CN109207506A - 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法 - Google Patents

一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109207506A
CN109207506A CN201710514435.1A CN201710514435A CN109207506A CN 109207506 A CN109207506 A CN 109207506A CN 201710514435 A CN201710514435 A CN 201710514435A CN 109207506 A CN109207506 A CN 109207506A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tomato
sequence
mushrooms
pork
bamboo shoots
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710514435.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李传友
邓磊
李常保
孙传龙
杜敏敏
周明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Original Assignee
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences filed Critical Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority to CN201710514435.1A priority Critical patent/CN109207506A/zh
Publication of CN109207506A publication Critical patent/CN109207506A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法。本发明公开了SlMYB12基因CRIPSR/Cas9基因编辑的两个sgRNA靶点序列，并获得了含有上述两个靶点的基因编辑载体，将该载体转化红果番茄材料可对其SlMYB12基因进行精确编辑，并可以从其自交子代中筛选出SlMYB12基因纯合突变的非转基因粉果材料，进而培育相应的粉果杂交种。通过实验证明：本发明的基因编辑方法适用于不同的番茄品种，且编辑效率高。与传统的y位点回交转育相比，该方法可以极大地缩短转育时间，1年内实现亲本果色性状的快速精准转化，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。

Description

一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法。
背景技术
番茄是世界范围内广泛种植的蔬菜和水果兼用类作物，深受各国消费者喜爱。番茄果实的颜色是重要的商品性状。目前国内市场销售的番茄以红色和粉红色两种为主。通常而言，红果番茄植株长势旺，抗病抗逆性强，果实形状好硬度高产量高；粉果番茄颜色更受我国消费者喜爱，相应品质更好。红果番茄和粉果番茄的果肉均呈红色，其颜色的差异主要由果皮颜色决定。前者果皮因积累柚皮素查尔酮而呈黄色，后者果皮不能积累该物质呈透明无色。黄色和无色是一对相对性状，黄色为显性，无色为隐性，受Y基因控制。最近的研究表明Y基因编码SlMYB12，控制果皮中柚皮素查尔酮的积累。红果番茄SlMYB12基因正常，粉果番茄SIMYB12基因的上游存在1个603bp的缺失，导致该基因不能正常表达，进而导致粉果表型。
高品质粉果番茄品种的培育一直是我国育种的重要目标之一。但我国不是番茄的原产地，种质资源大多引自国外，且多数为红果材料，不符合我国大众的消费习惯。因此在育种中常需要将红果材料转育为粉果材料。转育的方法主要靠y基因位点的高代回交。该法周期长，一般需要5-10年，且受连锁累赘等因素的限制。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术是近年来分子育种领域的热点技术。CRISPR/Cas9基因编辑系统由单向导RNA(Singleguided RNA，sgRNA)和Cas9蛋白两个组分构成。sgRNA用于识别、结合靶点DNA，并将Cas9蛋白招募到靶基因上。Cas9蛋白是一种核酸酶，可以对靶基因进行定点切割，产生DNA双链断裂，进而实现对基因组的精确替换、插入或缺失。植物CRISPR/Cas9基因编辑技术是在基因组水平上对遗传物质的修饰，并非涉及到外源基因的导入。其通过特定的载体将能够产生sgRNA和Cas9蛋白的外源DNA片段随机整合到植物基因组上，再通过产生的sgRNA和Cas9蛋白对靶基因进行定点编辑。由于外源DNA的插入和靶基因的编辑不在同一位点，因此可以从后代中分离出靶基因被编辑且不携带外源DNA片段的非转基因材料。与回交育种相比，基因编辑技术可打破生殖隔离、连锁累赘等因素的限制，1年内实现亲本目标性状的快速精准改良，且不涉及转基因安全问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种将番茄红果材料转变为粉果材料的方法。
本发明提供的将番茄红果材料转变为粉果材料的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对番茄红果材料基因组中的果皮颜色调控基因SlMYB12进行编辑，进而使所述果皮颜色调控基因SlMYB12功能丧失，得到番茄粉果材料；
所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄红果材料基因组中编码SlMYB12蛋白的DNA片段。
上述方法中，所述sgRNA1和所述sgRNA2均特异性靶向SlMYB12基因第1外显子；
所述sgRNA1识别的靶序列为序列2所示的DNA分子；
所述sgRNA2识别的靶序列为序列3所示的DNA分子。
上述方法中，所述编辑的方法为将向所述番茄红果材料中导入番茄基因组编辑的载体；所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因。
上述方法中，所述sgRNA1的编码基因为序列4第7260-7354位所示的DNA分子；所述sgRNA2的编码基因为序列4第7496-7590位所示的DNA分子；所述Cas9蛋白的编码基因为序列4第2753-6856所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，所述番茄基因组编辑的载体为重组载体pAGM4723::CR-SlMYB12。所述重组载体pAGM4723::CR-SlMYB12的核苷酸序列如序列4所示，依次包括T-DNA区的LB识别序列(序列4第12391-12415位)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子、抗性筛选基因NPTII(序列4第362-1156位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的OCS终止子、用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的35S启动子、Cas9蛋白的编码基因(序列4第2753-6856位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的NOS终止子，用于启动sgRNA1的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA1的编码基因、用于启动sgRNA2的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA2的编码基因、T-DNA区的RB识别序列(序列4第7695-7719位)。其中，sgRNA1的编码基因如序列4第7260-7354位所示，sgRNA1的靶点序列为序列4第7260-7278位所示；sgRNA2的编码基因如序列4第7496-7590位所示，sgRNA2的靶点序列为序列4第7496-7514位所示。
所述编辑的具体步骤如下：将所述重组载体pAGM4723::CR-SlMYB12导入农杆菌LBA4404，得到重组菌；再将所述重组菌转化番茄红果材料外植体，然后在含1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生番茄植株。
所述方法还包括筛选SlMYB12纯合突变体的步骤。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的SlMYB12基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，SlMYB12纯合突变体是指两条同源染色体的SlMYB12基因发生了相同的突变的植株。所述筛选的方法具体如下：采用序列8和序列9所示的引物对T0代再生番茄植株进行PCR扩增和测序。和野生型植株相比，靶点1(sgRNA1识别的靶序列)、靶点2(sgRNA2识别的靶序列)或两靶点间DNA片段出现核苷酸缺失或插入的T0代再生番茄植株为SlMYB12基因被编辑的植株。电泳条带单一且较野生型植株小的T0代再生番茄植株即为SlMYB12纯合突变植株。
上述方法中，所述番茄红果材料的品种可以是番茄常规品种，具体可以为AilsaCraig、Castlemart、M82和72-69。利用上述方法，本发明获得的SlMYB12纯合突变体(番茄粉果材料)为3号SlMYB12基因纯合打靶植株，其为将野生型番茄Ailsa Craig的两条同源染色体的SlMYB12基因第93-174位缺失，且保持野生型番茄Ailsa Craig的基因组其他序列不变后得到的植株。该植株的成熟果实为粉红色，果皮为透明无色。
本发明的第二个目的是提供一种非转基因番茄粉果材料的获得方法。
本发明的非转基因番茄粉果材料的获得方法包括如下步骤：将上述方法获得的番茄粉果材料自交，得到自交子代，选择SlMYB12纯合突变(两条同源染色体的SlMYB12基因发生了相同的突变)且不携带外源DNA片段的自交子代，即为非转基因番茄粉果材料。
所述选择的方法如下：将核苷酸大片段缺失的SlMYB12基因编辑植株进行自交，并收获种子，再将所得种子进行播种；待长出真叶后，采用序列8和序列9所示的引物对其SlMYB12基因片段进行PCR克隆和电泳，电泳条带单一且较野生型植株小的为SlMYB12纯合突变植株；采用序列6和序列7所示的引物对SlMYB12纯合突变植株的Cas9基因进行PCR扩增和电泳，选择不携带外源DNA片段的SlMYB12纯合突变植株即为SlMYB12纯合突变且不携带外源DNA片段的非转基因番茄粉果材料。
上述方法在培育粉果杂交种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供如下(1)-(4)中任一种生物材料：
(1)上述番茄基因组编辑的载体；
(2)含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；
(3)上述靶序列；
(4)序列5所示的果皮颜色调控基因SlMYB12的突变序列。
上述生物材料中，所述含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体为含有所述重组载体pAGM4723::CR-SlMYB12的农杆菌LBA4404。
上述生物材料中，所述果皮颜色调控基因SlMYB12的突变序列为序列5所示的DNA分子。与野生型SlMYB12基因相比，果皮颜色调控基因SlMYB12的突变序列为将野生型SlMYB12基因第93-174位缺失，且保持野生型SlMYB12基因的其他序列不变后得到的序列。
本发明的第四个目的是提供上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述生物材料在将番茄红果材料转变为粉果材料中的应用。
本发明还提供了上述生物材料在培育番茄粉果材料中的应用；
本发明还提供了上述生物材料在番茄育种中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄粉果材料或其子代的方法。
本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄粉果材料或其子代的方法包括如下步骤：采用引物对1和引物对2分别对待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物判断待测番茄是否为上述番茄粉果材料或其子代；
若引物对1仅扩增得到一个小于260bp的DNA片段且引物对2没有PCR扩增产物，则待测番茄为权利要求1-5中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代；
若引物对1和引物对2不满足上述条件，则待测番茄不为权利要求1-5中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代；
所述引物对1由引物1和引物2组成；
所述引物对2由引物3和引物4组成；
所述引物1为序列8所示的DNA分子；
所述引物2为序列9所示的DNA分子；
所述引物3为序列6所示的DNA分子；
所述引物4为序列7所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，所述引物对1对3号SlMYB12基因纯合打靶植株或其子代仅扩增得到一个大小为207bp的DNA片段且引物对2没有PCR扩增产物。
本发明的第六个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄粉果材料或其子代的产品。
本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄粉果材料或其子代的产品为如下(1)-(3)中的任一种：
(1)上述引物对1和引物对2；
(2)含有(1)所述的引物对1和引物对2的PCR试剂；
(3)含有(1)所述的引物对1和引物对2或(2)所述的PCR试剂的试剂盒。
本发明获得了用于对SlMYB12基因进行CRIPSR/Cas9基因编辑的两个sgRNA靶点序列，并获得了含有上述两个靶点的基因编辑载体，将该载体转化红果番茄材料可对其SlMYB12基因进行精确编辑，并可以从其自交子代中筛选出SlMYB12基因纯合突变的非转基因粉果材料，进而培育相应的粉果杂交种。通过实验证明：本发明的基因编辑方法适用于不同的番茄品种，且在不同品种中均获得多株纯合突变体，编辑效率高，可以快速将番茄红果材料转变为粉果材料。与传统的y位点回交转育相比，该方法可以极大地缩短转育时间，1年内实现亲本果色性状的快速精准转化，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。
附图说明
图1为SlMYB12基因的结构和CRIPSR/Cas9基因编辑sgRNA靶点的位置信息。其中E1-E4为1-4号外显子。
图2为重组载体的结构示意图。
图3为T0代植株SlMYB12基因的PCR检测电泳结果。其中，-为阴性空白对照，WT为未转化的野生型植株，1-11为T0代番茄植株。
图4为T0代植株SlMYB12基因的测序结果。其中，WT为未转化的野生型植株，1-11为T0代番茄植株。
图5为T0代纯合打靶植株成熟果实表型。其中，A：纯合打靶植株的田间表型；B：野生型植株和纯合突变植株的成熟果实；C：野生型植株和纯合突变植株的果皮。
图6为T0打靶植株自交子代的SlMYB12基因和Cas9基因PCR检测。其中，-为阴性空白对照，WT为未转化的野生型植株自交后代，1-15为3号打靶植株自交子代。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中使用的番茄品种均为常规种，其中，Ailsa Craig、Castlemart和M82购自美国番茄遗传资源中心(TGRC，http://tgrc.ucdavis.edu/)，72-69购自青岛国际种苗有限公司。
下述实施例中使用的pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS、pICSL01009::AtU6p、pICH47751、pICH47761、pAGM4723、pICH41780、pICH47742::2x35S-5’UTR-hCas9(STOP)-NOST和pICH47732::NOSp-NPTII-OCST载体均可从Addgene载体库(http://www.addgene.org/)购买。
下述实施例中使用的Premix Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1均为大连TaKaRa公司产品；限制性内切酶为NEB公司产品；PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品；快捷型植物基因组DNA提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品；引物为Thermo Fisher Scientific公司合成；测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。
实施例1、CRIPSR/Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-SlMYB12的构建
一、获得SlMYB12基因CRIPSR/Cas9基因编辑靶点序列
根据SGN数据库(http://solgenomics.net/)登录的SlMYB12基因序列(登录号为Solyc01g079620.2.1，核苷酸序列为序列表中的序列1)，对SlMYB12基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，SlMYB12基因有4个外显子(分别标注为E1-E4)和3个内含子构成。将外显子1的序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz 1706genomeSL2.50，进行CRIPSR/Cas9靶点设计。最终选定的两个sgRNA靶点如图1所示，具体序列如下：
SlMYB12基因sgRNA靶点1：5’-GGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’(序列2)；
SlMYB12基因sgRNA靶点2：5’-GGTCGTTACCTAAAAATGC-3’(序列3)。
二、构建SlMYB12基因的CRIPSR/Cas9基因编辑载体
1、sgRNA扩增引物的设计
根据选定的靶点序列，设计构建sgRNA扩增引物，具体为：SlMYB12-g1：5’-TGTAATTGGGGCATCAAGAGAGGCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，框内为Bsa I酶切位点，下划线为靶点1序列。SlMYB12-g2：5’-TGTAATTGGGTCGTTACCTAAAAATGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，框内为Bsa I酶切位点，下划线为靶点2序列。
sgRNA-R：5’-TGCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3’，框内为Bsa I酶切位点。
2、CRIPSR/Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-SlMYB12的构建
(1)重组质粒pICH47751::SlMYB12-sgRNA1的构建
以质粒pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS为模板，以序列4和序列6所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系为：10×PrimeSTAR Buffer(含MgCl2)5.0μL、2.5μM dNTP 8.0μL、前后引物各1.0μL、质粒模板30ng、PrimeSTAR HS DNA聚合酶1.0μL、加双蒸水至50μL。PCR反应条件为：98℃变性10秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，共32个循环；扩增获得两侧带均带有Bsa I酶切位点的靶点1-sgRNA核苷酸片段；PCR扩增产物纯化后用Bsa I酶切，再与经同样酶切的pICH47751载体和pICSL01009::AtU6p载体，在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pICH47751::SlMYB12-sgRNA1。
(2)重组质粒pICH47761::SlMYB12-sgRNA2的构建
以质粒pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS为模板，以序列5和序列6所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系同步骤(1)；扩增获得两侧带均带有Bsa I酶切位点的靶点2-sgRNA核苷酸片段；PCR扩增产物纯化后用Bsa I酶切，再与经同样酶切的pICH47761载体和pICSL01009::AtU6p载体，在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pICH47761::SlMYB12-sgRNA2。
(3)CRIPSR/Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-SlMYB12的获得
根据文献“Soyk S,Muller NA,Park SJ,Schmalenbach I,Jiang K,Hayama R,etal.Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutralityand early yield in tomato.Nature Genetics.2017；49(1):162-168”中所述方法，利用Golden Gate克隆技术对pICH47751::SlMYB12-sgRNA1、pICH47761::SlMYB12-sgRNA2、pICH47732::NOSp-NPTII-OCST、pICH47742::2x35S-5’UTR-hCas9(STOP)-NOST、pICH41780和pAGM4723进行重组，获得CRIPSR/Cas9基因编辑重组载体pAGM4723::CR-SlMYB12，重组载体结构图如图2所示。
重组载体pAGM4723::CR-SlMYB12的核苷酸序列如序列4所示，依次包括T-DNA区的LB识别序列(序列4第12391-12415位)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子、抗性筛选基因NPTII(序列4第362-1156位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的OCS终止子、用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的35S启动子、Cas9蛋白的编码基因(序列4第2753-6856位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的NOS终止子，用于启动sgRNA1的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA1的编码基因、用于启动sgRNA2的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA2的编码基因、T-DNA区的RB识别序列(序列4第7695-7719位)。其中，sgRNA1的编码基因如序列4第7260-7354位所示，sgRNA1的靶点序列为序列4第7260-7278位所示；sgRNA2的编码基因如序列4第7496-7590位所示，sgRNA2的靶点序列为序列4第7496-7514位所示。
实施例2、一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法
一、将基因编辑载体pAGM4723::CR-SlMYB12转化农杆菌
取1μg实施例1制备的基因编辑载体pAGM4723::CR-SlMYB12置于100μL LBA4404感受态细胞(北京华越洋生物，NRR01270)中，液氮中速冻3分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mLYEB培养基(YEB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蔗糖1g/L)，28℃培养2-4小时；10000×g离心30秒，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃黑暗培养2-3天；挑单菌落，接种于含有50μg/mL卡那霉素，500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜得，到转化子；将转化子进行菌液PCR鉴定，以dCAS9-F(5’-TCAACTGAGCAAAGACACCT-3’)和dCAS9-R(5’-CTCGTACAGCAGAGAGTGTT-3’)为引物，得到大小为757bp的扩增片段的即为阳性重组菌，并将该重组菌命名为pAGM4723::CR-SlMYB12/LBA4404，-80℃冻存备用。引物序列如下：
dCAS9-F：5’-TCAACTGAGCAAAGACACCT-3’(序列6)；
dCAS9-R：5’-CTCGTACAGCAGAGAGTGTT-3’(序列7)。
二、T0代SlMYB12基因编辑植株的获得及鉴定
1、T0代再生植株的获得
将重组菌pAGM4723::CR-SlMYB12/LBA4404转化红果番茄材料Ailsa Craig外植体，然后在含1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基(北京华越洋生物，M519)中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生植株。
2、T0代SlMYB12基因编辑植株的获得
采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒提取上述T0代再生植株DNA，利用序列6和序列7所示核苷酸序列为引物，对SlMYB12基因进行克隆和测序。PCR反应体系为：PremixTaq DNA聚合酶Mix 10μL、前后引物各0.8μL、DNA 1.5μL、加双蒸水至20μL；PCR反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环。引物序列如下：
crMYB12-F：5’-TTGCCTTTTGCTTCTCCATTTTGT-3’(序列8)；
crMYB12-R：5’-TCTACAACTCTTTCCGCATCTCAA-3’(序列9)。
PCR产物电泳结果如图3所示，1号、3号、6号、7号和9号植株的PCR产物明显小于野生型的条带，为打靶植株，其中3号和6号植株PCR条带单一，为纯合打靶植株。
PCR产物测序结果如图4所示。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，纯合突变体指的是该植株的两条同源染色体的SlMYB12基因发生了相同的突变。从图中可以看出：除2号再生植株外，其它植株均为SlMYB12基因被编辑的植株，打靶效率(SlMYB12基因被编辑的植株数/全部转化的植株数)为90.9％(10/11)；其中3号再生植株和6号再生植株为SlMYB12基因纯合打靶植株(SlMYB12纯合突变体)，其成熟果实为粉红色，果皮为透明无色(图5)。3号再生植株中SlMYB12基因的突变序列如序列表中的序列5所示。
3号SlMYB12基因纯合打靶植株为将野生型番茄Ailsa Craig的两条同源染色体的SlMYB12基因第93-174位缺失，且保持野生型番茄Ailsa Craig的基因组其他序列不变后得到的植株。
实施例3、非转基因粉果番茄材料的获得
一、突变SlMYB12基因的检测
将3号SlMYB12基因纯合打靶植株自交，获得F1代种子；取50粒F1代种子进行播种；待长出真叶后，得到3号SlMYB12基因纯合打靶植株的子代(F1代)。分别以野生型番茄植株Ailsa Craig和3号SlMYB12基因纯合打靶植株的子代的基因组DNA为模板，以序列8和序列9所示核苷酸序列为引物，对其SlMYB12基因片段进行PCR扩增和电泳。PCR反应体系为：Premix Taq DNA聚合酶Mix 10μL、前后引物各0.8μL、DNA 1.5μL、加双蒸水至20μL；PCR反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环。野生型番茄植株的SlMYB12基因PCR产物为289bp，突变SlMYB12基因PCR产物为207bp，两者可用1.5％的琼脂糖电泳区分。(注该检测方法也适用于实施例2所述其它缺失片段大于30bp的突变SlMYB12基因的检测。)
PCR产物电泳结果如图6A所示，野生型植株的SlMYB12基因PCR产物为289bp，3号打靶植株子代(1号-15号)的PCR产物均为207bp，较野生型植株小，说明3号SlMYB12基因纯合打靶植株的子代的SlMYB12基因均为纯合突变植株(图6A)。
二、外源DNA片段检测及非转基因粉果番茄材料的获得
以SlMYB12基因纯合打靶植株的子代中的纯合突变植株(1号-15号)的基因组DNA为模板，以实施例2所述dCAS9-F和dCAS9-F为引物，对纯合突变植株的Cas9基因进行PCR扩增和电泳。
结果表明：纯合突变植株(1号-15号)中4号、7号、9号和10号子代检测结果为阴性，为不携带外源DNA片段的粉果番茄材料(图6B)，即为目的非转基因粉果番茄材料。
实施例4、本发明的基因编辑方法在不同番茄红果品种中的应用
利用实施例1中的方法对除番茄品种Ailsa Craig外的其他不同番茄红果品种Castlemart、M82和72-69进行试验。并统计了其在不同番茄红果品种中的编辑效率。
结果如表1所示。从表中可以看出：本发明的方法同样适用于M82、Castlemart和72-69等其它番茄红果品种，一次试验均可获得10株以上的阳性T0代植株，且被编辑的植株不少于10株，编辑效率均高于85％。
表1、本发明的方法在不同番茄红果品种中的应用及对应的编辑效率
由以上结果可知，本发明的基因编辑方法适用于不同的番茄品种，编辑效率高，可以快速将番茄红果材料转变为粉果材料，有重要的应用价值。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京市农林科学院
<120> 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法
<160> 9
<210> 1
<211> 3277bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
taattttcat tgccttttgc ttctccattt tgtgataata ataataatgg gaagaacacc 60
ttgttgtgaa aaagtgggca tcaagagagg cagatggact gcagaagaag atcaaattct 120
cactaattat attatttcta atggagaagg ctcttggagg tcgttaccta aaaatgccgg 180
tacgattacc tactaatctt ttattttaat ttgaaattta aaattttttt cttcgtttaa 240
cagttttttt ataatatttt atttcgaagg attattgaga tgcggaaaga gttgtagact 300
acgatggatt aattatttga ggtctgatct caagagaggg aacattactt ctcaagagga 360
agatataatt ataaagttac atgcaacttt gggtaacagg taattagtca attacttgat 420
tggacttttt agcttgctaa ttaaaccact cattttgttt ctttttagtc taggtccaga 480
aaaaaatgtc tcctttaaaa tcaagtactt tcttcgttta aaaaataata attttatttt 540
tatttagtct gttttataaa gaatgacttt ttttttagta atatgttaaa tttaattttt 600
cacatgacat ctttaaaatt ataaaattag agatagtttg atacatttga cataacttta 660
atttagaatc acttctttct tttcttaaaa tccgtttcaa gtcaaatagg tcattctttt 720
ttatacgcaa gaagtatttt tttctttaaa aataaatctg aaactcattt taggttataa 780
acattgtcac aataatttgg tgcccgatct aacaacactt cttatatcat tttagtgtgt 840
gaatagtgtt acaccaaatt taatacaaca aaattactca tcaaaattat tactattcat 900
gataacatag tgtaatggat tcgagctaga gaaagaataa ataatatgtt ttaggtaaat 960
aatattaatg gattcgagct agagaaagaa taaataatat gttttaggta aataatattc 1020
catttgctta aaaaaataat cttttttttt aaaaaaagaa tgatttcttt tactttcaga 1080
tatattttaa tctcagctgt tgttcgtgtg ataagtttaa tatcatataa tactttgctt 1140
tatttgacat aattttaatt tagatttata aaattaataa ttttttttat tttcttaaat 1200
atcgtgttaa attaaactag gtcaatggta taattgattg aagtagatgc cctaataaat 1260
aaaagtgaga tcaatgcaat tataattaac ttaaattcat cacttctttt ttactacttg 1320
aattcatcac ataaaacaaa tgaatttttc ttcttctttt atttcatgtt tactccagta 1380
cttaatagtt tatagttatg tttgcctgga aaaaggagaa aagttttggt cactttaatt 1440
tgtagggtat tattttctac attcattatt tgtgctaatg aattaataag ttaattaaat 1500
tggtcccctc gagtaagttc aatattactc tttttttttt ctttttcata tgacgagtga 1560
catattcatg ctttaaaaac aattcatcct ttctattatt agtcatatac caagtctaga 1620
aaataaaaca gtgacaattt aaagtatttt ttcaaactag aaaacgtatc ttaagttgga 1680
tgtatacaca aatatatcaa ataatttcaa caaagaaaaa atttagaaaa gatgtgttag 1740
ttgtgagttg tgacattaaa tatgattgat taatacaata taccatcgat ctagtttcta 1800
acattttcta gtatcatcga ctttttaaaa ttggtctctt atagcagaac atttatcagg 1860
tagaacagac aatgagataa aaaactattg gaactctcat ctaagtcgaa aagttgatag 1920
cttaaggata ccaagcgatg agaagttacc taaagccgta gttgatttgg ctaaaaaagg 1980
tataccgaag ccaattaaaa aatcatcgat tagtcgacca aaaaataaaa agtcaaactt 2040
attagaaaaa gaagcattgt gttgtacaaa tatgccagct tgtgatagtg ccatggaatt 2100
aatgcaagaa gatctagcaa agatagaggt gccaaattct tgggcaggac ctatagaggc 2160
caagggaagc cttagttcag gtacaaattt cgatgttttg actatttttt attgtgaaat 2220
ttgattttaa aaaatatttt ttgatattaa agtgaaaaat aatattcaaa atttatttaa 2280
gttgtgtttg gttatgaata tgaattagag ttgttttttt cattttttcc tcaattattt 2340
cgagtaaacc tttttttttc tttaaagaat tgaaatttta ttgtcaaata tgattctctg 2400
agttttaact atcgaaaaaa gcgaaaaaga tcaaacaccc tctaatagtt tttattaatc 2460
aattaaatac attttcaata gtgactatga cgacataata tttatatatt gaaatatatg 2520
attattttat caaaaaactt aaaatttaat tttcacgtct ttcttttctt ttgaaacgtc 2580
attttttata tgtacctttt agatccaata tctatctatg gatagacgtt gcgaagtact 2640
ttttgttatt ttcaattatt aggcacaaat aattgaatct agcacctctt gtatgtacaa 2700
aattttaaac tgtagcaata aataaatata ttttttaatt tttttaaatt tttatttttt 2760
tttgtctgag cagatagtga tatcgaatgg ccaagactcg aggagattat gccagacgtg 2820
gtgattgatg atgaagataa gaacacaaat ttcatattga attgtttcag agaagaagta 2880
acgagcaata atgtagggaa tagttattca tgtatcgagg aaggtaataa aaagatatca 2940
agcgacgatg aaaaaatcaa attattaatg gattggcaag ataatgatga gttagtatgg 3000
ccaacgttac catgggaatt agaaacggat atagttccca gttggccaca atgggacgat 3060
actgacacta acttacttca aaattgcacc aatgataata ataattatga agaagcaaca 3120
acaatggaaa ttaataacca aaatcatagt accattgtat cttggctttt gtcttagaaa 3180
tataataata tgacattata tattgctttt gaatatatta ctcaactctt tttgtttcgt 3240
tttatatttg gaatgtggga attagaatga ctagttt 3277
<210> 2
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gggcatcaag agaggcaga 19
<210> 3
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ggtcgttacc taaaaatgc 19
<210> 4
<211> 12482bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gtgccgaatt cggatccgga gcggagaatt aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg 60
acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgttga aggagccact 120
gagccgcggg tttctggagt ttaatgagct aagcacatac gtcagaaacc attattgcgc 180
gttcaaaagt cgcctaaggt cactatcagc tagcaaatat ttcttgtcaa aaatgctcca 240
ctgacgttcc ataaattccc ctcggtatcc aattagagtc tcatattcac tctcctattt 300
ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacat ttacaattac 360
catggttgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt 420
cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc 480
agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact 540
gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt 600
gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca 660
ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat 720
gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg 780
catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga 840
agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga 900
cggcgaggat ctcgtcgtga ctcatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa 960
tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga 1020
catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt 1080
cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct 1140
tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgctagag tcctgcttta atgagatatg 1200
cgagacgcct atgatcgcat gatatttgct ttcaattctg ttgtgcacgt tgtaaaaaac 1260
ctgagcatgt gtagctcaga tccttaccgc cggtttcggt tcattctaat gaatatatca 1320
cccgttacta tcgtattttt atgaataata ttctccgttc aatttactga ttgtacccta 1380
ctacttatat gtacaatatt aaaatgaaaa caatatattg tgctgaatag gtttatagcg 1440
acatctatga tagagcgcca caataacaaa caattgcgtt ttattattac aaatccaatt 1500
ttaaaaaaag cggcagaacc ggtcaaacct aaaagactga ttacataaat cttattcaaa 1560
tttcaaaagt gccccagggg ctagtatcta cgacacaccg agcggcgaac taataacgct 1620
cactgaaggg aactccggtt ccccgccggc gcgcatgggt gagattcctt gaagttgagt 1680
attggccgtc cgctctaccg aaagttacgg gcaccattca acccggtcca gcacggcggc 1740
cgggtaaccg acttgctgcc ccgagaatta tgcagcattt ttttggtgta tgtgggcccc 1800
aaatgaagtg caggtcaaac cttgacagtg acgacaaatc gttgggcggg tccagggcga 1860
attttgcgac aacatgtcga ggctcagccg ctgcaagaat tcaagcttgg aggtcaacat 1920
ggtggagcac gacactctgg tctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct cagaagatca 1980
aagggctatt gagacttttc aacaaaggat aatttcggga aacctcctcg gattccattg 2040
cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct cctacaaatg 2100
ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatctc tctgccgaca gtggtcccaa 2160
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gaggttccaa ccacgtctac 2220
aaagcaagtg gattgatgtg ataacatggt ggagcacgac actctggtct actccaaaaa 2280
tgtcaaagat acagtctcag aagatcaaag ggctattgag acttttcaac aaaggataat 2340
ttcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt 2400
agaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcattca 2460
agatctctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 2520
aaaagaagag gttccaacca cgtctacaaa gcaagtggat tgatgtgaca tctccactga 2580
cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 2640
ttcatttcat ttggagagga cacgctcgag tataagagct catttttaca acaattacca 2700
acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tacatttaca attatcgata caatggacaa 2760
gaagtactcc attgggctcg atatcggcac aaacagcgtc ggctgggccg tcattacgga 2820
cgagtacaag gtgccgagca aaaaattcaa agttctgggc aataccgatc gccacagcat 2880
aaagaagaac ctcattggcg ccctcctgtt cgactccggg gagacggccg aagccacgcg 2940
gctcaaaaga acagcacggc gcagatatac ccgcagaaag aatcggatct gctacctgca 3000
ggagatcttt agtaatgaga tggctaaggt ggatgactct ttcttccata ggctggagga 3060
gtcctttttg gtggaggagg ataaaaagca cgagcgccac ccaatctttg gcaatatcgt 3120
ggacgaggtg gcgtaccatg aaaagtaccc aaccatatat catctgagga agaagcttgt 3180
agacagtact gataaggctg acttgcggtt gatctatctc gcgctggcgc atatgatcaa 3240
atttcgggga cacttcctca tcgaggggga cctgaaccca gacaacagcg atgtcgacaa 3300
actctttatc caactggttc agacttacaa tcagcttttc gaagagaacc cgatcaacgc 3360
atccggagtt gacgccaaag caatcctgag cgctaggctg tccaaatccc ggcggctcga 3420
aaacctcatc gcacagctcc ctggggagaa gaagaacggc ctgtttggta atcttatcgc 3480
cctgtcactc gggctgaccc ccaactttaa atctaacttc gacctggccg aagatgccaa 3540
gcttcaactg agcaaagaca cctacgatga tgatctcgac aatctgctgg cccagatcgg 3600
cgaccagtac gcagaccttt ttttggcggc aaagaacctg tcagacgcca ttctgctgag 3660
tgatattctg cgagtgaaca cggagatcac caaagctccg ctgagcgcta gtatgatcaa 3720
gcgctatgat gagcaccacc aagacttgac tttgctgaag gcccttgtca gacagcaact 3780
gcctgagaag tacaaggaaa ttttcttcga tcagtctaaa aatggctacg ccggatacat 3840
tgacggcgga gcaagccagg aggaatttta caaatttatt aagcccatct tggaaaaaat 3900
ggacggcacc gaggagctgc tggtaaagct taacagagaa gatctgttgc gcaaacagcg 3960
cactttcgac aatggaagca tcccccacca gattcacctg ggcgaactgc acgctatcct 4020
caggcggcaa gaggatttct accccttttt gaaagataac agggaaaaga ttgagaaaat 4080
cctcacattt cggataccct actatgtagg ccccctcgcc cggggaaatt ccagattcgc 4140
gtggatgact cgcaaatcag aagagactat cactccctgg aacttcgagg aagtcgtgga 4200
taagggggcc tctgcccagt ccttcatcga aaggatgact aactttgata aaaatctgcc 4260
taacgaaaag gtgcttccta aacactctct gctgtacgag tacttcacag tttataacga 4320
gctcaccaag gtcaaatacg tcacagaagg gatgagaaag ccagcattcc tgtctggaga 4380
gcagaagaaa gctatcgtgg acctcctctt caagacgaac cggaaagtta ccgtgaaaca 4440
gctcaaagaa gattatttca aaaagattga atgtttcgac tctgttgaaa tcagcggagt 4500
ggaggatcgc ttcaacgcat ccctgggaac gtatcacgat ctcctgaaaa tcattaaaga 4560
caaggacttc ctggacaatg aggagaacga ggacattctt gaggacattg tcctcaccct 4620
tacgttgttt gaagataggg agatgattga agaacgcttg aaaacttacg ctcatctctt 4680
cgacgacaaa gtcatgaaac agctcaagag gcgccgatat acaggatggg ggcggctgtc 4740
aagaaaactg atcaatggga tccgagacaa gcagagtgga aagacaatcc tggattttct 4800
taagtccgat ggatttgcca accggaactt catgcagttg atccatgatg actctctcac 4860
ctttaaggag gacatccaga aagcacaagt ttctggccag ggggacagtc tccacgagca 4920
catcgctaat cttgcaggta gcccagctat caaaaaggga atactgcaga ccgttaaggt 4980
cgtggatgaa ctcgtcaaag taatgggaag gcataagccc gagaatatcg ttatcgagat 5040
ggcccgagag aaccaaacta cccagaaggg acagaagaac agtagggaaa ggatgaagag 5100
gattgaagag ggtataaaag aactggggtc ccaaatcctt aaggaacacc cagttgaaaa 5160
cacccagctt cagaatgaga agctctacct gtactacctg cagaacggca gggacatgta 5220
cgtggatcag gaactggaca tcaatcggct ctccgactac gacgtggatc atatcgtgcc 5280
ccagtctttt ctcaaagatg attctattga taataaagtg ttgacaagat ccgataaaaa 5340
tagagggaag agtgataacg tcccctcaga agaagttgtc aagaaaatga aaaattattg 5400
gcggcagctg ctgaacgcca aactgatcac acaacggaag ttcgataatc tgactaaggc 5460
tgaacgaggt ggcctgtctg agttggataa agccggcttc atcaaaaggc agcttgttga 5520
gacacgccag atcaccaagc acgtggccca aattctcgat tcacgcatga acaccaagta 5580
cgatgaaaat gacaaactga ttcgagaggt gaaagttatt actctgaagt ctaagctggt 5640
ttcagatttc agaaaggact ttcagtttta taaggtgaga gagatcaaca attaccacca 5700
tgcgcatgat gcctacctga atgcagtggt aggcactgca cttatcaaaa aatatcccaa 5760
gcttgaatct gaatttgttt acggagacta taaagtgtac gatgttagga aaatgatcgc 5820
aaagtctgag caggaaatag gcaaggccac cgctaagtac ttcttttaca gcaatattat 5880
gaattttttc aagaccgaga ttacactggc caatggagag attcggaagc gaccacttat 5940
cgaaacaaac ggagaaacag gagaaatcgt gtgggacaag ggtagggatt tcgcgacagt 6000
ccggaaggtc ctgtccatgc cgcaggtgaa catcgttaaa aagaccgaag tacagaccgg 6060
aggcttctcc aaggaaagta tcctcccgaa aaggaacagc gacaagctga tcgcacgcaa 6120
aaaagattgg gaccccaaga aatacggcgg attcgattct cctacagtcg cttacagtgt 6180
actggttgtg gccaaagtgg agaaagggaa gtctaaaaaa ctcaaaagcg tcaaggaact 6240
gctgggcatc acaatcatgg agcgatcaag cttcgaaaaa aaccccatcg actttctcga 6300
ggcgaaagga tataaagagg tcaaaaaaga cctcatcatt aagcttccca agtactctct 6360
ctttgagctt gaaaacggcc ggaaacgaat gctcgctagt gcgggcgagc tgcagaaagg 6420
taacgagctg gcactgccct ctaaatacgt taatttcttg tatctggcca gccactatga 6480
aaagctcaaa ggatctcccg aagataatga gcagaagcag ctgttcgtgg aacaacacaa 6540
acactacctt gatgagatca tcgagcaaat aagcgaattc tccaaaagag tgatcctcgc 6600
cgacgctaac ctcgataagg tgctttctgc ttacaataag cacagggata agcccatcag 6660
ggagcaggca gaaaacatta tccacttgtt tactctgacc aacttgggcg cgcctgcagc 6720
cttcaagtac ttcgacacca ccatagacag aaagcggtac acctctacaa aggaggtcct 6780
ggacgccaca ctgattcatc agtcaattac ggggctctat gaaacaagaa tcgacctctc 6840
tcagctcggt ggagacagca gggctgaccc caagaagaag aggaaggtgt gagcttgtca 6900
agcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 6960
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 7020
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 7080
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 7140
atctatgtta ctagatcgac gctactagaa ttcgagctcg gagtgatcaa aagtcccaca 7200
tcgatcaggt gatatatagc agcttagttt atataatgat agagtcgaca tagcgattgg 7260
ggcatcaaga gaggcagagt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 7320
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tctagaccca gctttcttgt 7380
acaaagttgg cattacgctt tacgaattcc catggggagt gatcaaaagt cccacatcga 7440
tcaggtgata tatagcagct tagtttatat aatgatagag tcgacatagc gattgggtcg 7500
ttacctaaaa atgcgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 7560
caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcta gacccagctt tcttgtacaa 7620
agttggcatt acgctcagag aggatgcaca tgtgaccgag ggacacgaag tgatccgttt 7680
aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat 7740
tagaataatc ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt 7800
gccagccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 7860
gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 7920
tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 7980
aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 8040
aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 8100
ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 8160
ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 8220
cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 8280
atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 8340
accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 8400
gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 8460
gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 8520
ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 8580
cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 8640
aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 8700
gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 8760
agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 8820
ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 8880
atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 8940
accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 9000
tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 9060
cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 9120
gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 9180
tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 9240
cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 9300
gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 9360
tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 9420
cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 9480
gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 9540
gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 9600
tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 9660
tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 9720
agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 9780
gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 9840
gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 9900
ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 9960
cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 10020
aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 10080
catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 10140
gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaagcttct ttcctgtgga 10200
tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 10260
cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 10320
aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 10380
ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaacagctg caaaaagcgc ctacccttcg 10440
gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 10500
aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 10560
actcgaccgc cggcgcccac atcaaggctc cgagtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 10620
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 10680
taatattgaa aaaggaagag tatggctaaa atgagaatat caccggaatt gaaaaaactg 10740
atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa ggtatataag 10800
ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc 10860
acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt 10920
ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc 10980
gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag 11040
ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg 11100
aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat 11160
gtggattgcg aaaactggga agaggacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat 11220
tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga cctgggagac 11280
agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc 11340
agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgctcaggga ggatatcggg 11400
gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa 11460
ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagctgt cagaccaagt ttactcatat 11520
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 11580
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 11640
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 11700
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 11760
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 11820
gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 11880
ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 11940
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 12000
acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 12060
tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 12120
gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 12180
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 12240
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctgct cggatctgtt 12300
ggaccggaca gtagtcatgg ttgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag 12360
ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt 12420
gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactggg gttgaacact 12480
ct 12482
<210> 5
<211> 3195bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
taattttcat tgccttttgc ttctccattt tgtgataata ataataatgg gaagaacacc 60
ttgttgtgaa aaagtgggca tcaagagagg catgccggta cgattaccta ctaatctttt 120
attttaattt gaaatttaaa atttttttct tcgtttaaca gtttttttat aatattttat 180
ttcgaaggat tattgagatg cggaaagagt tgtagactac gatggattaa ttatttgagg 240
tctgatctca agagagggaa cattacttct caagaggaag atataattat aaagttacat 300
gcaactttgg gtaacaggta attagtcaat tacttgattg gactttttag cttgctaatt 360
aaaccactca ttttgtttct ttttagtcta ggtccagaaa aaaatgtctc ctttaaaatc 420
aagtactttc ttcgtttaaa aaataataat tttattttta tttagtctgt tttataaaga 480
atgacttttt ttttagtaat atgttaaatt taatttttca catgacatct ttaaaattat 540
aaaattagag atagtttgat acatttgaca taactttaat ttagaatcac ttctttcttt 600
tcttaaaatc cgtttcaagt caaataggtc attctttttt atacgcaaga agtatttttt 660
tctttaaaaa taaatctgaa actcatttta ggttataaac attgtcacaa taatttggtg 720
cccgatctaa caacacttct tatatcattt tagtgtgtga atagtgttac accaaattta 780
atacaacaaa attactcatc aaaattatta ctattcatga taacatagtg taatggattc 840
gagctagaga aagaataaat aatatgtttt aggtaaataa tattaatgga ttcgagctag 900
agaaagaata aataatatgt tttaggtaaa taatattcca tttgcttaaa aaaataatct 960
ttttttttaa aaaaagaatg atttctttta ctttcagata tattttaatc tcagctgttg 1020
ttcgtgtgat aagtttaata tcatataata ctttgcttta tttgacataa ttttaattta 1080
gatttataaa attaataatt ttttttattt tcttaaatat cgtgttaaat taaactaggt 1140
caatggtata attgattgaa gtagatgccc taataaataa aagtgagatc aatgcaatta 1200
taattaactt aaattcatca cttctttttt actacttgaa ttcatcacat aaaacaaatg 1260
aatttttctt cttcttttat ttcatgttta ctccagtact taatagttta tagttatgtt 1320
tgcctggaaa aaggagaaaa gttttggtca ctttaatttg tagggtatta ttttctacat 1380
tcattatttg tgctaatgaa ttaataagtt aattaaattg gtcccctcga gtaagttcaa 1440
tattactctt ttttttttct ttttcatatg acgagtgaca tattcatgct ttaaaaacaa 1500
ttcatccttt ctattattag tcatatacca agtctagaaa ataaaacagt gacaatttaa 1560
agtatttttt caaactagaa aacgtatctt aagttggatg tatacacaaa tatatcaaat 1620
aatttcaaca aagaaaaaat ttagaaaaga tgtgttagtt gtgagttgtg acattaaata 1680
tgattgatta atacaatata ccatcgatct agtttctaac attttctagt atcatcgact 1740
ttttaaaatt ggtctcttat agcagaacat ttatcaggta gaacagacaa tgagataaaa 1800
aactattgga actctcatct aagtcgaaaa gttgatagct taaggatacc aagcgatgag 1860
aagttaccta aagccgtagt tgatttggct aaaaaaggta taccgaagcc aattaaaaaa 1920
tcatcgatta gtcgaccaaa aaataaaaag tcaaacttat tagaaaaaga agcattgtgt 1980
tgtacaaata tgccagcttg tgatagtgcc atggaattaa tgcaagaaga tctagcaaag 2040
atagaggtgc caaattcttg ggcaggacct atagaggcca agggaagcct tagttcaggt 2100
acaaatttcg atgttttgac tattttttat tgtgaaattt gattttaaaa aatatttttt 2160
gatattaaag tgaaaaataa tattcaaaat ttatttaagt tgtgtttggt tatgaatatg 2220
aattagagtt gtttttttca ttttttcctc aattatttcg agtaaacctt tttttttctt 2280
taaagaattg aaattttatt gtcaaatatg attctctgag ttttaactat cgaaaaaagc 2340
gaaaaagatc aaacaccctc taatagtttt tattaatcaa ttaaatacat tttcaatagt 2400
gactatgacg acataatatt tatatattga aatatatgat tattttatca aaaaacttaa 2460
aatttaattt tcacgtcttt cttttctttt gaaacgtcat tttttatatg taccttttag 2520
atccaatatc tatctatgga tagacgttgc gaagtacttt ttgttatttt caattattag 2580
gcacaaataa ttgaatctag cacctcttgt atgtacaaaa ttttaaactg tagcaataaa 2640
taaatatatt ttttaatttt tttaaatttt tatttttttt tgtctgagca gatagtgata 2700
tcgaatggcc aagactcgag gagattatgc cagacgtggt gattgatgat gaagataaga 2760
acacaaattt catattgaat tgtttcagag aagaagtaac gagcaataat gtagggaata 2820
gttattcatg tatcgaggaa ggtaataaaa agatatcaag cgacgatgaa aaaatcaaat 2880
tattaatgga ttggcaagat aatgatgagt tagtatggcc aacgttacca tgggaattag 2940
aaacggatat agttcccagt tggccacaat gggacgatac tgacactaac ttacttcaaa 3000
attgcaccaa tgataataat aattatgaag aagcaacaac aatggaaatt aataaccaaa 3060
atcatagtac cattgtatct tggcttttgt cttagaaata taataatatg acattatata 3120
ttgcttttga atatattact caactctttt tgtttcgttt tatatttgga atgtgggaat 3180
tagaatgact agttt 3195
<210> 6
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
tcaactgagc aaagacacct 20
<210> 7
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ctcgtacagc agagagtgtt 20
<210> 8
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
ttgccttttg cttctccatt ttgt 24
<210> 9
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
tctacaactc tttccgcatc tcaa 24

Claims (10)

1.一种将番茄红果材料转变为粉果材料的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对番茄红果材料基因组中的果皮颜色调控基因SlMYB12进行编辑，进而使所述果皮颜色调控基因SlMYB12功能丧失，得到番茄粉果材料；
所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄红果材料基因组中编码SlMYB12蛋白的DNA片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述sgRNA1识别的靶序列为序列2所示的DNA分子；
或，所述sgRNA2识别的靶序列为序列3所示的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述编辑的方法为将向所述番茄红果材料中导入番茄基因组编辑的载体；
或，所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因；
或，所述sgRNA1的编码基因为序列4第7260-7354位所示的DNA分子；
或，所述sgRNA2的编码基因为序列4第7496-7590位所示的DNA分子；
或，所述Cas9蛋白的编码基因为序列4第2753-6856所示的DNA分子。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括筛选SlMYB12纯合突变体的步骤。
5.一种非转基因番茄粉果材料的获得方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄粉果材料自交，得到自交子代，选择SlMYB12纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为非转基因番茄粉果材料。
6.权利要求5所述的方法在培育粉果杂交种中的应用。
7.如下(1)-(4)中任一种生物材料：
(1)权利要求3中所述的番茄基因组编辑的载体；
(2)含有权利要求3中所述的番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；
(3)权利要求1或2中任一所述的靶序列；
(4)序列5所示的果皮颜色调控基因SlMYB12的突变序列。
8.权利要求7所述的载体或微生物转化体或靶序列或突变序列在将番茄红果材料转变为粉果材料中的应用；
或，权利要求7所述的载体或微生物转化体或靶序列或突变序列在培育番茄粉果材料中的应用；
或，权利要求7所述的载体或微生物转化体或靶序列或突变序列在番茄育种中的应用。
9.一种鉴定或鉴定待测番茄是否为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代的方法，包括如下步骤：采用引物对1和引物对2分别对待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物判断待测番茄是否为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代；
若引物对1仅扩增得到一个小于260bp的DNA片段且引物对2没有PCR扩增产物，则待测番茄为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代；
若引物对1和引物对2不满足上述条件，则待测番茄不为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代；
所述引物对1由引物1和引物2组成；
所述引物对2由引物3和引物4组成；
所述引物1为序列8所示的DNA分子；
所述引物2为序列9所示的DNA分子；
所述引物3为序列6所示的DNA分子；
所述引物4为序列7所示的DNA分子。
10.一种鉴定或鉴定待测番茄是否为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄粉果材料或其子代的产品，为如下(1)-(3)中的任一种：
(1)权利要求9中所述的引物对1和引物对2；
(2)含有(1)所述的引物对1和引物对2的PCR试剂；
(3)含有(1)所述的引物对1和引物对2或(2)所述的PCR试剂的试剂盒。
CN201710514435.1A 2017-06-29 2017-06-29 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法 Pending CN109207506A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710514435.1A CN109207506A (zh) 2017-06-29 2017-06-29 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710514435.1A CN109207506A (zh) 2017-06-29 2017-06-29 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109207506A true CN109207506A (zh) 2019-01-15

Family

ID=64976588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710514435.1A Pending CN109207506A (zh) 2017-06-29 2017-06-29 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109207506A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109825525A (zh) * 2019-03-07 2019-05-31 北京市农林科学院 一种可视标记与单性结实性状连锁的番茄品系制备方法
CN109929846A (zh) * 2019-03-28 2019-06-25 南京北恒生物科技有限公司 一种双sgRNA位点敲除LRRC20基因的CRISPR/Cas9系统与应用
CN110129363A (zh) * 2019-06-11 2019-08-16 先正达作物保护股份公司 提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法
CN111979261A (zh) * 2020-07-29 2020-11-24 武汉楚为生物科技股份有限公司 创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法
CN112779282A (zh) * 2019-11-11 2021-05-11 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988160A (zh) * 2015-07-31 2015-10-21 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种粉果番茄材料的制备方法
CN106636182A (zh) * 2016-10-21 2017-05-10 山西省农业科学院蔬菜研究所 一种番茄PSY 1基因的CRISPR‑Cas9体系构建及其应用
CN106793762A (zh) * 2014-07-30 2017-05-31 纽海姆有限公司 具有粉红色光泽果实的番茄植物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106793762A (zh) * 2014-07-30 2017-05-31 纽海姆有限公司 具有粉红色光泽果实的番茄植物
CN104988160A (zh) * 2015-07-31 2015-10-21 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种粉果番茄材料的制备方法
CN106636182A (zh) * 2016-10-21 2017-05-10 山西省农业科学院蔬菜研究所 一种番茄PSY 1基因的CRISPR‑Cas9体系构建及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA-ROSA BALLESTER, ET AL.: ""biochemical and molecular analysis of pink tomatoes- deregulated expression of the gene encoding trancsription factor SlMYB12 leads to pink tomato fruit color"", 《PLANT PHYSIOLOGY》 *
ITO Y, ET AL.: ""CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis of the RIN locus that regulates tomato fruit ripening"", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
SEBASTIAN SOYK, ET AL.: ""Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutrality and early yield in tomato"", 《NATURE GENETICS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109825525A (zh) * 2019-03-07 2019-05-31 北京市农林科学院 一种可视标记与单性结实性状连锁的番茄品系制备方法
CN109825525B (zh) * 2019-03-07 2021-07-02 北京市农林科学院 一种可视标记与单性结实性状连锁的番茄品系制备方法
CN109929846A (zh) * 2019-03-28 2019-06-25 南京北恒生物科技有限公司 一种双sgRNA位点敲除LRRC20基因的CRISPR/Cas9系统与应用
CN110129363A (zh) * 2019-06-11 2019-08-16 先正达作物保护股份公司 提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法
CN112779282A (zh) * 2019-11-11 2021-05-11 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料的方法
CN111979261A (zh) * 2020-07-29 2020-11-24 武汉楚为生物科技股份有限公司 创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109207506A (zh) 一种通过基因编辑将番茄红果材料转变为粉果材料的方法
CN109423498B (zh) 一种通过基因编辑创制高花青素紫黑果番茄材料的方法
CN104293828B (zh) 植物基因组定点修饰方法
CN109468339B (zh) 用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子
BRPI0609283A2 (pt) métodos para identificar um ìntron com propriedades intensificadoras de expressão em plantas, para enriquecer o número de ìntrons com propriedades intensificadoras de expressão em plantas, para isolar, fornecer ou produzir um ìntron com propriedades intensificadoras de expressão em plantas, para fornecer um cassete de expressão e para intensificar a expressão de uma seqüência de ácidos nucleicos em uma planta ou uma célula de planta, algoritmo de computador, dispositivo de computador ou dispositivo de armazenamento de dados, construto de expressão de dna recombinante, vetor de expressão, célula transgênica ou organismo não humano transgênico, cultura celular, partes ou material de propagação, e, uso de um organismo transgênico ou de culturas celulares, partes de material de propagação transgênico derivadas destas
CN114214336B (zh) 黑果枸杞LrNOR基因及其蛋白的应用
US20210348179A1 (en) Compositions and methods for regulating gene expression for targeted mutagenesis
CN105753953B (zh) 小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用
CN113801891B (zh) 甜菜BvCENH3基因单倍体诱导系的构建方法与应用
JP7438253B2 (ja) 植物調節エレメント及びその使用法
CN107937411A (zh) 毛白杨PtoWRKY40基因、其表达载体和构建方法以及应用
CN107338264A (zh) 病毒介导的基因沉默的vigs载体
CN107828816A (zh) 一种酵母‑农杆菌穿梭载体及构建方法和应用
CN111206047A (zh) OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用
CN110066813A (zh) 一种调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因及其应用
CN107236733B (zh) 转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体旁侧序列及其应用
CN105585623B (zh) 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
CN111996192A (zh) 创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及其应用
CN114107368B (zh) 表达反式菊酸的联合表达载体及其在调控番茄vi型腺体腺毛合成反式菊酸中的应用
CN114540356B (zh) 一种红冬孢酵母启动子及其应用
CN111592587B (zh) 氮的吸收利用相关的植物基因SiCUC1及其相关生物材料与应用
CN104109682B (zh) 一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用
CN103409432B (zh) 大豆凝集素基因lec-s的抗疫霉应用
CN109207510B (zh) 一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法
CN105420241B (zh) 西瓜ClCP2基因的启动子及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190115