CN104812897B - 在acs4基因中具有非转基因改变的番茄植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及番茄种的栽培植物，其包含具有一个或多个突变的acs4等位基因，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白。

Description

在ACS4基因中具有非转基因改变的番茄植物
技术领域
本发明涉及植物生物技术和植物育种的领域。提供了包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄(Solanum lycopersicum)植物，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失的或活性降低的突变acs4蛋白。本发明提供了植物，与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，所述植物的果实显示出更低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。此外，本发明提供了本发明的番茄植物的番茄果实、种子、花粉、植物部分和后代。本发明还提供了包含本发明植物果实或由其组成的食品和食品产品。
本发明还提供了内源性acs4基因和由所述基因编码的acs4蛋白，具有至少一个人工诱导的非转基因突变。
在另一个实施方案中，本文提供了用来制备在其基因组中包含一个或多个突变acs4等位基因的番茄植物的方法。
背景技术
番茄的育种的目的在于产生被最佳地改造为适于生长和贮藏条件的商业品种。育种者面临的挑战是在收获后的果实硬度与消费者对味道、质感和颜色的需求之间寻找一种改进的平衡。这些消费者需求与果实成熟密切相关。果实成熟是一个复杂的发育过程，其负责将含种子的器官转化成能吸引种子传播者(seed dispenser)和农业消费者的组织。与果实成熟相关的改变(特别是收获后软化)限制了新鲜番茄的贮藏期。
对于番茄果实的生长和发育，可以识别出许多连续的阶段：花发育，授粉，接着发生特征为高频率的细胞分裂的早期果实发育，而且所述果实的大小快速增大，这主要是由于细胞扩增。在第三阶段结束时，果实达到绿熟期。在第四阶段期间，发生果实成熟，其以颜色和味道以及果实硬度和质感的变化来表征。
番茄红素和胡萝卜素的累积致使形成番茄果实的特征性红色。一般而言，可区分不同的着色阶段：绿熟期(mature green)、破色期(breaker)、粉红期(pink)和红熟期(red)。在破色期阶段，开始了典型的红色色素沉积。红熟阶段或红熟收获果实阶段是果实在其主要部分上都达到其成熟颜色的阶段。
除了所述颜色改变，在果实成熟过程中，酶活性导致细胞壁的中间层状区域发生降解，该降解导致表现为果实软化和果实质感丧失的细胞松弛。通常，果实软化的测量方式为对压缩的外部抵抗力，这可以通过例如果实硬度计(penetrometer)进行量化。
对已知参与成熟的单个基因的修饰还没有获得正常成熟但具有最小的组织软化的果实。
乙烯促进呼吸跃变型果实例如番茄的成熟和衰老。乙烯通过增加1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)而自我催化其自身的生物合成。ACS也称作1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶；Le-ACS；或S-腺苷基-L-甲硫氨酸甲基硫代腺苷-裂解酶。因此，ACS和ACO的数量增加导致L-甲硫氨酸到乙烯的转化增加。在番茄中已经鉴定了至少八种ACS基因(LEACS1A、LEACS1B和LEACS2-7)(Alexander et.al.,Journal of ExperimentalBotany,Vol 53,No 377,pp2039-2055,2002)，并且各种ACS具有不同的表达方式。
ACC合酶(ACS)是催化从S-腺苷基甲硫氨酸合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的酶。然后ACO催化ACC转化为乙烯。例如Stearns和Glick(Biotechnology Advances 2003,vol21pp 193-210)描述了乙烯的生物合成，其以引用的方式纳入本文。
ACS属于5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖酶的α-家族，并且与该家族的其他成员(如天冬氨酸氨基转移酶(AATase)和酪氨酸氨基转移酶(TATase))具有适度水平的相似性。Capitani等人已经描述了来自不同来源的ACS的结构。在对八种ACS蛋白(苹果(Malusdomestica)、绿豆(Phaseolus aureus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、烟草(Nicotiana tabacum)、甜瓜(Cucumis melo)、番茄(Lycopersicon esculentum)和甘蓝(Brassica oleracea))的序列比对中，他们描述了在所述Capitani的出版物的图1中以红色和黄色指示的保守区。定义了三个结构域：第52-318位残基的一个大结构域，以及第20-49位和第333-430位残基的两个小结构域。定义了连接所述大结构域和第二小结构域的螺旋α12(Capitani et al.,Journal of MolecularBiology,1999,vol 294,pp 745-756)。
已经提出了在呼吸跃变型植物调节乙烯产生中起作用的两个系统。第一个在正常的营养生长中起作用(系统1)；它是自我抑制的并且负责产生基础乙烯水平，所述基础乙烯水平在所有组织(包括非呼吸跃变型植物的那些组织)内都可以检测到。系统1在果实发育中继续直到获得达到果实成熟的能力。然后到达过渡期，在此期间，LEACS1A和LEACS4被激活，导致乙烯水平升高。乙烯水平的升高诱导LEACS2的表达，所述LEACS2启动在呼吸跃变型果实的成熟过程中发挥作用的系统2。在系统2中，乙烯的产生是自我催化的。已经在转基因植物中使用LEACS2的反义抑制来研究乙烯调节的这种复杂性(Barry et al.,PlantPhysiology vol 123,pp 979-986,2000)。
WO2005/016504公开了“保绿”植物，即与标准对照相比其叶片衰老延缓的植物表型。其公开了具有中断的ACS2、ACS6、ASC7基因的植物，所述中断抑制了所述ACS的表达或活性。
Yokotani等人描述了所有已知LeEIL基因(乙烯不敏感类基因(EthyleneInsensitive Like gene))均被抑制的转基因番茄以研究乙烯生物合成的调节机制(Yokotani et al,Journal of Experimental Botany,vol 60,pp 3433-3442,2009)。
因此，需要具有改良的乙烯产生的栽培番茄植物，与野生型番茄植物相比，其番茄果实的成熟延缓和/或贮藏期更长。
发明内容
因此，本发明的目的是产生并鉴定番茄种的栽培植物，所述栽培植物的果实具有延迟的成熟和/或更长的果实贮藏期。
因此，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植物，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白，但是当所述突变等位基因以杂合或纯合形式存在时，所述突变acs4蛋白具有足够的功能以使番茄果实成熟到红熟期。
一般性定义
术语“核酸序列”(或核酸分子)是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。“分离的核酸序列”是指这样的核酸序列，即其不再处于分离出其的天然环境中，例如，在细菌宿主细胞中或者在植物细胞核或质体基因组中的核酸序列。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用并且指的是由氨基酸链组成的分子，不管具体的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，Acs4蛋白的“片段”或“部分”仍可以称作“蛋白质”。“分离的蛋白质”用于指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或者在重组的细菌或植物宿主细胞中。
术语“基因”指DNA序列，其包含与适合的调节区(例如启动子)可操作地连接的区域(转录区)，所述区域(转录区)在细胞中被转录为RNA分子(例如mRNA或RNAi分子)。因此，基因可以包含若干个可操作地连接的序列，例如启动子、含有例如参与翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和含有例如转录终止位点的3’非翻译序列。基因可以是内源基因(在来源的物种中)或是嵌合基因(例如转基因或同源转基因(cis-gene))。
“基因的表达”指与适合的调节区(特别是启动子)可操作地连接的DNA区域转录为RNA的过程，所述RNA具有生物活性，即其能够被翻译为有生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)或其本身具有活性(例如，在转录后基因沉默或RNAi中具有活性)。编码序列可以是有义方向的并编码所需的、有生物活性的蛋白质或多肽、或活性肽片段。
“活性蛋白质”或“功能性蛋白质”是具有在体外(例如通过体外活性测定)和/或在体内(例如通过所述蛋白质赋予的表型)可测量的蛋白质活性的蛋白质。“野生型”蛋白质是存在于野生型植物中的完全功能性蛋白质。本文的“突变蛋白质”是在编码该蛋白质的核酸序列中包含一个或多个突变的蛋白质，其中所述突变导致(所述突变核酸分子编码的)“功能降低”或“功能丧失”的蛋白质，例如在体内可测量的(例如通过所述突变等位基因赋予的表型可测量的)。
“功能降低的acs4蛋白”或“活性降低的acs4蛋白”是指突变acs4蛋白，与野生型Acs4蛋白相比，其具有降低的催化由S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，从而导致乙烯合成减少。当编码所述突变蛋白的等位基因以纯合或杂合形式存在于番茄植物中时，所述acs4蛋白的催化活性的降低影响了包含这类功能降低的acs4蛋白的果实的成熟行为，即果实的成熟延迟或贮存期更长。这种功能降低的acs4蛋白可以通过“部分敲除突变acs4等位基因”(例如，在其核酸序列中包含一个或多个突变的野生型Acs4等位基因)的转录和翻译来获得。在一个方面，这种部分敲除突变acs4等位基因是包含一个或多个突变的野生型Acs4等位基因，所述突变优选地导致产生其中至少一个保守的和/或功能性的氨基酸被另一个氨基酸置换以使得生物活性显著降低但不完全消失的asc4蛋白。但是，番茄Acs4等位基因中的其他突变(例如一个或多个无义、错义、剪接位点或移码突变)也可以导致功能降低的acs4蛋白，并且这种功能降低的蛋白与野生型ACS4蛋白相比，可以有一个或多个氨基酸被替换、插入或缺失。这种部分敲除突变acs4等位基因也可以编码显性负性的acs4蛋白，该蛋白能够对同一细胞内的其他Acs4蛋白的生物活性产生不利影响。这种显性负性的acs4蛋白可以是这样的acs4蛋白：其仍然能够如野生型Acs4蛋白一样与相同的元件相互作用但是阻断了其功能的一些方面。显性负性的acs4蛋白的实例是这样的acs4蛋白：其缺少对于激活的关键的特定氨基酸残基缺失，或在所述特定的氨基酸残基中具有修饰，但是仍然包含其结合结构域，使得不仅其自身的生物活性降低或消失，而且它们还通过与存在于细胞中的野生型和/或部分敲除acs4蛋白竞争结合位点从而降低细胞内的总acs4活性。突变等位基因可以是“天然突变”等位基因(其是天然存在的突变等位基因，例如，没有人工应用诱变剂的情况下而自发产生的)或“诱导突变”等位基因(其是由人工干扰诱导的，例如，通过诱变)。
“功能丧失的acs4蛋白”指突变acs4蛋白，其与野生型Acs4蛋白相比基本上没有催化从S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，致使与野生型Acs4蛋白相比乙烯合成减少。当编码所述突变蛋白的等位基因以纯合或杂合的形式存在于番茄植物中时，所述缺失催化活性的合成影响了包含这种功能丧失的acs4蛋白的果实的成熟行为。这种“功能丧失的acs4蛋白”的纯合型番茄植物的果实仍可以产生由其他蛋白(例如其他Acs蛋白如Acs1A)催化的乙烯。因此，这种“功能丧失的acs4蛋白”的纯合型番茄植物的果实仍可以成熟，但是成熟可能延迟和/或贮存期可能更长。
编码蛋白质的核酸分子中的“突变”是与野生型序列相比一个或多个核苷酸的改变，例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失或插入。“点突变”是单个核苷酸的置换，或单个核苷酸的插入或缺失。
“无义”突变是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，由此一个密码子变为终止密码子。这导致在mRNA中存在提前终止密码子并导致截短的蛋白。截短的蛋白可能具有降低的功能或丧失功能。
“错义”或非同义突变是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，由此一个密码子变为编码不同氨基酸的密码子。所产生的蛋白质可能具有降低的功能或丧失功能。
“剪接位点”突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此前mRNA(pre-mRNA)的RNA剪接发生改变，产生了具有与野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有与野生型不同的氨基酸序列的蛋白质。所产生的蛋白质可能具有降低的功能或丧失功能。
“移码”突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此mRNA的读码框发生改变，产生不同的氨基酸序列。所产生的蛋白质可能具有降低的功能或丧失功能。
调节序列(例如基因的启动子)中的突变是例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失或插入造成的与野生型序列相比的一个或多个核苷酸的改变，从而导致例如产生减少的或不产生所述基因的mRNA转录产物。
“沉默”指下调或完全抑制靶基因或基因家族的基因表达。
基因沉默方法中的“靶基因”是这样的基因或基因家族(或基因的一个或多个具体等位基因)：当嵌合沉默基因(或“嵌合RNAi基因”)被表达并且例如产生沉默RNA转录产物(例如能够沉默内源靶基因表达的dsRNA或发夹RNA)时，其内源性基因表达被下调或完全抑制(沉默)。在诱变方法中，靶基因是待突变的内源基因，导致基因表达的改变(降低或丧失)或所编码的蛋白质的功能的改变(降低或丧失)。
本文使用的术语“可操作地连接”指处于功能性关系中的多核苷酸元件的连接。当一种核酸与另一核酸序列置于功能性关系中时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子(或者更确切地说是转录调控序列)影响编码序列的转录，则该启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接意指所连接的DNA序列通常是相邻，并且当需要连接两种蛋白质编码区时所连接的DNA序列是邻近的且处于读码框中以产生“嵌合蛋白”。“嵌合蛋白”或“杂合蛋白”是由不同的蛋白“结构域”(或基序)组成的蛋白质，所述蛋白本身不是天然存在的，但是连接后形成了显示出被连接的结构域的功能的功能性蛋白。嵌合蛋白也可以是两个或更多个天然存在的蛋白的融合蛋白。
术语“食品”是被消耗以给机体提供营养支持的任何物质。其通常是植物或动物来源的，并且包含必需营养物质(例如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素或矿物质)。所述物质被生物体摄取并被生物体的细胞吸收以努力产生能量、维持生命或刺激生长。术语食品包括被消耗以给人类和动物机体提供营养支持的物质。
术语“贮藏期”或“收获后贮藏期”是指在果实被认为不适合出售或食用(‘坏的’)之前给予果实的(平均)时间长度。贮藏期是产品能被储存的时间段，在该时期内所定义的具体比例货物的质量在预期的分配、储藏和展示的条件下仍然是可接受的。贮藏期受以下几个因素的影响：光和热的暴露、气体的传送(包括湿度)、机械应力和例如微生物的事物的污染。通常围绕所述果实的硬度/柔软度参数对产品质量进行数学建模。可将贮藏期定义为植物株系的果实开始变坏并且不适合出售或食用时所花费的(平均)时间，例如从植物的第一果实进入破色期或转色期(turning stage)开始或从第一果实完全变红开始或从收获时开始。在一个实施方案中，本发明的突变体具有比野生型植物的贮藏期显著更长的贮藏期，例如，当植物在相同的条件下生长并且果实被用相同的方式处理且在相同的条件下保存时，从第一果实处于破色期(或转色期、粉红期、红熟期或从收获时起)直到所述第一果实开始变‘坏’并且不适合出售或食用的天数是明显更长的，例如，比对照植物(例如野生型Acs4/Acs4植物)的果实的贮藏期长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。因此，为了确定从特定阶段(例如从破色期或其后期阶段)到变‘坏’阶段所需要的天数，例如，可以将野生型对照植物(在与突变体植物相同的条件下生长的并且处于相同的发育阶段)的第一果实进入特定阶段(例如，破色期或其后期阶段)的那天作为起点(第一天)，从这天起定期(以特定的时间间隔，例如1、2、3、4、5或6天之后)观察果实，直到第一果实经过完全成熟阶段并变‘坏’的那天(如视觉上和/或通过评估果实柔软度可测定的)。
在本申请中，与词语“贮藏期”结合使用的词语“改善的”、“增加的”、“更长的”和“延长的”可互换使用并且所有这些都是指本发明番茄植物的果实平均具有比所述对照果实(Acs4/Acs4果实)更长的贮藏期。
“延迟的成熟”是指与野生型Acs4等位基因纯合型(Acs4/Acs4)的植物的野生型对照果实相比，本发明的番茄植物或植物株系(例如，突变体)的果实平均需要显著更多的天数以从番茄果实成熟的绿熟期、破色期、转色期和/或粉红期到达红熟期。延迟成熟可以在植物上测量和/或在收获后作为特定百分比的果实(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和/或100％的果实)达到红熟期所需的天数来进行测量。如果10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和/或100％的果实达到红熟期所花的天数与野生型对照果实达到相同百分比的红色果实所花的天数相比至少长2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天，则认为该植物具有延迟成熟的表型。应当理解，对于在植物上以及收获后测量的延迟成熟，上文所举例的天数(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)与达到红熟期阶段的果实的每个％(即10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和/或100％)的各种组合都包含在本文中。例如，如果10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和/或100％的果实达到红熟期阶段所花的天数与野生型对照果实达到相同百分比的红色果实所花的天数相比，长至少2天。另一个如何在植物上和/或收获后测定延迟成熟的实例是100％的果实达到红熟期阶段所花的天数与野生型对照果实达到相同百分比的红色果实所花的天数相比长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。例如可以将野生型对照植物(在与突变植物相同的条件下生长并且处于相同的发育阶段)的第一果实进入特定阶段(例如破色期阶段)的那天作为起点(第一天)，从这天起，定期(以特定时间间隔(例如1、2、3、4、5、或6天以后))对突变植物株系和对照植物的处于破色期的果实的数目和处于红熟期的果实的数目进行计数(参见实施例)。
用于本文时，“降低的乙烯产生”在本文中是指在果实成熟过程中(例如在粉红期和/或浅红期和/或红熟期阶段)，本发明的番茄果实产生的乙烯的量(与野生型Acs4/Acs4果实相比)在统计学上显著降低，如实施例中所描述，并且这可以通过实时乙烯测量来测量。在一个实施方案中，乙烯水平在从粉红期阶段至红熟期阶段的果实成熟的整个过程中显著降低。
应当理解，在不同植物株系之间进行的比较包括在与一种或多种对照植物株系的植物(优选野生型植物)相同的条件下种植一种株系的多株植物(例如至少五株植物，优选每种株系至少10株植物)，并且测定在相同环境条件下生长时的所述植物株系之间的统计学显著差异。
“破色期的延迟”指在相同条件下生长时，本发明突变体的第一果实和/或所有果实与野生型对照相比需要显著更多的天数以进入破色期，例如与野生型对照相比至少多1天，优选至少多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。
所述番茄果实的“成熟阶段”可划分如下：(1)绿熟期：表面完全是绿色的；绿色的深浅可从浅色到深色不等。(2)破色期：在不多于10％的表面上存在颜色从绿色到棕黄色、粉色或红色的明确变化(break)。(3)转色期：10％到30％的表面不是绿色的；整体来看，显示出从绿色到棕黄色、粉色、红色或其组合的明确变化。(4)粉红期：30％到60％的表面不是绿色的；整体来看，显示出粉红或红色。(5)浅红期：60％到90％的表面不是绿色的；整体来看，显示出粉红或红色。(6)红熟期：90％以上的表面不是绿色的；整体来看，显示出红色。
可通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定“序列同一性”或“序列相似性”。然后，当通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)对序列进行最佳比对时，这些序列共有至少某一特定的最小的序列同一性百分比(如下文进一步定义的)时，其可以被称作“基本相同”或“基本相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch全局比对算法来对两个序列的全长进行比对，该算法最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位生成(gap creation)罚分＝10，空位延伸(gag extension)罚分＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对)。对于核苷酸，使用的默认得分矩阵是DNAFULL，而对于蛋白质，默认得分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS89,10915-10919)。例如可以使用计算机程序(例如EMBOSS)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)来确定用于百分比序列同一性的序列比对和得分。或者，可以通过搜索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定序列相似性或同一性，但是应检索命中并进行两两比对以比较序列同一性。如果百分比序列同一性为至少90％、95％、98％、99％或更多(如使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5)，对于核苷酸，使用得分矩阵DNAFULL，对于蛋白质，使用得分矩阵Blosum62)通过Emboss“Needle”所确定的)，则两个蛋白质或两个蛋白质结构域、或两个核酸序列具有“基本序列同一性”。这类序列在本文中也被称作“变体”，例如，可鉴定除了本文公开的具体核酸和蛋白质序列之外的突变acs4等位基因和突变acs4蛋白的其他变体，这些变体对包含其的果实的延迟的成熟和/或更长的贮藏期具有相同的作用。
本申请的图1示出了Capitani等人(Journal of Molecular Biology,1999,vol194,pp 745-756)的图1中给出的五个序列(甜瓜登录号Q42668、天竺葵登录号Q43810、甘蓝登录号Q43747、绿豆登录号Q41688和马铃薯登录号Q43166)与SEQ ID NO 1(Le-ACS4)中给出的野生型番茄ACS4氨基酸序列的氨基酸序列比对。参见图1，该比对表明，Capitani等人的图1中用黄色和红色标示的保守氨基酸，在野生型番茄ACS4氨基酸序列中也是保守的。值得注意的是，本申请图1中所标示的氨基酸编号与Capitani等人的图1中的编号并不对应。
ACS4“大结构域”是指SEQ ID NO:1的第65位氨基酸至第327位氨基酸的氨基酸残基(也参见图4)。ACS4小结构域是指本申请的SEQ ID NO:1的第33至62位氨基酸残基(参见图4)和/或SEQ ID NO:1的第339至438位氨基酸(参见图4)。据认为ACS4的催化中心位于所述“大结构域”中。
在本说明书及其权利要求中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性的含义使用，意指包括该词之后所列的项目(item)，但是不排除未明确提到的项目。另外，由不定冠词“一”或“一个”提及一种要素(element)时，不排除存在超过一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常指“至少一个”。还应当理解的是，当本文中提到“序列”时，通常是指具有特定亚单位(例如氨基酸)序列的实际物理分子。
本文使用的术语“植物”包括完整的植物或其任何部分或衍生物，例如植物器官(如收获的或未收获的果实、花、叶等)、植物细胞、植物原生质体、可用于再生完整植物的植物细胞或组织培养物、可再生或不可再生的植物细胞、植物愈伤组织、植物细胞团和植物中完整的植物细胞、或植物的部分，例如胚胎、花粉、胚珠、子房、果实(例如收获的组织或器官，如收获的番茄或其部分)、花、叶、种子、块茎、无性繁殖的植物、根、茎、子叶、下胚轴、根尖等。还包括任何发育阶段，例如未成熟和成熟的幼苗等。
“植物株系”或“育种系”指植物及其后代。本文使用的术语“自交株系”指已经被反复自交的植物株系。
“植物品种”是在已知最低等级的相同植物分类中的一组植物，所述植物品种可以基于源自某一特定基因型或基因型组合的特征的表达来定义(无论是否满足《植物育种者权利》(plant breeder's rights)中的识别条件)，可以通过那些特征中的至少一种的表达而将所述植物品种与任何其他组的植物区分开，也可将所述植物品种看作一个实体，因为其可被繁殖而无任何改变。因此，如果它们的特征都在于存在1个基因座或基因(或者由该单个基因座或基因产生的一系列表型特征)，但是它们又在其它基因座或基因上可以彼此显著不同，那么即使它们是同一类的，也不可以使用术语“植物品种”来表述该组植物。
“F1、F2等”是指两个亲本植物或亲本株系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或株系杂交产生的种子长出的植物称为F1代。F1代植物自交产生F2代，等等。“F1杂种”植物(或F1种子)是由两个近交的亲本株系杂交得到的世代。“M1群体”是某植物株系或栽培种的多个诱变种子/植株。“M2、M3、M4等”指第一诱变种子/植株(M1)自交后得到的连续世代。
术语“等位基因”是指特定基因座上的基因的一种或多种替代形式中的任一种，所有这些等位基因均与特定基因座处的一种性状(trait)或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座。一对同源染色体中的每条染色体上存在一个等位基因。二倍体植物物种可以在特定基因座上包含大量不同的等位基因。这些等位基因可以是所述基因的相同等位基因(纯合的)或两个不同的等位基因(杂合的)。
术语“基因座”是指染色体上的存在例如基因或遗传标记物的一个或多个具体位置或位点。因此，ACS4基因座是在基因组中的存在ACS4基因的位置。
“野生型等位基因”(WT)在本文中是指编码完全功能性蛋白(野生型蛋白)的基因形式。这类编码完全功能性Acs4蛋白的序列是例如在基于Genbank登录号M63490.1的SEQID NO:8中描述的野生型Acs4 cDNA(mRNA)序列或SEQ ID NO:15中描述的野生型Acs4基因组序列。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:15中描述了由该野生型Acs4mRNA编码的蛋白质序列。其由476个氨基酸组成。已经提到Acs4蛋白上存在三个结构域，即第一小结构域，其范围为SEQID NO:1的第33至62位氨基酸；“大结构域”，其被认为包含所述蛋白的催化中心(其范围为SEQ ID NO:1的第65至327位氨基酸)；以及第二小结构域，其范围为SEQ ID NO:1的第339至438位氨基酸残基(参见图4)。其他编码完全功能性Acs4蛋白的等位基因(即赋予与SEQ IDNO:1的蛋白相同程度的成熟和乙烯产生的等位基因)可能存在于其他番茄植物中并可能与SEQ ID NO:1具有基本序列同一性，即与SEQ ID NO:1具有至少约90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性。这类完全功能性野生型Acs4蛋白在本文中被称作SEQ ID NO:1的“变体”。同样的，编码这类完全功能性Acs4蛋白的核苷酸序列被称作SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15的变体。
下面的突变acs4等位基因是本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的acs4突变的实例。值得注意的是，本文提到的核苷酸序列(SEQ IDNO:8-14)是编码SEQ ID NO:1-7的蛋白的cDNA，即编码DNA序列。显然，当提到这些cDNA核苷酸序列时，应当理解，cDNA是相应的番茄基因组acs4序列的编码区，而番茄基因组acs4序列还额外地包括内含子，因此其核苷酸具有不同的编号。因此，应当理解，当提到包含例如SEQID NO:8-14中的任一序列的acs4序列的番茄植物时，该番茄植物包含含有编码DNA(cDNA)的基因组acs4序列，SEQ ID NO:8-14的mRNA是从该编码DNA(cDNA)转录而来(并进而被翻译为蛋白质)。除了mRNA中的胸腺嘧啶(t)是尿嘧啶(u)之外，mRNA的核苷酸序列与cDNA相同。此外，当提到包含编码本发明的蛋白质(例如SEQ ID No:2-7的突变蛋白或不同的突变体)的核苷酸序列的番茄植物时，由于遗传密码的简并性，其包含不同的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述植物包含SEQ ID NO:15中描述的基因组Acs4序列或与其基本相同的基因组Acs4序列(例如与SEQ ID NO:15具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性)，但在所述序列特别是所述基因组序列的外显子(外显子1的范围为第1至318位核苷酸；外显子2的范围为第796至955位核苷酸，以及外显子3的范围为第1689至2638位核苷酸)中具有一个或多个突变，导致所编码的突变acs4蛋白的功能降低或功能丧失。
本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的一个示例性突变acs4等位基因(突变体2477或Nun 2477)包含导致所编码的蛋白质(SEQ IDNO:2)中第279位氨基酸处从丝氨酸(Ser或S)到天冬酰胺(Asn或N)置换的突变。所述S279N突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO:2描述了突变体2477的蛋白序列。氨基酸的置换是由于SEQ ID NO:8的第836位核苷酸处的G到A的突变，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。SEQ ID NO:9描述了该突变cDNA。
本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的另一个示例性突变acs4等位基因(突变体4043或Nun 4043)，包含导致所编码的蛋白质(SEQID NO:3)中第248位氨基酸处从丙氨酸(Ala或A)变为缬氨酸(Val或V)的突变。所述A248V突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO:3描述了突变体4043的蛋白序列。所述氨基酸的置换是由于SEQ ID NO:1的第743位核苷酸处的C到T的突变，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。SEQ ID NO:10描述了该突变cDNA。
本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的另一个示例性突变acs4等位基因(突变体4222或Nun 4222)，包含导致在翻译过程中产生具有203个氨基酸残基的截短的蛋白质的突变，而所述野生型蛋白具有476个氨基酸残基。SEQID NO:4描述了突变体4222的截短的蛋白序列。所述截短是由于SEQ ID NO:1的第610位核苷酸的A变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。突变体4222中的这种A610T突变导致赖氨酸密码子(AAA)变为终止密码子(TAA)。SEQ ID NO:11描述了该突变cDNA。
本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的另一个示例性突变acs4等位基因(突变体4043或Nun 4043)，包含导致所编码的蛋白质的第321位氨基酸处从亮氨酸(Leu或L)变为苯丙氨酸(Phe或F)的突变。所述L321F突变位于ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID NO:5描述了突变体4303的蛋白序列。所述氨基酸的置换是由于SEQ ID NO:1的第963位核苷酸处的G变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。SEQ ID NO:12描述了该突变cDNA。
本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的另一个示例性突变acs4等位基因(突变体4691或Nun 4691)，包含导致所编码的蛋白质的第250位氨基酸处从缬氨酸(Val或V)变为谷氨酸(Glu或E)的突变。所述V250E突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO:6描述了突变体4691的蛋白序列。所述氨基酸的置换是由于SEQ ID NO:1的第749位核苷酸的T变为A，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。SEQ IDNO:13描述了该突变cDNA。
本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的另一个示例性突变acs4等位基因(突变体5251或Nun 5251)，包含导致所编码的蛋白质的第316位氨基酸从苏氨酸(Thr或T)变为异亮氨酸(Ile或I)的突变。所述T316I突变位于ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID NO:7描述了突变体5251的蛋白序列。所述氨基酸的置换是由于SEQ ID NO:1的第947位核苷酸的C变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。SEQID NO:14描述了该突变cDNA。
本文中的“突变等位基因”是指与野生型等位基因相比在编码序列(mRNA、cDNA或基因组序列)中含有一个或多个突变的等位基因。这类突变(例如，一个或多个核苷酸的插入、倒位、缺失和/或置换)可导致所编码的蛋白具有降低的体外和/或体内功能(功能降低)或没有体外和/或体内功能(功能丧失)，例如，由于所述蛋白例如被截短或者具有其中一个或多个氨基酸被缺失、插入或置换的氨基酸序列。这类改变可导致蛋白质具有不同的3D构象、被靶向到不同的亚细胞区室、具有经修饰的催化结构域、具有经修饰的对核酸或蛋白质的结合活性等。
本文中的“野生型植物”和“野生型果实”或“正常成熟”的植物/果实是指含有编码完全功能性Acs4蛋白的野生型(WT)Acs4等位基因(Acs4/Acs4)的两个拷贝的番茄植物(例如不同于含有突变acs4等位基因的“突变植物”)。这些植物为例如在表型测定中的合适的对照。优选地，野生型和/或突变植物是“栽培的番茄植物”。例如栽培种Moneymaker、栽培种Ailsa Craig、栽培种Tapa以及许多其他栽培种都是野生型植物。
“番茄植物”或“栽培的番茄植物”是这样的番茄的植物：即人工栽培并具有优良的农艺学特征的番茄种的品种、育种系或栽培种；优选地，这类植物不是“野生植物”，所述野生植物即一般具有比栽培植物差得多的产量和差得多的农艺特征以及例如在野生群中天然生长的植物。“野生植物”包括例如物种的生态型、PI(植物引种)系、当地品种(landrace)或野生登记物或野生近缘种。所谓的传统品种(heirloom variety)或栽培种——即，通常在人类历史的较早时期被种植并通常被改造为适于特定地理区域的自由授粉品种或栽培种——在本文中被作为栽培番茄植物被涵盖在本发明的一个方面中。
番茄的野生近缘种(wild relative)包括：S.arcanum、克梅留斯基番茄(S.chmielewskii)、小花番茄(S.neorickii＝L.parviflorum)、契斯曼尼番茄(S.cheesmaniae)、多腺番茄(S.galapagense)、细叶番茄(S.pimpinellifolium)、智利番茄(S.chilense)、S.corneliomulleri、多毛番茄(S.habrochaites＝L.hirsutum)、S.huaylasense、赤茄(S.sisymbriifolium)、秘鲁番茄(S.peruvianum)、多毛番茄(S.hirsutum)或潘那利番茄(S.pennellii)。
本文中的“平均”是指算数平均值。
序列表说明
SEQ ID NO:1示出了从基于Genbank登录号AAA34131.1的mRNA获得的番茄野生型、完全功能性ACS4蛋白序列(由Genbank登录号M63490.1的cDNA编码)。
SEQ ID NO:2示出了番茄突变体2477 acs4蛋白序列。
SEQ ID NO:3示出了番茄突变体4043 acs4蛋白序列。
SEQ ID NO:4示出了番茄突变体4222 acs4蛋白序列。
SEQ ID NO:5示出了番茄突变体4303 acs4蛋白序列。
SEQ ID NO:6示出了番茄突变体4691 acs4蛋白序列。
SEQ ID NO:7示出了番茄突变体5251 acs4蛋白序列。
SEQ ID NO:8示出了基于Genbank登录号M63490.1的番茄野生型Acs4 cDNA。
SEQ ID NO:9示出了番茄突变体2477 acs4 cDNA。
SEQ ID NO:10示出了番茄突变体4043 acs4 cDNA。
SEQ ID NO:11示出了番茄突变体4222 acs4 cDNA。
SEQ ID NO:12示出了番茄突变体4303 acs4 cDNA。
SEQ ID NO:13示出了番茄突变体4691 acs4 cDNA。
SEQ ID NO:14示出了番茄突变体5251 acs4 cDNA。
SEQ ID NO:15示出了番茄野生型Acs4基因组DNA。
附图说明
图1：本图示出了Capitani等人(Journal of Molecular Biology,1999,vol 194,pp 745-756)的图1中给出的5个序列的氨基酸序列(甜瓜、天竺葵、甘蓝、绿豆和马铃薯)与SEQ ID NO 1中给出的野生型番茄ACS4氨基酸序列的比对。
图2：在粉红期和红熟期以nl/(h·g)(也写作nl·h-1·g-1)测量的番茄果实的乙烯释放。Tapa是商业野生型栽培种(Acs4/Acs4)。
图3：本图示出了处于红熟期的果实的百分比，其是在野生型对照果实开始进入破色期[在第一天，野生型的第一颗果实处于破色期]后的不同天数时确定的。与野生型(wt)相比，本发明的突变植物的所有果实都需要更多天才能成熟，“Ho”是指特定acs4突变纯合型(acs4/acs4)的突变植物(前面的编号所指示的)的果实；He是指特定acs4突变杂合型(Acs4/acs4)的突变体(前面的编号所指示的)的果实。
图4：SEQ ID NO:1-7的比对。还描述了Acs4的结构域(浅灰色)及突变(加粗并加下划线)。
具体实施方式
本发明公开了包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植物，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失和/或功能降低的突变acs4蛋白。
所述Acs4蛋白序列含有3个结构域：“大结构域”，是指本申请的图4所示的第65至327位氨基酸残基；以及两个小结构域，分别指本申请的图4所示的第33至62及339至438位氨基酸残基。Acs4催化中心被认为位于“大结构域”中。
在一方面，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植物和/或其部分(例如果实)，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中与野生型完全功能性Acs4等位基因(编码SEQ ID NO:1的功能性Acs4蛋白或功能性变体)纯合型(Acs4/Acs4)的番茄植物相比，所述一个或多个突变导致降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。
编码SEQ ID NO:1的蛋白的番茄植物是例如栽培种UC82B或其他。
在一方面，SEQ ID NO:1的功能性变体是编码Genbank登录号CAH56694、CAH56504或CAH56693的蛋白质的Acs4等位基因。编码SEQ ID NO:1的功能性变体的番茄植物是例如栽培种San Marzano Vesuvio、San Marzano Nano或Tondino。
在一方面，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植物和/或其部分(例如果实)，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中与野生型完全功能性Acs4等位基因(编码SEQ ID NO:1的功能性Acs4蛋白或功能性变体)纯合型(Acs4/Acs4)的番茄植物相比，所述一个或多个突变导致降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期，其中所述番茄植物不包含编码Genbank登录号CAH56694、CAH56504或CAH56693的蛋白质的Acs4等位基因。在另一方面，本发明植物的一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生。
在另一方面，本发明植物的一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。
在另一方面，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植物，所述突变导致产生功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白，其中所述一个或多个突变存在于“大结构域”中，即在Acs4等位基因编码的野生型、功能性Acs4蛋白的第65-327位氨基酸区域的编码部分中，并且所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中所述一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。在一个优选的方面中，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:1的第241至251位氨基酸的区域内和/或第304至327位氨基酸的区域内的一个或多个氨基酸的置换、缺失和/或插入；在另一个方面，所述一个或多个突变导致第200、201或203位氨基酸下游的大结构域的一部分或全部缺失，或所述突变导致截短的acs4蛋白，所述截短的acs4蛋白至少缺少第二小结构域和/或大结构域的一部分，例如终止密码子存在于SEQ ID NO:8的第600位核苷酸后的任何位置处。
在另一方面，本发明涉及包含编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的acs4等位基因的番茄植物，所述蛋白包含功能性“大结构域”，即导致降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的所述突变位于“大结构域”外。因此，在一个实施方案中，所述突变acs4等位基因在一个或两个所述小结构域中(来自包含功能性“大结构域”的SEQID NO:1或SEQ ID NO:1变体的第33至62位和/或第339至438位氨基酸)包含一个或多个突变，并且还在SEQ ID NO:1的第33至62位和/或第339至438位氨基酸中包含(核苷酸序列编码的)至少一个氨基酸插入、缺失或置换，所述至少一个插入、缺失或置换导致番茄植物果实的降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期。
在一个实施方案中，导致功能丧失的acs4蛋白或acs4蛋白的功能降低的一个或多个突变位于野生型Acs4蛋白的“大结构域”中，即所述蛋白包含功能性“小结构域”，因此在一个实施方案中，在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1变体的第65至327位氨基酸中一个或多个氨基酸被插入、缺失或置换。在另一个实施方案中，导致功能丧失的acs4蛋白或acs4蛋白的功能降低的一个或多个突变位于野生型Acs4蛋白的C-末端中，因此在一个实施方案中，在SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1变体)的第444至476位氨基酸中一个或多个氨基酸被插入、缺失或置换。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的番茄植物包含内源性(非转基因)突变acs4等位基因，所述突变acs4等位基因编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的突变acs4蛋白，由此所述植物的果实确实能够成熟到红熟期(优选比编码完全功能性Acs4蛋白的野生型等位基因纯合型的植物慢)。在本发明的另一个实施方案中，本发明的番茄植物包含人工诱导的非转基因突变acs4等位基因，所述突变acs4等位基因编码功能降低的突变acs4蛋白和/或功能丧失的acs4蛋白。在另一个实施方案中，这类突变acs4等位基因来源自栽培的番茄(例如育种系、品种或传统品种)或番茄的野生近缘种和/或在其中产生。这种人工诱导的突变可以例如使用EP1963505中描述的定向诱变来诱导。随后，番茄的野生近缘种中产生的突变acs4等位基因可以很容易地通过育种转入栽培的番茄中。
在另一方面，本发明涉及具有编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的内源性acs4等位基因的本发明植物，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的变体具有基本序列同一性，其中所述蛋白包含一个或多个氨基酸的置换、缺失和/或插入。
在另一方面，本发明涉及包含与野生型(Acs4/Acs4)植物相比降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期的本发明的植物，这是由于所述植物含有编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的内源性acs4等位基因，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:7具有基本序列同一性。在一个具体方面中，本发明涉及含有acs4等位基因的栽培的番茄植物，所述acs4等位基因以一个或两个拷贝(即以纯合或杂合的形式)存在于以登录号NCIMB 42034、NCIMB 42037、NCIMB 42038、NCIMB42039或NCIMB42041保藏的种子中。在杂合的形式中，另一个等位基因可以是野生型Acs4等位基因或另一个突变acs4等位基因，例如来自本文所提供的其他突变体中的任何一个，或是编码本文所述的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的任何其他突变acs4等位基因。因此，在杂合的形式中，所述另一个等位基因可以是功能降低的acs4等位基因。
在另一方面，本发明涉及内源性acs4等位基因或涉及其编码的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白与SEQ ID NO:2与或SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:7具有基本序列同一性，所述等位基因或蛋白存在于(及来自于)以登录号NCIMB 42034、NCIMB 42037、NCIMB 42038、NCIMB 42039或NCIMB 42041保藏的种子中。
在另一方面，本发明涉及包含编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的内源性acs4等位基因的本发明的番茄植物，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:7具有100％序列同一性。
在另一方面，本发明涉及包含编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的内源性acs4等位基因的本发明植物，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白在所述“大结构域”中具有至少一个氨基酸缺失、插入或置换。优选地，所述acs4蛋白包含功能性小结构域，例如SEQ ID NO:1的小结构域(第33至62位和/或第339至438位氨基酸残基)或SEQ ID NO:1的(功能性)变体的小结构域。在一个实施方案中，所述acs4蛋白还包含SEQ IDNO:1的C-末端(第444至476位氨基酸)或SEQ ID NO:1的(功能性)变体的C-末端。
在一方面，所述acs4蛋白不长于203个氨基酸，优选为开始的203个氨基酸。因此，在一个实施方案中，所述番茄植物编码截短的acs4蛋白，其包含SEQ ID NO:1或其变体的第1-450位、第1-400位、第1-350位、第1-300位、第1-250位或第1-203位氨基酸。
本发明还涉及含有编码cDNA(mRNA)的内源性acs4基因的番茄种子、植物和植物部分，所述cDNA(mRNA)与SEQ ID NO:8具有基本序列同一性并且在所述内源性acs4基因具有至少一个非转基因突变，其中所述至少一个非转基因突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白。优选地，与编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性变体的功能性野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，所述突变导致降低的乙烯产生和/或更加缓慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。本文任何位置中描述的突变可以是人工诱导的或其可以是自然突变。优选地，所述植物是栽培的番茄植物。在一个实施方案中，所述突变产生终止密码子或氨基酸置换。在一个实施方案中，选自野生型Acs4蛋白的Ala248、Val250、Ser279、Thr316和Leu321的氨基酸被置换为不同的氨基酸，例如Ala248Val、Val250Glu、Ser279Asn、Thr316Ile和Leu321Phe。在另一个实施方案中，所述突变选自SEQID NO:8的G836A、C743T、A610T、G963T、T749A和C947T。
在另一方面，本发明涉及含有内源性突变acs4基因的番茄种子、植物和植物部分，其中所述非转基因突变在由acs4基因编码并由其转录并翻译产生的acs4蛋白中产生氨基酸的改变，其中所述氨基酸改变选自SEQ ID NO:1的S279N、A248V、L321F、V250E、T316I及第204至476位氨基酸的完全缺失。
在另一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:2具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:4具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:5具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:6具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:7具有基本序列同一性的acs4蛋白。本发明还涉及含有编码这些蛋白质的核苷酸序列的番茄种子、植物和植物部分。
在另一方面，本发明涉及本发明的植物的番茄果实、种子、花粉、植物部分和/或后代。优选地，本发明涉及本发明的植物的果实或种子。更优选地，本发明涉及具有延迟的成熟和/或增加的收获后贮藏期的番茄果实，所述延迟的成熟和/或增加的收获后贮藏期是所描述的至少一个acs4等位基因中的非转基因突变引起，由本文别处所述。
在一方面，本发明番茄植物具有延迟的破色期，意指本发明突变体的第一果实和/或所有果实与野生型Acs4/Acs4对照相比需要显著更多的天数(例如多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天)来进入破色期。
在另一方面，本发明番茄植物的果实从破色期进入红熟期需要更多的天数，例如，本发明植物的果实从破色期进入红熟期需要的天数比野生型Acs4/Acs4对照多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14或更多天。
在另一方面，本发明涉及本发明植物的果实，所述果实具有的贮藏期与野生型Acs4等位基因纯和型的番茄果实的贮藏期相比长至少2天。在另一方面，本发明涉及具有降低的乙烯产生的本发明植物的果实，所述降低的乙烯产生与野生型Acs4等位基因纯和型的番茄相比降低至少15％或降低至少20％。
在一个具体的方面，本发明的番茄植株具有与野生型植物的贮藏期相比显著更长的贮藏期，例如，当在相同的条件下种植植物且用相同方式处理果实并在相同条件下保存果实时，从第一果实处于破色期(或转色期、粉红期、红熟期或从收获时起)直到其开始变‘坏’并不适合出售或食用的天数与对照植物(例如野生型Acs4/Acs4植物)的果实相比显著更长，例如，长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。
延迟的成熟和/或延长的贮藏期可以具有这样的优势，即有更多的时间可以用于将采摘的果实运输至例如零售商和超市，和/或消费者可以将果实保存更长的时间。可以在绿熟期或破色期或其后收获番茄。在破色期之前收获时，需要乙烯暴露，而在破色期附近或其后收获则不需要乙烯接触，这是由于果实自身产生乙烯。如图2中所示，本发明的成熟延迟的突变体在粉红期和红熟期与野生型果实相比产生更少的乙烯，但是产生的乙烯足以使其成熟到红熟期。在本发明的一个方面，提供了含有编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的突变acs4等位基因的番茄植物，其中所述植物的果实与野生型(Acs4/Acs4)植物相比产生明显更少的乙烯。“明显更少的乙烯”是指在粉红期或红熟期所述果实产生的乙烯等于或少于纯合型Acs4/Acs4果实所产生的乙烯的75％、等于或少于70％、等于或少于65％、等于或少于60％、等于或少于55％、等于或少于50％、等于或少于45％、等于或少于40％、等于或少于35％、等于或少于30％、等于或少于25％、等于或少于20％、或者等于或少于15％。因此，在一方面，在粉红期产生的乙烯低于约3.5nl/(h·g)，例如等于或低于约3nl/(h·g)、或等于或低于约2.5nl/(h·g)、或等于或低于约2.0nl/(h·g)、或等于或低于约1.5nl/(h·g)、或等于或低于约1.0nl/(h·g)、或等于或低于约0.5nl/(h·g)。在一方面，在红熟期产生的乙烯低于约6nl/(h·g)，例如等于或低于约5.5nl/(h·g)、或等于或低于约5.0nl/(h·g)、或等于或低于约4.5nl/(h·g)、或等于或低于约3.5nl/(h·g)、或等于或低于约3nl/(h·g)、或等于或低于约2.5nl/(h·g)、或等于或低于约2.0nl/(h·g)、或等于或低于约1.5nl/(h·g)、或等于或低于约1.0nl/(h·g)、或等于或低于约0.5nl/(h·g)。
在另一方面，本发明涉及具有由至少一个acs4等位基因中的非转基因突变引起的更长的成熟期和/或增加的收获后贮藏期的本发明植物的番茄果实，其中所述更长的成熟期和/或更长的收获后贮藏期为野生型Acs4等位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少110％。优选地，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs4等位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少115％，更优选至少120％，甚至更优选至少125％。在另一方面，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs4等位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少135％，更优选至少150％，甚至更优选至少165％。在另一方面，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs4等位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少180％，更优选至少200％，甚至更优选至少250％。
在本发明的另一方面，提供了具有与本发明番茄植物相同或相似的延迟的成熟和/或增加的贮藏期的番茄植物，所述番茄植物的代表性种子由Nunhems B.V.保藏并根据布达佩斯条约按照Expert Solution(EPC2000,Rule 32(1))于2012年8月21日被接受保藏在NCIMB Ltd.(英国苏格兰，阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn Aberdeen,Scotland AB21 9 YA,UK))。种子被给予以下保藏号:NCIMB 42034(突变体2477)、NCIMB 42037(突变体4043)、NCIMB 42038(突变体4222)、NCIMB 42039(突变体4691)、NCIMB 42041(突变体5251)。
根据另一方面，本发明提供了本发明的番茄植物的细胞培养物或组织培养物。所述细胞培养物或组织培养物包含可再生细胞。这类细胞可从叶、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖部、花药、花、种子和茎中获得。
还提供了可用于生长出本发明植物的种子，以及含有这类种子的包装物(package)。本发明的植物的无性繁殖物也是本文涵盖的一个方面。同样的，涵盖了用于新鲜食用的或用于加工的或以经加工形式的收获的果实和果实的部分。可以将果实分级、按大小分类和/或进行包装。可以将果实切成片状或切成块状或进一步加工。
在另一方面，本发明涉及本发明植物的一个或多个细胞。
本发明还涉及整合本发明番茄植物的果实或果实的部分的食品和/或食品产品。本文使用的食品指被人或动物物种食用的营养物质。实例是三明治、色拉、调味酱(sauce)、番茄酱等。
在另一方面，本发明涉及产生本发明番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从番茄植物中获得植物材料；
b.用诱变剂处理所述植物材料以产生诱变的植物材料；
c.分析所述诱变的植物材料以鉴定在至少一个和SEQ ID NO:1或其变体具有基本序列同一性的acs4等位基因上具有至少一个突变的植物。
所述方法还可以包括对所选择的植物或所述植物的后代的番茄果实的成熟期和/或贮藏期进行分析，并选择其果实具有延迟的成熟和/或延长的贮藏期的植物。
在一方面，所述突变可以选自acs4蛋白的大结构域和/或acs4蛋白的第二小结构域(第339-438位氨基酸)中的突变。在一方面，所述突变选自导致选自以下氨基酸置换的突变：S279N、A248V、L321F、V250E、T316I，或选自引起SEQ ID NO:1的第204至476位氨基酸或其一部分的缺失的终止密码子突变。在另一方面，所述突变选自引起选自以下的cDNA改变的突变：SEQ ID NO:8的G836A、C743T、A610T、G963T、T749A和C947T。在本方法中，步骤a)的植物材料优选地选自番茄植物株系或栽培种的种子、花粉、植物细胞或植物组织。更优选植物种子。在另一方面，本方法使用的诱变剂是甲基磺酸乙酯。在步骤b)和步骤c)中，所述诱变的植物材料优选地是突变群体，例如番茄TILLING群体。
因此，在一方面，提供了用于产生具有延迟的果实成熟和/或更长的果实贮藏期的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供番茄TILLING群，
b)筛选所述TILLING群的acs4基因上的突变体，特别是编码大结构域的核苷酸序列上的突变体，和
c)从b)的突变植物中选择出其果实与野生型(Acs4/Acs4)果实相比具有降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期的那些植物(或那些植物的后代)。
优选地将突变植物(M1)自交一次或多次以产生用于表型分析的例如M2群或优选M3或M4群。在M2群中，所述突变等位基因以1(突变等位基因纯合型)：2(突变等位基因杂合型)：1(野生型等位基因纯合型)的比例存在。
在另一方面，本发明涉及用于产生杂交番茄植物的方法，所述方法包括：
(a)获得本发明的第一番茄植物和
(b)用第二番茄植物与所述第一番茄植物杂交；
其中所述杂交番茄植物包含具有一个或多个突变的acs4等位基因。其中所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白。
本发明的植物和植物部分(例如果实、细胞等)可以是所述突变acs4等位基因纯合型或杂合型的。
优选地，包含一个或多个突变acs4等位基因(或变体)并且产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白的本发明植物不会产生与野生型植物相比更少的果实。因此，优选地，每个植株的果实数目不减少。
可通过计算机(in silico)来鉴定其他推定的ACS4基因/蛋白质，例如通过在已有的核酸或蛋白质数据库(例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中使用标准的序列分析软件(例如序列相似性搜索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等))来鉴定核酸或蛋白质序列。
在一个实施方案中，提供了acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变Acs4蛋白(包括变体或直系同源物，例如野生番茄近缘种的acs4蛋白)以及在其基因组中含有一个或多个acs4等位基因的植物或植物部分，所述acs4等位基因编码acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变体，由此所述降低的功能赋予了与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。
任何类型的突变都可能导致所编码Acs4蛋白的功能降低，例如在包含所述cDNA(SEQ ID NO:8或其变体)的所述基因组DNA中一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换。在一个优选的实施方案中，提供了与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，能够减少乙烯产生和/或赋予更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期的acs4核苷酸序列，藉此由于在大结构域中的一个或多个突变而使所述核酸序列编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的Acs4蛋白。
如本文所描述，可以通过确定该突变等位基因对乙烯产生和/或成熟期和/或贮藏期的影响来检测这类蛋白在体内的acs4蛋白功能丧失或功能降低。如本领域已知的，可以例如使用例如诱变来产生并通过TILLING来鉴定或使用EcoTILLING来鉴定这样的植物，即其包含编码此类突变的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的蛋白的核酸序列并且具有与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。还可以使用转基因方法来检测编码突变acs4蛋白的突变acs4等位基因的体内功能性。可以将突变等位基因与植物启动子可操作地连接，并可以通过转化将所得嵌合基因引入番茄植物中。可以检测再生植物(或后代，例如通过自交获得的后代)的乙烯产生和/或果实成熟期和/或贮藏期。例如可以转化包含无功能的acs4等位基因的番茄植物以检测所述转基因acs4等位基因的功能性。
TILLING(定向诱导基因组局部损伤)是一种常用的反向遗传技术，该技术使用常规的化学诱变方法产生诱变个体文库，然后对所述诱变个体文库进行高通量筛选以发现突变。TILLING将化学诱变与对混合的PCR产物的突变筛选相结合，导致对靶基因的错义和无义突变等位基因的分离。因此，TILLING使用常规的化学诱变(例如EMS或MNU诱变)或其他诱变方法(例如辐射，如UV)，随后高通量筛选特定靶基因(例如本发明Acs4)中的突变。使用S1核酸酶(例如CEL1或ENDO1)切割突变体和野生型靶DNA的异源双链体并使用例如电泳(如LI-COR凝胶分析仪系统)检测切割产物，参见例如Henikoff et al.Plant Physiology2004,135:630-636。TILLING已经应用于很多植物物种，例如番茄(参见
http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling)、稻(Till etal.2007,BMC Plant Biol 7:19)、拟南芥(Till et al.2006,Methods Mol Biol 323:127-35)、芸苔、玉米(Till et al.2004,BMC Plant Biol 4:12)等。
EcoTILLING也被广泛使用，由此检测天然群中的突变体，参见Till et al.2006(Nat Protoc 1:2465-77)和Comai et al.2004(Plant J 37:778-86)。
在本发明的一个实施方案中，编码所述突变acs4蛋白的(cDNA或基因组)核酸序列包含一个或多个无义和/或错义突变，例如转换(将嘌呤置换为另一嘌呤()或将嘧啶置换为另一嘧啶())或颠换(将嘌呤置换为嘧啶，或反之亦然())。在一个实施方案中，所述一个或多个无义和/或错义突变位于编码任意Acs4外显子的核苷酸序列中，更优选位于ACS4大结构域或Acs4蛋白变体的基本相似的结构域中，即位于和SEQID NO:1或其变体的第65-327位氨基酸具有至少80％、90％、95％、98％、99％的氨基酸同一性的结构域中。
在一个实施方案中，提供了在一个外显子-编码序列上含有一个或多个无义和/或错义突变的acs4核苷酸序列，以及含有这种导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期的突变等位基因的植物。
在本发明的一个具体的实施方案中，提供了含有功能丧失或功能降低的突变acs4等位基因的番茄植物和植物部分(果实、种子等)。
在一个实施方案中，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白是截短的蛋白，即上文进一步定义的任一种Acs4蛋白(包括其变体)的蛋白片段。通常，EMS(甲基磺酸乙酯)诱导鸟嘌呤/胞嘧啶到腺嘌呤/胸腺嘧啶的置换。在谷氨酰胺(Gln或Q，由核苷酸CAA或CAG编码)或精氨酸(Arg或R，由核苷酸CGA编码)密码子的情况下，将胞嘧啶置换为胸腺嘧啶可导致在阅读框中引入终止密码子(例如CAA/CAG/CGA变为TAA/TAG/TGA)，从而产生截短的蛋白。
还提供了编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的核酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA),例如所述acs4蛋白是SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7中描述的acs4；或上文所定义的其变体(包括任何嵌合或杂合蛋白或突变蛋白或截短蛋白)。由于遗传密码的简并性，不同的核酸序列可编码相同的氨基酸序列。所提供的核酸序列包括天然存在的、人工或合成的核酸序列。在Genbank登录号为M63490.1的SEQ ID NO:8(野生型cDNA)中提供了编码Acs4的核酸序列。
应当理解，当序列以DNA序列描述并同时提及RNA时，所述RNA分子的实际碱基序列是相同的，差异在于胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替换。当本文中提到核苷酸序列(例如DNA或RNA)时，使用斜体，例如acs4等位基因，而当提到蛋白时不使用斜体，例如acs4蛋白。突变体用小写字母(例如acs4等位基因或acs4蛋白)，而野生型/功能性的形式以大写字母开头(Acs4等位基因或Acs4蛋白)。
还提供了编码突变acs4蛋白(即如上文所述的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白)的核酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA),以及含有所述突变序列的植物和植物部分。例如，在野生型Acs4编码序列上含有一个或多个无义和/或错义突变的acs4核酸序列，使得所编码的蛋白质在体内功能丧失或功能降低。还提供了具有其他突变的序列，例如剪接位点突变体(即导致前mRNA异常剪接的基因组acs4序列上的突变)、和/或移码突变、和/或一个或多个核酸的插入(例如转座子插入)和/或缺失。
显然，可以使用很多方法(例如核酸杂交、PCR技术、计算机分析和核酸合成等)来鉴定、合成或分离acs4核酸序列的变体或片段。SEQ ID NO:8的变体既可以编码野生型、功能性Acs4蛋白，也可以编码所述蛋白的任一种的acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变等位基因(例如通过例如诱变产生的和/或通过例如TILLING或EcoTILLING的方法或其他方法鉴定的)。
可将本发明的植物用于传统的植物育种方案中以产生更多的具有相同特征的植物，或者用于将所述突变acs4等位基因引入到相同或相近植物物种的其他植物株系或品种中。
还可以通过本领域中已知的植物转化和再生技术使用本发明的突变acs4核苷酸序列来产生转基因植物。可以选择“良种事件(elite event)”，其为将所述嵌合基因(包含与编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子)插入到基因组中的特定位点并且所述插入导致所需表型的良好表达的转化事件。
如上文所述的本发明植物是突变acs4等位基因纯合型或杂合型的。为产生含有纯合形式的突变等位基因的植物，可以使用自交。可以通过传统的育种技术(例如杂交、自交、回交等)将本发明的突变acs4等位基因转移到任何其他番茄植物中。因此，可以产生任何类型的由于存在至少一个本发明的突变acs4等位基因而具有延迟的成熟和/或更长的贮藏期的番茄。可以产生和/或鉴定在其基因组中含有至少一个突变acs4等位基因并产生与野生型Acs4蛋白相比具有acs4蛋白功能丧失或活性降低的acs4蛋白的任何番茄。因此，所述番茄植物可以是任何栽培的番茄、任何商业品种、任何育种系或其它，其可以是确定或不确定的、自由授粉或杂交的，可以产生具有任何颜色、形状和大小的果实。可以通过育种(与含有突变等位基因的植物杂交然后选择含有所述突变等位基因的子代)容易地将在具体的番茄植株中或在番茄的性相容近缘种中产生和/或鉴定的突变等位基因转移到任何其他的番茄植物中。
任何番茄植物或植物部分中的本发明的突变acs4等位基因的存在或不存在和/或所述等位基因到后代植物的遗传，都可以从表型上和/或使用分子工具来确定(例如使用直接或间接的方法检测acs4核苷酸或acs4蛋白的存在或不存在)。
在一个实施方案中，在栽培植物中产生或鉴定所述突变等位基因，但是也可以在野生植物或非栽培植物中产生和/或鉴定所述突变等位基因，然后使用例如杂交和选择(任选地使用种间杂交与例如胚胎拯救来转移所述突变等位基因)将其转移到栽培植物中。因此，可以在番茄或其他茄属种中产生(使用诱变技术诱变所述靶acs4基因或其变体的人工诱导突变)和/或鉴定(自发的或天然的等位基因变异)突变Acs4等位基因，然后通过传统育种技术将其转移到栽培的茄属植物例如番茄中，所述茄属种包括例如番茄的野生近缘种，如契斯曼尼番茄、智利番茄、多毛番茄((S.habrochaites,L.hirsutum))、克梅留斯基番茄、S.lycopersicum x S.peruvianum、多腺番茄(S.glandulosum)、多毛番茄(S.hirsutum)、小花番茄(S.minutum)、小花番茄(S.parviflorum)、潘那利番茄、秘鲁番茄、S.peruvianumvar.humifusum和细叶番茄。术语“传统育种技术”在本文中包括育种者已知的杂交、自交、选择、双单倍体产生、胚胎拯救、原生质体融合、通过中间物种的转移等，即除了遗传修饰之外的可转移等位基因的方法。
在另一个实施方案中，将含有突变acs4等位基因的植物(例如番茄)与相同种或相近种的另一植物杂交，以产生含有所述突变acs4等位基因的杂交植物(杂交种子)。所述杂交植物也是本发明的一个实施方案。
在一个实施方案中，提供了F1代杂交番茄种子(即,可以用于生长出F1代杂交番茄植物的种子)，其含有至少一个本发明的acs4等位基因。F1代杂交种子是从两个近交番茄亲本植株之间的杂交中收获的种子。所述F1代杂种可以包含一个或两个本发明的突变acs4等位基因。因此，在一个实施方案中，将本发明的植物用作亲本植物以产生F1代杂种，所述F1代杂种的果实与野生型Acs4/Acs4植物相比具有降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期。
还提供了将突变acs4等位基因转移到另一植物的方法，所述方法包括提供在其基因组中含有突变acs4等位基因的植物，由此所述突变等位基因产生与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比表现出降低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期的果实(如上文所述)，将所述植物与另一植物杂交并获得所述杂交的种子。任选地，可以将从这些种子获得的植物进一步自交和/或杂交，并选择这样的后代，即其含有所述突变等位基因且由于所述突变等位基因的存在而产生与含有野生型Acs4等位基因的植物相比具有延迟的成熟和/或更长的贮藏期和/或降低的乙烯产生的果实。
如所述，应当理解，其他诱变和/或选择方法可以等同的用于产生本发明的突变植物。例如可以对种子进行辐射或化学处理以产生突变群体。也可使用acs4的直接基因测序来筛选诱变的植物群中的突变等位基因。例如，KeyPoint筛选是可以用于鉴定含有突变acs4等位基因的植物的基于测序的方法(Rigola et al.PloS One,March 2009,Vol4(3):e4761)。
因此，提供了非转基因的突变番茄植物，所述番茄植物在果实中产生更低水平的野生型Acs4蛋白、或在果实中完全缺失野生型Acs4蛋白，并且由于一个或多个内源性acs4等位基因中的一个或多个突变而在果实中产生功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白。可以通过诱变方法例如TILLING或其变型来产生这些突变体，或可以通过EcoTILLING或通过任何其他方法来鉴定所述突变体。可以将编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的Acs4等位基因分离并测序，或可以通过传统育种方法将其转移到其他植物中。
提供了基因组中含有本发明的突变acs4等位基因的所述植物或其后代的任意部分，包括收获的果实、收获的组织或器官、种子、花粉、花、子房等。还提供了在其基因组中含有突变acs4等位基因的植物细胞培养物或植物组织培养物。优选地，所述植物细胞培养物或植物组织培养物可再生为在其基因组中含有突变acs4等位基因的完整植株。本文还包括通过对含有acs4突变等位基因的单倍体细胞进行染色体加倍而产生的双单倍体植物(以及可以用于生长出所述双单倍体植物的种子)，和其基因组中含有突变acs4等位基因的杂交植物(以及可以用于生长出所述杂交植物的种子)，籍此所述双单倍体植物和杂交植物产生本发明的成熟延迟和/或贮藏期更长的果实。
优选地，所述突变植物还具有良好的其他农艺学特征，即与野生型植物相比，它们的果实数目不减少和/或果实质量不降低。在一个优选的实施方案中，所述植物是番茄植物，所述果实是番茄果实，例如具有任何形状、大小或颜色的加工的番茄、生鲜市场番茄。因此，还提供了含有一个或两个突变acs4等位基因的植物或植物部分的收获产品。所述产品包括下游的经加工产品，例如番茄糊、番茄酱、番茄汁、切开的番茄果实、灌装果实、干燥的果实、去皮的果实等。可以通过其基因组DNA中含有所述突变等位基因来鉴定所述产品。
种子保藏
实施例1的五种番茄TILLING突变体的代表性种子样本由Nunhems B.V.保藏并根据布达佩斯条约按照Expert Solution(EPC 2000,Rule 32(1))于2012年8月21日被接受保藏在NCIMB Ltd(英国苏格兰阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn Aberdeen,Scotland AB21 9YA,UK))。种子被给予以下保藏号:NCIMB 42034(突变体2477)、NCIMB 42037(突变体4043)、NCIMB 42038(突变体4222)、NCIMB 42039(突变体4691)、NCIMB 42041(突变体5251)。
申请人要求，依据Rule 32(1)EPC或具有类似条款和规章的国家或条约的相关法规，所述生物材料及其衍生的任何材料的样本只向指定的专业人员提供，直至专利授权公告或者提交之日起20年(如果所述申请被驳回、撤回或视为撤回)。
在本申请未决期间，由美国专利局主任确定的有资格的人员可请求并获得所述保藏。受37C.F.R.§1.808(b)的制约，在专利授权时，保藏者针对所保藏材料的公众可得性提出的所有限制都会被永久取消。所述保藏在最近一次请求之后会被维持30年或5年的时间，或被维持到专利的有效寿命期，以较长时间为准，在此期间如果所述保藏一旦不能存活，都要将其替换。申请人不会放弃任何本申请的专利或植物品种保护法(7USC 2321 et seq.)授予的任何权利。
实施例
一般方法
通过服务公司(BaseClear,The Netherlands,http://www.baseclear.com/)使用与用于扩增的引物相同的引物对PCR扩增产物直接测序。使用计算机程序(CLC Bio MainWork Bench,Denmark,www.clcbio.com)对所得到的序列进行比对以鉴定核苷酸的改变。
材料
用于分析和诱变的水是在Milli-Q水整合系统——配有Q-gard T2筒和QuantumTEX筒的Milli-Q型Reference A+——中过滤的自来水。水的电阻为>＝18MOhm。
甲基磺酸乙酯(EMS)(纯)获得自Sigma，产品编号为M0880。
番茄成熟和/或贮藏时间或周期的测量
可通过本领域已知的多种方法测定番茄成熟和/或贮藏时间或周期，所述方法例如定期对果实进行视觉上的评估和/或测量果实硬度或软化度、测量番茄果实中番茄红素的含量、果实的乙烯产生、果实的颜色或任何替代方法，或者方法的组合。针可以例如通过对使用装配有适当探针(例如3mm的探针)的果实硬度计测量的单位为例如0.1mm的变形阻力进行评估，来测量果实的硬度(Mutschler et al,1992,Horscience 27pp 352-355)(MaAcs4ez et al 1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)。本领域中存在替代的方法，例如使用食品质地测定计(Bui et al.2010；International Journal of FoodProperties,第13卷,第4版)。
可通过新鲜番茄等级的美国标准(U.S.Dept of Agriculture,1973,USstandards for grades of fresh tomatoes,U.S.Dept Agr.Agr.Mktg.Serv.,WashingtonD.C.)用比色计测量颜色(Mutschler et al,1992,Horscience 27pp 352-355)，或通过将所述颜色与比色图表如英国皇家园艺学会(RHS)比色图表进行比较(www.rhs.org.uk)来对果实颜色进行分类。
可根据Fish et al.A quantitative assay for lycopene that utilizesreduced volumes of organic solvents.J.Food Compos.Anal.2002,15,309-317的有机溶剂的体积降低的方法来确定番茄红素含量。可以将该方法用于测定在完整的番茄果实上直接测量的番茄红素的含量，并同时评估以下基本理化特征：颜色、硬度、可溶性固体、酸度和pH(Clement et al,J.Agric.Food Chem.2008,56,9813-9818)。
可以通过将果实放置在密闭空间中(例如在0.5L的玻璃容器(glass holder)中)来测量乙烯释放。可在1小时后提取1ml容器气体并可使用配有合适的检测单元(例如火焰离子化检测器)和合适的柱子(例如内径为3.5mm并含有80/100目的活性氧化铝的3m不锈钢柱)的气相色谱仪(例如Hewlett-Packard 5890)对产生的乙烯气体量进行定量。乙烯产生可以表示为每小时每克果实放出的乙烯的纳升(nl)数(nl g-1h-1)(MaAcs4ez et al1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)。
或者，如下文进一步所述，可使用基于激光的乙烯检测器(ETD-300,Sensor SenseB.V.,Nijmegen,the Netherlands)结合气体处理系统(Cristecu et al.,2008)进行的实时测量来测量乙烯产生。
实施例1
诱变
将商业化加工番茄育种中使用的高度纯合的近交株系用于使用下述的方案的诱变处理。种子在湿润的纸上萌发24h后，将被分为各2500粒的8批次的约20,000粒种子浸泡在锥形烧瓶中的100ml超纯水和1％浓度的甲基磺酸乙酯(EMS)中。将烧瓶在室温下轻轻振荡16小时。最后，在流水下将EMS冲洗掉。在EMS处理后，将种子直接播种于温室中。在60％的萌发种子中，将其中的10600株小植株(plantlet)移植到田里。在这10600株小植株中，有1790株不育或在产生果实之前死亡。对于每个其余的M1突变植物，收获一个果实并分离其种子。所得到的群体(命名为M2群体)由各代表一个M2家族的8810个种子批组成。其中有585个家族由于种子形成率较低(low seed set)而将其从所述群中排除。
从源自每个M2种子批的10粒种子的混合物中提取DNA。对于每个突变株系，将10粒种子在96孔深孔板的深孔管(http://www.micronic.com)中混合，在每个管中加入2个不锈钢球。将所述管和种子在液氮中冷冻1分钟并立即将种子在深孔振荡器(Vaskon 96grinder,Belgium；http://www.vaskon.com)中在16.8Hz(最大速度的80％)下持续2分钟以研磨至成细粉。将300μL来自Plant DNA Isolation Kit(http://www.agowa.de)的裂解缓冲液P加入到样品板中，并通过在深孔振荡器中在16.8Hz下振荡1分钟将所述粉末悬浮于溶液中。将板以4000rmp离心10分钟。使用Janus(Perkin Elmer,USA；http://www.perkinelmer.com)平台(96个分液头)将75μL上清液移液至96孔Kingfisher板上。使用Perkin Elmer液体处理装置(liquidhandler robot)和96(Thermo labsystems,Finland；http://www.thermo.com)进行下述步骤。用结合缓冲液(150μL)和磁珠(20μL)稀释含有DNA的上清液。一旦DNA结合到所述磁珠上，进行两步连续的洗涤步骤(洗涤缓冲液1：1/3的Agowa洗脱缓冲液1、1/3的乙醇、1/3的异丙醇；洗涤缓冲液2：70％乙醇、30％Agowa洗涤缓冲液2)并最后将其在洗脱缓冲液(100μL MQ、0.025μL Tween)中洗脱。
研磨的10粒番茄种子产生了足以使所述磁珠饱和的DNA，因此，获得了全部样品的高度均匀且相当的DNA浓度。和λDNA参照比较，估计各样品浓度为30ng/μl。将2倍稀释的DNA进行4倍平板混合(4fold flat pooled)。将2μl混合的DNA用于多重PCR以进行突变检测分析。
使用计算机程序(Primer3,http://primer3.sourceforge.net/)设计用于扩增HRM的基因片段的引物。扩增产物的长度被限制在200和400个碱基对之间。通过应当产生单一产物的测试PCR反应来测定所述引物的质量。
聚合酶链式反应(PCR)扩增基因片段。将10ng基因组DNA与4μL反应缓冲液(5×反应缓冲液)、2μL 10xLC染料(LCGreen+染料,Idaho Technology Inc.,UT,USA)、各5pmole的正向和反向引物、4nmole dNTPs(Life Technologies,NY,USA)和1单位DNA聚合酶(HotStart II DNA聚合酶)混合，总体积为10μL。反应条件为：98℃30秒，接着40个循环的98℃10秒、60℃15秒、72℃25秒，最后72℃60秒。
已经证明，高分辨熔解曲线分析(HRM)在人类和植物遗传学中是灵敏且高通量的方法。HRM是一种非酶学筛选技术。在PCR扩增过程中，染料(LCGreen+染料,IdahoTechnology Inc.,UT,USA)分子插入到双链DNA分子的每对退火的碱基对之间。在所述分子中被捕获时，所述染料在470nm处激发后在510nm处发射荧光。当DNA样品被逐渐加热时，荧光检测器(LightScanner,Idaho Technology Inc.,UT,USA)中的照相机记录荧光强度。在取决于DNA螺旋的序列特异性的稳定性的温度下，双链PCR产物开始熔解，释放出所述染料。染料的释放导致被荧光检测器记录为熔解曲线的荧光降低。含有突变的混合物在PCR后的片段混合物中形成异质双链体。与同质双链体相比，这些被鉴定为差异熔解温度曲线。
选择表现出成熟延迟的突变体并确定其acs4基因中的突变类型。
通过重复对来自所鉴定的相应DNA混合物的单个M2种子批的DNA进行HRM分析来确认单个植物中具体突变的存在情况。当基于HRM图谱在所述4个单个M2家族的DNA样品的一个中确认了所述突变的存在时，则对PCR片段进行测序以鉴定基因中的突变。
一旦知道了突变，则使用计算机程序CODDLe(用于选择密码子以优化有害损伤的发现http://www.proweb.org/coddle/)来预测这个突变的作用，所述程序鉴定了用户所选择的基因和其编码序列的区域，在该区域中所期望的点突变最有可能对基因功能产生有害效应。
播种来自含有对蛋白质活性有预期作用的突变的M2家族的种子，用于所述植物的表型分析。
在自交和随后的选择后选择或获得纯合型的突变体。确定所述突变对所述植物的相应蛋白质和表型的效应。
使含有所述不同的鉴定的突变的种子萌发，并将植物在温室中种植在带有土壤的花盆(pot)中，所述温室的光暗方案(regime)是16/8，夜间温度18℃，日间温度22-25℃。对于每种基因型，种植了5株植物。将第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每个花序上留下6朵花，使所述6朵花能够通过自花授粉结出果实。记录第一和第六朵花的果实形成的日期以及所述第一和第六颗果实的破色期和红熟期的日期。在第六颗果实的破色期，收获番茄串(truss)并将其储存于温室中的开口盒子里。在整个成熟阶段记录所述果实的果实状况。
在后期，基于对果实的视觉评估来确定果实状况，并记录最老的果实变“坏”的日期，并进一步记录果实变质情况(由通过夹紧果实所评估的进一步果实软化度，以及对脱水/失水、果皮破损和真菌生长的视觉评估所指示)。
鉴定了下述突变体：突变体2477、突变体4043、突变体4222、突变体4691和突变体5251，并将种子以上文给出的登录号保藏在NCIMB。
在SEQ ID NO 8中示出了野生型Acs4的cDNA，其对应SEQ ID NO1中描述的蛋白序列。
突变体2477(NCIMB 42034)
在突变体2477中，如SEQ ID NO:9所示，第836位核苷酸从G变为A，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第279位氨基酸从丝氨酸变为天冬酰胺。该S279N突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO:2描述了突变体2477的蛋白序列。
突变体4043(NCIMB 42037)
在突变体4043中，如SEQ ID NO:10所示，第743位核苷酸从C变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第248位氨基酸从丙氨酸变为缬氨酸。该A248V突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO:3描述了突变体4043的蛋白序列。
突变体4222(NCIMB 42038)
在突变体4222中，如SEQ ID NO:11所示，第610位核苷酸从A变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该A610T突变导致赖氨酸的密码子(AAA)变为终止密码子(TAA)，以致在翻译过程中形成具有203个氨基酸残基的截短的蛋白，而所述天然蛋白具有476个氨基酸残基。所表达的蛋白质中氨基酸248从丙氨酸变为缬氨酸。SEQ ID NO:4描述了突变体4222的截短的蛋白序列。
突变体4303
在突变体4303中，如SEQ ID NO:12所示，第963位核苷酸从G变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第321位氨基酸从亮氨酸变为苯丙氨酸。该L321F突变位于ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID NO:5描述了突变体4303的蛋白序列。
突变体4691(NCIMB 42039)
在突变体4691中，如SEQ ID NO:13所示，第749位核苷酸从T变为A，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第250位氨基酸从缬氨酸变为谷氨酸。该V250E突变位于ACS4蛋白质的大结构域中。SEQ ID NO:6描述了突变体4691的蛋白序列。
突变体5251(NCIMB 42041)
在突变体5251中，如SEQ ID NO:14所示，第947位核苷酸从C变为T，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第316位氨基酸从苏氨酸变为异亮氨酸。该T316I突变位于ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID NO:7描述了突变体5251的蛋白序列。
在所述靶序列中含有突变的植物(例如上文的突变植物或由其得到(例如通过自交或杂交)并含有突变acs4等位基因的植物)与野生型植物相比，除番茄果实的成熟外，所有植物部分都表现为正常的营养生长。对在所述靶序列中含有突变的植物的果实成熟、乙烯产生和贮藏期进行表型上的筛选。
实施例2
所述acs4突变体的成熟行为
使含有所述不同突变的种子萌发，并将植物在温室中种植在带有土壤的花盆中，所述温室的光暗方案是16/8，夜间温度18℃，日间温度22-25℃。对于每种基因型，种植了5株植物。将第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每个花序上留下6朵花，使所述6朵花能够通过自花授粉结出果实。记录第一和第六朵花的果实形成的日期，以及第一和第六颗果实的破色期和红熟期的日期。在第四颗果实的红熟期，收获番茄串(truss)并将其储存于温室中的开口盒子里。在整个成熟阶段通过从每个番茄串拍摄照片来记录所述果实的果实状况。收获后，对含有来自一种基因型的所有番茄串的每个盒子拍摄照片。
在后期，基于对果实的视觉评估来确定果实状况，并记录最老的果实变“坏”的日期，并进一步记录果实变质情况(由通过夹紧果实所评估的进一步果实软化度，以及对脱水/失水、果皮破损和真菌生长的视觉评估所指示。)
图3示出了果实的成熟行为。将野生型植物的第一果实进入破色期的那天记为第一天。对此后的天数以连续的天数进行编号。突变体表现出成熟延迟，即所述突变体的果实需要更多天来变红。特别是，突变体2477和突变体4222表现出数天的显著延迟。突变体4222表现出从第一颗果实处于破色期至100％的果实处于红熟期花费了更多的时间。
本发明植物的果实的特征在于破色期开始较晚(例如突变体2477、4222、4691、5251)。下文示出了收获后的特征。
可以看出，突变果实更晚进入破色期(除了突变体4043之外)并且所有果实都处于破色期的日期也更晚。同样的，突变果实更晚进入红熟期并且突变株系的所有果实都处于红熟期的日期也明显晚于野生型。
实施例3
乙烯释放
用基于激光的乙烯检测器(ETD-300,Sensor Sense B.V.,Nijmegen,theNetherlands)结合气体处理系统(Cristecu et al.,Laser-based systems for tracegas detection in life sciences.Appl Phys B 2008；92pp343-349)来实时测量番茄果实释放的乙烯。每次实验使用6个玻璃比色皿(100mL体积)，其中一个作为没有植物材料的参照。对实验室空气取样并使所述空气通过基于铂的催化剂(Sensor Sense B.V.,Nijmegen,the Netherlands)以去除微量乙烯或其他碳氢化合物。在样品和检测器之间放置带有KOH和CaCl2的涤气器，以分别降低CO2浓度(至低于1ppm)和减少气流中的含水量。
比较突变体2477、4043、4222和5251与野生型(商业品种tapa)的果实在粉红期和红熟期所释放的乙烯，显示了在这两个时期，所有突变体的乙烯产生都比野生型(商业品种tapa)低。突变体4303在粉红期产生的乙烯比野生型少28％，突变体2477、4043和4222产生的乙烯比野生型少50-60％。突变体5251在粉红期产生的乙烯比野生型少80％以上：突变体为<1.0nl/(h·g)而野生型为4.8nl/(h·g)。在红熟期的差异甚至更明显：突变体4303在红熟期产生的乙烯比野生型少42％，突变体2477、4043和4222产生的乙烯比野生型少48-74％。突变体5251在红熟期产生的乙烯比野生型少82％以上。其中nl/(h·g)指每克果实每小时纳升。

Claims (8)

1.一种番茄(Solanum lycopersicum)种的栽培植物的不可再生的植物细胞，其包含具有一个或多个突变的acs4等位基因，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中所述一个或多个突变导致与野生型ACS4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期，
其中所述突变acs4蛋白具有一个或多个选自以下的改变的氨基酸：A248V、S279N、L321F、V250E和T316I；或其中在所述突变acs4蛋白中丢失了SEQ ID NO:1的全部第204位至第476位氨基酸。
2.权利要求1的不可再生的植物细胞，其中所述一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，所述番茄的果实需要明显更多天以达到红熟期。
3.权利要求1或2任一项的不可再生的植物细胞，其中所述一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，所述植物的番茄果实的乙烯产生降低至少20％。
4.权利要求1至3任一项的不可再生的植物细胞，其中所述植物是F1代杂交植物。
5.权利要求1的不可再生的植物细胞，其中所述番茄种的栽培植物由以登录号NCIMB42034、NCIMB 42037、NCIMB 42038、NCIMB 42039或NCIMB 42041保藏的种子生长出。
6.一种用于产生杂交番茄植物的方法，所述方法包括：
(a)获得包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的第一番茄植物，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白；和
(b)将所述第一番茄植物与第二番茄植物杂交以获得杂交种子；
其中由所述杂交种子生长出的所述杂交番茄植物包含具有一个或多个突变的acs4等位基因，其中所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中所述一个或多个突变导致与野生型ACS4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期，并且其中所述突变acs4蛋白具有一个或多个选自以下的改变的氨基酸：A248V、S279N、L321F、V250E、S253P和T316I；或其中在所述突变acs4蛋白中丢失了SEQ ID NO:1的全部第204位至第476位氨基酸。
7.一种内源性acs4等位基因，其存在于以登录号NCIMB 42034、NCIMB 42037、NCIMB42038、NCIMB 42039或NCIMB 42041保藏的种子中。
8.一种由其编码的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白，所述蛋白与SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:6或与SEQ IDNO:7具有100％序列同一性。
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