CN115261405B - 一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法，利用CRISPR/Cas9系统对番茄材料基因组中的转录因子SlNAP1进行编辑，进而使转录因子SlNAP1性能丧失，从而延缓番茄果实成熟；所述CRISPR/Cas9系统包括两个sgRNA靶位点，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄材料基因组中编码SlNAP1蛋白的DNA片段。本发明获得一个SlNAP1敲除株系，并发现SlNAP1基因能正调控番茄果实成熟。抑制SlNAP1在番茄果实中的表达，能延缓绿熟期果实叶绿素的降解和转色期果实类胡萝卜素的积累，从而延缓果实成熟的进程。

Description

一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法
技术领域
本发明属于植物基因编辑技术领域，具体涉及一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法，具体涉及使用CRISPR-Cas9系统对番茄进行SlNAP1基因的双位点(CTGATCTTCCTCCTGGATTT和CAGAATTTGGAGACAATGAG)进行编辑的方法。
背景技术
番茄是一种世界范围内广泛种植的设施作物，其营养丰富，口味鲜美，深受大众喜爱。因此，在番茄实际生产中栽培番茄的优良品种是至关重要的。应用遗传工程改良作物品种是未来的研究方向之一，挖掘重要品质调控基因是各国竞相角逐的前沿领域。因此，如何应用遗传工程改良番茄品种是未来生产中亟待解决的问题。
果实成熟是一个尤为复杂的过程，它需要环境因素和蛋白高度协调，调控果实成熟中一系列生理生化的改变，达到调控果实品质的效果，比如色泽、风味、口感、质地和营养成分等。果实成熟还伴随一系列的生理生化过程，比如叶绿素降解和类胡萝卜素积累等。近年来，研究发现一些转录因子能直接或间接调控果实成熟相关基因的表达，调控果实成熟。例如转录因子CNR、RIN和NOR是目前在番茄果实成熟中发现的最重要的成熟相关转录因子。RIN转录因子缺失突变的番茄果实不能正常成熟，应用RIN位点培育的耐贮番茄品种显著提高了番茄果实的货架寿命。在番茄中，转录因子NAC1，NAC4，NOR-like等被报道调控番茄果实成熟。因此，对于跃变型果实的成熟相关转录因子的发掘，目前研究还存在很多不足。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法，是使用CRISPR-Cas9系统对番茄进行SlNAP1基因编辑，并提供可高效敲除SlNAP1基因的双编辑位点(CTGATCTTCCTCCTGGATTT和CAGAATTTGGAGACAATGA G)。该编辑位点可用于Cas9介导的番茄SlNAP1基因打靶，使其功能失活，从而延缓番茄果实成熟。本发明针对SlNAP1基因设计、筛选可高效切割的基因编辑位点，为构建Sl NAP1基因内源性敲除或定点敲入外源基因的番茄提供新途径。
本发明提供一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法，利用CRISPR/Cas9系统对番茄材料基因组中的转录因子SlNAP1进行编辑，进而使转录因子SlNAP1性能丧失，从而延缓番茄果实成熟；
所述CRISPR/Cas9系统包括两个sgRNA靶位点，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄材料基因组中编码SlNAP1蛋白的DNA片段。
作为优选方案，所述sgRNA1靶位点序列为：CTGATCTTCCTCCTGGATTT；
所述sgRNA2靶位点序列为：CAGAATTTGGAGACAATGAG。
作为优选方案，所述编辑的方法为向所述番茄材料中导入番茄基因组编辑的载体；
所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1靶位点序列、所述sgRNA2靶位点序列的编码基因；
作为进一步优选，所述方法还包括筛选SlNAP1纯合突变体的步骤。
本发明还提供SlNAP1基因在调控番茄果实成熟中的应用；作为进一步优选，所述调控为正调控。
本发明还提供一种晚熟番茄材料的获得方法，包括以下步骤：将上述方法获得的番茄材料自交，得到自交子代，选择SlNAP1纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为晚熟番茄材料。
本发明还提供上述的方法在培育晚熟番茄材料中的应用。
本发明还提供如下(1)-(3)中任一种生物材料：
(1)上述的靶位点序列；
(2)上述的番茄基因组编辑的载体；
(3)含有上述的番茄基因组编辑的载体的微生物转化体。
本发明还提供上述的载体或微生物转化体或靶位点序列在延缓番茄果实成熟性能中的应用；
或，上述的载体或微生物转化体或靶位点序列在培育晚熟番茄材料中的应用；
或，上述的载体或微生物转化体或靶位点序列在番茄育种中的应用。
本发明还提供一种鉴定待测番茄是否为上述方法获得的晚熟番茄材料或其子代的方法，其特征在于：包括以下步骤：
分别提取番茄野生株和待测番茄转化株基因组DNA，以上游引物和下游引物对番茄野生株和待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物测序结果，判断待测番茄是否为上述方法获得的延缓果实成熟的番茄材料或其子代，判断方法为将转化株测序结果与野生型植株测序结果进行比对，如果在sgRNA1、sgRNA2附近或二者之间出现碱基的缺失或插入，即可判断其为上述方法获得的晚熟番茄或其子代；
所述上游引物：CTAAAATTTCATTTTCTCTC
所述下游引物：GATAATATGTGTCTTAAGTA。
本发明还提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述方法获得的晚熟番茄材料或其子代的产品，为如下(1)-(3)中的任一种：
(1)上述的上游引物和下游引物；
(2)含有(1)所述的上游引物和下游引物的PCR试剂；
(3)含有(1)所述的上游引物和下游引物或(2)所述的PCR试剂的试剂盒。
本发明获得一个SlNAP1敲除株系，并首次发现SlNAP1基因能正调控番茄果实成熟，并且与叶绿素降解和类胡萝卜素积累色素途径相关。抑制SlNAP1在番茄果实中的表达，能延缓绿熟期果实叶绿素的降解和转色期果实类胡萝卜素的积累，从而延缓果实成熟的进程。因此，通过合理利用该基因可以调节番茄早熟品种的果实上市时间，为番茄生产服务。本发明为利用基因工程技术调控果实成熟进程提供了理论依据与技术手段，因此在调控番茄早熟品种果实上市时间具有重大的应用价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为WT组和slnap1-5突变体组株系的表型。
图2为WT组和slnap1-5突变体组叶绿素含量。
图3为WT组和slnap1-5突变体组类胡萝卜素、叶黄素、番茄红素及β类胡萝卜素含量。
图4为WT组和slnap1-5突变体组叶绿素降解相关基因表达量。
图5为WT组和slnap1-5突变体组类胡萝卜素积累相关基因表达量。
图6为WT组和slnap1-5突变体组成熟相关基因表达量。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1利用CRISPR/Cas9技术获得SlNAP1敲除突变体slnap1
1CRISPR/Cas9载体的构建
1.1CRISPR/Cas9引物的设计
从Phytozome网站查找SlNAP1的登录号，其登录号为Solyc05g007770.2.1，将登录号输入CRISPR-PLANT中设计引物并选择，选择的原则是靠近ATG，选择两个靶位点进行打靶，确保靶点序列在外显子区域，保证靶点序列的连续性，如果是反义链要翻译成正义链。
得到的sgRNA靶位点序列1为：CTGATCTTCCTCCTGGATTT
sgRNA靶位点序列2为：CAGAATTTGGAGACAATGAG。
sgRNA靶位点序列1和2在番茄SlNAP1基因的CDS区域，在5号染色体上，编码区坐标在SlNAP1基因的第一个外显子上。
根据选择的sgRNA核心序列，设计正义链引物和反义链引物，最终得到的正义链引物和反义链引物分别为：
模板1上游引物：CTGGTCTCTATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTG
模板1下游引物：CTGGTCTCTAAATCCAGGAGGAAGATCAGTGCACCAGCCGGGAA
模板2上游引物：GCTGGTCTCTATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
模板2下游引物：GCTGGTCTCTAAACCTCATTGTCTCCAAATTCTGTGCACCAGCCGGGAATCG
SlNAP1基因的CDS核苷酸序列为：
>Solyc05g007770.2.1CDS
上述标下划线的部分为靶位点序列。
上述SlNAP1基因的氨基酸序列为：
>Solyc05g007770.2.1
1.2靶点序列的扩增
PCR反应体系见表1。
表1反应体系
表1中的引物为模板1上游引物和模板1下游引物，或者为模板2上游引物与模板2下游引物，分别用于扩增模板1和模板2。
PCR反应条件见表2。
表2克隆目的片段的PCR反应程序
1.3跑胶并切胶回收
(1)向吸附柱CB2中加入500uL BL平衡液。12 000g离心1min，将收集管中的废液倒掉；
(2)按照常规方法将PCR产物进行电泳，然后切下单一条带放入灭菌离心管中，称取重量；
(3)加入等倍体积PC溶液。在50℃水浴放置10min左右后取出，为了确保胶块充分溶解，在其间不断温和的上下翻转离心管；
(4)然后12 000g离心2min，弃废液；
(5)向吸附柱CB2中加入600uL PW漂洗液，12 000g离心1min，并弃废液；
(6)重复操作步骤5；
(7)12 000g离心2min，打开盖子室温放置数分钟至彻底晾干；
(8)换灭菌离心管，向吸附膜中间悬空滴加40μL EB洗脱缓冲液。然后室温放置2min，在12 000g离心2min收集DNA溶液。
1.4连接
连接载体反应体系见表3。
表3连接反应体系
缓慢混匀。
用下列条件进行连接：
37°1h；60°5min。
1.5热激转化
(1)从-80℃冰箱取制备好的Trans5α大肠感受态细胞(厂家：北京全式金生物，货号：CD201-01)，在冰上慢慢融化；
(2)待完全融化成液体后，吸取2μL步骤1.4制备的质粒加入到装有感受态细胞的管中，混匀，在冰上静置30min；
(3)然后42℃金属浴热击90sec；
(4)插入冰中放2min；
(5)之后每管加入无抗性的LB液体培养基1mL，混匀，37℃，165rpm培养45min；
(6)室温，6 000g，离心1min，倒取上清液留少许，悬起沉淀，涂在LB固体培养基上，37℃倒置培养至长出单菌落。
1.6鉴定阳性菌落
菌落PCR反应体系见表4。
表4菌落PCR反应体系
其中，Primer F为：TGTAAAACGACGGCCAGT。
Primer R：GGTATTGGTTTATCTCATCGGAACTGCA。
反应条件同表2。
1.7质粒小提
使用TIANprep Mini PlasmidKit质粒提取试剂盒(Cat.#DP103-02)进行质粒提取，提取方法具体如下：
(1)向吸附柱CP4中加入500uL BL平衡液。在12 000g离心1min，将收集管中的废液倒掉；
(2)取1.5mL过夜培养的步骤1.6经鉴定为阳性的菌液加入离心管中，12 000g离心1min，弃上清，重复多次至菌液离心完；
(3)加入500uL P1溶液悬起菌体；
(4)向离心管中加入500uL P2溶液，上下翻转使菌体充分裂解；
(5)向离心管中加入700uL P3溶液，上下翻转充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12 000g离心10min，此时在离心管底部形成沉淀；
(6)将上述上清液加入吸附柱中CP4，12 000g离心1min，弃废液；
(7)向吸附柱CP4中加入600uL PW漂洗液，12 000g离心1min，弃废液；
(8)重复操作步骤8；
(9)然后12 000g离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。打开盖子室温放置数分钟至彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入一个干净的灭菌离心管中，加50uL EB洗脱缓冲液，室温放置2-5min。12 000g离心2min，将质粒溶液收集到离心管中；
(11)质粒DNA浓度及纯度检测(质粒的浓度200-300ng/uL，OD260/280为1.8-2.0)。
得到的质粒DNA的浓度和纯度可用紫外分光光度计检测。
将所得质粒进行测序，若所测序列包含设计的靶点，说明测序合格，载体构建成功。2农杆菌介导的番茄的遗传转化(叶盘法)
2.1无菌番茄幼苗的种植
(1)取一定数量的番茄种子置于装少许水的锥形瓶并封口，摇床培养8-10h，温度28℃,转速165rpm，弃溶液。将培养好的种子倒入无菌的培养皿中，倒入75％的无水乙醇，浸洗45sec，弃溶液，用灭菌水清洗2次，加入10％的次氯酸钠溶液(现用现配)，浸洗15min，弃溶液，用灭菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；
(2)在超净工作台中，用无菌镊子将消完毒的种子均匀摆放至1/2MS培养基中，每个培养瓶约20-30粒；
(3)放置于黑暗条件下培养2～3d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至3-5mm；
(4)将发芽种子的培养瓶转入光照培养，生长条件为温度25℃，16h光照/8h黑暗交替照明，至子叶完全展开，但真叶还未长出。
2.2无菌番茄叶片外植体的获得
(1)在超净工作台中，用无菌镊子拔出无菌苗完全展开的子叶，将其子叶置于无菌水中，防止失水；
(2)在培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌剪刀将无菌子叶剪成0.4-0.6cm大小，子叶背面朝上，均匀放至在培养基上；
(3)封口胶带封住培养皿，置于暗处，温度25℃，预培养2d。
2.3农杆菌侵染番茄叶片外植体
(1)取50μL的农杆菌感受态(GV3101菌株)至1.5mL无菌离心管，取2μL步骤1.7的测序成功的载体加入农杆菌感受态中，使用电转仪进行电击转化，将上述感受态转移至LB液体培养基28℃复苏2h，然后将菌液涂在含有相关抗生素的固体培养基上进行培养24h左右，挑取含目的基因质粒的农杆菌单菌落置于装有1mL LB培养基(加入相应的抗生素)的1.5mL无菌离心管，在温度28℃，转速200rpm摇床培养24h，使菌液完全复苏；
(2)取200μL菌液加到新的20mL LB培养基(加入相应的抗生素)中，28℃，200rpm摇床培养12h，培养至对数中期，在超净工作台吸取1mL菌液测定OD值，用不加抗生素的LB培养基调零，至菌液浓度OD600达到0.8-1.0；
(3)将置于暗处预培养2d的步骤2.2制备的无菌叶片收集到无菌培养皿中，倒入菌液，侵染2min，此过程避光并不断摇晃培养皿，使得叶片接触到菌液；
(4)迅速用无菌镊子将子叶捞到带无菌滤纸的空的培养皿中，用无菌的碎片滤纸擦干叶片表面的菌液，将叶片背面朝上，均匀的摆放到培养基上，需要更换滤纸；
(5)封口胶带封住培养皿，置于暗处，温度25℃，共培养2d。如果叶片受伤严重，可只共培养1d。
2.4获得转基因幼苗
将共培养的叶片进行植物组织培养，诱导出愈伤组织和芽，继续进行培养，直至长成完整的植株，将其转基因幼苗移出培养皿。
2.5T0代转基因植株的移土培养
(1)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
(2)将转基因幼苗从培养基中拔出，洗净根上的培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
(3)用适当大小的透明一次性水杯罩住植株，避免失水。光照培养(16h光照/8h黑暗交替照明)，温度为光照时25℃，黑暗时20℃；待转基因苗完全适应环境后，慢慢将水杯移除，继续培养至三叶一心大小时，按照下述步骤3的方法进行验苗，筛出阳性植株，然后继续培养繁种直至获得完全纯合的株系。
3T0代转基因植株分子鉴定
3.1T0代转基因植株DNA的提取
操作步骤参照植物DNA快提液试剂盒说明书，具体如下：
(1)剪取植物叶片(幼苗组织更好)3-5mm，放入2mL离心管；
(2)每管加一粒瓷珠，同时加入200μL的快提液；
(3)将离心管放入组织研磨机里打磨1min，频率24Hz；
(4)样品打碎后放入离心管内13000rpm离心1min，直接取上清1μL用于PCR鉴定。
3.2T0代转基因植株的PCR鉴定以及纯合突变体的获得
以转基因植株基因组DNA为模板，野生型植物DNA为阴性对照，分别进行PCR扩增。引物，反应体系和反应条件如下：
表5 T0代转基因植株的PCR鉴定反应体系
其中，Primer F为：CTAAAATTTCATTTTCTCTC
Primer R：GATAATATGTGTCTTAAGTA。
反应条件为：反应条件同表2。
扩增得到的PCR反应液送去擎科生物公司测序，比对序列并看测序结果图谱，如果测序结果图谱在靶点附近或者靶点处是双峰，则为杂合体，杂合体的后代自交获得纯合体；如果图谱在靶点附近或者靶点处是单峰，且靶点附近有碱基的缺失或者添加，则为纯合体。T0代的组培苗所获种子即为T1代，将T1代继续播种，验苗(和T0代植株验苗方法一致)，获得纯合的突变体植株，将纯合的突变体进行繁种，留种，得到纯合的slnap1-5突变体。
实施例2SlNAP1基因调控番茄果实成熟的实验
1.实验样品
野生型番茄(WT)和slnap1-5突变体。
2.叶绿素含量测定
分别取WT组和实施例1制备的slnap1-5突变体组株系的绿熟期(MG)，绿熟期后第4天(MG+4)，绿熟期后第7天(MG+7)，转色期(Br)，转色期后第4天(Br+4)，转色期后第7天(Br+7)，转色期后第12天(Br+12)，转色期后第15天(Br+15)番茄果实实验样品1g，液氮研磨，加入10mL 95％乙醇，避光静置24h。空白对照是95％的乙醇，在波长665nm和649nm处测定吸光度A。用以下公式计算：
Chla＝13.95×A665nm-6.88×A649nm
Chlb＝24.96×A649nm-7.32×A665nm
Cchl＝(Chla+Chlb)×V/m×1000。
3.类胡萝卜素含量
使用丙酮浸提法提取番茄果实总类胡萝卜素并测定，方法参考杨淑一的。首先，分别取WT组和slnap1-5突变体组株系的绿熟期(MG)，绿熟期后第4天(MG+4)，绿熟期后第7天(MG+7)，转色期(Br)，转色期后第4天(Br+4)，转色期后第7天(Br+7)，转色期后第12天(Br+12)，转色期后第15天(Br+15)番茄果实实验样品1g，用液氮研磨成粉末，加5mL 80％的丙酮，4℃，避光提取24h。之后，离心15min(4℃、8000r/min)，取上清液备用。空白对照是80％丙酮，在470nm波长下测得光密度值，每组试验中三次重复。
4.叶黄素、番茄红素及β类胡萝卜素含量
取0.5gWT组和slnap1-5突变体组株系的绿熟期(MG)，绿熟期后第4天(MG+4)，绿熟期后第7天(MG+7)，转色期(Br)，转色期后第4天(Br+4)，转色期后第7天(Br+7)，转色期后第12天(Br+12)，转色期后第15天(Br+15)番茄果实实验样品，用50mL石油醚和丙酮(2:1，v/v)在超声波条件下提取类胡萝卜素，将提取液收集到棕色瓶中，直至除去所有颜色，然后将合并的滤液转移到分液漏斗中，用250mL蒸馏水洗涤两次，排出水相后，加入无水硫酸钠去除水相，在真空下用砂芯漏斗过滤，倒入圆底烧瓶中，在小于45℃下旋转蒸发将石油醚提取物减少至干燥。最后用25mL乙腈：二氯甲烷：甲醇(体积比55:20:25)溶解，并通过0.22μm膜进行过滤，上机。采用HPLCCI8柱(250mm×4.6mm，5μm，Waters Symmetry)，柱温为25℃，流速是1.2mL·min-1，流动相为乙睛：二氯甲烷：甲醇(体积比为55:20:25)，使用配备有1525泵和2998光电二极管阵列检测器的Waters液相色谱系统进行类胡萝卜素的HPLC分析。吸取10uL样品在450nm处检测叶黄素、番茄红素及β类胡萝卜素。
5.SlNAP1敲除突变体slnap1果实成熟相关基因检测
采用实时荧光定量RT-PCR的检测方法，对WT组和slnap1-5突变体组株系的绿熟期(MG)，绿熟期后第4天(MG+4)，绿熟期后第7天(MG+7)，转色期(Br)，转色期后第4天(Br+4)，转色期后第7天(Br+7)，转色期后第12天(Br+12)，转色期后第15天(Br+15)番茄果实实验样品的成熟关键基因进行了检测，包括叶绿素降解基因，类胡萝卜素积累基因，成熟关键酶基因等。
在本申请的图中，
图1为WT组和slnap1-5突变体组株系的表型。其中，MG是绿熟期，MG+4是绿熟期后第4天，MG+7是绿熟期后第7天，Br是转色期，Br+4是转色期后第4天，Br+7是转色期后第7天，Br+12是指转色期后第12天，Br+15是转色期后第15天。
图2为WT组和slnap1-5突变体组叶绿素含量。其中，MG是MG是绿熟期，MG+4是绿熟期后第4天，MG+7是绿熟期后第7天。
图3为WT组和slnap1-5突变体组类胡萝卜素、叶黄素、番茄红素及β类胡萝卜素含量。其中，A图是WT组和slnap1-5突变体组类胡萝卜素的含量，B图为WT组和slnap1-5突变体组叶黄素、番茄红素及β类胡萝卜素含量；Br是指转色期，Br+4是指转色期后第4天，Br+7是转色期后第7天。
图4为WT组和slnap1-5突变体组叶绿素降解相关基因表达量。其中，MG是绿熟期，MG+4是绿熟期后第4天，MG+7是绿熟期后第7天。
图5为WT组和slnap1-5突变体组类胡萝卜素积累相关基因表达量。其中，Br是指转色期，Br+4是指转色期后第4天，Br+7是指转色期后第7天。
图6为WT组和slnap1-5突变体组成熟相关基因表达量。其中，Br是指转色期，Br+4是转色期后第4天，Br+7是转色期后第7天。
实施例3获得基因编辑晚熟番茄种质材料
通过组培获得的植株为T0代，T0代的组培苗进行自交获得T1代种子，将T1代继续播种，验苗(和T0代植株验苗方法一致)，获得纯合的突变体植株，将纯合的突变体进行繁种，留种，得到纯合的slnap1-5突变体。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9系统对番茄材料基因组中的转录因子SlNAP1进行编辑，进而使转录因子SlNAP1性能丧失，从而延缓番茄果实成熟；
所述CRISPR/Cas9系统包括两个sgRNA靶位点，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄材料基因组中编码SlNAP1蛋白的DNA片段；
所述sgRNA1靶位点序列为：CTGATCTTCCTCCTGGATTT；
所述sgRNA2靶位点序列为：CAGAATTTGGAGACAATGAG。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编辑的方法为向所述番茄材料中导入番茄基因组编辑的载体；
所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1靶位点序列、所述sgRNA2靶位点序列的编码基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括筛选SlNAP1纯合突变体的步骤。
4.一种晚熟番茄材料的获得方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求1-3任一所述方法获得的番茄材料自交，得到自交子代，选择SlNAP1纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为晚熟番茄材料。
5.权利要求4所述的方法在培育晚熟番茄材料中的应用。
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