CN109423498B - 一种通过基因编辑创制高花青素紫黑果番茄材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过基因编辑创制高花青素紫黑果番茄材料的方法。本发明公开了Solyc07g052490基因CRIPSR/Cas9基因编辑的两个sgRNA靶点序列，并获得了含有上述两个靶点的基因编辑载体，将该载体转化含有Aft位点的番茄材料可对其Solyc07g052490基因进行精确编辑，并可以从其自交子代中筛选出Solyc07g052490基因纯合突变的非转基因高花青素紫黑果番茄材料。通过实验证明：本发明的基因编辑方法可以快速将含Aft位点的浅紫果番茄材料转变为高花青素紫黑果材料，具有极大的育种应用前景和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因编辑创制高花青素紫黑果番茄材料的方法。
背景技术
花青素是一类广泛存在于植物体内的类黄酮类色素。因其极强的抗氧化性能力，在防治心血管疾病和乳腺癌方面疗效显著。花青素的生物合成受MYB家族转录因子调控。根据结构域差异，MYB转录因子可分为R2R3-MYB和R3-MYB等亚家族。R2R3-MYB一般激活花青素合成途径，而R3-MYB一般抑制花青素合成途径，两者在调控花青素合成方面是相互拮抗的。
番茄是重要的果实类蔬菜作物，但绝大多数栽培番茄果实不含有花青素，而一些野生种番茄果实有花青素积累。目前人们已从野生种番茄中分离多个与果实花青素积累有关的遗传位点，包括来自智利番茄(Solanum chilense)的显性遗传位点Aft、来自类番茄(Solanum lycopersicoides)的显性遗传位点Abg以及来自契斯曼尼番茄(Solanumcheesmaniae)的隐性遗传位点atv。Aft和Abg位于10号染色体，它们很可能是普通栽培番茄ANT1或AN2的等位基因，编码R2R3-MYB类转录因子。而atv位于7号染色体，可能是普通栽培番茄Solyc07g052490基因的等位基因，编码R3-MYB类转录因子。通过与上述野生种的杂交，人们已将这三个位点转育到普通栽培番茄中，获得了含有单个和多个位点的遗传材料。遗传学数据表明：单个Aft或Abg基因位点对果实花青素的积累贡献不大，相应材料(分别名为Aft材料和Abg材料)果皮部位只有少量花青素积累，呈浅紫色点状分布；而单独含有atv位点的材料与普通栽培番茄无异，果皮不积累花青素。但同时聚合Aft(或Abg)和atv两个位点的材料，果皮部位会积累大量的花青素，果实呈紫黑色。可见atv与Aft(或Abg)存在互作。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种创制高花青素番茄材料的方法。
本发明提供的创制高花青素番茄材料的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对含有Aft位点的番茄材料基因组中的花青素合成调控基因Solyc07g052490进行编辑，进而使所述Solyc07g052490功能丧失，得到高花青素番茄材料；
所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述含有Aft位点的番茄材料基因组中编码Solyc07g052490蛋白的DNA片段或部分片段。
上述高花青素紫黑果番茄材料为花青素含量高于所述含有Aft位点的番茄材料的番茄材料。
上述方法中，所述sgRNA1和所述sgRNA2均特异性靶向Solyc07g052490基因第2外显子；
所述sgRNA1识别的靶序列为序列2所示的DNA分子；
所述sgRNA2识别的靶序列为序列3所示的DNA分子。
上述方法中，所述编辑的方法为将向所述含有Aft位点的番茄材料中导入表达所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的载体。
上述方法中，所述sgRNA1的编码基因为序列4第7260-7354位所示的DNA分子；所述sgRNA2的编码基因为序列4第7496-7590位所示的DNA分子；所述Cas9蛋白的编码基因为序列4第2753-6856所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，表达所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的载体为重组载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490。所述重组载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490的核苷酸序列如序列4所示，依次包括T-DNA区的LB识别序列(序列4第12391-12415位)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子、抗性筛选基因NPTII(序列4第362-1156位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的OCS终止子、用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的35S启动子、Cas9蛋白的编码基因(序列4第2753-6856位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的NOS终止子，用于启动sgRNA1的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA1的编码基因、用于启动sgRNA2的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA2的编码基因、T-DNA区的RB识别序列(序列4第7695-7719位)。其中，sgRNA1的编码基因如序列4第7260-7354位所示，sgRNA1的靶点序列为序列4第7260-7278位所示；sgRNA2的编码基因如序列4第7496-7590位所示，sgRNA2的靶点序列为序列4第7496-7514位所示。
所述编辑的具体步骤如下：将所述重组载体pAGM4723::Solyc07g052490导入农杆菌LBA4404，得到重组菌；再将所述重组菌转化含有Aft位点的番茄材料外植体，然后在含1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生番茄植株。
所述方法还包括筛选Solyc07g052490基因纯合突变体的步骤。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的Solyc07g052490基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，Solyc07g052490纯合突变体是指两条同源染色体的Solyc07g052490基因发生了相同的突变的植株。所述筛选的方法具体如下：采用序列6和序列7所示的引物对T0代再生番茄植株进行PCR扩增和测序。和野生型植株相比，靶点1(sgRNA1识别的靶序列)、靶点2(sgRNA2识别的靶序列)或两靶点间DNA片段出现核苷酸缺失或插入的T0代再生番茄植株为Solyc07g052490基因被编辑的植株。电泳条带单一且较野生型植株小的T0代再生番茄植株即为Solyc07g052490基因纯合突变植株。
上述高花青素番茄材料为高花青素紫黑果番茄材料。
上述方法中，所述含有Aft位点的番茄材料为含有Aft位点的品种，具体可以为LA1996，也可为其它含有Aft位点的材料。利用上述方法，本发明获得的Solyc07g052490基因纯合突变体(番茄紫果材料)为4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株，其为将野生型番茄LA1996的两条同源染色体的Solyc07g052490基因第673-766位缺失，且保持野生型番茄LA1996的基因组其他序列不变后得到的植株。该植株果实的果皮为紫黑色。
本发明的第二个目的是提供一种非转基因高花青素番茄材料的获得方法。
本发明的非转基因番茄材料的获得方法包括如下步骤：将上述方法获得的高花青素番茄材料自交，得到自交子代，选择Solyc07g052490基因纯合突变(两条同源染色体的Solyc07g052490基因发生了相同的突变)且不携带外源DNA片段的自交子代，即为非转基因高花青素番茄材料。
所述选择的方法如下：将核苷酸大片段缺失的Solyc07g052490基因编辑植株进行自交，并收获种子，再将所得种子进行播种；待长出真叶后，采用序列6和序列7所示的引物对其Solyc07g052490基因片段进行PCR克隆和电泳，电泳条带单一且较野生型植株小的为Solyc07g052490基因纯合突变植株；采用dCAS9-F(5’-TCAACTGAGCAAAGACACCT-3’)和dCAS9-R(5’-CTCGTACAGCAGAGAGTGTT-3’)引物对Solyc07g052490基因纯合突变植株的Cas9基因进行PCR扩增和电泳，选择不携带外源DNA片段的Solyc07g052490基因纯合突变植株即为Solyc07g052490基因纯合突变且不携带外源DNA片段的非转基因番茄高花青素紫黑果材料。
上述方法在培育高花青素紫黑果番茄杂交种或高花青素番茄杂交种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供如下(1)-(4)中任一种生物材料：
(1)上述表达sgRNA1的编码基因、sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的载体；
(2)含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；
(3)上述靶序列；
(4)序列5所示的花青素合成调控基因Solyc07g052490的突变序列。
上述生物材料中，所述含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体为含有所述重组载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490的农杆菌LBA4404。
上述生物材料中，所述花青素合成调控基因Solyc07g052490的突变序列为序列5所示的DNA分子。与野生型Solyc07g052490基因相比，花青素合成调控基因Solyc07g052490的突变序列为将野生型Solyc07g052490基因第673-766位缺失，且保持野生型Solyc07g052490基因的其他序列不变后得到的序列。
本发明的第四个目的是提供上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述生物材料在提高含有Aft位点的番茄材料花青素含量中的应用。
本发明还提供了上述生物材料在培育番茄高花青素紫黑果材料中的应用；
本发明还提供了上述生物材料在番茄育种中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的方法。
本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的方法包括如下步骤：采用引物对1对待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物测序结果判断待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代；
若测序结果显示缺失DNA片段与序列5所示一致，则待测番茄为上述方法获得的高花青素番茄材料或其子代；
若测序结果1不满足上述条件，则待测番茄不为上述方法获得的高花青素番茄材料或其子代；
所述引物对1由引物1和引物2组成；
所述引物1为序列6所示的DNA分子；
所述引物2为序列7所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，所述引物对1对4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株或其子代仅扩增得到一个大小为670bp的DNA片段。
本发明的第六个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的产品。
本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的产品为如下(1)-(3)中的任一种：
(1)上述引物对1；
(2)含有(1)所述的引物对1的PCR试剂；
(3)含有(1)所述的引物对1或(2)所述的PCR试剂的试剂盒。
上述高花青素番茄材料为高花青素紫黑果番茄材料(即为Solyc07g052490基因纯合突变体)。
本发明获得了用于对Solyc07g052490基因进行CRIPSR/Cas9基因编辑的两个sgRNA靶点序列，并获得了含有上述两个靶点的基因编辑载体，将该载体转化Aft番茄材料可对其Solyc07g052490基因进行精确编辑，并可以从其自交子代中筛选出Solyc07g052490基因纯合突变的非转基因高花青素紫黑果番茄材料。通过实验证明：本发明的基因编辑方法有效，可以快速将含Aft位点的浅紫果番茄材料转变为高花青素紫黑果材料，具有重要的育种应用前景和经济价值。
附图说明
图1为Solyc07g052490基因的结构和CRIPSR/Cas9基因编辑sgRNA靶点的位置信息。其中E1-E3为1-3号外显子。
图2为重组载体的结构示意图。
图3为T0代植株Solyc07g052490基因的测序结果。其中，WT为未转化的野生型植株，1-7为T0代番茄植株。
图4为T0代打靶植株果实表型。其中1号为嵌合打靶植株，果皮黑紫色扇区Solyc07g052490被打靶，4号为纯合打靶植株，植株所有细胞的Solyc07g052490被打靶。
图5为T0代纯合打靶植株果皮花青素含量测定结果。其中野生型植株为LA1996材料，4号和5号纯合突变植株为Solyc07g052490纯合突变的LA1996再生植株。
图6为T0打靶植株自交子代的Solyc07g052490基因和Cas9基因PCR检测。其中，-为阴性空白对照，WT为未转化的野生型植株自交后代，1-15为4号打靶植株自交子代。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中使用的番茄品种LA1996购自美国番茄遗传资源中心(TGRC，http://tgrc.ucdavis.edu/)。
下述实施例中使用的pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS、pICSL01009::AtU6p、pICH47751、pICH47761、pAGM4723、pICH41780、pICH47742::2x35S-5’UTR-hCas9(STOP)-NOST和pICH47732::NOSp-NPTII-OCST载体均可从Addgene载体库(http://www.addgene.org/)购买。
下述实施例中使用的Premix Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1均为大连TaKaRa公司产品；限制性内切酶为NEB公司产品；PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品；快捷型植物基因组DNA提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品；引物为Thermo Fisher Scientific公司合成；测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。
实施例1、CRIPSR/Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490的构建
结合R2R3-MYB和R3-MYB转录因子拮抗关系，推测Aft(或Abg)材料中的Atv基因是正常，其编码有功能的R3-MYB转录因子削弱Aft(或Abg)基因对花青素合成途径的激活，而野生种来源的atv基因是突变的，不能编码出正确的蛋白，进而丧失了对Aft基因的抑制作用。因此理论上，利用基因编辑技术对Aft(或Abg)材料的Atv基因进行敲除可以解除其对Aft或Abg基因的抑制作用，提高花青素合成基因的表达水平，并创制出高花青素紫黑果番茄材料。
一、获得Solyc07g052490基因CRIPSR/Cas9基因编辑靶点序列
根据SGN数据库(http://solgenomics.net/)登录的Solyc07g052490基因序列(登录号为Solyc07g052490.2.1，核苷酸序列为序列表中的序列1)，对Solyc07g052490基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，Solyc07g052490基因有3个外显子(分别标注为E1-E3)和2个内含子构成。将外显子2的序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz 1706genome SL2.50，进行CRIPSR/Cas9靶点设计。最终选定的两个sgRNA靶点如图1所示，具体序列如下：
Solyc07g052490基因sgRNA靶点1：5’-GAGTGGTTGCATTAGAGAC-3’(序列2)；
Solyc07g052490基因sgRNA靶点2：5’-GTTCAGCTTGGTTAGAGAG-3’(序列3)。
二、构建Solyc07g052490基因的CRIPSR/Cas9基因编辑载体
1、sgRNA扩增引物的设计
根据选定的靶点序列，设计构建sgRNA扩增引物，具体为：Solyc07g052490-g1：5’-TGT
AATTGGAGTGGTTGCATTAGAGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，框内为Bsa I酶切识别位点，下划线为靶点1序列。Solyc07g052490-g2：5’-TGT
AATTGGTTCAGCTTGGTT AGAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，框内为Bsa I酶切识别位点，下划线为靶点2序列。
sgRNA-R：5’-TG
CAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3’，框内为Bsa I酶切识别位点。
2、CRIPSR/Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490的构建
(1)重组质粒pICH47751::Solyc07g052490-sgRNA1的构建
以质粒pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS为模板，以Solyc07g052490-g1和sgRNA-R所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系为：10×PrimeSTARBuffer(含MgCl2)5.0μL、2.5μM dNTP 8.0μL、前后引物各1.0μL、质粒模板30ng、PrimeSTARHS DNA聚合酶1.0μL、加双蒸水至50μL。PCR反应条件为：98℃变性10秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，共32个循环；扩增获得两侧带均带有Bsa I酶切位点的靶点1-sgRNA核苷酸片段；PCR扩增产物纯化后用Bsa I酶切，再与经同样酶切的pICH47751载体和pICSL01009::AtU6p载体，在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pICH47751::Solyc07g052490-sgRNA1。
(2)重组质粒pICH47761::Solyc07g052490-sgRNA2的构建
以质粒pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS为模板，以Solyc07g052490-g2和sgRNA-R所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系同步骤(1)；扩增获得两侧带均带有Bsa I酶切位点的靶点2-sgRNA核苷酸片段；PCR扩增产物纯化后用Bsa I酶切，再与经同样酶切的pICH47761载体和pICSL01009::AtU6p载体，在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pICH47761::Solyc07g052490-sgRNA2。
(3)CRIPSR/Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490的获得
根据文献“Soyk S,Muller NA,Park SJ,Schmalenbach I,Jiang K,Hayama R,etal.Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutralityand early yield in tomato.Nature Genetics.2017；49(1):162-168”中所述方法，利用Golden Gate克隆技术对pICH47751::Solyc07g052490-sgRNA1、pICH47761::Solyc07g052490-sgRNA2、pICH47732::NOSp-NPTII-OCST、pICH47742::2x35S-5’UTR-hCas9(STOP)-NOST、pICH41780和pAGM4723进行重组，获得CRIPSR/Cas9基因编辑重组载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490，重组载体结构图如图2所示。
重组载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490的核苷酸序列如序列4所示，依次包括T-DNA区的LB识别序列(序列4第12391-12415位)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子、抗性筛选基因NPTII(序列4第362-1156位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的OCS终止子、用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的35S启动子、Cas9蛋白的编码基因(序列4第2753-6856位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的NOS终止子，用于启动sgRNA1的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA1的编码基因、用于启动sgRNA2的编码基因表达的拟南芥U6启动子(ATU6)、sgRNA2的编码基因、T-DNA区的RB识别序列(序列4第7695-7719位)。其中，sgRNA1的编码基因如序列4第7260-7354位所示，sgRNA1的靶点序列为序列4第7260-7278位所示；sgRNA2的编码基因如序列4第7496-7590位所示，sgRNA2的靶点序列为序列4第7496-7514位所示。
实施例2、一种通过基因编辑技术创制高花青素紫黑果番茄材料的方法
一、将基因编辑载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490转化农杆菌
取1μg实施例1制备的基因编辑载体pAGM4723::CR-Solyc07g052490置于100μLLBA4404感受态细胞(北京华越洋生物，NRR01270)中，液氮中速冻3分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mL YEB培养基(YEB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蔗糖1g/L)，28℃培养2-4小时；10000×g离心30秒，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃黑暗培养2-3天；挑单菌落，接种于含有50μg/mL卡那霉素，500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜得，到转化子；将转化子进行菌液PCR鉴定，以dCAS9-F(5’-TCAACTGAGCAAAGACACCT-3’)和dCAS9-R(5’-CTCGTACAGCAGAGAGTGTT-3’)为引物，得到大小为757bp的扩增片段的即为阳性重组菌，并将该重组菌命名为pAGM4723::CR-Solyc07g052490/LBA4404，-80℃冻存备用。
二、T0代Solyc07g052490基因编辑植株的获得及鉴定
1、T0代再生植株的获得
将重组菌pAGM4723::CR-Solyc07g052490/LBA4404转化红果含有Aft位点的番茄材料LA1996外植体(子叶)，然后在含1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基(北京华越洋生物，M519)中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，得到7株植株，即为T0代再生植株。
2、T0代Solyc07g052490基因编辑植株的获得
采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒分别提取上述7株T0代再生植株DNA，利用序列6和序列7所示核苷酸序列为引物，对不同植株中的Solyc07g052490基因进行克隆和测序。PCR反应体系为：Premix Taq DNA聚合酶Mix 10μL、前后引物各0.8μL、DNA 1.5μL、加双蒸水至20μL；PCR反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸25秒，共35个循环。引物序列如下：
Solyc07g052490-F：5’-TTGGACATCTCATGCTCCTT-3’(序列6)；
Solyc07g052490-R：5’-TGGGATTCTTCCAGCAATTA-3’(序列7)。
PCR产物测序结果如图3所示。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，纯合突变体指的是该植株的两条同源染色体的Solyc07g052490基因发生了相同的突变。从图中可以看出：7株T0代再生植株中，除3号再生植株外，其它植株均为Solyc07g052490基因被编辑的植株，打靶效率(Solyc07g052490基因被编辑的植株数/再生植株总数)为85.7％(6/7)。
Solyc07g052490基因被编辑的植株中，1号为部分细胞Solyc07g052490基因被编辑的嵌合体材料，被编辑的扇区果皮呈黑紫色(图4)。4号再生植株为Solyc07g052490基因纯合打靶植株(Solyc07g052490纯合突变体)，其果皮为紫黑色(图4)。2、6和7号也是Solyc07g052490基因纯合打靶植株，其果皮为紫黑色。
总花青素测定结果表明Solyc07g052490纯合突变体果皮花青素含量显著增加，为野生型LA1996的30倍以上(图5)。
上述花青素测定方法为文献“Zhang,B.,Hu,Z.,Zhang,Y.,Li,Y.,Zhou,S.,andChen,G.(2012).A putative functional MYB transcription factor induced by lowtemperature regulates anthocyanin biosynthesis in purple kale(BrassicaOleracea var.acephala f.tricolor).Plant Cell Rep 31,281-289.”中所述。
4号再生植株中Solyc07g052490基因的突变序列如序列表中的序列5所示。4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株为将野生型番茄LA1996的两条同源染色体的Solyc07g052490基因第673-766位缺失，且保持野生型番茄LA1996的基因组其他序列不变后得到的植株。
实施例3、非转基因高花青素紫黑果番茄材料的获得
一、突变Solyc07g052490基因的检测
将4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株自交，获得F1代种子；取50粒F1代种子进行播种；待长出真叶后，得到4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代(F1代)。
分别以野生型番茄植株LA1996和4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代1号-15号的基因组DNA为模板，以序列6和序列7所示核苷酸序列为引物，对其Solyc07g052490基因片段进行PCR扩增和电泳。PCR反应体系为：Premix Taq DNA聚合酶Mix10μL、前后引物各0.8μL、DNA 1.5μL、加双蒸水至20μL；PCR反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸25秒，共35个循环。野生型番茄植株的Solyc07g052490基因PCR产物为764bp，突变Solyc07g052490基因PCR产物为670bp，两者可用3％的琼脂糖电泳区分。
PCR产物电泳结果如图6A所示，野生型植株的Solyc07g052490基因PCR产物为764bp，4号打靶植株子代(1号-15号)的PCR产物均为670bp，较野生型植株(764bp)小，说明4号Solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代的Solyc07g052490基因均为纯合突变植株(图6A)。
二、外源DNA片段检测及非转基因高花青素紫黑果番茄材料的获得
以上述获得的Solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代中的纯合突变植株(1号-15号)的基因组DNA为模板，以实施例2所述dCAS9-F和dCAS9-F为引物，对纯合突变植株的Cas9基因进行PCR扩增和电泳。
结果表明：纯合突变植株(1号-15号)中4号、6号、7号、9号、11号、12号和14号子代检测结果为阴性，为不携带外源DNA片段的紫黑果番茄材料(图6B)，即为目的非转基因紫黑果番茄材料。
由以上结果可知，本发明的基因编辑方法可以快速将含Aft位点的浅紫果番茄材料转变为高花青素紫黑果材料，有重要的应用价值和育种前景。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京市农林科学院
<120> 一种通过基因编辑创制紫黑果番茄材料的方法
<160> 7
<210> 1
<211> 953bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atggcagatt ggaatagatc aagcacatca gataatgcct cagtggtctc acctggtaat 60
taacaattct tttttatttt atcgcaagag cttttaatta ttcttttcgt tcacttttat 120
tgatctattt tggacatctc atgctcctta ccaaaaattt cttttgatat aagggtccta 180
cagtacatat taattgatat ttgatattat gttttgaaag aagatttgag aaataaataa 240
ctaatgagct aagggtaaac atgaaataaa atatttgtct ttttttcatg ttaaaaagta 300
acgagtaaaa atgaacggat acttttatat ttgcttataa atatattcct taaaggaatt 360
tggagaacat tatgatatga ttatctgcgt ctaaccatat actctaataa tgccataagt 420
aaacaaatat ttatcctttt ggctacttcc aaaatacatg ttcatttatg aaatcatttt 480
ttttaataat aagttagtta gtcggaattt agaatttaaa atttatgtat ttttatacat 540
caagttaata tattacacta cttataagtt cacaattaaa tattcaattt tgttaataat 600
tttcttaata tatttataag tctaaataaa agttattgag ttcacgtgaa ttcattatag 660
attcgacccg agtggttgca ttagagacta ccaacgaaga aacctctaaa cttgaatttt 720
cagaagatga agaaatgctc attgctaaaa tgttcagctt ggttagagag aggtacgttt 780
aatatttttt taaaaaaatt cttgaatttt gtgtattaat tatttaaggt ttaatataaa 840
attgtcatgg tgtaatttta attaggtggt cattaattgc tggaagaatc ccaggaagaa 900
atgctgatga gattgaaaaa tattggaaat caaaatactc caaaagccag taa 953
<210> 2
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gagtggttgc attagagac 19
<210> 3
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gttcagcttg gttagagag 19
<210> 4
<211> 12482bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gtgccgaatt cggatccgga gcggagaatt aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg 60
acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgttga aggagccact 120
gagccgcggg tttctggagt ttaatgagct aagcacatac gtcagaaacc attattgcgc 180
gttcaaaagt cgcctaaggt cactatcagc tagcaaatat ttcttgtcaa aaatgctcca 240
ctgacgttcc ataaattccc ctcggtatcc aattagagtc tcatattcac tctcctattt 300
ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacat ttacaattac 360
catggttgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt 420
cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc 480
agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact 540
gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt 600
gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca 660
ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat 720
gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg 780
catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga 840
agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga 900
cggcgaggat ctcgtcgtga ctcatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa 960
tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga 1020
catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt 1080
cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct 1140
tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgctagag tcctgcttta atgagatatg 1200
cgagacgcct atgatcgcat gatatttgct ttcaattctg ttgtgcacgt tgtaaaaaac 1260
ctgagcatgt gtagctcaga tccttaccgc cggtttcggt tcattctaat gaatatatca 1320
cccgttacta tcgtattttt atgaataata ttctccgttc aatttactga ttgtacccta 1380
ctacttatat gtacaatatt aaaatgaaaa caatatattg tgctgaatag gtttatagcg 1440
acatctatga tagagcgcca caataacaaa caattgcgtt ttattattac aaatccaatt 1500
ttaaaaaaag cggcagaacc ggtcaaacct aaaagactga ttacataaat cttattcaaa 1560
tttcaaaagt gccccagggg ctagtatcta cgacacaccg agcggcgaac taataacgct 1620
cactgaaggg aactccggtt ccccgccggc gcgcatgggt gagattcctt gaagttgagt 1680
attggccgtc cgctctaccg aaagttacgg gcaccattca acccggtcca gcacggcggc 1740
cgggtaaccg acttgctgcc ccgagaatta tgcagcattt ttttggtgta tgtgggcccc 1800
aaatgaagtg caggtcaaac cttgacagtg acgacaaatc gttgggcggg tccagggcga 1860
attttgcgac aacatgtcga ggctcagccg ctgcaagaat tcaagcttgg aggtcaacat 1920
ggtggagcac gacactctgg tctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct cagaagatca 1980
aagggctatt gagacttttc aacaaaggat aatttcggga aacctcctcg gattccattg 2040
cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct cctacaaatg 2100
ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatctc tctgccgaca gtggtcccaa 2160
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gaggttccaa ccacgtctac 2220
aaagcaagtg gattgatgtg ataacatggt ggagcacgac actctggtct actccaaaaa 2280
tgtcaaagat acagtctcag aagatcaaag ggctattgag acttttcaac aaaggataat 2340
ttcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt 2400
agaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcattca 2460
agatctctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 2520
aaaagaagag gttccaacca cgtctacaaa gcaagtggat tgatgtgaca tctccactga 2580
cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 2640
ttcatttcat ttggagagga cacgctcgag tataagagct catttttaca acaattacca 2700
acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tacatttaca attatcgata caatggacaa 2760
gaagtactcc attgggctcg atatcggcac aaacagcgtc ggctgggccg tcattacgga 2820
cgagtacaag gtgccgagca aaaaattcaa agttctgggc aataccgatc gccacagcat 2880
aaagaagaac ctcattggcg ccctcctgtt cgactccggg gagacggccg aagccacgcg 2940
gctcaaaaga acagcacggc gcagatatac ccgcagaaag aatcggatct gctacctgca 3000
ggagatcttt agtaatgaga tggctaaggt ggatgactct ttcttccata ggctggagga 3060
gtcctttttg gtggaggagg ataaaaagca cgagcgccac ccaatctttg gcaatatcgt 3120
ggacgaggtg gcgtaccatg aaaagtaccc aaccatatat catctgagga agaagcttgt 3180
agacagtact gataaggctg acttgcggtt gatctatctc gcgctggcgc atatgatcaa 3240
atttcgggga cacttcctca tcgaggggga cctgaaccca gacaacagcg atgtcgacaa 3300
actctttatc caactggttc agacttacaa tcagcttttc gaagagaacc cgatcaacgc 3360
atccggagtt gacgccaaag caatcctgag cgctaggctg tccaaatccc ggcggctcga 3420
aaacctcatc gcacagctcc ctggggagaa gaagaacggc ctgtttggta atcttatcgc 3480
cctgtcactc gggctgaccc ccaactttaa atctaacttc gacctggccg aagatgccaa 3540
gcttcaactg agcaaagaca cctacgatga tgatctcgac aatctgctgg cccagatcgg 3600
cgaccagtac gcagaccttt ttttggcggc aaagaacctg tcagacgcca ttctgctgag 3660
tgatattctg cgagtgaaca cggagatcac caaagctccg ctgagcgcta gtatgatcaa 3720
gcgctatgat gagcaccacc aagacttgac tttgctgaag gcccttgtca gacagcaact 3780
gcctgagaag tacaaggaaa ttttcttcga tcagtctaaa aatggctacg ccggatacat 3840
tgacggcgga gcaagccagg aggaatttta caaatttatt aagcccatct tggaaaaaat 3900
ggacggcacc gaggagctgc tggtaaagct taacagagaa gatctgttgc gcaaacagcg 3960
cactttcgac aatggaagca tcccccacca gattcacctg ggcgaactgc acgctatcct 4020
caggcggcaa gaggatttct accccttttt gaaagataac agggaaaaga ttgagaaaat 4080
cctcacattt cggataccct actatgtagg ccccctcgcc cggggaaatt ccagattcgc 4140
gtggatgact cgcaaatcag aagagactat cactccctgg aacttcgagg aagtcgtgga 4200
taagggggcc tctgcccagt ccttcatcga aaggatgact aactttgata aaaatctgcc 4260
taacgaaaag gtgcttccta aacactctct gctgtacgag tacttcacag tttataacga 4320
gctcaccaag gtcaaatacg tcacagaagg gatgagaaag ccagcattcc tgtctggaga 4380
gcagaagaaa gctatcgtgg acctcctctt caagacgaac cggaaagtta ccgtgaaaca 4440
gctcaaagaa gattatttca aaaagattga atgtttcgac tctgttgaaa tcagcggagt 4500
ggaggatcgc ttcaacgcat ccctgggaac gtatcacgat ctcctgaaaa tcattaaaga 4560
caaggacttc ctggacaatg aggagaacga ggacattctt gaggacattg tcctcaccct 4620
tacgttgttt gaagataggg agatgattga agaacgcttg aaaacttacg ctcatctctt 4680
cgacgacaaa gtcatgaaac agctcaagag gcgccgatat acaggatggg ggcggctgtc 4740
aagaaaactg atcaatggga tccgagacaa gcagagtgga aagacaatcc tggattttct 4800
taagtccgat ggatttgcca accggaactt catgcagttg atccatgatg actctctcac 4860
ctttaaggag gacatccaga aagcacaagt ttctggccag ggggacagtc tccacgagca 4920
catcgctaat cttgcaggta gcccagctat caaaaaggga atactgcaga ccgttaaggt 4980
cgtggatgaa ctcgtcaaag taatgggaag gcataagccc gagaatatcg ttatcgagat 5040
ggcccgagag aaccaaacta cccagaaggg acagaagaac agtagggaaa ggatgaagag 5100
gattgaagag ggtataaaag aactggggtc ccaaatcctt aaggaacacc cagttgaaaa 5160
cacccagctt cagaatgaga agctctacct gtactacctg cagaacggca gggacatgta 5220
cgtggatcag gaactggaca tcaatcggct ctccgactac gacgtggatc atatcgtgcc 5280
ccagtctttt ctcaaagatg attctattga taataaagtg ttgacaagat ccgataaaaa 5340
tagagggaag agtgataacg tcccctcaga agaagttgtc aagaaaatga aaaattattg 5400
gcggcagctg ctgaacgcca aactgatcac acaacggaag ttcgataatc tgactaaggc 5460
tgaacgaggt ggcctgtctg agttggataa agccggcttc atcaaaaggc agcttgttga 5520
gacacgccag atcaccaagc acgtggccca aattctcgat tcacgcatga acaccaagta 5580
cgatgaaaat gacaaactga ttcgagaggt gaaagttatt actctgaagt ctaagctggt 5640
ttcagatttc agaaaggact ttcagtttta taaggtgaga gagatcaaca attaccacca 5700
tgcgcatgat gcctacctga atgcagtggt aggcactgca cttatcaaaa aatatcccaa 5760
gcttgaatct gaatttgttt acggagacta taaagtgtac gatgttagga aaatgatcgc 5820
aaagtctgag caggaaatag gcaaggccac cgctaagtac ttcttttaca gcaatattat 5880
gaattttttc aagaccgaga ttacactggc caatggagag attcggaagc gaccacttat 5940
cgaaacaaac ggagaaacag gagaaatcgt gtgggacaag ggtagggatt tcgcgacagt 6000
ccggaaggtc ctgtccatgc cgcaggtgaa catcgttaaa aagaccgaag tacagaccgg 6060
aggcttctcc aaggaaagta tcctcccgaa aaggaacagc gacaagctga tcgcacgcaa 6120
aaaagattgg gaccccaaga aatacggcgg attcgattct cctacagtcg cttacagtgt 6180
actggttgtg gccaaagtgg agaaagggaa gtctaaaaaa ctcaaaagcg tcaaggaact 6240
gctgggcatc acaatcatgg agcgatcaag cttcgaaaaa aaccccatcg actttctcga 6300
ggcgaaagga tataaagagg tcaaaaaaga cctcatcatt aagcttccca agtactctct 6360
ctttgagctt gaaaacggcc ggaaacgaat gctcgctagt gcgggcgagc tgcagaaagg 6420
taacgagctg gcactgccct ctaaatacgt taatttcttg tatctggcca gccactatga 6480
aaagctcaaa ggatctcccg aagataatga gcagaagcag ctgttcgtgg aacaacacaa 6540
acactacctt gatgagatca tcgagcaaat aagcgaattc tccaaaagag tgatcctcgc 6600
cgacgctaac ctcgataagg tgctttctgc ttacaataag cacagggata agcccatcag 6660
ggagcaggca gaaaacatta tccacttgtt tactctgacc aacttgggcg cgcctgcagc 6720
cttcaagtac ttcgacacca ccatagacag aaagcggtac acctctacaa aggaggtcct 6780
ggacgccaca ctgattcatc agtcaattac ggggctctat gaaacaagaa tcgacctctc 6840
tcagctcggt ggagacagca gggctgaccc caagaagaag aggaaggtgt gagcttgtca 6900
agcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 6960
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 7020
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 7080
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 7140
atctatgtta ctagatcgac gctactagaa ttcgagctcg gagtgatcaa aagtcccaca 7200
tcgatcaggt gatatatagc agcttagttt atataatgat agagtcgaca tagcgattgg 7260
agtggttgca ttagagacgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 7320
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tctagaccca gctttcttgt 7380
acaaagttgg cattacgctt tacgaattcc catggggagt gatcaaaagt cccacatcga 7440
tcaggtgata tatagcagct tagtttatat aatgatagag tcgacatagc gattggttca 7500
gcttggttag agaggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 7560
caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcta gacccagctt tcttgtacaa 7620
agttggcatt acgctcagag aggatgcaca tgtgaccgag ggacacgaag tgatccgttt 7680
aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat 7740
tagaataatc ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt 7800
gccagccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 7860
gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 7920
tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 7980
aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 8040
aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 8100
ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 8160
ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 8220
cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 8280
atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 8340
accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 8400
gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 8460
gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 8520
ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 8580
cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 8640
aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 8700
gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 8760
agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 8820
ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 8880
atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 8940
accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 9000
tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 9060
cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 9120
gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 9180
tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 9240
cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 9300
gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 9360
tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 9420
cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 9480
gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 9540
gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 9600
tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 9660
tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 9720
agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 9780
gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 9840
gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 9900
ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 9960
cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 10020
aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 10080
catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 10140
gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaagcttct ttcctgtgga 10200
tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 10260
cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 10320
aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 10380
ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaacagctg caaaaagcgc ctacccttcg 10440
gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 10500
aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 10560
actcgaccgc cggcgcccac atcaaggctc cgagtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 10620
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 10680
taatattgaa aaaggaagag tatggctaaa atgagaatat caccggaatt gaaaaaactg 10740
atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa ggtatataag 10800
ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc 10860
acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt 10920
ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc 10980
gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag 11040
ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg 11100
aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat 11160
gtggattgcg aaaactggga agaggacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat 11220
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agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc 11340
agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgctcaggga ggatatcggg 11400
gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa 11460
ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagctgt cagaccaagt ttactcatat 11520
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 11580
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 11640
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ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 11760
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 11820
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gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 12180
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 12240
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ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt 12420
gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactggg gttgaacact 12480
ct 12482
<210> 5
<211> 859bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
atggcagatt ggaatagatc aagcacatca gataatgcct cagtggtctc acctggtaat 60
taacaattct tttttatttt atcgcaagag cttttaatta ttcttttcgt tcacttttat 120
tgatctattt tggacatctc atgctcctta ccaaaaattt cttttgatat aagggtccta 180
cagtacatat taattgatat ttgatattat gttttgaaag aagatttgag aaataaataa 240
ctaatgagct aagggtaaac atgaaataaa atatttgtct ttttttcatg ttaaaaagta 300
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tggagaacat tatgatatga ttatctgcgt ctaaccatat actctaataa tgccataagt 420
aaacaaatat ttatcctttt ggctacttcc aaaatacatg ttcatttatg aaatcatttt 480
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caagttaata tattacacta cttataagtt cacaattaaa tattcaattt tgttaataat 600
tttcttaata tatttataag tctaaataaa agttattgag ttcacgtgaa ttcattatag 660
attcgacccg agagagaggt acgtttaata tttttttaaa aaaattcttg aattttgtgt 720
attaattatt taaggtttaa tataaaattg tcatggtgta attttaatta ggtggtcatt 780
aattgctgga agaatcccag gaagaaatgc tgatgagatt gaaaaatatt ggaaatcaaa 841
atactccaaa agccagtaa 859
<210> 6
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
ttggacatct catgctcctt 20
<210> 7
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
tgggattctt ccagcaatta 20
Claims (4)
1.一种创制高花青素番茄材料的方法，包括如下步骤：先利用CRISPR/Cas9系统对含有Aft位点的番茄材料基因组中的花青素合成调控基因Solyc07g052490进行编辑，进而使所述Solyc07g052490功能丧失，再筛选Solyc07g052490基因纯合突变体；得到高花青素番茄材料；
所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述含有Aft位点的番茄材料基因组中编码Solyc07g052490蛋白的DNA片段或部分片段；
所述sgRNA1识别的靶序列为序列2所示的DNA分子；
所述sgRNA2识别的靶序列为序列3所示的DNA分子；
所述编辑的方法为将向所述含有Aft位点的番茄材料中导入表达所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的载体；
所述sgRNA1的编码基因为序列4第7260-7354位所示的DNA分子；
所述sgRNA2的编码基因为序列4第7496-7590位所示的DNA分子；
所述Cas9蛋白的编码基因为序列4第2753-6856所示的DNA分子。
2.一种非转基因高花青素番茄材料的获得方法，包括如下步骤：将权利要求1所述方法获得的高花青素番茄材料自交，得到自交子代，选择Solyc07g052490纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为非转基因高花青素番茄材料。
3.权利要求1所述的方法在培育高花青素紫黑果番茄杂交种中的应用。
4.如下(1)-(4)中任一种生物材料在创制高花青素番茄材料中的应用；
(1)权利要求1中所述表达sgRNA1的编码基因、sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的载体；
(2)含有权利要求1中所述载体的微生物转化体；
(3)权利要求1中所述的靶序列；
(4)序列5所示的花青素合成调控基因Solyc07g052490的突变序列。
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| "Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutrality and early yield in tomato";Sebastian Soyk, et al.;《Nature genetics》;20161205;第49卷(第1期);线上方法第2页左栏第2,3,4段，第164页右栏图2 * |
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