CN107312795A - 运用CRISPR/Cas9系统创制粉色果实番茄的基因编辑方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及番茄转基因材料的构建，旨在提供一种运用CRISPR/Cas9系统对番茄SlMYB12基因造成突变，将红色果实番茄转变为粉色果实番茄的基因编辑方法。包括：设计SlMYB12基因的gRNA靶位点对应oligo引物，重组连接oligo二聚体和Cas9/gRNA载体。然后转化大肠杆菌感受态细胞，将测序结果正确的质粒转化农杆菌，并介导转化番茄愈伤组织获得转基因植株，获得转基因阳性株系；经基因测序和表型观察确定的纯合突变株系，即为完全丧失SlMYB12功能，果实粉红色的番茄突变体。本发明能有效敲除阻断SlMYB12基因的转录翻译，是成功实现番茄红色果实向粉色果实转变的理想基因编辑体系。

Description

运用CRISPR/Cas9系统创制粉色果实番茄的基因编辑方法

技术领域

本发明涉及番茄转基因材料的构建，特别涉及运用CRISPR/Cas9基因编辑系统将红果番茄材料转变为粉果番茄材料的基因编辑方法。

背景技术

番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，也是果实类研究模式植物。目前在番茄生产上，欧美地区消费习惯以大红色果实番茄为主，而部分亚洲国家，尤其是中国和日本，则有一定的粉色果实番茄消费习惯。由于红果番茄育种工作开展早、积累材料丰富，红果番茄材料的丰产性、抗病性和商品性等相关特征总体上优于粉果番茄。因此，在育种工作中可利用的红果优异种质资源也远多于粉果材料。番茄果实颜色取决于果皮和果肉颜色，当果肉颜色为粉红色时，黄色果皮的番茄果实呈现红色，而透明果皮的番茄呈现粉红色。SlMYB12是番茄MYB转录因子家族成员之一，相关文献证明SlMYB12基因编码蛋白通过转录调控番茄果皮中类黄酮含量决定果皮颜色，当SlMYB12突变时，类黄酮合成路径被阻断，番茄果实果皮颜色呈透明。

在过去数年中，有相关研究通过QTL，病毒诱导基因沉默等生物学技术手段进行SlMYB12与透明果皮之间的相关性研究。但是以上技术手段不能完全抑制SlMYB12基因在番茄中的转录和翻译，且获得的材料不能稳定遗传。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。至今为止，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入、缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段，应用前景十分广阔。但是，目前尚无运用该技术敲除水稻SlMYB12基因，实现番茄果实颜色从红色转为粉色的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有传统番茄育种技术周期长、效率低的不足和现有转基因技术无法定向敲除基因的问题，提供一种运用CRISPR/Cas9系统敲除红果番茄材料SlMYB12基因的基因编辑方法，以获得完全丧失SlMYB12功能，稳定遗传且无外源基因插入的理想粉果番茄突变体。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种运用CRISPR/Cas9系统敲除番茄SlMYB12基因编辑方法，包括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择，SlMYB12位于番茄基因组的1号染色体上，利用CRISPR-Plant在线设计工具，根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，把靶位点设计在SlMYB12基因的5’端第一个外显子上；

(2)gRNA的片段克隆，以番茄(Solanum lycopersicum)基因组DNA序列为参考，设计两段oligo序列，其中F和R分别代表正、反向引物：

Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’

Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’

反应体系为：Target-F 5μL；Target-R 5μL；H₂O 15μL

反应条件为：95℃，3min；95℃到25℃室温条件下缓慢冷却；16℃5min；

(3)靶标序列插入Cas9/sgRNA载体：将上一步获得的退火oligo产物通过同源重组插入Cas9/sgRNA载体。取oligo二聚体1μL，与1μL Cas9/gRNA，1μL Solution 1，1μLSolution 2，6μL H₂O混合均匀，在PCR仪中16℃反应2小时完成重组连接；

(4)载体农杆菌转化：将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素(Kanamycin)平板培养过夜，挑取单菌落摇菌培养，抽取质粒样品测序，测序结果正确的质粒转化农杆菌GV3101；

(5)农杆菌介导转化番茄愈伤组织获得转基因植株：以野生型番茄Alisa Craig为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的番茄转化实验，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系；

(6)获得阳性株系后，提取基因组DNA，在靶位点的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物后进行测序，并判断突变是否纯合。如果靶标基因SlMYB12测序结果显示纯合突变，观察T0代突变体果实颜色加以验证(纯合突变为粉色)；如果靶标基因SlMYB12测序结果显示为杂合突变，收取T0代突变体植株种子，发苗，筛选T1代植株中的SlMYB12纯合突变体，筛选方法同上。

(7)经基因组测序和表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SlMYB12功能，无外源基因插入的粉红色番茄果实突变体。

附图说明

图1：Cas9/sgRNA(编号VK005-14)与载体oligo二聚体重组连接位置示意图；

图2：SlMYB12基因1号外显子及1#株系基因变异图；

图3：野生型(Wt)，1#株系，2#株系的靶位点突变测序图谱；

图4：SlMYB12编辑失败株系2#和编辑成功株系1#的番茄果实表型变化对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1番茄SlMYB12基因敲除株系的获得与鉴定

本发明所转番茄品种为Alisa Craig(Solanum lycopersicum cv.Alisa Craig)。

1.gRNA靶位点的选择

由于SlMYB12基因位于番茄基因组的第一号染色体上，根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，本发明靶位点设计在SlMYB12基因第一个外显子上。见SEQ ID NO:1，SlMYB12基因1号外显子，划线部分为靶位点

2.gRNA的oligo合成与退火

2.1以gRNA靶位点为模板，按照如下格式设计引物oligo，引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：

Target-F:5’-TTG-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA

Target-R:5’-AAC-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA

2.2 oligo退火

将oligo分别稀释成10μM，反应体系和程序分别为：

Target-F	5μL
		Target-R	5μL
H2O	15μL
		总计	25μL

预变性95℃3min，95℃到25℃室温条件下缓慢冷却，16℃冷浴5min。

3.含gRNA载体构建

将退火后oligo二聚体和Cas9/gRNA载体进行连接，如图1所示，反应体系和程序如下：

16℃冷浴2小时。

4.将连接后的载体转化大肠杆菌感受态DH5a，涂板过夜，挑取单菌落，摇菌4h，提取质粒进行样品测序(生工，DP105)。测序引物为sqprimer1，序列如下：

GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG。

5.将连接正确的质粒，转化农杆菌GV3101。

6.农杆菌介导转化番茄愈伤组织获得转基因植株以野生型番茄Alisa Craig为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的番茄转化实验。以GV3101农杆菌进行感染转化，经过潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系。

7.转基因番茄中SlMYB12基因突变体的检测

7.1设计目的基因检测引物，根据目的基因，在gRNA序列上游和下游分别设计引物，引物序列分别为：

SlMYB12-F:TAATTTTCATTGCCTTTTGCT

SlMYB12-R:TATTATTTTTTAAACGAAGAAAGTA

7.2将获得的3个转基因阳性植株，分别提取基因组DNA(天根，DP305试剂盒)，进行PCR反应。利用天根PCR产物纯化试剂盒(DP214)纯化PCR产物，进行测序，测序公司为上海生工生物，测序引物序列如下：

Sqprimer2:TTCTGGACCTAGACTAAA

测序结果如图2、3所示。

测序结果经突变序列分析，发现1#株系存在4bp的小片段缺失，2#株系没有碱基变化(与野生型一致)。以上二个株系种植在人工温室内，收取果实，发现1#株系果实果皮为透明，果实为粉红色，而2#株系与野生型Alisa Craig一致，果皮为黄色，果实为大红色，如图4所示。相关文献证明SlMYB12为控制黄色果皮显性基因，因此，结果表明1#株系为SlMYB12纯合突变体。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (3)

1.运用CRISPR/Cas9系统敲除番茄SlMYB12的基因编辑方法，其特征在于，

包括gRNA靶位点设计在SlMYB12基因的上游5’端第一个外显子上的序列，为：F:5’-TGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’，R:5’-TCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’；

包括gRNA靶位点对应oligo二聚体的合成的序列，oligo序列为：Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’。

2.运用CRISPR/Cas9系统敲除番茄SlMYB12的基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择

利用CRISPR在线设计工具CRISPR-Plant，根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，把gRNA靶位点设计在SlMYB12基因的上游5’端第一个外显子上，具体序列为：F:5’-TGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’，R:5’-TCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’；

(2)gRNA靶位点对应oligo二聚体的合成

根据gRNA靶点序列设计oligo并进行合成，oligo序列为：

Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’

Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’；

(3)oligo二聚体插入到Cas9/gRNA表达转化载体中

利用北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒，试剂混合比例为：

取最终体系10μL在16℃反应2小时；

(4)载体转化和阳性克隆鉴定

取步骤(3)的最终体系产物10μL加入到50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟，42℃热激60秒，冰浴2分钟，加入800μL LB培养液，置于37℃恒温150rpm摇床，复苏1小时候涂卡那霉素抗性平板，37℃恒温培养箱过夜，挑5-10个白色菌落摇菌培养测序，测序引物序列为：5’-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3’；

(5)农杆菌介导转化番茄愈伤组织获得基因编辑植株

以野生型番茄Alisa Craig为材料，进行农杆菌介导的番茄转化试验，将测序结果正确的质粒，转化GV3101农杆菌进行感染转化，经过潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系；

(6)突变体阳性株系基因测序和表型验证

获得阳性植株后，提取基因组DNA，在靶位点的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，将PCR产物进行纯化回收，直接进行测序，根据测序结果单碱基峰值判断靶标基因突变是否纯合，如果SlMYB12基因纯合突变，观察T0代突变体植株果实颜色进行表型验证，如果为杂合突变，收取T0代突变体植株种子，发苗，同样方法筛选T1代植株中的SlMYB12纯合突变体，结合表型观察验证；

(7)验证判断

经基因组测序和表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SlMYB12功能，无外源基因插入的粉红色番茄果实突变体。

3.根据权利要求2所述的运用CRISPR/Cas9系统敲除番茄SlMYB12的基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(2)中将合成的oligo分别稀释成10μM，按照如下比例混合：

Target-F 5μL

Target-R 5μL

H₂O 15μL

取最终体系25μL，混匀后，按照如下程序处理：

95℃ 3min

95℃到25℃室温条件下缓慢冷却

16℃ 5min。