリズム及び配列データベースを検索するための配列類似性検索ツール（パブリックドメインデータベースとしては、Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIRなどがある）を用いて、当業者には周知のコンピュータに基づく方法により同定することもできる。例えば、以下を参照されたい：例えば、オンラインリソースについて、Baxevanis, A 2001. The molecular biology database collection: an updated compilation of biological database resources. Nucleic Acids Research 29(1): 1-10；Wheeler, D, Church, D, Lash, A, Leipe, D, Madden, T 2001. Database resources of the National Centre for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research 29(1): 11-16。類似性検索によって、解析しようとする配列（即ち、クエリー配列）との比較のために標的配列を検索し、アラインメントする。配列比較アルゴリズムは、スコアリングマトリックスを用いて、総合スコアをアラインメントの各々に割り当てる。

配列データベースで変異体を同定するのに有用な例示的な一群のプログラムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ及びｔＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴプログラム集（バージョン２．２．５［Nov 2002］）であり、これらは、（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から、又は米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）、米国国立医学図書館（National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894 USA）から一般に入手可能である。ＮＣＢＩはまた、他の一般に入手可能な配列データベースをスクリーニングするためのプログラムを使用する手段も提供する。ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースと比較する。ＢＬＡＳＴＸは、全てのリーディングフレーム内で翻訳されたヌクレオチドクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較する。ｔＢＬＡＳＴＮは、タンパク質クエリー配列を、全てのリーディングフレーム内で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する。ｔＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳と比較する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ドラフトパラメータと一緒に用いてもよいし、又はスクリーンを精緻化するための必要に応じて、パラメータを改変してもよい。

ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＢＬＡＳＴＸを含む、ＢＬＡＳＴアルゴリズム集の使用は、Altschul, S., Madden, T., Schaffer, A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402の刊行物に記載されている。

ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、ｔＢＬＡＳＴＸ、又は類似のアルゴリズムにより作製される問合せ配列による１つ又は複数のデータベース配列への「ヒット」によって、配列の類似部分のアラインメント及び識別が行われる。これらのヒットは、配列の類似性の程度及び配列オーバーラップの長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、一般に、問合せ配列の配列長さの一部のみにわたるオーバーラップを表す。

ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ及びｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズムはまた、アラインメントについての「期待」値を生成する。期待値（Ｅ）は、ランダムな連続配列を含む同じサイズのデータベースを検索する場合に、偶然に見出すと「予想する」ことができるヒット数を意味する。期待値は、データベースへのヒットが真の類似性を示すか否かを決定するための有意閾値として用いられる。例えば、ポリヌクレオチドヒットに割り当てられた０．１のＥ値は、選別されたデータベースのサイズのデータベースにおいて、同様のスコアを有する配列のアラインメント部分にわたって、全く偶然に０．１の一致を見出すと予想し得ることを意味すると解釈される。アラインメントされ、一致した部分にわたる０．０１以下のＥ値を有する配列の場合、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ又はｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いて、当該データベースで一致を偶然見出す確率は、１％以下である。

一群の関連配列の多重配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson, J., Higgins, D., and Gibson, T., 1994. CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680,）又はT-COFFEE（Notredame, C., Higgins, G., and Heringa, J., 2000. T-COFFEE: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, Journal of Molecular Biology 302: 205-217）又は累進的、ペアワイズアラインメント（Feng, D and Doolittle, R. 1987. Progressive sequence alignment as prerequisite to correct phylogenetic trees Journal of Molecular Evolution 25, p351-360）を使用するＰＩＬＥＵＰを用いて実施することができる。

モチーフ又はシグネチャー配列を見出すために、パターン認識ソフトウエアアプリケーションが利用可能である。例えば、ＭＥＭＥ（Multiple Em for Motif Elicitation）は、一連の配列内のモチーフとシグネチャー配列を検索し、ＭＡＳＴ（Motif Alignment and Search Tool）は、これらのモチーフを用いて、クエリー配列内の類似又は同じモチーフを識別する。ＭＡＳＴ結果は、適切な統計データとの一連のアラインメント及び見出されたモチーフの視覚的全体像として提供される。ＭＥＭＥ及びＭＡＳＴは、カリフォルニア大学（University of California, San Diego）で開発された。

ＰＲＯＳＩＴＥ（Bairoch, A and Bucher, P. 1994. PROSITE: recent developments. Nucleic Acids Research 22(17): 3583-3589；Hofmann, K., Bucher, P., Falquet, L., and Bairoch, A. 1999. The PROSITE database its status in 1999. Nucleic Acids Research 27(1): 215-219）は、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列から翻訳される非特性決定タンパク質の機能を特定するための方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（www.expasy.org/prosite）は、生物学的に重要なパターン及びプロフィールを含み、これは、適切な計算ツールと一緒に用いられて、新しい配列をタンパク質の既知ファミリーに割り当てるか、又はどの既知ドメインが当該配列に存在するかを決定することができるように設計されている（Falquet, L., Pagni, M., Bucher, P., Hulo, N., Sigrist, J., Hofmann, K and Bairoch, A. 2002. The PROSITE database, its status in 2002 Nucleic Acids Research 30(1): 235-238）。プロサーチ（Prosearch）は、所与の配列パターン又はシグネチャーを有するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＥＭＢＬデータベースを検索することができるツールである。

ポリペプチドを単離するための方法
変異型ポリペプチドを含め、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法で使用されるポリペプチドは、当技術分野で公知のペプチド合成方法、例えば、固相技術を用いた直接ペプチド合成（例えば、Stewart, J and Young, J. 1969. Thesis, Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California, or automated synthesis, for example using an Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California)を用いて調製することができる。ポリペプチドの突然変異型形態も、このような合成工程中に生成され得る。

本発明のポリペプチド及び変異型ポリペプチド、又は本発明の方法で使用されるポリペプチド及び変異型ポリペプチドは、当技術分野で公知の様々な技術を用いて、天然の供給源から精製することもできる（例えば、Deutscher, M. (Ed) 1990. Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification,）。

或いは、本発明のポリペプチド及び変異型ポリペプチド、又は本発明の方法で使用されるポリペプチド及び変異型ポリペプチドは、好適な宿主細胞に組換えにより発現させた後、以下に論じるように細胞から分離してもよい。

構築物及びベクターを生成する方法
本発明の遺伝子構築物は、本発明の１つ若しくは複数のポリヌクレオチド配列及び／又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳動物又は植物生物を形質転換するのに有用であり得る。本発明の遺伝子構築物は、本明細書に定義するような発現構築物を含むことが意図される。

遺伝子構築物及びベクターを生成及び使用する方法は、当技術分野において公知であり、Sambrook et al., 1989；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)に概説されている。

構築物及びベクターを含む植物細胞並びに植物を生成する方法
本発明は、さらに、本発明の遺伝子構築物を含む植物細胞、及び本発明のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの発現を改変するように修飾された植物細胞、又は本発明の方法で使用される植物細胞も提供する。こうした細胞を含む植物も本発明の一態様を形成する。

植物細胞、植物及びその部分をポリペプチドで形質転換する方法は、以下の文献に記載されている：Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R. 1988. Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual. Blackwell Scientific Publishers Oxford,；Potrykus, I. and Spangenburg, G. 1995. Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.；及びGelvin, S., Schilperoort, R. 2000. Plant Molecular Biology Manual Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. A review of transgenic plants, including transformation techniques, is provided in Galun and Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London。

植物の遺伝子操作方法
いくつかの植物形質転換戦略が利用可能である（例えば、Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297；Hellens et al., 2000, Plant Mol Biol 42: 819-32；Hellens et al., Plant Meth 1: 13）。例えば、戦略は、それが正常に発現される場合／とき、植物細胞、器官中の及び／又は特定の発生段階にあるポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を増大するように、又は、それが正常に発現されない／とき、植物細胞、組織、器官中の及び／又は特定の発生段階にあるポリヌクレオチド／ポリペプチドを異所的に発現させるように設計され得る。発現したポリヌクレオチド／ポリペプチドは、形質転換しようとする植物種に由来するものであってもよいし、又は異なる植物種に由来するものであってもよい。

形質転換戦略は、それが正常に発現される／とき、植物細胞、組織、器官中の、又は特定の発生段階にあるポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低減するように設計され得る。こうした戦略は、遺伝子サイレンシング戦略として知られる。

遺伝子導入植物における遺伝子の発現のための遺伝子構築物は、典型的に、形質転換植物中の遺伝子構築物の存在を検出する目的で、１つ又は複数のクローン化ポリヌクレオチド、ターミネータ及び選択マーカ配列の発現を駆動するためのプロモータを含む。

本発明の構築物での使用に好適なプロモータは、単子葉又は双子葉植物の細胞、組織、若しくは器官において機能性であり、そのようなものとして、細胞特異的、組織特異的及び器官特異的プロモータ、細胞周期特異的プロモータ、一過性プロモータ、誘導性プロモータ、ほとんどの植物組織で活性の構成性プロモータ、並びに組換えプロモータが挙げられる。プロモータの選択は、所望されるクローン化ポリヌクレオチドの時間的及び空間的発現に応じて変動し得る。プロモータは、目的の導入遺伝子と通常関連するもの、又は他の植物、ウイルス、並びに植物病原菌及び真菌の遺伝子に由来するプロモータであってもよい。当業者であれば、過度な実験をせずに、本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を用いて、植物の特徴の修飾及び調節に使用するのに好適なプロモータを選択することができるだろう。構成性植物プロモータの例として、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ、ノパリンシンターゼプロモータ及びオクトピンシンターゼプロモータ並びにトウモロコシ由来のＵｂｉ １プロモータが挙げられる。内部発生シグナル、又は外部非生物ストレス若しくは生物ストレスに応答する特定の組織で活性の植物プロモータは、科学文献に記載されている。例示的なプロモータは、例えば、国際公開第０２／００８９４号及び国際公開第２０１１／０５３１６９号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

植物形質転換遺伝子構築物に一般に使用されている例示的なターミネータとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネータ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼターミネータ若しくはオクトピンシンターゼターミネータ、トウモロコシ（Zea mays）ゼイン遺伝子ターミネータ、イネ（Oryza sativa）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼターミネータ及びバレイショ（Solanum tuberosum）ＰＩ−ＩＩターミネータが挙げられる。

植物形質転換に一般に使用される選択マーカは、カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴ ＩＩ）、スペチノマイシン及びストレプトマイシン耐性を付与するａａＡ遺伝子、Ignite（AgrEvo）及びBasta（Hoechst）耐性のためのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（bar遺伝子）、並びにヒグロマイシン耐性のためのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）が挙げられる。

植物における遺伝子／タンパク質発現又は活性を低減若しくは排除する方法
遺伝子サイレンシング
形質転換戦略は、それが正常に発現される／とき、植物細胞、組織、器官中の、又は特定の発生段階にあるポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低減するように設計され得る。こうした戦略は、遺伝子サイレンシング戦略として知られる。

遺伝子サイレンシング戦略は、コードされたポリペプチドの発現に影響を与える遺伝子自体又は調節エレメントを焦点とし得る。「調節エレメント」は、本明細書では可能な限り最も広義に使用され、目的の遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。好ましくは、調節エレメントは、遺伝子の一部である。

本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低減又は抑制するように設計される遺伝子構築物は、本発明のポリヌクレオチドのアンチセンスコピーを含む。こうした構築物では、ポリヌクレオチドは、プロモータ及びターミネータに関してアンチセンス配向で配置される。

「アンチセンス」ポリヌクレオチドは、生成された転写物が、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、例えば、
５’ＧＡＴＣＴＡ ３’（コード鎖）
３’ＣＴＡＧＡＴ ５’（アンチセンス鎖）
３’ＣＵＡＧＡＵ ５’（ｍＲＮＡ）
５’ＧＡＵＣＵＡ ３’（アンチセンスＲＮＡ）
と相補性となるように、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセグメントを反転することによって得られる。

遺伝子サイレンシングのために設計される遺伝子構築物は、逆方向反復も含み得る。「逆方向反復」は、反復される配列であり、ここで、反復配列の後半部分が、相補鎖、例えば、
５’−ＧＡＴＣＴＡ．．．ＴＡＧＡＴＣ−３’
３’−ＣＴＡＧＡＴ．．．ＡＴＣＴＡＧ−５’
内にある。

形成された転写物は、相補性塩基対合を経て、ヘアピン構造を形成し得る。通常、反復領域間の少なくとも３〜５ｂｐのスペーサが、ヘアピン形成を可能にするために必要とされる。こうした逆方向反復配列を含む構築物は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に使用され得るため、ＲＮＡｉ構築物と呼ぶことができる。

別のサイレンシングアプローチは、ｍｉＲＮＡと同等の転写物にターゲティングされる小分子アンチセンスＲＮＡの使用を含む（Llave, C., Xie, Z., Kasschau, K and Carrington, J. 2002. Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA. Science 297(5589): 2053-2056）。本発明のポリヌクレオチドに対応するこうしたアンチセンスＲＮＡの使用は、明確に考慮される。

本明細書で使用される遺伝子構築物という用語はまた遺伝子サイレンシングをもたらす、小分子アンチセンスＲＮＡ及び他のそうしたポリペプチドも含む。

本明細書に定義される通り、発現構築物による形質転換も、センス抑制として知られるプロセスを介して遺伝子サイレンシングを達成し得る（例えば、Napoli, C., Lemieux, C and Jorgensen, R. 1990. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. The Plant Cell 2: 279-289;）。いくつかのケースでは、センス抑制は、コード配列全体又は一部の過剰発現を伴い得るが、イントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などの遺伝子の非コード領域の発現も伴い得る。キメラ部分センス構築物を用いて、複数の遺伝子を協調的に抑制することができる（Abbott, J., Barakate, A., Pincon, G., Legrand, M., Lapierre, C., Mila, I., Schuch, W. and Halpin, C. 2002. Simultaneous suppression of multiple genes by single transgenes. Down-regulation of three unrelated lignin biosynthetic genes in tobacco. Plant Physiology 128(3): 844-53；Jones, C., Scothern, G., Lycett, G. and Tucker, G. 1998. The effect of chimeric transgene architecture on co-ordinated gene silencing. Planta 204: 499-505）。本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制するための、こうしたセンス抑制戦略の使用も考慮される。

遺伝子サイレンシングのために設計される遺伝子構築物中のポリヌクレオチド挿入断片は、対応する遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列、例えば、プロモータ及び／又はイントロン及び／又は５’及び／又は３’ＵＴＲ配列などに対応し得る。

その他の遺伝子抑制戦略としては、ドミナントネガティブアプローチ及びリボザイム構築物の使用が挙げられる（McIntyre, C and Manners, J. 1996. Strategies for the suppression of peroxidase gene expression in tobacco. I. Designing efficient ribozymes. Transgenic Research 5: 257-262）。

転写前抑制は、遺伝子自体又はその調節エレメントの突然変異によってもたらされ得る。こうした突然変異として、点突然変異、フレームシフト、挿入、欠失及び置換を挙げることができる。

植物の内在性ゲノムを編集する方法
本発明の一部の実施形態は、クサトベラ属（Scaevola）植物のゲノムを修飾して、ＣＹＣ２遺伝子及びタンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除することにより、植物中の本発明の所望の花表現型を生成することを含む。

植物の内在性ゲノムＤＮＡ配列を修飾する方法は、当業者には周知である。こうした方法は、目的の遺伝子に、標的二本鎖ＤＮＡ切断を生じる配列特異的ヌクレアーゼの使用を含み得る。植物に使用されるこのような方法の例として、以下のものがある：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Curtin, S., Zhang, F., Sander, J., Haun, W., Starker, C., Baltes, N., Reyon, D., Dahlborg, E., Goodwin, M., Coffman, A., Dobbs, D., Joung, J., Voytas, D. and Stupar, R. 2011. Targeted mutagenesis of duplicated genes in soybean with zinc-finger nucleases. Plant Physiology 156: 466-473;）、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ又は 「ＴＡＬＥＮｓ」（Cermak, T, Doyle, E., Christian, M., Wang, L., Zhang, Y., Schmidt, C., Baller, J., Somia, N. and Bogdanove, A. 2011. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Research 39(12): e82；Mahfouz , M., Li, L., Shamumuzzaman, M., Wibowo, A., Fang, X and Zhu, J. 2011. De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double -strand breaks. Proceedings of the National Academy of Science USA 108(6): 2623-2628；Li, T., Spalding, M., Weeks, D and Yang, B. 2012. High efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nature Biotechnology 30: 390-392）、並びに「メガヌクレアーゼ」とも呼ばれるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（Tzfira, T., Weinthal, D., Marton, I., Zeevi, V., Zuker, A. and Vainstein, A. 2012. Genome modifications in plant cells by custom-made restriction enzymes. Plant Biotechnology 10 :373-389）。

一定の間隔を空けて配置された短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）技術などの人工ヌクレアーゼを用いた標的化ゲノム編集は、カスタマイズ可能な特異性を備えるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を作製するための重要な新規アプローチである。これらのヌクレアーゼにより媒介されるゲノム編集は、多種多様な生物医学的に重要な細胞型、及び遺伝子操作が伝統的に困難であった生物中の内在性遺伝子を高速、容易及び効率的に修飾するために使用されている。生存細胞において内在性遺伝子発現を調節することができる、又は特定のゲノム遺伝子座を標識することができる異種ドメインを動員するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの修正バージョンが開発されている（Sander, J and Joung, J. 2014. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology 32: 347-355. The system is applicable to plants and can be used to regulate expression of target genes. (Bortesi, L. and Fischer, R.2015. The CRISPR/Cas9 system for pant genome editing and beyond. Biotechnology Advances 33(1): 41-52)。

本発明の特定の実施形態では、ゲノム編集技術（例えば、ＴＡＬＥＮｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術）を使用して、ＣＹＣ２遺伝子及びタンパク質の発現又は活性を低減若しくは排除するように標的内在性ＣＹＣ２中の１つ若しくは複数の塩基対を修飾し、これにより、所望の花表現型を有する本発明の植物を生産することができる。

クサトベラ属（Scaevola）植物の再生方法
クサトベラ属（Scaevola）植物を再生する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、以下に開示されているものが挙げられる：
Wang, Y. and Bhalla P. 2004. Somatic embryogenesis from leaf explants of Australian fan flower, Scaevola aemula R. Br. Plant Cell Reports 22: 408-414,及びBhalla, P. and Xu, H. 1999. Plant Regeneration from Callus of Australian Fan Flower, Scaevola. Journal of Plant Physiology, 154(3): 374-378。

植物のゲノムを突然変異させる方法
「変異育種」と呼ばれることもある突然変異育種は、望ましい形質を備える突然変異体を作製するために、植物、植物部分、生殖材料、種子、細胞、切穂などを化学物質又は放射線に曝露するプロセスである。

様々な種類の突然変異育種が当業者には周知であり、そうしたものとして、突然変異体を作製する目的で、メタンスルホン酸エチル及び硫酸ジメチルなどの化学的突然変異誘発物質、放射線又はトランスポゾンを使用するなどのアプローチがある。突然変異育種は、一般に、穀物及び観賞植物に形質を生み出すために使用される。

こうした方法は、例えば、以下に記載されている：Shu, Q., Forster, B. and Nakagawa, H. (Eds) 2011. Plant mutation breeding and biotechnology, Joint FAO/IAEA Division of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, Vienna Austria. Ceccarelli, S.E, Guimaraes, E. and Weltzien, E. (Eds). 2009. Plant breeding and farmer participation, Chapter 8. Methodologies for generating variability. Part 4: Mutation techniques., Publisher: Food and Agriculture Organization of the United Nations, Editors: pp.159-194；及びSikora, P. et al, 2011, Mutagenesis as a Tool in Plant Genetics, Functional Genomics, and Breeding. Volume 2011 |Article ID 314829, International Journal of Plant Genomics。

低減若しくは排除された発現又は活性を測定する方法
植物遺伝子又はタンパク質の低減若しくは排除された発現を測定する方法は、当業者には周知であり、そうしたものとして、限定されないが、核酸に基づく方法、例えば、ノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ及びドット−ブロット分析（Sambrook et al, 1989）、並びにタンパク質に基づく方法、例えば：ＥＬＩＳＡ（Kemeny, 1991, A Practical Guide to ELISA, NY Pergamon Press）及びウエスタンブロット分析（Towbin & Gordon, 1994, J Immunol Methods, 72, 313）が挙げられる。

種子寄託
クサトベラ属（Scaevola）アクセッション２０〜６１の種子は、以下の通り、NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YAに寄託されている。

寄託受領証及び生育性の説明書は、以下のページに掲載する。

本発明は、「ＦＵＳＥＤ」と称されるスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の新規の突然変異型アレルを記載する。ＦＵＳＥＤアレルは、花に表現型として発現されて、融合又は部分的に融合した花筒をもたらし、これは、花冠内の花弁の放射相称又はほぼ放射相称の表現型外観を付与する。本発明はまた、新規のＦＵＳＥＤアレルを有するクサトベラ属（Scaevola）種子、植物及び植物部分に関する。本発明は、ＦＵＳＥＤアレルを広範囲の異なるクサトベラ属（Scaevola）遺伝子型に移入して、新規の放射相称顕花植物を作製する方法にも関する。

本発明のＦＵＳＥＤアレルは、任意のクサトベラ属（Scaevola）植物に導入することができる。上記アレルが欠如している任意のクサトベラ属（Scaevola）植物に、容易にそれを移入することができる。本明細書に記載されるアレル及び方法を用いて、任意のクサトベラ属（Scaevola）植物の花序を修飾することができる。

１つの方法は、花粉又は胚珠親として、ＦＵＳＥＤアレルを有する親を用いた他花受粉によるハイブリダイゼーションを含む。別の方法は、ＦＵＳＥＤアレルを有する植物の自家受粉を含む。

ＦＵＳＥＤアレルを用いて、商業的生産のためのあらゆるクサトベラ属（Scaevola）品種の花冠の外観を修飾することができる。

本発明の植物は、請求される突然変異型アレルに対してヘテロ接合型又はホモ接合型いずれかの植物を、このアレルが欠如した任意のクサトベラ属（Scaevola）品種と交配させることによって、取得することができる。次に、さらなる育種を実施して、目的の他の遺伝子を育種プログラムに組み込むことができる。放射相称表現型を発現する花を早期に発生する表現型マーカに基づいて、アレルを移入する目的で使用するために、ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型の植物を正選択することができる。

新規の突然変異型アレルは、他の望ましい遺伝形質、例えば、コンパクトな草性、匍匐性、直立性、早期開花性、耐乾性、ユニークな花の色、例えば、黄色、ピンク色、白色、青色及びそれらの組合せ、害虫及び病気に対する抵抗性、繋殖のしやすさ、並びに目的とするいずれか他の特徴を備える品種に導入することができる。

本発明は、専有アクセッションが、γ線処理に付された突然変異育種プログラムの一環として開発された。本発明によれば、突然変異は、別の突然変異誘発物質、又は遺伝子編集によっても生成することができる。他の突然変異誘発物質の例として、Ｘ線、紫外線照射、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）などが挙げられる。遺伝子編集システムの例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ’ｓ （Mao, Y, Botella, J.R., Liu, Y and Zhu, J. 2019. Gene editing in plants: progress and challenges. National Science Review 6:421-437）が挙げられる。

従って、平均的な当業者であれば、クサトベラ属（Scaevola）のCYCLOIDEA2遺伝子に対する他の欠失又は破壊が、同じ放射状の花の相称の表現型発現をもたらし得ると予想するであろう。

本発明のクサトベラ属（Scaevola）突然変異型ＦＵＳＥＤアレルを、他花受粉により、多数の遺伝子的に多様なスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）株に移入した。突然変異型アレルを含む一連のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物を生産した。

ＦＵＳＥＤアレルは、ホモ接合状態で発現させると、融合した背側開裂を有する、植物のほぼ全ての花の生成がもたらされる。ヘテロ接合状態の場合、ＦＵＳＥＤアレルは、最初のいくつかの花に明らかな融合背側開裂により表現型として発現され得るが、その後の花は、正常野生型表現型に戻る。突然変異型アレルは、CYCLOIDEA2コード領域内の劣性ナンセンス突然変異（終止コドンを導入する一塩基変化）である。

本出願人は、突然変異型アレルを含む植物を確実に識別するためのＣＡＰＳマーカ系を開発した。相互優性ＣＡＰＳマーカは、ホモ接合又はヘテロ接合状態のいずれにおいてもＦＵＳＥＤアレルを有する全ての植物を正確に識別した。

ペロリック植物は、園芸の技術において知られているが、これらは極めて稀有である。こうした植物の開発のための基本的機構は、種に応じて非常に異なる。スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の場合、広範な先行技術検索の後、本発明者の知る限り、ペロリック植物は一度も報告されていない。

他の植物種において、ペロリック植物が見出され、いくつかのケースでは、CYCLOIDEA遺伝子（その多くが存在する）の発現の喪失又は増大のいずれかを伴い、往々にして他の遺伝子又は遺伝機構にも関わる。

例えば、キンギョソウ（Antirrhinum）の場合、ＣＹＣ及びＤＩＣＨ遺伝子の両方が無効化され、それによってペロリックキンギョソウ（Antirrhinum）植物が得られ、さらには、これらの植物は、余剰の花弁、萼片及び雄蕊（突然変異体には各々６つ、野生型植物には各々５つ）を有した（Luo, D., Carpenter, R., Vincent, C., Copsey, L. and Coen, E. 1995. Origin of Floral Symmetry in Antirrhinum, Nature 383 :794-799）。

本発明の現在のクサトベラ属（Scaevola）花表現型の場合、花弁、萼片及び雄蕊の増加はなく、放射相称花を開発するために、（２つの異なる遺伝子ではなく）１つの特定のＣＹＣ遺伝子（ＣＹＣ２遺伝子）の突然変異は必要なかった。従って、キンギョソウ（Antirrhinum）に関する先行技術によって、技術者が、クサトベラ属（Scaevola）に関する本発明に到達することは決してない。

Dong et al 2018 (Dong, Y., Liu, J., Li, P., Li, C., Lu, T., Yang, X. and Wang, Y. 2018. Evolution of Darwin’s peloric Gloxinia (Sinningia speciosa) is caused by a null mutation in a pleiotropic TCP gene, Molecular Biology and Evolution 38(8): 1901-1915)は、ペロリックグロキシニア（Gloxinia）の進化が、２倍機構を含むことを示唆している。即ち、１０ｂｐ欠失は、ＳｓＣＹＣタンパク質の機能の喪失をもたらし、これが、今度は、ＳｓＣＹＣの自己調節ループをさらに破壊し、背側特異的発現の完全な喪失を招く。彼らの分析では、この突然変異は、ペロリック花をもたらす以外に、花の基部のギボス構造の抑制により花の配向を変化させた。さらに、グロキシニア（Gloxinia）の場合、花には背側開裂がなく、従ってやはり、キンギョソウ（Antirrhinum）に関する先行技術によって、当業者が、クサトベラ属（Scaevola）に関する本発明に到達することは決してなく、ここでは、背側開裂の融合が放射相称花をもたらし、それは予想外で、驚くべき結果であった。

アフリカスミレ（African violet）（Hsu, H., He, C., Kuo, E., Hsin, K., Lu, J., Pan, Z. and Wang, C. 2018. Genetic analysis of floral symmetry transition in African Violet suggests the involvement of trans-acting factor for CYCLOIDEA expression shifts, Frontiers in Plant Science 9: 1-19）には、ＣＹＣ２遺伝子は見出されず、ＣＹＣ１遺伝子ファミリーの品種のみが見出された。本発明のＣＹＣ２遺伝子は、Hsu et al 2018のアフリカスミレ（African violet）研究で調べられた植物には存在しなかった。

マメ（pea）科の広範な研究で（Zhao, Z., Hu, J., Chen, S., Luo, Z., Luo, D., Wen, J., Tu, T., Zhang, D. 2019. Evolution of CYCLOIDEA-like genes in Fabales: Insights into duplication patterns and the control of floral symmetry, Molecular Phylogenetics and Evolution 132: 81-89）、著者は、「ＣＹＣ１及びＣＹＣ２遺伝子両方の多様化パターンは、非マメ亜科（non-papilionoid）マメ目（Fabales）群の花の対称性とは無関係であるが、ＣＹＣ２の遺伝子重複及び機能的相違は、マメ亜科（Papilionoideae）の花の左右相称に必須である」と唱える。さらに、（第８７ページ）著者は、「非マメ亜科の多くの種は、対称形態に違いがあるにもかかわらず、ＣＹＣ２遺伝子の１つのコピーしかないが、放射相称の花を有する他のいくつかは、２つのコピーを有しており、これは、ＣＹＣ２遺伝子の重複事象が、これらの生物の花の対称性と関連しないことを示唆している」と言う。この研究から、花の対称性の原因となるのはどの遺伝子かを（もし存在する場合）厳密に特定することがいかに難しいか、また、あるファミリーの一部における特定のＣＹＣ２遺伝子は、ファミリーの別の部分に異なる作用を有し得ることを示した。

マメ科植物カディア（Cadia）の場合、左右相称から放射相称への稀な変化は、ＣＹＣ遺伝子の発現パターンの変化を特徴とする。ＣＹＣ遺伝子の１つの発現パターンは、花冠の向軸面から側方及び背軸領域まで拡大したが、これは、カディア（Cadia）の放射状の花が背面化され、それにより、放射相称への逆転は起こらなかったが、全ての花弁が背側同一性を獲得するホメオティックな形質転換が起こったことを示唆している（Citerne, H., Pennington, R., Cronk, Q. 2006. An apparent reversal in floral symmetry in the legume Cadia is a homeotic transformation, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(32): 12017-12020）。この稀な発現の変化は、完全に異なる花序であり、これによって放射相称、即ち、本発明に従って見出されるものが達成される。

ヒマワリ（Helianthus annuus）の場合、Fambrini et al(Fambrini, M., Salvini, M., Basile, A., and Pugliesi, C. 2014. Transposon-dependent induction of Vincent van Gogh’s sunflowers: Exceptions revealed, Genesis 52:315-327)が、放射相称放射状花を有する花突然変異体を調べた。通常のヒマワリは、左右相称放射状花及び放射相称円盤状小花を有する。シバ（turf）（筒状花）突然変異型ヒマワリの分子解析は、ＨａＣＹＣ２遺伝子のＴＣＰドメインへの非自律的転移因子（ＴＥ）の挿入を明らかにし、それにより、放射状花は、左右相称から放射相称へと変化する。Chrysとして知られる別の突然変異体は、円盤状花の放射相称から左右相称様花弁への変化を特徴とする。単一の半優性主要遺伝子がこの形質を制御し、これは、プロモータ領域内で、CYCLOIDEA様遺伝子（HaCYC2）の開始コドン上流の９９９ｂｐ挿入に起因する。本発明において、関与する転移因子はなかった。

リナリア（Linaria）の場合、（Cubas, P., Vincent, C. and Coen, E., 1999. An epigenetic mutation responsible for natural variation in floral symmetry, Nature 40: 157-161）著者は、左右相称から放射相称への変化が、ＬＣＹＣ遺伝子の広範なメチル化によるものであり、これが、遺伝子を転写的にサイレントにしたことを明らかにした。左右相称から放射相称に変化するこの方法も、やはり、本発明の主題に見出されたものとは異なり、さらにまた、ＬＣＹＣ遺伝子は、クサトベラ属（Scaevola）に存在しない。

既に指摘したように、本発明は、クサトベラ属（Scaevola）に放射相称の花をもたらす最初の例である。従って、そうした花をクサトベラ属（Scaevola）にもたらすことができることを示す前例はなかった。むしろ、本出願人は、驚くことに、その商業的育種プログラムにおいて、本発明の花表現型を有するクサトベラ属（Scaevola）植物を生産した。

さらに、多様な植物ファミリーの範囲内で左右相称から放射状の花の相称への変化に関与するこうしたいくつかの多様な機構、及びこれらの種とクサトベラ属（Scaevola）の非関連性を考慮すれば、当業者は、本発明によってここに提供されるような、クサトベラ属（Scaevola）に放射相称花をもたらす同様の機構を予想することはできなかったであろう。

ＦＵＳＥＤアレルによって得られる新規の改変された花表現型は、花筒を融合させるが、ここには、通常、花冠の端縁から子房へと延びる背側花弁の間に位置する背側開裂がある。この花筒の融合によって、昆虫が花に進入して授粉する能力が制限される。予想外なことに、屋外で栽培した場合、改変表現型を有する植物は、通常のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物と比較して、昆虫による授粉から生じる非常に遅い種子生産を示す。また、予想外なことに、この属性は、意外にも、花が昆虫による授粉を容易に受けることができないために、花の提示の長さを増加する。授粉に成功した通常のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）花は、受粉から１日以内にその花冠の成長を止める。より長い貯蔵寿命及び花の提示を有するスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物は、観賞の魅力が長くなるために、植物小売業者及び消費者により好ましいとみなされる可能性があり、従って、本発明から開発された植物は、向上した商業的有用性及び新規性を有する。

本出願人は、さらに、ＦＵＳＥＤアレルを有する植物の人工受粉による種子生産が成功し、突然変異型アレルが欠如した植物同士で他花受粉させる他花受粉当たりの量と同様の量で種子が生産されることも実証した。

本出願人は、多数の非関連クサトベラ属（Scaevola）遺伝子型との他花、自家及び自然受粉(open pollinated)からの、ＦＵＳＥＤアレルを有するクサトベラ属（Scaevola）植物を用いて、数千の種子を生産することに成功した。

本発明は、さらに、親選択及びハイブリッド作製、循環選択、戻し交配、系統育種、ＣＡＰＳマーカ支援選択、形質転換及び遺伝子編集などの植物育種技術を用いた植物育種プログラムでクサトベラ属（Scaevola）植物を開発する方法を提供する。こうした育種方法により生産される種子、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物、及び植物部分も、本発明の一部である。

本発明はまた、その遺伝物質に１つ又は複数の導入遺伝子(transgene)を含有するクサトベラ属（Scaevola）植物を生産する方法、及びこの方法により生産される遺伝子導入(transgenic)サトベラ属（Scaevola）植物にも関する。好ましくは、導入遺伝子は、突然変異型アレルＦＵＳＥＤ又は突然変異型アレルＦＵＳＥＤのｃＤＮＡである。

本発明は、ユニークなクサトベラ属（Scaevola）植物の開発にも一部関する。改変された花表現型特徴を伝達する、ＦＵＳＥＤと称される移入可能なアレルが、単離されて、他の遺伝的背景に組み込まれる。また、本発明のアレルは、多くの異なる遺伝的背景でも発現される。

本発明の新規の改変クサトベラ属（Scaevola）植物は、一般に、連続的ラウンドの無性繋殖による改変表現型の安定性と、広範な遺伝的に多様な有性交配による形質の子孫への伝達によって示されるように、遺伝的に安定している。

本発明以前に、花の放射相称を有するクサトベラ属（Scaevola）植物の開発は、当業者に明白な方法によって達成することは不可能であった。この新規の形質をクサトベラ属（Scaevola）の多様な遺伝的背景に確実に、且つ予測可能に組み込むことにより、交雑(inter-crossing)組合せの雄又は雌親が上記アレルを有するか否かにかかわらず、新しい品種を作出することができる。

本明細書において、特許明細書、他の外部文書、又は他の情報源を参照する場合、これは、概して、本発明の特徴を論述するための環境を提供することを目的とする。別に明示されない限り、こうした外部文書への参照は、いかなる管轄であれ、そのような文書、又はそのような情報源が、先行技術である、又は当技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することの承認として解釈されるべきではない。

本明細書で使用される「含むこと」という用語は、「少なくとも一部が〜から構成されること」を意味する。本明細書において、「含むこと」という用語を含む各記述を解釈する際、この用語で始まる１つ又は複数のもの以外の特徴も存在し得る。「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの関連用語も同様に解釈するべきである。一部の実施形態では、「含むこと」という用語（並びに「含む(comprise)」又は「含む(comprises)」などの関連用語）は、「〜から構成されること」（並びに「構成される(consist)」又は「構成される(consists)」などの関連用語）で置き換えることができる。

本出願に引用される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ、その一部を成す以下の図面は、いくつかの、しかし唯一若しくは排他的ではない例の実施形態及び／又は特徴を示し、例示的であって、範囲に関して非限定的であると解釈すべきである。

スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の通常の「野生型」ファンフラワー形態（下部）と、背側、側方及び腹側花弁が標識された本発明の新規「放射状」花形態（上部）とを示す。 花冠の端縁から子房まで延びる背側開裂を示す通常の花（右）と比較した本発明の融合背側開裂特徴（左）を示す。 ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型の本発明の成熟植物の例（左）と、ＦＵＳＥＤアレルを有していない通常の野生型スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物（右）とを示す。 放射状の花の相称を呈示する本発明の様々な花の色及びサイズを示し、花の色は、青色、白色、黄色、ピンク色、ピンク色と黄色の組合せ、並びに紫と黄色の組合せを含む。 アクセッション１１３６１からの自家受粉した子孫を示し、これは、放射相称花の形質がホモ接合型であり、子孫の１００％が放射相称を呈示することを実証するものである。 実施例５からの１０の放射状に対称な開花線の交雑から作製した花の子孫を示し、これらは、１００％が放射相称花の形質を有する。 アクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１のＣＹＣ２ｃＤＮＡ配列を示し、放射相称顕花１１３６１の単一塩基ＴＡＡ（終止）コドン突然変異と、初め放射相称で、その後正常顕花７９５２（赤いボックス）の突然変異型アレルを示す。 アクセッション１１３６１から放射相称花形態をもたらす突然変異の図表示を示す。 アクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１の花弁のＣＹＣ２発現パターンを示す。 遺伝子研究で使用したスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）アクセッション中のＣＹＣ２のコピー数を決定するためのサザンブロットを示す。 突然変異型アレルの同定のためのＣＡＰＳマーカ系の図表示を示す。 アクセッション７４８２（正常）、７９５２（ＦＵＳＥＤアレルに対してヘテロ接合型）及び１１３６１（ＦＵＳＥＤアレルに対してホモ接合型）のＣＡＰＳマーカ結果を示す。 表３に関するＣＡＰＳマーカ分析の電気泳動ゲル画像を示す。 スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）（ＳａｍＣｙＣ２−配列番号１）、スカエボラ・タッカダ（Scaevola taccada）（ＳｔａＣｙＣ２−配列番号２）、及びスカエボラ・セリセア（Scaevola sericea）（ＳｓｅＣＹＣ２−配列番号３）由来のＣＹＣ２タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ（１．２．４）多重配列アラインメントを示す。Chen et al. 2018.に記載される通り、モチーフ１、２及び４に対応するクサトベラ属（Scaevola）ＣＹＣ２の位置は、グレーの陰影でハイライトされている。Chen et al. 2018.の著者によって記載される通り、モチーフ１、２及び４は、ＣＹＣ２様形態のキク目（Asterales）の全てに存在する。 図１４でアラインメントしたＣＹＣ２タンパク質形態のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）（ＳａｍＣｙＣ２−配列番号１）、スカエボラ・タッカダ（Scaevola taccada）（ＳｔａＣｙＣ２−配列番号２）とスカエボラ・セリセア（Scaevola sericea）（ＳｓｅＣＹＣ２−配列番号３）の間の同一性％を示す。 以下の配列：野生型スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）、CYCLOIDEA2−「７４８２」のコード配列（配列番号２３）、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）CYCLOIDEA2−FUSED ALLELE−「１１３６１」のコード配列（配列番号２４）、野生型スカエボラ・タッカダ（Scaevola taccada）CYCLOIDEA2「スカエボラ・タッカダ（Scaevola_taccada）」のコード配列（配列番号２５）及び野生型グーデニア・ピロサ（Goodenia pilosa）、Cycloidea様遺伝子「グーデニア・ピロサ（Goodenia_pilosa）」のコード配列（配列番号２６）のアラインメントを示す。ＦＵＳＥＤアレルに特有の「１１３６１」（配列番号２４）内のヌクレオチド位置９９のアデニン（Ａ）は、白いボックスでハイライトされている。他の３つの野生型配列には、対応する位置にシトシン（Ｃ）がある。

実施例
前述した例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の非限定的な例を詳細に読むことにより、さらなる態様及び実施形態が明らかになるであろう。

以下の実施例は、本発明をさらに詳しく説明するために提供される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲に記載される制限事項を超えるいかなる様式でも、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。多くの変更及び修正を実施することが可能であり、これらは、依然として本発明の趣旨及び範囲内である。

実施例１．初期突然変異型放射相称顕花植物の作製
商業ベースのスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）育種プログラムは、国際観賞用園芸市場への新品種を生産するために、１９９７年に開始された。１９９７年から２０１３年までに、最大６７の野生採取及び市販の栽培品種を起源とする様々な他花及び自然受粉から約２７，４８６の苗が作製された。苗は、商業的に実現可能な形質について注意深く選別された。放射相称花は全く観察されなかった。ガンマ線照射アクセッションを含む２０１３年中の交配の結果として、２０１４年中に専有植物の集団に最初の改変された花表現型植物（アクセッション７９５２）が観察された。しかし、この植物は、生産期間中に生育した最初のいくつかの花に放射相称花を有したに過ぎない。その後生育した花は、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の正常花表現型を呈示した。さらなる選択及び交配によって、２０１６年に選択された１つの完全に安定した放射相称顕花植物が得られた。この植物は、アクセッション１１３６１と称された。このアクセッションは、イエローロック、ＮＳＷ オーストラリア（Yellow Rock, NSW Australia）及び日本国、滋賀県、東近江市で、年間の全季節を通して非常に多様な環境条件下での何世代もの無性繋殖及び栽培によって、新規の放射相称花表現型を均質に、且つ安定して発現した。

実施例２．初期突然変異型放射相称顕花植物（アクセッション１１３６１）の自家受粉
スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物は、当技術分野で、自家不和合性(self-incompatible)であることがわかっている（Luo, 2005；Sweeney, 1999；Howell, 1995）。しかし、新しいスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）アクセッション１１３６１は、自家和合性(self-compatible)であると考えられた。自家受粉は、公開された方法に従い、イエローロック（Yellow Rock, Australia）にて夏季の間防虫網付き温室内で小型ペイントブラシを用い、手作業で実施した。

最初の初期安定放射相称顕花植物（アクセッション１１３６１）を自家受粉させた（小型ペイントブラシを用いた、手作業による１００の自家受粉）ところ、予想外なことに、６９の種子が生産された。これらの種子から、５３の植物が生育し、開花まで生長した。５３の植物は全て、全ての植物の全ての花に、放射相称花形質を有し、これは、この株が、放射相称花形質に対してホモ接合型であったことを示している（図５）。加えて、この実験は、この株の花の白色もホモ接合型形質であることを示した。近交弱勢（遅く、弱い生長及び遅咲き）のエビデンスがこの集団に観察された。アクセッション１１３６１の自家受粉後に、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）果実に生産され得る種子の最大数は、２つであり、３４．５％の結実率が得られた（表１）。

実施例３．放射相称花形質の伝達を評価するための７つの放射相称顕花アクセッションの交雑
アクセッション１１３６１を用いて、通常の花を呈示する多数のアクセッションの間で、他花及び自然受粉を実施した。これらの交配からの子孫もまた直接又は自然受粉によって交雑させた。この育種結果から、相称花形質を安定に呈示した７つのアクセッションを選択した。放射相称花形質を安定に呈示する７つのアクセッションの間で他花受粉を手作業でランダムに実施した。これらの７つの株は、遺伝子的に多様であり、以下：濃い青、ピンク、カボチャ色、黄色、斑点のあるピンク、斑点のある濃いピンク、及び斑点のある濃い青を含む花の色を有した。７つの株は全て、全７つの株から収集したバルク花粉を用いて交雑させた。１３６７の受粉を実施し、２６２の果実を採取し、２２５の種子を播いて、７１の植物が得られた。これら７１の植物のうち、５４が開花期に到達した（１７は弱く、開花しなかった）。開花期に到達した５４の植物は全て、放射相称花形質を呈示した。子孫では、様々な花の色及び組合せが明らかになった。この研究は、放射相称花形質が、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の異なる遺伝子型の間で伝達され得ることを実証した。

実施例４．放射相称花形質の伝達を評価するための１０の放射相称顕花アクセッションの交雑
実施例３の１０の異なるアクセッションを用いて、放射相称花形質を安定に呈示する１０のアクセッションの間で、他花受粉を手作業でランダムに実施した。これらの１０の株は、遺伝子的に多様であり、以下：黄色と青の２色、黄色とピンクの２色、青と白い中心、白、濃い黄色とピンクの２色、青及び水色を含む花の色を有した。１０の株は全て、全１０の株から収集したバルク花粉を用いて交雑させた。受粉を実施し、６２１の果実を採取し、６２９の種子を播いて、開花期に到達した４２１の植物が得られた。開花期に到達した４２１の植物は全て、放射相称花形質を安定に呈示した。子孫では、様々な花の色及び組合せが明らかになった（図６）。実施例２、３及び４は、放射相称花形質が、形質を安定に呈示する植物においてホモ接合型であったことを実証した。

実施例６．放射相称花形質の遺伝メカニズムの決定
クサトベラ科（Goodeniaceae）に関する近年の花形態学研究（Berger et al. 2017, Gardner et al. 2016及びHan, 2018）は、CYCLOIDEA様遺伝子のメンバーが、この科における花弁の配列の変化を担うことを示唆している。これらの遺伝子は、転写因子であり、正しい時間に植物の正しい位置で正しい遺伝子発現が起こるように、ＤＮＡからＲＮＡへのコピーを調節する。Hanは、花の相称は、これらの転写因子の非対称発現及び重複に影響され得ると説明している。スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）において、Han 2018（ｐ５９〜ｐ６２）は、ＣＹＣの３つのコピー；ＣＹＣ１、ＣＹＣ２及びＣＹＣ３を見出し、ＣＹＣ３内には２つのコピーＣＹＣ３Ａ及びＣＹＣ３Ｂがあった。これらの異なるコピーは、葉、花芽及び側方及び／又は腹側花弁において発現が異なっていた。Hanは、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の花により呈示される左右相称の程度が、複数のＣＹＣ様遺伝子の発現レベルの微かな変化により影響されることを見出した（ｐ６７）。Hanは、（植物の）放射相称群において、ＣＹＣ２クレードメンバーが、花冠組織に発現されないか、又は遍在的に発現されるかのいずれかである（下線が加えられた）と述べた（Howarth et al 2011及びZhang et al 2013を参照）。この記述は、ＣＹＣ２遺伝子を取り巻く曖昧さと、余剰コピー及び／又は欠失の影響の可能性を事前に予測する難しさとを明らかに示している。

本発明以前に、どんな遺伝機構（もしあれば）が、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の放射状の花の相称の原因となり得るのかは不明であった。実際に、放射相称スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）顕花植物は、入手可能な文献に報告されていない。そのため、当業者であれば、この時点で、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）の放射相称花形質の原因として考えられる多数があり得たことは理解されよう。様々な見解が考慮され、実験が実施された。

アクセッション１１３６１の花相称を制御するメカニズムであると事前に予測することはできなかったため、CYCLOIDEA遺伝子が、本発明の新規形態の原因であるかどうかを決定するために、実験を実施した。分析のために３つの専有アクセッションを選択した（表２）。

実験研究は、CYCLOIDEA 2遺伝子のクローン化を含んだ。GenBankに寄託されたスカエボラ・タッカダ（Scaevola taccada）ＣＹＣ２配列（アクセッション番号：ＭＧ５９３３７２．１）を用いて、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）CYCLOIDEA 2（ＣＹＣ２）遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した。これらのプライマー（Ｓｔ−ｃｙｓＦ１：TCCATGTCTGCCCTCCTTCT［配列番号２７］、及びＳｔ−ｃｙｓＲ１：TTACACGCATCACCCTGCTG［配列番号２８］）は、アクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１ ｃＤＮＡからの約１ｋｂアンプリコンを生成した。ｃＤＮＡは、ReverTra Ace逆転写酵素（Toyobo）を用いた花芽から作製された全ＲＮＡを用いて生成された。Tks gflexポリメラーゼ（Takara Bio）を用い、９８℃で１５秒、６０℃で２０秒、及び６８℃で３０秒の３５サイクルにわたってＰＣＲを実施した。これらのアンプリコンをTArget clone -plus-（Toyobo）を用いてクローン化した後、3500 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いてシーケンシングした。

図７は、３つのスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）アクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１の塩基配列を示す。１１３６１から得られた配列は全て、ＣからＡの点突然変異を有し、終止コドン（TAA）と、短縮型で、恐らく非機能性のタンパク質を生成した（図７及び８）。７９５２から得られた６つの配列の２つは、同じＣからＡへの点突然変異を有し、７９５２がヘテロ接合型突然変異体であることを示している。

以下の配列：野生型スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）、CYCLOIDEA2−「７４８２」のコード配列（配列番号２３）、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）、CYCLOIDEA2−FUSED ALLELE−「１１３６１」のコード配列（配列番号２４）、野生型スカエボラ・タッカダ（Scaevola taccada）CYCLOIDEA2「スカエボラ・タッカダ（Scaevola_taccada）」のコード配列（配列番号２５）及び野生型グーデニア・ピロサ（Goodenia pilosa）、Cycloidea様遺伝子「グーデニア・ピロサ（Goodenia_pilosa）」のコード配列（配列番号２６）のさらなるアラインメントを図１６に示す。ＦＵＳＥＤアレルに特有の「１１３６１」（配列番号２４）内のヌクレオチド位置９９のアデニン（Ａ）は、白いボックスでハイライトされている。他の３つの野生型配列には、対応する位置にシトシン（Ｃ）がある。

スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）花の花弁中のＣＹＣ２の発現レベルを決定するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。RNeasy植物ミニキット（Qiagen）を用いて、１ｃｍ、１．５ｃｍ、及び２ｃｍの花芽の背側、側方、及び腹側花弁の全ＲＮＡを個別に分離した。ReverTra Ace逆転写酵素（Toyobo）を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）及びStepOnePlus real-time PCR system（Applied Biosystems）を用いて、定量的ＰＣＲを実施した。ＣＹＣ２ ｑＰＣＲ用のプライマーは、ＣＹＣ２ｒｔ−Ｆ（GGCAAGAGCAAGAGCTAGGG）−配列番号２９及びＣＹＣ２ｒｔ−Ｒ（AGGTTGGGCTTACGTGACAG）−配列番号３０である。ＣＹＣ２発現レベルをアクチン発現レベルに対して正規化した。アクチンｑＰＣＲ用のプライマーは、actrt-F（GCCTGATGGGCAGGTAATCA）−配列番号３１及びactrt-R（TACCAGCAGCTTCCATTCCG）−配列番号３２である。結果を図１０に示す。アクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１は、本質的に同じＣＹＣ２発現パターンを示す。

スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）アクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１中のＣＹＣ２のコピー数を決定するために、サザンブロット分析を実施した。NucleoSpin PlantII Kit（Macherey-Nagel）を用いて、ゲノムＤＮＡを葉組織から抽出した。約１５μｇのゲノムＤＮＡをAflII又はHincII（New England Biolabs）で消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動させた後、正荷電ナイロン膜（GE Healthcare）に移した。全てのCycloidea遺伝子間で保存された領域を排除したＣＹＣ２ ｃＤＮＡ配列の一部を、DIG-High Prime（Roche）を用いて、ジゴキシゲニンで標識した。製造者のマニュアルに従い、ハイブリダイゼーション及び検出を実施した。

AflIIを用いたサザンブロット分析は、全３つの品種に１つのバンドを示した。HincIIを用いたサザンブロット分析は、１１３６１に１つのバンドを示したが、７４８２及び７９５２には２つのバンドを示した。本発明者らは、７４８２は、同じＣＹＣ２遺伝子の２つの正常アレルを有し、その１つは、ＣＹＣ２遺伝子に近接して別のHincII部位を有し、７９５２は、１つの突然変異型アレルと、別のHincII部位を有する１つの正常アレルとを有し、１１３６１は、２つの突然変異型アレルを有すると仮定した。これらの結果は、スカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）が、ＣＹＣ２遺伝子の少なくとも１つのコピーを有する可能性があり、これは、Han 2018の結果と一致することを示唆するものであった。

実施例７．ヘテロ接合型及びホモ接合型ＣＹＣ２突然変異体を同定するためのＣＡＰＳマーカ系の作製
NucleoSpin Plant II（MACHEREY-NAGEL）を用いて、ＤＮＡ抽出を実施した。下記のＰＣＲプライマー及び条件を用いて、１５１ｂｐ断片を作製した後、Msel消化及び電気泳動を実施して、正常放射相称（ホモ接合型）及び初めは放射相称で、後に正常顕花（ヘテロ接合型）植物になったものを識別した。ＣＡＰＳマーカ系用のＰＣＲプライマーは、ＣＹＣ２−２Ｆ（CCATGTCTGCCCTCCTTCT）−配列番号３３及びＣＹＣ２−１５２Ｒ（AACATTCTCCATAACCTGAGGA）−配列番号３４である。Tks gflex ＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio）を用い、９８℃で１５秒、６０℃で２０秒、及び６８℃で３０秒の３０サイクルにわたってＰＣＲを実施した。

図１１は、ＣＡＰＳマーカ系の図表示を示し、図１２は、これらの３つのアクセッション７４８２、７９５２及び１１３６１についてのＣＡＰＳマーカ結果を示す。

実施例８．市販及び専有アクセッションに対するＣＡＰＳマーカ系の適用
作製したＣＡＰＳマーカ系を使用して、２０のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）品種及び１９のスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）アクセッションを評価した。結果を表３及び図１４に表示する。

実施例９．他花受粉による広範なスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）遺伝的背景へのＦＵＳＥＤ突然変異型アレルの移入
花放射相称を呈示するホモ接合型ＦＵＳＥＤ突然変異体アクセッション１１３６１を雄及び雌親の両方として、複数の異なるスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）アクセッションと交配させた（遺伝子型正常／正常＝ＮＮ、突然変異型／正常＝ＮＭ又は突然変異型／突然変異型＝ＭＮ）。得られたＦ_１子孫を突然変異型ＦＵＳＥＤアレルの存在について表現型により評価し、ＣＡＰＳ分子マーカ系を用いて、多数の植物を試験して、ヘテロ接合体を同定した。

実施例１０．ＦＵＳＥＤ形質の分離比を決定するためのＦＵＳＥＤヘテロ接合体の交雑
開花の早期段階の間に少なくとも１つの放射相称花をもたらす能力に基づいて、６つのアクセッションを選択した。この表現型の特徴は、突然変異型ＦＵＳＥＤアレルに対するヘテロ接合型遺伝子型と相関することが示されている。６つのアクセッションは、全６つのアクセッションから収集されたバルク花粉を用いた人工受粉によりランダムに交雑させた。種子を収集し、発芽させて、１３３の植物が得られ、これらを開花成熟期まで生長させた。得られた分離は、予測通り、２５％の放射相称顕花成熟植物と、７５％の正常表現型植物が報告された。

正常：ＦＵＳＥＤ突然変異型植物の観測比は、２．８：１であり、予想比は、３：１と予想された。このデータによれば、先に示した分子データと一致して、ＦＵＳＥＤアレルは劣性遺伝子であると考えることができる。

Claims (20)

1. ＦＵＳＥＤアレルを含むスカエボラ・アエムラ（Scaevola aemula）植物。
2. 前記植物が前記ＦＵＳＥＤアレルを含むことの結果として、花弁の放射相称配置を特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産する、請求項１に記載の植物。
3. 前記花表現型が、以下：
   ａ）融合した背側開裂、及び
   ｂ）遅延型老化
   の少なくとも１つをさらに特徴とする、請求項２に記載の植物。
4. 前記アレルがヘテロ接合状態で存在し、前記植物は、前記植物に発生する最初のいくつかの花に前記花表現型を発現し、その後の花は、通常の（野生型）外観である、請求項２に記載の植物。
5. 前記アレルがホモ接合状態で存在し、前記植物は、生産される全ての、又はほぼ全ての花に前記花表現型を発現する、請求項２に記載の植物。
6. 前記ＦＵＳＥＤアレルが、以下：
   ａ）配列番号７の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
   ｂ）配列番号８の配列のヌクレオチド３９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在、
   ｃ）配列番号２４の配列のヌクレオチド９９に対応する位置におけるアデニン（Ａ）の存在
   の少なくとも１つを特徴とする、請求項１に記載の植物。
7. 前記アデニン（Ａ）が、対応する野生型配列中の同じ位置におけるシトシン（Ｃ）の置換である、請求項６に記載の植物。
8. ａ）配列番号４が、配列番号７に対応する野生型配列であり、
   ｂ）配列番号５が、配列番号８に対応する野生型配列であり、
   ｃ）配列番号２３が、配列番号２４に対応する野生型配列である、
   請求項７に記載の植物。
9. 前記植物、又は前記ＦＵＳＥＤアレルが、以下：
   ａ）配列番号７、
   ｂ）配列番号８、及び
   ｃ）配列番号２４
   のいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載の植物。
10. アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託された種子から生産される、又はそれに由来する、請求項１に記載の植物。
11. 請求項１に記載の植物の、又はそれを生産することができる、植物細胞、植物部分、零余子、種子、切穂、細胞培養物、組織培養物、若しくはカルス。
12. 以下：
    ａ）前記植物細胞、植物部分、零余子、種子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルスが、前記ＦＵＳＥＤアレルを含む、
    ｂ）前記植物細胞、植物部分、零余子、種子、切穂、細胞培養物、又はカルスが、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９で寄託された種子から生産される、並びに
    ｃ）前記種子が、アクセッション番号：ＮＣＩＭＢ４３６１９として寄託されている、
    の少なくとも１つが当てはまる、請求項１１に記載の植物細胞、植物部分、零余子、種子、切穂、細胞培養物、組織培養物、又はカルス。
13. 花弁の放射相称配置を特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花を生産するクサトベラ属（Scaevola）植物を生産する方法であって、前記方法が、以下：
    ａ）前記植物中に前記ＦＵＳＥＤアレルを生成するように、植物を遺伝子操作すること、
    ｂ）前記植物中に前記ＦＵＳＥＤアレルを生成するように、植物を遺伝子編集すること、
    ｃ）前記植物中に前記ＦＵＳＥＤアレルを生成する突然変異を誘導すること、
    ｄ）請求項１に記載の植物、又は前記ＦＵＳＥＤアレルを含む植物を、別の植物と交配させること、
    ｅ）請求項１に記載の植物、又は前記ＦＵＳＥＤアレルを含む植物を、自家受粉させること、
    ｆ）前記ＦＵＳＥＤアレルを前記植物に導入すること、及び、
    ｇ）請求項１に記載の植物、又は前記ＦＵＳＥＤアレルを含む植物を、栄養繋殖させること
    の少なくとも１つを含む方法。
14. 前記ＦＵＳＥＤアレルの存在について、生産された前記植物を試験するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１４に記載の方法により生産される植物。
16. 種子を生産する方法であって、前記方法が、請求項１に記載の植物を栽培すること、及び生長した前記植物により生産される前記種子を回収すること、を含む方法。
17. 花弁の放射相称配置を特徴とする花表現型を有する少なくとも１つの花の生産を示す遺伝子型を有するクサトベラ属（Scaevola）植物を識別する方法であって、前記方法は、以下：
    ａ）ＦＵＳＥＤアレルの存在、及び
    ｅ）前記ＦＵＳＥＤアレルに関連するマーカの存在
    の少なくとも１つについて、植物を試験することを含み、
    ここで、ａ）〜ｂ）のいずれか１つは、前記植物が、上記花表現型を有する少なくとも１つの花を生産することを示す、方法。
18. 花弁の放射相称配置を特徴とするクサトベラ属（Scaevola）花表現型に関連するマーカ。
19. 以下：
    ａ）前記マーカを用いて、前記ＦＵＳＥＤアレルを検出することができる、及び
    ｂ）前記マーカを用いて、前記ＦＵＳＥＤアレルを含む植物と、含まない植物とを識別することができる、
    の少なくとも１つが当てはまる、請求項１８に記載のマーカ。
20. 以下：
    ｉ）配列番号７又は８のヌクレオチド位置３９に相当する位置にアデニン（Ａ）を含む配列番号７又は８の配列の断片、
    ｉｉ）ｉ）の前記断片の補体、
    ｉｉｉ）配列番号２４のヌクレオチド位置９９に相当する位置にアデニン（Ａ）を含む配列番号２４の配列の断片、
    ｉｖ）ｉｉｉ）の前記断片の補体
    の少なくとも１つを含む、請求項１８に記載のマーカ。

Images