WO2021040011A1 - 高温耐性、高収量性および単為結果性を示す果実類植物 - Google Patents

高温耐性、高収量性および単為結果性を示す果実類植物 Download PDF

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fruit
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亨 有泉
浩 江面
圭一郎 原田
良仁 篠崎
亮一 矢野
宇 陸
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Definitions

  • the present invention relates to fruit plants that exhibit high temperature tolerance, high yield and parthenocarpy.
  • the present invention also relates to a method for producing the above parthenocarpy fruit plant.
  • the present invention further relates to a method for selecting parthenocarpy plants from fruit plants.
  • Tomatoes are self-pollinating plants, but it is known that in facility cultivation, the pollination rate decreases and the fruit set rate decreases because the wind and insects that assist pollination are eliminated. Therefore, a method of promoting parthenocarpy and fruit enlargement by phytohormonal treatment of flower clusters is widely used.
  • pollination promotion methods using bumblebees and vibrators are also often used.
  • plant hormone treatment and pollination promotion treatment with a vibrator require enormous labor, and workability is significantly reduced.
  • the method using bumblebees has good workability, but there is a problem that the cost and labor of temperature control in the facility increase in summer and winter because the active temperature range of bumblebees is limited.
  • fruit set based on pollination and fertilization has a problem that it is difficult to secure a stable production amount throughout the year due to a decrease in pollen fertility in summer and winter. Therefore, in order to reduce the influence of environmental factors such as seasons and enable stable cultivation with less labor and cost, it is required to develop a technique for inducing parthenocarpy with higher work efficiency in tomato plants. ing.
  • Pat for example, pat2, etc.
  • Sldel1a mutation Sldel1a mutation, and the like.
  • Patent Documents 1 to 3 use DNA markers linked to the parthenocarpy gene to introduce parthenocarpy mutations into other tomato strains to obtain tomatoes that produce seedless fruits.
  • Mutations described in Patent Documents 1 to 3 can increase the efficiency of parthenocarpy, but are known to have an adverse effect on reproductive organs, nutritional organs, etc., and reduce fruit quality. ing.
  • An object of the present invention is to provide a gene mutation capable of inducing parthenocarpy with high efficiency at least without adversely affecting nutritional organs in fruit plants including fruit trees and fruit vegetables. ..
  • the present invention includes the following features.
  • the gene or its ortholog is a polynucleotide encoding a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 50% or more sequence identity with the amino acid sequence. Described fruit plant or part thereof.
  • Solic10g038170 gene or a mutation in its ortholog according to the present invention By using the Solic10g038170 gene or a mutation in its ortholog according to the present invention, it is possible to impart a high parthenocarpy rate of 99% or more in tomato, which is a fruit plant, and poor fruit set occurs at high temperatures. High yields can be maintained by induction of parthenocarpy even in areas where the yield is high. Furthermore, by inducing similar mutations in the above genes or their orthologs using gene duplication techniques such as genome editing and homologous recombination, highly efficient, parthenocarpy and high temperature resistance enhancement in all fruit plants. Can be induced.
  • This figure shows the parthenocarpy rate of the tomato Micro-Tom backcross line.
  • the figure above shows the parthenocarpy rate of strains cultivated under high temperature stress conditions (summer).
  • P indicates a parthenocarpy line.
  • WT wild-type strains
  • P indicates a parthenocarpy line.
  • WT wild-type strains
  • NP indicates a non-parthenocarpy line
  • P indicates a parthenocarpy line.
  • Three wild strains and four BC3S2 strains were tested, and 10 to 15 flowers were removed from each individual.
  • Genotype indicates the genotype of the identified genetic mutation described below. "No. emasc.” Indicates the total number of masculine flowers.
  • This figure shows the fruit yield in the tomato W2939 BC2S2 parthenocarpy line. The BC2S2 strain and the Micro-Tom wild strain were sown in May. The figure above shows the yield of red-ripened fruits between late August and early September (left: 4 Micro-Tom wild strains (WT), right: 6 W2939 BC2S2 parthenocarpy strains). The bar represents 5 cm.
  • the error bar represents the standard error, and ** represents the significant difference from the wild strain (Student's t-test; 1% level).
  • This figure shows the proportion of tomato seeded fruits and the number of seeds.
  • C, D and E are the number of seeds contained in the red ripe fruits obtained from the Micro-Tom wild strain (C), the BC3S2 non-parthenocarpy line (D), and the W2939 BC3S2 parthenocarpy line (E).
  • Cultivation was carried out in a closed cultivation room at a constant temperature of 24 ° C.
  • the numbers in the pie chart indicate the number of fruits. This figure shows fruit weight (weight) and sugar content (Brix value).
  • C and D are the measurement results of fruit weight and sugar content in the Micro-Tom wild strain (WT), W2939 BC3S2 non-parthenocarpy line (NP), and parthenocarpy line (SP) (fruit weight: WT, n).
  • This figure shows a map-based cloning of W2939 strains using SNP markers.
  • MT Micro-Tom wild strain
  • RE Regina wild strain
  • M Micro-Tom type homo
  • H hetero
  • R Regina type homo
  • S chromosome short arm
  • L chromosome long arm
  • Solic10g038170 is a gene with a total length of 1131bp consisting of only one exon, and has a domain conserved with class 3 lipase (triglyceride lipase).
  • class 3 lipase triglyceride lipase
  • single nucleotide substitutions both C ⁇ T
  • R37C and A49V two amino acid missense mutations
  • A refers to W2939 in the 1st to 150th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 (wild type (WT)) and SEQ ID NO: 3 (W2939 (mutant)) (SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively) compared with WT.
  • the mutation site, B indicates the mutation site in the 1st to 100th amino acid sequences (SEQ ID NOs: 7 and 8) of SEQ ID NO: 2 (wild type (WT)) and SEQ ID NO: 4 (W2939 (variant)), respectively.
  • the sequence surrounded by a black frame indicates the place where the mutation occurred.
  • Cas9 a sequence encoding the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes, pUbi; Petroselinum crispum ubiquitin promoter, tPea3A; soybean 3A terminator, pU6; Shiroinuanasuna (PU6; Single-stranded guide RNA, pNOS; promoter derived from Nopaline Synthase gene, NPTII; canamycin resistance gene, tNOS; terminator derived from Nopaline Synthase gene, RB; T-DNA borderline sequence derived from Agrobacterium (Right-border), LB; agrobacterium Represents a T-DNA border sequence (Left-border) derived from Um.
  • This figure shows a mutagenesis model with the CRISPR / Cas9 system.
  • insertion Insertion
  • substitution Substation
  • deletion Deformation
  • NHEJ Non-Homologous end joining
  • This figure shows the target sequence and the base sequence around the causative mutation (that is, the base sequence from the translation start point of SEQ ID NO: 1 of Solic10g038170 to 300 base pairs; SEQ ID NO: 11 (normal chain) and SEQ ID NO: 12 (complementary chain)).
  • each PAM sequence is shown by a double line
  • the sequence in which a single nucleotide substitution has occurred in the W2939 line is shown by a black frame.
  • This figure shows the Target1 peripheral sequences of wild-type strains (WT) and T0 mutation-introduced strains (# 3-1, # 9-1, # 10-1, # 25-1, # 37-1, # 42-1). The editing pattern and the base sequence of each strain are shown.
  • the bold sequence refers to the target sequence (Target1) designed on the 5'side
  • the "TGG” sequence refers to the PAM sequence
  • the 23rd "T” sequence refers to the mutation site by the CRISPR / Cas9 system.
  • Chimera (# 9-3, # 9-4) indicates from the waveform of the Sanger sequence that transformed cells with different mutation patterns are considered to be mixed.
  • This figure shows the amino acid sequence change of the T0 mutation-introduced line.
  • the amino acid sequences around the target sequence (Target1) in the wild strain (WT), the W2939 strain, and the strain into which the mutation was introduced homozygously are shown.
  • Mutation represents the type of mutation
  • Polypeptide lens represents the total length of the polypeptide chain produced by translation (here, a.a .: represents an amino acid).
  • Amino acid residues surrounded by a black frame indicate the location of mutation.
  • * indicates a stop codon.
  • the causative gene expressing the parthenocarpy trait is Solic10g038170 gene or its ortholog.
  • the above gene exists on chromosome 10 of a tomato plant (may be referred to as "crop") and is presumed to be one of the dad1 gene family.
  • the DAD1 protein is chloroplast phospholipase A1, which catalyzes the initial steps of jasmonate biosynthesis.
  • the Solic10g038170 gene which may also be referred to as the Sldad1 gene, contains a domain encoding class 3 lipase (triglyceride lipase) activity (FIG. 7).
  • the Solic10g038170 gene or its ortholog is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or the nucleotide sequence and, for example, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more. , About 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 98% or more, or a polynucleotide which may contain a nucleotide sequence having about 99% or more sequence identity.
  • the ortholog may have less than 50% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the Solyc10g038170 gene or the protein encoded by its ortholog is, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence and, for example, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more. , About 85% or more, about 90% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 98% or more, or about 99% or more of nucleotide sequences having sequence identity.
  • the ortholog may have less than 50% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • nucleotide sequence of the Solic10g038170 gene and its ortholog or the amino acid sequence encoded by it is aligned, for example, about 50% or more, about 60% or more, for the region (or range) having the highest homology. Alternatively, it may have about 70% or more sequence identity.
  • regions are, for example, the 52nd to 240th regions of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the 18th to 80th regions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (FIG. 9).
  • ortholog is a group of homologous genes generated from a common ancestral gene by speciation in fruit plants, and is a group of genes having homologous functions in species different from tomato plants. To say.
  • sequence identity is used to introduce a gap between two sequences by using a protein or gene search system using a known algorithm BLAST or FASTA, or to create a gap. It can be determined without introduction, preferably by introducing a gap (Zheng Zhang et al., J. Comput. Biol., 2000; 7: 203-214; Altschul, FA et al., Algorithm. of Molecular Biologic, 1990; 215: 403-410; Pearson, WR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85: 2444-2448).
  • parthenocarpy refers to seedless fruits in which ovaries, tentacles, etc. are enlarged without seed formation when pollination and fertilization do not occur in plants. It means to occur.
  • Parthenocarpy in the present invention refers to the property that a plant produces parthenocarpy without the need for artificial parthenocarpy-inducing treatments such as plant hormone treatment or specific physical stimuli.
  • the part-time consequentiality according to the invention is that a mutation in the Solic10g038170 gene or its ortholog lacks at least one amino acid in the amino acid sequence of the gene or the protein encoded by that ortholog. It contains a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that includes loss, substitution, addition or insertion, and such mutations reduce (or suppress) or delete the expression (or function) of the protein.
  • the mutation involves the partial or total nucleotide deletion, substitution, addition or insertion of the nucleotide sequence of the gene or its ortholog, thereby expressing (or to the extent that parthenocarpy) the protein. Function) is reduced or deleted, preferably disruption of gene function.
  • a decrease or deletion of expression (or function) of the Solyc10g038170 gene or the protein encoded by its ortholog can be caused by the deletion, substitution, addition or insertion of at least one amino acid in the amino acid sequence of the protein.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Examples of such single base substitutions are not limited to the following, but in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, substitution of arginine at position 37 with another amino acid, substitution of alanine at position 49 with another amino acid, And both of them can be included.
  • amino acids other than arginine in the case of the 37th arginine for example hydrophilic amino acids (excluding arginine) or hydrophobic amino acids such as cysteine, and in the case of the 49th alanine, amino acids other than alanine.
  • an example of a polynucleotide comprising the Solic10g038170 gene or its ortholog with a partially consequential gene mutation comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, which sequence is 109 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It is the same as the sequence containing a single base polymorphism in the second C109T and the 146th C146T (where C is cytosine and T is thymine).
  • the expression of the gene or its ortholog can be significantly or significantly reduced by partially or wholly knocking out and destroying the gene or its ortholog using gene duplication techniques such as gene duplication and homologous recombination. It may (or decrease) or be deleted, or the expression of the gene or its ortholog can be expressed by inserting or adding a heterologous base sequence into the nucleotide sequence of the gene or its ortholog using gene modification technology. It may be significantly or significantly reduced (or reduced).
  • the structural form of the above mutation is not limited to the above-exemplified ones, and any structural form may be used as long as it can express parthenocarpy in fruit plants.
  • Examples of the ortholog of the Solic10g038170 gene include those listed in Table 1 below, but are not limited thereto.
  • the parthenocarpy fruit plants of the present invention must have mutations in the Solic10g038170 gene or the gene or ortholog thereof such that the expression of the protein encoded by the Solic10g 038170 gene or its ortholog is reduced or deficient. It is characterized by.
  • the Solic10g038170 gene or its ortholog, the causative gene mutation, and the protein see 1. It is as described in, and can be quoted as it is here.
  • the plants used for gene modification or transformation for imparting parthenocarpy are fruit plants (for example, fruits and vegetables, plants including fruit trees), for example, cultivated plants for which fruits are edible.
  • Such plants are not limited to the following, but include, for example, Solanaceae [Tomato (Solanum lycopersium), Nas (Solanum melongena), Peppers (Capsicum annuum var.
  • Cucurbitaceae Cucurbitaceae (Cucumis sativus L.), melon (Cucumis melo L.), watermelon (Cittlelus lanatus), pumpkin (Cucurbita) Cucurbita, Cucurbita, Cucurbita Cucumis melo var.
  • Makuwa, etc. Cucurbitaceae [Strawberry (Fragaria ananassa), Apple (Malus pumila), etc.], Cucurbitaceae [Grape (Vitis spp.), Etc.], Ahi Amarijo (Pepper), Capsicum bac (Hima; Ricinus communis), Robusta coffee tree (Coffea canephora) and other plants can be mentioned.
  • the above-mentioned plants are not parthenocarpy or have considerably low parthenocarpy in the natural environment, and a preferable plant is tomato (tomato plant).
  • tomatoes examples include Solanum lycopersicum, Solanum seraciforme (also referred to as Lycopersicon cerasifome), Solanum pympinylimporium (Solanum lycopericum) (Solanum cheesmanii; also Lycopersicon Cheesmanii referred), Solanum Parubifurorumu (Solanum parviflorum; also referred Lycopersicon Parviflorum), Solanum Kumiereusukyi (Solanum chmielewskii; also referred Lycopersicon chmielewskii), Solanum Hirusutumu (Solanum hirsutum; Lycopersicon (also called hilsutum), Solanum pennelli (also referred to as Solanum Lycoperson pennellii), Solanum pennellii (also referred to as Lycopersicon peruvianum), Solanum chilenselum Examples include, but are not limited to
  • Wild-type tomato variety Microtom (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) (Scott JW, Harbaugh BK (1989) Micro-Tom A miniature dwarf tomato.FloridA 1-6) are commercially available and can also be obtained from Tomato Genetics Resource Center (TGRC) (USA) under accession number LA3911.
  • the wild-type tomato variety Microtom is dwarf (about 10 to 20 cm), has small leaves and fruits, and can be crossed with conventional tomato varieties.
  • the entire genome sequence of the wild-type tomato variety Microtom has been determined (Kobayashi M, et al., Plant Cell Physiol. 2014; 55 (2): 445-454).
  • derivative strain refers to a progeny plant obtained by one or more mating of the original plant with another plant line / variety, or by mutagenesis or mutagenesis. ..
  • the expression (or function) of the Solic10g038170 gene or the protein encoded by the ortholog thereof is reduced or deleted, preferably by performing the desired gene modification operation on the wild-type plant as described above. Is a plant that can be obtained by causing disruption of gene function.
  • Gene mutations include deletions, substitutions, additions or insertions of partial or total nucleotides in the Solyc10g038170 gene or its orthologous nucleotide sequence, thereby causing parthenocarpy expression (or function) of the above proteins. Is reduced or deleted, preferably disruption of gene function.
  • the gene or its ortholog is partially or wholly knocked out and destroyed, or the arginine at position 37 in the amino acid sequence of, for example, SEQ ID NO: 2 of the protein encoding the gene is cysteine (R37C).
  • the introduction of mutations such that the 49th alanine is substituted for valine (A49V) can be mentioned.
  • These mutations induce parthenocarpy.
  • parthenocarpy can be achieved if the mutation reduces or disrupts gene function.
  • the fruit plant of the present invention has a high parthenocarpy rate, a high fruit set rate and a high yield even at a high temperature (for example, an environmental temperature of 30 ° C. or higher) as compared with the wild type (not including the above gene mutation). Has the property of being able to impart.
  • the parthenocarpy rates in the plants of the present invention are not limited, for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more. It is 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the wild strain had a parthenocarpy rate of 57.1%, whereas the plant of the present invention, for example, a tomato plant showed a high parthenocarpy rate of 99.4%.
  • the yield when the weights of the fertilized red ripe fruits were totaled and compared, the wild strain was 26.3 ⁇ 2.7 g, whereas the plant of the present invention, for example, a tomato plant was 63. The yield was 1 ⁇ 2.5 g, which was about 2.4 times higher.
  • the fruit plant of the present invention is preferably homozygous (also simply referred to as "homo") for the above mutations in the Solic10g038170 gene or its ortholog. Being homozygous, the two alleles have the same mutation. In contrast, in the heterozygous type (also simply referred to as "hetero”), one of the two alleles is normal and the other has a mutation.
  • the plants of the present invention have phenotypes such as premature ovary hypertrophy, protrusion of styles, discoloration of anther tube tips, and residual petals and styles after ovary enlargement due to the above mutations in the Solic10g038170 gene or its ortholog. In some cases (see Examples below).
  • the present invention further provides a portion of the fruit plant in addition to the above-mentioned plant body.
  • the plant portion includes, but is not limited to, for example, stems, leaves, roots, flowers, buds, fruits, seeds, tissues, cells, callus and the like.
  • callus is an artificial cell mass generated when a part of a plant body is cultured on a medium containing a plant hormone (for example, auxin, cytokinin, etc.).
  • Plant portions such as those described above have mutations in the Solic10g038170 gene or its ortholog that reduce or delete expression of the protein encoded by its ortholog.
  • the present invention further describes the above 2.
  • the second step of culturing the cells, callus or tissue of the plant (transformant) in the first step to prepare a plant population, and selecting a plant having participatory results from the plant population in the second step.
  • Third step Provide a method characterized by including.
  • a mutation of the Solic10g038170 gene or its ortholog is introduced into cells, calluses or tissues (including a plant part) of a wild-type plant.
  • This gene mutation is a decrease or deletion of the expression of the gene or its ortholog, and for this purpose, the gene is knocked out by using a gene modification technique such as a genome editing technique or a homologous recombination technique. Can be destroyed or chipped.
  • a gene modification technique such as a genome editing technique or a homologous recombination technique. Can be destroyed or chipped.
  • An example of the above mutation is disruption or deletion of the above Solic10g038170 gene or its ortholog.
  • Another example of the mutation is in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the Solic10g038170 gene or the nucleotide sequence of its ortholog, at least one nucleotide of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, eg, position 109, 146, or both. , Or a position in the nucleotide sequence of the ortholog that corresponds to that position, is to introduce a polynucleotide containing a mutation due to a single nucleotide substitution.
  • An example of the polynucleotide is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Genome editing is a technique for editing and modifying genomic DNA using, for example, an artificial cleaving enzyme such as TALEN (TALE nuclease), a CRISPR-Cas system, or the like. Any technique for genome editing can be used in the methods of the invention, preferably the use of the CRISPR-Cas system.
  • an artificial cleaving enzyme such as TALEN (TALE nuclease), a CRISPR-Cas system, or the like.
  • Any technique for genome editing can be used in the methods of the invention, preferably the use of the CRISPR-Cas system.
  • the CRISPR / Cas9 system was discovered from the adaptive immune system against bacterial and archaeal viruses and plasmids, but the vector construction is relatively simple and it is possible to modify multiple genes at the same time (Jinek et. al., Science, 17,337 (6096): 816-821,202; Sander et al., Nature biotechnology, 32 (4): 347-355, 2014).
  • This system includes a Cas9 protein and a single-stranded guide RNA (single guide RNA; sgRNA) having about 20 base pair target sequences.
  • the sgRNA recognizes the PAM sequence near the target sequence and specifically binds to the target genomic DNA, and the Cas9 protein is DSB (double-strand break) upstream of the 5'side of the PAM sequence. ) Is induced.
  • the most used Cas9 protein is SpCas9 type, and since the PAM sequence is NGG, there are few restrictions on the mutation introduction position.
  • the CRISPR / Cas9 system has already been used as a mutagenesis technique for plants and has been confirmed to be applicable for the first time in 2014 in tomatoes (Blocks et al., Plant physiology, 166 (3): 1292). -1297, 2014).
  • the target gene in the present invention is the Solic10g038170 gene or its ortholog.
  • the sequence of the Solic10g038170 gene or its ortholog is, for example, the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or the polynucleotide sequence and, for example, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 85% or more.
  • a region having a PAM sequence can be selected as a target sequence so that it can be recognized by, for example, Cas9.
  • the PAM sequence is, for example, NGG (N is an arbitrary base).
  • N is an arbitrary base.
  • an example of the target sequence in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is the following sequence.
  • the 3'end 3 bases (underlined) in these sequences are NGG.
  • Cas9 for example, S.A. SpCas9, S. cerevisiae derived from pyogenes. SaCas9, S. et al. Derived from aureus. Examples include StCas9 derived from thermophilus.
  • the PAM sequence also differs depending on the origin of Cas9. For example, SpCas9 recognizes NGG (N is an arbitrary base).
  • the sgRNA is a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence of preferably 18 to 26 bases, for example, 20 to 24 bases, from one base upstream of the PAM sequence in the target gene.
  • promoters include ubiquitin promoter, U6 promoter, CaMV35S promoter, and other plant tissue-specific promoters.
  • expression vectors include a vector containing the above-mentioned Cas9-encoding nucleotide sequence, sgRNA sequence, promoter sequence, drug resistance gene or reporter gene, terminator, etc., and in addition to the above-mentioned elements, T-DNA derived from Agrobacterium.
  • examples thereof include binary vectors containing a border sequence (Light-border), a T-DNA border sequence derived from Agrobacterium (Left-border), and the like.
  • the vector include pUC-based, pBluescript-based, pBI-based, and pPZP-based vectors. An example of a binary vector is shown in FIG. 10 (an example with two targets).
  • the above vector can be introduced into plants, cells, callus, tissues (including plant parts such as leaves, roots and stems) by, for example, the Agrobacterium method, electroporation method, protoplast method or the like.
  • the target gene of the present invention is, for example, cleaved, deleted or (partially or completely) disrupted (knocked out), a foreign gene is inserted (knocked in), or substituted, duplicated or inverted. It enables the introduction of mutations such as (Fig. 11).
  • a foreign gene sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the above mutation imparts at least a parthenocarpy phenotype to the plant, as well as high fruit set rate, high temperature tolerance, high yield and the like.
  • Second step In this step, cells (including cultured cells (cell mass)), callus or tissue (including plant portion) of the plant (transformant) in the first step are cultured. Create a plant population.
  • Culturing can be performed by tissue culture (usually 20 to 30 ° C.) using a solid medium or a liquid medium.
  • the medium is a medium such as that used in plant tissue cultures, such as yeast extract, coconut milk, amino acids, sugars (eg, sucrose), growth regulators (eg 2,4-D (2,4). -Medium containing dicholophenoxy acid acid), NAA ( ⁇ -naphtaleneacetic acid), IAA (indole-3-acetic acid), vitamins (eg, thiamine, calcium pantothenate, biotin, folic acid, nicotinic acid), inorganic salts, etc. (Usually, pH 5.5 to 6) can be exemplified.
  • the above selection includes detecting a decrease or deficiency in the expression of the Solic10g038170 gene or its ortholog, or a disruption or deficiency of the gene or its ortholog in cells or tissues isolated from the produced plant population.
  • the detection method can include a PCR method, a hybridization method, and the like as described in 3.4 below.
  • the selected parthenocarpy plant can be cultivated using a cultivation method suitable for the plant. Cultivation can be carried out by any cultivation method such as hydroponics, facility cultivation (eg, greenhouse cultivation, plant factory cultivation, etc.), open field cultivation, planter cultivation and the like.
  • the present invention further comprises a method for selecting parthenocarpy plants from fruit plants, which suppresses the expression of the Solic10g038170 gene or its ortholog in the cells or tissues of the fruit plants, or Provided are methods comprising detecting disruption or deletion of the gene or its ortholog.
  • genomic DNA chromosome
  • total RNA is isolated from plant cells or tissues, cDNA is synthesized from RNA as needed, and then a pre-prepared Solyc10g038170 gene or its ortholog-specific primer or A probe (these include a label such as a fluorescent dye, if necessary) is brought into contact with the above DNA or RNA or cDNA, and hybridization (including FISH method and SNP analysis method) or polymerase chain reaction (PCR). Includes quantitative RT-PCR).
  • the presence or absence of a protein encoded by the Solic10g038170 gene or its ortholog in the above cells may be examined by, for example, an immunoassay using a specific antibody against the protein, or the presence or absence of mutations in the protein. May be examined by sequencing.
  • Example 1 ⁇ Acquisition and characteristics of parthenocarpy tomato W2939 strain> 1.
  • Test Plants and Cultivated Tomatoes show parthenocarpy from a large-scale mutant population of tomatoes treated with ethyl methanesulfonate (EMS) on Microtom, a dwarf model variety.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • the W2939 (TOMJPW2939) line was selected.
  • the BC 2 S 2 , BC 3 S 2 line in which the wild strain of "Micro-Tom" was returned to this line, and the F 3 hybrid line crossed with the mini tomato variety "Ueleie 106 WP". was used in the following experiments.
  • BC 3 S 2 lines were carried out during the summer months (May to September) in a closed system cultivation room. Seeds germinated in petri dishes were transplanted into rock wool cubes (Grodan) and cultivated using the NFT system in the same manner as in greenhouses.
  • the nutrient solution used was OAT House A formulation (OAT Agrio), and the EC was adjusted to 1.5. Irrigation was set to occur every morning at 8 o'clock for 15 minutes.
  • the room temperature was kept constant at 24 ° C., and the light period was set to 16 hours.
  • the plants were covered with a wrap for 2 days after transplanting, and acclimation was carried out with a gradual gap.
  • BC 2 S 2 were backcrossed the wild-type strain system, was evaluated for the results of a single in the emasculation method in high temperature conditions. BC 2 S 2 Parthenocarpy 5 individuals were used for the sex line and 4 individuals were used for the wild strain, and 10 to 20 flowers per individual were sterilized 2 days before flowering. As a comparison of the case of changing environmental conditions, it was evaluated in conjunction also backcross BC 3 S 2 system of the W2939 strains were grown in a closed system cultivation room "Micro-Tom" wild-type strain.
  • BC 3 S 2 Parthenocarpic system BC 3 S 2 non-single for the results of the system by four individuals, try subjected to a wild-type strain three individuals, was emasculated 10 to 15 flowers per individual to 2 days before flowering.
  • the first flower cluster was subjected to vibration pollination to prevent adverse effects on the fruit set rate due to unsuccessful fertilization of the first flower cluster.
  • Judgment was made about 10 days after flowering, and fruits having a diameter of 5 mm or more were judged to be parthenocarpy fruits.
  • F 3 hybrids Parthenocarpic lines were seeded in May, for a typical one individual F 3 hybrid non-parthenocarpic lines and "Ueleie106WP" wild-type strain, collected Akajuku fruit and Midorijukuhate in early September did. As for green ripe fruits, only fruits having a diameter of 1 cm or more were collected. Since the yield survey was conducted on individuals that overlapped with the parthenocarpy rate survey, no quantitative survey was conducted.
  • the average temperature was 30 ° C or higher and the maximum temperature was 40 ° C or higher in many days in early August, when males were removed from the end of June when the first flower cluster began to bloom.
  • the presence or absence of ovary hypertrophy after sterilization was determined under such environmental conditions where fruit set by fertilization was severe, 19% (12 out of 63 flowers) in the parthenocarpy line and 4% (12 out of 63 flowers) in the wild strain Three of the 77 flowers) have settled (Fig. 1).
  • Plants BC 3 S 2 Parthenocarpic system the non-single for each 4 individual results lineage, "Micro-Tom" wild-type strain of the three individuals subjected to trial, was emasculated the 3 to 15 flowers per individual.
  • BC 3 S 2 non-single for 9.8% the result lineages (41 flowers 4 of flower)
  • BC 3 S 2 8 a parthenocarpic line. 5% (5 out of 59 flowers) set fruit.
  • the "Ueleie106WP" wild-type strain and the F 3 lines were grown in the cultivation environment, in June and July, carried out emasculated to 2 days before flowering, was investigated for the results of a single.
  • F 2 hybrid population fruit set there heat tolerance of the high was strains, the fruit set did not show low heat tolerance system determines that heat tolerance not, with each next-generation research.
  • F 3 hybrid system and the "Ueleie106WP" wild-type strain of the 4 individuals each test trial was emasculated the 20 flowers per individual.
  • parthenocarpy rate is "Ueleie106WP" wild strain, with strains that do not exhibit heat tolerance of F 3 hybrids lines, was 13.8%.
  • the heat-resistant strain showed a parthenocarpy rate of 57.5%. From this result, it was suggested that the parthenocarpy rate may be improved when crossed with the non-core cultivar "Ueleie106WP" as compared with the case where the genetic background is "Micro-Tom".
  • Fruit traits such as fruit weight, seeding rate, and sugar content (Brix value) are important traits that affect the taste of tomatoes.
  • Fruit traits such as fruit weight, seeding rate, and sugar content (Brix value) are important traits that affect the taste of tomatoes.
  • the average fruit weight of the "Micro-Tom" wild strain cultivated in the closed cultivation room was 3.33 ⁇ 0.26 g, but that of the BC 3 S 2 non-parthenocarpy strain was 2.83 ⁇ 0. a 23g, BC 3 S 2 parthenocarpy the result lineages was 2.73 ⁇ 0.19 g.
  • the fruit weight was smaller in the seedless fruit of the parthenocarpy line, but the decrease in fruit weight was suppressed in the case of having seeds (Fig. 3).
  • a reduction in fruit weight in seedless fruits has also been confirmed in planta mutants, where the authors lack auxin, which should be supplied due to non-seed formation, and suppress cell division, especially in the flesh. (Carrera et al., Plant physiology, 2012; 160 (3): 1581-96). Another possible cause is an increase in the number of fruit set due to parthenocarpy.
  • the average number of red ripe fruits in a certain period measured in the above yield survey was 8.0 ⁇ 0.9 in the "Micro-Tom" wild strain, but BC 2 S 2 parthenocarpy produced from the W2939 strain. In the consequential line, it increased more than 4 times to 36.3 ⁇ 3.1.
  • the Brix value was used as an index indicating the sugar content.
  • the average Brix value in the cultivated in a greenhouse "Micro-Tom" wild strain 8.59 ⁇ 0.12%, in the BC 2 S 2 lines was the 7.70 ⁇ 0.06%, Student ' No significant difference was found in the st-test.
  • the average Brix value of the "Micro-Tom" wild strain cultivated in the closed cultivation room was 5.57 ⁇ 0.15%, but that of the BC 2 S 2 non-parthenocarpy strain was 5.02 ⁇ . It was 0.15% and 7.90 ⁇ 0.37% in the BC 2 S 2 parthenocarpy strain.
  • Example 2 ⁇ Identification of parthenocarpy causative genes and mutations> 1.
  • Water supply is a nutrient solution adjusted to 1.2 to 1.3 dS / m with OAT House A prescription (Otsuka No. 1 1.5 g / L; Otsuka No. 2 1 g / L, OAT Agrio) from 9:00 to 16:00. It was circulated every hour for 5 minutes.
  • parthenocarpy Judgment of parthenocarpy by flower phenotype The judgment of parthenocarpy was based on the flower phenotype at the flowering stage. In the flower organs, individuals with protrusion of the corolla due to early hypertrophy of the ovary, dehiscence of the anther tube, and incomplete detachment of the petals and corolla were judged as parthenocarpy individuals.
  • the DNA extraction buffer was prepared by adding distilled water to 4 ml of 200 mM Tris, 10 ml of 250 mM NaCl, 1 ml of 25 mM EDTA and 1 ml of 0.5% SDS to make 20 ml.
  • the solution of ground leaves with pestle was centrifuged at 13,200 rpm for 2 minutes, and 300 ⁇ l of the supernatant was added to a new 1.5 ml tube. Further, 300 ⁇ l of an equal amount of isopropyl alcohol was added to precipitate DNA. After shaking for 2 minutes, centrifugation was performed at 13,200 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the tube was carefully tilted to discard the solution, 1 ml of 70% ethanol was added, and then the tube was centrifuged again at 13,200 rpm for 5 minutes. The solution was discarded, air-dried for about 30 minutes and sufficiently dried, 100 ⁇ l of 1 ⁇ TE solution was added, the mixture was shaken for 5 minutes, and stored at 4 ° C. The concentration of each sample for which extraction was completed was measured using Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific).
  • Primer design The sequence information obtained in 1.4 above is input to the BLAST search (https://solgenomics.net/tools/blast/) of Sol Genomics Database, and about 300 base pairs before and after the SNP. The peripheral array was acquired. Primer3 (https://primer3plus.com/) was used as a primer design tool, and it was designed so that about 150 base pairs before and after the SNP could be amplified.
  • KOD FX Neoo (1.0 U / ⁇ l) 0.3 ⁇ l, 2 ⁇ Buffer 7.5 ⁇ l, 2 mM dNTPs 3.0 ⁇ l, Fw Primer (10 ⁇ l) 0.3 ⁇ l, Rv Primer (10 ⁇ l) 0.3 ⁇ l, It consists of 3.3 ⁇ l of distilled water and 0.3 ⁇ l of template DNA, for a total of 15 ⁇ l.
  • the PCR conditions were as follows: after treatment at 94 ° C. for 2 minutes, 35 cycles were repeated with 98 ° C. for 10 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 30 seconds as one cycle, and then treatment was performed at 68 ° C. for 7 minutes.
  • Electrophoresis A 1% Star agarose gel (RIKEN) was used for electrophoresis of PCR products. 0.6 ⁇ l of 10 ⁇ loading dye (Takarabio, Kyoto, Japan) was mixed with 5 ⁇ l of the PCR reaction solution, the agarose gel was set in an electrophoresis tank filled with 1 ⁇ TAE buffer, and the mixed solution was applied. Electrophoresis was performed at 100 V for 15 minutes to confirm whether the area around the SNP site was specifically amplified. Gene Ladder Wide1 (Wako) was used as the DNA marker. After the electrophoresis, the presence or absence of a band was confirmed with a UV irradiation gel imaging device E-BOX-Vx2 / 20M (Vilber Lourmat).
  • Exostar treatment In order to remove unreacted primers and dNTPs, Exosoluse I (New England Biolabs) and Shrim Alkaline Phosphatase (rSAP, New England Biolabs treated with PCR and treated with New England Biolabs) were used.
  • the solution composition consists of 1 ⁇ l of Exosoluse I, 1 ⁇ l of rSAP, 1 ⁇ l of distilled water (DW), and 5 ⁇ l of PCR product, for a total of 8 ⁇ l.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes and 80 ° C. for 15 minutes.
  • Cultivation was carried out by thin film hydroponics using rock wool cubes (Grodan) in a closed cultivation room in the 2D building of the University of Tsukuba in order to accurately determine the phenotype. Irrigation was performed daily at 8 am for about 10 minutes. The temperature was kept constant at 24 ° C and the humidity was maintained at around 60 to 70%.
  • OAT House A formulation OAT House No. 1 1.5 g / L; OAT House No. 2 1 g / L, OAT Agrio
  • EC electrical conductivity
  • parthenocarpy Judgment of parthenocarpy based on flower phenotype The judgment of parthenocarpy was based on the flower phenotype at the flowering stage. In the flower organs, individuals with protrusion of the corolla due to early hypertrophy of the ovary, dehiscence of the anther tube, and incomplete detachment of the petals and corolla were judged as parthenocarpy individuals.
  • Maxwell16 DNA purification Kits Promega was used to increase the purity. About 200 mg of fresh leaf sample was collected in a 1.5 ml Eppendorf tube, frozen in liquid nitrogen, and then crushed using a homogenization pestle. The crushed leaf sample was added frozen to the cell containing the Lysis Buffer of the cartridge in Kits. After attaching the plunger attached to Kits, it was set in Maxwell16 (Promega), and 400 ⁇ l of Elution Buffer was applied. After the extraction was completed, the mixture was centrifuged at 6,000 rpm for 3 minutes, and the solution from which the precipitate had been removed was transferred to another 1.5 ml tube for purification. The concentration of the extracted genomic DNA was measured using NanoDrop (Thermorphisher scientific).
  • Genome-tip column QIAGEN
  • Maxwell purification 250 ⁇ l of each individual DNA solution was dispensed into a 1.5 ml tube so that the total amount of DNA was within 30 ⁇ g. 1 ml of QBT buffer (QIAGEN) was added to this DNA solution and mixed. A Genome-tip column was placed in a 15 ml conical tube (Falcon) and 3 ml of QBT buffer was added for equilibration. The passing fraction of the column was discarded.
  • the solution contained in the conical tube was dispensed into three 2 ml tubes and centrifuged at 13,200 rpm for 15 minutes at a setting of 4 ° C. After centrifugation, the tube was carefully tilted to discard the supernatant, then about 1 ml of 70% ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 13,200 rpm for 15 minutes at a setting of 4 ° C. After centrifugation, the tube was turned upside down and air dried for 15 minutes, and when the tube was sufficiently dry, 30 ⁇ l of TE buffer was applied and this solution was used for whole genome sequencing.
  • Primer design BLAST search https://solgenomics.net/tools/blast/) of Sol Genomics Database by acquiring base sequence information around SNP from the physical position of the candidate gene mutation found as a result of resequence. The peripheral sequence of about 300 base pairs before and after the SNP was obtained.
  • Primer3 https://primer3plus.com/ was used as a primer design tool, and it was designed so that about 150 base pairs before and after the SNP could be amplified.
  • the designed primers are as shown in Table 2.
  • KOD FX Neo Toyobo
  • the composition of these reaction solutions was KOD FX Neoo (1.0 U / ⁇ l) 0.24 ⁇ l, 2 ⁇ buffer 6 ⁇ l, 2 mM dNTPs 2.4 ⁇ l, Fw primer (10 ⁇ l) 0.24 ⁇ l, Rv primer (10 ⁇ l) 0.24 ⁇ l, distillation. It consists of 2.58 ⁇ l of water and 0.3 ⁇ l of template DNA, for a total of 12 ⁇ l.
  • the PCR conditions were as follows: after treatment at 94 ° C. for 2 minutes, 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 30 seconds were repeated for 35 cycles, and then treatment was performed at 68 ° C. for 7 minutes.
  • SL2.50 and SL3.0 differed in the physical position corresponding to Solic10g038170, but the place where the mutation was introduced was common among the lineage comparisons.
  • Solic10g038170 on chromosome 10 other chromosomes were also searched to see if there were any gene mutations commonly detected in all strains. However, no other mutations were commonly detected. Mutations of two positions revealed from the results of whole genome sequencing, actually to confirm that you parthenocarpy linkage, a backcross BC 3 S 1 line of the "Micro-Tom" wild strain Using, linkage analysis by Sanger sequencing was performed.
  • BC 3 S 1 parthenogenetic 21 individuals variant forms genotype mutation site in all the result lineage, while in BC 3 S 1 non-parthenocarpic line, hetero or wild-type strain at 32 individuals all It was genotype.
  • the BC 3 S 1 strains should parthenogenetic not involved in the result of mutations have been most excluded, in addition to Solyc10g009590, Solyc10g009640, on Solyc10g019033 mutations Solyc10g038170 has been detected as a candidate.
  • Solic10g 909590 was presumed to be a tomato homologue of the TRICHOME BIREFRINGENCE-LIKE family gene involved in cellulose synthesis and deposition in the secondary cell wall of Arabidopsis thaliana.
  • Solic10g 909640 was presumed to be a tomato homologue of the Jasmonate resetant 1 (JAR1) gene that catalyzes the synthesis of jasmonyl isoleucine (JA-Ile) in Arabidopsis thaliana and induces a jasmonic acid (JA) response. al., Science, 2012; 336: 1708-1711). Solic10g019033 was an unknown gene that has not been reported to suggest function in the past. For these three gene mutations, linkage analysis by sanger sequencing was performed using similar individuals. In the BC 3 S 1 parthenocarpy line, 6 out of 21 individuals with Solic 10g 909590 were genotyped as wild-type homozygous.
  • JAR1 Jasmonate resetant 1
  • Solic10g019033 was not expressed at all in the ovary, but it was slightly expressed in Solic10g038170. From this result, it was not possible to confirm whether there was a difference in the expression level of Solic10g038170 (0.03 and 0.02, respectively) between the parthenocarpy line and the non-parthenocarpy line. Since the difference in expression level between the two genes was small, we decided to use public data together for judgment. Solic10g019033 was the first gene discovered in ITAG3.0, which is annotation information for the tomato genome.
  • Solic10g019033 was considered very unlikely that the mutation on Solic10g019033 was involved in the parthenocarpy.
  • Solic10g038170 was predicted to encode for the early stages of JA biosynthesis, according to annotation information. Therefore, among the genes analyzed by RNA-seq, genes related to JA function were searched from the DEGs list in which specific expression patterns were observed in parthenocarpy strains.
  • the gene with the second lowest q-value in the gene group whose expression was increased in the parthenocarpy strain encodes the Jasmonic acid 2 (JA2) protein, and the 238th gene is the NAC domain protein IPR003441 (JA2-like). ; JA2L) was coded.
  • JA2L is a gene whose expression is promoted by JA, and it is reported that the antisense individual of JA2L, in common with the jai1 mutant having a defect in JA transmission, enhanced disease resistance by persistent stomatal closure. Has been done.
  • Solic10g038170 The functional deficiency of Solic10g038170 is thought to cause JA biosynthesis, which is different from the results considered from the reports, but the change in the expression pattern of these genes as a result of RNA-seq is that JA biosynthesis in the mutant. It suggested that there was a change in the transmission pathway.
  • Solic10g038170 is a gene with a total length of 1.131 kbp consisting of only one exon, and has a domain conserved with class 3 lipase (triglyceride lipase).
  • class 3 lipase triglyceride lipase
  • At2G44810 on chromosome 2 had about 63% amino acid sequence homology, and was prominently similar to At4G16820 (about 45%), which had the second highest homology.
  • the amino acid sequences of this ortholog and Solic10g038170 were compared.
  • the 37th arginine of the two missense mutation sites was common to both sequences (Fig. 9). Therefore, assuming that this gene is a homologue of Solic10g038170, the 37th arginine is more important than the 49th amino acid for the maintenance of gene function, and the mutation of the 37th amino acid residue is the gene expression and translation. It was thought to affect the function of later proteins.
  • ⁇ Creation and characteristics of Solic10g038170 gene mutation-introduced strain > 1.
  • the sgRNA that induces mutation in the Solic10g038170 gene is a CRISPR-P2.0 (http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/, 20191) target sequence search site for the CRISPR / Cas9 system. Retrieved 10th May, Lei et al., Molecular plant, 2014; 7 (9): 1494-1496), and CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/, accessed 10th January 2019, Naito et al. , Bioinformatics, 2015: 31 (7): 1120-1123).
  • FIG. 1 An example of the Cas9 vector is shown in FIG.
  • two target sequences were set in order to cause a large-scale mutation in Solic10g038170.
  • the mutation generated in the W2939 strain is related to parthenocarpy, it is possible to select a target sequence existing in the vicinity of the mutation site and obtain an individual having various mutation patterns in the vicinity of the mutation site.
  • CCACTAGATGATAATTTACG SEQ ID NO: 77
  • Target1 has a relatively high On-score of 0.5071 indicating a low off-target effect in CRISPR-P, and is a mutant in the sequence. It contained a site where a single nucleotide substitution occurred.
  • TATTTGCACATTGCGTAGA (SEQ ID NO: 78) selected as the target sequence on the 3'side (Target2) had a relatively low On-score of 0.0405.
  • this sequence is close to the site where the single base substitution occurred, and from the results of CRISPRdirect, there is no homologous sequence in the 20 base pairs upstream of the PAM sequence, and even if it is limited to the 12 base pairs upstream of the PAM sequence, it is specific.
  • CCACTAGATGATAATTTACG (SEQ ID NO: 77) was determined as the target sequence.
  • Solic10g038170 gene mutation-introduced line 1. A vector containing the two target sequences (SEQ ID NOs: 77 and 78) selected in the above was constructed in the expression cassette, and an attempt was made to create a line in which the function of the Solic10g038170 gene was knocked out (FIGS. 11 and 12). For the transformation of tomatoes, about 200 seeds of the "Micro-Tom" wild strain were tested using the Agrobacterium method optimized for "Micro-Tom" (Sun et al., Plant cell physiology). , 2006; 47 (3): 426-431).
  • a diploid individual was selected using a flow cytometer using a plant redifferentiated from a series of selection media containing kanamycin as a candidate for a transformant. These individuals were investigated for inclusion of the NPTII region inserted by the Cas9 vector. As a result, insertion of the NPTII region was confirmed in 14 individuals of 11 strains. Furthermore, in order to confirm whether DNA double-strand breaks and repair errors occurred due to the Cas9 protein, the presence or absence of mutation introduction was investigated using a primer that amplifies the periphery of the target sequence. As a result, it was confirmed that mutations were introduced in the vicinity of the PAM sequence of the Solic10g038170 gene in 8 individuals of 6 strains.
  • the mutation introduction by the Target2 target sequence was examined, the mutation introduction was not confirmed in 7 out of 8 individuals, but in # 42-1, a 7-base deletion mutation occurred in one of the double strands. However, no mutations such as large-scale deletions were confirmed due to the simultaneous introduction of mutations at two sites. It is considered that the reason why the mutation introduction efficiency of Target2 was lower than that of Target1 was that the sequence effectiveness of the sgRNA incorporating the Target2 sequence was low.
  • SlDAD1 also known as Solic10g038170
  • SlDAD1 also known as Solic10g038170
  • the participatory causative gene of the tomato W2939 strain is the Solic10g038170 (also known as Sldad1) gene on chromosome 10, which is a 1131bp long gene consisting of only one exon and is a class 3 lipase (triglyceride lipase). ) Has a domain stored in.
  • the causative gene mutation in the W2939 parthenocarpy lineage is the "C ⁇ T" of the two bases 109 and 146 from the 5'end, that is, the 37th "arginine” (R) is "cysteine" ( This time, it was revealed that the 49th "alanine” (A) is a missense mutation of an amino acid that changes to "valine” (V).
  • the wild tomato strain and the phenotype of the plant into which the Sldad1 mutation was introduced by the CRISPR / Cas9 system were compared for parthenocarpy and yield in summer (high temperature stress conditions), and parthenocarpy.
  • the rate was determined by removing males from pre-flowering flowers and then investigating the proportion of male buds that developed intraspecific fruits. As a result, the parthenocarpy rate was 57.1% in the wild strain, whereas the Sldad1 mutation was used.
  • the parthenocarpy rate was as high as 99.4% in the plants with.
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of Solic10g038170 gene variant
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of Solic10g038170 protein variant
  • SEQ ID NO: 6 Partial nucleotide sequence of Solic10g038170 gene variant (nucleotide numbers 1-150)
  • SEQ ID NO: 8 Partial amino acid sequence of Solic10g038170 protein variant (amino acid numbers 1-80)
  • SEQ ID NOs: 15-16 Nucleotide sequence of target 1 region of T0 mutation-introduced strain (Fig. 13)
  • SEQ ID NO: 18-20 Amino acid sequence of target 1 region of T0 mutation-introduced strain (Fig. 14)
  • SEQ ID NOs: 21-76 Primers All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

この出願は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現が低下するかもしくは欠損するような前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を有することを特徴とする、単為結果性を有する果実類植物またはその部分、ならびに、その作出方法および選抜方法を提供する。

Description

高温耐性、高収量性および単為結果性を示す果実類植物
　本発明は、高温耐性、高収量性および単為結果性を示す果実類植物に関する。
　本発明はまた、上記単為結果性果実類植物の作出方法に関する。
　本発明はさらに、果実類植物から単為結果性植物を選抜する方法に関する。
　トマトは自家受粉植物であるが、施設栽培では、受粉を補助する風や虫が排除されてしまうため、受粉率が低下し着果率が下がることが知られている。そのため花房の植物ホルモン処理により単為結果及び果実肥大を促進する方法が広く使用されている。またマルハナバチやバイブレーターを使用した受粉促進法もよく用いられている。しかし植物ホルモン処理やバイブレーターによる受粉促進処理は膨大な労力が必要であり、作業性が著しく低下する。マルハナバチを用いる方法について、作業性はよいが、マルハナバチの活動温度域が限定されるため、夏季及び冬季は施設内の温度管理のコストや労力が増大するという問題がある。また受粉・受精に基づく着果では、夏季や冬季の花粉稔性の低下により年間を通した安定な生産量の確保が難しいという問題もある。そこで、季節等の環境要因の影響を少なくしてより少ない労力及びコストで安定的な栽培を可能とするために、トマト植物においてより高い作業効率で単為結果を誘導する技術の開発が求められている。
　トマトの単為結果性を誘導する変異として、Ｐａｔ（例えばｐａｔ２など）変異、Ｓｌｄｅｌ１ａ変異などが知られている（特許文献１～３）。これらの技術では、単為結果遺伝子と連鎖したＤＮＡマーカーを使用して他のトマト系統に単為結果変異を導入し、種無し果実を生産するトマトを得る技術である。
　また、トマトの単為結果性を誘導するさらに別の変異に関し、サイクリンＦ－ｂｏｘ遺伝子の変異による単為結果性トマトなどの植物が知られている（特許文献４）。
　さらに、ナス科植物の単為結果制御遺伝子の機能を抑制することによる単為結果性植物の作出は、特許文献５および６に記載されている。
　さらに、トマトなどの果実類植物において、耐暑性を付与する遺伝子変異に関しては、特許文献７および８に記載されている。
　さらに単為結果性と変異に関し、エチレン受容体タンパク質ＥＴＲ１の膜貫通領域に変異をもつＳｌｅｔｒ１－１やＳｌｅｔｒ１－２が日持ち性や単為結果性の付与に有効であることが記載されている（非特許文献１～３）。
ＷＯ　１９９９／０２１４１１　Ａ１ ＷＯ　２０１７／０２２８５９　Ａ１ 特表２０１０－５３２１６４号公報 再表２０１７／０２２８５９号公報 再表２０１４／０２１３９８号公報 再表２０１５／１０８１８５号公報 特開２０１５－０８９３６８号公報 再表２０１６／０４７７７８号公報
Ｏｋａｂｅ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　＆　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１１；５２（１１）：１９９４－２００５ Ｏｋａｂｅ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；６２（２）：２０２－２０８ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１５；８３（２）；２３７－２５１
　特許文献１～３に記載される変異は、単為結果の効率を上昇させることができるが、生殖器官、栄養器官などにも悪影響を及ぼすことや、果実の品質を低下させることなどが知られている。
　本発明の目的は、果樹や果菜類を含む果実類の植物において、少なくとも栄養器官に悪影響を及ぼすことなく、かつ高効率で単為結果性を誘導することができる遺伝子変異を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究した結果、トマトなどの果実性植物において高効率の単為結果性及び高温での高収量性を付与することができる特定遺伝子の変異を見出し、本発明を完成した。
　従って、本発明は、以下の特徴を包含する。
[１]Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現が低下するかもしくは欠損するような前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を有することを特徴とする、単為結果性を有する果実類植物またはその部分。
[２]前記遺伝子もしくはそのオーソログが、配列番号２のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記[１]に記載の果実類植物またはその部分。
[３]前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異が、前記タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、前記[１]または[２]に記載の果実類植物またはその部分。
[４]前記少なくとも１つのアミノ酸の置換が、配列番号２のアミノ酸配列において３７番目のアルギニンの他のアミノ酸への置換を含む、前記[３]に記載の果実類植物またはその植物部分。
[５]前記配列番号２のアミノ酸配列において４９番目のアラニンの他のアミノ酸への置換をさらに含む、前記[４]に記載の果実類植物またはその部分。
[６]前記果実類植物が、ナス科植物、ウリ科植物、バラ科植物、およびブドウ科植物からなる群から選択される、前記[１]～[５]のいずれかに記載の果実類植物またはその部分。
[７]９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の単為結果率を有する、前記[１]～[６]のいずれかに記載の果実類植物またはその部分。
[８]３０℃以上の環境温度に耐性である、前記[１]～[７]のいずれかに記載の果実類植物またはその部分。
[９]前記変異についてホモ接合型である、前記[１]～[８]のいずれかに記載の果実類植物またはその部分。
[１０]前記[１]～[９]のいずれか１項に記載の果実類植物の作出方法であって、前記植物の野生型の細胞、カルスもしくは組織においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現を低下するかもしくは欠損するような前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を導入する第１工程、前記第１工程の植物の細胞、カルスもしくは組織を培養し植物体集団を作製する第２工程、ならびに前記第２工程の植物体集団から単為結果性を有する植物を選抜する第３工程を含むことを特徴とする前記方法。
[１１]前記変異が、前記遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損である、前記[１０]に記載の方法。
[１２]前記変異を、前記Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列または該遺伝子のオーソログのヌクレオチド配列において、前記配列番号１のヌクレオチド配列の１０９番目、１４６番目もしくはその両方の位置、または該位置に相当する前記オーソログのヌクレオチド配列内の位置、の一塩基置換による変異を含むポリヌクレオチドを導入することによって行う、前記[１０]に記載の方法。
[１３]前記ポリヌクレオチドが配列番号３のヌクレオチド配列を含む、[１２]に記載の方法。
[１４]前記第３工程で選抜された植物が、前記変異についてホモ接合型である、前記[１０]～[１３]のいずれかに記載の方法。
[１５]配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[１６]果実類植物から単為結果性植物を選抜する方法であって、果実類植物の細胞もしくは組織においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現の低下もしくは欠損、あるいは、該遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損を検出することを含むことを特徴とする、前記方法。
[１７]前記検出を、ＰＣＲもしくはハイブリダイゼーションによって行う、前記[１６]に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－１５８９５０号（２０１９年８月３０日出願）の開示内容を包含する。
　本発明によるＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子もしくはそのオーソログの変異を用いることによって、果実類植物であるトマトで９９％以上の高い単為結果率を付与することが可能であるし、また、高温で着果不良が発生する地域でも、単為結果誘導により高収量性を維持することができる。さらにまた、上記遺伝子もしくはそのオーソログに例えばゲノム編集、相同組換えなどの遺伝子改変技術を用いて同様の変異を誘導することによって、あらゆる果実類植物において高効率で単為結果性及び高温耐性の強化を誘導することができる。
この図は、トマトＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍ戻し交配系統の単為結果率を示す。上図は、高温ストレス条件下（夏季）で栽培した系統の単為結果率である。「Ｐ」は単為結果性（Ｐａｒｔｈｅｎｏｃａｒｐｙ）系統を示す。野生株（ＷＴ）は４個体、単為結果性系統は５個体供試し、１個体あたり１１～２０花除雄した。下図は、生育適温条件下（２４℃）で栽培した系統の単為結果率である。「ＮＰ」は非単為結果性（Ｎｏｎ－ｐａｒｔｈｅｎｏｃａｒｐｙ）系統、「Ｐ」は単為結果性（Ｐａｒｔｈｅｎｏｃａｒｐｙ）系統を示す。野生株は３個体、ＢＣ３Ｓ２系統は４個体供試し、１個体あたり１０～１５花除雄した。Ｇｅｎｏｔｙｐｅは、後述する、同定した遺伝子変異の遺伝子型を示す。「Ｎｏ．ｅｍａｓｃ．」は除雄した花の合計数を示す。 この図は、トマトＷ２９３９　ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統における果実収量を示す。ＢＣ２Ｓ２系統およびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株の播種を５月に行った。上図は、８月下旬から9月初旬の間に赤熟した果実の収量を示す（左：Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株（ＷＴ）４個体、右：Ｗ２９３９　ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統６個体）。バーは、５ｃｍを表す。下図の縦棒グラフは、８月中旬から１０月初旬にかけて収穫した、１個体あたりの赤熟果合計収量を示す（ｎ＝６）。エラーバーは標準誤差を表し、＊＊は野生株との有意差を表す（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ；１％水準）。 この図は、トマト有種子果の割合および種子数を示す。ＡおよびＢは、Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株（Ａ）およびＷ２９３９　ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統（Ｂ）から得た赤熟果に含まれる種子数（各ｎ＝６）を示す。栽培は温室にて高温ストレス条件下（観測された日平均気温は約２５～３３℃）で行った。Ｃ、ＤおよびＥは、Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株（Ｃ）、ＢＣ３Ｓ２非単為結果性系統（Ｄ）、およびＷ２９３９　ＢＣ３Ｓ２単為結果性系統（Ｅ）から得た赤熟果に含まれる種子数（Ｃ，Ｅ：ｎ＝８；Ｄ：ｎ＝５）を示す。栽培は閉鎖系栽培室にて２４℃一定で行った。円グラフ内の数字は、果実数を示す。 この図は、果実重（重量）および糖度（Ｂｒｉｘ値）を示す。ＡおよびＢは、Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株（ＷＴ）、Ｗ２９３９　ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統における果実重および糖度の測定結果（果実重：ＷＴ，ｎ＝４８；単為結果性系統，ｎ＝２１８，Ｂｒｉｘ：ＷＴ，ｎ＝３７；単為結果性系統，ｎ＝９８）を示す。＊＊は野生株との有意差ありを示す（Ｗｅｌｃｈ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ，１％水準）。エラーバーは標準誤差を示す。ＣおよびＤは、Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株（ＷＴ）、Ｗ２９３９　ＢＣ３Ｓ２非単為結果性系統（ＮＰ）、および単為結果性系統（ＳＰ）における果実重および糖度の測定結果（果実重：ＷＴ，ｎ＝４９；ＮＰ，ｎ＝３８；ＳＰ，ｎ＝４４、Ｂｒｉｘ：ＷＴ，ｎ＝４８；ＮＰ，ｎ＝３９；ＳＰ，ｎ＝３７）を示す。果実重は系統間で有意差なし（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ，５％水準）を示す。異なるアルファベットは系統間で有意差ありを示す（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ，１％水準）。 この図は、ラフマッピングで使用したＳＮＰマーカーの一覧とプライマー配列を示す。マーカー名は、Ｔｏｍａｔｏ　ｍａｒｋｅｒ　ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｒｋｅｒ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｔｏｍａｔｏ／）内の表記に従っている。Ｓは染色体短腕、Ｌは染色体長腕を示す。染色体はトマト染色体番号を表す。 この図は、ＳＮＰマーカーを用いたＷ２９３９系統のマップベースクローニングを示す。ＭＴ：Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ野生株、ＲＥ：レジナ(Ｒｅｇｉｎａ)野生株、Ｍ：Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ型ホモ、Ｈ：ヘテロ、Ｒ：レジナ型ホモ、Ｓ：染色体短腕、Ｌ：染色体長腕をそれぞれ表す。Ｗ２９３９系統とレジナを交配して作出したＦ２雑種系統のうち、単為結果性を示す１２個体を用いた。 この図は、Ｗ２９３９単為結果性系統の候補原因遺伝子Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の遺伝子構造を示す。２１２０＿１００８（Ｓ）はマップベースクローニングで用いた短腕のマーカー、および１３５３６＿４３８（Ｌ）は長腕のマーカーをそれぞれ示す。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０は、１つのエクソンのみからなる全長１１３１ｂｐの遺伝子であり、クラス３リパーゼ（トリグリセリドリパーゼ）で保存されているドメインをもつ。Ｗ２９３９単為結果性系統では５’末端から１０９番目と１４６番目の塩基に一塩基置換（いずれもＣ→Ｔ）が入っており、その結果、２箇所のアミノ酸ミスセンス変異（Ｒ３７ＣおよびＡ４９Ｖ）を引き起こしている。 この図は、Ｗ２９３９系統のＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子内変異を示す。Ａは、配列番号１（野生型（ＷＴ））および配列番号３（Ｗ２９３９（変異体））の１～１５０番目のヌクレオチド配列（それぞれ配列番号５、６）中の、ＷＴと対比させたＷ２９３９の変異箇所、Ｂは、配列番号２（野生型（ＷＴ））および配列番号４（Ｗ２９３９（変異体））のそれぞれ１～１００番目のアミノ酸配列（配列番号７、８）中の変異箇所を示し、黒枠で囲んだ配列は変異が生じた箇所を示す。３７番目のアルギニン（Ｒ）がシステイン（Ｃ）に、４９番目のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に変化するミスセンス変異である。 この図は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０（野生型）のアミノ酸配列（配列番号１の１～８０番目；配列番号９）と、それと最も相同性が高いシロイヌナズナオーソログであるＡｔ２Ｇ４４８１０の対応するアミノ酸配列（配列番号１０）との比較を示す。黒枠で囲んだ配列は、Ｗ２９３９系統（変異型）でミスセンス変異が生じていた箇所を示す。 この図は、ゲノム編集のためのベクターのコンストラクトおよびＣａｓ９ベクターの作出モデルを示す。図中、Ｃａｓ９；化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９タンパク質をコードする配列、ｐＵｂｉ；パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ　ｃｒｉｓｐｕｍ）ユビキチンプロモーター、ｔＰｅａ３Ａ；大豆３Ａターミネーター、ｐＵ６；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡ；単鎖ガイドＲＮＡ、ｐＮＯＳ；Ｎｏｐａｌｉｎｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子由来プロモーター、ＮＰＴＩＩ；カナマイシン耐性遺伝子、ｔＮＯＳ；Ｎｏｐａｌｉｎｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子由来ターミネーター、ＲＢ；アグロバクテリウムに由来するＴ－ＤＮＡ境界配列（Ｒｉｇｈｔ－ｂｏｒｄｅｒ）、ＬＢ；アグロバクテリウムに由来するＴ－ＤＮＡ境界配列（Ｌｅｆｔ－ｂｏｒｄｅｒ）を表す。 この図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる変異導入モデルを示す。標的配列が１箇所の場合，非相同末端結合（ＮＨＥＪ：Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｎｄ　ｊｏｉｎｉｎｇ）修復による挿入（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）・置換（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）・欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）変異が生じる。また、標的配列が２箇所の場合，より大規模な欠失、逆位（Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、重複（Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）変異が生じうる。 この図は、標的配列と原因変異周辺の塩基配列（すなわち、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の配列番号１の翻訳開始点から３００塩基対までの塩基配列；配列番号１１（正鎖）および配列番号１２（相補鎖））およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。後述の実施例で選択された２つの標的配列を一重線で、それぞれのＰＡＭ配列を二重線で、さらにＷ２９３９系統で一塩基置換が生じていた配列を黒枠でそれぞれ示す。 この図は、野生株（ＷＴ）およびＴ０変異導入系統（＃３－１，＃９－１，＃１０－１，＃２５－１，＃３７－１，＃４２－１）のＴａｒｇｅｔ１周辺配列における編集パターン、ならびに各系統の塩基配列を示す。太字の配列は５’側に設計した標的配列（Ｔａｒｇｅｔ１）を、「ＴＧＧ」配列はＰＡＭ配列を、２３番目の「Ｔ」配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる変異箇所を指している。Ｃｈｉｍｅｒａ（＃９－３，＃９－４）は、サンガーシーケンスの波形から、異なる変異パターンの形質転換細胞が混在すると考えられることを示す。 この図は、Ｔ０変異導入系統のアミノ酸配列変化を示す。野生株（ＷＴ）、Ｗ２９３９系統、および変異がホモに導入された系統における、標的配列（Ｔａｒｇｅｔ１）周辺のアミノ酸配列を示す。Ｍｕｔａｔｉｏｎは変異の種類を表し、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｅｎｇｔｈは，翻訳によって生じるポリペプチド鎖の全長を表す（ここで、ａ．ａ．：アミノ酸を表す）。黒枠で囲んだアミノ酸残基は変異が生じた箇所を示す。また、＊はストップコドンを示す。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．単為結果性の原因遺伝子およびその変異
　本発明において、果実類植物の特性である単為結果性の形質を発現する原因遺伝子は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログである。
　上記遺伝子は、トマト植物（「作物」と称してもよい。）の１０番染色体上に存在し、ｄａｄ１遺伝子ファミリーの一つであると推測される。ＤＡＤ１タンパク質は、ジャスモン酸生合成の初期ステップを触媒するクロロプラストホスホリパーゼＡ１である。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子は、Ｓｌｄａｄ１遺伝子と称してもよく、クラス３リパーゼ（トリグリセリドリパーゼ）活性をコードするドメインを含む（図７）。
　Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログは、例えば配列番号１のヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチド配列と例えば約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよいポリヌクレオチドである。あるいは、上記オーソログは、配列番号１のヌクレオチド配列と５０％未満の配列同一性を有していてもよい。
　さらに、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、例えば配列番号２のアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列と例えば約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、上記オーソログは、配列番号２のアミノ酸配列と５０％未満の配列同一性を有していてもよい。
　あるいは、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子およびそのオーソログのヌクレオチド配列またはそれによってコードされるアミノ酸配列を整列比較（アライメント）した時、最も相同性の高い領域（もしくは範囲）について、例えば約５０％以上、約６０％以上、もしくは約７０％以上の配列同一性を有していてもよい。そのような領域は、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列の５２番目～２４０番目までの領域、ならびに配列番号２のアミノ酸配列の１８番目～８０番目の領域である（図９）。
　本明細書中で使用する「オーソログ」は、果実類植物における、種分岐によって共通の祖先遺伝子から生じた相同な遺伝子群であって、トマト植物と異なる生物種において互いに相同な機能をもつ遺伝子群をいう。
　また、本明細書中で使用する「配列同一性（％）」は、公知のアルゴリズムＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、２つの配列間にギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、好ましくはギャップを導入して、決定することができる（Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｃｏｍｐｕｔ．　Ｂｉｏｌ．，２０００；７：２０３－２１４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０；２１５：４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８；８５：２４４４－２４４８）。
　本明細書中で使用する「単為結果」（ｐａｒｔｈｅｎｏｃａｒｐｙ）とは、植物において、受粉及び受精が起こらない場合に、種子形成を伴わずに子房や花托等が肥大し、無種子の果実を生じることをいう。本発明における「単為結果性」は、植物ホルモン処理や特定の物理的刺激などの人為的な単為結果誘導処理を必要とせずに、植物が単為結果を生じる性質をいう。
　後述の実施例で検証されるように、本発明に関わる単為結果性は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの変異が、該遺伝子もしくはそのオーソログによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含ものであり、そのような変異によって、該タンパク質の発現（もしくは機能）が低下（もしくは抑制）されているか、もしくは欠損することによって生じる。言い換えれば、上記変異は、上記遺伝子またはそのオーソログのヌクレオチド配列の部分的もしくは全体的なヌクレオチド欠失、置換、付加もしくは挿入を含み、それによって単為結果性が生じる程度の上記タンパク質の発現（もしくは機能）の低下もしくは欠損であり、好ましくは遺伝子機能の破壊である。
　これに関連して、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現（もしくは機能）の低下もしくは欠損は、該タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入によって引き起こすことができる。後述の実施例に記載されるように、一塩基多型（ＳＮＰ）にみられるような少なくとも１つの一塩基置換による上記タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸の置換によって、単為結果性が発現されうる。そのような一塩基置換の例は、以下のものに限定されないが、配列番号２のアミノ酸配列において、３７番目のアルギニンの他のアミノ酸への置換、４９番目のアラニンの他のアミノ酸への置換、およびそれらの両方の置換を含むことができる。
　上記の他のアミノ酸は、３７番目のアルギニンの場合、アルギニン以外のアミノ酸、例えば親水性アミノ酸（アルギニンを除く）または疎水性アミノ酸、例えばシステインであり、４９番目のアラニンの場合、アラニン以外のアミノ酸、例えば親水性アミノ酸または疎水性アミノ酸（アラニンを除く）、例えばバリンである。
　また核酸変異体の例として、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログにおいて単為結果性遺伝子変異を含むポリヌクレオチドの例は、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、この配列は、配列番号１のヌクレオチド配列中に１０９番目にＣ１０９Ｔおよび１４６番目にＣ１４６Ｔ（ここで、Ｃはシトシンであり、Ｔはチミンである。）の一塩基多型を含む配列と同じである。
　しかし必ずしも上記の特定の変異に限らず、遺伝子機能が低下または破壊される変異であれば単為結果が達成されうる。
　あるいは、ゲノム編集、相同組換えなどの遺伝子改変技術を利用して、上記遺伝子またはそのオーソログを部分的もしくは全体的にノックアウトし破壊することによって上記遺伝子またはそのオーソログの発現を有意にもしくは顕著に減少（もしくは低下）または欠損させてもよいし、あるいは、遺伝子改変技術を利用して、上記遺伝子またはそのオーソログのヌクレオチド配列内に異種塩基配列を挿入もしくは付加することによって記遺伝子またはそのオーソログの発現を有意にもしくは顕著に減少（もしくは低下）させてもよい。
　上記変異の構造的形態は、上記例示のものに制限されないものとし、果実類植物において単為結果性を発現させることが可能なものであればいずれの構造的形態であってもよい。
　Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子のオーソログの例として、以下の表１に記載のものを挙げることができるが、これらに限定されないものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．単為結果性植物
　本発明の単為結果性を有する果実類植物は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現が低下するかもしくは欠損するような前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を有することを特徴とする。
　単為結果性の原因遺伝子である上記Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログ、原因遺伝子変異、ならびに上記タンパク質については、上記１．に記載されたとおりであり、ここでもそのまま引用しうる。
　本明細書中で単為結果性を付与するための遺伝子改変もしくは形質転換に使用される植物は、果実類植物（例えば果菜類、果樹を含む植物）であり、例えば果実を食用とする栽培植物である。そのような植物としては、以下に限定されないが、例えば、ナス科[トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ　ｖａｒ．　ｇｒｏｓｓｕｍ）、パプリカ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ）、シシトウ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ　ｖａｒ．　ｇｒｏｓｓｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）等]、ウリ科［キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　Ｌ．）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　Ｌ．）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ　ｌａｎａｔｕｓ）、カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ズッキーニ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ）、マクワウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　ｖａｒ．　ｍａｋｕｗａ）等］、バラ科[イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ　ａｎａｎａｓｓａ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ）等]、ブドウ科[ブドウ（Ｖｉｔｉｓ　ｓｐｐ．）等]、アヒ・アマリージョ（キイロトウガラシ；Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｂａｃｃａｔｕｍ）、トウゴマ（ヒマ；Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ロブスタコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ　ｃａｎｅｐｈｏｒａ）などの植物が挙げられる。
　上記植物は、自然環境下では単為結果性ではないか又は単為結果性がかなり低い植物であり、好ましい植物は、トマト（トマト植物）である。
　トマトの例としては、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・セラシフォルメ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅとも称される）、ソラナム・ピムピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍとも称される）、ソラナム・チーズマニイ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉとも称される）、ソラナム・パルビフロルム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍとも称される）、ソラナム・クミエレウスキィ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉとも称される）、ソラナム・ヒルストゥム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｈｉｒｓｕｔｕｍとも称される）、ソラナム・ペンネリィ（Ｓｏｌａｎｕｍ　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｐｅｎｎｅｌｌｉｉとも称される）、ソラナム・ペルビアヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍとも称される）、ソラナム・チレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｃｈｉｌｅｎｓｅ；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｃｈｉｌｅｎｓｅとも称される）、ソラナム・リコペルシコイデス（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）及びソラナム・ハブロカイネス（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）等に属するトマト系統・品種又はそれらの派生株が挙げられるが、これらに限定されない。
　トマトの一例である野生型トマト品種マイクロトム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ　ｃｖ．　Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ）（Ｓｃｏｔｔ　ＪＷ、　Ｈａｒｂａｕｇｈ　ＢＫ（１９８９）Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ　Ａ　ｍｉｎｉａｔｕｒｅ　ｄｗａｒｆ　ｔｏｍａｔｏ．Ｆｌｏｒｉｄａ　Ａｇｒ．Ｅｘｐｔ．Ｓｔａ．Ｃｉｒｃ．３７０，ｐ．１－６）は、市販されており、またＴｏｍａｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＴＧＲＣ）（米国）からアクセッション番号ＬＡ３９１１の下で入手することもできる。野生型トマト品種マイクロトムは、矮性（約１０～２０ｃｍ）であり、葉や果実が小さく、従来トマト品種との交雑も可能である。野生型トマト品種マイクロトムについては全ゲノム配列が決定されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；５５（２）：４４５－４５４）。
　なお本明細書中で使用される「派生株」とは、元の植物と他の植物系統・品種との１回以上の交配を経て又は変異誘発若しくは変異導入を経て得られた子孫植物を指す。
　本発明の果実類植物は、上記例示のような野生型植物に対し目的の遺伝子改変操作を行うことによって、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現（もしくは機能）の低下もしくは欠損、好ましくは遺伝子機能の破壊をもたらすことによって得ることができる植物である。
　遺伝子変異は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログのヌクレオチド配列の部分的もしくは全体的なヌクレオチドの欠失、置換、付加もしくは挿入を含み、それによって単為結果性が生じる程度の上記タンパク質の発現（もしくは機能）の低下もしくは欠損であり、好ましくは遺伝子機能の破壊である。改変例として、上記遺伝子またはそのオーソログを部分的もしくは全体的にノックアウトし破壊するか、あるいは、上記遺伝子をコードするタンパク質の例えば配列番号２のアミノ酸配列において３７番目のアルギニンがシステイン（Ｒ３７Ｃ）に、および場合により４９番目のアラニンがバリン（Ａ４９Ｖ）に、それぞれ置換されるような変異を導入することが挙げられる。これらの変異は、単為結果を誘導する。しかし必ずしも上記の特定の変異に限らず、遺伝子機能が低下または破壊される変異であれば単為結果が達成されうる。
　本発明の果実類植物は、野生型（上記遺伝子変異を含まない。）と比較して、高温（例えば３０℃以上の環境温度）下でも高単為結果率、高着果率および高収量性を付与することができるという特性を有する。
　この関連で、本発明の植物における単為結果率は、非限定的に、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上である。後述の実施例では、野生株で５７．１％の単為結果率であったのに対し、本発明の植物、例えばトマト植物では９９．４％と高い単為結果率を示した。さらに、収量について、稔った赤熟果実の重量を合計として両者を比較したところ、野生株では２６．３±２．７ｇであったのに対し、本発明の植物、例えばトマト植物では６３．１±２．５ｇであり約２．４倍高い収量であった。
　本発明の果実類植物は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの上記変異についてホモ接合型（単に「ホモ」とも称する。）であることが好ましい。ホモであるので、２つの対立遺伝子が同一の上記変異を有している。これに対し、ヘテロ接合型（単に「ヘテロ」とも称する。）では、２つの対立遺伝子の一方が正常であり、他方が変異を有することになる。
　本発明の植物は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの上記変異のために、子房の早期肥大、花柱の突出、葯筒先端の変色、子房肥大後の花弁や花柱の残存などの表現型を有することがある（後述の実施例参照）。
　本発明はさらに、上記果実類植物の植物体の他に、該植物の部分を提供する。
　上記植物部分は、非限定的に、例えば茎、葉、根、花、蕾、果実、種子、組織、細胞、及びカルス等を含む。ここで、カルスは、植物体の一部を植物ホルモン(例えばオーキシン、サイトカイニン等)を含む培地上で培養したとき生じる人工的な細胞塊である。上記のような植物部分は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現が低下するかもしくは欠損するような該遺伝子もしくはそのオーソログの変異を有している。
３．単為結果性果実類植物の作出方法
　本発明はさらに、上記２．に記載の果実類植物の作出方法であって、
　該植物の野生型の細胞、カルスもしくは組織（植物部分を含む。）においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現を低下するかもしくは欠損するような上記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を導入する第１工程、
　上記第１工程の植物（形質転換体）の細胞、カルスもしくは組織を培養し植物体集団を作製する第２工程、ならびに
　上記第２工程の植物体集団から単為結果性を有する植物を選抜する第３工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
　以下に、上記第１工程から第３工程について説明する。
＜３．１＞第１工程
　この工程では、野生型植物の細胞、カルスもしくは組織（植物部分を含む。）において上記Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子もしくはそのオーソログの変異を導入する。
　この遺伝子変異は、上記遺伝子またはそのオーソログの発現の低下または欠損であり、そのために、例えばゲノム編集技術や相同組換え技術などの遺伝子改変技術を用いて上記遺伝子をノックアウトすることによって、上記遺伝子の破壊もしくは欠損を行うことができる。
　上記変異の例は、上記Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損である。
　上記変異の別の例は、上記Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列またはそのオーソログのヌクレオチド配列において、前記配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド、例えば１０９番目、１４６番目もしくはその両方の位置、または該位置に相当する前記オーソログのヌクレオチド配列内の位置、の一塩基置換による変異を含むポリヌクレオチドを導入することである。該ポリヌクレオチドの例は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
　ゲノム編集は、例えばＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）などの人工切断酵素、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどを使用してゲノムＤＮＡの編集や遺伝子改変を行う技術である。本発明の方法では、ゲノム編集の任意の技術を使用することができるが、好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用である。
　特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、細菌および古細菌のウイルスやプラスミドに対する適応免疫機構から発見されたが、ベクターの構築が比較的簡便であり、複数の遺伝子を同時に改変することが可能である（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７，３３７（６０９６）：８１６－８２１，２０１２；Ｓａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５，２０１４）。このシステムは、Ｃａｓ９タンパク質と約２０塩基対標的配列をもつ単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）を含む。植物体内でこれらを共発現させることにより、ｓｇＲＮＡが標的配列近傍のＰＡＭ配列を認識して標的ゲノムＤＮＡと特異的に結合し、Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列の５’側上流でＤＳＢ（二本鎖切断）を誘導する。現在最も使用されているＣａｓ９タンパク質はＳｐＣａｓ９型であり、ＰＡＭ配列がＮＧＧであることから変異導入位置の制約が少ない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは既に植物の突然変異誘発技術として利用されており、トマトにおいては２０１４年に初めて適用可能であることが確認されている（Ｂｒｏｏｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６６（３）：１２９２－１２９７，２０１４）。
　本発明における標的遺伝子は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子もしくはそのオーソログである。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子もしくはそのオーソログの配列は、例えば配列番号１のポリヌクレオチド配列、もしくは該ポリヌクレオチド配列と例えば約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。
　上記遺伝子もしくはそのオーソログのヌクレオチド配列中、例えばＣａｓ９によって認識可能なように、ＰＡＭ配列を有する領域を標的配列として選択することができる。この場合、ＰＡＭ配列は、例えばＮＧＧ（Ｎは任意の塩基である。）などである。例えば配列番号１のヌクレオチド配列中の標的配列の例は、以下の配列である。これらの配列の３'末端の３塩基（下線）は、ＮＧＧである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　Ｃａｓ９の例として、例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＳｐＣａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＳａＣａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＳｔＣａｓ９などが挙げられる。Ｃａｓ９の由来によりＰＡＭ配列も異なる。例えばＳｐＣａｓ９はＮＧＧ（Ｎは任意の塩基である。）を認識する。
　ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子内のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは１８～２６塩基、例えば２０～２４塩基のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
　プロモーターの例として、ユビキチンプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、その他、植物組織特異的プロモーターなどが挙げられる。
　発現ベクターの例として、上記のＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列、ｓｇＲＮＡ配列、プロモーター配列、薬剤耐性遺伝子もしくはレポーター遺伝子、ターミネーターなどを含むベクター、さらに上記エレメントの他に、アグロバクテリウムに由来するＴ－ＤＮＡ境界配列（Ｒｉｇｈｔ－ｂｏｒｄｅｒ）、アグロバクテリウムに由来するＴ－ＤＮＡ境界配列（Ｌｅｆｔ－ｂｏｒｄｅｒ）などを含むバイナリーベクターを挙げることができる。ベクターの例として、例えばｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系ベクターなどを挙げることができる。バイナリーベクターの一例を、図１０（２つの標的を有する場合の例）に示す。
　上記ベクターを、例えばアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法などによって植物体、細胞、カルス、組織（葉、根、茎などの植物部分含む。）などに導入することができる。
　ゲノム編集を利用することによって、本発明の標的遺伝子を、例えば切断、欠失または（部分的もしくは完全に）破壊（ノックアウト）する、外来遺伝子を挿入（ノックイン）する、あるいは置換、重複もしくは逆位する、などの変異の導入を可能にする（図１１）。外来遺伝子の挿入や特定塩基の置換などの場合には、上記ベクターに外来遺伝子配列、置換すべき特定塩基を含む配列を発現可能に挿入しておくことによって可能となる。外来遺伝子配列の例は、配列番号３のヌクレオチド配列である。上記変異によって、植物に対し、少なくとも単為結果性の表現型、さらには高着果率、高温耐性、高収量性などが付与される。
＜３．２＞第２工程
　この工程では、上記第１工程の植物（形質転換体）の細胞（培養細胞（細胞の塊）を含む。）、カルスもしくは組織（植物部分を含む。）を培養し植物体集団を作製する。
　培養は、固体培地または液体培地を用いる組織培養（通常２０～３０℃）によって行うことができる。培地は、植物組織培養で使用されるような培地であって、例えば酵母エキス、ココナッツミルク、アミノ酸類、糖類（例、ショ糖）、成長調節物質（例、２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、ＮＡＡ（α－ｎａｐｈｔａｌｅｎａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、ＩＡＡ（ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ））、ビタミン類（例、チアミン、パントテン酸カルシウム、ビオチン、葉酸、ニコチン酸）、無機塩類などを含む培地（通常、ｐＨ５．５～６）を例示することができる。
＜３．３＞第３工程
　この工程では、上記第２工程の植物体集団から単為結果性を有する植物を選抜する。
　上記選抜は、作製された植物体集団から単離した細胞もしくは組織においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現の低下もしくは欠損、あるいは、該遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損を検出することを含む。検出法は、後述の３．４に記載するようにＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法などを含むことができる。
　さらに、例えばＦＩＳＨ法を使用することによって、２つの対立遺伝子の両方に、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子もしくはそのオーソログの上記変異が存在することを確認し、選抜された植物が上記変異についてホモ接合型であることを確定することができる。
　選抜された単為結果性植物は、植物に適した栽培法を用いて栽培することができる。栽培は、水耕栽培、施設栽培（例、温室栽培、植物工場栽培等）、露地栽培、プランター栽培などの任意の栽培法で行うことができる。
４．単為結果性植物の選抜方法
　本発明はさらに、果実類植物から単為結果性植物を選抜する方法であって、果実類植物の細胞もしくは組織においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現の抑制、あるいは、該遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損を検出することを含むことを特徴とする方法を提供する。
　上記方法は、植物の細胞もしくは組織からゲノムＤＮＡ（染色体）またはトータルＲＮＡを単離し、必要に応じてＲＮＡからｃＤＮＡを合成したのち、予め作製された、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログに特異的なプライマーまたはプローブ（これらには、必要に応じて蛍光色素等のラベルが含まれる。）を上記ＤＮＡまたはＲＮＡもしくはｃＤＮＡと接触させて、ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ法、ＳＮＰ解析法含む。）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；定量ＲＴ－ＰＣＲを含む。）を行うことを含む。
　さらに、必要に応じて、上記細胞内の、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の有無を、該タンパク質に対する特異抗体を用いる例えばイムノアッセイによって調べてもよいし、あるいは該タンパク質内の変異の有無をシークエンシングによって調べてもよい。
　以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
＜単為結果性トマトＷ２９３９系統の取得及び特性＞
１．供試植物および栽培
　トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ　Ｌ．）の矮性モデル品種であるマイクロトム「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍにメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）処理を行ったトマト大規模変異体集団から、単為結果性を示すＷ２９３９（ＴＯＭＪＰＷ２９３９）系統を選抜した。この系統に「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株を戻し交配したＢＣ２Ｓ２、ＢＣ３Ｓ２系統、およびミニトマト品種である「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」と交配したＦ３雑種系統を以下の実験に用いた。
　栽培は、つくば機能植物イノベーション研究センター（つくば市、茨城、日本）内のＧ４温室、および筑波大学２Ｄ棟内閉鎖系栽培室で行った。ＢＣ２Ｓ２系統およびＦ３雑種系統の栽培は、Ｇ４温室で夏季（５～１０月）に行った。シャーレ内で発芽させた種子を、ジフィーミックス（サカタのタネ）を詰めたジフィーポッド（サカタのタネ）に移植した。温室での給水には、薄膜水耕（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｆｉｌｍ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＮＦＴ）システムを用いた。ＯＡＴハウスＡ処方（ＯＡＴハウス１号１．５ｇ／Ｌ、ＯＡＴハウス２号１ｇ／Ｌ、ＯＡＴアグリオ）で電気伝導率（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ：ＥＣ）を１．２～１．３ｄＳ／ｍに調整した養液を、６時～１８時の間、３時間おきに１５分間循環させた。また高温期である７月以降は、養分不足を防ぐため、ＥＣを１．８程度に高めた。栽培期間中は温室内でファンを稼働させ、また天窓と側窓を開放し、遮光カーテンで直射日光を遮ることで植物体が生育可能な温度を維持した。栽培期間中の明期は１２～１３．５時間であった。
　また、ＢＣ３Ｓ２系統の栽培は、閉鎖系栽培室にて夏季（５～９月）に行った。シャーレ内で発芽させた種子を、ロックウールキューブ（Ｇｒｏｄａｎ）に移植し、温室と同様にＮＦＴシステムを用いて栽培した。養液はＯＡＴハウスＡ処方（ＯＡＴアグリオ）を用い、ＥＣを１．５に調整した。潅水は毎朝８時に１５分間行われるよう設定した。室温は２４℃に一定に保ち、明期は１６時間に設定した。いずれの系統も移植後２日間は植物体をラップで覆い、徐々に隙間を空けて順化を行った。
２．単為結果率調査
　Ｗ２９３９系統と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株を戻し交配したＢＣ２Ｓ２系統の、高温条件下における単為結果性を除雄法で評価した。ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統は５個体、野生株は４個体供試し、１個体あたり１０～２０花を開花２日前に除雄した。環境条件を変えた場合の比較として、閉鎖系栽培室で栽培したＷ２９３９系統と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株の戻し交配ＢＣ３Ｓ２系統も併せて評価した。ＢＣ３Ｓ２単為結果性系統、ＢＣ３Ｓ２非単為結果性系統を４個体ずつ、野生株３個体を供試し、１個体あたり１０～１５花を開花２日前に除雄した。なお、第一花房に対しては振動受粉を行い、第一花房の受精不成立による着果率への悪影響が無いようにした。開花から約１０日後に判定を行い、直径が５ｍｍ以上になった果実を単為結果果実と判断した。
　Ｗ２９３９系統と「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株を交配したＦ３雑種系統を用いて、除雄法による単為結果性判定を行った。除雄は開花２日前の第三花房以降の蕾に対して行い、受精による着果が起こらないようにした。また、第一花房に対しては振動受粉を行い、第一花房の受精不成立による着果率への悪影響が無いようにした。開花から約１０日後に判定を行い、直径が１ｃｍ以上になった果実を単為結果果実と判断した。
３．収量調査
　ＢＣ２Ｓ２系統を用いて、高温ストレス条件下における野生株との果実収量の差を検証した。播種は５月に行い、発芽後温室に移し、８月から１０月初旬の間に収穫された赤熟果の合計重量を、系統間で比較した。収量調査には、単為結果性調査で用いなかった個体を供試した。
　また、Ｆ３雑種系統を用いて、収量調査を行った。５月に播種したＦ３雑種単為結果性系統、Ｆ３雑種非単為結果性系統および「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株の代表的な１個体について、９月初めに赤熟果および緑熟果を採取した。緑熟果は、直径が１ｃｍ以上の果実のみを採取した。収量調査には、単為結果率調査と重複する個体を供試したため、定量的な調査は行わなかった。
４．結果
４．１　Ｗ２９３９系統の単為結果性
　Ｗ２９３９系統に生じた遺伝子変異による単為結果性の強度を調べるため、Ｗ２９３９系統と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株を交配したＢＣ２Ｓ２およびＢＣ３Ｓ２系統を用いて、除雄法による単為結果性の評価試験を行った。はじめに高温条件下における評価を、夏季（８～１０月）にかけて実施した。植物体は、ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統５個体、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株４個体を供試し、単為結果性系統では１個体あたり１１～１４花、野生株では１個体あたり１８～２０花を除雄した。第一花房の開花が始まった６月下旬から除雄を開始した８月上旬における平均気温は３０℃以上の日が多く、最高気温は４０℃を超える日もあった。このような受精による着果が厳しい環境条件で、除雄後の子房肥大の有無を判定したところ、単為結果性系統では１９％（６３花のうち１２花）、野生株では４％（７７花のうち３花）が着果した（図１）。また追加実験として、Ｗ２９３９系統（変異体）を生育適温である２４℃で栽培した場合の単為結果率を調査した。植物体はＢＣ３Ｓ２単為結果性系統、非単為結果性系統を４個体ずつ、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株を３個体供試し、１個体あたり３～１５花を除雄した。その結果、野生株は全て着果しなかったが、ＢＣ３Ｓ２非単為結果性系統では９．８％（４１花のうち４花）、ＢＣ３Ｓ２単為結果性系統では８．５％（５９花のうち５花）が着果した。
　また、他品種と交配した場合の単為結果性を評価するため、Ｗ２９３９系統と「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株を交配したＦ３系統を用いて、同様の評価試験を行った。高温ストレス下における単為結果性の強度を評価するため、栽培は夏季（５～９月）に行った。この期間における平均気温は通じて２５℃以上であり、生育期間後半は３０℃以上になる日がほとんどであった。また最高気温は生育期間前半からしばしば３５℃に達し、６月下旬以降は４０℃以上に達するなど、昨年と同様に着果には厳しい高温条件となった。「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株とＦ３系統をこの栽培環境で生育させ、６～７月に、開花２日前に除雄を行い、単為結果性を調査した。Ｆ２雑種集団において、着果率が高かった系統を耐暑性あり、着果率が低く耐暑性を示さなかった系統を耐暑性無いと判定し、それぞれの次世代を調査に用いた。これらのＦ３雑種系統と「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株を４個体ずつ供試し、１個体あたり２０花を除雄した。除雄後の子房肥大の有無を判定した結果、「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株では単為結果率が０％、Ｆ３雑種系統の耐暑性を示さない系統では、１３．８％であった。しかしながら、耐暑性を示す系統では、５７．５％の単為結果率を示した。この結果から、非芯止まり品種である「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」と交配した場合には、遺伝背景が「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」である場合よりも単為結果率が向上する可能性が示唆された。
４．２　Ｗ２９３９系統の高温耐性
　「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株と戻し交配をした単為結果性を示すＢＣ２Ｓ２系統を６個体ずつ用いて、赤熟果の収量調査を行った。８～９月における「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株の収量（平均）は、２６．３±２．７ｇであった。一方、単為結果性ＢＣ２Ｓ２系統の収量（平均）は、６３．１±２．５ｇであり約２．４倍増加した（図２）。この結果から、単為結果性は高温耐性（高温ストレス下における収量維持）と連鎖している可能性が高いことが示された。今回の除雄では花弁は残して実施したため、これらの植物ホルモンが花弁で産生され、子房に作用していた可能性は十分にある。「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」バックグラウンドの系統に加えて、「Ｕｅｌｅｉｅ１０６ＷＰ」野生株とＷ２９３９系統（変異体）を交配して得られたＦ３雑種系統についても、播種から１２３日後に各系統１個体の赤熟果および緑熟果を採取し、収量比較を行った。この結果から野生株およびＦ２で耐暑性を示さなかった後代では、着果率が低かったが、高温耐性を示した後代では、着果率の向上による収量性維持が確認された。よって、単為結果性の付与によって高温ストレス下における収量性が維持されることが示唆された。
４．３　果実形質の特性
　果実重や有種子率、糖度（Ｂｒｉｘ値）といった果実形質は、トマトの食味を左右する重要な形質である。これらの形質について、屋外温室で栽培した「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株およびＢＣ２Ｓ２単為結果性系統、閉鎖系栽培室で栽培した「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株およびＢＣ３Ｓ２系統を用いて、系統間の比較を行った。
　温室で栽培した「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株における平均果実重は３．２８±０．２３ｇであったが、ＢＣ２Ｓ２系統では１．７４±０．０６ｇ（ｐ＜０．０１）であった。有種子率は、野生株で４２．９％（４９個のうち２１個）、ＢＣ２Ｓ２系統では０．６％（３６３個のうち２個）であった。また、閉鎖系栽培室で栽培した「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株における平均果実重は３．３３±０．２６ｇであったが、ＢＣ３Ｓ２非単為結果性系統では２．８３±０．２３ｇであり、ＢＣ３Ｓ２単為結果性系統では２．７３±０．１９ｇであった。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定を実施したところ、系統間で有意差は確認されなかった。また有種子率は、野生株で８７．５％（４８個のうち４２個）、ＢＣ３Ｓ２非単為結果性系統では９２％（３９個のうち３６個）、ＢＣ３Ｓ２単為結果性系統では７５％（４４個のうち３３個）であった（図３）。これらの結果より、Ｗ２９３９変異体単為結果性系統は、花粉不稔の起こらない環境条件であれば、自殖によって種子を産生することが可能な条件的単為結果性を示すことが明らかとなった。また、ＢＣ３Ｓ２変異体において種子数の減少傾向が見られた。果実重に関しては、単為結果性系統の種なし果実では果実重が小さくなったが、種子を有する場合は果実重の減少は抑えられた（図３）。種なし果実での果実重の減少は、ｐｒｏｃｅｒａ変異体においても確認されており、著者らは、種子が形成されないために本来供給されるはずのオーキシンが欠損し、特に果肉部位の細胞分裂が抑制される可能性を指摘している（Ｃａｒｒｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２；１６０（３）：１５８１－９６）。またもう一つの原因として、単為結果に伴う着果数の増加が考えられる。上記の収量調査で計測した一定期間における平均赤熟果数は、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株で８．０±０．９個であったが、Ｗ２９３９系統から作製されたＢＣ２Ｓ２単為結果性系統では３６．３±３．１個と４倍以上に増加した。
　この実施例では、糖度を示す指標としてＢｒｉｘ値を用いた。測定の結果、温室で栽培した「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株における平均Ｂｒｉｘ値は８．５９±０．１２％、ＢＣ２Ｓ２系統では７．７０±０．０６％であったが、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにおいて有意差は見られなかった。一方で、閉鎖系栽培室で栽培した「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株における平均Ｂｒｉｘ値は５．５７±０．１５％であったが、ＢＣ２Ｓ２非単為結果性系統では５．０２±０．１５％であり、ＢＣ２Ｓ２単為結果性系統では７．９０±０．３７％であった。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定を実施したところ、単為結果性系統と非単為結果性系統間、および単為結果性系統と野生株間において１％水準で有意差が見られた（図４）。以上の結果から、Ｗ２９３９系統の単為結果性系統では果実のＢｒｉｘ値が増加することが明らかとなった。
［実施例２］
＜単為結果性原因遺伝子および変異の同定＞
１．マップベースクローニング法による遺伝子領域の絞り込み
１．１　供試植物および栽培条件
　Ｗ２９３９（ＴＯＭＪＰＷ２９３９）系統とミニトマト品種「レジナ」（サカタのタネ）野生株を交配したＦ２種子を得た。このＦ２雑種集団を４月に播種し、Ｇ４ガラス温室内のインキュベーターで５日間保温した。その後、温室内の薄膜水耕装置に移植して栽培を行い、全３１４個体から、明らかに単為結果性を示す個体のみを供試した。栽培期間中の気温条件は、昼間２５～４０℃、夜間１５～２５℃であり、明期は１３～１４．５時間であった。給水は、ＯＡＴハウスＡ処方（大塚１号１．５ｇ／Ｌ；大塚２号１ｇ／Ｌ、ＯＡＴアグリオ）で１．２～１．３ｄＳ／ｍに調整した養液を、９時から１６時の間、１時間おきに５分間循環させて行った。
１．２　花の表現型による単為結果性判定
　単為結果性の判定は、開花期の花の表現型に基づいて行った．花器官において、子房の早期肥大による花柱の突出や葯筒の裂開、花弁および花柱の脱離不全が見られる個体を、単為結果性個体と判定した。
１．３　ゲノムＤＮＡ抽出
　若い葉を１．５ｍｌチューブにサンプリングし、ＤＮＡ抽出バッファーを４００μｌ加えた。ＤＮＡ抽出バッファーは、２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ４ｍｌ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ１０ｍｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ１ｍｌおよび０．５％ＳＤＳ１ｍｌに蒸留水を加えて２０ｍｌにすることによって作製した。
　ペッスルで葉をすり潰した溶液を、１３、２００ｒｐｍで２分間遠心し、上清３００μｌを新しい１．５ｍｌチューブに加えた。さらに等量のイソプロピルアルコールを３００μｌ加え、ＤＮＡを析出させた。２分間の振盪を行った後に遠心を１３、２００ｒｐｍで５分間行った。遠心後、チューブを慎重に傾けて溶液を捨て、７０％エタノールを１ｍｌ加えた後に再び１３、２００ｒｐｍで５分間遠心した。溶液を捨て、約３０分間風乾して十分に乾燥した後、１００μｌの１×ＴＥ溶液を加え、５分間の振盪を行い、４℃で保存した。抽出が完了した各サンプルについて、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度測定を行った。
１．４　ラフマッピング用ＳＮＰマーカーの選抜
　かずさＤＮＡ研究所（木更津、千葉、日本）では「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」と「Ｒｅｇｉｎａ」の間で多型を示すＳＮＰマーカーを５５９箇所開発しており、Ｋａｚｕｓａ　Ｔｏｍａｔｏ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｄａｔａｂａｓｅ上で公開している（ｈｔｔｐ：／／ｍａｒｋｅｒ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｔｏｍａｔｏ／）。それらの中から、１から１２番染色体の短腕、長腕に位置するマーカーを選抜し、ＳＮＰマーカー情報およびＳＮＰの前後５０塩基対の配列を入手した。
１．５　プライマーの設計
　上記１．４で取得した配列情報を、Ｓｏｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ＤａｔａｂａｓｅのＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／）に入力して、ＳＮＰの前後約３００塩基対の周辺配列を取得した。プライマーの設計ツールには、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ．ｃｏｍ／）を用い、ＳＮＰの前後約１５０塩基対を増幅できるよう設計した。
１．６　ＰＣＲ反応
　上記のＤＮＡ粗抽出液およびプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ用酵素として、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（東洋紡、大阪、日本）を使用した。これらの反応液組成は、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅoｏ（１．０Ｕ／μｌ）０．３μｌ、２×Ｂｕｆｆｅｒ７．５μｌ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ３．０μｌ、Ｆｗ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｌ）０．３μｌ、Ｒｖ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｌ）０．３μｌ、蒸留水３．３μｌ、鋳型ＤＮＡ０．３μｌ、合計１５μｌからなる。
　ＰＣＲ条件は、９４℃２分で処理したのち、さらに９８℃１０秒、５９℃３０秒、および６８℃３０秒を１サイクルとして３５サイクル繰り返したのち、６８℃７分処理した。
１．７　電気泳動
　ＰＣＲ産物の電気泳動には、１％Ｓｔａｒアガロースゲル（理科研）を用いた。ＰＣＲ反応溶液５μｌに０．６μｌの１０×ｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅ（タカラバイオ、京都、日本）を混和させ、１×ＴＡＥバッファーで満たした泳動槽にアガロースゲルをセットし、混合液をアプライした。１００Ｖで１５分間電気泳動を行い、ＳＮＰ部位周辺が特異的に増幅されているかを確認した。ＤＮＡマーカーはＧｅｎｅ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｗｉｄｅ１（Ｗａｋｏ）を用いた。泳動後、ＵＶ照射ゲル撮影装置Ｅ－ＢＯＸ－Ｖｘ２／２０Ｍ（Ｖｉｌｂｅｒ　Ｌｏｕｒｍａｔ）でバンドの有無を確認した。
１．８　Ｅｘｏｓｔａｒ処理
　未反応のプライマーやｄＮＴＰｓを除去するため、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳｈｒｉｍｐ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｒＳＡＰ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＰＣＲ産物に対してＥｘｏ　Ｓｔａｒ処理を行った。溶液組成は、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ１μｌ、ｒＳＡＰ１μｌ、蒸留水（ＤＷ）１μｌ、ＰＣＲ産物５μｌ、合計８μｌからなる。また、反応は、３７℃６０分、８０℃１５分で行った。
１．９　ダイレクトシーケンシング
　Ｅｘｏ　Ｓｔａｒ処理を行った反応液を、ＤＷで３０倍に希釈した。希釈液を用いて、ダイレクトシークエンス用のプレミックス溶液を作製した。プレミックス溶液の組成は、希釈液（×３０）１μｌ、Ｆｗ　Ｐｒｉｍｅｒ（３．２ｐｍｏｌ／μｌ）３μｌ、ＤＷ１７μｌ、合計２１μｌからなる。ダイレクトシーケンシングには、Ｖａｌｕｅ　Ｒｅａｄシーケンスサービス（ユーロフィンジェノミクス）を利用した。解析結果から、各単為結果性個体が「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」ホモ、ヘテロ、「レジナ」ホモのいずれの遺伝子型であるか判定した。
２．ＮＧＳマッピングによる遺伝子変異の検出
２．１　供試植物および栽培条件
　Ｗ２９３９（ＴＯＭＪＰＷ２９３９）系統と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株を交配して得たＢＣ１Ｓ１、ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ３Ｓ１分離集団を供試した。供試個体数は、ＢＣ１Ｓ１単為結果性系統２個体、ＢＣ２Ｓ１単為結果性系統１３個体、ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統４個体、ＢＣ３Ｓ１非単為結果性系統２３個体とした。栽培は正確に表現型判定を行うため、筑波大学２Ｄ棟内の閉鎖系栽培室にて、ロックウールキューブ（Ｇｒｏｄａｎ）を用いた薄膜水耕で行った。潅水は毎日午前８時に、約１０分間行った。気温は２４℃一定、湿度は６０～７０％前後に維持した。水耕栽培溶液として、ＯＡＴハウスＡ処方（ＯＡＴハウス１号１．５ｇ／Ｌ；ＯＡＴハウス２号１ｇ／Ｌ、ＯＡＴアグリオ）を用い、電気伝導度（ＥＣ）を１．５ｄＳ／ｍに設定した培養液を使用した。
２．２　花の表現型による単為結果性判定
　単為結果性の判定は、開花期の花の表現型に基づいて行った。花器官において、子房の早期肥大による花柱の突出や葯筒の裂開、花弁および花柱の脱離不全が見られる個体を、単為結果性個体と判定した。
２．３　ゲノムＤＮＡの抽出
　ＮＧＳ　ｍａｐｐｉｎｇ用のゲノムＤＮＡ抽出には、純度を高めるためＭａｘｗｅｌｌ１６ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。約２００ｍｇの新鮮な葉サンプルを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに採集し、液体窒素で凍結後、ホモジナイゼーション用ペッスルを用いて葉サンプルを破砕した。ＫｉｔｓにおけるカートリッジのＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒが入っているセルに、破砕した葉サンプルを凍結状態で加えた。Ｋｉｔｓ付属のプランジャーを装着したのち、Ｍａｘｗｅｌｌ１６（Ｐｒｏｍｅｇａ）にセットし、Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを４００μｌアプライした。抽出完了後、６、０００ｒｐｍで３分間遠心し、沈殿物を除いた溶液を別の１．５ｍｌチューブに移すことで、精製を行った。抽出したゲノムＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度測定した。
２．４　ゲノムＤＮＡの精製
　ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統で供試できた個体数は、４個体のみであった。そこでゲノムＤＮＡの品質をより向上させ、全ゲノムシーケンシングの精度を高めるため、これらの個体について、Ｍａｘｗｅｌｌ精製後にＧｅｎｏｍｅ－ｔｉｐカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いたゲノムＤＮＡ精製を行った．トータルＤＮＡ量が３０μｇ以内となるように、各個体のＤＮＡ溶液２５０μｌを、１．５ｍｌチューブに分注した。このＤＮＡ溶液に１ｍｌのＱＢＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）を加えて混合した。Ｇｅｎｏｍｅ－ｔｉｐカラムを１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に立て、ＱＢＴバッファーを３ｍｌ加えて平衡化した。カラムの通過画分は捨てた。続いて、ＤＮＡとＱＢＴの混合液をＧｅｎｏｍｅ－ｔｉｐカラムにアプライし、その後、ＱＣバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）を３ｍｌアプライした。精製ＤＮＡが十分に得られなかった場合に備え、これらの手順の通過画分は捨てずに保管した。次に、Ｇｅｎｏｍｅ－ｔｉｐカラムを受けるチューブを、新しい１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に交換した。予めインキュベーターで５０℃に加温したＱＦバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）２ｍｌを、３回に分けてＧｅｎｏｍｅ－ｔｉｐカラムにアプライした。カラムを通過した溶液に、２ｍｌの２－イソプロパノールを加えて混合し、室温で５分静置した。その後、コニカルチューブに入った溶液を２ｍｌチューブ３本に分注し、１３、２００ｒｐｍで１５分間、４℃設定で遠心した。遠心後、慎重にチューブを傾けて上清を捨て、その後、７０％エタノールを約１ｍｌ加え、１３、２００ｒｐｍで１５分間、４℃設定で遠心した。遠心後、チューブを逆さに立てて１５分間風乾し、チューブが十分に乾いたら、３０μｌのＴＥバッファーをアプライし、この溶液を全ゲノムシーケンスに用いた。
２．５　ＮＧＳによる全ゲノム配列の決定
　Ｗ２９３９系統に特異的なＳＮＰを抽出するため、ＮＧＳを用いた全ゲノムシークエンシングを実施した．単為結果性を示すＢＣ１Ｓ１系統２個体、ＢＣ２Ｓ１系統１３個体、ＢＣ３Ｓ１系統４個体、単為結果性を示さないＢＣ３Ｓ１系統２３個体のゲノムＤＮＡを総量が５μｇになるようそれぞれバルクにして、各サンプルについてショートリードアセンブリによるゲノムリシークエンシングを行った。ＮＧＳプラットフォームには、Ｈｉ　Ｓｅｑ　Ｘ　Ｔｅｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いた。ただし、ＢＣ１Ｓ１系統についてはＨｉ　Ｓｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した。Ｗ２９３９系統に存在する変異はＰｕｌｕｎｇｕｎ（Ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１８；５９（６）：１１７０－１１８６）に記載の通り、Ｂｏｗｔｉｅ２－Ｓａｍｔｏｏｌｓ－ＧＡＴＫのパイプラインに従って同定した。リシークエンスのリファレンス配列には、「Ｈｅｉｎｚ　１７０６」のトマトゲノムＳＬ３．０を使用した。ＢＣ１Ｓ１系統については、トマトゲノムＳＬ２．５０を用いた。単為結果性ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ３Ｓ１系統については、リシークエンスによって解析された配列を、非単為結果性ＢＣ３Ｓ１系統の配列および当研究室で解析された「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生型の全ゲノム情報と比較して、変異体の単為結果性系統に特異的なＳＮＰを検出した。また、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生型系統内の遺伝子多型については、野生型１０系統の配列比較により除外した。単為結果性ＢＣ１Ｓ１系統については、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株３系統および他の「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」変異体６系統と配列を比較し、この単為結果性系統にのみ確認される変異を検出した。
２．６　全ゲノムシーケンス結果に基づいた候補遺伝子変異の選抜
　上記２．５で検出された単為結果性系統に特異的なＳＮＰから、さらに条件を設定して原因遺伝子変異を選抜した。選抜は、アミノ酸の非同義置換を引き起こしており、ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘが１（アレル頻度１００％）、リードデプス（リード数）が５以上、ジェノタイピングの確からしさを示すＧＱ値２０以上のＳＮＰに限定して行った。また、上記マップベースクローニングの結果から、候補遺伝子変異は第１０番染色体のみから探索した。単為結果性ＢＣ１Ｓ１、ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ３Ｓ１系統の特異的変異それぞれに、同様の条件を適用して選抜した。また、選抜した候補遺伝子について、各系統の結果を比較し、共通して表れた遺伝子変異を調査した。
３．連鎖解析による原因遺伝子変異の同定
３．１　供試植物および対象遺伝子
　連鎖解析には、Ｗ２９３９（ＴＯＭＪＰＷ２９３９）系統と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株を交配して得たＢＣ３Ｓ１分離集団を供試した。供試個体数は、単為結果性系統で２１個体、非単為結果性系統で３２個体であった。連鎖解析を行う対象の遺伝子変異は、上記２．４のＢＣ３Ｓ１単為結果性系統において選抜された候補遺伝子変異とした。
３．２　ゲノムＤＮＡの抽出
　ＢＣ３Ｓ１集団のゲノム抽出には、Ｍａｘｗｅｌｌ１６ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。抽出方法は、上記２．３と同様である。
３．３　プライマーの設計
　リシークエングの結果判明した候補遺伝子変異の物理的位置から、ＳＮＰ周辺の塩基配列情報を取得し、Ｓｏｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ＤａｔａｂａｓｅのＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／）に入力して、ＳＮＰの前後約３００塩基対の周辺配列を取得した。プライマーの設計ツールには、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ．ｃｏｍ／）を用い、ＳＮＰの前後約１５０塩基対を増幅できるよう設計した。設計したプライマーは、表２に示した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
３．４　ＰＣＲ反応
　上記のＤＮＡ抽出液およびプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ酵素として、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（東洋紡）を使用した。これらの反応液組成は、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅoｏ（１．０Ｕ／μｌ）０．２４μｌ、２×バッファー６μｌ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ２．４μｌ、Ｆｗプライマー（１０μｌ）０．２４μｌ、Ｒｖプライマー（１０μｌ）０．２４μｌ、蒸留水２．５８μｌ、鋳型ＤＮＡ０．３μｌ、合計１２μｌからなる。また、ＰＣＲ条件は、９４℃２分で処理したのち、さらに９８℃１０秒、５９℃３０秒、および６８℃３０秒を１サイクルとして３５サイクル繰り返したのち、６８℃７分処理した。
４．結果
４．１　ラフマッピングによる原因遺伝子領域の絞り込み
　Ｗ２９３９系統の原因遺伝子領域を絞り込むため、マップベースクローニングの一手法として、１染色体あたり２個の品種間多型マーカーを配置するラフマッピングを行った。このとき、図５に示した正方向プライマーと逆方向プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を行った。「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」と「レジナ」間で多型を示すＳＮＰマーカーを各染色体の短腕と長腕に配置し、Ｗ２９３９系統と「レジナ」野生株を交配したＦ２単為結果性集団１２個体を供試した（図５）。その結果、１０番染色体の短腕に位置しているマーカー（２１２０＿１００８）で１２個体中１０個体が「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」型ホモの遺伝子型を示した。その他２３個のマーカーでは、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」型の遺伝子型を示したのは８個体以下であった（図６）。これらのＦ２個体が持つ単為結果性は、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」に変異を導入したＷ２９３９系統に由来すると考えられるため、１０番染色体短腕のマーカー近傍に、原因遺伝子変異が座上していると考えられた。この領域に対し、多型マーカーをさらに配置するファインマッピングを行うことで原因遺伝子領域の絞り込みが可能と思われたが、その領域を絞り込める位置に多型マーカーが存在していなかったため、これ以上の絞り込みを行うことができなかった。また、２１２０＿１００８マーカーにおいて１２個体中２個体でヘテロの遺伝子型となった理由として、遺伝的距離が原因遺伝子から離れていたことが考えられた。
４．２　全ゲノムシーケンシング結果に基づいた候補遺伝子変異の選抜
　ＮＧＳを用いて、Ｗ２９３９単為結果性ＢＣ１Ｓ１、ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ３Ｓ１集団の全ゲノムシーケンシングを実施し、リファレンス配列ＳＬ２．５０、またＳＬ３．０に対してリシーケンスを行った。決定された塩基配列に対し、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株や他の変異体、およびＢＣ３Ｓ１非単為結果性系統の全ゲノム解析結果と比較し、アミノ酸の非同義置換を引き起こし、ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘが１であり、ＧＱ値が信頼できる遺伝子変異を検出した。ＢＣ１Ｓ１集団と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株および変異体計９個体を比較したところ、１０番染色体上に特異的な変異は３箇所発見された。また、ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統と「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株、変異体およびＢＣ３Ｓ１非単為結果性系統計３２個体を比較したところ、１０番染色体に特異的な変異はそれぞれ３、５箇所発見された。これらの変異体特異的な遺伝子変異のうち、ＢＣ１Ｓ１、ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統で共通していたものを調べたところ、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０に座上する２箇所のＳＮＰが抽出された。ＳＬ２．５０とＳＬ３．０では、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０に対応する物理的位置が異なっているが、変異が導入された箇所は各系統比較間で共通していた。また、１０番染色体上のＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の他に全ての系統で共通して検出された遺伝子変異が無いか確かめるため、その他の染色体も対象に探索を行った。しかしながら、共通して検出された変異は他に存在しなかった。全ゲノムシーケンシングの結果から明らかとなった２箇所の変異が、実際に単為結果性と連鎖していることを確かめるため、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株との戻し交配ＢＣ３Ｓ１系統を用いて、サンガーシーケンシングによる連鎖解析を実施した。その結果、ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統では２１個体全てで変異箇所の遺伝子型が変異体型であり、一方ＢＣ３Ｓ１非単為結果性系統では、３２個体全てでヘテロもしくは野生株の遺伝子型であった。単為結果性に関わっていない変異が最も除外されているはずのＢＣ３Ｓ１系統では、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の他にＳｏｌｙｃ１０ｇ００９５９０、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ００９６４０、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３上の変異が候補として検出されていた。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ００９５９０は、シロイヌナズナで二次細胞壁におけるセルロース合成や沈着に関与するＴＲＩＣＨＯＭＥ　ＢＩＲＥＦＲＩＮＧＥＮＣＥ－ＬＩＫＥファミリー遺伝子のトマトホモログと推定された。またＳｏｌｙｃ１０ｇ００９６４０は、シロイヌナズナでジャスモニルイソロイシン（ＪＡ－Ｉｌｅ）の合成を触媒し、ジャスモン酸（Ｊａｓｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ：ＪＡ）応答を誘導するＪａｓｍｏｎａｔｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１（ＪＡＲ１）遺伝子のトマトホモログと推定された（Ｗｅｓｔｆａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３６：１７０８－１７１１）。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３は、機能を示唆する報告が過去にされていない未知遺伝子であった。これらの３遺伝子変異についても、同様の個体を用いてサンガーシーケンシングによる連鎖解析を行った。ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統では、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ００９５９０で２１個体中６個体が野生株型ホモの遺伝子型であった。また、ＢＣ３Ｓ１非単為結果性系統では、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ００９５９０とＳｏｌｙｃ１０ｇ００９６４０で３２個体中２個体が変異体型ホモの遺伝子型であった。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３は、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０と同様に、全ての個体で表現型と遺伝子型が連鎖していた。この結果からはＳｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３が単為結果に関与している可能性を排除できなかったため、次項の通り、ＲＮＡ－ｓｅｑによる網羅的トランスクリプトーム解析データから、各組織における発現量を調査した。
４．３　トランスクリプトーム解析結果に基づいた候補遺伝子変異の選抜
　上記３．１で記述した連鎖解析結果からは、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３とＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０のうち、いずれの遺伝子が単為結果に関わるのか、もしくは両遺伝子が関与するのか判断することができなかった。単為結果性に関わる遺伝子であれば子房組織で発現していると考え、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」戻し交配により得られた、ＢＣ３Ｓ１単為結果性系統、ＢＣ３Ｓ１非単為結果性系統の開花２日後の子房を用いてＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、両系統の遺伝子発現量を判断材料に用いた。その結果、子房ではＳｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３は全く発現していなかったが、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０ではわずかながら発現していた。またこの結果からは、単為結果性系統、非単為結果性系統の間でＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の発現量（それぞれ０．０３、０．０２）に差があるか確認することはできなかった。両遺伝子の発現レベル差がわずかであったため、公共データを併用して判断することにした。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３はトマトゲノムのアノテーション情報であるＩＴＡＧ３．０で初めて発見された遺伝子であった。そこで、この遺伝子が解析されているＴｏｍａｔｏ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ｄａｔａｂａｓｅ内の比較的新しい解析データ（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｄ．ｂｔｉ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＴＦＧＤ／ｄｉｇｉｔａｌ／ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ｃｇｉ？ＩＤ＝Ｄ０１９、２０１９年１月１２日閲覧）を参照した。その結果、解析対象であるＳｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ「ＶＦ３６」およびＳｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ同質遺伝子系統の赤熟果ではほとんど発現しておらず、最も発現していた系統（ＬＡ４２５０Ａ）においても、発現量を示唆するＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｒｅａｄｓ）が０．０９であった。このことから、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３上の変異が単為結果に関与している可能性は非常に低いと考えられた。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０１９０３３の遺伝子機能は未知であったが、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０は、アノテーション情報によるとＪＡ生合成の初期段階に関をコードしていると予想された。そこで、ＲＮＡ－ｓｅｑで解析した遺伝子のうち、単為結果性系統で特異的発現パターンが見られるＤＥＧｓリストから、ＪＡ機能に関連する遺伝子を探索した。単為結果性系統で発現増加した遺伝子群のうち２番目にｑ－ｖａｌｕｅが低かった遺伝子はＪａｓｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　２（ＪＡ２）タンパク質をコードしており、２３８番目の遺伝子はＮＡＣドメインタンパク質ＩＰＲ００３４４１（ＪＡ２－ｌｉｋｅ；ＪＡ２Ｌ）をコードしていた。これらの遺伝子は、単為結果性系統でそれぞれ非単為結果性系統の４．５倍、３．８倍に増加していた。ＪＡ２はアブシジン酸（Ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ：ＡＢＡ）処理によって発現上昇することから、ＡＢＡ生合成を調節する役割を持つことが報告されている。また、ＪＡ２Ｌは、ＪＡによって発現が促進される遺伝子であり、ＪＡ２Ｌのアンチセンス個体は、ＪＡ伝達に欠損を持つｊａｉ１変異体と共通して、気孔閉鎖の持続による病害耐性の強化が起こったと報告されている。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の機能欠損は、ＪＡ生合成を引き起こすと考えられ、報告から考えられる結果とは異なるが、ＲＮＡ－ｓｅｑの結果でこれらの遺伝子の発現パターンが変化したことは、変異体でＪＡ生合成、伝達経路に変化が生じていることを示唆していた。また、単為結果性系統での発現量が、非単為結果性系統の０．５倍以下に減少していた遺伝子群についても調査した。その結果、ＪＡと直接的に関連した遺伝子は発見できなかったが、特筆すべき遺伝子として、８７番目にｑ－ｖａｌｕｅが小さいＧｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ　２－ｏｘｉｄａｓｅ　２（ＧＡ２ｏｘ２）が挙げられた。この遺伝子は、ＧＡ生合成経路において活性型ＧＡの不活化に関与している（Ｘｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，２００７；１８（６）：４７４－４７９）。単為結果性系統におけるＧＡ２ｏｘ２の発現量は、非単為結果性系統の約１６％に低下していた。この結果は、単為結果性系統において、活性型ＧＡが増加し、ＧＡ応答および着果が促進されている可能性を示唆している。以上の結果から、単為結果性原因遺伝子の変異によってＪＡやＧＡの発現パターンに変化が生じている可能性が示されたとともに、ＪＡ生合成に関与するＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０が最も有力な候補原因遺伝子であると考えられた。
４．４　最も有力な候補遺伝子の配列解析
　Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０の詳細情報をＳｏｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｎｅｔｗｏｒｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／、２０１８年１１月２１日閲覧）で検索したところ、この遺伝子は、１、１３１塩基対のエクソンのみから構成されると推定されていた（図７）。Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０は、１つのエクソンのみからなる全長１．１３１ｋｂｐの遺伝子であり，クラス３リパーゼ（トリグリセリドリパーゼ）で保存されているドメインを持つ。Ｗ２９３９単為結果性系統では５’末端から１０９番目と１４６番目の塩基に一塩基置換が入っており、その結果、２箇所のアミノ酸ミスセンス変異を引き起こしている。すなわち、Ｗ２９３９単為結果性系統では、２箇所で「Ｃ→Ｔ」の一塩基置換変異が確認され、３７番目の「アルギニン」（Ｒ）が「システイン」（Ｃ）、４９番目の「アラニン」（Ａ）が「バリン」（Ｖ）に変化するアミノ酸のミスセンス変異が確認された（図８）。これら２箇所のＳＮＰ近傍に別の変異が無いか確認したところ、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ３８１７０上に他の変異は存在せず、最も近い変異の存在位置は、エクソン開始配列の約１３、３００塩基対上流の遺伝子間領域であった。また、タンパク質のドメイン検索を、検索ツールであるＰｆａｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／、２０１８年１１月２１日閲覧）を用いて行った。その結果、１３７番目から２８３番目のタンパク質にかけて、クラス３リパーゼ（トリグリセリドリパーゼ）で保存されているドメインが確認された（図７）。しかしながら、変異の生じた箇所はドメイン内には存在しなかった。また、この遺伝子のオーソログを、ＮＣＢＩのタンパク質ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ、２０１８年１２月１日閲覧）で探索したところ、Ｔｏｔａｌ　Ｓｃｏｒｅが２００以上で相同性の比較的高いオーソログが８遺伝子発見された。その中でも２番染色体のＡｔ２Ｇ４４８１０は、約６３％のアミノ酸配列相同性があり、２番目に相同性が高かったＡｔ４Ｇ１６８２０（約４５％）と比較すると突出して類似していた。このオーソログとＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０のアミノ酸配列を比較した。その結果、２箇所のミスセンス変異箇所のうち３７番目のアルギニンは両者の配列で共通していた（図９）。よって、この遺伝子がＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０のホモログと仮定するならば、遺伝子機能の維持には３７番目のアルギニンの方が４９番目のアミノ酸よりも重要であり、３７番目のアミノ酸残基の変異が遺伝子発現、翻訳後のタンパク質の機能に影響を与えていると考えられた。
［実施例３］
＜Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子変異導入系統の作出および特性＞
１．標的配列の決定
　Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子に突然変異を誘導させるｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム用標的配列検索サイトであるＣＲＩＳＰＲ－Ｐ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＣＲＩＳＰＲ２／、２０１９年１月１０日閲覧、Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｌａｎｔ，２０１４；７（９）：１４９４－１４９６）、およびＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／、２０１９年１月１０日閲覧、Ｎａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１５：３１（７）：１１２０－１１２３）を用いて設計した。Ｃａｓ９ベクターの例を図１０に示す。また、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０に大規模な変異を起こすために、標的配列は２つ設定した。さらにまた、Ｗ２９３９系統で生じた変異が単為結果性と関連することを示すため、変異箇所の近傍に存在する標的配列を選択し、変異箇所近傍で様々な変異パターンを持つ個体が得ることを期待した。５’側の標的配列（Ｔａｒｇｅｔ１）として選択したＣＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＣＧ（配列番号７７）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐにおいてオフターゲット効果の低さを示すＯｎ－ｓｃｏｒｅが０．５０７１と比較的高く、配列中に変異体で一塩基置換が生じた部位を含んでいた。また、３’側の標的配列（Ｔａｒｇｅｔ２）として選択したＴＡＴＴＴＧＣＡＣＡＴＴＧＣＧＴＡＴＧＡ（配列番号７８）は、Ｏｎ－ｓｃｏｒｅが０．０４０５と比較的低かった。しかしながら、この配列は一塩基置換が生じた部位に近接しており、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔの結果から、ＰＡＭ配列上流２０塩基対に相同配列は存在せず、ＰＡＭ配列上流１２塩基対に限定しても特異性が比較的高かったことから、ＣＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＣＧ（配列番号７７）を標的配列に決定した。
２．Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子変異導入系統の作出
　上記１．で選択した２つの標的配列（配列番号７７および７８）を発現カセットに含むベクターを構築し、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子の機能をノックアウトした系統の作出を試みた（図１１、図１２）。トマトの形質転換には、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」に最適化したアグロバクテリウム法を利用して、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株の種子約２００粒を供試した（Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６；４７（３）：４２６－４３１）。カナマイシンを含む一連の選抜培地から再分化した植物体を形質転換体の候補として、フローサイトメーターを用いて二倍体の個体を選抜した。これらの個体について、Ｃａｓ９ベクターによって挿入されるＮＰＴＩＩ領域を含むか調査した。その結果、１１系統１４個体で、ＮＰＴＩＩ領域の挿入が確認された。さらに、Ｃａｓ９タンパク質によるＤＮＡの二本鎖切断と修復エラーが生じているかを確認するため、標的配列周辺を増幅させるプライマーを用いて変異導入の有無を調査した。その結果、６系統８個体でＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子のＰＡＭ配列近傍に変異が導入されていることが確認された。得られた計８個体のうち、Ｔａｒｇｅｔ１配列によってホモに変異が入ったと考えられる個体が３個体見つかった。それらのうち＃３－１個体では、Ｗ２９３９系統において一塩基置換が生じた部位から２塩基上流で、１塩基の挿入変異が見られた。また、＃２５－１、＃４２－１個体では、前述の１塩基挿入と、その近傍の２塩基欠失によるバイアレリックな変異が生じていた（図１３）。
　その結果、以降のアミノ酸配列でフレームシフトが生じ、本来より手前で終止コドンが現れた。野生株およびＷ２９３９系統では３７６アミノ酸残基からなるポリペプチドが、＃３－１個体では４７アミノ酸、＃２５－１、＃４２－１では４７アミノ酸もしくは４２アミノ酸になったと推定された（図１４）。残りの個体のうち、＃９－１、＃１０－１、＃３７－１個体では、＃３－１と同様の位置の１塩基挿入がヘテロに入っており、もう片方の鎖は野生株型であった（図１３）。また＃９－３と＃９－４では、サンガーシーケンシングの結果から三重の波形が確認されたことから、形質転換細胞と非形質転換細胞の混在、もしくは異なる変異が生じた形質転換細胞の混在が示唆された。
　また、Ｔａｒｇｅｔ２標的配列による変異導入を調べたところ、８個体中７個体では変異導入が確認されなかったが、＃４２－１では二本鎖のうち片方に７塩基欠失変異が生じていた。しかしながら、２箇所で同時に変異導入したことによる大規模な欠失などの変異は確認されなかった。Ｔａｒｇｅｔ１に比べＴａｒｇｅｔ２で変異導入効率が低かった理由としては、Ｔａｒｇｅｔ２配列を組み入れたｓｇＲＮＡの配列有効性が低かったことが考えられる。
３．Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子変異導入系統の表現型
　変異導入系統では、アミノ酸配列の変化により、タンパク質の機能欠損が起こっていると考えられた。Ｗ２９３９系統では、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０上の一塩基置換によってタンパク質の機能が失われ、単為結果が誘導されていると考えられたため、変異導入系統でも単為結果が生じているか調べた。開花期における表現型を調べたところ、ホモに変異が導入された全ての変異導入個体において、子房の早期肥大、花柱の突出、葯筒先端の変色、子房肥大後の花弁や花柱の残存といった表現型が確認された。これらの表現型は、Ｗ２９３９単為結果性系統と共通していた。また変異導入個体では、種子の無い赤熟果がしばしば確認された。比較を行うため、導入遺伝子が入っているが変異は生じていない形質転換体の表現型も調査した。その結果、変異導入個体とは対照的に、花の表現型は野生株と同様であり、全ての赤熟果で１１粒以上の種子が入っていた。これらの結果から、変異導入系統で確認されたＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子の変異によって、単為結果が誘導されることが示唆された。よって、この遺伝子は新規の単為結果性関連遺伝子であると推察された。
４．ＳｌＤＡＤ１遺伝子の発現量解析
　過去に実施されたトランスクリプトーム解析の結果から、ＳｌＤＡＤ１（別称、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０）遺伝子は開花前の蕾で特異的に発現することが示唆されている。そこで、Ｗ２９３９単為結果性系統の蕾においてＳｌＤＡＤ１遺伝子の発現量が抑制されていることを確認し、ＪＡ生合成に影響を及ぼしている可能性を示唆するために、「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」野生株、Ｗ２９３９非単為結果性系統、単為結果性系統を用いた組織別の発現量解析を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲ法によって発現量を測定した結果、野生株における各組織の発現量は、４ｍｍ蕾の時期と開花当日では非常に低かったが、開花２日前の花弁サンプルでは発現量が大きく増加していた。また、本実施例のサンプリング方法では、トマトの花糸（Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）は花弁と組織が部分的に結合しているために花弁サンプルに含まれていた。この事実を踏まえると、シロイヌナズナのオーソログＡｔ２Ｇ４４８１０で示されているように（図９）、ＳｌＤＡＤ１遺伝子はこの発達ステージの花糸で一時的に発現している可能性が考えられる（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ，２００１；１３（１０）：２１９１－２２０９；　Ｋｌｅｐｉｋｏｖａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｊｏｕｒｎａｌ，２０１６；８８（６）：１０５８－１０７０）。一方で、Ｗ２９３９単為結果性系統では開花２日前の花弁サンプルの発現量が野生株と比較して約１％と有意に減少していた。また、Ｗ２９３９非単為結果性系統においても発現量が約３８％に減少していたが、有意差は見られなかった。ＳｌＤＡＤ１遺伝子にＥＭＳによって導入された一塩基置換変異は、上記の２箇所以外に存在しなかったことを考慮すると、これら２箇所のＳＮＰによってＳｌＤＡＤ１遺伝子の発現が抑制されたと考えられる。
　上記実験の結果を要約すると、次のようになる。
　トマトＷ２９３９系統の単為結果性の原因遺伝子は、１０番染色体上のＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０（別称、Ｓｌｄａｄ１）遺伝子であり、これは、１つのエクソンのみからなる全長１１３１ｂｐの遺伝子であり、クラス３リパーゼ（トリグリセリドリパーゼ）で保存されているドメインをもつ。Ｗ２９３９単為結果性系統の原因遺伝子変異は、５’末端から１０９番目と１４６番目の２箇所の塩基の「Ｃ→Ｔ」であり、すなわち３７番目の「アルギニン」（Ｒ）が「システイン」（Ｃ）、４９番目の「アラニン」（Ａ）が「バリン」（Ｖ）に変化するアミノ酸のミスセンス変異であることが今回明らかになった。
　トマトの野生株と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりＳｌｄａｄ１変異が導入された植物体の表現型とを、夏季（高温ストレス条件下）での単為結果率と収量性について比較し、また、単為結果率を、開花前の花より除雄を行い、その後種内果実が発達した雄蕊の割合を調査した結果、野生株では５７．１％の単為結果率であったのに対し、Ｓｌｄａｄ１変異をもつ植物では９９．４％と高い単為結果率を示した。さらに、収量について、稔った赤熟果実の重量を合計として両者を比較したところ、野生株では２６．３±２．７ｇであったのに対し、Ｓｌｄａｄ１変異をもつ植物では６３．１±２．５ｇであり、かつ高着果率および高温耐性を示した。
　従来のトマト栽培では、着果を安定させるために。開花した花に振動刺激や植物ホルモン剤の処理、或いは媒介昆虫の利用が必要であるが、単為結果を誘導する本発明の変異を利用することによって労力を軽減できるし、また、高温でも栽培が可能になるため、栽培期間や栽培区域の拡大に寄与することができる。その結果、本発明による植物変異体を育種素材とした省労力の栽培が可能な品種開発が可能となり、生食用及び加工用を目的としたトマトの安定的周年生産が可能となる。さらに、この遺伝子変異情報を利用してとも後だけでなく他の果菜類等でも単為結果性や高温耐性が付与された品種の開発が可能となる。
配列番号３：Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子変異体のヌクレオチド配列
配列番号４：Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０タンパク質変異体のアミノ酸配列
配列番号６：Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子変異体の一部ヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号１～１５０）
配列番号８：Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０タンパク質変異体の一部アミノ酸配列（アミノ酸番号１～８０）
配列番号１５～１６：Ｔ０変異導入系統の標的１領域のヌクレオチド配列（図１３）
配列番号１８～２０：Ｔ０変異導入系統の標的１領域のアミノ酸配列（図１４）
配列番号２１～７６：プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (17)

  1. 　Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログによってコードされるタンパク質の発現が低下するかもしくは欠損するような前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を有することを特徴とする、単為結果性を有する果実類植物またはその部分。
  2. 　前記遺伝子もしくはそのオーソログが、配列番号２のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の果実類植物またはその部分。
  3. 　前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異が、前記タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の果実類植物またはその部分。
  4. 　前記少なくとも１つのアミノ酸の置換が、配列番号２のアミノ酸配列において３７番目のアルギニンの他のアミノ酸への置換を含む、請求項３に記載の果実類植物またはその植物部分。
  5. 　前記配列番号２のアミノ酸配列において４９番目のアラニンの他のアミノ酸への置換をさらに含む、請求項４に記載の果実類植物またはその部分。
  6. 　前記果実類植物が、ナス科植物、ウリ科植物、バラ科植物、およびブドウ科植物からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の果実類植物またはその部分。
  7. 　９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の単為結果率を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の果実類植物またはその部分。
  8. 　３０℃以上の環境温度に耐性である、請求項１～７のいずれか１項に記載の果実類植物またはその部分。
  9. 　前記変異についてホモ接合型である、請求項１～８のいずれか１項に記載の果実類植物またはその部分。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の果実類植物の作出方法であって、前記植物の野生型の細胞、カルスもしくは組織においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現を低下するかもしくは欠損するような前記遺伝子もしくはそのオーソログの変異を導入する第１工程、前記第１工程の植物の細胞、カルスもしくは組織を培養し植物体集団を作製する第２工程、ならびに前記第２工程の植物体集団から単為結果性を有する植物を選抜する第３工程を含むことを特徴とする前記方法。
  11. 　前記変異が、前記遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記変異を、前記Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列または該遺伝子のオーソログのヌクレオチド配列において、前記配列番号１のヌクレオチド配列の１０９番目、１４６番目もしくはその両方の位置、または該位置に相当する前記オーソログのヌクレオチド配列内の位置、の一塩基置換による変異を含むポリヌクレオチドを導入することによって行う、請求項１０に記載の方法。
  13. 　前記ポリヌクレオチドが配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記第３工程で選抜された植物が、前記変異についてホモ接合型である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  16. 　果実類植物から単為結果性植物を選抜する方法であって、果実類植物の細胞もしくは組織においてＳｏｌｙｃ１０ｇ０３８１７０遺伝子またはそのオーソログの発現の低下もしくは欠損、あるいは、該遺伝子またはそのオーソログの破壊もしくは欠損を検出することを含むことを特徴とする、前記方法。
  17. 　前記検出を、ＰＣＲもしくはハイブリダイゼーションによって行う、請求項１６に記載の方法。
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