JP2017522053A - 淡紅色で光沢のある果実を有するトマト植物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み(このような植物の果実は淡紅色の外見を示す)、且つ、変異型クチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子をさらに含む(これにより果実が光沢のあるものとなる)、トマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物に関する。
Description
本発明は植物バイオテクノロジーおよび植物育種の分野に関する。一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子(myeloblastosis allele number 12)を含み、さらに、CDタンパク質をコードする対立遺伝子(クチン欠乏性(Cutin Deficient)またはクチン欠乏(Cutin Deficiency)タンパク質)等のクチクラ発達に関与する対立遺伝子に変異を含み、前記変異が、野生型と比較して(有意に)増加した果実の光沢および/または赤熟(RR)期における(有意に)増加もしくは減少したクチンの蓄積をもたらす、淡紅色で光沢のある果実(すなわち、外見が淡紅色で光沢のある果実)を生産する栽培トマト(Solanum lycopersicum)植物が提供される。一つの態様において、赤熟(RR)期における増加もしくは減少したクチンの蓄積は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子(例えば、CDタンパク質をコードするCD遺伝子における対立遺伝子)における変異を欠く植物と比較して、少なくとも15%の増加または減少(すなわち、それぞれ、少なくとも15%より厚い、または少なくとも15%より薄いクチン層厚)である。一つの態様において、栽培トマト植物は、ホモ接合型のmyb12対立遺伝子(淡紅色(pink)対立遺伝子とも称される)を含み、さらに、ホモ接合型またはヘテロ接合型のcd対立遺伝子(光沢性(glossy)対立遺伝子またはクチン欠失(cutin deficiency)対立遺伝子とも称される)、特に、cd2/cd2(ホモ接合型)またはCD2/cd2(ヘテロ接合型)を含み、これにより、前記植物の赤熟した果実は、無色の果皮を有して、光沢のある外見に加えて淡紅色の外見を有する。光沢性(glossy)変異型cd2のヘテロ接合型は、前記変異を欠く植物(野生型CD2/CD2についてホモ接合性)と比較して、増加した光沢を示した。
本発明はさらに、配列番号1に、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型に、G50Rアミノ酸置換を有する;もしくは、配列番号1に、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型に、アミノ酸61〜338の欠失を含む、変異型myb12タンパク質の生産をもたらす、一つもしくは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含む、または、y(黄色)遺伝子を含む、本発明の植物を提供する。さらに、変異型myb12タンパク質を含む前記植物は、好ましくは、変異型CDタンパク質をコードする対立遺伝子、例えば、CD1、CD2またはCD3タンパク質の変異対立遺伝子、も含む。一つの態様において、変異型CDタンパク質は、野生型CD2タンパク質(配列番号2)に対してG736Vアミノ酸置換を含む配列番号11のタンパク質;および/または、配列番号10に示されるような野生型CD2タンパク質に対してD737Nおよび/またはQ708Hアミノ酸置換を含む配列番号15の変異型CD2タンパク質である。従って、一つの態様において、トマト植物は、淡紅色で光沢があり、細胞が、myb12/myb12(変異型淡紅色(pink)対立遺伝子)またはy/y(黄色(yellow)対立遺伝子)についてホモ接合性であり、且つ、cd1、cd2およびcd3から選択される変異型cd対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性(変異型光沢性(glossy)対立遺伝子、例えば、CD2/cd2またはcd2/cd2;CD1/cd1またはcd1/cd1;CD3/cd3またはcd3/cd3)である、果実を生産する。本発明はまた、本発明の植物に成長することができる、および/または、淡紅色で光沢のある果実を生産する他のトマト植物を作製するために、本発明の変異型myb12遺伝子および/または変異型cd2遺伝子を入手し、従来の育種によりあらゆる他のトマト植物に導入することができる、トマト種子を提供する。本発明の植物の果実を含む、または本発明の植物の果実から成る食物および食品も提供される。または、あらゆる他のトマト植物、種子、組織、細胞、食物または飼料から、本発明の植物、種子、植物組織および細胞、並びに/またはそれらを原料とする食物および/もしくは飼料品を生産する方法も本明細書に包含され、これにより、変異型myb12および/もしくはcd2の遺伝子、mRNA(cDNA)並びに/またはタンパク質の存在が検出可能である。
トマト果実の果皮色はY遺伝子によって決定される。遺伝子Yは果実の表皮の細胞壁中に満たされた明確な黄色色素を産生し、一方、その対立形質であるy遺伝子は、表皮壁に透明または無色の状態を生み出す(E.W. Lindstrom, 1925, Inheritance in Tomatoes, Genetics, issue 10(4) pp 305-317)。
淡紅色のトマト果実はアジアにおいて非常に好まれて消費されている。淡紅色の果実は、黄色色素を欠いた透明な表皮を有する果実において最初に記述された(Lindstrom, 1925, Inheritance in Tomatoes, Genetics, issue 10 (4) pp 305-317)。遺伝的研究によって、淡紅色果実が染色体1上に存在する一遺伝子的な劣性y(黄色)遺伝子座からもたらされ、一方、赤色果実が優性Y対立遺伝子を有するということが明らかにされた(Lindstrom 1925)。Y遺伝子はMYB12と同定されている(Ballester et al、下記参照)。y遺伝子を含む多くのトマトの目録が利用可能であり、例えば、tgrc.ucdavis.edu/data/acc/GenDetail.aspx?gene=yにおけるワールドワイドウェブを参照されたい。
トマト果実の色は主にカロテノイド類およびフラボノイド類によって決定される。熟したトマト果実の赤色は、主に、果実の熟成中に産生されるカロテノイドall−trans−リコピンの蓄積によるものである。リコピンに加え、トマト果実はかなりのレベルのビオラキサンチン、およびルテインを含有する。カロテノイド経路に変異を有するトマト植物は、変化したカロテノイド組成を有し、これが、オレンジ色(タンジェリンベータ(tangerine beta))または黄色(r)の果実等の異なる果実色をもたらす(Lewinsohn et al. 2005 Trends Food Sci Technol., Vol 16 pp 407-415)。
さらに、フラボノイド類はトマト果実の色の決定に関与する。フラボノイド経路は果肉においては活性ではないため、フラボノイド類は主に果皮に蓄積する。トマト果皮において最も豊富なフラボノイド類の1つは黄色のナリンゲニンカルコンである。さらに、70種に達する様々なフラボノイド類がトマト果実において同定されている。
Ballester et al.により、トマト(Solanum lycopersicum)の「Moneyberg」と野生種ソラヌム・クミエレウスキイ(Solanum chmielewskii)との間の交雑種に由来する遺伝子移入系統(IL)集団の表現型分析が行われ、淡紅色の果実色を有する3つのILが明らかにされた。これらのILは、無色表皮をもたらす、故に赤色の果肉と組み合わされた場合に淡紅色果実をもたらすことが知られているy(黄色)変異の位置と一致する、染色体1の短腕上に、ホモ接合性のソラヌム・クミエレウスキイ(S. chmielewskii)遺伝子移入を有していた。淡紅色の果実が、成熟後のMoneyberg果実の果皮では増加していた、果皮中の黄色フラボノイドナリンゲニンカルコンの成熟依存的な蓄積を欠いており、一方で、カロテノイドレベルは影響を受けていなかったことが、これと同じ研究によって明らかにされた(Ballester et al. 2010 Plant Physiology, vol 152 pp 71-84)。同じ研究において、Ballester et al.(Ballester et al. 2010 Plant Physiology, vol 152 pp 77、右側のコラム)は、「商業的供給源から得られた淡紅色MYB12対立遺伝子の推定アミノ酸配列は赤色Moneyberg対立遺伝子と同一であった」と開示しており、「異常なMYB12[タンパク質]機能ではなく、[Ballester et al.によって]試験された全ての淡紅色(pink)遺伝子型において観察された、調節解除されたMYB12遺伝子発現が、淡紅色の表現型の主要な原因であることを示唆している。この淡紅色の原因は、遺伝子サイレンシング研究 遺伝子マッピング、分離比分析、およびVIGS(ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング)の結果を用いて確認された。
これまで、既存の市販の非GMO無色果皮(すなわち淡紅色)y変異体の解析では、myb12対立遺伝子における変異も、そのプロモーター配列における変異も明らかにされなかったが、このことは、y変異体表現型が調節遺伝子における変異、すなわち、さらなる変異対立遺伝子によるものであることを示している(Adato et al 2009 PLoS Genetics, vol 5, issue 12, e1000777)。
PCT/EP2014/051582において、野生型トマト(Solanum lycopersicum)myb12タンパク質配列と比較した場合にG50Rアミノ酸置換を有する、または、配列番号1におけるアミノ酸61〜338の欠失を含む、変異型myb12タンパク質を有する、2つの非GMO栽培淡紅色トマト(Solanum lycopersicum)植物が開示された。これらの非GMO栽培トマト植物の(無色の果皮による)淡紅色の果実は、一遺伝子劣性y(黄色)座位についてホモ接合性である植物から得られる淡紅色の果実と同様に、野生型(すなわち赤色)栽培トマト植物と比較した場合に、外見の色が鈍い。これにより、これらの果実は光沢性が低く見える。結果として、淡紅色の非GMO栽培トマト果実は、光沢がある野生型栽培トマト植物の果実と比較して、魅力のない外見を有することとなる。
植物クチクラは、クチンから成り、表面上にも蓄積する蝋で満たされた、保護層である。植物クチクラは植物の表皮細胞壁により合成される。植物クチクラは、気中植物器官からの水損失の制限、病原体、裂開、および収穫後の貯蔵期間の制御において重要な役割を果たす。トマト果実の輝度(光沢とも称される)もトマト果実のクチクラによって制御され、蝋の積載量とは無関係と思われる。しかし、これまで、クチンの積載量および/または組成と果実輝度との間の明らかな関連付けは為されていない。変質したクチン層を有する果実を有するトマト植物は、色が鈍いかまたは光沢があるように見え得る。多くの遺伝子がクチン発達に関与していると思われる。これらの遺伝子は異なる染色体に位置する場合があり、異なる遺伝様式を有する場合すらある(Petit et al Plant Physiology, 2014, Vol 164, pp 888-906; Isaacson et al The Plant Journal, 2009, Vol 60, pp 363-377)。
従って、淡紅色トマト果実を生産する通常の非GMO栽培トマト植物の果実よりも、より光沢がある(more glossy)(すなわち、より光沢がある(glossier))淡紅色トマト果実を生産する非GMO栽培トマト植物が必要とされている。
驚くべきことに、調節解除されたMYB12遺伝子発現ではなく、異常なMYB12タンパク質機能を有するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物が、淡紅色の外見のトマト果実を生産したことが、本発明者らによって発見された。これは非常に驚くべきことであり、Ballester et al. 2010およびAdato et al (2009)(上記)の概説では、調節解除されたMYB12遺伝子発現が淡紅色の外見のトマト果実をもたらすことが開示されている。残念なことに、異常なMYB12タンパク質機能を有するこれらの植物は、y遺伝子を含む非GMOトマト植物と同様に、色が鈍い(すなわち、光沢が無い)トマト果実も有する。しかし、淡紅色の果実を有する(または生産することができる)トマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物が、クチン欠乏(Cutin Deficiency)遺伝子(CD遺伝子)の対立遺伝子等のクチクラ発達に関与する対立遺伝子に追加の変異を有する場合、前記変異は、光沢のある果実の外見をもたらす。一つの態様において、前記変異は、果実の赤熟(RR)期におけるクチンの蓄積の増加または減少をもたらす。一つの態様において、果実のRR期におけるクチンの量(クチクラのクチン含量)は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子(CD対立遺伝子等)における変異を欠く植物と比較して、少なくとも15%増加もしくは少なくとも15%減少し、および/または、クチクラ層はそれぞれ少なくとも15%より厚い、もしくは少なくとも15%より薄い。このような植物は光沢のある淡紅色のトマト果実を生産する(生産可能である)。特に、前記植物または果実がいかなる他の植物または果実の表現型変化も疾患感受性も有さなかったという事実を考慮すると、これは非常に驚くべきことであった。クチクラ発達に関与する対立遺伝子は、一つの態様では、トマトCD遺伝子(例えば、トマトCD1遺伝子、CD2遺伝子またはCD3遺伝子)から、特に、変異型のcd1対立遺伝子、cd2対立遺伝子またはcd3対立遺伝子から選択される。クチンの量および/またはクチクラ層厚が、変異型CD遺伝子を含まない、すなわち、野生型のCD1、CD2およびCD3対立遺伝子を含む正常なトマト植物と比較される。
従って、本発明は、一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、クチクラ発達に関与する対立遺伝子に変異を含み、前記変異が野生型植物(クチクラ発達の遺伝子における変異対立遺伝子を欠く)と比較して増加または減少した赤熟(RR)期におけるクチンの蓄積をもたらす、淡紅色で光沢のある果実(pink and glossy fruit)(「淡紅色で光沢のある果実(pink glossy fruit)」とも称される)を生産するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物に関する。一つの態様において、クチンの増加または減少はクチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く植物と比較して少なくとも15%であり、および/または、それぞれ、クチクラ厚は少なくとも15%より厚い、もしくは少なくとも15%より薄い。
また、本発明は、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子をホモ接合型で含み、または、y(黄色)遺伝子をホモ接合型で含み、さらに、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、この変異型cd対立遺伝子が該変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実の光沢の増加をもたらすものである、淡紅色で光沢のある果実を生産するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物に関する。
また、本発明は、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子をホモ接合型で含み、または、y(黄色)遺伝子をホモ接合型で含み、さらに、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、この変異型cd対立遺伝子が該変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実の光沢の増加をもたらすものである、淡紅色で光沢のある果実を生産するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物に関する。
一つの実施態様において、本発明は、変異型cd対立遺伝子、好ましくは変異型CDタンパク質をコードする変異型cd対立遺伝子、の存在による、果実の光沢のある(色が鈍くない)外見と好ましくは組み合わせて、前記変異すなわちゲノムmyb12遺伝子における変異が、果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において淡紅色の外見を示す前記植物の果実をもたらす、本発明の栽培トマト植物に関する。一つの態様において、変異型cd対立遺伝子はcd2対立遺伝子であり、前記変異は、配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を含むCD2タンパク質をコードするcd対立遺伝子等の配列番号10の異型をコードするCD対立遺伝子において、G736V置換、D737N置換および/またはQ708H置換から選択される、野生型(機能的)CD2タンパク質に対する一つまたは複数のアミノ酸置換を引き起こす。G736V置換、D737N置換および/またはQ708H置換から選択される一つまたは複数の変異は、従って、一つの態様においては、配列番号10のそのような異型に存在する。
一般的定義
用語「核酸配列」(または核酸分子)とは、一本鎖形態または二本鎖形態のDNA分子またはRNA分子、特に、本発明のタンパク質またはタンパク質断片をコードするDNA、を指す。「単離核酸配列」とは、それが単離された天然環境、例えば、細菌宿主細胞内の、または植物の核内ゲノムもしくは色素体ゲノム内の核酸配列、の中にはもはや存在しない、核酸配列を指す。
用語「核酸配列」(または核酸分子)とは、一本鎖形態または二本鎖形態のDNA分子またはRNA分子、特に、本発明のタンパク質またはタンパク質断片をコードするDNA、を指す。「単離核酸配列」とは、それが単離された天然環境、例えば、細菌宿主細胞内の、または植物の核内ゲノムもしくは色素体ゲノム内の核酸配列、の中にはもはや存在しない、核酸配列を指す。
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は同義的に使用され、特定の作用機序、サイズ、三次元構造または起源に関係なく、アミノ酸鎖から成る分子を指す。従って、Myb12タンパク質の「断片」または「部分」も、「タンパク質」と称され得る。「単離タンパク質」は、その天然環境、例えば、インビトロまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞内、にもはや存在しないタンパク質を指して用いられる。
用語「遺伝子」は、適切な調節領域(例えば、プロモーター)に機能的に連結された、細胞内でRNA分子(例えば、mRNA、hpRNAまたはRNAi分子)に転写される領域(転写領域)を含むDNA配列を意味する。従って、遺伝子は、いくつかの機能的に連結された配列、例えば、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む5’リーダー配列、(タンパク質)コード領域(cDNAまたはゲノムDNA)、および、例えば転写終結点を含む3’非翻訳配列、を含み得る。遺伝子は、内在性遺伝子(起源種内の)またはキメラ遺伝子(例えば、導入遺伝子またはシス遺伝子)であり得る。
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーター、に機能的に連結されたDNA領域が、生物学的に活性である、すなわち、生物学的に活性なタンパク質もしくはペプチド(もしくは活性ペプチド断片)に翻訳可能である、または、それ自体が活性を有する(例えば、転写後の遺伝子サイレンシングまたはRNAiにおいて)、RNAに転写されるプロセスを指す。コード配列は、センス配向(sense-orientation)であり得、所望の生物学的に活性なタンパク質またはペプチド、または活性ペプチド断片をコードする。
「活性タンパク質」または「機能的タンパク質」は、インビトロで、例えばインビトロ活性アッセイによって、および/または、インビボで、例えばタンパク質によって付与される表現型によって測定可能なタンパク質活性を有するタンパク質である。「野生型」Myb12タンパク質は、配列番号1に対して少なくとも約85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%のアミノ酸配列同一性を含む完全に機能的なタンパク質である(配列番号1の「異型」または「機能的異型」とも称される)。同様に、野生型Myb12対立遺伝子は、前記野生型タンパク質または野生型の機能的異型をコードする対立遺伝子である。
「変異型myb12タンパク質」は、本明細書においては、野生型Myb12タンパク質をコードする核酸配列内に一つまたは複数の変異を含み、前記変異が、例えばインビボで、例えば変異対立遺伝子によって付与される改変された表現型によって測定可能な、「機能低減型」または「機能喪失型」のタンパク質(をコードする変異型核酸分子)をもたらす、タンパク質である。「機能低減型myb12タンパク質」または「活性低減型myb12タンパク質」または機能喪失型myb12タンパク質とは、赤色のトマト果肉と組み合わされた場合に完熟果実に淡紅色を与える、無色の果実表皮すなわち無色の果皮をもたらす、変異型myb12タンパク質を指す。
「変異型cdタンパク質」は、本明細書においては、野生型CDタンパク質(クチン欠乏(Cutin Deficiency)タンパク質またはクチン欠乏性(Cutin Deficient)タンパク質)をコードする核酸配列内に一つまたは複数の変異を含み、前記変異が、例えばインビボで、例えば変異対立遺伝子によって付与される改変された表現型によって測定可能な、「機能低減型」または「機能喪失型」のタンパク質(をコードする変異型核酸分子)をもたらす、タンパク質である。「機能低減型cdタンパク質」または「活性低減型cdタンパク質」または機能喪失型cdタンパク質とは、赤熟期における光沢のある外見もしくはトマト果実、並びに/または果実(果実クチクラ)のクチン含量および/もしくはクチクラ層厚の有意な増加もしくは減少をもたらす、変異型cdタンパク質を指す。変異型cdタンパク質は、例えば、変異型のcd1、cd2またはcd3タンパク質であり得る。
「淡紅色のトマト果実」、「y変異体」、「y表現型」、または「無色果皮y表現型/変異体」または「無色表皮」または「無色果皮」とは、例えば、黄色/オレンジ色の正常型表皮(配列番号1の野生型Myb12タンパク質または機能的異型をコードする遺伝子の1つまたは2つのコピーを含む植物の果実において見られる)と比較した場合に、色が薄い(色素が少ない;より透明な)果実表皮を有し、それにより、赤色の果肉と組み合わされた場合に果実の淡紅色の外見がもたらされる、トマト果実、または果実を生産可能なトマト植物を指す。myb12変異は劣性であるため、変異型myb12対立遺伝子をホモ接合型で含むトマト植物の果実表皮のみが無色の果皮を有する。果実表皮の色は、赤色期の果実を調べることにより、および/または、表皮を剥がし、例えば表皮を光源にかざして、表皮の色素沈着を視覚的に評価することにより、視覚的に簡単に比較することができる。あるいは、総フラボノイド含量またはナリンゲニンカルコンのレベルが、Adato et al(上記)またはBallester et al. 2010(上記)に記載されるのように、果皮組織において決定され得る。具体的には、材料および方法(Materials and Methods)の、フラボノイドおよびカロテノイドの抽出およびHPLC解析(Flavonoid and Carotenoid Extraction and HPLC Analysis)において、Ballester et alは、「Phenolic and ascorbic acid extraction, separation and detection by HPLC-PDA (Boni et al (2005)(Boni et al. New Phytologist (2005) volume 166 pp 427-438)の429頁の左側のカラム の節にフラボノイド検出法を記載しているBoni et al (2005)を参照している。無色表皮myb12変異体の表皮組織(果皮)は、野生型果実の果皮よりも有意に少ないナリンゲニンカルコンを含み、例えば、変異型myb12対立遺伝子についてホモ接合性の果実において、50mg/kg新鮮果皮重量未満、好ましくは、20、10、5、2、または1mg/kg新鮮果皮重量(fw of p
eel)未満の、ナリンゲニンカルコンを含む。そのため、一つの態様において、 無色表皮」または「無色果皮」は、果実において、50mg/kg新鮮果皮重量未満、好ましくは20、10、5、2、またはさらには1mg/kg新鮮果皮重量未満のナリンゲニンカルコンを含む表皮と定義される。
eel)未満の、ナリンゲニンカルコンを含む。そのため、一つの態様において、 無色表皮」または「無色果皮」は、果実において、50mg/kg新鮮果皮重量未満、好ましくは20、10、5、2、またはさらには1mg/kg新鮮果皮重量未満のナリンゲニンカルコンを含む表皮と定義される。
表皮とは、植物の葉、花、果実および茎を覆う一層の細胞群を指す。表皮は植物と外部環境との間に境界を形成する。表皮はいくつかの機能を果たし、表皮は、水損失を防ぎ、ガス交換を制御し、代謝化合物を分泌し、(特に根において)水および無機栄養素を吸収する。
正常型表皮、すなわち正常型/赤色トマト果実の(すなわち、野生型Myb12タンパク質をコードする遺伝子を含む植物の)表皮は、例えば、Moneyberg、Pusa Sheetal、Tapa、M82またはTPAADASU等の赤色品種、および中国以外の国で生育される多くの他のトマト品種のように、赤熟期において、果実表皮内の黄色のフラボノイドナリンゲニンカルコンの蓄積により、黄色/オレンジ色を有する。
機能低減型myb12タンパク質は、例えば、一つまたは複数の変異をその核酸配列内に含む野生型Myb12対立遺伝子である、「部分ノックアウト変異型myb12対立遺伝子」の転写および翻訳によって、得ることができる。一つの態様において、このような部分ノックアウト変異型myb12対立遺伝子は、生物活性が有意に低減するが完全には消失しないように、少なくとも1つの保存されたおよび/または機能的なアミノ酸が別のアミノ酸に置換された、myb12タンパク質の産生を好ましくはもたらす、一つまたは複数の変異を含む野生型Myb12対立遺伝子である。しかし、トマトMyb12対立遺伝子における、一つまたは複数のナンセンス変異、ミスセンス変異、スプライス部位変異またはフレームシフト変異等の他の変異も、機能低減型myb12タンパク質をもたらし得、このような機能低減型タンパク質は、野生型Myb12タンパク質に対して、一つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有し得る。変異対立遺伝子は、天然において見られる(例えば、ヒトによる変異誘発物質の適用無しに自然に生成される)変異対立遺伝子である「天然変異型」対立遺伝子、または人の介在によって、例えば変異誘発によって誘導される「誘導変異型」対立遺伝子のいずれかであり得る。
タンパク質をコードする核酸分子における「変異」は、例えば、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入による、野生型配列と比較した場合の一つまたは複数のヌクレオチドの変化である。「点変異」は、単一のヌクレオチドの置換、または単一のヌクレオチドの挿入もしくは欠失である。
「ナンセンス」変異は、コドンを終止コドンに変化させる、タンパク質をコードする核酸配列における(点)変異である。これにより、mRNA内および切断タンパク質内に存在する、中途での終止コドンがもたらされる。切断タンパク質は、機能低減または機能喪失を有し得る。
「ミスセンス」または非同義的変異は、コドンを異なるアミノ酸のコードに変化させる、タンパク質をコードする核酸配列における(点)変異である。結果として生じるタンパク質は、機能低減または機能喪失を有し得る。
「スプライス部位」変異は、RNA前駆体のRNAスプライシングを変化させる、タンパク質をコードする核酸配列における変異であり、これにより、野生型と異なるヌクレオチド配列を有するmRNAおよび野生型と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質がもたらされる。結果として生じるタンパク質は、機能低減または機能喪失を有し得る。
「フレームシフト」変異は、mRNAの読み取り枠を変化させる、タンパク質をコードする核酸配列における変異であり、これにより、異なるアミノ酸配列をもたらされる。結果として生じるタンパク質は、機能低減または機能喪失を有し得る。
制御配列、例えば遺伝子のプロモーター、における変異は、遺伝子のmRNA転写物の生成を減少させるまたは生成させなくする、例えば一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入による、野生型配列と比較した場合の一つまたは複数のヌクレオチドの変化である。
「サイレンシング」とは、標的遺伝子または遺伝子ファミリーの遺伝子発現の下方制御または完全阻害を指す。
遺伝子サイレンシングアプローチにおける「標的遺伝子」は、キメラサイレンシング遺伝子(または「キメラRNAi遺伝子」)が発現され、例えば、サイレンシングRNA転写物(例えば、内在性標的遺伝子発現を発現停止させることが可能なdsRNAまたはヘアピンRNA)を生成する場合に、その内在性遺伝子発現が下方制御または完全阻害(発現停止)される、遺伝子または遺伝子ファミリー(または前記遺伝子の一つもしくは複数の特定の対立遺伝子)である。変異誘発アプローチでは、標的遺伝子は、遺伝子発現における変化(低減または喪失)またはコードされるタンパク質の機能における変化(低減または喪失)をもたらす変異をされる内在性遺伝子である。
本明細書で使用される場合、用語「機能的に連結された」とは、機能的な関係にあるポリヌクレオチド成分の連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的な関係に置かれた場合、「機能的に連結されている」。例えば、プロモーター、さらに厳密にいえば転写制御配列、は、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたとは、連結されているDNA配列が、典型的には近接しており、2つのタンパク質コード領域の連結が必要な場合では、「キメラタンパク質」を生成するように近接し且つ読み取り枠内にある、ことを意味する。「キメラタンパク質」または「ハイブリッドタンパク質」は、連結されることで連結されたドメインの機能性を示する機能的タンパク質を形成する、種々のタンパク質「ドメイン」(またはモチーフ)から構成される、それ自体としては天然に存在しないタンパク質である。キメラタンパク質はまた、天然に生じる2つ以上のタンパク質の融合タンパク質であり得る。
用語「食物」は、消費されることで身体に栄養補給を与えるあらゆる物質である。通常、食物は植物起源または動物起源であり、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、またはミネラル等の必須栄養素を含有する。前記物質は、エネルギーを生産する、生命を維持する、または成長を刺激する目的で、生物によって摂取され、生物の細胞によって同化される。食物という用語には、消費されることでヒトおよび動物の身体に栄養補給を与える物質の両方が含まれる。
異なる植物系統間の比較には、一つまたは複数の対照植物系統の植物(好ましくは野生型植物)と同じ条件下で、ある系統のいくつかの植物(例えば、系統あたり、少なくとも5の植物、好ましくは少なくとも10、15または20の植物)を成長させること、および同じ環境条件下で成長した場合の植物系統間の統計的に有意な差異の決定が含まれると理解される。
トマト果実の「成熟期」は以下のように分けることができる:(1)緑熟期(Mature green stage):表面が完全に緑色であり;緑の濃淡度は薄縁色から濃緑色まで異なり得る。(2)催色期(Breaker stage):多くて10%の表面上で緑からやや黄褐色〜黄色、淡紅色または赤色への明確な色の変わり目がある;(3)転換期(Turning stage):10%〜30%の表面が緑色でなくなり;全体として、緑色からやや黄褐色〜黄色、淡紅色、赤色、またはそれらの組合せへの明確な変化を示す。(4)淡紅色期(Pink stage):30%〜60%の表面が緑でなくなり;全体として、淡紅色〜赤色を示す。(5)薄赤色期(Light red stage)(または後期オレンジ色期(late orange stage)):60%〜90%の表面が緑でなくなり;全体として、やや淡紅色〜赤色または赤色を示す。(6)赤色期(Red stage)(または赤熟期(Red Ripe stage)):90%超の表面が緑でなくなり;全体として、赤色を示す。なお、通常のトマト果実(すなわち、熟した際に赤色)および本発明の淡紅色果実は共に、同様の成熟期を有する。しかし、赤色期(6)における色が異なり:本発明の果実では淡紅色であり、通常の(野生型)トマト果実では赤色である。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を用いることで、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を特定することができる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下では異なってくる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の融解温度(thermal melting point)(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50%が完全一致プローブにハイブリダイズする(規定のイオン強度およびpH下での)温度である。典型的には、塩濃度がpH7において約0.02モル濃度であり、温度が少なくとも60℃である、ストリンジェントな条件が選択されることとなる。塩濃度の低下および/または温度の上昇はストリンジェンシーを増加させる。RNA−DNAハイブリダイゼーション(例えば100ntのプローブを使用するノーザンブロット)のストリンジェントな条件は、例えば、63℃で20分間の0.2×SSC中での少なくとも1回の洗浄を含む条件、または等価条件である。DNA−DNAハイブリダイゼーション(例えば100ntのプローブを使用するサザンブロット)のストリンジェントな条件は、例えば、少なくとも50℃の温度、通常は約55℃で、20分間の0.2×SSC中での少なくとも1回の洗浄(通常2回)を含む条件、または等価条件である。Sambrook et al. (1989)およびSambrook and Russell (2001)も参照されたい。
「配列同一性」および「配列類似性」は、包括的または局所的なアラインメントアルゴリズムを用いる、2つのペプチド配列または2つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。配列は、例えばGAPプログラムまたはBESTFITプログラムまたはEmbossプログラム「Needle」(初期パラメータを使用、下記参照)によって最適にアラインメントされ、少なくともある特定の最小パーセンテージの配列同一性(以下で詳述)を共有する場合に、「実質的に同一な」または「実質的に類似した」と称され得る。これらのプログラムは、NeedlemanおよびWunschの包括的アラインメントアルゴリズムを使用して、2つの配列をそれらの全長に亘ってアラインメントし、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する。一般的には初期パラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティーは10であり、ギャップ伸長ペナルティーは0.5である(ヌクレオチドアラインメントおよびタンパク質アラインメントの両方で)。ヌクレオチドにおいては、使用される初期スコア行列はDNAFULLであり、タンパク質においては、初期スコア行列はBlosum62である(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919)。配列アラインメントおよび配列同一性パーセントのスコアは、例えば、ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)においてワールドワイドウェブ上で利用可能なEMBOSS等のコンピュータプログラムを用いて決定され得る。あるいは、配列類似性または配列同一性は、FASTA、BLAST等のデータベースに対して検索をかけることによって決定され得るが、ヒットを回収し、ペアワイズアラインメントにかけて、配列同一性を比較するべきである。2つのタンパク質または2つのタンパク質ドメイン、または2つの核酸配列は、配列同一性パーセントが少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%またはそれ以上(例えば、少なくとも99.1、99.2 99.3 99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9またはそれ以上である場合に(Emboss「needle」によって決定、初期パラメータ、すなわち、ギャップ生成ペナルティー=10、ギャップ伸長ペナルティー=0.5、を使用、核酸にはスコア行列DNAFULL、タンパク質にはBlosum62を使用)、「実質的な配列同一性」を有する。
参照配列「に対する実質的な配列同一性」を有する、または参照配列に対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.9%の核酸配列同一性の配列同一性を有する、核酸配列(例えばDNAまたはゲノムDNA)に対して言及が為される場合、一つの実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であると見なされ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて特定され得る。別の実施態様では、核酸配列は、所与のヌクレオチド配列と比較して一つまたは複数の変異を含むが、それでもなお、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて特定され得る。
本明細書において、およびその特許請求の範囲において、動詞「含む(to comprise)」およびその語形変化は、その非制限的な意味で用いられて、その言葉の後に続く項目が包含されるが、特に明記されていない事項が除外されないことを意味する。加えて、不定冠詞「a」または「an」による要素に対する照応(reference)は、文脈が1つの要素が存在することおよび1つのみの要素が存在することを明白に要求していない限り、2つ以上の前記要素が存在する可能性を排除せしない。従って、不定冠詞「a」または「an」は、通常、「少なくとも1つの」を意味する。さらに、本明細書において「配列」に対して言及する場合、概して、ある特定のサブユニット配列(例えばアミノ酸)を有する実際の物理的分子(actual physical molecule)が言及されることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、用語「植物」は、植物全体またはそのあらゆる部分もしくは誘導体、例えば植物器官(例えば、収穫された、または収穫されていない果実、花、葉等)、植物細胞、植物プロトプラスト、植物全体に再生可能な植物細胞または組織の培養物、再生可能または再生不可な植物細胞、植物カルス、植物細胞集塊、および、植物中の、または、胚、花粉、胚珠、子房、果実(例えば、収穫後の組織または器官、例えば、収穫後のトマトまたはその一部)、花、葉、種子、塊茎、クローン増殖植物(clonally propagated plant)、根、茎、子葉、胚軸、根端等の植物の一部中の無処置の植物細胞を包含する。また、実生、未熟および成熟等のあらゆる発生段階も包含される。本明細書で使用される場合、植物という用語は、一つまたは複数の、本発明の変異型のmyb12対立遺伝子および/もしくはmyb12タンパク質、並びに/または、クチクラ発達、特に果実クチクラのクチン含量および/もしくは果実のクチクラ層厚、に関与する対立遺伝子における変異、を含む植物および植物部位を包含する。
別の実施態様では、植物部位という用語は、一つまたは複数の、本発明の変異型のmyb12対立遺伝子および/またはmyb12mRNA(cDNA)および/またはmyb12タンパク質を含み、且つ、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異をさらに含む、植物細胞、または植物組織または植物器官を指す。一つの態様において、植物部位は、植物に成長可能であり、および/または、光合成(すなわち、水、二酸化炭素および無機塩等の無機物からの炭水化物およびタンパク質の合成)で生存可能である。別の態様では、植物部位は、植物に成長不可であり、および/または、光合成(すなわち、水、二酸化炭素および無機塩等の無機物からの炭水化物およびタンパク質の合成)で生存不可である。
「植物系統」または「育種系統」とは、植物およびその子孫を指す。本明細書で使用される場合、用語「近交系」とは、繰り返し同系繁殖された植物系統を指す。
「植物品種(plant variety)」は、(植物育種者権の承認条件が満たされているか否かにかかわらず)ある特定の遺伝子型または遺伝子型の組合せからもたらされる特徴の発現に基づいて定義可能であり、それらの特徴のうちの少なくとも1つの発現によって他のあらゆる植物と区別可能であり、いかなる変化も無しに繁殖可能であるため、独立体として認識可能である、既知の最下位の同一植物分類群内の植物群である。従って、用語「植物品種」は、植物が同じ種類であったとしても、全てが1つの遺伝子座または遺伝子(またはこの単一の遺伝子座または遺伝子による一連の表現型的特徴)の存在を特徴とするが、その他の遺伝子座または遺伝子に関しては著しく互いに異なり得る場合、植物群を表すのに使用することはできない。
「F1、F2等」は、2つの親植物間または親系統間の交雑後の連続的な近縁世代を指す。2つの植物または系統を交雑することにより生産された種子から成長した植物はF1世代と称される。F1植物の自家受粉により、F2世代等がもたらされる。「F1雑種」植物(またはF1種)は、2つの近交系親系統の交雑から得られる世代である。「M1集団」は、ある特定の植物系統または栽培品種の複数の変異誘発種子/植物である。「M2、M3、M4等」は、第一の変異誘発種子/植物(M1)の自家受粉後に得られる連続的な世代を指す。
トマト果実に関連した用語「光沢(gloss)」、「光沢のある(glossy)」または「光沢度(glossiness)」または「輝度(brightness)」は、トマト果実表面による正反射レベルに関する。光沢(gloss)は、トマト果実表面に光沢のある(shiny)または光沢のある(lustrous)外見を持たせる特性である。光沢は散乱無しに光を反射する表面の能力により増加する。それ故、光沢はしばしば、試験表面に対してある角度をなす定出力光線を向けた後、反射光の量をモニターすることによって測定される。しかし、果実光沢はまた、正の対照および/または負の対照(例えば、WT栽培トマト植物の果実等)と比較して、光の反射をスコア化することにより、視覚的に測定することもできる。あるいは、果実の写真画像において、光飽和画素(light saturated pixel)の数を、光沢の尺度と解釈してもよい(特に、光強度、角度、環境および光源に対する果実の位置等の同一条件下で様々な果実を測定する場合。トマト(Solanum lycopersicum)果実において、クチクラを包埋している表皮細胞はトマト果実の輝度における重大な役割を担っているが、クチン積載量(すなわち、クチクラの果実クチン含量および/または果実クチクラ層厚)と果実輝度(上記参照)との間の明白な関連付けはできていない。果実クチクラ層厚はトマト果実発達の赤熟期において完熟に達する。消費者はしばしば果実光沢を果実品質と関連付けるため、果実光沢は重要な果実特性である。同様に、トマト果実は、色が鈍い(dull)と称される場合、光沢が無い。光沢は、2つ以上の対象の光沢を互いに比較することによって視覚的に測定することができ、あるいは、光沢計を使用してもよい。例えば、実施例3を参照されたい。従って、本明細書における、統計的に「有意に増加した光沢」または「増加した光沢」を有する果実を生産するトマト植物は、例えば、上記および実施例に記載のように、例えば赤熟期の果実の表面反射測定により測定された、その系統または品種のいくつかの果実およびいくつかの植物の平均光沢が、対照(例えば、野生型CD対立遺伝子についてホモ接合性、例えば、機能的なCD2タンパク質をコードするCD2/CD2)の果実よりも、(統計的に)有意により高い植物である。
用語「対立遺伝子」は、特定の遺伝子座の遺伝子の一つまたは複数の別形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子は全て、特定の遺伝子座における1つの形質または特徴に関連している。生物の二倍体細胞では、所与の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定の位置、すなわち遺伝子座(locus)(複数形ではloci)に位置している。1つの対立遺伝子が、相同染色体対の各染色体上に存在している。二倍体植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含み得る。これらは、遺伝子の同一対立遺伝子(ホモ接合性)または2つの異なる対立遺伝子(ヘテロ接合性)であり得る。
用語「遺伝子座(locus)」(複数形ではloci)は、例えば遺伝子または遺伝子マーカーが存在する、染色体上の特定の1つもしくは複数の場所または部位を意味する。Myb12遺伝子座は従って、Myb12遺伝子が存在するゲノム内の位置である。
「野生型対立遺伝子」(WTまたはWt)とは、本明細書では、完全に機能的なタンパク質(野生型タンパク質)をコードする遺伝子型を指す。完全に機能的なMyb12タンパク質をコードするこのような配列は、例えば、ncbi.nlm.nih.govウェブサイト上で、/nuccore/171466740下に開示されるNCBI EU419748 トマト(Solanum lycopersicum)MYB12(MYB12)のmRNA(完全長cds)に基づく、配列番号4に示される野生型Myb12 cDNA(mRNA)配列、または配列番号7に示される野生型Myb12ゲノム配列である。この野生型Myb12 mRNAにコードされるタンパク質配列は配列番号1に示される。前記タンパク質配列は338個のアミノ酸から成る。対立遺伝子(すなわち、配列番号1のタンパク質と同程度の果実着色、すなわち果実が成熟期にある場合は赤色トマト果実、を与える対立遺伝子)をコードする他の完全に機能的なMyb12タンパク質が、他のトマト(Solanum lycopersicum)植物に存在し得、配列番号1との実質的な配列同一性、すなわち、配列番号1との少なくとも約85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%の配列同一性を含み得る。このような完全に機能的な野生型Myb12タンパク質は、本明細書では、配列番号1の「異型(variant)」と称される。同様に、このような完全に機能的なMyb12タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号4および配列番号7の異型と称される。
完全に機能的なCD2(Cutin Deficient 2)タンパク質をコードする野生型(WT)配列は、例えば、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nihの/nuccore/NM_001247728下(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247728 の、NCBI NM_001247728 トマト(Solanum lycopersicum)CD2(CD2)mRNA(完全長cds)に基づく配列番号12に示される野生型CD2 cDNA(mRNA)配列に、または、配列番号14に示される野生型CD2ゲノム配列にコードされる。この野生型CD2 mRNAにコードされる野生型(機能的)タンパク質配列は配列番号10に示される。前記野生型(機能的)タンパク質配列は821個のアミノ酸から成る。対立遺伝子(すなわち、配列番号10のタンパク質と同程度のクチクラ発達、すなわち果実が成熟期にある場合は光沢のあるトマト果実、を与える対立遺伝子)をコードする他の完全に機能的なCD2タンパク質が、他のトマト(Solanum lycopersicum)植物に存在し得、配列番号10との実質的な配列同一性、すなわち、配列番号10との少なくとも約85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%の配列同一性を含み得る。このような完全に機能的な野生型CD2タンパク質は、本明細書では、配列番号10の「異型」と称される。同様に、このような完全に機能的なCD2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号12および配列番号14の異型と称され、配列番号12または14との実質的な配列同一性、すなわち、配列番号12または14との少なくとも約70%、75%、85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%の配列同一性を含み得る。
以下の変異型myb12対立遺伝子は、本発明に記載の野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と比較して、ホモ接合型である場合に、果実発達の後期オレンジ色期および/もしくは赤色期において色の薄いトマト果実表皮を有する、および/または、淡紅色のトマト果実を有する、myb12変異体の例示である。
なお、本明細書で参照されるヌクレオチド配列(配列番号4〜6)は、配列番号1〜3のタンパク質をコードするcDNA、すなわちコードDNA配列である。開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なすと、配列番号4〜6は、TAG終止コドンを含む1017個のヌクレオチドを有する。明らかなことであるが、これらのcDNAヌクレオチド配列に対して言及がなされる場合、cDNAは、イントロンを追加で含有するためにヌクレオチドが異なる番号付けを有する、対応するトマト(Solanum lycopersicum)のゲノムmyb12配列のコード領域であると理解される。従って、例えば配列番号4〜6のいずれか1つに記載のmyb12配列を含むトマト植物に対して言及がなされる場合、配列番号4〜6のmRNAが転写される(順に、タンパク質に翻訳される)、コードDNA(cDNA)を含むゲノムmyb12配列を含むトマト植物、と理解される。チミン(T)がmRNA内ではウラシル(U)であることを除いては、mRNAはcDNAと同じヌクレオチド配列を有する。
さらに、本発明のタンパク質(すなわち、配列番号2または3の変異型myb12タンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含むトマト植物に対して言及がなされる場合、これは、遺伝暗号の縮重による、異なるヌクレオチド配列を包含する。一つの実施態様では、前記植物は、配列番号7に示されるゲノムMyb12配列、または、それと実質的に同一(例えば、配列番号7と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%の配列同一性を有する)であるが、前記配列に、特に前記ゲノム配列のエクソンのコード配列(エクソン1のコード配列はヌクレオチド1〜134に亘り;エクソン2はヌクレオチド225〜353に亘り、エクソン3はヌクレオチド1791〜2140に亘り、エクソン4はヌクレオチド2734〜3137に亘る;開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なす)に、一つもしくは複数の変異を有し、色の薄いおよび/もしくは無色のトマト果実表皮をもたらす変異型myb12タンパク質をコードする、ゲノムMyb12配列、を含む。一つの実施態様では、前記ゲノム配列は、配列番号2または配列番号3の変異型myb12タンパク質をコードする。
本発明により特定される、ホモ接合型である場合に、淡紅色のトマト果実および/または色の薄い表皮および/または無色表皮を付与する、1つの例示的な変異型myb12対立遺伝子(変異体2961;種子寄託NCIMB42087およびNCIMB42268に存在)は、翻訳中に60個のアミノ酸残基から成る切断型タンパク質をもたらす変異を含み、一方で、野生型タンパク質は338個のアミノ酸残基を有する(配列番号1参照)。変異体2961の切断型タンパク質配列は配列番号2に示される。切断は、開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なして、配列番号4のヌクレオチド182におけるチミン(T)からアデニン(A)への変化によるものである。変異体2961におけるこのT182A変異は、ロイシン(すなわちLeuまたはL)のコドン(TTG)から終止コドン(TAG)への変化をもたらす。これは、配列番号7の1305位における、ゲノムDNAにおけるチミン(T)からアデニン(A)への変異に対応する。変異型cDNAは配列番号5に示される。
本発明により特定される、ホモ接合型である場合に、淡紅色のトマト果実および/または色の薄い表皮および/または無色表皮を付与する、別の例示的な変異型myb12対立遺伝子(変異体5505;種子寄託NCIMB42088に存在)は、コードされるタンパク質(配列番号3)のアミノ酸50におけるグリシン(GlyまたはG)からアルギニン(ArgまたはR)への変化をもたらす変異、すなわちG50R変異、を含む。変異体5505のタンパク質配列は配列番号3に示される。前記アミノ酸置換は、開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なして、配列番号4のヌクレオチド148におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(すなわち、G148C変異)によるものである。これは、配列番号7の1271位における、ゲノムDNAにおけるグアニンからシトシンへの変異に対応する。変異型cDNAは配列番号6に示される。
以下の変異型cd2対立遺伝子は、以下の変異型cd2対立遺伝子は、本発明に記載の野生型CD2対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と比較して、変異型cd2対立遺伝子がホモ接合型である場合に、光沢のあるトマト果実(例えば、果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期において)、すなわち有意に増加した光沢を有する果実、を有するcd2変異体の例示である。また、変異型cd2対立遺伝子がヘテロ接合型である場合も、前記果実は、野生型CD2対立遺伝子(野生型CD2タンパク質をコードする)についてホモ接合性の、すなわち変異型cd2対立遺伝子(変異型cd2タンパク質をコードする)を欠くトマト植物の果実と比較して、有意に増加した光沢を有する。
従って、一つの態様において、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子をホモ接合型で含み、またはy(黄色)遺伝子をホモ接合型で含み、且つ、下記の変異型cd2対立遺伝子等の、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(cd)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、この変異型cd対立遺伝子が、変異型cd2対立遺伝子を欠く植物等の、該変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実光沢の(統計的に有意な)増加をもたらすものである、淡紅色で光沢のある果実を生産するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物が提供される。なお、cd1、cd2およびcd3遺伝子は異なる染色体上に位置する単一劣性遺伝子であるため(Isaacson et al. 2009によって、cd2は染色体1、cd3は染色体8に、cd1は染色体11に位置付けられた)、複数の異なるCD遺伝子の変異対立遺伝子の存在は可能ではあるが、本発明のトマト植物は、cd1、cd2およびcd3から選択されるcd遺伝子の1つのみの対立遺伝子に変異を含むことが好ましい。
なお、本明細書に参照されるヌクレオチド配列(配列番号12、13、および16)は、配列番号10(野生型(wilt type)CD2タンパク質)、配列番号11(光沢をもたらす、G736V、すなわちグリシン(GまたはGly)からバリン(VまたはVal)へのアミノ酸変化を有する変異型cd2タンパク質)、および配列番号15(光沢をもたらす、Q708H、すなわちグルタミン(QまたはGln)からヒスチジン(HまたはHis)への、およびD737N(すなわちアスパラギン酸(DまたはAsp)からアスパラギン(NまたはAsn)へのアミノ酸変化を有する変異型cd2タンパク質) のタンパク質をそれぞれコードする、cDNA、すなわちコードDNA配列である。開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なすと、配列番号12、13および16は、TAG終止コドンを含む2466個のヌクレオチドを有する。明らかなことであるが、これらのcDNAヌクレオチド配列に対して言及がなされる場合、cDNAは、イントロンを追加で含有するためにヌクレオチドが異なる番号付けを有する、対応するトマト(Solanum lycopersicum)のゲノムcd2配列のコード領域であると理解される。従って、例えば配列番号12、13、または16のいずれか1つに記載のcd2配列を含むトマト植物に対して言及がなされる場合、それぞれ配列番号12、13、および16のmRNAが転写される(順に、タンパク質に翻訳される)、コードDNA(cDNA)を含むゲノムcd2配列を含むトマト植物、と理解される。チミン(T)がmRNA内ではウラシル(U)であることを除いては、mRNAはcDNAと同じヌクレオチド配列を有する。
さらに、本発明のタンパク質(クチクラ発達、特にクチン産生、に関与)(すなわち、配列番号11または配列番号15の変異型cd2タンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含むトマト植物に対して言及がなされる場合、これは、遺伝暗号の縮重による、異なるヌクレオチド配列を包含する。一つの実施態様では、前記植物は、配列番号14に示されるゲノムCD2配列、または、それと実質的に同一(例えば、配列番号14と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、または99.9%の配列同一性を有する)であるが、前記配列に、特に前記ゲノム配列のエクソンにおけるコード配列(エクソン1におけるコード配列はヌクレオチド1〜(両端を含む(and including))204に亘り;エクソン2はヌクレオチド282〜502に亘り、エクソン3はヌクレオチド600〜715に亘り、エクソン4はヌクレオチド809〜ヌクレオチド1494に亘り、エクソン5はヌクレオチド1617〜ヌクレオチド1717に亘り、エクソン6はヌクレオチド1819〜ヌクレオチド2032に亘り、エクソン7はヌクレオチド3417〜ヌクレオチド3591に亘り、エクソン8はヌクレオチド3718〜ヌクレオチド4086に亘り、エクソン9はヌクレオチド4542〜4921に亘る;開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なす)に、一つまたは複数の変異を有し、トマト果実発達の緑熟期以後(Mature Green stage)(例えば、催色期(Breaker stage)、オレンジ色期、または赤熟期)に光沢のあるトマト果実をもたらす変異型cd2タンパク質をコードする、ゲノムCD2配列、を含む。一つの実施態様では、前記ゲノム配列は、配列番号11の変異型タンパク質をコードする。別の実施態様では、前記植物は、配列番号14のヌクレオチド7171にグアニン(G)からチミン(T)への変異(配列番号11に示されるアミノ酸変化G736Vをもたらす)を含む配列番号14に示されるゲノムCD2配列、またはそれと実質的に同一なゲノムCD2配列、を含む。
本発明により特定される、光沢のあるトマト果実を付与する、1つの例示的な変異型cd2対立遺伝子(変異体8.17および変異体26428_001に存在するような)は、コードされるタンパク質(配列番号11)のアミノ酸736におけるグリシン(GlyまたはG)からバリン(ValまたはV)への変化をもたらす変異、すなわちG736V変異、を含む。変異体8.17(および変異体26428_001)のcd2タンパク質配列は配列番号11に示される。前記アミノ酸置換は、開始コドンのATGにおけるAをヌクレオチド位置1と見なして、配列番号12のヌクレオチド2207におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(すなわち、G2207T変異)によるものである。変異型cDNAは配列番号13に示される。配列番号12のcDNAにおけるG2207T変異は、配列番号14のゲノムDNAにおけるG7171T変異と一致する。
従って、一つの態様において、本発明のトマト植物は、変異型CD2対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、それによって、果実は変異型cd2対立遺伝子を欠く植物と比較して増加した光沢を有し、それによって、変異型cd2対立遺伝子はアミノ酸736(または異型における等価な位置)にバリンを含む配列番号10のCD2タンパク質(または、配列番号10に対して少なくとも85%、90%、95%もしくはそれ以上の配列同一性を含む配列番号10の異型)をコードする。
本発明で特定される光沢のあるトマト果実を付与する、1つの他の例示的な変異型cd2対立遺伝子(Isaacson et al(Isaacson et al, 2009, The plant Journal 60, 363-377)にあるような、変異型「cd2」;この論文のCD2の配列データは、GenBank/EMBLデータライブラリーの受託番号GQ222185に見出すことができる)は、コードされるタンパク質(配列番号15)のアミノ酸737においてアスパラギン酸(AspまたはD)からアスパラギン(AsnまたはN)への変化をもたらす変異、すなわちD737N変異;さらに、コードされるタンパク質(配列番号15)のアミノ酸708においてグルタミン(GlnまたはQ)からヒスチジン(HisまたはH)への変化をもたらす変異、すなわちQ708H変異、を含む。この「Isaacson 2009」cd2タンパク質配列は配列番号15に示される。なお、結果(Results)の章において、Isaacson et alは、それらのcd2変異体がG736R変異のみを含むと記載している(Isaacson et al, 2009, The plant Journal 60, 363-377の372頁、左側カラム)。Isaacson 2009に記載される変異型cd2対立遺伝子を含む植物系統は、コーネル大学からの、「Genes that make tomatoes」コレクションにおいて入手可能である(e4393m2系統)。あるいは、前記アミノ酸置換の一方または両方を有する対立遺伝子を含む植物は、誘導性変異誘発によって新規に作製され得る。
従って、別の態様では、本発明のトマト植物は、変異型cd2対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、それによって、果実は変異型cd2対立遺伝子を欠く植物と比較して増加した光沢を有し、それによって、変異型cd2対立遺伝子は、アミノ酸737(もしくは異型における等価な位置)にアスパラギンを含み、および/または、アミノ酸708(もしくは異型における等価な位置)にヒスチジンを含む、配列番号10のCD2タンパク質(または配列番号10に対して少なくとも85%、90%、95%もしくはそれ以上の配列同一性を含む配列番号10の異型)をコードする。
他の例示的な変異型クチン欠乏(Cutin Deficiency)(またはクチン欠乏性(Cutin Deficient))対立遺伝子は、Isaacson et al, 2009 (The plant Journal 60, 363-377)に開示されているような、cd1およびcd3である。変異型cd1対立遺伝子を含む植物系統(e4247m1系統)または変異型cd3対立遺伝子を含む植物系統(n3056m1系統)は、コーネル大学からの「Genes that make tomatoes」コレクションにおいて入手可能な、から得ることができる。
変異体P23C10、P32H5、P8A12、P5E1、P4B6、P30B6、P6A2、P3H6、P4E2、P15C12、P30A12、P18H8、P17F12、P23F12、P11H2、およびP26E8(Petit et al、上記参照、光沢のある植物(Glossy plant)下の表1に列挙される)等の、Petit et al (Plant Physiology 2014 vol 164 pp 888-906)で開示されている他の光沢のある植物。
「変異対立遺伝子」とは、本明細書では、野生型対立遺伝子と比較して、コード配列(mRNA、cDNAまたはゲノム配列)内に一つまたは複数の変異を含む対立遺伝子を指す。このような変異(例えば、一つまたは複数のヌクレオチドの挿入、逆位、欠失および/または置換)は、例えば、タンパク質が、例えば、切断されることにより、または、一つもしくは複数のアミノ酸が欠失、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列を有することにより、インビトロおよび/もしくはインビボ機能性が低減した(機能低減型)、または、インビトロおよび/もしくはインビボ機能性が無い(機能喪失型)、コード化タンパク質をもたらし得る。このような変化は、タンパク質の、異なる3D高次構造の所有、異なる細胞内区画への標的化、改変された触媒ドメインの所有、核酸またはタンパク質に対する改変された結合活性の所有、等をもたらし得る。
「野生型植物」および「野生型果実」または「正常型成熟」植物/果実とは、本明細書では、完全に機能的なMyb12タンパク質をコードする、野生型(WTまたはWt)Myb12対立遺伝子(Myb12/Myb12)の2つのコピーを含むトマト植物を指す(例えば、変異型myb12対立遺伝子をホモ接合型で含む「変異型植物」とは対照的)。「野生型果実光沢」または「正常型果実光沢」または「正常型光沢」とは、本明細書では、通常のクチクラ層を含む、例えば、機能的CDタンパク質をコードするCD1、CD2および/またはCD3遺伝子の野生型(WTまたはWt)CD対立遺伝子の2つのコピー、すなわち、CD1/CD1、CD2/CD2およびCD3/CD3を含む、トマト植物;特に、完全に機能的なCD2タンパク質をコードする野生型CD2対立遺伝子(CD2/CD2)を含む植物(例えば、変異型cd2対立遺伝子をホモ接合型で含む「変異型植物」とは対照的)、を指す。このような植物は、例えば、表現型アッセイにおける適切な対照となる。野生型および/または変異型植物は「栽培トマト植物」であることが好ましい。例えば、栽培品種Moneymakerは野生型植物であり、同様に、栽培品種Ailsa Craig、栽培品種Tapa、M82、並びに野生型CD1、CD2およびCD3対立遺伝子(完全に機能的なCDタンパク質をコードする)についてホモ接合性の多くの他の栽培品種も野生型植物である。
「トマト植物」または「栽培トマト植物」は、人により栽培された、良好な農学的特徴を有する、トマト(Solanum lycopersicum)植物、すなわち、トマト(Solanum lycopersicum)の品種、育種系統または栽培品種であり;このような植物は、「野生型植物」、すなわち、栽培植物よりもかなり乏しい生産量および乏しい農学的特徴を一般的に有し、例えば野生集団において天然に生育する植物、ではないことが好ましい。「野生型植物」には、例えば、ある種の、生態型、PI(移入植物(Plant Introduction))系統、在来種または野生系統(wild accession)もしくは近縁野生種が含まれる。ヒトの歴史において古くから一般に育成され、しばしば特定の地理的地域に適合した、いわゆる、伝播品種(heirloom variety)または伝播栽培品種(heirloom cultivar)、すなわち、放任受粉品種または放任受粉栽培品種も、本発明の一つの態様において、栽培トマト植物として本明細書に包含される。
トマトの近縁野生種としては、ソラヌム・アルカヌム(S. arcanum)、ソラヌム・クミエレウスキ(S. chmielewskii)、ソラヌム・ネオリクキ(S. neorickii)(=L・パルビフロルム(L. parviflorum))、ソラヌム・ケエスマニアエ(S. cheesmaniae)、ソラヌム・ガラパゲンセ(S. galapagense)、ソラヌム・ピムピネルリホリウム(S. pimpinellifolium)、ソラヌム・キレンセ(S. chilense)、ソラヌム・コルネリオムレリ(S. corneliomulleri)、ソラヌム・ハブロカイテス(S. habrochaites)(=L・ヒルスタム(L. hirsutum))、ソラヌム・フアユラセンセ(S. huaylasense)、ソラヌム・シシュムブリイフォリウム(S. sisymbriifolium)、ソラヌム・ペルビアナム(S. peruvianum)、ソラヌム・ヒルスタム(S. hirsutum)またはソラヌム・ペンネリ(S. pennellii)が挙げられる。
「平均値(average)」または「平均値(mean)」とは、本明細書では、相加平均を指し、両方の用語が同義的に使用される。用語「平均値(average)」または「平均値(mean)」は、従って、いくつかの測定値の相加平均を指す。植物系統または品種の表現型がある程度生育条件に依存すること、および、それ故、少なくとも5、10、15、20、30またはそれ以上の植物(または植物部位)の相加平均が、好ましくは、何回かの反復実験および同一実験における同一条件下で育成された適切な対照植物を伴う無作為化された実験計画において測定されることが、当業者によって理解される。「統計的に有意な」または「統計的に有意に」異なる、または「有意に」異なる、とは、適切な対照(control)または比較対象(comparison)と比較した場合に、対照または比較対象(の平均値)からの、その特徴における統計的に有意な差異を示す(例えば、ANOVAを用いて、p値が0.05未満、p<0.05)、植物系統または品種の特徴を指す。
色(colour)および色(color)は同義的に使用される。
用語「ある特定の表現型形質を有する果実を生産するトマト植物」および「ある特定の表現型形質を有する果実を生産可能なトマト植物」は本明細書中で同義的に使用され、果実を生産可能な(栽培)トマト植物(トマト(Solanum lycopersicum))を指す。特定の表現型形質は、果実にのみ見られるものであり、植物それ自体に見られるものである必要はない。
配列番号1は、NCBI EU419748トマト(Solanum lycopersicum)MYB12(MYB12)mRNA(完全長cds)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171466740)に基づくmRNAに由来する、トマト(Solanum lycopersicum)の野生型の、完全に機能的な、MYB12タンパク質配列を示す。
配列番号2は、トマト(Solanum lycopersicum)の変異体2961 myb12タンパク質配列を示す。
配列番号3は、トマト(Solanum lycopersicum)の変異体5505 myb12タンパク質配列を示す。
配列番号4は、NCBI EU419748トマト(Solanum lycopersicum)Myb12(MYB12)mRNA(完全長cds)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171466740)に基づく、トマト(Solanum lycopersicum)の野生型Myb12 cDNAを示す。
配列番号5はトマト(Solanum lycopersicum)の変異体2961 myb12 cDNA配列を示す。
配列番号6はトマト(Solanum lycopersicum)の変異体5505 myb12 cDNA配列を示す。
配列番号7は、配列番号1および4と同じ供給源の、トマト(Solanum lycopersicum)の野生型Myb12ゲノムDNAを示す。
配列番号8は、果実表皮色に影響を与えない変異体5058 myb12タンパク質配列を示す。
配列番号9は、果実表皮色に影響を与えない変異体6899 myb12タンパク質配列を指す。
配列番号10は、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nihの/nuccore/NM_001247728下(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247728)の、NCBI NM_001247728トマト(Solanum lycopersicum)CD2(CD2)mRNA(完全長cds)に基づくmRNAに由来する、トマト(Solanum lycopersicum)の野生型の、完全に機能的な、CD2タンパク質配列を示す。
配列番号11はトマト(Solanum lycopersicum)の変異体26428_001 cd2タンパク質配列を示す。
配列番号12は、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nihの/nuccore/NM_001247728下(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247728)の、NCBI NM_001247728トマト(Solanum lycopersicum)CD2(CD2)mRNA(完全長cds)に基づく、トマト(Solanum lycopersicum)の野生型Cd2 cDNAを示す。
配列番号13はトマト(Solanum lycopersicum)の変異体26428_001 cd2 cDNA配列を示す。
配列番号14は、配列番号10および12と同じ供給源の、トマト(Solanum lycopersicum)の野生型Cd2ゲノムDNAを示す。対応する変異体26428_001 cd2ゲノムDNAは、野生型配列におけるようなグアニン(G)の代わりに、7171位のチミン(T)、すなわちG7171T変異、を配列番号14に含む。
配列番号15は、Isaacson et al(上記参照)のトマト(Solanum lycopersicum)の変異型cd2タンパク質配列を示す;Genbank EMBL ACCESSION GQ222185 version GQ222185.1 GI:255529748 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/gq222185。
配列番号16は、Isaacson et al(上記参照)に基づく、トマト(Solanum lycopersicum)の変異型cd2 cDNA配列を示す;Genbank EMBL ACCESSION GQ222185 version GQ222185.1 GI:255529748 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/gq222185。
最も広い意味において、本発明は、果実の「光沢」における有意な増加および/または果実クチクラのクチン量の有意な増加もしくは減少を引き起こす変異を有する、「淡紅色の」果実色を生じさせる対立遺伝子の組合せに関する。一つの態様では、クチクラ厚が有意に増加および/または減少することにより、光沢の増加または減少がもたらされる。そのため、一つの態様において、本発明は、果実の「光沢」における有意な増加、および/または果実クチクラのクチン量の有意な増加もしくは減少、および/またはそれぞれ有意により厚いもしくはより薄い果実クチクラ層(すなわち、より多量のクチンを有するより厚いクチクラおよびより低量のクチンを有するより薄いクチクラ)を引き起こす変異を有する、「淡紅色の」果実色を生じさせる対立遺伝子の組合せに関する。従って、淡紅色に関するあらゆる変異対立遺伝子(myb12変異体およびy遺伝子、本明細書に記載)が、光沢および/またはクチン蓄積に関する変異対立遺伝子(特に、CD1、CD2またはCD3遺伝子の変異対立遺伝子、本明細書に記載)と組合せられる。淡紅色で光沢のある変異体が本明細書において異なる態様で記載されている場合も、単一植物(系統または品種)のゲノムにおける、およびそのような単一植物(系統または品種)の細胞における、遺伝子組合せが、淡紅色で光沢のある果実をもたらすと見なされることを理解されたい。また、淡紅色で光沢のある果実を生産するF1雑種を生産するのに適した親系統も本明細書に包含される(例えば同系交配)。親系統は、F1雑種がmyb12またはy遺伝子についてホモ接合性であり淡紅色を発現する限り、変異型myb12対立遺伝子またはy遺伝子についてヘテロ接合性であってよい。
従って、一つの態様において、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含み、または、y(黄色)遺伝子をホモ接合型で含み、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(cd)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、この変異型cd対立遺伝子が該変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実の光沢の増加をもたらすものである、淡紅色で光沢のある果実を生産するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物が提供される。
本発明は淡紅色で光沢のある果実を生産する(生産可能である)トマト(Solanum lycopersicum)栽培植物を開示しており、前記栽培植物は、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含み、クチクラ発達に関与する対立遺伝子において、特にCD1、CD2およびCD3から選択されるCD遺伝子において変異を含み、前記変異は、野生型植物、すなわちクチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く植物、と比較して、少なくとも15%の赤熟(RR)期におけるクチン蓄積の増加もしくは減少をもたらし;および/または、一つの態様では、それぞれ、クチクラ層が少なくとも15%より厚いもしくは少なくとも15%より薄く;および/または、前記変異は野生型植物(すなわち、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く(すなわち、クチクラ発達に関与する完全に機能的な対立遺伝子、例えば、完全に機能的なCD遺伝子を有する)植物を含む)と比較して、果実光沢の有意な増加をもたらす。
一つの態様において、淡紅色で光沢のある果実を生産可能な本発明の植物は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子(本明細書では「変異型myb12対立遺伝子」とも称される)を含む。別の態様では、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子は、myb12対立遺伝子の、およびmyb12対立遺伝子の発現を調節する遺伝子における、コード領域における変異、非コード領域における変異、プロモーターにおける変異からなる群から選択される変異を有する。別の態様では、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異は、y変異表現型を生じる変異、すなわち、当該技術分野において公知の調節遺伝子における変異によるもの、である(例えば、Adato et al 2009 PLoS Genetics, Vol 5 issue 12, e1000777)。
さらに別の態様では、淡紅色で光沢のある果実を生産可能な本発明の植物における、変異型myb12タンパク質の産生をもたらすか、またはより低いmyb12タンパク質レベルをもたらす変異は、myb12対立遺伝子における変異である。前記より低いmyb12タンパク質レベルは、前記一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を欠く植物と比較されることを理解されたい。
変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異。前記変異を欠く植物は、myb12対立遺伝子を除いて、本発明の植物と同一の遺伝子構造を有することが好ましい。さらに別の態様では、myb12対立遺伝子におけるこの変異によって、変異型myb12タンパク質の産生がもたらされる。
別の態様における、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含み、前記変異型myb12タンパク質は配列番号1において(すなわち、配列番号1の野生型タンパク質に対して)、または配列番号1の(機能的)異型において(すなわち、配列番号1の野生型タンパク質の機能的異型に対して)、G50Rアミノ酸置換を有し、前記異型は配列番号1に対して少なくとも約85%アミノ酸配列同一性を有し;または、前記G50Rアミノ酸置換を有する配列番号1に対する配列同一性に加えて、配列番号1に対して少なくとも約90%、93%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%のアミノ酸配列同一性を有し;または、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において(すなわち、配列番号1の野生型タンパク質に対して)、または(機能的な)その異型(すなわち、配列番号1の野生型タンパク質の機能的異型に対して)、アミノ酸61〜338の欠失を含み、前記異型は、配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有し;または、配列番号1に対して少なくとも約90%、93%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%のアミノ酸配列同一性を有し、あるいは、前記異型は、配列番号1のアミノ酸1〜60に対して少なくとも95%(例えば、96%、97%、98%、99%)のアミノ酸配列同一性を有する、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な本発明の植物。言い換えれば、変異型myb12タンパク質は、配列番号1のアミノ酸1〜60、または配列番号1に対して少なくとも約85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の機能的異型のアミノ酸1〜60を含む。配列番号1の(機能的)異型においてG50Rアミノ酸置換を有する変異型myb12タンパク質に対する言及が為される場合、このような配列番号1の(機能的)異型は、G50R置換に加えて、配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有し;または、配列番号1に対して少なくとも約90%、93%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%のアミノ酸配列同一性を有する。言い換えれば、G50R置換が配列番号1の異型に存在することによって、前記異型は本発明の機能低下myb12タンパク質となるはずである。
配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性(または、あらゆる他の配列同一性割合)を有し、且つ前記G50Rアミノ酸置換を有する配列番号1の(機能的)異型に対して言及が為される場合は常に、GからRへのアミノ酸置換の位置は、配列番号1の異型に生じ得る一つまたは複数のアミノ酸欠失または挿入によって、いくつかのアミノ酸位置、例えば、−5、−4、−3、−2、−1、+1、+2、+3、+4、+5のアミノ酸位置、変動し得る、と理解される。さらに、特定の位置に変異を有する他の配列の異型に対して言及が為される場合も常に、同じ理論的根拠が適用されると理解される。
別の態様では、より低量のmyb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む光沢のある淡紅色の果実を生産可能な本発明の植物は、y(黄色)対立遺伝子を含む。
配列番号1の異型が機能的であるかどうかは、表現型によって、すなわち、配列番号1の異型をコードする対立遺伝子についてホモ接合性であるトマト植物が、果実発達の赤熟期におけるトマト果実上に有色の(黄色〜オレンジ)表皮を生産する(この場合は機能的なMyb12タンパク質である)かどうかを判定することによって、試験可能である。
一つの実施態様において、本発明は、変異型myb12対立遺伝子がホモ接合型である場合に、前記一つまたは複数の変異が果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期において淡紅色の外見を示す前記植物の果実をもたらす、本発明の栽培トマト植物に関する。
別の実施態様において、本発明は、変異型myb12対立遺伝子がホモ接合型である場合に、またはy遺伝子がホモ接合型である場合に、野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性であるトマト(Solanum lycopersicum)と比較して、前記一つまたは複数の変異が果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期において淡紅色の外見を示す前記植物の果実をもたらす、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な栽培トマト植物に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は、変異型myb12対立遺伝子がホモ接合型である場合に、前記一つまたは複数の変異が、果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期におけるトマト果実の、野生型Myb12対立遺伝子(例えば、配列番号1のタンパク質をコードする)についてホモ接合性のトマト植物の表皮よりも色が薄い表皮、または無色の表皮を示す、前記植物の果実をもたらす、本発明の栽培トマト植物に関する。
一つの態様において、本発明は、受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子に見られ、前記種子から由来し得る、または入手され得る(または由来する、または入手される)myb12対立遺伝子を、1つまたは2つのコピーで、すなわち、ホモ接合型またはヘテロ接合型で含む、本発明の栽培トマト植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)に関する。ヘテロ接合型では、他の対立遺伝子は、野生型Myb12対立遺伝子、または本明細書で提供される他のmyb12変異体のうちのいずれか1つ等に由来する別の変異型myb12対立遺伝子、または、本明細書に記載の機能喪失型myb12タンパク質もしくは機能低減型myb12タンパク質をコードするあらゆる他の変異型myb12対立遺伝子であり得る。ヘテロ接合型では、他の対立遺伝子は、従って、機能低減型または機能喪失型のmyb12対立遺伝子であり得る。両方の対立遺伝子が機能低減型または機能喪失型のmyb12対立遺伝子である場合、野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性の植物と比較して、または、機能的(野生型もしくは異型)Myb12対立遺伝子について1つのコピーを含む(ヘテロ接合性の)植物と比較して、表皮は無色になるか、または色素沈着の有意な減少を有する。
一つの態様において、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子の植物と、別のトマト植物とを交雑することによって入手可能であり;別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である。
別の態様において、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子の植物から、前記種子から成長した植物と別のトマト植物とを交雑することによって入手可能であり、別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である。
別の態様において、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子の植物と、別のトマト植物とを交雑することによって入手可能であり、別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である。
このように、ホモ接合型である場合に無色果皮表現型を与えるNCIMB42087またはNCIMB42088の変異型myb12対立遺伝子を、従来の育種によってあらゆる他のトマト植物に導入することにより、赤熟したトマトに前記対立遺伝子が導入された場合に淡紅色の果実をつける品種を作製することができる。変異対立遺伝子はまた、黄色、緑、オレンジ等の他の果肉色を生み出すトマト植物にも導入可能である。果肉色を決定する遺伝子座がいくつか存在する(Sacks and Francis 2001, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126(2): 221-226を参照)。しかし、一つの態様では、赤色の果肉色を生み出すトマト植物との組合せによって、赤熟期における果実の全体的に淡紅色の外見が得られる。
さらに別の態様では、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子等における、変異型myb12対立遺伝子を含む。
さらに別の態様では、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子の植物と、別のトマト植物とを交雑することによって派生可能であり、別の態様では、この他の植物は、光沢のあるトマト果実を生産する、すなわち、クチクラ発達に関与する遺伝子の変異対立遺伝子を含む、特に、CD1、CD2およびCD3遺伝子から選択される変異型CD遺伝子を含む、植物である。変異型myb12対立遺伝子(またはy遺伝子)(例えば上記)をホモ接合型で含み、且つ、変異型cd対立遺伝子、特に、対立遺伝子にコードされるCD1、CD2またはCD3タンパク質に変異を含む変異型cd1、cd2またはcd3対立遺伝子を含む、交雑子孫を選択することにより、前記植物によって生産される果実は淡紅色で光沢のある表現型を有することとなる。
別の態様では、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087として寄託された種子の植物および別のトマト植物から入手可能であり、別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である(特に、変異型cd対立遺伝子、例えばcd1、cd2またはcd3、をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む植物)。
別の態様では、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42088として寄託された種子の植物および別のトマト植物から入手可能であり、別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である(特に、変異型cd対立遺伝子、例えばcd1、cd2またはcd3、をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む植物)。
別の態様では、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42088として寄託された種子の植物と別のトマト植物とを交雑することによって派生可能であり、別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である(特に、変異型cd対立遺伝子、例えばcd1、cd2またはcd3、をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む植物)。
別の態様では、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)は、受託番号NCIMB42087として寄託された種子の植物と別のトマト植物とを交雑することによって派生可能であり、別の態様では、この他の植物は光沢のあるトマト果実を生産する植物である(特に、変異型cd対立遺伝子、例えばcd1、cd2またはcd3、をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む植物)。
別の態様では、一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子は本発明の植物にホモ接合型で存在する。
一つの態様において、一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子は本発明の植物にヘテロ接合型で存在する。
一つの態様において、y遺伝子はホモ接合型で存在する。
一つの態様において、本発明は、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子をホモ接合型で含み(無色の果実表皮または有意に低減した色素沈着を有する表皮を生じる)、且つ一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(cd)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型でさらに含み、前記変異型cd対立遺伝子が前記変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較して増加した果実の光沢をもたらす、淡紅色で光沢のある果実を生産する(生産可能な)トマト(Solanum lycopersicum)栽培植物を開示する。一つの態様において、変異型cd対立遺伝子は、本明細書の別の場所に記載された対立遺伝子のうちの1つ、特に、配列番号11または配列番号15のタンパク質をコードする対立遺伝子等の変異型cd2対立遺伝子である。光沢の増加は、種々の方法により、例えば、視覚的または定量的に、例えば、光沢計を用いて、実施例に記載されるように光の反射を測定することにより、測定することができる。平均果実光沢は、野生型(変異型cd対立遺伝子を欠く/野生型の完全に機能的なCD対立遺伝子を含む)の果実よりも、統計的に有意により高いことが好ましい。従って、平均光沢は、品種M82、Moneymaker、および他の品種の果実等の、野生型(光沢が無い、色が鈍い)果実の平均光沢の、少なくとも1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍またはそれ以上であることが好ましい。
一つの態様において、本発明は、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子をホモ接合型で含み(無色の果実表皮または有意に低減した色素沈着を有する表皮を生じる)、且つ、クチクラ発達に関与する対立遺伝子に変異をさらに含み(CD遺伝子の変異対立遺伝子等)、前記変異が、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く植物と比較して、赤熟(RR)期におけるクチンの蓄積の少なくとも15%の増加もしくは減少(例えば、少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、もしくはさらには少なくとも90%、95%、97%、98%の増加もしくは減少)をもたらし;および/または、別の態様では、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における前記変異(CD遺伝子の変異対立遺伝子等)が、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く植物と比較して、少なくとも15%より厚いもしくは少なくとも15%より薄いクチクラ層(例えば、それぞれ、少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、もしくはさらには少なくとも90%、95%、97%、98%より厚いもしくはより薄いクチクラ層)をもたらす、淡紅色で光沢のある果実を生産する(生産可能な)トマト(Solanum lycopersicum)栽培植物を開示する。従って、一つの態様において、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における前記変異(CD遺伝子の変異対立遺伝子等)は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く植物の果実と比較して、RR期における果実の、クチクラの平均クチン含量の(統計的に)有意な増加または量および平均クチクラ層厚の(統計的に)有意な増加または減少の両方をもたらす。
別の態様では、本発明は、少なくとも15%の赤熟(RR)期におけるクチン蓄積の増加もしくは減少および/またはクチクラ層厚の増加もしくは減少(例えば、少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、またはさらには少なくとも90%、95%、97%、98%の増加または減少)をもたらす変異が、M82またはMoneymakerまたはTAPA等の野生型植物と比較される、本発明の植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物)に関する。
さらに別の態様では、クチン蓄積および/またはクチクラ厚は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を除いて、本発明の植物と同じ遺伝的特質を有する植物と比較される。
別の態様では、本発明は、クチンの量および/またはクチクラ層厚が、トマト(Solanum lycopersicum)の正常型栽培植物の70%未満である、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。さらに別の態様では、本発明は、クチンの量および/またはクチクラ層厚が、M82等(例えば、正常型/野生型植物)の、2つの野生型CD対立遺伝子(例えばCD2/CD2)を含む植物のそれの90%未満、85%未満、または70%未満である、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。例えば、クチンの量および/またはクチクラ層厚は、トマト(Solanum lycopersicum)の正常型栽培植物(変異型cd対立遺伝子を欠く)の、65%未満、例えば60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、またはさらには10%未満、またはさらには5%未満、または4%未満または3%未満または2%未満である。さらに別の態様では、クチンの量および/またはクチクラ層厚は、M82の、65%未満、例えば、60%、55%、50、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、またはさらには10%未満、またはさらには5%未満、4%未満、3%未満または2%未満である。
さらに別の態様では、本発明は、平均クチン量が、赤熟(RR)期において、850μg cm−2未満または700μg cm−2未満、または600もしくは500μg cm−2未満である、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。例えば、クチン層厚は、450μg cm−2未満、例えば、400μg cm−2未満、または350μg cm−2未満または300μg cm−2未満または250μg cm−2未満または200μg cm−2未満または150μg cm−2未満またはさらには100μg cm−2未満または50μg cm−2未満または40μg cm−2未満または20μg cm−2未満である(赤熟期において)。
果実クチクラの(平均)クチン量は、クチン単量体および蝋の解析下で、Isaacson et al. 2009(上記)375頁に記載されるように、クチン単量体レベルを測定することによって測定することができる。
さらに別の態様では、本発明は、平均クチクラ層厚が、赤熟期(RR)において11μm未満、10μm未満、8μm未満、6μm未満、4μm未満またはさらには2μm未満である、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。クチクラ層厚(または「クチクラ膜」)は、例えば、同じ表題下のIsaacson et al. 2009(上記)374頁および375頁に記載されるように、透過型電子顕微鏡法(TEM)、走査型電子顕微鏡法(Scanning Electron Microspcopy)(SEM)または光学顕微鏡法によって測定することができる。
既に記載したように、一つの態様において、平均クチン含量および平均クチクラ層厚は共に、変異対立遺伝子によって影響を受け、すなわち、上記の両方の値は前記2つの列挙から選択されるあらゆる組合せで組合せられる。
さらに別の態様では、本発明は、赤熟(RR)期における果実の光沢レベルが、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異(変異型cd1、cd2またはcd3対立遺伝子等)を欠く同一系統または野生型植物の果実の光沢レベルよりも少なくとも1.3倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍高い、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。一つの実施態様では、光沢レベルは、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠くが淡紅色の果実を生産する同一系統の(すなわち、同じ遺伝的特質を有する)植物と比較される。
さらに別の態様では、本発明は、赤熟(RR)期における淡紅色果実の光沢レベルが、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠く同一系統または野生型植物の果実の光沢レベルよりも少なくとも1.3倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍高い、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。一つの実施態様では、光沢レベルは、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を欠くが淡紅色の果実を生産する同一系統の(すなわち、同じ遺伝的特質を有する)植物と比較される。
Isaacson et al(上記参照)は、減少したクチクラ層厚(例えば、考察(Discussion)の5行目の「クチン含量における劇的な減少」を参照)および高度に光沢のある表現型を有する、3つの変異型系統(cd1、cd2、およびcd3)を開示している。これらの変異体は、「Genes that Make Tomatoes」のコレクションから入手された(Menda et al, 2004, In silico screening of a saturated mutation library of tomato, Plant Journal 38, pp 861-872)。Isaacsonは、cd2への原因変異をトマト染色体1に位置付けた。Isaacsonらは、タンパク質をG736Rとする原因変異を特許請求している。しかしながら、これは、Isaacsonらが論文の最後で参照しているタンパク質配列(すなわち、GenBank/EMBL受託番号GQ222185)と一致していない。Genbankタンパク質配列は、G736R変異を示しておらず、代わりに、野生型タンパク質配列(配列番号10に示される)と比較した場合の2つの他の変異を示している:野生型cd2配列の708位において、グルタミン(QまたはGln)がヒスチジン(HまたはHis)に置換されている(すなわち、Q708H変異);加えて、737位において、アスパラギン酸(DまたはAsp)がアスパラギン(NまたはAsn)に置換されている(すなわち、D737N変異)。
本発明者らはまた、CD2遺伝子に変異を含み、前記変異を欠く野生型植物よりも有意により光沢のある果実をもたらす変異型植物を特定したが、前記変異体はIsaacson 2009のアミノ酸置換、すなわちG736Vアミノ酸置換、とは異なるアミノ酸置換を有していた。G736V変異体を異なるmyb12変異体(淡紅色変異体)と組み合わせることにより、光沢のある淡紅色の果実を生産するトマト果実がもたらされた。
従って、本発明は、一つの態様において、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異がCD1、CD2、またはCD3遺伝子の対立遺伝子に存在する(例えば、Isaacson et al(上記参照)によって開示される、または本明細書の別の場所に記載される)、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。変異の結果、コードされるCD1、CD2またはCD3タンパク質が一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を含むことにより、果実光沢が有意に増加され、および/または、果実クチクラのクチンレベルが有意に増加もしくは減少され、および/または、クチクラ層厚が有意に増加もしくは減少され;あるいは、クチクラ発達に関与するCD2対立遺伝子における変異は、配列番号10における(配列番号11に示される)、または配列番号10に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する(且つ、前記異型はアミノ酸736位にバリンを有する)その異型(配列番号10の)における、G736V(グリシンからバリンへの置換)アミノ酸置換をもたらし;あるいは、クチクラ発達に関与するCD2対立遺伝子における変異は、配列番号10における、または配列番号10に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の異型における、Q708H(グルタミンからヒスチジン)および/またはD737N(アスパラギン酸からアスパラギン)アミノ酸置換をもたらす。Q708HおよびD737Nアミノ酸置換を有する配列番号10のアミノ酸配列は、配列番号15において開示され、Isaacson et al, 2009(The plant Journal 60, 363-377)に記載される植物から、例えば、e4393m2e系統(コーネル大学からの「Genes that make tomatoes」コレクションの)と変異対立遺伝子を欠く野生型トマト植物とを交雑することにより、得ることができる。すなわち、通常の育種を用いて、変異型cd2対立遺伝子を他のトマト植物に導入することができる。あるいは、TILLING等の方法を用いて、淡紅色の果実の光沢を増強するのに適した変異型cd2対立遺伝子を含む(変異型myb12対立遺伝子またはy遺伝子を含む)植物を特定することができる。
同様に、変異型cd1対立遺伝子および変異型cd3対立遺伝子は、コーネル大学からの「Genes that make tomatoes」コレクションにおいて入手可能な、変異型cd1対立遺伝子を含む植物系統(e4247m1系統)または変異型cd3対立遺伝子を含む植物系統(n3056m1系統)から得ることができる。あるいは、cd1およびcd2をクローニングおよび配列決定し、その後、光沢を増強する変異対立遺伝子(および前記対立遺伝子を含む植物)を、変異誘発を用いて新規に作製することができる。また、トマトのCD1配列はGenBank受託番号AEJ88779.1(タンパク質)およびJF968592(ゲノムDNA)において入手可能であるため、この配列に基づいて、果実光沢の増強をもたらすCD1標的遺伝子におけるTILLING変異体を特定することができる。
別の態様では、本発明は、変異型cd2対立遺伝子を含み、前記変異が、配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有し且つ前記G736Vアミノ酸置換を有するその(すなわち、配列番号10の)異型においてG736Vアミノ酸置換を含むcd2タンパク質の産生をもたらす(コードする)、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。さらに別の実施態様では、前記異型は、配列番号10に対して少なくとも80%、例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5%の配列同一性を有し、736位バリンを含み、野生型(機能的)異型CD2タンパク質と比較して増強された果実光沢を与える。
ある配列の「異型」におけるG736V等の特定の変異が言及される場合、アミノ酸の番号/位置は同じである必要はないと理解されるべきであり、すなわち、配列番号11の736位のバリンは、異型においては異なる位置番号を有していてもよい。しかし、当業者は、例えば、変異の前後の一連の、例えば5つの、アミノ酸(例えばVVMNGVDSAYV)を見ることによって、または、これらの配列を互いにアラインメントすることによって、それが異型における相当アミノ酸であるかどうかを容易に特定することができる。そのため、適切にペアワイズ・アラインメントが行われた場合、当業者は、高いアミノ酸配列同一性(これらのタンパク質の少なくとも80%、例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5%の同一性)により、異型タンパク質における相当アミノ酸を特定することができる。
さらに別の態様では、本発明は、配列番号10において、または、配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有し且つ前記Q708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換を有する配列番号10の異型において、Q708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換を有するCD2タンパク質をコードする変異型cd2対立遺伝子を含む、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。さらに別の実施態様では、前記異型は、配列番号10に対して少なくとも80%、例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5または99.9%の配列同一性を有し、野生型(機能的)異型CD2タンパク質と比較して増強された果実光沢を与える。
別の態様では、本発明は、配列番号13に記載の、または配列番号13に対して70%の核酸配列同一性を有し且つ2207位にチミンを有するその異型に記載のmRNAをコードする、変異型cd2対立遺伝子を含む、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。さらに別の実施態様では、前記異型は、配列番号13に対して少なくとも75%、80%、例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5または99.9%の配列同一性を有し、増強された光沢を与える変異型cd2タンパク質をコードする。
別の実施態様では、本発明は、配列番号12に記載の、または70%の核酸配列同一性を有し且つG2207Tヌクレオチド置換を有するその異型に記載のmRNAをコードする変異型cd2対立遺伝子を含む、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。さらに別の実施態様では、前記異型は、配列番号12に対して少なくとも75%、80%、例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5または99.9%の配列同一性を有し、増強された光沢を与える変異型cd2タンパク質をコードする。
さらに別の実施態様では、本発明は、配列番号11または配列番号15に記載の変異型cd2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。
さらに別の実施態様では、本発明は、以下のアミノ酸置換:G736V、D737Nおよび/またはQ708Hのうちの一つまたは複数を含む配列番号10に記載のCD2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。
さらに別の実施態様では、本発明は、配列番号14と実質的に同一な、具体的には、配列番号14と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%の配列同一性を有し、配列番号10にG736Vアミノ酸置換をコードする、ゲノムcd2配列を含む、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。さらなる実施態様では、ゲノムcd2配列は、配列番号14のヌクレオチド7171位にグアニン(g)からチミン(t)への(G7171T)変異を含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、前記変異型cd2対立遺伝子がヘテロ接合型で存在する、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。CD2/cd2植物が野生型CD2/CD2植物よりも有意により光沢のある果実を生産することが分かったことから、CD2/cd2(またはCD1/cd1;CD3/cd3)等のヘテロ接合型の変異型cd対立遺伝子の使用も、変異型myb12対立遺伝子(好ましくはホモ接合型)またはy遺伝子(好ましくはホモ接合型)と組み合わせて、淡紅色で光沢のある果実をもたらす、本発明の実施態様である。
さらに別の実施態様では、本発明は、前記変異型cd2対立遺伝子がホモ接合型で存在する、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。cd2/cd2植物が野生型CD2/CD2対立遺伝子を含む植物の果実よりはるかに光沢のある、非常に光沢のある果実を生産したことが分かったため、cd2/cd2(またはcd1/cd1;cd3/cd3)等のホモ接合型の変異型cd対立遺伝子の使用も、変異型myb12対立遺伝子(好ましくはホモ接合型)またはy遺伝子(好ましくはホモ接合型)と組み合わせて、淡紅色で光沢のある果実をもたらす、本発明の実施態様である。
なお、淡紅色対立遺伝子は、一つの態様において、異なる染色体上に存在することから複数の変異型cd遺伝子の積み重ね(stacking)も可能ではあろうが、CD1遺伝子、CD2遺伝子またはCD3遺伝子から選択されるクチクラ発達に関与する1つのみの遺伝子の変異体と組み合わされる。そのため、CD1、CD2またはCD3遺伝子(の変異対立遺伝子)のいずれか1つが、トマト植物において、変異型myb12対立遺伝子またはy遺伝子と組み合わせられ、一方で、前記トマト植物はその他のCD遺伝子については野生型(機能的)対立遺伝子を含む(例えば、変異型cd2対立遺伝子がホモ接合型またはヘテロ接合型で使用される場合、CD1遺伝子およびCD3遺伝子は野生型、機能的である)。
さらに別の実施態様では、本発明は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異が、NCIMB42268として寄託された種子に存在する変異型cd2対立遺伝子における変異である、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。従来の育種を用いることで、この対立遺伝子を、変異型myb12対立遺伝子またはy遺伝子と組み合わせることができる。
別の実施態様では、本発明は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異が、NCIMB42269として寄託された種子に存在する変異型cd2対立遺伝子における変異である、本発明の植物、すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な植物、に関する。従来の育種を用いることで、この対立遺伝子を、変異型myb12対立遺伝子またはy遺伝子と組み合わせることができる。
さらに別の態様では、本発明の栽培トマト植物(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産可能な)はF1雑種である。F1雑種は、2つの本発明の変異型myb12対立遺伝子を含むことが好ましい。さらなる態様において、F1雑種は2つの本発明の変異型cd2対立遺伝子を含む。別の態様では、F1雑種は、2つの本発明の変異型myb12対立遺伝子、および1つまたは2つの本発明の変異型cd2対立遺伝子を含む。F1雑種は2つの近交系親系統から作製され、これも本発明の一つの態様であるが、これは、これらの親系統が少なくとも1つの変異型myb12対立遺伝子、または所望により2つの変異型myb12対立遺伝子(myb12についてホモ接合性)を含むためである。あるいは、これらの親系統は本発明の少なくとも1つの変異型myb12対立遺伝子および1つの変異型cd2対立遺伝子を含む。一つの態様において、前記親系統は本発明の2つの変異型myb12対立遺伝子および2つの変異型cd2対立遺伝子を含む。
本発明はまた、本発明の植物に成長可能な種子に関する。
別の態様では、本発明は、本発明の植物に成長可能な種子を含有する容器に関する。
さらに別の態様では、本発明は、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含み、または、y遺伝子を含み、さらに、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を含むことで、すなわち、cd2等の変異型cd対立遺伝子を含むことで、果実光沢の有意な増強がもたらされる、本発明の(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産することが可能な)植物の植物部位に関する。前記変異対立遺伝子は植物のゲノムにおいて組合せられるため、植物および植物部位の全ての栄養細胞が前記組合せを含む。加えて、いくつかの生殖細胞(花粉、子房)はまた、前記組合せを保持する。そのため、一つの態様において、本明細書に記載の変異対立遺伝子を有する栄養細胞を含む全ての栄養細胞および植物部位も包含され、変異対立遺伝子を保持する生殖細胞も同様に包含される。
一つの態様において、本発明は、ゲノム内に変異対立遺伝子の組合せを含む、例えば、トマト果実、種子、花粉、細胞または子孫等の本発明の植物の植物部位に関する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産することが可能な)植物の、植物および植物部位(例えば、トマト果実、種子、花粉、細胞または子孫)に関し、前記植物および植物部位は、
配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性(例えば、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、G50Rアミノ酸置換を有する、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異を含む、myb12対立遺伝子;
配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性(例えば、0%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異を含む、myb12対立遺伝子;および
y(黄色)遺伝子
からなる群から選択される、一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み;
前記植物または植物部位は、
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子;
並びに、
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、Q708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子、
からなる群から選択されるクチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異をさらに含む。
配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性(例えば、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、G50Rアミノ酸置換を有する、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異を含む、myb12対立遺伝子;
配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性(例えば、0%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異を含む、myb12対立遺伝子;および
y(黄色)遺伝子
からなる群から選択される、一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み;
前記植物または植物部位は、
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子;
並びに、
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、Q708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子、
からなる群から選択されるクチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異をさらに含む。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産することが可能な)植物の、植物または植物部位(例えば、トマト果実、種子、花粉、細胞または子孫)に関し、前記植物または植物部位は、配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、G50Rアミノ酸置換を有する、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、前記植物または植物部位は、
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子、
並びに
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、Q708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子
からなる群から選択される、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異をさらに含む。
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子、
並びに
配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)を有するその異型において、Q708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子
からなる群から選択される、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異をさらに含む。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の(すなわち、光沢のある淡紅色の果実を生産することが可能な)植物の、トマト植物および植物部位(例えば、トマト果実、種子、花粉、細胞または子孫)に関し、前記トマト植物および植物部位は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1に、または配列番号1に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%)を有するその異型に、アミノ酸61〜338の欠失を含み、前記植物部位は、配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%)のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす、クチクラ発達に関与する対立遺伝子、特にcd2対立遺伝子、に変異をさらに含み;一つの態様では、配列番号1に対して90%の配列同一性を有する異型が、配列番号10に対して少なくとも75%(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の異型と組み合わされ;別の態様では、配列番号1に対して95%の配列同一性を有する異型が、配列番号10に対して少なくとも75%(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の異型と組み合わされ;別の態様では、配列番号1に対して99%の配列同一性を有する異型が、配列番号10に対して少なくとも75%(例えば、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または99.8%等)のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の異型と組み合わされる。一つの態様において、上記組合せのうちのいずれかを含むトマト果実は、前記myb12対立遺伝子がホモ接合型である場合に、果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において淡紅色の外見を示す。一つの態様において、上記組合せのうちのいずれかを含むトマト果実は、前記myb12対立遺伝子がホモ接合型である場合に、果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において淡紅色で光沢のある外見を示す。
一つの態様において、本発明は、本発明の植物のトマト果実、種子、花粉、植物部位、細胞または子孫に関し、前記トマト果実、種子、花粉、植物部位、細胞または子孫は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、G50Rアミノ酸置換を有し;
または、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む。
または、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む。
あらゆるトマト植物の組織、細胞、果実、花粉、花、またはトマト植物の他の部分における本発明の変異型myb12対立遺伝子の1つまたは2つのコピーの存在は、標準的な分子生物学的手法を用いて、内在性の対立遺伝子(ゲノムDNA)、mRNA(cDNA)またはタンパク質の存在を検出することによって決定することができる。例えば、PCR、配列決定、ELISAアッセイまたは他の手法が使用され得る。
あらゆるトマト植物の組織、細胞、果実、花粉、花、またはトマト植物の他の部分における本発明の変異型cd2対立遺伝子の1つまたは2つのコピーの存在は、標準的な分子生物学的手法を用いて、内在性の対立遺伝子(ゲノムDNA)、mRNA(cDNA)またはタンパク質の存在を検出することによって決定することができる。例えば、PCR、配列決定、ELISAアッセイまたは他の手法が使用され得る。
また本発明は、トマト果実が果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において淡紅色の外見を示し、植物および植物部位が本発明の変異型myb12対立遺伝子についてホモ接合性である、本発明の植物のトマト果実に関する。一つの態様において、本発明は、トマト果実が、野生型Myb12対立遺伝子、例えば、配列番号1のタンパク質をコードする対立遺伝子、についてホモ接合性であるトマト(Solanum lycopersicum)と比較して、果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において淡紅色の外見を示す、本発明の植物のトマト果実に関する。
また本発明は、トマト果実が果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において光沢のある淡紅色の外見を示し、植物および植物部位が本発明の変異型myb12対立遺伝子についてホモ接合性である、本発明の植物のトマト果実に関する。一つの態様において、本発明は、トマト果実が、野生型Myb12対立遺伝子、例えば、配列番号1のタンパク質をコードする対立遺伝子、についてホモ接合性であり、且つ、野生型CD2対立遺伝子、例えば、配列番号10のタンパク質をコードする対立遺伝子、についてホモ接合性である、トマト(Solanum lycopersicum)と比較して、果実発達の後期オレンジ色期および赤色期において光沢のある淡紅色の外見を示す、本発明の植物のトマト果実に関する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の植物から得られる果実または前記果実の一部を含む、またはそれから成る、食物または食品に関する。繰り返しになるが、食物または食品中の本発明の変異型cd2対立遺伝子または変異型myb12対立遺伝子等の変異対立遺伝子の1つまたは2つのコピーの存在は、特に、食物または食品が新鮮果実組織を含むまたはそれから成る場合、標準的な分子生物学的手法によって検出することができ;組織の種類に依っては、本発明の植物の果実の淡紅色で光沢のある表現型を見せることが難しい場合がある。トマトペースト、トマトスープまたはトマトソース等の高度に加工された食品においては、変異型myb12対立遺伝子、またはその断片(myb12対立遺伝子のゲノムDNA断片)、または変異型myb12タンパク質を検出することが難しい場合があるが、それは、これらが加工中に破壊されている場合があるためである。これらの製品においては、解析は早期に実行される必要がある。
別の態様では、本発明は、本発明の植物から得られる果実または果実の一部を含む組成物に関する。また、本発明の植物の栄養繁殖も本明細書に包含される一つの態様である。同様に、新鮮なうちの消費(fresh consumption)のための、または加工するための、または加工形態の、収穫された果実および果実部分も、包含される。果実は、等級分けされ、大きさで分類され、および/または梱包されてもよい。果実はスライスもしくはダイスカットまたはさらに加工されてもよい。
なお、本発明の変異対立遺伝子は、あらゆる種類の栽培トマト、すなわち、様々な形状(丸い、長方形の、細長い、セイヨウナシ形の(pear)、等)および大きさ(チェリートマト(cherry)、マイクロトマト(micro)、ミニトマト(mini)、ビーフステーキトマト(beefsteak)、グレープトマト(grape)、スライシングまたはグローブトマト(slicing or globe)、プラムトマト(plum)、ペアートマト(pear)等)の果実を生産する栽培トマトに導入することができる。前記果実は二房室型または多房室型であり得る。従って、そのようなあらゆる種類が、本発明の淡紅色で光沢のある果実を生産することができる。淡紅色で光沢のある特徴はまた、WO2013135726に記載のインテンス(intense)果実表現型とも組み合わせることができる。
また、本発明は、ハイブリッドトマト(Solanum lycopersicum)植物を作製する方法に関し、該方法は、
(a)本発明の(例えば、請求項1〜17のいずれか一項からの)、または本発明の植物に成長可能な植物から得られる種子(例えば、請求項18に記載の)から、第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を入手すること;および
(b)前記第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を第二のトマト(Solanum lycopersicum)植物と交雑して雑種種子を得ること
を含み、
前記雑種種子から成長した前記ハイブリッドトマト(Solanum lycopersicum)植物は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、G50Rアミノ酸置換を有し;
あるいは、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型の、アミノ酸61〜338の欠失を含み;または、前記植物は、y(黄色)遺伝子を含む。
(a)本発明の(例えば、請求項1〜17のいずれか一項からの)、または本発明の植物に成長可能な植物から得られる種子(例えば、請求項18に記載の)から、第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を入手すること;および
(b)前記第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を第二のトマト(Solanum lycopersicum)植物と交雑して雑種種子を得ること
を含み、
前記雑種種子から成長した前記ハイブリッドトマト(Solanum lycopersicum)植物は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、G50Rアミノ酸置換を有し;
あるいは、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型の、アミノ酸61〜338の欠失を含み;または、前記植物は、y(黄色)遺伝子を含む。
一つの態様において、段階b)で生産された種子から成長した植物はまた、からなる群から選択される変異を含むcd2対立遺伝子等の、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を含む:配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異、並びに、配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてQ708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異。
一つの態様において、段階b)で生産された種子から成長した植物は、配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG736Vアミノ酸置換の生成をもたらす、cd2対立遺伝子等の、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を含み;加えて、これらの植物は、一つもしくは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を有し、前記変異は、変異型myb12タンパク質の産生をもたらし、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG50Rアミノ酸置換を有し;もしくは、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型のアミノ酸61〜338の欠失を含み;または、前記植物はy(黄色)遺伝子を含む。
また、一つの態様において、トマト(Solanum lycopersicum)植物は、本発明の植物であり、すなわち、少なくとも1つの本発明の変異型cd2およびmyb12対立遺伝子を含む。得られるF1雑種種子、および前記種子から成長した植物は、少なくとも1つ、好ましくは2つの変異型cd2対立遺伝子、および1つ、好ましくは2つの変異型myb12対立遺伝子、好ましくは2つの同一のcd2対立遺伝子および2つの同一のmyb12対立遺伝子を含む。F1雑種種子(およびそれから成長した植物)は、従って、一つの態様において、本発明のmyb12対立遺伝子についてホモ接合性であり、且つ、本発明のcd2対立遺伝子についてもホモ接合性である。
さらに別の実施態様では、変異型myb12対立遺伝子は、栽培トマト(例えば、育種系統、品種または伝播品種)またはトマトの近縁野生種に由来し、および/または、それにおいて生成される。このような人為的突然変異は、例えば、EP1963505に記載されるような標的変異を用いて誘導され得る。トマトの近縁野生種で生成された変異型myb12対立遺伝子は、次に、育種によって栽培トマトに容易に導入される。同様に、変異型cd2対立遺伝子は、栽培トマト(例えば、育種系統、品種または伝播品種)またはトマトの近縁野生種に由来し得る、および/または、それにおいて生成され得る。このような人為的突然変異は、例えば、EP1963505に記載されるような標的変異を用いて誘導され得る。トマトの近縁野生種で生成された変異型myb12対立遺伝子は、次に、育種によって栽培トマトに容易に導入される。NCIMB42087に存在する変異型myb12対立遺伝子(配列番号2のmyb12タンパク質をコードする)は、例えば、NCIMB42268として寄託された単一トマト植物において、NCIMB42269に存在するような変異型cd2対立遺伝子(配列番号11のcd2タンパク質をコードする)と組み合わされている。
別の態様では、本発明は、配列番号2もしくは配列番号3に対する実質的な配列同一性を有する、または、配列番号2もしくは配列番号3のタンパク質と100%同一である、機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型myb12タンパク質をコードする、内因性myb12対立遺伝子をホモ接合型で含むことから、野生型(Myb12/Myb12)植物と比較した場合に、果実発達の後期オレンジ色期または赤色期において色の薄い表皮および/または無色表皮および/または淡紅色のトマト果実を有する、本発明のトマト植物に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号2もしくは配列番号3に対する実質的な配列同一性を有する、または、配列番号2もしくは配列番号3のタンパク質と100%同一である、機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型myb12タンパク質をコードする、内因性myb12対立遺伝子をホモ接合型で含むことから、野生型(Myb12/Myb12)植物と比較した場合に、果実発達の後期オレンジ色期または赤色期(例えば、赤熟期)において色の薄い表皮および/または無色表皮および/または淡紅色のトマト果実を有し、さらに、G736V、D737NおよびQ708Hから選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む配列番号10のCD2タンパク質をコードする内因性cd2対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、野生型(CD2/CD2)植物の果実と比較した場合に果実発達の赤色期(RR期)において有意により光沢のある;および/または、野生型(CD2/CD2)植物の果実と比較した場合に果実発達の赤色期(RR期)において有意により高いもしくはより低いクチン含量を含む、および/または、野生型(CD2/CD2)植物の果実と比較した場合に果実発達の赤色期(RR期)において有意により厚いもしくはより薄いクチクラ層を含む、果実を生産する、本発明のトマト植物に関する。
別の実施態様では、本発明は、配列番号2もしくは配列番号3に対する実質的な配列同一性または配列番号2もしくは配列番号3に対する100%の配列同一性を有する、単離タンパク質に関する。さらなる別の実施態様では、本発明は、配列番号2もしくは配列番号3に対する実質的な配列同一性または配列番号2もしくは配列番号3に対する100%の配列同一性を有するタンパク質をコードする、単離核酸配列に関する。
別の実施態様では、本発明は、配列番号11に対する実質的な配列同一性または配列番号11に対する100%の配列同一性を有する、単離タンパク質に関する。さらなる別の実施態様では、本発明は、配列番号11に対する実質的な配列同一性または配列番号11に対する100%の配列同一性を有するタンパク質をコードする、単離核酸配列に関する。
さらに別の実施態様では、本発明は、配列番号5もしくは配列番号6に対する実質的な配列同一性を有する、もしくは配列番号5もしくは配列番号6に対して100%の配列同一性を有する、単離核酸配列、DNAもしくはRNA;または、配列番号5もしくは配列番号6に対する実質的な配列同一性を有する、もしくは配列番号5もしくは配列番号6に対して100%の配列同一性を有する核酸配列に転写されている、単離核酸配列、に関する。
さらに別の実施態様では、本発明は、配列番号13に対する実質的な配列同一性を有する、もしくは配列番号13に対して100%の配列同一性を有する、単離核酸配列、DNAもしくはRNA;または、配列番号13に対する実質的な配列同一性を有する、もしくは配列番号13に対して100%の配列同一性を有する核酸配列に転写されている、単離核酸配列、に関する。
本発明のさらに別の態様では、Expert Solution(EPC2000、Rule32(1))に従い、ブダペスト条約に従って、その代表的な種子がNunhems B.V.によって寄託され、NCIMB Ltd.(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA、英国)において2012年12月5日に寄託が受諾された、本発明のトマト植物の果実と同じまたは類似の表皮および/または果皮色を果実発達の赤熟期において有する、トマト植物が提供される。種子は以下の受託番号:NCIMB42087(変異体2961)またはNCIMB42088(変異体5505)を与えられた。
本発明のさらなる態様において、その代表的な種子がNCIMB42268(変異体8.17)およびNCIMB42269(変異体26428.001)としてNunhems B.Vによって寄託された、本発明のトマト植物の果実と、同一もしくは類似の果実発達の赤熟期における光沢、および/または同一もしくは類似のクチン含量、および/または同一もしくは類似のクチクラ層厚を有する、トマト植物が提供される。
本発明のさらなる態様において、NCIMB42268(変異体8.17;cd2/cd2)またはNCIMB42269(変異体26428.001;cd2/cd2)として寄託された種子から成長した植物を、cd2変異体を欠く(CD2遺伝子について野生型である、CD2/CD2)別のトマト植物と交雑することから得られたF1トマト植物の果実と、同一もしくは類似の果実発達の赤熟期における光沢、および/または同一もしくは類似のクチン含量、および/または同一もしくは類似のクチクラ層厚を有する、トマト植物が提供される。
本発明のさらに別の態様では、その代表的な種子がNCIMB42268(変異体8.17;myb12/myb12およびcd2/cd2)としてNunhems B.Vによって寄託された、本発明のトマト植物の果実と;またはNCIMB42268と野生型トマト植物(Myb12/Myb12およびCD2/CD2)との交雑によって得られたF1植物の果実と、同一または類似の光沢(および/またはクチン含量および/またはクチクラ層厚)並びに同一または類似の表皮および/または果皮色を果実発達の赤熟期において有する、トマト植物が提供される。
「同一または類似の」とは、特徴(例えば、色;光沢;クチン含量;クチクラ厚)が、記述および/または寄託された植物の特徴と統計的に有意に異なっていないこと;言い換えれば、特徴について比較された植物(または植物系統または品種)の間で統計的に有意な差異が見られないこと(例えば、一元配置ANOVAにおいて、P値が、有意差が無いことを示す0.05超である)、を意味する。
さらなる態様により、本発明は、本発明のトマト植物の細胞培養物または組織培養物を提供する。細胞培養物または組織培養物は再生可能な細胞を含む。このような細胞または組織は、本発明のトマト植物の葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、葯、花、種子または茎に由来し得る。別の実施態様では、細胞培養物または組織培養物は再生可能な細胞を含まない。一つの態様において、本発明の非増殖性細胞が提供され、本発明の非増殖性細胞を含む、またはそれから成る細胞培養物または組織培養物が提供される。
本発明の一つの態様は、本発明のトマト植物を作製する方法であり、前記方法は、以下の段階を含む:
a. トマト植物の植物材料(plant material)、好ましくは種子、を入手すること;
b. 前記植物材料を変異誘発物質で処理して変異誘発された植物材料、例えば変異誘発種子、を生成すること;
c. 前記変異誘発された植物材料、例えば、変異誘発種子または自家受粉により得られたその子孫、を解析すること、並びに
配列番号7に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのmyb12対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有する植物を特定すること;並びに/または、
配列番号14に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのcd2対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有する植物を特定すること;または、
配列番号7に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのmyb12対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有し、且つ、配列番号14に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのcd2対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有する、植物を特定すること。
前記方法は、前記少なくとも1つのmyb12対立遺伝子を含む植物、または自家受粉によって得られたその子孫を、前記少なくとも1つのcd2対立遺伝子を含む前記植物と、または自家受粉によって生産されたその子孫と、交雑して、前記myb12対立遺伝子および前記cd2対立遺伝子の両方を含む植物をえること、をさらに含んでいてもよい。
a. トマト植物の植物材料(plant material)、好ましくは種子、を入手すること;
b. 前記植物材料を変異誘発物質で処理して変異誘発された植物材料、例えば変異誘発種子、を生成すること;
c. 前記変異誘発された植物材料、例えば、変異誘発種子または自家受粉により得られたその子孫、を解析すること、並びに
配列番号7に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのmyb12対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有する植物を特定すること;並びに/または、
配列番号14に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのcd2対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有する植物を特定すること;または、
配列番号7に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのmyb12対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有し、且つ、配列番号14に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのcd2対立遺伝子において、もしくはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有する、植物を特定すること。
前記方法は、前記少なくとも1つのmyb12対立遺伝子を含む植物、または自家受粉によって得られたその子孫を、前記少なくとも1つのcd2対立遺伝子を含む前記植物と、または自家受粉によって生産されたその子孫と、交雑して、前記myb12対立遺伝子および前記cd2対立遺伝子の両方を含む植物をえること、をさらに含んでいてもよい。
前記方法は、選択された植物または前記植物の子孫のトマト果実の色または光沢を解析し、その果実が淡紅色またはやや淡紅色を有する植物を選択すること、をさらに含み得る。一つの態様において、前記変異は、配列番号1に、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型に、G50Rからなる群から選択されるアミノ酸置換をもたらす変異から選択され;または、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1の、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む。さらなる態様において、前記変異は、配列番号4においてG148CおよびT182Aからなる群から選択されるcDNAにおける変化を引き起こす変異から選択される。
この方法の、段階c)において、配列番号14に対する実質的な配列同一性を有する少なくとも1つのcd2対立遺伝子において、またはその機能的異型において、少なくとも1つの変異を有するcd2対立遺伝子を含む、植物材料が特定され得る。1つのcd2対立遺伝子におけるこの少なくとも1つの変異は、一つの態様では、配列番号10に、もしくは配列番号10に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型に、G736Vおよび/またはD737Nおよび/またはQ708Hアミノ酸置換をもたらす変異である。さらに別の実施態様では、1つのcd2対立遺伝子におけるこの少なくとも1つの変異は、配列番号14におけるG7171T変異を含む。
この方法において、段階a)の植物材料は、トマト植物系統または栽培品種の種子、花粉、植物細胞、または植物組織からなる群から選択されことが好ましい。植物種子がより好ましい。別の態様では、この方法で使用される変異誘発物質はエチルメタンスルホン酸である。段階b)および段階c)において、変異誘発された植物材料は、トマトTILLING集団等の変異型集団であることが好ましい。従って、一つの態様において、変異型myb12対立遺伝子を含むトマト植物を生産する方法が提供され、前記方法は以下の段階を含む:
a) トマトTILLING集団を用意すること、
b) myb12遺伝子における変異体を求めて前記TILLING集団を選別すること、および
c) その果実が野生型(Myb12/Myb12)果実と比較して無色の表皮または色の薄い表皮を生産する植物(またはそれらの植物の子孫)をb)の変異型植物から選択すること。
別の態様では、変異型cd2対立遺伝子を含むトマト植物を生産する方法が提供され、前記方法は以下の段階を含む:
i) トマトTILLING集団を用意すること、
ii) cd2遺伝子における変異体を求めて前記TILLING集団を選別すること、および
iii) その果実が野生型(CD2/CD2)果実と比較してより光沢のある植物(またはそれらの植物の子孫)をb)の変異型植物から選択すること。
従って、別の態様では、変異型myb12およびcd2対立遺伝子を含む本発明のトマト植物を生産する方法が提供され、前記方法は、段階c)で選択された植物(または自家受粉によって生産されたその子孫)を、段階iii)で選択された植物と(または自家受粉によって生産されたその子孫と)交雑する段階、並びに、子孫植物を自家受粉させ、淡紅色で光沢のある果実を生産する子孫を選択する段階、を含む。
a) トマトTILLING集団を用意すること、
b) myb12遺伝子における変異体を求めて前記TILLING集団を選別すること、および
c) その果実が野生型(Myb12/Myb12)果実と比較して無色の表皮または色の薄い表皮を生産する植物(またはそれらの植物の子孫)をb)の変異型植物から選択すること。
別の態様では、変異型cd2対立遺伝子を含むトマト植物を生産する方法が提供され、前記方法は以下の段階を含む:
i) トマトTILLING集団を用意すること、
ii) cd2遺伝子における変異体を求めて前記TILLING集団を選別すること、および
iii) その果実が野生型(CD2/CD2)果実と比較してより光沢のある植物(またはそれらの植物の子孫)をb)の変異型植物から選択すること。
従って、別の態様では、変異型myb12およびcd2対立遺伝子を含む本発明のトマト植物を生産する方法が提供され、前記方法は、段階c)で選択された植物(または自家受粉によって生産されたその子孫)を、段階iii)で選択された植物と(または自家受粉によって生産されたその子孫と)交雑する段階、並びに、子孫植物を自家受粉させ、淡紅色で光沢のある果実を生産する子孫を選択する段階、を含む。
変異型植物(M1)は、一回または複数回自家受粉されて、段階c)における表現型検査のための、例えばM2集団または好ましくはM3もしくはM4集団が生産されることが好ましい。M2集団において、前記変異対立遺伝子は、1(変異対立遺伝子についてホモ接合性):2(変異対立遺伝子についてヘテロ接合性):1(野生型 対立遺伝子についてホモ接合性)の割合で存在する。
さらに別の態様において、本発明は、ハイブリッドトマト(Solanum lycopersicum)植物を生産する方法に関し、前記方法は、
(a) 本発明の、または本発明の植物に成長可能な種子由来の、第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を入手する工程;および
(b) 前記第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を第二のトマト(Solanum lycopersicum)植物と交雑して雑種種子を得る工程;
を含んでなり、
前記ハイブリッドトマト(Solanum lycopersicum)植物は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG50Rアミノ酸置換を有する、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つもしくは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み;
または、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1のアミノ酸61〜338の欠失、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型におけるアミノ酸61〜338(もしくはアミノ酸61からタンパク質の末端まで)の欠失を含み;
さらに、前記植物は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異、特に、配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子、並びに、配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてQ708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子からなる群から選択されるcd2対立遺伝子を含む。
(a) 本発明の、または本発明の植物に成長可能な種子由来の、第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を入手する工程;および
(b) 前記第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を第二のトマト(Solanum lycopersicum)植物と交雑して雑種種子を得る工程;
を含んでなり、
前記ハイブリッドトマト(Solanum lycopersicum)植物は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG50Rアミノ酸置換を有する、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つもしくは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み;
または、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1のアミノ酸61〜338の欠失、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型におけるアミノ酸61〜338(もしくはアミノ酸61からタンパク質の末端まで)の欠失を含み;
さらに、前記植物は、クチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異、特に、配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてG736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子、並びに、配列番号10または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するその異型においてQ708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd2対立遺伝子からなる群から選択されるcd2対立遺伝子を含む。
本発明の植物および植物部位(例えば、果実、細胞等)は、変異型myb12対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
一つまたは複数の変異型myb12対立遺伝子を含み、且つ、配列番号1または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列類似性を有するその異型においてG50Rアミノ酸置換を有する変異型myb12タンパク質を産生し;
または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1に、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型にアミノ酸61〜338の欠失を含む、
本発明の植物は、野生型植物よりも少ない果実を生産しないことが好ましい。従って、植物当たりの果実数は減少しないことが好ましい。
または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1に、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型にアミノ酸61〜338の欠失を含む、
本発明の植物は、野生型植物よりも少ない果実を生産しないことが好ましい。従って、植物当たりの果実数は減少しないことが好ましい。
他の推定上のMYB12遺伝子/タンパク質は、コンピュータで、例えば、既存の核酸またはタンパク質データベース(例えば、GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)において、配列類似性検索ツール(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等)等の標準的な配列解析ソフトウェアを用いて、核酸配列またはタンパク質配列を特定することにより、特定することができる。
一つの実施態様では、機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型変異型myb12タンパク質(野生型トマト近縁体のmyb12タンパク質等の異型またはオルソログを含む)が提供され、植物および植物部位が、機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型変異体をコードする一つまたは複数のmyb12対立遺伝子をそれらのゲノム内に含むことによって、機能低減型が、野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性であるトマト(Solanum lycopersicum)と比較して、変異対立遺伝子がホモ接合型である場合に、淡紅色のトマト果実(ホモ接合型myb12変異体と赤色果肉の組合せにおいて)並びに/または色の薄い表皮および/もしくは無色表皮を与える。
別の実施態様では、配列番号1に対して少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有する;または配列番号1に対して少なくとも約90%、93%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%、もしくは100%のアミノ酸配列同一性を有する、変異タンパク質が提供される。別の実施態様では、配列番号1の、または配列番号1に対して少なくとも約90%、93%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%、もしくは100%のアミノ酸配列同一性を有する配列の、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、または150個の連続アミノ酸を含み、配列番号1におけるG50Rアミノ酸置換を含む、そのような変異タンパク質の断片が提供される。さらなる別の実施態様では、そのようなタンパク質またはタンパク質断片をコードする核酸配列が提供される。
さらに別の実施態様では、果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期においてトマト果実の無色表皮を得るための、トマト植物における、本明細書で定義される、変異タンパク質またはその異型、またはその断片の使用が提供される。このようなタンパク質またはタンパク質断片をコードする核酸の使用も提供される。
cDNA(配列番号4、またはその異型)を含むゲノムDNAにおける、いかなる種類の変異も(例えば、一つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換)、コードされるMyb12タンパク質の機能の低下をもたらし得る。しかし、全ての変異が、本明細書に含まれる実施例で説明されるように、無色表皮を生じさせるわけではない。好ましい実施態様において、例えば野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性であるトマト(Solanum lycopersicum)と比較した場合に、淡紅色のトマト果実(ホモ接合型myb12変異体と果肉の組合せにおいて)並びに/または色の薄い表皮および/もしくは無色表皮をもたらす、一つまたは複数の変異による機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型myb12タンパク質をコードする、myb12核酸配列が提供さる。
同様に、野生型CD対立遺伝子についてホモ接合性であるトマト(Solanum lycopersicum)と比較した場合に、赤色期における果実光沢の増強、および/または有意により高いもしくはより低いクチンレベル、および/または有意により厚いもしくはより薄いクチクラ層をもたらす、一つまたは複数の変異による機能喪失型CDタンパク質または機能低減型CDタンパク質(例えば、変異型cd1、cd2またはcd3タンパク質)をコードする、cd核酸配列が提供される。
インビボにおける機能喪失型myb12タンパク質またはこのようなタンパク質の機能低減型は、本明細書に記載のように、この変異対立遺伝子が、ホモ接合型において、後期オレンジ色期もしくは赤熟期のトマト果実の表皮の色に対して有する影響を決定することにより、または、後期オレンジ色期または赤熟期のトマト果実におけるトマト果実の色に対する変異の影響を決定することにより、試験することができ;ホモ接合型変異対立遺伝子が赤色果肉と組み合わされている場合、果実色は淡紅色になる。このような変異型の機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型タンパク質をコードする核酸配列を含み、野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と所望により比較した場合に、後期オレンジ色期および/または赤熟期において色の薄い表皮および/または無色表皮および/または淡紅色のトマト果実を有する植物は、例えば、例えば変異誘発を用いて新規に作製することができ、当該技術分野において公知のTILLINGによって特定することができる。
CDタンパク質のインビボにおける機能喪失または機能低減は、本明細書に記載されるように、この変異対立遺伝子が、ホモ接合型またはヘテロ接合型で、果実の赤熟期における光沢、クチン含量および/またはクチクラ層厚に対して有する影響を決定することによって、試験することができる。
また、遺伝子導入法を用いて、変異型のmyb12タンパク質またはcdタンパク質をコードする変異型のmyb12対立遺伝子またはcd対立遺伝子のインビボにおける機能性を試験することができる。変異対立遺伝子が植物プロモーターに機能的に連結され、キメラ遺伝子が形質転換によってトマト植物に導入され得る。再生植物(または、例えば自家受粉によって得られた子孫)が、後期オレンジ色期および/または赤熟期における表皮色および/またはトマト果実色について試験され得る。例えば、非機能的なmyb12対立遺伝子またはcd対立遺伝子を含むトマト植物が形質転換されて、遺伝子導入myb12対立遺伝子またはcd対立遺伝子の機能性が試験され得る。
TILLING(ゲノム内誘導性局所破壊標的化(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))は、従来の化学的突然変異誘発法を用いて、変異発見のためのハイスループットスクリーニングを後に受ける変異誘発された個体のライブラリーを作製する、一般的な逆遺伝学の手法である。TILLINGは、化学的突然変異誘発とプールされたPCR産物の変異スクリーニングとを組合せることで、標的遺伝子のミスセンス変異対立遺伝子およびナンセンス変異対立遺伝子の単離を得る。従って、TILLINGは、従来の化学的突然変異誘発(例えば、EMSまたはMNU変異誘発)または他の変異誘発法(例えば、UV等の照射)を使用し、それに続いて、本発明のMyb12等の特定の標的遺伝子における変異についてのハイスループットスクリーニングを使用する。CEL1またはENDO1等のS1ヌクレアーゼが、変異型および野生型標的DNAのヘテロ二本鎖の切断、並びに、例えば、LI−CORゲルアナライザーシステム等の電気泳動を用いた切断産物の検出に使用される(例えばHenikoff et al. Plant Physiology 2004, 135: 630-636を参照)。TILLINGは、トマト(http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling参照)、イネ(Till et al. 2007, BMC Plant Biol 7: 19)、シロイヌナズナ(Till et al. 2006, Methods Mol Biol 323: 127-35)、アブラナ属、トウモロコシ(Till et al. 2004, BMC Plant Biol 4: 12)等の多くの植物種で応用されている。
本発明の一つの実施態様において、係る変異型myb12または変異型cdタンパク質をコードする(cDNAまたはゲノム)核酸配列は、一つまたは複数のナンセンス変異および/またはミスセンス変異、例えば、塩基転位(プリンの別のプリンとの置換(A⇔G)またはピリミジンの別のピリミジンとの置換(C⇔T))または塩基転換(プリンのピリミジンとの置換、またはその逆(C/T⇔A/G) を含む。一つの実施態様では、ナンセンス変異および/またはミスセンス変異は、Myb12エクソンもしくはCDエクソンのいずれかをコードするヌクレオチド配列、または、異型Myb12タンパク質もしくは異型CDタンパク質の実質的に類似したドメイン、すなわち、配列番号1(Myb12)もしくは配列番号10(CD2)のアミノ酸に対して、もしくはその異型に対して、少なくとも80%、90%、95%、98%、99%のアミノ酸配列同一性を含むドメイン、に存在する。
一つの実施態様において、エクソンコード配列の1つに一つまたは複数のナンセンス変異および/またはミスセンス変異を含むmyb12ヌクレオチド配列、並びに、野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と所望により比較した場合に淡紅色のトマト果実および/または色の薄い表皮および/または無色表皮をもたらす係る変異対立遺伝子を含む植物が提供される。
一つの実施態様において、エクソンコード配列の1つに一つまたは複数のナンセンス変異および/またはミスセンス変異を含むcd2ヌクレオチド配列、並びに、野生型CD2対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と比較した場合に光沢のあるまたは有意により光沢のあるトマト果実をもたらす係る変異対立遺伝子を含む植物が提供される。
本発明の特定の実施態様において、本発明の変異型の機能喪失型または機能低減型のmyb12対立遺伝子および/またはcd2対立遺伝子を含むトマト植物および植物部位(果実、種子等)が提供される。
また、例えば、配列番号2もしくは3に示されるmyb12、または上記で定義された(あらゆるキメラタンパク質またはハイブリッドタンパク質または変異型タンパク質または切断型タンパク質を含む)その異型等の、機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型myb12タンパク質をコードする核酸配列(ゲノムDNA、cDNA、RNA)が提供される。遺伝暗号の縮重により、種々の核酸配列が同じアミノ酸配列をコードし得る。提供される核酸配列は、自然発生的な核酸配列、人工的な核酸配列または合成核酸配列を包含する。Myb12をコードする核酸配列は、配列番号4(NCBI EU419748 トマト(Solanum lycopersicum)MYB12(MYB12)mRNA(完全長cds) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171466740)で規定される。
また、例えば、配列番号11もしくは15に示されるcd2、または上記で定義された(あらゆるキメラタンパク質またはハイブリッドタンパク質または変異型タンパク質または切断型タンパク質を含む)その異型等の、機能喪失型cdタンパク質(特にcd2)または機能低減型cdタンパク質(特にcd2)をコードする核酸配列(ゲノムDNA、cDNA、RNA)が提供される。
RNAが言及されながら、配列がDNA配列として示されている場合、RNA分子の実際の塩基配列は、チミン(T)がウラシル(U)で置換されているという差異を伴って、同一であると理解される。本明細書でヌクレオチド配列(例えば、DNAまたはRNA)について言及する場合、イタリック体が使用され(例えば、myb12対立遺伝子)、一方、タンパク質について言及する場合、イタリック体は使用されない(例えば、myb12タンパク質)。変異体は小文字であり(例えば、myb12対立遺伝子またはmyb12タンパク質)、一方、野生型/機能性型は大文字(Myb12対立遺伝子またはMyb12タンパク質)から始まる。
また、変異型myb12タンパク質、すなわち、上記のような、機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型myb12タンパク質をコードする核酸配列(ゲノムDNA、cDNA、RNA)、並びに、そのような変異型配列を含む植物および植物部位が提供される。例えば、コードされるタンパク質をインビボにおいて機能喪失または機能低減させる、野生型Myb12コード配列に一つまたは複数のナンセンス変異および/またはミスセンス変異を含むmyb12核酸配列。また、スプライス部位変異、すなわち、RNA前駆体の異常なスプライシングに繋がるゲノムmyb12配列における変異、並びに/またはフレームシフト変異、並びに/または一つもしくは複数の核酸の挿入(例えば、トランスポゾン挿入)および/もしくは欠失等の、他の変異を有する配列が提供される。
明らかなことであるが、核酸ハイブリダイゼーション、PCR技術、コンピュータによる解析および核酸合成等の多くの方法を用いて、myb12核酸配列またはcd核酸配列の異型または断片を同定、合成または単離することができる。配列番号4(または配列番号10)の異型は、野生型の機能的Myb12タンパク質(もしくはCD2タンパク質)をコードし得るか、または、例えば、TILLING等の方法による変異誘発、もしくは他の方法によって生成された、これらのうちいずれかの、機能喪失型myb12タンパク質(もしくはCD2タンパク質)もしくは機能低減型変異対立遺伝子をコードし得る。
本発明の植物を従来の植物育種法で使用することで、同じ特徴を有するより多くの植物を生産することができ、または、変異型myb12対立遺伝子もしくは変異型cd2対立遺伝子を、同一もしくは近縁植物種の他の植物系統もしくは品種に導入することができる。
また、当該技術分野において公知の植物形質転換法および再生法を用いて、本発明の変異型myb12ヌクレオチド配列または変異型cd2ヌクレオチド配列を用いて、遺伝子導入植物を作製することができる。所望の表現型の良好な発現をもたらす、ゲノム内の特定の位置に挿入されたキメラ遺伝子(機能喪失型myb12もしくはcdタンパク質または機能低減型myb12もしくはcdタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む)を有する形質転換事象である、「選良事象(elite event)」が選択され得る。
上記の本発明の植物は、変異型myb12対立遺伝子についてホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性である。同様に、上記の本発明の植物は、変異型cd対立遺伝子(cd1、cd2またはcd3)、例えばcd2対立遺伝子、についてホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性である。変異対立遺伝子をホモ接合型で含む植物を作製するために、自家受粉が使用され得る。本発明の変異型のmyb12およびまたはcd対立遺伝子(例えばcd2対立遺伝子)は、交雑、自家受粉、戻し交雑等等の従来の育種法によって、他のあらゆるトマト植物に導入することができる。従って、本発明の少なくとも1つの変異型のmyb12およびまたはcd(例えばcd2)対立遺伝子を有する含むあらゆる種類のトマトが作製可能である。そのゲノム内に少なくとも1つの変異型myb12およびまたはcd(例えばcd2)対立遺伝子を有し、機能喪失型myb12タンパク質(もしくはcdタンパク質、例えばcd2タンパク質)または野生型Myb12(もしくはCD、例えばCD2)タンパク質と比較して低減した活性を有するmyb12(またはcdタンパク質、例えばcd2タンパク質、各々)を産生する、あらゆるソラヌム・リコペルシクム(S. lycopersicum)が作製および/または特定され得る。従って、トマト植物は、あらゆる栽培トマト、あらゆる市販品種、あらゆる育種系統または他であり得、トマト植物は、あらゆる色の果肉、あらゆる形状および大きさの果実を生産する、確定または不定の、放任受粉したまたはハイブリッドの、トマト植物であり得る。特定のトマト植物において、または生殖互換性の(sexually compatible)トマト近縁種において、作製および/または特定された変異対立遺伝子は、育種(変異対立遺伝子を含む植物との交雑、およびその後の、変異対立遺伝子を含む子孫の選別)によって、他のあらゆるトマト植物に容易に導入され得る。
あらゆるトマト植物もしくは植物部位における本発明の変異型のmyb12対立遺伝子もしくはcd対立遺伝子(例えばcd2対立遺伝子)の有無、および/または子孫植物への前記対立遺伝子の遺伝の有無は、表現型によって、および/または分子ツールを用いて(例えば、直接的または間接的な方法を用いた、myb12もしくはcdヌクレオチド配列またはmyb12もしくはcdタンパク質の有無を検出)、決定することができる。
変異対立遺伝子は、一つの実施態様では、栽培植物において作製または特定されるが、野生型植物または非栽培植物において作製および/または特定された後に、例えば交雑および選別を用いて栽培植物に導入されてもよい(例えば胚救出による種間交雑を用いて変異対立遺伝子を導入してもよい)。従って、変異型のmyb12対立遺伝子またはcd対立遺伝子は、トマト(Solanum lycopersicum)において、または、例えば、ソラヌム・ケエスマニイ(S. cheesmanii)、ソラヌム・キレンセ(S. chilense)、ソラヌム・ハブロカイテス(S. habrochaites)(L・ヒルスタム(L. hirsutum))、ソラヌム・クミエレウスキ(S. chmielewskii)、ソラヌム・リコペルシクムxソラヌム・ペルビアナム(S. lycopersicum x S. peruvianum)、ソラヌム・グランデュロスム(S. glandulosum)、ソラヌム・ヒルスタム(S. hirsutum)、ソラヌム・ミヌタム(S. minutum)、ソラヌム・パルビフロルム(S. parviflorum)、ソラヌム・ペンネリ(S. pennellii)、ソラヌム・ペルビアナム(S. peruvianum)、ソラヌム・ペルビアナム変種フミフサム(S. peruvianum var. humifusum)およびソラヌム・ピンピネリフォリウム(S. pimpinellifolium)等のトマトの近縁野生種を含む他のソラヌム属種において、作製(変異誘発法を用いて標的のmyb12遺伝子もしくはcd遺伝子またはその異型を変異誘発する人為的変異)および/または特定(自然発生的または天然の対立遺伝子変異)された後に、栽培されたソラヌム属植物、例えばトマト(Solanum lycopersicum)、に従来の育種法によって導入されてもよい。用語「従来の育種法」は、本明細書において、対立遺伝子を導入することができる、育種家に公知の、交雑、自家受粉、選別、倍加半数体作製、胚救出、原形質融合、橋渡し種を介した導入等、すなわち遺伝子改変以外の方法、を包含する。
別の実施態様において、変異型myb12対立遺伝子および/または変異型cd対立遺伝子を含む植物(例えばトマト)が、同一種または近縁種の別の植物と交雑されて、変異型のmyb12対立遺伝子および/またはcd対立遺伝子を含む雑種植物(雑種種子)が作製される。このような雑種植物も本発明の一つの実施態様である。
一つの実施態様では、本発明の少なくとも1つの変異型myb12対立遺伝子および/または少なくとも1つの変異型cd対立遺伝子、好ましくは2つのmyb12対立遺伝子および/または1つもしくは2つのcd対立遺伝子(例えばcd2)を含む、F1雑種トマト種子(すなわち、F1雑種トマト植物に成長可能な種子)が提供される。F1雑種種子(雑種種子とも称される)は、2つの近交系トマト親植物間の交雑種から回収された種子である。このようなF1雑種は、1つもしくは2つの本発明の変異型myb12対立遺伝子および/または1つもしくは2つの本発明の変異型cd対立遺伝子(例えば変異型cd2)を含み得る。2つの本発明の変異型myb12対立遺伝子を含むこのようなF1雑種は、同一のmyb12対立遺伝子の2つのコピーまたは2つの異なる本発明のmyb12対立遺伝子を含み得る。従って、一つの実施態様では、本発明の植物が親植物として使用されて、F1雑種が生産される。2つの本発明の変異型cd対立遺伝子を含むF1雑種は、同一のcd対立遺伝子の2つのコピー(例えば配列番号11のタンパク質を共にコードするcd2/cd2)または2つの異なる本発明のcd対立遺伝子(例えば、1つが配列番号11のタンパク質をコードするcd2で、1つが配列番号15のタンパク質をコードするcd2)を含み得る。従って、一つの実施態様では、本発明の植物が親植物として使用されて、F1雑種が生産される。
また、変異型のmyb12対立遺伝子またはcd対立遺伝子(例えばcd2)を別の植物に導入するための方法が提供され、前記方法は、変異型のmyb12対立遺伝子および/またはcd対立遺伝子(例えばcd2)をそのゲノム内に含むトマト植物を用意し、前記植物を別のトマト植物と交雑し、前記交雑種の種子を得ること、を含む。これらの種子から得られる植物をさらに自家受粉および/または交雑し、前記変異対立遺伝子を含む子孫を選別、および/または、前記変異対立遺伝子の存在について表現型によって選別してもよい。例えば、果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期において色の薄いもしくは無色のトマト果実表皮を示す果実または淡紅色のトマト果実を生産する植物の選別は、変異型myb12対立遺伝子(ホモ接合型)についての選別となる。同様に、cd2対立遺伝子等の変異型cd対立遺伝子が導入され、遺伝子型および/または表現型によって選別され得る。
上記のように、他の変異誘発法および/または選別法が、本発明の変異型植物を作製するために、同様に使用され得ると理解される。種子が、例えば照射または化学処理されることで、変異型集団が作製され得る。また、myb12またはcd(例えばcd2)の直接的な遺伝子配列決定を用いて、変異誘発された植物集団が変異対立遺伝子についてスクリーニングされ得る。例えば、KeyPointスクリーニングは、変異型のmyb12またはcd対立遺伝子を含む植物を特定するために使用され得る、配列に基づく方法である(Rigola et al. PloS One, March 2009, Vol 4(3):e4761)。
従って、より低レベルの野生型Myb12タンパク質を果実内に産生する非遺伝子導入変異型トマト植物が提供され、または、一つまたは複数の内因性myb12対立遺伝子における一つまたは複数の変異により、果実内に野生型Myb12タンパク質を完全に欠く、果実内に機能喪失型myb12タンパク質または機能低減型myb12タンパク質を産生する、非遺伝子導入変異型トマト植物が提供される。これらの変異体は、TILLINGもしくはその変形法等の変異誘発法によって、または他のあらゆる方法によって、作製され得る。機能喪失型Myb12タンパク質または機能低減型Myb12タンパク質をコードするMyb12対立遺伝子が、単離および配列決定され得る、または、従来の育種法によって他の植物に導入され得る。
同様に、より低レベルの野生型CDタンパク質(例えば、CD2タンパク質)を果実内に産生する非遺伝子導入変異型トマト植物が提供され、または、一つまたは複数の内因性cd(例えば、cd2)対立遺伝子における一つまたは複数の変異により、果実内に野生型CD(例えば、CD2タンパク質)タンパク質を完全に欠く、果実内に機能喪失型cdタンパク質(例えば、cd2タンパク質)または機能低減型cdタンパク質(例えば、cd2タンパク質)を産生する、非遺伝子導入変異型トマト植物が提供される。これらの変異体は、TILLINGもしくはその変形法等の変異誘発法によって、または他のあらゆる方法によって、作製され得る。機能喪失型CDタンパク質(例えばCD1、CD2またはCD3)または機能低減型CDタンパク質(例えば、CD1、CD2またはCD3)をコードするCD対立遺伝子が、単離および配列決定され得る、または、従来の育種法によって他の植物に導入され得る。
特に、より低レベルの野生型Myb12タンパク質果実内に産生する非遺伝子導入変異型トマト植物が提供され、または、果実内に野生型Myb12タンパク質を完全に欠き、一つもしくは複数の内因性myb12対立遺伝子における一つもしくは複数の変異による機能喪失型myb12タンパク質もしくは機能低減型myb12タンパク質を果実内に産生し、さらに、低レベルの野生型CDタンパク質(例えばCD2タンパク質)を果実内に産生する、非遺伝子導入変異型トマト植物が提供され、または、野生型CDタンパク質(例えばCD2タンパク質)を果実内に完全に欠き、一つもしくは複数の内因性cd(例えばcd2)対立遺伝子における一つもしくは複数の変異による、機能喪失型cdタンパク質(例えばcd2タンパク質)もしくは機能低減型cdタンパク質(例えばcd2タンパク質)を果実内に産生する、非遺伝子導入変異型トマト植物が提供される。
本発明の変異型myb12対立遺伝子および/または変異型cd対立遺伝子をゲノム内に含む、収穫された果実、収穫された組織または器官、種子、花粉、花、子房等を包含する、植物の、またはその子孫のあらゆる部分が提供される。また、それらのゲノム内に変異型myb12対立遺伝子および/または変異型cd対立遺伝子を含む植物細胞培養または植物組織培養が提供される。植物細胞培養または植物組織培養は、変異型myb12対立遺伝子および/または変異型cd対立遺伝子をそのゲノム内に含む植物全体に再生可能であることが好ましい。また、myb12変異対立遺伝子および/またはcd変異対立遺伝子を含む一倍体細胞の染色体倍加によって生じる倍加半数体植物(および倍加半数体植物に成長可能な種子)、並びに、変異型のmyb12および/またはcd対立遺伝子をそれらのゲノム内に含む雑種植物(および雑種植物に成長可能な種子)が本明細書に包含され、一つの態様において、変異型myb12対立遺伝子を含む倍加半数体植物および雑種植物は、野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と比較した場合に、果実発達の後期オレンジ色期および/もしくは赤色期におけるトマト果実の、色の薄いもしくは無色の表皮を示し、並びに/または、一つの態様において、変異型cd対立遺伝子を含む倍加半数体植物および雑種植物は、野生型CD対立遺伝子についてホモ接合性のトマト(Solanum lycopersicum)と比較した場合に、果実発達の赤色期において有意により光沢のあるトマト果実を示す。
植物部位は、増殖性(propagating)または非増殖性(non-propagating)、例えば、非増殖性植物細胞であり得、具体的には、本明細書において開示される本発明の変異型myb12対立遺伝子をそのゲノム内に含む非増殖性植物細胞が提供される。一つの実施態様では、本発明は、本明細書において開示される本発明の変異型myb12対立遺伝子を含み、本明細書において開示されるクチクラ発達に関与する対立遺伝子における変異を含む、非増殖性植物細胞に関する。さらなる実施態様では、本発明は、本明細書において開示される本発明の変異型myb12対立遺伝子を含み、本発明の変異型cd2対立遺伝子を含む、非増殖性植物細胞に関する。
本発明はさらに、配列番号1のG50Rから選択される少なくとも1つの人為的な非遺伝子導入的変異を有する、もしくは、配列番号1の、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するその異型における、アミノ酸61〜338の欠失を含む、内因性myb12タンパク質;または、そのようなタンパク質をコードする内因性myb12対立遺伝子、に関する。
変異型植物は良好な他の農学的特徴も有することが好ましく、すなわち、変異型植物は、野生型植物と比較して、減少した果実数および/または低下した果実品質を有さないことが好ましい。好ましい実施態様では、植物はトマト植物であり、果実は、あらゆる形状または大きさまたは果肉色の加工トマト(processing tomato)、生食用トマト等のトマト果実である。従って、1つもしくは2つの変異型myb12対立遺伝子および/または1つもしくは2つの変異型cd対立遺伝子を含む植物または植物部位の収穫産物も提供される。これには、トマトペースト、ケチャップ、トマトジュース、カットされたトマト果実、缶詰果実、乾燥果実、皮むき加工された果実等の下流の加工製品が包含される。前記製品は、それらのゲノムDNA内に変異対立遺伝子を含むことにより特定され得る。
一つの態様において、NCIMB42268として寄託された植物におけるような淡紅色で光沢のある形質のための遺伝的特質を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物が提供される。
別の態様において、NCIMB42268またはNCIMB42269として寄託された植物におけるような光沢のある形質のための遺伝的特質を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物が提供される。
別の態様において、NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された植物におけるような淡紅色の形質のための遺伝的特質を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物が提供される。
別の態様において、NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された植物におけるような淡紅色の形質のための遺伝的特質を含み、NCIMB42268として寄託された植物におけるような光沢形質のための遺伝的特質を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物が提供される。
別の態様において、NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された植物におけるような淡紅色の形質のための遺伝的特質を含み、NCIMB42269として寄託された植物におけるような光沢形質のための遺伝的特質を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物が提供される。
さらに別の態様において、本発明は、配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有し、G736V置換を有する配列番号10の異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd対立遺伝子を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物(または植物部位)に関する。
さらに別の態様において、本発明は、配列番号1において、または配列番号1アミノ酸1〜60に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含む、本発明のトマト植物(または果実、種子、花粉、細胞等の植物部位)に関する。
一つの態様において、本発明は、配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有し、G736V置換を有する配列番号10の異型において、G736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd対立遺伝子を含み;且つ、配列番号1において、または配列番号1アミノ酸1〜60に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型において、アミノ酸61〜338の欠失を含む変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物(または植物部位)に関する。
一つの態様において、本発明は、配列番号10においてG736Vアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd対立遺伝子を含み;且つ、配列番号1においてアミノ酸61〜338の欠失を含む変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含む、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物(または植物部位)に関する。
一つの態様において、本発明は、本発明の(すなわち光沢のある淡紅色の果実を生産する)植物(または植物部位)に関し、前記植物または植物部位は、配列番号1においてアミノ酸61〜338の欠失を含む変異型myb12タンパク質の産生をもたらす一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み;且つ、前記植物部位は、配列番号10において、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の異型において、G736Vおよび/またはQ708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd対立遺伝子をさらに含む。
本発明はさらに以下の実施態様に関する。これらの実施態様では、非増殖性植物細胞が、光合成を通じて水、二酸化炭素および無機塩等の無機物から炭水化物およびタンパク質を合成することによりその生命を維持できない植物細胞であることを理解されたい。
実施態様1.
淡紅色で光沢のある果実を生産することができるトマト(Solanum lycopersicum)栽培植物の非増殖性細胞であって、ホモ接合型で、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む、またはy(黄色)遺伝子を含み;
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、前記変異型cd対立遺伝子が前記変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実の光沢の増加をもたらす、前記非増殖性細胞。
実施態様2.
一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、myb12対立遺伝子の、およびmyb12対立遺伝子の発現を調節する遺伝子における、コード領域における変異、非コード領域における変異、プロモーターにおける変異からなる群から選択される変異を有する、実施態様1に記載の非増殖性植物細胞。
実施態様3.
一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、変異型myb12タンパク質の産生をもたらすか、または前記一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を欠く植物と比較してより低いmyb12タンパク質レベルをもたらす、実施態様1または2に記載の非増殖性植物細胞。
実施態様4.
前記変異型myb12タンパク質が配列番号1においてグリシン50からアルギニンへの(G50R)アミノ酸置換を有する;または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換をさらに含む;または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下(例えば、1、2、3、または4以下)のアミノ酸置換または欠失をさらに含む;または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下(例えば1、2、3、または4以下)のアミノ酸置換または欠失をさらに含み、配列番号1のN末端および/またはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10以下)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、実施態様4に記載の非増殖性植物細胞;
または、
前記変異型myb12タンパク質が、配列番号1に、もしくは配列番号1のアミノ酸1〜60に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するその異型に、アミノ酸61〜338の欠失を含む、実施態様3に記載の非増殖性植物細胞;
または、
前記植物がy(黄色)遺伝子を含む、実施態様3に記載の植物細胞。
実施態様5.
一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、ヌクレオチド1271におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G1271C)をさらに含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、ヌクレオチド148におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G148C)をさらに含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;
または、
一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、ヌクレオチド1305位におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T1305)をさらに含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、ヌクレオチド182位におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T182A)をさらに含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様6.
受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子に存在し、前記種子から由来し得る、もしくは入手され得る(もしくは由来する、もしくは入手される)、myb12対立遺伝子を含む、実施態様1〜5のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様7.
前記変異型cd対立遺伝子がCD1遺伝子、CD2遺伝子およびCD3遺伝子からなる群から選択される遺伝子の対立遺伝子である、実施態様1〜6のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様8.
一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が変異型cdタンパク質の産生をもたらす、実施態様1〜7のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様9.
一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が配列番号10において一つまたは複数の変異を含む変異型cd2タンパク質をコードするcd2対立遺伝子である、実施態様1〜8のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様10.
クチン含量および/またはクチクラ層厚が通常のトマト(Solanum lycopersicum)栽培植物の70%未満である、実施態様1〜9のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。トマト(Solanum lycopersicum)の正常型栽培植物は、変異型cd対立遺伝子を欠き、さらに、本発明の植物細胞と同じ遺伝子構造を含むトマト(Solanum lycopersicum)植物であることが好ましい。
実施態様11.
変異型cd対立遺伝子が配列番号10から成るタンパク質をコードするcd2対立遺伝子であり、前記タンパク質が配列番号10にG736Vアミノ酸置換をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、前記異型がさらに配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列から成る;
または、
変異型cd対立遺伝子が配列番号10から成るタンパク質をコードするcd2対立遺伝子であり、前記タンパク質が配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、前記異型がさらに配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列から成る、
実施態様1〜10のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様12.
非増殖性植物細胞が、配列番号13に記載のmRNAをコードする核酸配列、もしくは配列番号13に対して少なくとも90%(例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%)の核酸配列同一性を有し且つ2207位にチミンを有する配列番号13の異型を含む;または、前記植物が配列番号11に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む;または、前記植物が、配列番号14と少なくとも90%(例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7% の配列同一性を有し、且つ以下のアミノ酸置換:G736V、D737Nおよび/もしくはQ708Hのうちの一つもしくは複数を含む変異型CD2タンパク質をコードするゲノムcd2配列を含む、実施態様1〜11のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様13.
変異型cd対立遺伝子が配列番号10から成るタンパク質をコードするcd2対立遺伝子であり、前記タンパク質が配列番号10にG736Vアミノ酸置換をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が、配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、さらに、8以下の(例えば1、2、3もしくは4以下の)アミノ酸置換もしくは欠失を含む、配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子である;または、
変異型cd対立遺伝子が、配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、さらに、8以下(例えば1、2、3もしくは4以下)のアミノ酸置換もしくは欠失を含み、さらに、配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列から成る、配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子である、
実施態様1〜12のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様14.
変異型cd対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号14にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド7171におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(G7171T)を含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号12にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド2207におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(T2207G)を含む、実施態様1〜13のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様15.
一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が、NCIMB42268またはNCIMB42269として寄託された種子に存在するようなcd2対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様16.
変異型cd対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号14にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド7171におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(G7171T)を含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号12にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド2207におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(T2207G)を含む、変異型cd対立遺伝子。
実施態様17.
植物育種における、または植物の特定における、実施態様16に記載の変異型cd対立遺伝子の用途。
実施態様18.
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド1271におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G1271C)を含む;または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド148におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G148C)を含む;
または、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド位置1305におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T1305)を含む;または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド位置182におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T182A)を含む、変異型myb12対立遺伝子。
実施態様19.
植物育種における、または植物の特定における、実施態様18に記載の変異型myb12対立遺伝子の用途。
実施態様20.
配列番号1から成り、G50Rアミノ酸置換をさらに含む、変異型myb12タンパク質;または、配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下の(例えば1、2、3、もしくは4以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む、変異型myb12タンパク質;または、配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下の(例えば、1、2、3、もしくは4以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、配列番号1のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10以下)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、変異型myb12タンパク質;
または、
配列番号1のアミノ酸1〜60から成る変異型myb12タンパク質、または、
配列番号1のアミノ酸1〜60から成り、1つのアミノ酸置換もしくは欠失からさらに成る、変異型myb12タンパク質;または
配列番号1のアミノ酸1〜60から成り、1つのアミノ酸置換もしくは欠失からさらに成り、配列番号1のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10以下)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、変異型myb12タンパク質。
実施態様21.
配列番号10から成り、配列番号10にG736Vアミノ酸置換をさらに含む、変異型cd2タンパク質;または
配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む、配列番号10の機能的異型;または、
配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、配列番号10の機能的異型;
または、
配列番号10から成り、配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換をさらに含む、タンパク質;または
配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む、配列番号10の機能的異型;または
配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、配列番号10の機能的異型。
実施態様22.
植物選別法であって、前記植物材料における実施態様16もしくは18に記載の変異対立遺伝子を特定する段階を含む、または、実施態様20もしくは21に記載の変異タンパク質を特定する段階を含む、前記植物選別法。
実施態様23.
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;または
変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42268もしくはNCIMB42269として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;または
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在するような対立遺伝子であり、変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42268として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;または
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在するような対立遺伝子であり、変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42269として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様24.
淡紅色で光沢のある果実を示すトマト(Solanum lycopersicum)植物を生産する方法であって、
a.レシピエントトマト(Solanum lycopersicum)植物またはその一部を準備する段階;
b. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、ホモ接合型の、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む、またはy(黄色)遺伝子を含む、第一のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
c. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較して増加した果実光沢をもたらす、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む、第二のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
d. レシピエント植物および第一のドナー植物を交雑する段階;
e. 淡紅色の果実を示す子孫植物を選別する段階;
f. 段階eの子孫植物を第二のドナー植物と交雑する段階;
g. 淡紅色で光沢のある果実を示し、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子を含む、子孫植物を選別する段階、
を含む、方法。
実施態様25.
淡紅色で光沢のある果実を示すトマト(Solanum lycopersicum)植物を生産する方法であって、
a. レシピエントトマト(Solanum lycopersicum)植物またはその一部を準備する段階;
b. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、ホモ接合型の、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む、またはy(黄色)遺伝子を含む、第一のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
c. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較して増加した果実光沢をもたらす、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む、第二のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
d. レシピエント植物および第二のドナー植物を交雑する段階;
e. 光沢のある果実を示し、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子を含む、子孫植物を選別する段階;
f. 段階eの子孫植物を第一のドナー植物と交雑する段階;
g. 淡紅色で光沢のある果実を示す子孫植物を選別する段階、
を含む、前記方法。
実施態様26.
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子が実施態様13または16で定義されたcd対立遺伝子である、実施態様24または25に記載の方法。
実施態様27.
一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が実施態様5で定義されたmyb12対立遺伝子である、実施態様24または25に記載の方法。
実施態様28.
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子が実施態様13または16で定義されたcd対立遺伝子であり、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が実施態様5で定義されたmyb12対立遺伝子である、実施態様24または25に記載の方法。
実施態様29.
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子が実施態様16で定義されたcd対立遺伝子であり、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が実施態様5で定義されたmyb12対立遺伝子である、実施態様28に記載の方法。
実施態様1.
淡紅色で光沢のある果実を生産することができるトマト(Solanum lycopersicum)栽培植物の非増殖性細胞であって、ホモ接合型で、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む、またはy(黄色)遺伝子を含み;
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含み、前記変異型cd対立遺伝子が前記変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実の光沢の増加をもたらす、前記非増殖性細胞。
実施態様2.
一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、myb12対立遺伝子の、およびmyb12対立遺伝子の発現を調節する遺伝子における、コード領域における変異、非コード領域における変異、プロモーターにおける変異からなる群から選択される変異を有する、実施態様1に記載の非増殖性植物細胞。
実施態様3.
一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、変異型myb12タンパク質の産生をもたらすか、または前記一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を欠く植物と比較してより低いmyb12タンパク質レベルをもたらす、実施態様1または2に記載の非増殖性植物細胞。
実施態様4.
前記変異型myb12タンパク質が配列番号1においてグリシン50からアルギニンへの(G50R)アミノ酸置換を有する;または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換をさらに含む;または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下(例えば、1、2、3、または4以下)のアミノ酸置換または欠失をさらに含む;または、前記変異型myb12タンパク質が配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下(例えば1、2、3、または4以下)のアミノ酸置換または欠失をさらに含み、配列番号1のN末端および/またはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10以下)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、実施態様4に記載の非増殖性植物細胞;
または、
前記変異型myb12タンパク質が、配列番号1に、もしくは配列番号1のアミノ酸1〜60に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するその異型に、アミノ酸61〜338の欠失を含む、実施態様3に記載の非増殖性植物細胞;
または、
前記植物がy(黄色)遺伝子を含む、実施態様3に記載の植物細胞。
実施態様5.
一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、ヌクレオチド1271におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G1271C)をさらに含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、ヌクレオチド148におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G148C)をさらに含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;
または、
一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、ヌクレオチド1305位におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T1305)をさらに含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、ヌクレオチド182位におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T182A)をさらに含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様6.
受託番号NCIMB42087またはNCIMB42088として寄託された種子に存在し、前記種子から由来し得る、もしくは入手され得る(もしくは由来する、もしくは入手される)、myb12対立遺伝子を含む、実施態様1〜5のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様7.
前記変異型cd対立遺伝子がCD1遺伝子、CD2遺伝子およびCD3遺伝子からなる群から選択される遺伝子の対立遺伝子である、実施態様1〜6のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様8.
一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が変異型cdタンパク質の産生をもたらす、実施態様1〜7のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様9.
一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が配列番号10において一つまたは複数の変異を含む変異型cd2タンパク質をコードするcd2対立遺伝子である、実施態様1〜8のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様10.
クチン含量および/またはクチクラ層厚が通常のトマト(Solanum lycopersicum)栽培植物の70%未満である、実施態様1〜9のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。トマト(Solanum lycopersicum)の正常型栽培植物は、変異型cd対立遺伝子を欠き、さらに、本発明の植物細胞と同じ遺伝子構造を含むトマト(Solanum lycopersicum)植物であることが好ましい。
実施態様11.
変異型cd対立遺伝子が配列番号10から成るタンパク質をコードするcd2対立遺伝子であり、前記タンパク質が配列番号10にG736Vアミノ酸置換をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、前記異型がさらに配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列から成る;
または、
変異型cd対立遺伝子が配列番号10から成るタンパク質をコードするcd2対立遺伝子であり、前記タンパク質が配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子であり、前記異型が配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、前記異型が16以下(例えば1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下)のアミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、前記異型がさらに配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列から成る、
実施態様1〜10のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様12.
非増殖性植物細胞が、配列番号13に記載のmRNAをコードする核酸配列、もしくは配列番号13に対して少なくとも90%(例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%)の核酸配列同一性を有し且つ2207位にチミンを有する配列番号13の異型を含む;または、前記植物が配列番号11に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む;または、前記植物が、配列番号14と少なくとも90%(例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7% の配列同一性を有し、且つ以下のアミノ酸置換:G736V、D737Nおよび/もしくはQ708Hのうちの一つもしくは複数を含む変異型CD2タンパク質をコードするゲノムcd2配列を含む、実施態様1〜11のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様13.
変異型cd対立遺伝子が配列番号10から成るタンパク質をコードするcd2対立遺伝子であり、前記タンパク質が配列番号10にG736Vアミノ酸置換をさらに含む;または
変異型cd対立遺伝子が、配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、さらに、8以下の(例えば1、2、3もしくは4以下の)アミノ酸置換もしくは欠失を含む、配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子である;または、
変異型cd対立遺伝子が、配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、さらに、8以下(例えば1、2、3もしくは4以下)のアミノ酸置換もしくは欠失を含み、さらに、配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列から成る、配列番号10の機能的異型をコードするcd2対立遺伝子である、
実施態様1〜12のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様14.
変異型cd対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号14にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド7171におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(G7171T)を含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号12にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド2207におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(T2207G)を含む、実施態様1〜13のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様15.
一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が、NCIMB42268またはNCIMB42269として寄託された種子に存在するようなcd2対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様16.
変異型cd対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号14にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド7171におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(G7171T)を含む;または、myb12対立遺伝子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号12にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド2207におけるグアニン(G)からチミン(T)への変異(T2207G)を含む、変異型cd対立遺伝子。
実施態様17.
植物育種における、または植物の特定における、実施態様16に記載の変異型cd対立遺伝子の用途。
実施態様18.
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド1271におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G1271C)を含む;または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド148におけるグアニン(G)からシトシン(C)への変異(G148C)を含む;
または、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号7にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド位置1305におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T1305)を含む;または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号4にハイブリダイズし、さらに、ヌクレオチド位置182におけるチミン(T)からアデニン(A)への変異(T182A)を含む、変異型myb12対立遺伝子。
実施態様19.
植物育種における、または植物の特定における、実施態様18に記載の変異型myb12対立遺伝子の用途。
実施態様20.
配列番号1から成り、G50Rアミノ酸置換をさらに含む、変異型myb12タンパク質;または、配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下の(例えば1、2、3、もしくは4以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む、変異型myb12タンパク質;または、配列番号1から成り、前記G50Rアミノ酸置換および8以下の(例えば、1、2、3、もしくは4以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、配列番号1のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10以下)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、変異型myb12タンパク質;
または、
配列番号1のアミノ酸1〜60から成る変異型myb12タンパク質、または、
配列番号1のアミノ酸1〜60から成り、1つのアミノ酸置換もしくは欠失からさらに成る、変異型myb12タンパク質;または
配列番号1のアミノ酸1〜60から成り、1つのアミノ酸置換もしくは欠失からさらに成り、配列番号1のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10以下)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、変異型myb12タンパク質。
実施態様21.
配列番号10から成り、配列番号10にG736Vアミノ酸置換をさらに含む、変異型cd2タンパク質;または
配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む、配列番号10の機能的異型;または、
配列番号10にG736Vアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、配列番号10の機能的異型;
または、
配列番号10から成り、配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換をさらに含む、タンパク質;または
配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含む、配列番号10の機能的異型;または
配列番号10にQ708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換を含み、16以下の(例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8以下の)アミノ酸置換もしくは欠失をさらに含み、配列番号10のN末端および/もしくはC末端における1〜10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)のアミノ酸残基から成る任意の配列からさらに成る、配列番号10の機能的異型。
実施態様22.
植物選別法であって、前記植物材料における実施態様16もしくは18に記載の変異対立遺伝子を特定する段階を含む、または、実施態様20もしくは21に記載の変異タンパク質を特定する段階を含む、前記植物選別法。
実施態様23.
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;または
変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42268もしくはNCIMB42269として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;または
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在するような対立遺伝子であり、変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42268として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞;または
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在するような対立遺伝子であり、変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42269として寄託された種子に存在するような対立遺伝子である、実施態様1〜14のいずれか1つに記載の非増殖性植物細胞。
実施態様24.
淡紅色で光沢のある果実を示すトマト(Solanum lycopersicum)植物を生産する方法であって、
a.レシピエントトマト(Solanum lycopersicum)植物またはその一部を準備する段階;
b. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、ホモ接合型の、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む、またはy(黄色)遺伝子を含む、第一のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
c. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較して増加した果実光沢をもたらす、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む、第二のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
d. レシピエント植物および第一のドナー植物を交雑する段階;
e. 淡紅色の果実を示す子孫植物を選別する段階;
f. 段階eの子孫植物を第二のドナー植物と交雑する段階;
g. 淡紅色で光沢のある果実を示し、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子を含む、子孫植物を選別する段階、
を含む、方法。
実施態様25.
淡紅色で光沢のある果実を示すトマト(Solanum lycopersicum)植物を生産する方法であって、
a. レシピエントトマト(Solanum lycopersicum)植物またはその一部を準備する段階;
b. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、ホモ接合型の、一つもしくは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含む、またはy(黄色)遺伝子を含む、第一のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
c. 本明細書における本発明の実施態様または態様のいずれかにおいて定義される、変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較して増加した果実光沢をもたらす、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含む、第二のドナートマト(Solanum lycopersicum)植物を準備する段階;
d. レシピエント植物および第二のドナー植物を交雑する段階;
e. 光沢のある果実を示し、一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子を含む、子孫植物を選別する段階;
f. 段階eの子孫植物を第一のドナー植物と交雑する段階;
g. 淡紅色で光沢のある果実を示す子孫植物を選別する段階、
を含む、前記方法。
実施態様26.
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子が実施態様13または16で定義されたcd対立遺伝子である、実施態様24または25に記載の方法。
実施態様27.
一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が実施態様5で定義されたmyb12対立遺伝子である、実施態様24または25に記載の方法。
実施態様28.
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子が実施態様13または16で定義されたcd対立遺伝子であり、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が実施態様5で定義されたmyb12対立遺伝子である、実施態様24または25に記載の方法。
実施態様29.
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(cuticle deficiency)(cd)対立遺伝子が実施態様16で定義されたcd対立遺伝子であり、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が実施態様5で定義されたmyb12対立遺伝子である、実施態様28に記載の方法。
特定の受託番号として寄託された種子に存在するような対立遺伝子に対して言及がなされる場合は常に、前記特定の受託番号に存在するような、もしくはそれから由来し得る、もしくは入手され得る、もしくは由来する、もしくは入手される、または、前記特定の受託番号に存在するような、もしくはそれから由来し得る、もしくは入手され得る、もしくは由来する、もしくは入手される、対立遺伝子も包含されると理解される。
種子寄託
実施例1に記載の2つのトマトTILLING変異体(myb12変異体)の代表的な種子サンプルが、Expert Solution(EPC2000、Rule32(1))に従い、ブダペスト条約に従って、Nunhems B.V.によって寄託され、NCIMB社(NCIMB Ltd.)(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA、英国)において2012年12月5日に寄託が受諾された。種子は以下の受託番号:NCIMB42087(変異体2961)およびNCIMB42088(変異体5505)を与えられた。
実施例1に記載の2つのトマトTILLING変異体(myb12変異体)の代表的な種子サンプルが、Expert Solution(EPC2000、Rule32(1))に従い、ブダペスト条約に従って、Nunhems B.V.によって寄託され、NCIMB社(NCIMB Ltd.)(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA、英国)において2012年12月5日に寄託が受諾された。種子は以下の受託番号:NCIMB42087(変異体2961)およびNCIMB42088(変異体5505)を与えられた。
実施例3に記載のトマト変異体(cd2変異体)を含む2つの系統の代表的な種子サンプルが、Expert Solution(EPC2000、Rule32(1))に従い、ブダペスト条約に従って、Nunhems B.V.によって寄託され、NCIMB社(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA、英国)において2014年7月4日に寄託が受諾された。種子は以下の受託番号:NCIMB42268(変異体8.17)およびNCIMB42269(変異体26428.001)が与えられ、共に同一の光沢変異(cd2/cd2)を有する。変異体8.17はまた、変異体2961に存在するMyb12変異対立遺伝子についてホモ接合性であり、光沢のある淡紅色の果実を生産する。さらに、野生型淡紅色(pink)(赤色(red))対立遺伝子および光沢性(glossy)(色の鈍い(dull))対立遺伝子の両方についてホモ接合性の7.9系統の種子が寄託され(NCIMB42267)、NCIMB社において2014年7月4日に寄託が受諾された。
出願人は、出願が拒絶され,取下又は擬制取下とされた場合において、特許付与についての公告まで、または出願日から20年間、生物材料およびそれに由来するあらゆる材料の試料が、Rule32(1)EPCまたは各国の関連法または同様の規定および規制を有する条約に従って、指定の専門家に譲渡されるのみであることを要求する。
寄託物へのアクセスは、請求に応じて権利を有すると米国特許庁長官が定めた人物が、本願の係属中は利用可能である。特許が付与された際は、米国特許法施行規則§1.808(b)に従って、寄託された材料の公衆への利用可能性に対して寄託者により課される全ての制限は、変更不能に取り除かれる。寄託物は、30年間、または最終請求の後5年間、またはいずれか長い方の特許の権利行使可能期間、維持され、その期間中に生育不能になった場合は置き換えられる。出願人は、本願の本発明に基づきまたは植物品種保護法(7 USC 2321 et seq.)に基づき付与されたいかなる権利も放棄しない。
一般的方法
PCR増幅産物は、増幅に使用されたものと同じプライマーを用いて、サービス会社(ベース・クリアー社(BaseClear)、オランダ、http://www.baseclear.com/)によって直接配列決定された。得られた配列をコンピュータプログラム(CLC Bio Main Work Bench、デンマーク、www.clcbio.com)を用いてアラインメントし、ヌクレオチド変化を特定した。
PCR増幅産物は、増幅に使用されたものと同じプライマーを用いて、サービス会社(ベース・クリアー社(BaseClear)、オランダ、http://www.baseclear.com/)によって直接配列決定された。得られた配列をコンピュータプログラム(CLC Bio Main Work Bench、デンマーク、www.clcbio.com)を用いてアラインメントし、ヌクレオチド変化を特定した。
材料
解析および変異誘発に使用した水は、Milli−Q water Integral system、Q−gard T2 CartridgeおよびQuantum TEX Cartridgeが搭載されたMilli−Q type Reference A+において濾過された水道水である。水の抵抗値は18MOhm以上である。
解析および変異誘発に使用した水は、Milli−Q water Integral system、Q−gard T2 CartridgeおよびQuantum TEX Cartridgeが搭載されたMilli−Q type Reference A+において濾過された水道水である。水の抵抗値は18MOhm以上である。
エチルメタンスルホン酸(EMS)(純粋)はシグマ社から入手した(製品番号M0880)。
トマト成熟および表皮色および/またはトマト果実色の測定
トマト成熟は、例えば、果実の視覚的評価および/または果実の硬度もしくは軟化の測定、トマト果実中のリコピン含量、果実のエチレン生産、果実の色の測定、または別のあらゆる方法、または方法の組合せを定期的に行うことのような、当該技術分野において公知の種々の方法により測定することができる。果実硬度は、例えば、適切な触針(例えば、3mmの触針)を装着された針入度計で測定された、例えば0.1mmを単位にして、耐変形性を評価することによって測定することができる(Mutschler et al, 1992, Hortscience 27 pp 352-355)(Martinez et al 1995 Acta Horticulturae 412 pp 463-469)。当該技術分野にはテクスチュロメーターの使用等の別の方法が存在する(Bui et al. 2010; International Journal of Food Properties, Volume 13, Issue 4 pp 830 846)。
トマト成熟は、例えば、果実の視覚的評価および/または果実の硬度もしくは軟化の測定、トマト果実中のリコピン含量、果実のエチレン生産、果実の色の測定、または別のあらゆる方法、または方法の組合せを定期的に行うことのような、当該技術分野において公知の種々の方法により測定することができる。果実硬度は、例えば、適切な触針(例えば、3mmの触針)を装着された針入度計で測定された、例えば0.1mmを単位にして、耐変形性を評価することによって測定することができる(Mutschler et al, 1992, Hortscience 27 pp 352-355)(Martinez et al 1995 Acta Horticulturae 412 pp 463-469)。当該技術分野にはテクスチュロメーターの使用等の別の方法が存在する(Bui et al. 2010; International Journal of Food Properties, Volume 13, Issue 4 pp 830 846)。
果実色は、新鮮トマトのグレードに関する米国基準(アメリカ合衆国農務省、1973、US standards for grades of fresh tomatoes、U.S. Dept Agr. Agr. Mktg. Serv.、ワシントンD.C.)により、比色計で色を測定することにより(Mutschler et al, 1992, Hortscience 27 pp 352-355)、または王立園芸協会(RHS)色表(www.rhs.org.uk)等の色表に対して色を比較することにより、分類することができる。
あるいは、トマト果実の外側の色は、3つのパラメータが得られる比色計によって測定することができる:明度、並びに緑から赤のスケールにおける色度座標および青から黄色のスケールにおける色度座標(Liu et al, 2003, Plant Biotechnology Journal 1, pp 195-207)。
リコピン含量は、Fish et al. A quantitative assay for lycopene that utilizes reduced volumes of organic solvents. Fish et al. J. Food Compos. Anal. 2002, 15, 309-317の有機溶剤体積減少法(reduced volumes of organic solvents)に従って測定することができる。この方法を用いることで、基礎的な物理化学的特徴(色、硬度、溶性固形物、酸味、およびpH)を同時に評価しながら、無処置のトマト果実に対して直接測定されたリコピン含量を決定することができる(Clement et al, J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 9813-9818)。
フラボノイド含量は、Ballester et al 2010(上記参照)またはSlimestad et al (Slimestad et al 2008, J. Agric. Food Chem. Vol 56, pp 2436-2441)で提供されたプロトコルに従って測定することができる。あるいは、フラボノイド類は、加水分解抽出物および非加水分解抽出物をそれぞれ調製することにより、アグリコンとして、またはそれらのグリコシドとして、測定することができる。加水分解抽出物は、調製し、光ダイオード検出を用いるHPLC(0.1%トリフルオロ酢酸中25%アセトニトリル)によって解析することができる。ケルセチン、ナリンゲニン、およびケンフェロール(0〜20g/mL)の用量反応曲線を確立することで、加水分解抽出物中のこれらの化合物を定量化することができる。非加水分解抽出物は、10分間の超音波処理により、75%メタノール水溶液中で調製することができる。続いて、抽出されたフラボノイド種のHPLCが、0.1%トリフルオロ酢酸中5〜50%アセトニトリルの勾配を用いて行われ得る。溶出ピークの吸光度スペクトルおよび滞留時間が、Bovy et al (Bovy et al 2002, The Plant Cell vol 14 pp 2509-2526)に詳述されるように、市販のフラボノイド標準物質のそれらと比較され得る。
果実果皮または表皮を、メスを用いてトマト果実の残部(すなわち、トマト果実の果肉)から注意深く分離させた。果皮または表皮の色を視覚により分類した。
実施例1
変異誘発
商業的加工トマト育種で使用された高度にホモ接合性の(highly homozygous)近交系を、以下のプロトコルを用いる変異誘発処理に使用した。種子を湿ったWhatman(登録商標)紙上で24時間吸水した後、20,000個の種子を、それぞれ2500個から成る8つの処理単位に分け、三角フラスコ内で100mlの超純水および1%の濃度のエチルメタンスルホン酸(EMS)中に浸漬した。フラスコを室温で16時間穏やかに振盪した。最後に、EMSを流水下で洗い落した。EMS処理の後、種子を温室に直接播種した。発芽した60%の種子のうち、10600の植物を畑に移植した。これらの10600の植物のうち、1790は果実をつけなかったか、または果実を生産する前に枯れた。それぞれの残りのM1変異型植物について、1つの果実が収穫され、その種子が分離された。M2集団と名付けられた得られた集団は、それぞれが1つのM2ファミリーを表す8810個の種子ロットから構成される。これらのうち、585のファミリーを、低い結実により、集団から除外した。
変異誘発
商業的加工トマト育種で使用された高度にホモ接合性の(highly homozygous)近交系を、以下のプロトコルを用いる変異誘発処理に使用した。種子を湿ったWhatman(登録商標)紙上で24時間吸水した後、20,000個の種子を、それぞれ2500個から成る8つの処理単位に分け、三角フラスコ内で100mlの超純水および1%の濃度のエチルメタンスルホン酸(EMS)中に浸漬した。フラスコを室温で16時間穏やかに振盪した。最後に、EMSを流水下で洗い落した。EMS処理の後、種子を温室に直接播種した。発芽した60%の種子のうち、10600の植物を畑に移植した。これらの10600の植物のうち、1790は果実をつけなかったか、または果実を生産する前に枯れた。それぞれの残りのM1変異型植物について、1つの果実が収穫され、その種子が分離された。M2集団と名付けられた得られた集団は、それぞれが1つのM2ファミリーを表す8810個の種子ロットから構成される。これらのうち、585のファミリーを、低い結実により、集団から除外した。
DNAを各M2種子ロットに由来する10の種子プールから抽出した。1つの変異体系統につき、10個の種子を、96ディープウェルプレートからのMicronic(登録商標)ディープウェルチューブ(http://www.micronic.com)にプールし、2個のステンレスボールを各チューブに加えた。チューブおよび種子を液体窒素中で1分間凍結し、直ちに種子を、Deepwell振盪機(バスコン社製(Vaskon)96 grinder、ベルギー;http://www.vaskon.com)において、16,8Hz(最高速度の80%)で2分間、細粉に挽いた。AGOWA(登録商標)Plant DNA Isolation Kit(http://www.agowa.de)からの300μlのAgowa(登録商標)Lysis buffer Pを試料植物に加え、粉末をDeepwell振盪機において16,8Hzで1分間振盪することにより溶液中に懸濁させた。プレートを4000rpmで10分間遠心した。75μlの上清を、Janus MDT(登録商標)(パーキンエルマー社、米国;http://www.perkinelmer.com)プラットフォーム(96ヘッド)を用いて96 Kingfisherプレートにピペッティング移動させた。パーキンエルマー社製Janus(登録商標)液体取扱いロボットおよび96 Kingfisher(登録商標)(サーモ・ラボシステムズ社(Thermo labsystems)、フィンランド;http://www.thermo.com)を用いて、以下の段階を行った。DNAを含有する上清を、結合緩衝液(150μl)および磁気ビーズ(20μl)で希釈した。DNAがビーズに結合した後、2回の連続的な洗浄段階を実行し(洗浄緩衝液1:Agowa洗浄緩衝液1 1/3、エタノール1/3、イソプロパノール1/3;洗浄緩衝液2:70%エタノール、30%Agowa洗浄緩衝液2)、最後に、溶出緩衝液(100μl MQ、0,025μl Tween)中で溶出させた。
10個のトマト(S. lycopersicum)種子の粉砕により磁気ビーズを飽和させるのに充分なDNAが得られ、これにより、高度に均一な、同程度のDNA濃度の全ての試料を得た。λDNA参照と比較して、各試料について30ng/μlの濃度を推定した。2回希釈したDNAを4倍フラットプールした(4 fold flat pooled)。変異検出解析のために、2μlのプールDNAをマルチプレックスPCRに使用した。
HRMのための遺伝子断片を増幅するために使用したプライマーは、コンピュータプログラム(Primer3、http://primer3.sourceforge.net/)を用いて設計した。増幅産物の長さは200〜400塩基対に限定した。プライマーの質を、単一産物をもたらすべきテストPCR反応によって決定した。
遺伝子断片を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)。 10ngのゲノムDNAを、10μlの総体積の、4μlの反応緩衝液(5×反応緩衝液)、2μlの10×LC色素((LCGreen+色素、アイダホ・テクノロジー社(Idaho Technology Inc.)、ユタ州、米国)、それぞれ5pmoleのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、4nmoleのdNTP(ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州、米国)および1ユニットのDNAポリメラーゼ(Hot Start II DNA Polymerase)と混合した。反応条件は以下であった:98℃30秒、次に、40サイクルの、98℃10秒、60℃15秒、72℃25秒、最後に、72℃で60秒。
高解像度融解曲線解析(High Resolution Melt curve analysis)(HRM)は、ヒトおよび植物の遺伝学における感度の良いハイスループットな方法であると証明されている。HRMは非酵素的なスクリーニング法である。PCR増幅中、色素(LCGreen+色素、アイダホ・テクノロジー社、ユタ州、米国)分子が、二本鎖DNA分子の各々のアニールされた塩基対間にインターカレートする。前記分子に捕捉された際、前記色素は470nmでの励起後に510nmの蛍光を放出する。DNA試料連続的に加熱されている間、蛍光検出器(LightScanner、アイダホ・テクノロジー社、ユタ州、米国)内のカメラによって蛍光強度が記録される。DNA螺旋の配列特異的な安定性に依存した温度において、二本鎖PCR産物が融解を開始し、色素を放出する。色素の放出により、蛍光の減少がもたらされ、これが蛍光検出器によって融解曲線として記録される。変異を含有するプールはPCR後の断片混合物においてヘテロ二重鎖を形成する。これらは、ホモ二重鎖と比較して、示差的な融解温度曲線と特定される。
個々の植物における特定の変異の存在を、特定された対応DNAプールの個々のM2種子ロットから得られたDNAに対してHRM解析を繰り返すことで確認した。4つの個々のM2ファミリーDNA試料のうち1つにおいて、HRMプロファイルに基づいて、変異の存在が確認された場合、PCR断片を配列決定してその遺伝子における変異を特定した。
変異が分かった後、そのような変異の影響を、予測された点変異が遺伝子の機能に対して有害作用をもたらす可能性が最も高い、ユーザーにより選択された遺伝子の領域およびそのコード配列の領域を特定する、コンピュータプログラムCODDLe(Choosing codons to Optimize Discovery of Deleterious Lesions、http://www.proweb.org/coddle/)を用いて予測した。
タンパク質活性に対する予測された影響を有する変異を含有するM2ファミリー由来の種子を、前記植物の表現型分析のために播種した。
自家受粉とその後の選別の後に、ホモ接合性変異体を選別または入手した。植物の対応タンパク質および表現型に対する変異の影響を決定した。
異なる特定された変異を含有する種子を発芽させ、植物を、土を含む鉢において育成した。温室は16/8明暗レジーム並びに18℃の夜間温度および22〜25℃の日中温度を有した。各々の遺伝子型について、5つの植物を育てた。第二、第三および第四花序を解析に使用した。花序を、自家受粉により着果させる花序当たり6つの花を残して、剪定した。第一および第六の花の着果の日付を記録し、同様に、第一および第六の果実の催色期および赤色期の日付を記録した。第六の果実の催色期において、果房(truss)を収穫し、温室内の開放箱の中で貯蔵した。果実の状態を成熟期の全体に亘って記録した。
後期において、果実の状態を果実の視覚的評価に基づいて決定し、最も古い果実が「不良」となった日付を記録し、さらに、果実の劣化を記録した(果実を挟むことにより評価されるさらなる果実の柔らかさ、並びに脱水/水分喪失、果皮の破れおよび真菌生育の視覚的評価によって示される)。
以下の変異体が特定され:変異体2961、変異体5505、変異体5058、変異体6899、最初の2つの変異体の種子を上記の受託番号でNCIMBに寄託した。異型Myb12タンパク質を含む植物5058および6899は無色果皮表現型を示さなかったため、Myb12の機能的異型と見なされる。
野生型Myb12のcDNA(配列番号4に示される)と比較したヌクレオチド配列における変異、および各変異体のタンパク質配列に対するその影響は、上に記載されており(変異体2961および5505)、図2にも示される。変異体5058および6899のタンパク質配列は図2に示される。
観察された、変異体2961におけるT182A変異および変異体5505におけるG148C変異は、両変異がEMS変異体においてあまり多く見られないという意味において注目すべきものである。EMSは通常、グアニンのエチル化を引き起こし、エチルグアニンをもたらすことで、エチルグアニンとチミンとの対合エラーを生じさせる。これは、GからAへの変異およびCからTへの変異をもたらす(Krieg (1963) Genetics 48 pp 561 - 580)。
上記変異型植物またはそれに由来する植物(例えば、自家受粉または交雑による)等の、標的配列における変異を含み、変異型myb12対立遺伝子を含む、植物は、変異体2961および5505のトマト果実色を除いて、野生型植物と比較した場合に、全ての植物部位の正常な栄養生長を示す。その他の2つの変異体(5058および6899)は、野生型と比較した場合に、正常なトマト果実色を有する。標的配列に変異を含む植物を、それらの果実色について、表現型によって選別した。
上記変異型植物またはそれに由来する植物(例えば、自家受粉または交雑による)等の、標的cd2配列における変異を含み、変異型cd2対立遺伝子を含む、植物は、変異体2961および5505のトマト果実光沢を除いて、野生型植物と比較した場合に、全ての植物部位の正常な栄養生長を示す。その他の2つの変異体(5058および6899)は、野生型と比較した場合に、正常なトマト果実色を有する。標的配列に変異を含む植物を、それらの果実色について、表現型によって選別した。
実施例2
トマト果実の果実色決定
異なる変異を含有する種子を発芽させ、植物を、土を含む鉢において育成した。温室は16/8明暗レジーム並びに18℃の夜間温度および22〜25℃の日中温度を有した。各々の遺伝子型について、5つの植物を育てた。第二、第三および第四花序を解析に使用した。花序を、自家受粉により着果させる花序当たり6つの花を残して、剪定した。第一および第六の花の着果の日付を記録し、同様に、第一および第六の果実の催色期および赤色期の日付を記録した。第四の果実の赤色期において、果房を収穫し、温室内の開放箱の中で貯蔵した。果実の状態を成熟期の全体に亘って記録した。
トマト果実の果実色決定
異なる変異を含有する種子を発芽させ、植物を、土を含む鉢において育成した。温室は16/8明暗レジーム並びに18℃の夜間温度および22〜25℃の日中温度を有した。各々の遺伝子型について、5つの植物を育てた。第二、第三および第四花序を解析に使用した。花序を、自家受粉により着果させる花序当たり6つの花を残して、剪定した。第一および第六の花の着果の日付を記録し、同様に、第一および第六の果実の催色期および赤色期の日付を記録した。第四の果実の赤色期において、果房を収穫し、温室内の開放箱の中で貯蔵した。果実の状態を成熟期の全体に亘って記録した。
果実および表皮の色を後期オレンジ色期および赤色期において視覚的に決定した。果実および表皮の色は、例えば、王立園芸協会(RHS)の色表(http://www.rhs.org.uk/Plants/RHS-Publications/RHS-colour-charts)の色コードに位置付けることにより特徴付けることができる。
変異体2961(図2における変異体1、ホモ接合性)の果実は、赤熟期において、淡紅色の表現型および無色の透明な表皮を有した。変異体5505(図2における変異体2、ホモ接合性)の果実も、赤熟期において、淡紅色の表現型および色の薄い/無色の透明な表皮を有した。赤色期における何日かの後、変異体5505(myb12変異についてホモ接合性)の果実は、主に果実の岐肩(shoulder)上の表皮(すなわち、皮)内に存在する少量のフラボノイドを発達させた。淡紅色の果実表現型以外では、両変異体は、植物に対する他のいかなる外見上の多面発現効果も有さなかった。
myb12変異についてヘテロ接合性(すなわち、Myb12/myb12)の、変異体5505(図2におけるヘテロ接合性の変異体2、ヘテロ接合性)の果実は、赤熟期において、赤色果実表現型およびオレンジ色表皮を有した。
上記の実験1の集団において、2つの他の変異体を特定した(5058および6899)。5058のトマト果実は果実発達の赤色期において赤色であった。変異体6899(図2における変異体3、ホモ接合性)のトマト果実も赤色の果実を有した。このことから、アミノ酸置換G68RおよびE20Kは、タンパク質機能に影響を与えるとは思われず、これらの2つの変異体はMyb12の機能的異型であると見なすことができる。
特定された4つ全てのmyb12変異体は、図2に示すようなmyb12タンパク質における変異を含み、変異型myb12タンパク質がそれら全てにおいて産生される。しかし、myb12タンパク質の機能に対する変異の影響は異なっており:それらのうち2つのみが、異常なmyb12タンパク質機能によって生じる淡紅色の表現型を有する。従って、全てのmyb12変異体が無色の果皮および淡紅色のトマト果実をもたらすわけではないと思われる。本発明の淡紅色トマトは、無色果皮表現型をもたらす特定の遺伝的セットアップを含む。
実施例3
トマト果実の果実光沢決定
種々の室内ヌンヘムス社(Nunhems)専売育種系統の果実を、果実光沢についてスコア化した(視覚によるスコア化、データ未記載)。高い果実光沢を有し、赤色果実を有する1つの系統を、淡紅色のトマトを生産可能なトマト植物との交雑のために選択した。この材料(変異体26428.001)の種子をNCIMB42269として寄託した。
トマト果実の果実光沢決定
種々の室内ヌンヘムス社(Nunhems)専売育種系統の果実を、果実光沢についてスコア化した(視覚によるスコア化、データ未記載)。高い果実光沢を有し、赤色果実を有する1つの系統を、淡紅色のトマトを生産可能なトマト植物との交雑のために選択した。この材料(変異体26428.001)の種子をNCIMB42269として寄託した。
形質遺伝研究によって、2つの形質(淡紅色および光沢)が、各々一遺伝子性であったこと、すなわち、単一遺伝子によって生じたことが明らかにされた。交雑、自家受粉および戻し交雑等の育種法を用いた際、最初、前記2つの形質は組み合わせることができず、これにより、前記形質が同一染色体(染色体1)上に位置していることが示唆され、さらに、組換え頻度が低いことから、これらの形質(淡紅色果実色および光沢)のための2つの対立遺伝子は互いに近く位置しており、組換え可能でないかもしれないと想定された。最終的に、本発明者らは、所望の組換えを得ることに成功し、変異型myb12対立遺伝子についてホモ接合性およびヘテロ接合性の、且つ、cd2対立遺伝子についてホモ接合性およびヘテロ接合性の、トマト植物を生産することができた。myb12対立遺伝子についてホモ接合性であり、且つ変異型cd2対立遺伝子についてホモ接合性である植物(変異体8.17;配列番号11の変異型cd2タンパク質をコード)の種子が、NCIMB42268として寄託された。淡紅色および光沢のある変異のいずれかまたは両方についてホモ接合性またはヘテロ接合性である本発明の植物は、正常な成長挙動および正常な植物特徴(果実色および光沢を除く)を示し、すなわち、淡紅色変異体のTILLINGバックグラウンドによる負の植物特徴は存在しなかった。
異なる変異を含有する種子を発芽させ、植物を、土を含む鉢において育成した。温室は16/8明暗レジーム並びに18℃の夜間温度および22〜25℃の日中温度を有した。各々の遺伝子型について、5つの植物を育てた。第二、第三および第四花序を解析に使用した。花序を、自家受粉により着果させる花序当たり6つの花を残して、剪定した。第一および第六の花の着果の日付を記録し、同様に、第一および第六の果実の催色期および赤色期の日付を記録した。第四の果実の赤色期において、果房を収穫し、温室内の開放箱の中で貯蔵した。果実の状態を成熟期の全体に亘って記録した。
果実光沢を緑熟期、オレンジ色期および赤色期(赤熟期、またはRR期)において視覚的に決定した。果実光沢を以下の範囲に亘る相対スケールでスコア化した:
例えば、淡紅色の果実(変異型淡紅色(pink)対立遺伝子についてホモ接合性、myb12/myb12)、野生型光沢性(Glossy)形質についてホモ接合性(すなわち、CD2/CD2により色が鈍いまたは光沢が無い)に対しての、+;から
赤色の果実(変異型淡紅色(pink)対立遺伝子についてヘテロ接合性、Myb12/myb12、または野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性(Myb12/Myb12)、変異型光沢性(Glossy)形質についてホモ接合性(例えばcd2/cd2)に対しての、++++++まで。
例えば、淡紅色の果実(変異型淡紅色(pink)対立遺伝子についてホモ接合性、myb12/myb12)、野生型光沢性(Glossy)形質についてホモ接合性(すなわち、CD2/CD2により色が鈍いまたは光沢が無い)に対しての、+;から
赤色の果実(変異型淡紅色(pink)対立遺伝子についてヘテロ接合性、Myb12/myb12、または野生型Myb12対立遺伝子についてホモ接合性(Myb12/Myb12)、変異型光沢性(Glossy)形質についてホモ接合性(例えばcd2/cd2)に対しての、++++++まで。
さらに、光沢の程度を、光沢計(ETB−0686光沢計、グライガー社(Graigar)、広東、中国)を用いて、(赤熟期に)定量化した。この光沢計を用いて、正反射を測定した。60度の所定の反射角にわたって光強度を記録した。光沢計の測定結果を、既定の屈折率を有する黒色ガラス基準(ETB−0686光沢計に付属)からの反射光の量と関連付けた。この既定標準の測定値は100光沢ユニットに等しいものとした。混入光(すなわち、環境からの光)の影響を防ぐために、測定は暗室で行った。果実の光沢性は、果実の全体にわたって等しく分布していない。従って、1つの果実につき、ちょうど果柄(pedicel)から花床(blossom end)までの果皮上の4つの位置で光反射を測定することにより、光沢を決定した。1つの遺伝子型につき、4つの果実を測定し、これらのそのようにして得られた16の測定値の平均値を、光沢の相対値と見なした。これらの光沢測定の結果を下記の表1に示す。
野生型(7.9)の果実は赤熟期において正常な赤色トマト色および反射を示す。変異体7.67(ホモ接合性の淡紅色(pink)、NCIMB42269由来のヘテロ接合性の光沢性(glossy)対立遺伝子 の果実は、淡紅色であり、野生型よりもわずかにより光沢があった。変異体7.22(NCIMB42087由来のホモ接合性のmyb12対立遺伝子;NCIMB42269由来のホモ接合性の光沢性(glossy)変異体)の果実は、淡紅色で非常に光沢のある果実を有した。
NCIMB42269として寄託された(配列番号11のcd2タンパク質を産生する)光沢性(glossy)変異体を用いた従来の育種は、植物系統に依存して、植物果実が光沢に対する中間の表現型影響を示したこと、すなわち、NCIMB42269に存在するcd2対立遺伝子についてヘテロ接合性の植物が、野生型植物より高いが、変異型cd2対立遺伝子についてホモ接合性の植物の果実よりも低い、光沢を有したこと、を示した。
Claims (20)
- 淡紅色で光沢のある果実を生産するトマト(Solanum lycopersicum)の栽培植物であって、
ホモ接合型で、一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を含んでなり、またはy(黄色)遺伝子を含んでなり;かつ、
一つまたは複数の変異を含むクチクラ欠乏(Cuticle Deficiency)(CD)対立遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で含んでなり、この変異型cd対立遺伝子が、該変異型cd対立遺伝子を欠く植物の果実と比較した場合に果実の光沢の増加をもたらすものである、植物。 - 一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、myb12対立遺伝子の、およびmyb12対立遺伝子の発現を調節する遺伝子における、コード領域における変異、非コード領域における変異、プロモーターにおける変異からなる群から選択される変異を有する、請求項1に記載の植物。
- 一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子が、変異型myb12タンパク質の産生をもたらすか、または前記一つまたは複数の変異を含むmyb12対立遺伝子を欠く植物と比較してより低いmyb12タンパク質レベルをもたらす、請求項1または2に記載の植物。
- 前記変異型myb12タンパク質が配列番号1もしくはその異型においてグリシン50からアルギニンへの(G50R)アミノ酸置換を有し、該異型が配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、且つ前記G50Rアミノ酸置換を有するものである、請求項3に記載の植物;
または
前記変異型myb12タンパク質が配列番号1もしくはその異型においてアミノ酸61〜338の欠失を含み、該異型が配列番号1のアミノ酸1〜60に対して少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するものである、請求項3に記載の植物;
または
y(黄色)遺伝子を含む、請求項3に記載の植物。 - 前記植物の果実が果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期(すなわち、赤熟期)においてトマト果実の無色表皮を含み、果実クチクラのクチンの量が前記変異型cd対立遺伝子を欠く植物と比較して少なくとも15%増加または減少している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の植物。
- 前記myb12対立遺伝子またはy遺伝子がホモ接合型である場合に、植物の果実が果実発達の後期オレンジ色期および/または赤色期において淡紅色の外見を示す、請求項1〜5のいずれか一項に記載の植物。
- 前記変異型cd対立遺伝子が、CD1遺伝子、CD2遺伝子およびCD3遺伝子からなる群から選択される遺伝子の対立遺伝子である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の植物。
- 一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が変異型cdタンパク質の産生をもたらす、請求項1〜7のいずれか一項に記載の植物。
- 一つまたは複数の変異を含むcd対立遺伝子が、配列番号10において一つまたは複数の変異を含む変異型cd2タンパク質をコードするcd2対立遺伝子である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の植物。
- クチン含量および/またはクチクラ層厚が、通常のトマト(Solanum lycopersicum)栽培植物の70%未満である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の植物。
- トマト果実のクチン含量が赤熟(RR)期において500μg cm−2未満であり、および/またはトマト果実のクチクラ層厚が赤熟(RR)期において8μm未満、もしくは6μm未満である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の植物。
- 赤熟(RR)期における果実の光沢レベルが、同一系統または野生型植物の果実の光沢レベルよりも少なくとも2倍高い、請求項1〜11のいずれか一項に記載の植物。
- 変異型cd対立遺伝子が、配列番号10において、もしくは配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の機能的異型において、G736Vアミノ酸置換をコードするcd2対立遺伝子であるか;または
変異型cd対立遺伝子が、配列番号10において、もしくは配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の機能的異型において、Q708Hおよび/もしくはD737Nアミノ酸置換をコードするcd2対立遺伝子である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の植物。 - 変異型cd対立遺伝子が、配列番号10の、または配列番号10に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、736位におけるグリシンからバリンへのアミノ酸置換(G736V)を含む配列番号10の機能的異型における、G736Vアミノ酸置換をコードするcd2対立遺伝子である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の植物。
- トマト植物が、配列番号13に記載のmRNAをコードする核酸配列、もしくは配列番号13に対して70%の核酸配列同一性を有し且つ2207位にチミンを有する配列番号13の異型を含む;または、前記植物が配列番号11に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む;または、前記植物が、配列番号14と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%の配列同一性を有し、且つ、以下のアミノ酸置換:G736V、D737Nおよび/もしくはQ708Hのうちの一つもしくは複数を含む変異型CD2タンパク質をコードするゲノムcd2配列を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の植物。
- F1雑種植物である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の植物。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の植物に成長可能な、種子。
- a)配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型においてG50Rアミノ酸置換を有する、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異;
b)配列番号1において、または配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型においてアミノ酸61〜338の欠失を含む、変異型myb12タンパク質の産生をもたらす変異;および
y(黄色)遺伝子
からなる群から選択される一つまたは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含んでなり;
配列番号10における、または配列番号10に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号10の異型における、G736Vおよび/またはQ708Hおよび/またはD737Nアミノ酸置換の生成をもたらす変異を含むcd対立遺伝子をさらに含んでなる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の植物の果実、種子、花粉、細胞または子孫などのトマト植物部位。 - トマト(Solanum lycopersicum)植物を生産する方法であって、
(a)請求項1〜17のいずれか一項に記載の、または請求項18に記載の種子に由来する第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を得る工程;および
(b)前記第一のトマト(Solanum lycopersicum)植物を第二のトマト(Solanum lycopersicum)植物と交雑して種子を得る工程;
を含んでなり、
工程(b)の種子から成長した前記トマト(Solanum lycopersicum)植物が一つもしくは複数の変異を有するmyb12対立遺伝子を含み、該変異は変異型myb12タンパク質の産生をもたらすものであり、該変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型においてG50Rアミノ酸置換を有し;
もしくは、前記変異型myb12タンパク質は、配列番号1において、もしくは配列番号1に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する配列番号1の異型においてアミノ酸61〜338の欠失を含み;
または、前記植物がy(黄色)遺伝子を含み;
所望により段階(b)において雑種種子が生産される、方法。 - 変異型myb12対立遺伝子が、受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に見られ、該種子に由来し得る、もしくは該種子から入手され得る、もしくは該種子に由来する、もしくは該種子から入手される、または該種子に存在する、対立遺伝子である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の植物もしくは請求項17に記載の種子もしくは請求項18に記載の植物部位;または
変異型cd対立遺伝子が、受託番号NCIMB42268もしくはNCIMB42269として寄託された種子に存在する対立遺伝子である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の植物もしくは請求項17に記載の種子もしくは請求項18に記載の植物部位;または
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在する対立遺伝子であり、変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42268として寄託された種子に存在する対立遺伝子である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の植物もしくは請求項17に記載の種子もしくは請求項18に記載の植物部位;または
変異型myb12対立遺伝子が受託番号NCIMB42087もしくはNCIMB42088として寄託された種子に存在する対立遺伝子であり、変異型cd対立遺伝子が受託番号NCIMB42269として寄託された種子に存在する対立遺伝子である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の植物もしくは請求項17に記載の種子もしくは請求項18に記載の植物部位。
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