CN101663400B - 分生组织切除和转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从棉籽中切下包含分生组织的外植体材料。本发明还公开了组织的制备、储存、转化以及选择或确认转化的植物的方法，还公开了由这些方法产生的可转化的分生组织和植物以及用于组织制备的装置。

Description

分生组织切除和转化方法

背景技术

本申请要求于2007年3月9日提交的美国临时申请60/894,096和于2007年4月30日提交的60/915,066的优先权，在此其全部公开内容都通过引用方式结合于本文中。

1.发明领域

本发明主要涉及制备和转化棉花分生植物组织的方法以及后续的转基因植物的再生。

2.相关技术描述

可以通过将异源DNA转移到植物胚的分生组织来获得转化的植物。分生组织包含形成性植物细胞，形成性植物细胞可以分化产生多种植物结构，包括茎、根、叶、种系组织和种子。可以处理和选择或筛选植物分生组织，以确定这些处理过的分生组织中哪些已将新的遗传信息引入种系组织中。美国专利6,384,301和7,002,058以及美国公布20060059589描述了直接对大豆胚的分生组织细胞应用细菌介导的基因转移来遗传转化大豆(Glycine max)的方法。美国公布20050005321描述了从种子中切下大豆分生组织。分离的棉花分生组织和幼苗顶端组织已经被转化(例如WO9215675；美国专利5,164,310；McCabe和Martinell，1993)。但是，由于棉籽的物理和生理性质，为获得转基因植物而切除分生组织材料和转化的条件与大豆的不同。

目前从吸胀(imbibed)的棉籽中切除胚的手工过程是缓慢的，并且具有人工负担(ergonomic burden)。在这一过程中，戴上手套，一次一个地对表面灭菌的种子进行无菌操作。然后小心切下外植体。对于棉花分生组织，仔细地将种子定向，以使用施加的力弹出胚。但是即使小心处理每个种子，可用胚的回收率仍然通常较低。

切下之后胚的细菌污染也是一个重要的考虑方面。为保持外植体的较高生命力和回收率而增加的处理也增加了破坏性污染的可能性(这将会在后面的操作步骤中表现出来)。这样的污染会导致显著的损失，因为一个污染的外植体会在转化和组织培养过程中污染其它样品。这会导致产率和/或转化频率的降低。而且，手工切除过程是极其劳动密集和耗费时间的，并且为转化过程的规模扩大化设置了障碍，在这种扩大化中许多植物一般必须要经过处理来达到理想的结果。因此，迫切需要能够在不会不可接受地增加总费用和/或用于转化的外植体制备时间的同时增加可转化棉胚的可获得性的方法。

发明概述

一方面，本发明提供了一种用于产生转化的棉花组织的高通量方法，包括：a)机械破坏棉籽以获得多个棉胚分生组织外植体；和b)将外植体与选择的DNA序列相接触以获得由选择的DNA转化的至少第一外植体。在某些实施方案中，在与选择的DNA序列相接触之前，外植体储存在0-15℃温度中1小时至7天。在另一些实施方案中，该方法进一步包括由至少第一外植体再生被选择的DNA转化的转基因棉花植物的步骤。在某些实施方案中，该方法不包括由外植体产生愈伤组织培养物。

在特定的实施方案中，转基因棉花植物是经导致种系组织转化的分生组织转化产生的。在某些实施方案中，产生的植物为非嵌合的。在可替代的实施方案中，产生的植物是嵌合的。

在某些实施方案中，该方法进一步包括在外植体与选择的DNA序列接触之前筛选外植体，以确认适合用选择的DNA转化并由其再生转基因植物的部分外植体。在另外的实施方案中，筛选外植体包括将包含外植体的机械破坏的棉籽置于水性环境中，并根据浮力选择将与选择的DNA接触的外植体。在另一些实施方案中，筛选外植体包括筛分机械破坏的棉籽以从种皮和子叶组织中分离出外植体。筛选外植体也可以富集适合转化的外植体部分。

在某些实施方案中，选择的DNA序列编码一种可选择的或可筛选的标记，或者可编码或确定一种农学性状，包括环境适应性，以及其它表型。该性状还可确定理想终产物的产生。该方法还可进一步包括通过将外植体与选择剂相接触来选择或筛选经选择的DNA转化的外植体，其中，可选择的标记提供对选择剂的耐受性。该方法可以进一步限定为包括从外植体再生转基因植物组织。该方法还可以进一步限定为包括从外植体再生嵌合转基因植物组织，以及从植物组织中选择或筛选转基因组织。在其它的实施方案中，该方法进一步包括从外植体再生嵌合植物，并从该植物中选择或筛选转基因组织。在特定的实施方案中，转基因棉花植物组织由分生组织的转化产生。在某些实施方案中，转基因棉花植物由周缘转化(periclinal transformation)产生。

该方法可进一步涉及转基因组织的选择或筛选，包括将组织与选择剂或产生可筛选表型的试剂相接触，该选择剂或产生可筛选表型的试剂选自草丁膦、麦草畏、草甘膦、壮观霉素、链霉素、卡那霉素、G418、巴龙霉素、潮霉素B、咪唑啉酮、GUS的底物及其组合。

在其它的实施方案中，该方法包括通过使种子通过碾碎种子的轧辊来机械破坏棉籽。在特定的实施方案中，轧辊包含次级凹槽。在另一些实施方案中，轧辊由不锈钢制成。

在特定的实施方案中，外植体与选择的DNA序列相接触，例如通过将外植体与能够用选择的DNA至少转化外植体第一细胞的重组根瘤菌或土壤杆菌相接触。在特定的实施方案中，外植体与生长到大约0.0045至大约1.4的OD₆₆₀的重组土壤杆菌培养物相接触。在某些实施方案中，棉花分生组织与土壤杆菌细胞相接触的pH为大约5.0至大约6.0，最高大约10.0。在某些实施方案中，在外植体与重组根瘤菌或土壤杆菌相接触之前，根瘤菌或土壤杆菌在对未转化的外植体有活性的选择剂存在下悬浮。在其它的实施方案中，外植体可以通过微粒轰击与选择的DNA序列相接触。

在某些实施方案中，外植体与选择的DNA序列相接触之后，外植体在35℃下、在选择剂的存在下生长，或者外植体在允许质体正常发育的光照条件下生长。在其它的实施方案中，外植体可以在黑暗中生长。在特定的实施方案中，在35℃下生长大约1-7天，例如大约3-5天；选择剂选自壮观霉素、链霉素、卡那霉素、草甘膦、草丁膦、潮霉素和麦草畏；或者外植体在≥5μ爱因斯坦(包括5-200μ爱因斯坦、5-130μ爱因斯坦或70-130μ爱因斯坦)的光强度和大约16小时光/8小时暗的光周期下生长。

在某些实施方案中，在外植体与选择的DNA接触之前、期间或之后，外植体在杀真菌剂的存在下生长。在某些实施方案中，外植体在杀真菌剂和DMSO的存在下生长。在特定的实施方案中，外植体在制霉菌素、噻苯达唑和DMSO的存在下生长。在另一方面，本发明提供了一种用于高通量产生可转化的植物组织的装置，包括相互间隔的轧辊，该轧辊包含用于向通过轧辊的棉籽施加力的次级凹槽。在某些实施方案中，轧辊之间的间隔为大约2.2mm至大约4mm或大约2.2mm至大约3.5mm，这是根据相对的轧辊的峰顶与谷底之间的距离测量到的。在特定的实施方案中，轧辊由不锈钢制成。该装置进一步可以包含用于从种皮或子叶组织中分离棉花分生组织外植体的分离器。在特定的实施方案中，该分离器包含一个用于确定可转化的植物组织的浮力的液体容器。该装置可以进一步包含一个水和种子接纳盘(containment tray)。在特定的实施方案中，该装置进一步可以包含一个用于清洗该装置的自动机械装置，该机械装置控制一个或多个下述清洗步骤：(a)施加清洗溶液(sanitizing solution)；(b)除去清洗溶液；和(c)在无菌条件下存储该装置。

附图简述

下面的附图是本说明书的一部分，被包含在此意于进一步阐明本发明的某些方面。通过参考附图结合本文提出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：种子切割机器：(A)种子切割机器，全图；(B)料斗；(C)料斗和轧辊的顶视图；(D)显示“峰谷”间隙距离的钢辊的特写图；(E)轧辊的侧视图。

图2：机器切割和棉胚纯化：(A)轧辊间隙大小对胚切除的影响；(B)通过筛分和浮选的纯化对外植体部分纯度的影响；(C)切除的棉胚的特写图。

图3：筛子横截面图(V-技术)，(A)为侧面示意图；(B)为顶视图；(C)为底视图。

图4：包含水和种子接纳系统的切割机器。

图5：壮观霉素作为早期确认转化的选择剂和可视标记。(A-B)为两张嵌合转化棉花组织的图，显示未转化的组织在壮观霉素选择中出现变白，并通常为畸形，而转化的组织为绿色的，并且正常发育。还显示了存活的转化的芽。

图6：DNA印迹杂交结果，证实了转化，以及机器切割的转基因棉花组织的确认。

图7：蛋白质印迹，两次曝光，证实了来自机器切割的外植体的棉花组织中DMO转基因的表达。

图8：随着向共培养培养基中添加的壮观霉素浓度的增加，观察到的转化频率(TF)％的增加。

发明详述

下面是本发明的详述，用以帮助本领域的技术人员实施本发明。本领域的技术人员可以在不背离本发明的精神或范围的情况下，对本文所述的实施方案进行修改和改变。

本发明提供了以自动化高通量的过程制备、筛选和使用棉花外植体的方法和组合物。然后可以使用选择的外源DNA序列来转化这些外植体，并可从该外植体再生转基因棉花植物，而无需从转化的外植体产生愈伤组织细胞培养物来获得转基因后代植物。选择的外源DNA序列可以例如编码可筛选的或可选择的标记，和/或包含确定由于异源核酸表达而使由棉花植物或细胞显示的性状的目的基因。该性状在农学上可能是有用的，例如导致产率提高、害虫或病菌抗性或环境适应性以及其它表型。这使得能够以快速和有效的机械化高通量的方法产生转化的棉花植物。所述的切除棉花的机械化方法具有显著的经济、安全和灵活性优势。机械化使得产生10000个棉花外植体所需的估计的人力小时从大约40小时减少到仅为2.4小时，因而显著地节约了人力成本。更低成本的外植体提供了发展改良的转化方法或使用如下技术的更好的机会，这些技术尽管提供了例如缩短产生转基因植物的时间或能够使用优良载培品种进行转化的益处，但是迄今为止其转化效率太低因而不能广泛应用。这样的技术允许检测较大量的转基因以及选择较高质量事件用于进一步分析，因为预期只有非常少量的转化事件能够显示适于商业发展的最理想的表达模式。由于外植体转运的灵活性增加，改良的切除方法还能够为转化步骤提供更好的时机选择和安排。

此处所描述的机械方法可以进一步容易地进行扩大，以支持更高通量的转化。假定每周进行28小时切除，可能的生产率从使用手工切除的每人7000个外植体(等同于全部时间)增加到使用此处所描述的方法的每人117600个。本发明的具体实施方案获得的益处总结在表14-16中。由于去掉了手工切除方法典型的重复动作，此处所描述的机械化方法显著地在农学上是更加友好的。当需要大量的棉花外植体时，优势尤其明显。

为了使说明书和权利要求书(包括这些术语的范围)的理解清楚和一致，提供了下述定义。

“胚”是种子的一部分，由叶子、茎和根的前体组织(分生组织)以及一个或多个子叶构成。一旦胚开始生长(发芽)，胚就成为幼苗植物。

“分生组织”由未分化的细胞-分生组织细胞构成，其分化产生多种植物结构，包括茎、根、叶、种系组织和种子。分生组织细胞是用于获得转基因植物的转化靶点。

使用的术语“外植体”是指用于转化的靶材料。因此，在此处的实施方案中，“外植体”可与“分生组织”或“胚”互换使用。

“嵌合植物”是指包含遗传学上不同的组织的植物，即植物仅有一部分组织被转化，而其余的组织未发生遗传转化。

“种系转化”是当目的基因被转化到产生花粉或胚珠的细胞中因而进入种子中时发生的。

将要制备外植体的种子可从目的棉花栽培品种中获得。由于所述的方法不需要胚发生或器官发生和棉花植物的再生，因此该方法适于许多栽培品种，甚至那些已知具有较差的胚发生潜力的栽培品种。因此，与许多现有方法相比，不需要使用具有较好胚发生潜力的非农学上优良的栽培品种(例如Coker 312)获得初始的R₀转基因植物。可以对例如吸胀(imbibition)条件(例如在种子吸胀过程中的温度和光强度)、轧辊间隙和筛孔大小等参数进行调节使其适用于不同大小的棉籽。用于切除的种子可以是转基因的或非转基因的。因此，包括对已经是转基因的棉花品种进行再次转化。

在吸胀、发芽和/或切除外植体之前，可以对种子进行灭菌步骤和挑选步骤，以避免微生物污染、去除细菌或真菌高度污染的种子以及去除那些因任何原因可能不会产生用于本发明的活外植体组织的种子。例如，可以根据例如种子的大小、颜色或密度或其它特征(包括化学组成特征)等参数来进行挑选。种子在水溶液中的漂浮可用于选择待切除的种子。挑选方法的例子可以包括在进行大小分选或使用电扇进行空气分类之后使用自动称和/或使用振动重力分选台根据重量分离种子。还可以使用其它的挑选技术，包括根据含水量的挑选。在吸胀之前还可以进行热处理(例如42-55℃)。还可以使用种子引发(priming)，在切除之前或之后来控制胚发育。还可以在吸胀、发芽或切除之前或期间使用某些化学剂和/或环境条件来预处理种子，以使得外植体在切除之后更加可转化和可再生。

吸胀可以在一个处理干净的、不透水的容器(有时候被称为吸胀器)中进行，例如能够容纳种子的塑料或钢容器。典型的容量为1-12.5kg的干种子，尽管也可以使用其它大小的容器。种子的吸胀温度和时间的范围可以为例如，大约15℃至大约40℃，例如大约20℃、23℃、24℃或28℃。在该温度范围的下端温度时可使用更长的吸胀时间。时间的范围可为几小时至14-48小时或几天。在某些实施方案中，可以使用大约18小时的吸胀时间。

在具体实施方案中，使用轧辊进行机械切除，轧辊将施加在它们表面的种子碾碎，在特定的实施方案中，轧辊可以反向旋转。基于所施加的种子的大小可以调节轧辊的间隙。在某些碾碎棉籽的实施方案中，轧辊的间隙可以为例如2-4.5mm(这是根据相对的轧辊之间从峰顶到谷底的距离测量的)。轧辊材料可以是例如弹性体或金属。在某些实施方案中，发现不锈钢辊能够保持较好的工作质量，即使是在重复和持续使用之后。发现当用于棉籽时，带有次级凹槽的轧辊能够有效地抓紧和碾碎种子，且对分生组织外植体种子部分的损害最小。还可以对干棉籽进行切除。由其得到的分生组织然后可以再水化和转化。

切除之后，本发明还提供了用于筛选的方法和装置，以将可转化的分生组织外植体材料从不可转化的损坏的外植体、子叶、种皮和其它碎屑中分离出来。该方法可以通过手工进行或者也可以部分或全部机械化。在某些实施方案中，筛选过程基本上是机械化的。例如，可以进行一个或多个筛分步骤，其中根据所碾碎的种子和所分离的外植体的大小使用适当大小的筛子。通过轧辊的碾碎的大批种子可以通过一系列的分离筛，使得通过大小排阻将不想要的大的和小的碎屑与想要的外植体进行分离。为了利于植物材料的移动，筛分筛子可以是倾斜的。还可以使用例如水流(包括喷水)或筛子倾斜和喷水的组合来辅助材料沿着或穿过筛子的移动(例如胚和碎屑)。筛子表面的振动也可以辅助植物材料的移动。还可以使用由适当大小的网筛制成的转筒(tumbler)进行连续筛分。例如使用棉籽材料，使用美国标准筛子例如#8(2.36mm孔)、#10(2.0mm孔)、#16(1.18mm孔)和其它合适的筛子(例如延长的窗口筛子，例如1/16″×3/4″、1/18″×3/4″、1/19″×1/2″1/20″×1/2″)，可以有效地进行筛分。具有其它的孔大小的筛子可根据所施用材料的大小因需制作。还可以调节筛选过程的时间长度和筛分的力度来提高该过程的通量和/或产率。

该装置可以进一步包含一个帮助维持无菌状态的种子和水接纳系统，以及一个便于维护和清洗机器的就地清洗系统。

还可以使用其它的筛选方法，例如测量溶液中外植体材料与碎屑的浮力差异。已发现在水溶液中漂浮的部分材料中富集了完整的可转化外植体。还可以使用这些筛选方法的组合。包含可转化的外植体的部分材料可以既包括分生组织，也包括其它组织，例如子叶部分。但是，外植体应该至少包含部分分生组织区域，以使得外植体通常可以在开始适当生长条件的12周内产生芽或苗。在某些实施方案中，在开始共培养或其它转化过程之前，可以储存切除的分生组织材料。可以改变的参数包括储存所使用的温度、时间和培养基等。例如，外植体可以在0℃或更高温度(例如大约4-15℃)下浸没储存在培养基中，例如INO培养基或除气INO培养基中。外植体还可以储存在INO浸湿的滤纸上，例如在4℃下。还可以使用培养基组分例如抗生素、PEG8000和抗氧化剂。储存时间的范围可以为例如从1小时或数小时至过夜，或1、2、3、4天或直到7天。储存能够调节相对于转化时间的胚的发育阶段，以及能够辅助安排切除和转化过程，或使得切除的材料从切除的机械压力中恢复。湿切除的分生组织外植体可干燥后储存，然后在接种之前再水化。这种干燥例如可以在筛分之前或期间发生。接种可以进行例如10-120分钟，其间在振荡器上温育外植体和土壤杆菌悬浮液。悬浮培养基可以是INO或其它培养基。在此接种步骤之后，去除悬浮液，继续共培养(例如在INO中)。在共培养过程中可以使用抗细胞凋亡剂，包括抗蛋白酶(antipain)(1-100uM)；3-氨基苯甲酰胺(5uM-4mM)、Ac-DEVD-CHO(0.01-0.1uM)和Ac-YVAD-CMK(0.01-0.1uM)或其它胱天蛋白酶抑制剂，等等。还可以包括植物生长调节物和其它促进T-DNA转移和整合以及植物再生的试剂，以提高转化和植物再生。还可以向共培养培养基中加入亚硫酸盐，来改善植物组织的健康。还可以使用抗生素和抗真菌剂，例如链霉素、壮观霉素、制霉菌素和噻苯达唑等，来补充共培养培养基。共培养可以在黑暗中进行，也可以在适于促进正常质体发育的光照条件下进行，例如在光照Percival培养箱中，在≥5μE(例如大约5μE至大约200μE)的光强度下，以大约16小时光/8小时暗的光周期进行共培养。这样的光照条件可以促进来自土壤杆菌的基因转移(Zambre等人，2003)。

在某些实施方案中，切除的和筛选的组织可以用异源目的基因转化。已经研发了各种将基因转移到植物组织中的方法，包括高速显微投影、显微注射、电穿孔、直接DNA摄取和细菌介导的转化。已知可介导植物细胞转化的细菌包括根瘤菌科的许多种，包括但不限于土壤杆菌、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium spp.)、根瘤菌(Rhizobium sp.)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)(例如Broothaerts等人，2005；美国专利申请公布2007/0271627)。用于这种转化的靶点通常为未分化的愈伤组织，尽管分化的组织也已经用于短暂的和稳定的植物转化，并且可以用于这种情况中。

在设计用于转化过程的载体时，选择一种或多种引入到植物细胞或组织中的遗传成分。遗传成分可以包括使用本发明的方法引入到植物细胞或组织中的任何核酸。在一个实施方案中，遗传成分被引入到DNA组合物中，例如包含至少一种或多种下述类型的遗传成分的重组、双链质粒或载体分子：(a)在植物细胞中起作用导致产生RNA序列的启动子，(b)导致产生编码农业学应用产物的RNA序列的结构性DNA序列，和(c)在植物细胞中起作用导致将多腺苷酸化核苷酸添加到RNA序列的3’末端的3’非翻译DNA序列。

载体可以包含多种遗传成分以利于植物细胞或组织的转化，以及调控结构性核酸序列的表达。在一个优选实施方案中，遗传成分被定向为表达mRNA，在一个可选的实施方案中，该mRNA可以翻译成蛋白质。以双链形式存在的植物结构性编码序列(基因、cDNA、合成DNA或其它DNA)的表达包括使用RNA聚合酶从DNA的一条链转录信使RNA(mRNA)，然后在核内加工mRNA初级转录物。这种加工涉及3’非翻译区，其将多腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3’末端。制备包含所需的遗传成分的质粒或载体的方法是本领域公知的。

DNA转录为mRNA是由通常被称为“启动子”的DNA区域调控的。启动子区域包含一个给RNA聚合酶发出信号以使其与DNA结合并启动向mRNA的转录的碱基序列，转录中使用DNA链中的一条作为模板来产生对应的互补RNA链。许多在植物细胞中有活性的启动子已经在文献中所有描述。这些启动子包括但不限于在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒上携带的胭脂氨酸合酶(NOS)和章鱼氨酸合酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子和玄参花叶病毒(FMV)35S启动子，以及增强的CaMV35S启动子(e35S)。许多其它的响应环境、激素、化学和/或发育信号进行调控的植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达外源基因，包括例如由(1)热(Callis等人，1988)、(2)光(例如豌豆RbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人，(1989)；玉米RbcS启动子，Schaffner等人，(1991))、(3)激素例如脱落酸(Marcotte等人，1989)、(4)创伤(例如Wuni，Siebertz等人，1989)调控的启动子；或其它信号或化学物质。组织特异性的表达也是已知的。

如下所述，优选地，选择的特定的启动子应该能够引起足够的表达，以导致产生有效量的目的基因产物。描述这些启动子的例子包括但不限于美国专利6,437,217(玉米RS81启动子)、美国专利5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)、美国专利6,426,446(玉米RS324启动子)、美国专利6,429,362(玉米PR-1启动子)、美国专利6,232,526(玉米A3启动子)、美国专利6,177,611(组成型玉米启动子)、美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S启动子)、美国专利6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)、美国专利6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和水稻肌动蛋白2内含子)、美国专利5,837,848(根特异性启动子)、美国专利6,294,714(光诱导型启动子)、美国专利6,140,078(盐诱导型启动子)、美国专利6,252,138(病原体诱导型启动子)、美国专利6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、美国专利6,635,806(γ-薏苡醇溶蛋白启动子)和美国专利申请09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。可以使用的其它启动子包括胭脂氨酸合酶(NOS)启动子(Ebert等人，1987)、章鱼氨酸合酶(OCS)启动子(携带在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导的质粒上)、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，1987)、CaMV 35S启动子(Odell等人，1985)、玄参花叶病毒35S启动子(Walker等人，1987；美国专利6,051,753；5,378,619)，蔗糖合酶启动子(Yang等人，1990)、R基因复合物启动子(Chandler等人，1989)和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、PC1SV(美国专利5,850,019)以及AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Depicker等人，1982；Bevan等人，1983)启动子。

也可以构建启动子杂合体来提高转录活性(美国专利5,106,739)或者组合所需的转录活性、可诱导性和组织特异性或发育特异性。在植物中起作用的启动子包括但不限于所述诱导型、病毒的、合成的、组成型启动子以及时间调控型、空间调控型和空间-时间调控型启动子。其它的组织增强型、组织特异性或发育调控型启动子也是本领域已知的，并且能够想到它们在本发明的实施中有用。

在本发明的DNA构建体(即嵌合/重组植物基因)中使用的启动子可被修饰(如果需要的话)以影响它们的调控性能。可以通过与操纵子区域连接、随机或控制诱变等方式来衍生启动子。此外，还可以改造启动子使其包含多个“增强子序列”来辅助提高基因表达。

由本发明的DNA构建体产生的mRNA也可以包含5’非翻译前导序列。这个序列可来自为表达基因而选择的启动子，也可被特别地修饰以增加或降低mRNA的转录。5’非翻译区也可由病毒RNA、适当的真核基因或合成基因序列获得。可能需要这样的“增强子”序列来增强或改变所产生的mRNA的转录效率。本发明并不局限于其中非翻译区来自于伴随启动子序列的5’非翻译序列的构建体。非翻译前导序列而是可以来自于不相关的启动子或基因(参见，例如，美国专利5,362,865)。非翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白前导序列(美国专利5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)前导序列、GmHsp(美国专利5,659,122)、PhDnaK(美国专利5,362,865)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed，1990)和AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Bevan等人，1983)。还可以想到其它用于提高表达或影响基因转录或翻译的遗传成分也可作为遗传成分。

嵌合构建体的3’非翻译区可以包含转录终止子或具有等同功能的元件，以及在植物中发挥功能以在RNA 3’末端添加多腺苷酸化核苷酸的多腺苷酸化信号。该DNA序列在此被称为转录终止区。该区域是转录的信使RNA(mRNA)的有效多腺苷酸化所需的。RNA聚合酶通过发生多腺苷酸化的位点来转录DNA编码序列。合适的3’区的例子包括(1)包含土壤杆菌肿瘤诱导的(Ti)质粒基因例如胭脂氨酸合酶(NOS；Fraley等人，1983)基因的多腺苷酸化信号的3’转录、非翻译区，以及(2)植物基因，例如大豆储存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基。优选的3’区的一个例子是来自豌豆ssRUBISCO E9基因的3’区(欧洲专利申请0385 962)。

在一个实施方案中，载体包含可选择的、可筛选的或可评分的标记基因。这些遗传成分在此也被称为功能性遗传成分，因为它们可以产生在转化植物的确认中行使功能的产物或具有农学应用的产物。作为选择或筛选装置的DNA可以在可再生的植物组织中起作用，以产生能够使植物组织具有对毒性化合物的抗性的化合物。许多可筛选的或可选择的标记基因是本领域已知的，并可用于本发明中。用作可选择的、可筛选的或可评分的标记的目的基因包括但不限于gus、绿色荧光蛋白(gfp)、萤光素酶(lux)、提供抗生素(例如卡那霉素(Dekeyser等人，1989)或壮观霉素(例如壮观霉素氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)；美国专利5,217,902)抗性的基因、编码产生对如下除草剂的耐受性的酶的基因：例如草甘膦(例如5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)：Della-Cioppa等人，1987；美国专利5,627,061；美国专利5,633,435；美国专利6,040,497；美国专利5,094,945；WO04074443和WO04009761；草甘膦氧化还原酶(GOX；美国专利5,463,175)；草甘膦脱羧酶(WO05003362和美国专利申请20040177399)；或草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)：Castle等人，美国专利公布20030083480)、茅草枯(例如编码提供2，2-二氯丙酸耐受性的2，2-二氯丙酸脱卤素酶的dehI(茅草枯；WO9927116)、溴草腈(提供溴草腈耐受性的卤代芳基腈水解酶(Bxn)(WO8704181A1；US 4,810,648；WO8900193A))、磺酰基除草剂(例如提供对乙酰乳酸合酶抑制剂(例如磺酰脲类、咪唑啉酮、三唑嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸酯和苯酞)的耐受性的乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶；(美国专利6,225,105；5,767,366；4,761,373；5,633,437；6,613,963；5,013,659；5,141,870；5,378,824；5,605,011)；编码ALS，GST-II))、双丙氨膦或草胺膦或衍生物(例如提供草胺膦或草丁膦耐受性的草胺膦乙酰转移酶(bar)(美国专利5,646,024，5,561,236,5,276,268；5,637,489；5,273,894；和EP 275,957)、莠去津(编码GST-III)、麦草畏(麦草畏单加氧酶；美国专利申请公布20030115626，20030135879)或稀禾定(提供对环己二酮(稀禾定)和芳氧基苯氧基丙酸酯(吡氟氯禾灵)耐受性的修饰的乙酰辅酶A羧化酶(美国专利6,414,222))等。还可以使用其它的选择程序，包括正选择机制(例如使用大肠杆菌manA基因，其允许在甘露糖的存在下生长)和双选择(例如同时使用75-100ppm壮观霉素和3-10ppm草丁膦或75ppm壮观霉素和0.2-0.25ppm麦草畏)，这些仍然在本发明的范围之内。还可以想到使用浓度为大约25-1000ppm，例如大约150ppm的壮观霉素。

本发明可与包含所述可选择的或可筛选的标记和相关调节元件的任何合适的植物转化质粒或载体以及一种或多种以足以提供特定的所需性状的方式表达的核酸一起使用。本发明涉及的具有农学意义的合适的结构基因的例子包括但不限于病害、昆虫或虫害耐受性、除草剂耐受性基因、质量改善的基因，所述质量改善例如是产率、营养增加、环境或应激耐受或在植物生理学、生长、发育、形态学或植物产物方面的任何希望的改变，包括淀粉产生(美国专利6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改进的油产生(美国专利6,444,876；6,426,447；6,380,462)、高油产生(美国专利6,495,739；5,608,149；6,483,008；6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；6,459,018)、高蛋白质产生(美国专利6,380,466)、果实成熟(美国专利5,512,466)、提高的动物和人类营养(美国专利6,723,837；6,653,530；6,541,259；5,985,605；6,171,640)、生物聚合物(美国专利RE37,543；6,228,623；5,958,745和美国专利公布US20030028917)。还包括环境应激抗性(美国专利6,072,103)、药物肽和可分泌肽(美国专利6,812,379；6,774,283；6,140,075；6,080,560)、改善的加工性能(美国专利6,476,295)、改善的消化性(美国专利6,531,648)、低棉子糖(美国专利6,166,292)、工业性酶生产(美国专利5,543,576)、改良的香味(美国专利6,011,199)、固氮(美国专利5,229,114)、杂种种子生产(美国专利5,689,041)、纤维生产(美国专利6,576,818；6,271,443；5,981,834；5,869,720)和生物燃料生产(美国专利5,998,700)。本领域的普通技术人员在看到本发明的公开内容之后会明白：任何这些或其它遗传元件、方法和转基因都可用于本发明。

或者，目的DNA序列可以通过编码RNA分子影响这些表型，该RNA分子能够通过基因沉默技术例如反义-、共抑制介导的机制、包括miRNA(例如美国专利申请公布2006/0200878)的RNAi技术引起内源基因表达的靶向抑制。

可以通过本发明包括的方法引入的示例性核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或者来自或存在于同一物种中、但是通过基因工程方法而不是传统的生殖或育种技术引入接受细胞内的基因或序列。但是，术语“外源的”还指在被转化的细胞中正常情况下不存在的基因，或者也许只是不以在转化DNA片段或基因中发现的形式或结构等存在的基因，或者通常存在、但是人们希望例如过表达的基因。因此，术语“外源的”基因或DNA是指引入接受细胞内的任何基因或DNA片段，无论在该细胞中是否已经有相似的基因存在。外源DNA中包含的DNA类型可包括已经在植物细胞中存在的DNA、来自其它植物的DNA、来自不同生物体的DNA或外部产生的DNA，例如包含基因的反义信息的DNA序列或编码基因的合成或修饰形式的DNA序列。

在一个实施方案中，植物组织的转化是通过土壤杆菌或其它根瘤菌介导的方法进行的，目的DNA序列存在于一个或多个T-DNA(美国专利6,265,638，5,731,179；美国专利申请公布2005/0183170；2003110532)或其它转移到植物细胞中的序列(例如载体骨架)上。T-DNA可被RB和/或LB序列结合，并可以包含一个边界序列或两个相邻的边界序列。可以转入植物细胞内的序列可以存在于用于转化的细菌菌株中的一个转化载体上。在另一个实施方案中，序列可以存在于细菌菌株中的不同的转化载体上。在另一个实施方案中，序列可以存在于一起用于转化的不同的细菌细胞或菌株中。

本发明的方法中用于转化的DNA构建体通常还包含在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA片段，例如大肠杆菌复制起点(例如ori322)、土壤杆菌复制起点(例如oriV或oriRi)和用于选择性标记的编码区(例如编码提供壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)的Spec/Strp)或庆大霉素选择性标记基因。对于植物转化而言，宿主细菌菌株通常为携带具有转移表达单元的功能的质粒的根癌土壤杆菌ABI、C58、LBA4404、AGLO、AGL1、EHA101和EHA105。植物转化领域的技术人员已知的其它菌株也可用于本发明。

细菌介导的基因递送(例如土壤杆菌介导的；美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840)可以向从种子上切下的胚的活分生组织的细胞中进行(例如美国专利6,384,301)。在共培养步骤期间或之后，可以使用抗真菌和/或抗细菌化合物。这些化合物的非限制性例子包括制霉菌素、PCNB(五氯硝基苯)和噻苯达唑等。还可以使用壮观霉素或链霉素，例如在共培养之前、期间或之后。在某些实施方案中，还可以在共培养期间添加壮观霉素(例如100或150ppm，或高达300-500ppm，或高达1000ppm)，可选地在后面的培养步骤的培养基中不存在壮观霉素。

可以在选择剂的存在下培养分生组织区域。选择剂可以是“脉冲的”。即，使用的选择剂的浓度可以在预培养、共培养或后续的组织培养过程中不同。在某些实施方案中，脉冲的选择剂是一种氨基糖苷，例如壮观霉素。这一步骤的结果是终止或至少延迟了大多数未导入外源遗传构建体的细胞的生长，同时由包括转化的分生组织细胞的单细胞或小簇细胞形成了苗。产生的转化的苗和植物可以是嵌合的(例如周缘嵌合体)或者它们可以是克隆产生的。但是，一旦确认了表型阳性小植株，在某些实施方案中，可以省去继续使用选择剂，也被称为“二次选择”。因此，在这种情况下，产生的植物可以与缺乏选择时生长的非转化根组织嵌合，甚至由接触异源核酸的分生组织产生的延长的苗组织本身也可能是嵌合的或可能不是嵌合的。避免二次选择可以节约时间、劳力还可以显著节约培养基和容器的使用。分生组织可以在选择剂的存在下进行培养，该选择剂包括但不限于生长素样除草剂，例如麦草畏、2，4-D或MCPA、草丁膦、草甘膦、咪唑啉酮类除草剂、乙酰乳酸合酶抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂和羟基苯基-丙酮酸-双加氧酶抑制剂、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、G418、氨基糖苷类、壮观霉素、链霉素、潮霉素B、博来霉素、腐草霉素、磺胺类、链丝菌素、氯霉素、甲氨喋呤、2-脱氧葡萄糖、甜菜醛、S-氨乙基L-半胱氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、苄基腺嘌呤-N-3-葡糖醛酸酶。提供对它们的抗性的各种选择性标记和基因的例子在Miki和McHugh，2004中公开。

根据该公开内容，本领域的技术人员将会知道许多其它可能的可选择的或可筛选的标记基因、调节元件和其它目的序列。因此，上述讨论是示例性的而不是详尽的。

对于嵌合R0亲本植物，使用这样的选择剂有助于转化的种系细胞的恢复，从而产生全转化的R1种子。也就是说，嵌合R0植物的非转化组织的“化学修整(chemical pruning)”或至少是生长抑制选择了转化组织的生长和发育，该转化组织包括在后一代中能够产生全转化植物的转化的种系组织。这可以允许简化的组织培养和植物再生，例如通过消除胚发生，使过程更加快速、更便宜和适于更大范围的棉花表型，包括一般难于转化的优良栽培品种，以及胚发生和再生方法尚未很好地开发的其它植物(如果这样的话)。在某些实施方案中，可以在嵌合植物或植物部分中选择种系组织，以产生转化的种系组织，如下所述。

或者，可以使用可筛选的或可评分的标记确认转基因部分和/或植物。示例性的标记是已知的，包括编码不同的发色底物的酶的β-葡糖醛酸酶(GUS)(Jefferson等人，1987a；Jefferson等人，1987b)；编码调控在植物组织中产生花青苷色素(红色)的产物的R-基因座基因(Dellaporta等人，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978)；编码已知其各种显色底物的酶的基因(例如PADAC，一种显色头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等人，1986)；编码可以转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的xylE基因(Zukowsky等人，1983)；α-淀粉酶基因(Ikatu等人，1990)；编码能够氧化酪氨酸为多巴和多巴醌、然后缩合为黑色素的酶的酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)；绿色荧光蛋白(Elliot等人，1999)和α-半乳糖苷酶。

如本领域已知的，还可以使用其它的植物转化方法，例如Miki等人，(1993)中所描述的，包括使用微粒轰击(例如美国专利5,914,451；McCabe等人，1991；美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880)。

已知多种组织培养基当进行适当补充时，可以支持植物组织生长和发育，包括由切下的分生组织形成成熟植物。这些组织培养基可以作为商品制剂购买到，或者可以由本领域的技术人员定制和改良。这样的培养基的例子包括但不限于Murashige和Skoog，(1962)；Chu等人，(1975)；Linsmaier和Skoog，(1965)；Uchimiya和Murashige，(1962)；Gamborg等人，(1968)；Duncan等人，(1985)；McCown和Lloyd，(1981)；Nitsch和Nitsch(1969)；以及Schenk和Hildebrandt，(1972)中描述的培养基，或者相应补充的这些培养基的衍生物。本领域的技术人员应当知道：转化和再生使用的培养基和培养基补充物(例如营养物和生长调节物)通常是根据特定的靶作物或目的品种而优化的。组织培养基可以补充碳水化合物，例如但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖、右旋糖，或一定比例的碳水化合物。试剂可以购买获得，并可以从多家供应商购买(参见例如SigmaChemical Co.，St.Louis，MO；和PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)。可以在组织培养开始时进行一个升温步骤(例如在35℃下培养1-7或3-5天)，然后再进行共培养。外植体也可以在例如共培养和选择过程中在允许质体正常发育的光照条件下生长。因此，外植体可以在5-200μ爱因斯坦(例如5-130μ爱因斯坦)的光强度和大约16小时光/8小时暗的光周期下生长。

转基因植物可以通过在此公开的方法和组合物从转化的植物细胞再生。当在培养中确认了推定的转基因小植株时，可以将它们移植。移植生长培养基可以包括在罐或生长塞(例如OASIS塞、Fertiss^TM塞或Elle罐)中的土壤或无土培养基。植物生长调节物(例如二甲基哌啶五硼酸酯)可用于降低植物大小并有助于处理大量植物。使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物通常(但不总是)含有一个插入一个染色体中的简单的重组DNA序列，并称为转基因事件。这样的转基因植物由于插入的外源序列而被认为是杂合的。对于转基因而言纯合的转基因植物可以通过使含有单一外源基因序列的独立的分离转基因植物与其本身(例如R0植物)有性繁殖(自交)而获得，产生R1种子。产生的R1种子中的四分之一对于转基因而言是纯合的。发芽的R1种子产生植物，可以测试该植物的接合性，通常使用允许区别杂合子和纯合子的SNP分析或热扩增分析来分析(即接合性分析)。

为了证实转基因植物中存在外源DNA或“转基因”，可以使用多种分析。这些分析包括：例如“分子生物学”分析，例如DNA印迹法和RNA印迹法和PCR^TM；“生物化学”分析，例如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹法)或通过酶功能(例如GUS分析)；花粉组织化学；植物部分分析，例如叶子或根分析；还可以通过分析整个再生植物的表型。

一旦转基因被引入到一个植物中，该基因就可以通过杂交而引入到与该第一植物“性”相容的任何植物中，而不需要直接转化第二植物。因此，此处所使用的术语“子代”是指根据本发明制备的亲本植物的任何一代的后代，其中子代包含选择的DNA构建体。因此，“转基因植物”可以是任何一代的。使植物“杂交”以提供相对于起始植物系具有一种或多种添加的转基因或等位基因的植物系，被确定为通过使起始系与包含转基因或等位基因的供体植物系杂交而向植物系中引入特定序列的技术。为了实现这项技术，可以进行例如下述步骤：(a)种植第一(起始系)和第二(包含所需的转基因或等位基因的供体植物系)亲本植物的种子；(b)使第一和第二亲本植物生长成为具有花的植物；(c)将来自第一亲本植物的花使用来自第二亲本植物的花粉授粉；和(d)收获在具有受精花的亲本植物上产生的种子。

本发明还提供了使用本发明的方法产生的部分或植物。植物部分包括但不限于果实、种子、胚乳、胚珠、花粉、叶子、茎和根。在本发明的优选实施方案中，植物部分为种子。

实施例

本领域的技术人员可以理解本发明提供的方法和组合物的许多优点。本文包括下面的实施例来证明本发明的优选的实施方案。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明中运用良好的技术，因此可被认为构成了实施本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而仍然获得相同或类似的结果。本文引入在此引用的全部参考文献作为参考，以补充、解释、提供背景或教导在此使用的方法、技术或组合物。

实施例1

棉籽的灭菌、水化，以及分生组织外植体的切除和回收

A.棉籽的灭菌和水化

机械加工棉籽以切除和分离它们的分生组织。为了获得可转化的分生组织外植体材料，按照下述加工棉籽(例如来自基因型STN474(Stoneville Pedigreed Seed Co.，Stoneville，MS)、Delta Pearl(Delta andPine Land Co.，Scott，MS)、DP5415、DP393、00S04(Delta and PineLand Co.)、SureGrow501或SureGrow747(Sure Grow Cotton SeedCompany，Maricopa，AZ)来从种皮和子叶中分离包含分生组织的胚。棉籽从4℃或-20℃的贮存中取出，并升至室温。称取种子，置于无菌吸胀单元内，并且在50％Clorox(次氯酸钠)中表面灭菌5分钟。然后使用无菌蒸馏水漂洗种子三次，在液体水化培养基(CSM)中在28℃下黑暗中进行水化大约18小时(范围为14至42小时)。或者，吸胀温度可以降低到例如大约23℃。CSM培养基包含200mg/L羧苄青霉素(PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)、125mg/L头孢噻肟(Midwest Scientific，St.Louis，MO)、30mg/L BRAVO75(Carlin，Milwaukee，WI)和30mg/L克菌丹50(Carlin)。其它一些溶液也已成功地用于水化棉籽，包括无菌去离子水或含有低浓度漂白剂(通常为50至1000ppm次氯酸钠)的水。水化之后，种子可以立即使用，或在进一步加工之前在冷藏温度下储存长达一周。

B.棉籽的碾碎

现有的切割机器样式示于图1中。将表面灭菌的水化种子通过一个位于机器顶部的料斗(图1B，1C)无定向地分批或连续地加到切割机器中。使用切割机器在专用的干净套具中机械切除胚。切割机器包括一对用于碾碎种子的钢辊。这些钢辊(图1D，1E)是由用于大豆分生组织切除的轧辊(例如美国申请2005/0005321)改造而成的，材料从弹性体改为不锈钢，从3对轧辊减少到1对，并沿着辊轴添加了凹槽，以便更好地抓住棉籽和更有效地碾碎种子。表1示出了改良的钢辊和之前研制的在大豆胚轴切除中使用的弹性体轧辊的比较。“质量外植体”理解为是指具有活分生组织的外植体(即可用作转化靶点)。

表1.改良的钢辊和弹性体轧辊的比较。

	改良的钢辊	弹性体轧辊
			产率％	41.6	11.5
可再生的％	14.3	3.5
			质量外植体％	45.8	16.6
GUS阳性％	0.5	0.2
			具有强的近周缘gus表达％	0.08	0.04

机器参数(例如轧辊间隙距离和轧辊速度)的测试结果总结于表2-4中。发现下述示例性的设置尤其运行良好：轧辊间隙距离为2.5mm；右轧辊在设置40(转盘上的任意速度设置值)顺时针旋转；左轧辊在设置80逆时针旋转；水流速为10L/min。

表2.轧辊间隙距离对外植体产率的影响。

表3.轧辊速度对外植体产率的影响。

右/左轧辊速度设置	质量外植体的回收(％)	具有分生组织的外植体％
			40/60	7	27.3
40/80	9.3	32.5
			40/100	6.3	31
60/80	6.2	20.3
			60/100	9.45	31
80/100	7	23.2

表4.水流速对外植体回收的影响。

水流速(L/min)	种子碾碎％	回收％	质量外植体回收％	具有分生组织的外植体％
					5	21	23.9	5.7	24
10	24	40.8	10.4	25.4
					15	19	20.5	5.9	28.8
20	14	18.2	4.4	24.2
					25	14	15.0	3.5	23.1

实施例2

通过筛分的分生组织外植体分离

种子材料通过轧辊机构之后，使用筛子来收集碾碎的种子混合物(图2)，该筛子允许去除水，但是保留碾碎的种子。图2还显示了轧辊间距对来自碾碎的种子的分生组织状况的影响。然后筛选保留的物质以去除碎屑，并富集包含分生组织的潜在可再生和可转化的外植体。一种从大批碾碎的种子的种皮和子叶材料中分离分生组织外植体的方法是通过机械或手工筛分，如图2所示。使用不同的材料测试构造筛子，包括具有铝、木或钢侧边的碳钢筛子和不锈钢筛子。发现“V”形筛子截面是比较容易制造的，并且可以有效保留外植体，同时允许较小的碎屑通过筛子(图3)。还可以通过两步筛分方法(可以机械进行或手工进行)来有效地从碾碎的种子中分离分生组织外植体。首先，碾碎的种子(种皮、子叶和胚的混合物)通过#8筛子，该筛子保留了大的碎屑(种皮和子叶)，而使小的碎屑和外植体通过。

然后使用第二个不锈钢筛子重新筛分得到的混合物。测试不同的窗口大小，其范围为例如1/16″×3/8″至1/24″×1/2″。1/18″×3/4″或1/19″×3/4″窗口大小得到最佳外植体纯度，且外植体回收的附加损失最小。因此选择1/18″×3/4″或1/19″×3/4″窗口大小的筛子进一步用于第二步筛分步骤中。这个参数可以根据种子大小和预期的外植体大小来进行调节。第二步筛选保留了外植体和一些较大碎屑，但是允许小的碎屑通过。表5示出了在涉及机械化或手工过程的两个筛分步骤之后得到的材料的比较。在第一种情况下，初始手工筛分步骤之后为机器筛分步骤。在第二种情况下，两步筛分步骤都是用机器进行的。手工和机器筛分两者都能从其它碎屑中分离出分生组织外植体。机器筛分看起来在产生用于转化的外植体方面比手工筛分效率更高。

表5.使用手工和/或机器筛分的外植体回收。

	第一步手工筛分，第二步机器筛分	第一步和第二步均为机器筛分
			干种子投入量(g)	850	300
碾碎的混合物产出量(g)	96.8	34.7
			产率％	27.8	36.2
质量外植体％	46.4	62.1

在筛分过程中可以改变的其它参数包括种子量(例如每批种子的克数)、筛分过程的强度和时间长度(例如分钟)、导致可转化材料的提高的纯度和产率，这是根据每克筛分材料的“质量外植体”数量或每分钟筛分回收的“质量外植体”数量而确定的。“质量外植体”理解为是指具有可用作转化靶点的分生组织的外植体。据观察，当短时间筛分大批碾碎的种子时，可以得到最佳的加工产率(但不一定是外植体数量)。尽管在这种情况下“质量外植体”的绝对数量可能有些减少，但是时间上的节约可以更多地弥补。还可以增加外植体的纯度。但这是假定可利用的碾碎种子的量是不够成限制因素，因为切除时间在整个获得可转化的棉花外植体组织的加工时间长度中所占份额相对较小。因此，如果种子的量是限制因素，可以相应调整筛分参数。通过描述的自动化过程制备的质量外植体可用于转化，或者也可以在使用之前储存在冷藏温度下或高达28℃下。在这些温度下的储存可以保持质量和可转化性至少1周。冷藏优选用于长期储存。

实施例3

回收的胚外植体的进一步富集

从上述实施例回收的外植体仍然包含一些碎屑。可以使用浮选方法进一步纯化外植体。该方法是基于以下发现：大多数新鲜筛分的外植体、但不是大部分碎屑，能够漂浮在新鲜的无菌去离子水的表面。这个步骤去除了其它的碎屑，提高了外植体的纯度(例如图2)，如表6-7所示。浮选分离(即弃去下沉部分)会造成一些可转化外植体的损失，因为漂浮部分和下沉部分都包含可转化的外植体，这是通过后续的土壤杆菌介导的瞬时转化和来自每个外植体部分的外植体材料的GUS染色判断得出的。但是，漂浮部分的外植体纯度与未经过浮选步骤的材料相比显著提高。

表6.通过浮选富集外植体。

组分产率	两步筛分	两步筛分+浮选
			具有分生组织的外植体％	25	44
损坏的外植体％	25	35
			碎屑％	50	21

表7.通过使用浮选筛选步骤的外植体纯度富集。

外植体部分	各部分中的外植体％	总外植体/克(纯度)
			漂浮	57％	62.7
下沉	43％	14.6

实施例4

进一步的工艺改进

为了进一步改进该工艺的效率，对“切除器”进行另外的改造。例如，加入水和种子接纳盘以确保种子的接纳(图4)。该盘例如可以是矩形不锈钢盘，位于机器的出口下方，在盘的四个侧面的三个上具有侧壁。第四个侧面含有用于附加一次性网袋的设置，该网袋可保留种子和碎屑而使水流出。

“就地清洗(clean-in-place)”系统也可添加到外植体生产系统中，以简化设备的清洗和降低工作场所事故的可能性和样品的污染。清洗程序包括使用流动的无菌水和镊子去除碎屑，如果需要的话，再以大约10L/min泵送清洗溶液(例如过乙酸，例如MINNCARE(Minntech，Minneapolis，MN))或气体通过机器10分钟。施加加压的无菌空气从机器中压出清洗溶液。在使用之间，清洗过的机器维持在正压无菌空气中。自动化就地清洗系统已被设计出来。机械装置以下述方式控制清洗过程：首先，泵送清洗剂(例如1％MINNCARE等)通过设备一定时间(例如10分钟或清洗剂厂商所推荐的时间)。然后停止试剂的流动，使用加压的无菌空气清除设备中残余的液体。最后，施加低正压无菌空气作为在使用之间无菌保存设备的方法。对于筛子，可拆除的部件可以高压灭菌，而固定部件可使用1％MINNCARE溶液或其它消毒溶液进行喷洒。

实施例5

使用切除的胚的棉花转化方法的发展

该实施例描述了使用机械切除的胚进行的土壤杆菌介导的棉花转化。

A.用于转化的植物表达构建体：

使用本领域技术人员已知的标准的分子生物技术构建根癌土壤杆菌转化载体。使用下述转化构建体：

(1)pMON96959：包含在增强的CaMV.35S启动子(美国专利5,322,938；5,352,605；5,359,142；和5,530,1960)、35S前导序列和来自根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因的3’非翻译区(GenBank登录号E01312)控制下的uidA基因；和通过叶绿体转运肽靶向叶绿体的来自嗜麦芽假单胞菌的选择性标记麦草畏单加氧酶(DMO)(美国专利7,022,896)，和来自豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)的成熟蛋白的前24个氨基酸。DMO基因盒包含花生褪绿条死病病毒(PCISV.Flt)的全长转录物的增强的启动子、烟草蚀纹RNA病毒基因组的5’非翻译区的前导序列(TEV Carrington和Freed，1990)和豌豆rbcS2的3’非翻译区(Coruzzi等人，1984)。

(2)pMON96999：包含与pMON96959所述相同的uidA盒，但是具有不同的选择性标记-提供壮观霉素抗性的aadA基因(例如美国专利5,217,902)。aadA腺苷酰转移酶基因产物通过拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽靶向叶绿体(ShkG-CTP2Klee等人，1987)，并且在拟南芥延伸因子EF-1α启动子(Tsf1；美国专利申请20050022261)和FMV-35S增强子、Tsf1前导序列(外显子1)、Tsf1内含子和豌豆rbcS2的3’非翻译区的调控之下。

(3)pMON102514：包含DMO和bar基因，用于麦草畏和/或草丁膦单选择则或双选择方案。DMO基因盒包含针对花生褪绿条死病病毒全长转录物的增强的启动子(PCLSV.Flt；美国专利5,850,019)、TEV前导序列、来自海岛棉纤维蛋白E6基因的3’非翻译区和用于将DMO靶向至叶绿体的拟南芥叶绿体转运肽ShkG-CTP2。bar基因盒包含增强的CaMV.35S启动子、矮牵牛花Hsp70前导序列(美国专利5,362,865)、bar基因和土壤杆菌nos终止子。

(4)pMON107303：包含在增强的CaMV.35S启动子、35S前导序列和来自根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶的3’非翻译区控制下的uidA基因；bar基因盒包含相同的调控元件，但是不包含叶绿体转运肽序列，正如pMON96999中的aadA盒一样。

上述转化构建体的例子均包含用于将转基因整合到植物基因组内的单个T-DNA。包含两个T-DNA的转化载体也用于本发明中。这种载体的一个例子如下所述：

(5)pMON107375：携带2个T-DNA，它们在从头到尾的方向上包含两个标记基因。第一个T-DNA包含aadA和uidA盒。aadA腺苷酰转移酶基因产物通过拟南芥EPSPS的叶绿体转运肽(ShkG-CTP2，Klee等人，1987)靶向至叶绿体，并且该基因在拟南芥延伸因子EF-1α启动子(Tsf1；美国专利申请2005/0022261)和FMV-35S增强子、Tsf1前导序列(外显子1)、Tsf1内含子和豌豆rbcS2的3’非翻译区的控制之下。uidA基因在增强的CaMV.35S启动子和来自根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因的3’非翻译区的控制之下。第二个T-DNA包含DMO和bar表达盒。DMO基因盒包含针对花生褪绿条死病病毒全长转录物的增强的启动子(PCLSV.Flt；美国专利5,850,019)、TEV前导序列、来自海岛棉纤维蛋白E6基因的3’非翻译区和用于将DMO靶向至叶绿体的拟南芥叶绿体转运肽ShkG-CTP2。DMO基因经过密码子优化以提高在双子叶植物中的表达。bar基因盒包含增强的CaMV.35S启动子、矮牵牛花Hsp70前导序列(美国专利5,362,865)、bar基因和土壤杆菌nos终止子。pMON107353(oriV)与pMON107375(oriRi)相似，除了在此处所述的研究中还广泛使用复制起点。

使用这个构建体及其衍生的目的事件证明了，使用草丁膦作为确认转基因植物和/或嵌合植物中的阳性转化部分的手段进行化学修整和化学消除阴性部分的应用。

B.土壤杆菌细胞的制备：

将包含带有一个或两个上述植物表达盒的双运载体的土壤杆菌菌株C58从甘油储存液中接种到包含75mg/mL壮观霉素和50mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中(10g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，10g/L细菌用胰蛋白胨)。让液体培养液在28℃下在200rpm的旋转振荡器上生长过夜。当过夜培养液的光密度(OD₆₆₀)达到目标范围0.4-1.2之后，以3500rpm离心细菌培养液大约20-25分钟以沉淀细胞。

去除上清液之后，将沉淀重悬浮在10mL接种培养基(INO，表8)中，并进一步稀释、调节OD₆₆₀为大约0.28-0.32。一系列的瞬时GUS表达研究显示：OD₆₆₀0.6-0.8的接种物产生了相对较高比例的分生组织转化和转基因表达。

表8.接种培养基(INO)的组成。

成分	量/L
		硫酸镁(Fisher M63)	0.1g
硫酸铵(Fisher A702)	53.6mg
		一水合磷酸钠(Fisher S369-500)	60mg
氯化钙(Sigma C-3881)	60mg
		硼酸(Fisher A73-3)	0.3mg
硫酸锰(Sigma I-2550)	1mg
		七水合硫酸锌(Sigma Z-1001)	0.2mg
碘化钾(Sigma P-8166)	0.075mg
		二水合钼酸钠(Sigma S-6646)	0.025mg
硫酸铜(Fisher C493-500)	2.5mg
		六水合氯化钴(Sigma C-2911)	2.5μg
乙二胺四乙酸(Ciba 964603)	2.8mg
		硝酸钾(Sigma P-8291)	1g
葡萄糖(Phytotech G386)	30g
		MES(Sigma M8250)	3.9g
使用去离子蒸馏水调节体积为1L
		使用KOH调节pH为	5.4

高压灭菌
		添加包含下述成分的无菌维生素储存液
肌醇(Sigma I-3011)	10mg
		烟酸(Sigma N-0765)	0.1mg
盐酸吡哆醇(Sigma P-8666)	0.1mg
		盐酸硫胺素(Sigma T-3902)	1mg

发现土壤杆菌制备培养基(生长、重悬浮和共培养培养基)的pH能够影响切除的棉花分生组织的转化效率。大约pH 5.3显示出最高的后续“高质量”稳定转化事件的比例，尽管也可以使用pH 5.0至10.0的其它pH的培养基。“高质量”事件是指如组织化学GUS分析所示，例如在一片包含中脉的叶子中包含大面积稳定GUS表达、或者在所有或多个叶子中具有稳定的GUS表达的转基因事件。已经显示这样的表达模式更有可能与分生组织的L1、L2或L3细胞层的转化(例如周缘转化)相关，这可能导致种系转化，或者提示苗为单细胞来源。

C.外植体的创伤、接种和共培养：

来自实施例1或实施例2的外植体在无菌水中清洗。将大约1-60g(例如30g)外植体置于Plantcon^TM容器(MP Biomedicals，Solon，OH)的顶部(倒置)，然后再添加足以覆盖外植体的大约50mL制备的土壤杆菌悬浮液。关闭Plantcon^TM之后，将其插入适当大小的支持物中，置于超声器(例如L&R Ultrasonics QS 140；L&RManufacturing Co.，Kearny，NJ；或Honda W 113超声器，Honda，DenshiJapan)中。超声器内装有大约2L 0.1％Triton

(例如Sigma 526-36-23；Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)。经过最长达5分钟的超声处理之后，将Plantcon^TM稳固地置于65-70rpm或更高转速的振荡器中培育10分钟。接种之后，从Plantcon^TM中去除土壤杆菌接种物。将大约2g接种外植体组织转移到包含无菌滤纸和5mL INO的新鲜的Plantcon^TM中，并将外植体散布在培养基表面以避免聚集。INO培养基还可以补加植物生长调节物，例如赤霉素(GA3)、生长素(例如NAA、IBA、IAA、2，4-D、麦草畏等)、细胞分裂素(例如BAP、苯基噻二唑脲、故草克(dikegulac)、激动素等)和/或抗真菌剂或抗细菌剂(例如制霉菌素或噻苯达唑(TBZ))。将包含接种外植体的Plantcon^TM置于Percival培养器中在大约22-28℃和16小时光周期(光强度≥5μE，例如大约5μE至大约200μE)下共培养2-5天。在某些研究中，共培养培养基包含壮观霉素(50-100ppm)。如图8所示，这个导致了提高的TF。

D.通过在组织培养基中使用壮观霉素或其它选择剂对转基因事件的选择和确认：

该实施例描述了使用抗生素壮观霉素进行的选择。但是，还可以使用诸如卡那霉素、链霉素、G418、巴龙霉素、草丁膦、草甘膦、潮霉素B、咪唑啉酮和麦草畏等其它选择剂或任何这些或类似选择剂的组合进行类似的方法。还可以使用可筛选的标记，例如GUS、CrtB或酵母ATP依赖性磷酸果糖激酶(ATP PFK)。

共培养之后，取出外植体并植入Plantcon^TM容器中的半固态WPM培养基中或置于其表面上(表9)，该培养基补加有200mg/L头孢噻肟、200mg/L羧苄青霉素和25-200mg/L壮观霉素，以及根据刺激多苗形成的需要包含或不包含植物生长调节物(例如BAP、苯基噻二唑脲、GA3或敌草克)。通常将～25个外植体置于每个容器中。结果显示：表面种植的外植体至少与植入一样有效(表10)。也测试了将接种的外植体种植在液体WPM培养基(表9，但是不含胶凝剂AGARGEL)表面上可以提高效率并降低外植体植入培养基的人工负担。还成功地测试了外植体在液体培养基底(滤纸、聚酯毡和其它织物以及其它透性和半透性膜)上的表面种植。让外植体在28℃(每天和季节性变化22-33℃)下在通常16小时光的光周期(尽管24小时光也能有效地产生转基因棉花植物)和5-200(通常70-130)μ爱因斯坦的光强度下在选择培养基中生长大约4-8周。在将外植体移至28℃之前，还测试了在选择期中的前3-5天的起始温度35℃。发现在35℃下的培养期是有利的(例如参见实施例9)。

然后将具有绿色健康苗生长的再生外植体(例如图5)转移到新鲜的选择培养基中继续生长(第二选择步骤)。与之相比，当与壮观霉素一起生长时，缺乏提供壮观霉素抗性的基因的外植体产生变白的苗或原基，这可以很容易地被识别。1-4周后，将具有绿色健康外观的苗的小植株转移和植入到棉花生根培养基(CRM)中(表11)进行生根。生根培养基可以包含壮观霉素或链霉素，或者在生根步骤中可以停止选择。然后将生根的植物移到温室中继续生长并用于进一步分析。

从切除和富集外植体后的土壤杆菌感染开始，外植体经过选择过程。然后选择的转基因事件生长成为成熟的植物。开始转化实验(例如土壤杆菌共培养)的大约24周后可以收获转基因R1种子，与典型的使用胚发生的棉花植物转化和再生策略相比，能够显著地节约时间和劳力。表12示出了测试的选择剂和有效量。

表9.补加抗生素的改良的WPM的组成。

成分	量/L或终浓度
		包含维生素的LM WPM(Phytotech L449)	2.41g
葡萄糖(Fisher D16-3)	20g
		葡糖酸钙(Sigma G-4625)	1.29g
Clearys 3336WP(Carlin 10-032)	0.03g
		AGARGEL(Sigma A-3301)	4g
加水至	1L
		pH	5.6
高压灭菌
		羧苄青霉素(Phytotech C346)(40mg/mL)	200ppm
头孢噻肟(Midwest NDC0039-0019-10)(50mg/mL)	200ppm
		壮观霉素(50mg/mL)	150ppm

表10.外植体植入和表面种植的比较。

	植入	表面种植
			外植体总数	2942	2530
可再生的％	25.8	35.3
			阳性表型％	3.0	4.7
含GUS时可再生的％	0.5	1.2
			含GUS时阳性表型％	4.6	8.4
具有强近周缘gus表达时可再生的％	0.1	0.1
			具有强近周缘gus表达时阳性表型％	1.2	0.8

阳性表型：证明有指示对使用的选择剂的抗性的可见表型(例如在壮观霉素选择下适当形成的看起来绿色健康的生长，与变白的畸形的和坏死的非转基因表型阴性组织截然不同)；

近周缘转化：根据GUS的组织化学染色分析，在包括中脉的一个叶子中切割边缘50％或更大面积有稳定的GUS表达，或在多个叶子中有稳定的GUS表达。

表11.CRM的组成。

成分	量/L或终浓度
		MS基础盐(Phytotech M524)	2.15g
肌醇(Sigma I-3011)	0.1g
		葡萄糖(Fisher D16-3)	30g
SBRM维生素储存液：甘氨酸(Sigma G-6143)：1g/L烟酸(Sigma N-0765)：0.25g/L盐酸吡哆醇(Sigma P-8666)：0.25g/L盐酸硫胺素(Sigma T-3902)：0.5g/L	2mL
		半胱氨酸(10mg/mL)	10mL

使用去离子蒸馏水调节体积
		使用KOH调节pH	5.8
细菌培养用琼脂(BD 214030)
		高压灭菌	8g
IAA(Sigma I-2886)(0.02mg/mL)	0.1ppm
		特美汀(Duchefa TO 190)(100mg/mL)	100ppmL
头孢噻肟(Midwest NDC0039-0019-10)(50mg/mL)	200ppm

表12.选择剂和它们的有效量。

选择剂	测试范围(ppm)	在以下浓度(ppm)时产生的稳定转化的植物
			麦草畏	0-10	0.3
草丁膦	0-25	0、4、5、7、10、13、25
			草丁膦+麦草畏	0-7/0-0.3	4/0.2、4/0.25
壮观霉素	0-1000	50、75、100、150+
			巴龙霉素	0-400	200、300

壮观霉素可作为早期确认转化的有用的可视标记。在壮观霉素选择下，非转化的组织通常显示变白和通常是畸形的，而转化的组织是绿色的并适当发育(图5)。在选择培养基上大约4-8周之后通过GUS表达证实绿色组织的转化特性。因此，使用壮观霉素作为选择剂优于在分生组织转化系统中通常使用的费力和费时的GUS分析，并且具有能够显著地降低产生转基因植物所需的劳力的优点。

E.使用化学修整或除草剂喷洒对转基因事件的选择和确认：

通过除草剂喷洒进行的化学修整(即杀死非转化的组织)也在用麦草畏和草丁膦抗性转基因转化的植物上进行了测试。将植物置于一个特殊的喷洒室内，手动喷洒市售的除草剂制剂，例如100-3000ppm的LIBERTY和100-3000ppm的CLARITY。喷洒植物直到液体流出，使其干燥大约2小时，然后移回到温室中。非转基因的组织通常会被杀死或者它们的生长受到喷洒的抑制，而表达转基因的组织能够持续生长，因此能够很容易地识别出转基因的组织。CLARITY和LIBERTY喷洒通常会造成侧枝的发育，这成为了主要的生长，导致了包含转基因的R1种子。

同样地，除草剂喷洒也用于在缺乏选择剂的情况下或在无效的组织培养选择之后选择转基因植物。接种包含除草剂抗性基因的质粒后，未知转基因状态的再生事件用优化剂量的选择剂(例如1000ppm草丁膦)喷洒，以获得抗性表型。

F.通过使用分析测定对转基因事件的选择和确认：

用包含可视标记基因(例如uidA)的质粒转化的植物可以通过叶子、花粉或其它组织的组织化学分析来确认，如WO9215675；美国专利5,164,310；McCabe和Martinell，1993所述。还可以使用实时PCR。

实施例6

从机械切除的棉花外植体获得的转基因事件的表征

这部分描述了转基因事件的表征。使用事件#GH A24519作为一个例子。种子(来自棉花cv.STN474)进行表面灭菌、清洗，并在28℃下在CSM培养基中吸胀大约16小时。然后对吸胀的种子进行机器切割，使用钢辊，设置为2至3mm间隙距离(是根据相对的轧辊的峰顶与谷底之间的距离测量的，确定适合这批STN474种子)，并经过两步筛分过程进行筛选(使用#10筛子进行手动筛分，然后进行自动筛分，然后使用包含pMON96959的土壤杆菌进行制备和接种，例如，如实施例1-5中所述。共培养之后，将外植体植入到补加有100mg/L头孢噻肟和0.3mg/L麦草畏的WPM固体培养基中，每个Plantcon^TM中25个胚。让外植体在该选择性培养基中在28℃和16小时光的光周期下生长大约一个月。在一个月后进行GUS分析，将包括GH_A24159的几个有希望的植物转移到CRM上生根。3周以后再次进行GUS分析来检测转化，所有的样品叶子都显示出高水平的GUS表达。横截面GUS组织化学分析显示在叶柄脉管组织中有GUS表达。R₀植物的第一朵花也显示在花粉、花瓣、萼片等中存在GUS表达。

还进行了分子分析来确定转化。叶子样品的PCR结果显示存在DMO序列。R₀植物的DNA印迹杂交分析确定了在采样的叶子中存在至少两个拷贝的DMO转基因(例如图6的2-4泳道)。蛋白质印迹分析进一步证明了DMO蛋白的表达(图7)。R₀植物的插条显示耐受200ppm CLARITY喷洒。为了加速R1分析，从第一朵花上切下生长16天的未成熟胚进行研究。8个进行染色来分析GUS活性，其中6个证明在所有的组织中具有GUS表达，提示3∶1的孟德尔分离。让剩余的花朵正常成熟，回收R1种子。在15个R1秧苗植物中，9个是GUS阳性的。应用麦草畏(200ppm CLARITY或3000ppmCLARITY)进一步确定了GUS+表型，并且麦草畏耐受性在GH_A24519的R1秧苗中共分离。

使用改良的钢辊进行机械化棉籽胚轴切除结合从碾碎的种子中机械回收外植体，以及有效地选择转化的材料，包括在创伤外植体的土壤杆菌介导的转化后“化学修整”，允许在很短的时间内(3个月)产生转基因棉花植物，转基因R1种子在转化后24周可以获得。获得转基因植物和后代所需的时间明显短于经过胚发生产生转基因棉花植物所需的时间，产生的植物是可以繁殖的，并且植物可以在多种目标棉花种质中获得，甚至在具有较差的胚发生潜力的系中也可以获得。这些方法具有提高加工效率和强度的优势，同时降低了成本和人工负担。

实施例7

手工与机械切除的效率

从种子中切除胚轴的手工过程是缓慢、费力的，并具有相当大的人工负担。使用机器切除和机械化筛分的结合不但克服了上述问题，还可以扩大化以增加处理量。表13和14示出了手工与日益改进的机械化切除/筛分方法在切除通量和生产能力方面的比较。手工切除的生产能力是基于7小时/天、4天/周不间断切除的假定，而机器切除的生产能力是基于1个运转(45-75分钟)/天、4天/周的假定。表15显示：机械切除/筛分每小时可以产生4000-5000个质量外植体，即具有可视分生组织的外植体，比手工切除提高了大约20倍，并且具有较高通量和较低人工负担的优势。

表13.切除通量的比较。

切除方法	产生的外植体数/人工小时
		手工切除	250
弹性体轧辊和手工筛分	1400
		钢辊和手工筛分	4200
钢辊和机器筛分	4200

表14.每周产生10000个外植体所需的工时的比较。

切除方法	工时/周
		手工切除	40
弹性体轧辊和手工筛分	7
		钢辊和手工筛分	2.4
钢辊和机器筛分	2.4

表15.生产能力的比较。

	手工切除	机器切除
			产生1000个质量外植体所需的种子g	300	333
质量外植体的回收％	32	30
			产生1000个质量外植体所需的时间	4小时	14分钟
生产能力：质量外植体/小时	250	4200

实施例8

外植体储存对转化的影响

还研究了机器切除的棉花外植体的储存。储存准备转化的外植体的能力使得安排和进行转化实验更加灵活。切除之后，在继续例如转化过程之前可以储存棉花外植体。在一个实验中，切除之后、用土壤杆菌接种之前，外植体储存在4℃过夜。按照这种方案储存之后，发现外植体能够维持转化能力。表16总结了另一实验的结果。当按照例如上述实施例1和2所述回收外植体之后，将外植体置于无菌Plantcon^TM(例如ICN Biomedical Cat.#26-720-02)中或INO培养基浸湿的滤纸上，并置于灭菌的150mm培养皿中于4℃冷却器中暗处存放0天和7天。在接种前使外植体回到室温。可再生％代表了能够生长成为小植株的外植体总数目的百分比。具有阳性GUS的可再生％是指具有阳性GUS的外植体的数目除以可再生外植体的总数×100。可再生的强近周缘gus表达命中％是指强的近周缘gus表达的数目除以可再生外植体的总数×100。

总而言之，结果(表16)显示：在接种之前在4℃下储存外植体3天提高了可再生外植体的回收百分比，因此，这是控制转化工作流程的一个简单有效的方法。尽管冷储存看起来降低了表达GUS的小植株相对于可再生外植体的数目的百分比，但是那些保持生长的植株更有可能具有稳定的GUS表达。因此，产生转化事件所涉及的劳力也降低了。

表16.外植体储存对转化的影响。

实施例9

在吸胀、共培养、选择和生长步骤过程中操作其它参数的效果

通过操作一种或多种下述参数，例如将吸胀温度从28℃降低到24℃或15℃、共培养后在35℃下初始选择外植体3天、在允许正常质体发育的光照条件(例如强度≥5μE，例如大约5μE至大约130-200μE，大约16小时光/8小时暗的光周期)下共培养、在接种/共培养或选择中使用较高的壮观霉素浓度、在共培养培养基中使用壮观霉素、通过后续的喷洒选择植物(例如在生根或后续生长中的“化学修整”)，可以使每个外植体的种系阳性事件％增加2至10倍。在预培养培养基中使用壮观霉素还证明了在提高TF(％)或提高事件质量方面的有益效果。

在进一步的研究中，根据上述(例如实施例5)或美国专利公布20050005321中所述进行种子吸胀和外植体切除。对于接种和共培养，使用带有包含1或2个T-DNA和aadA选择性标记基因和uidA可筛选标记的双运载体的土壤杆菌ABI菌株(C58衍生物)。大批超声处理或在各个PLANTCON容器中超声处理外植体。通过在半固体选择培养基(表9)上表面种植外植体来进行苗诱导和选择大约4周。进一步进行苗诱导和生根，这是通过具有绿色苗的外植体在用于延长苗和诱导根的Oasis

塞(Smithers-Oasis USA；Kent，OH)中生长，其在不含选择剂、包含0.5g/L WPM盐和维生素(Phytotech L449)和0.25mg/L IBA的简单液体培养基中在温室中生长大约2-3周。结果示于表17中。发现当35℃的初始培养温度对产生GUS阳性棉苗是有益的。

表17.比较两种接种/共培养方法和两种不同的培养方案的实验的结果。

实验-处理	接种/共培养方法1	培养温度	具有分生组织的外植体数	GUS+苗的数目(分析的苗的总数)	产生GUS+苗的外植体％
						1021-1	A	35℃三天至28℃	127	6(7)	4.7
1021-2	B	28℃	183	0(2)	0
						1021-3	B	35℃三天至28℃	141	0(2)	0
1021-4	A	28℃	324	2(2)	0.6
						1021-5	A	35℃三天至28℃	225	7(9)	3.1
1023-1	A	35℃三天至28℃	81	5(7)	6.2
						1023-2	B	28℃	95	0(0)	0
1023-3	B	35℃三天至28℃	81	11(13)	13.6
						1023-4	A	28℃	101	0(0)	0
1023-5	A	35℃三天至28℃	88	1(3)	1.1

^1.方法A：每种处理中的所有的外植体被置于一个PLANTCON中，添加土壤杆菌接种物来覆盖外植体。对接种物中的外植体超声处理(批量超声处理)2分钟，然后再震荡10分钟(80rpm)。然后去除接种物，将外植体分配到各包含一片滤纸和5ml接种培养基的PLANTCON中。

方法B：将外植体分配至每个PLANTCON的覆盖部分(大约每个PLANTCON中100个外植体)。添加5ml土壤杆菌接种物。然后超声处理外植体20秒，然后立即与接种物一起转移到装有一片滤纸的PLANTCON的底部。

实施例10

Roundup Ready^TM棉花种质的再转化

使用本发明所述的方法，可以进一步使用1个2T-DNA载体(或使用两个1T-DNA载体)转化优良转基因Roundup Ready^TM种质，该载体编码用于壮观霉素选择的aadA基因，并在第二个T-DNA上使用一个新的基因(通常称为“目的基因”；“GOI”)，使其能够与上述aadA分离。下述棉花方法和数据集在描述这种“再转化”中是有用的。

将棉花RRFlex

种子品种(07W610F)与种质对照非转基因品种(00S04)进行对比。种子在24℃下吸胀约18小时，机器切割、机器筛分(分两步)，然后再浮选富集外植体。将外植体用土壤杆菌在INO中的OD 0.3的悬浮液进行接种，超声处理2分钟，并培育10分钟。然后去除土壤杆菌悬浮液，将外植体分配到共培养容器中，大约每个容器2g。将外植体置于用5ml共培养培养基(INO，添加有50ppm制霉菌素、10ppm TBZ(噻苯达唑)和100ppm壮观霉素)浸湿的滤纸上，在光照的Percival培养器中在大约23至25℃(16小时光/8小时暗，光强度≥5μE，例如5μE至200μE)下共培养3天。然后将外植体转移到选择培养基(表9)中，在35℃下在有光照的房间里(16小时光/8小时暗)培育3天，然后转移到28℃的有光照的房间里(16小时光/8小时暗)。接种后六周收获表型阳性的绿色小植株，置于使用0.5g/L WPM盐浸湿的OASIS塞中，并转移到温室条件中。一旦植物适应新环境并开始生长时，分析其CP4、GUS和脉管的GUS表达(种系转化的预测指标)。再转化的转基因植物预期是CP4+GUS+，而转化的对照植物预期是CP4-GUS+。转化的植物的产率分析列于下述表18中。因此，所述的过程可用于再次转化转基因棉花植物，其效率与传统的非转基因棉花品种的转化效率相似。

表18.从转基因棉花种质的再次转化观察到的转化频率。

测试的棉花种质

接种的质量外植体

壮观霉素表型阳性(绿色)小植株

绿色小植株％

为GUS采样的植物数

在所有的叶子中表达GUS的植物(种系)

％TF，表达GUS的种系

00S04

928

18

1.90％

11

2

0.22％

07W610F

3665

87

2.40％

64

9

0.25％

************

所有在此公开和要求保护的组合物和方法都可以根据本发明的公开内容无需过多的实验就可以制备和实施。尽管本发明的组合物和方法已经在上述示例性的实施方案中进行了描述，但是本领域的技术人员应当明白：在不偏离本发明的真实概念、精神和范围的情况下，可以对此处所描述的组合物、方法、方法的步骤或步骤的顺序进行一些变化、改变、改进和改造。更具体而言，应当理解某些化学和生理相关的试剂可以替代此处所描述的试剂，而获得相同或相似的结果。本领域技术人员明白的所有这些相似的替代物或改变被认为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

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本文特别引入以下文献作为参考，其提供补充本文所述信息的示例性的程序上的或其它方面的细节。

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Claims (26)

1.一种用于产生转化的棉花植物组织的高通量方法，包括：

a)机械破坏棉籽以获得多个棉胚分生组织外植体；和

b)将外植体与编码可选择的或可筛选的标记的选择的DNA序列相接触以获得由选择的DNA转化的至少第一外植体，

c)从由选择的DNA转化的至少第一外植体再生包含转基因植物组织的嵌合棉花植物，其中转基因棉花植物的再生不包括由外植体产生愈伤组织培养物；

d)通过将嵌合棉花植物与选择剂相接触来从嵌合棉花植物选择转基因组织，其中可选择的标记提供对选择剂的耐受性；和

e)从步骤(d)选择的转基因组织获得非嵌合转基因棉花植物，从而获得转化的棉花植物组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在进行(b)步骤之前，所述外植体贮存在0-15℃温度下1小时至7天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非嵌合转基因棉花植物是通过导致种系组织转化的分生组织的转化产生的。

4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在外植体与选择的DNA序列接触之前筛选外植体，以确认适合用选择的DNA转化和由其再生转基因植物的一部分外植体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，筛选外植体包括将包含外植体的机械破坏的棉籽置于水性环境中，并根据浮力选择将与选择的DNA接触的外植体。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，筛选外植体包括筛分机械破坏的棉籽以从种皮或子叶组织中分离出外植体。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，筛选外植体包括富集适合转化的外植体部分。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述选择的DNA序列编码所述标记，或确定一种农学性状。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的外植体包含转基因。

10.根据权利要求8所述的方法，进一步包括通过将外植体与选择剂相接触来选择或筛选由选择的DNA转化的外植体，其中，可选择的标记提供对选择剂的耐受性；或在可筛选的标记的存在下通过将外植体与产生可筛选表型的试剂相接触来选择或筛选由选择的DNA转化的外植体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，转基因棉花植物组织是由分生组织的转化产生的。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，转基因外植体的选择或筛选包括将外植体与选择剂或产生可筛选表型的试剂相接触，该选择剂或产生可筛选表型的试剂选自草丁膦、麦草畏、草甘膦、壮观霉素、链霉素、卡那霉素、G418、巴龙霉素、咪唑啉酮、GUS的底物及其组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，机械破坏棉籽包括使种子通过碾碎种子的轧辊。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述轧辊包含次级凹槽。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述轧辊由不锈钢制成。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，外植体与选择的DNA序列的接触包括将外植体与能够用选择的DNA至少转化外植体第一细胞的重组根瘤菌或土壤杆菌相接触。

17.根据权利要求16所述的方法，包括将外植体与生长至0.0045到1.4的OD660的重组土壤杆菌培养物相接触。

18.根据权利要求16所述的方法，包括将外植体与土壤杆菌培养物相接触，其中，棉花分生组织与土壤杆菌细胞接触的pH为5.0至10.0。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，在外植体与重组根瘤菌或土壤杆菌相接触之前，根瘤菌或土壤杆菌在对未转化的外植体有活性的选择剂存在下悬浮。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，外植体与选择的DNA序列的接触包括通过微粒轰击转化外植体。

21.根据权利要求16所述的方法，其中，在外植体与选择的DNA序列相接触之后，外植体在35℃下、在选择剂的存在下生长，或者外植体在允许质体正常发育的光照条件下生长。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，在35℃下生长1-7天；所述选择剂选自壮观霉素、链霉素、卡那霉素、草甘膦、草丁膦、潮霉素和麦草畏；或者外植体在≥5μ爱因斯坦的光强度和16小时光/8小时暗的光周期下生长。

23.根据权利要求16所述的方法，其中，在步骤(b)之前、期间或之后，外植体在杀真菌剂的存在下生长。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，外植体在杀真菌剂和DMSO的存在下生长。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，外植体在制霉菌素、噻苯达唑和DMSO的存在下生长。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，转基因组织的选择包括将嵌合植物与选择剂相接触，该选择剂选自草丁膦、麦草畏、草甘膦、壮观霉素、链霉素、卡那霉素、G418、巴龙霉素、咪唑啉酮及其组合。

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