CN109234310B

CN109234310B - 快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法

Info

Publication number: CN109234310B
Application number: CN201811347308.8A
Authority: CN
Inventors: 黄昌军; 刘勇; 于海芹; 曾建敏; 李永平
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: CN109234310A

Abstract

快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法，所述重组载体是在原始载体中插入含有PAP1和NtFT表达元件，该表达元件命名为PF Cas sete，其核苷酸序列如SEQ ID No.1；所述原始载体为含有sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因的用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9的载体；NtFT表达元件产生促进植物早花的蛋白，PAP1表达元件产生促进植物花青素生物合成的蛋白。本发明可以极大地缩短得到基因编辑突变后代的时间，并通过植株颜色对后代植株进行筛选，既保留了目的基因突变的后代，又确保了该突变后代中不含有转基因片段，同时可以显著提高基因编辑效率。本发明方法简单，快速、廉价和高效。

Description

快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法。

背景技术

2012年，成簇的规律间隔性短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palirdromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISP R/Cas9)及相关核酸酶Cas9被报道可用于基因的编辑。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(Zinc fingernuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcrip tion activator likeeffector nuclease，TALEN)之后发展的新的基因编辑系统。经过短短几年的发展，因其具有操作简单、编辑效率高、脱靶效率低等特点迅速成为最成功，应用最广泛的基因组编辑技术。CRISPR/Cas9系统在主要的粮食作物如水稻、小麦、玉米、大豆及经济作物棉花、烟草、花卉等均已经获得了成功的应用，展现出了强大的育种应用潜力，其中基因编辑的蘑菇已经在美国成功上市。

CRISPR/Cas9体系中的载体用于基因编辑主要由两大元件构成：sgRNA(singleguide RNA)以及核酸酶Cas9。sgRNA是一种非编码小RNA，其中含有人为设计的一段20bp左右和基因组匹配的序列，指导Cas9编码的核酸酶蛋白匹配到基因组的特定位置进行DNA核酸序列切割，形成双链切口，从而在植物利用自身的修复系统在DNA损伤修复过程中引入突变。此外，在CRISPR/Cas9载体中一般还含有在转基因过程需要的筛选基因，一般为抗生素基因例如潮霉素抗性基因(Hygromycin)，草甘膦抗性基因(Basta)或卡那霉素(Kanamycin)。与传统转基因不同的是，CRISPR/Cas9系统在转基因T0代植株中就可以实现靶基因的突变。一般在T0代筛选到靶基因的突变后(杂合突变、等位突变或纯合突变)需要在T1代植株中通过回交或自交的方式剔除CRISPR/Cas9转基因元件，获得无转基因成分的基因编辑植株。无转基因成分的基因编辑植株既可以避免含有转基因成分对靶基因表型和生物学功能的干扰，在生产上也可以降低公众对转基因的恐慌心理，提高作物基因编辑的食品安全性。目前从T0代苗期获得靶基因突变后到得到T1代种子一般需要整个营养生长和生殖生长的过程，时间漫长。对于T1代无转基因成分的筛选，一般利用基于PCR技术的各种衍生方法，但基本都需要进行DNA提取、特异性引物PCR扩增和电泳检测，费时、费力、费财且容易产生假阴性结果。因此现用的CRISPR/Cas9系统还存在较大的优化和提高的空间，主要存在于：(1)如何提高CRISPR/Cas9系统的编辑事件发生的效率；(2)如何缩短从获得T0代靶基因突变后到T1代植株中剔除CRISPR/Cas9转基因元件的时间；(3)能否建立一个高效的无转基因成分筛选体系。通过以上三部分的优化将节约时间和人力成本，也可使得作物全基因组的大规模编辑更容易实现，促进CRISPR/Cas9系统在作物的基础研究和应用中发挥更强大的作用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种筛选方法简单、廉价和高效，可以显著提高得到基因编辑植株的效率，缩短得到无转基因成分基因编辑后代植株的时间的快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体，该重组载体携带有NtFT和PAP1表达元件；所述重组载体是在原始载体中插入含有PAP1和NtFT表达元件，该表达元件命名为PFCassete，其核苷酸序列如SEQ ID No.1；所述原始载体为含有sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因的用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9的载体；所述NtFT表达元件产生促进植物早花的蛋白，所述PAP1表达元件产生促进植物花青素生物合成的蛋白。

本发明所述无转基因基因编辑植株重组载体的使用方法如下：

(1)将所述含有PF Cassete的重组载体转入植株中，培养获得T0代转基因植株，转基因植株中含有PF Cassete和原始载体中的其他元件如sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因；

(2)从T0代转基因植株中选择颜色为紫色或深紫色的植株进行下述步骤(3)的筛选，丢弃紫色绿色嵌合或淡紫色的植株；

(3)从紫色或深紫色的植株中筛选得到含重组载体同时目标基因已完成编辑的T0代植株；

(4)继续培养T0代植株直至获得T1代种子；

(5)种植T1代种子，在T1代幼苗期间，观察紫色和绿色；若植物幼苗为紫色，则为含有外源重组载体插入的植株；反之，若幼苗没有任何紫色，仅表现为绿色，则为无外源重组载体插入的植株，判定为无转基因基因编辑材料。

上述步骤(3)所述筛选过程包括：

(3.1)选取步骤(2)存在所述T0代转基因植株中选择颜色为紫色或深紫色的植株，得到含重组载体的转基因植株；

(3.2)提取步骤(3.1)中含重组载体的转基因植株DNA，经测序或者酶切验证，确定转基因植株中sgRNA对应的靶片段区域的序列已经发生突变，从中挑取已发生基因突变的序列所对应的植株，获得含重组载体的转基因突变植株T0代。

本发明与现有技术相比，具有以下益效果：

本发明的重组载体携带有NtFT和PAP1表达元件，采用本发明的重组载体和方法可以利用T0转基因植株中紫色的深浅作为判定编辑事件发生效率的指标，即嵌合型紫色或者淡紫色的植株，编辑效率低不需要保留进行编辑事件检测，只需要保留深紫色的转基因植株，显著提高获得发生基因编辑事件植株的效率；可以在T0代转基因植株中缩短作物开花时间，迅速得到T1代有基因编辑的种子，极大节约获得T1代种子的时间；可以在T1代苗期可以通过观察紫色表型的有无进行转基因成分的筛选，若植株表现出紫色，则为携带转基因成分的植株，不需要保留，而表型为绿色，紫色丢失的植株则为不含有转基因片段的后代，简单高效，省时省力，不需要用到任何检测试剂即可获得既保留了目的基因的突变，又确保了该突变后代中不含有T-DNA，开花时间恢复到正常的植株。

本发明提供的快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法，是基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，在原始基因编辑载体中引入NtFT和PAP1表达元件，可以极大地缩短得到无转基因成分基因编辑后代植株的时间，并通过植株颜色对后代植株进行无转基因成分筛选，既保留了目的基因突变的后代，又确保了该突变后代中不含有转基因片段，同时可以在早期筛选掉基因编辑效率不高的植株，显著提高得到基因编辑植株的效率。本发明的筛选方法简单，廉价和高效。

附图说明

图1为PF Cassete的构建示意图。其中PAP1基因(PAP1)来源于拟南芥，该基因用于原花青素的合成，由CmYLCV启动子(Cm)驱动，由35s终止子(35Ster)终止转录。NtFT基因(NtFT)来源于烟草，可以调控植物的早花，由AtUbi10启动子驱动(AtUbi10)，Nos终止子(Nos)终止转录。

图2为含有PF Cassete的基因编辑植株的早花现象。从图中可以看出典型的紫色叶片，苗期早花现象。图左为常规Cas9编辑载体转化的植株，图右为本发明创制的含有PFCassete的基因编辑载体转化的植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体，所述重组载体携带有NtFT和PAP1表达元件；所述重组载体是在原始载体中插入含有PAP1和NtFT表达元件，该表达元件命名为PF Cassete，其核苷酸序列如SEQ ID No.1；所述原始载体为含有sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因的用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9的载体，所有对上述原始载体所做的基于PF Cassete的改造都属于本发明的保护范围。本发明所述NtFT表达元件产生促进植物早花的蛋白，所述PAP1表达元件产生促进植物花青素生物合成的蛋白。

核苷酸序列表如下：

(2)从T0代转基因植株中选择颜色为紫色或深紫色的植株进行后续步骤(3)的筛选，丢弃紫色绿色嵌合或淡紫色的植株，一般这样的植株编辑事件发生效率较低；

(3)从紫色或深紫色的植株中筛选得到含重组载体同时目标基因已完成编辑的T0代植株；筛选过程包括：

(3.2)提取步骤(3.1)中含重组载体的转基因植株DNA，经测序或者酶切验证，确定转基因植株中sgRNA对应的靶片段区域的序列已经发生突变，从中挑取已发生基因突变的序列所对应的植株，获得含重组载体的转基因突变植株T0代；

(4)继续培养T0代植株直至获得T1代种子，因T0代植株中含有PF Cassete，获得T1代种子将缩短三分之一时间以上；

本发明中的PAP1基因为花青素合成途径中重要的转录因子，可以产生促进植物花青素生物合成的蛋白，该基因的表达将在植物中叶片和茎等多个部位产生紫色的表型，如无该基因的表达，则植物中将保持本来的绿色表型。NtFT能够诱导作物早花，可以缩短作物开花时间，达到缩短育种年限的目的。

本发明通过在原始载体中引入PF Cassete，使得PF Cassete和原始载体中的其他元件如sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因置于同一个转基因片段(即该重组载体的片段，T-DNA)中。因此该重组载体在保留原始载体正常进行植物基因组编辑的前提下，新增有如下功能：可以利用T0转基因植株中紫色的深浅作为判定编辑事件发生效率的指标，即嵌合型紫色或者淡紫色的植株，编辑效率低不需要保留进行编辑事件检测，只需要保留纯紫色或深紫色的转基因植株，显著提高获得发生基因编辑事件植株的效率；可以在T0代转基因植株中缩短作物开花时间，迅速得到T1代有基因编辑的种子，极大节约获得T1代种子的时间；可以在T1代苗期可以通过观察紫色表型的有无进行转基因成分的筛选，若植株表现出紫色，则为携带转基因成分的植株，不需要保留，而表型为绿色，紫色丢失的植株则为不含有转基因片段的后代，简单高效，省时省力，不需要用到任何检测试剂即可获得既保留了目的基因的突变，又确保了该突变后代中不含有T-DNA，开花时间恢复到正常的植株。

一个具体的实施例如下：

1、PF Cassete表达元件的制备和重组载体构建

用于本实例基因重组载体构建的原始基因编辑载体pRGEB31在文献“Xie,K.andY.Yang(2013)."RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system."Mol Plant 6(6):1975-1983.”中公开过；

(1)PF Cassete表达元件的制备

这里用到的PF Cassete表达元件主要含有NtFT和PAP1表达元件，其核苷酸序列如SEQ ID No.1。如图1所示，NtFT由CmYLCV启动子驱动，而NtFT由拟南芥AtUbi10启动子驱动。PF Cassete表达元件两端含有15bp的原始载体序列线性化之后两端互补序列，用于步骤2中的同源重组构建。该元件由上海捷瑞生物工程有限公司基因合成并测序确定序列正确。

(2)重组载体的构建

(a)利用限制性内切酶HindIII酶切pRGEB31后电泳并回收纯化酶切后的DNA；

(b)将步骤(1)中得到的PF Cassete表达元件和步骤(a)中的DNA进行重组反应，重组反应体系：10ul

最适克隆载体使用量＝【0.01×克隆载体长度】ng

最适插入片段使用量＝【0.02×插入片段长度】ng

(c)重组反应程序：

室温下配置反应体系，37℃反应30min后，迅速转移到冰水中放置5min，-20℃备用或直接转化。形成最终的重组载体pRGEB31-PF。

2、烟草Eif4E-1基因敲除载体的构建

根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，本发明靶位点设计在Eif4E-1基因Nitab4.5_0000982g0080.1第一个外显子上。寻找靶位点时，首先从第一个外显子序列上找到PAM(NGG或CCN，在基因序列上的形式为5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’或5’-CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NN-3’)位点，gRNA的oligo合成与退火：以gRNA靶位点为模板，按照如下格式设计引物oligo，为确保基因敲除事件效率，本发明针对Eif4E-1基因第一个外显子选择了两个靶位点，设计引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：

EIF4E-1_gRNAF1 ggcagaagtagaagtagtcgacga

EIF4E-1_gRNAR1 aaactcgtcgactacttctacttc

EIF4E-1_gRNAF2 ggcagtcgacgatggacctgaaga

EIF4E-1_gRNAR2 aaactcttcaggtccatcgtcgac

引物退火：合成的一对互补DNA oligo退火形成dsDNA，退火体系如下：

退火程序为:95℃ 5mim，90℃ 1mim，80℃ 1mim，70℃ 1mim，60℃ 1mim，50℃1mim，40℃ 1mim，30℃ 1mim，20℃ 1mim，10℃ 1mim。

酶切pRGEB31质粒体系

酶切后回收大片段的酶切产物。

pRGEB31质粒回收的片段与退火后形成的dsDNA的连接体系：

连接产物转化大肠杆菌并进行菌落PCR鉴定阳性克隆，菌落PCR的检测正向引物为：OsU3 5'F5’-aaggaatctttaaacatacgaacag-3’反向引物为退火合成sgRNA的反向序列EIF4E-1_gRNAR1或EIF4E-1_gRNAR2)

将扩增得到的阳性克隆摇菌并进行测序，测序引物为OsU35'F，分析gRNA是否正确，得到构建好的重组编辑载体pRGEB31-PF-EIF4E-1_gRNA1和pRGEB31-PF-EIF4E-1_gRNA2。

3、基因敲除载体的植物转化和EIF4E-1基因敲除植株检测：

将连接正确的质粒，电击转化农杆菌EHA105，以野生型烟草云烟87为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的烟草转化实验。经过潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得T0代转基因阳性株系。

转基因烟草中EIF4E-1基因突变体的检测：设计目的基因检测引物。根据目的基因在靶位点序列上游和下游分别设计引物，引物序列分别为：

EIF4E-1Test_primerF ttagccactaatattccaccgtcctg

EIF4E-1Test_primerR actcgcttcgtcccaatttacattag

将获得的T0代转基因阳性植株提取基因组DNA进行PCR反应。利用PCR产物进行测序，测序公司为赛默飞世尔科技公司(广州)，测序引物序为EIF4E-1Test_primerF。

利用测序产物是否在靶标位点，即PAM上游5-8bp处出现双峰判定是否有编辑事件发生，同时统计T0代转基因阳性植物的叶色表型，结果见表1

表1.pRGEB31-PF-EIF4E-1_gRNA1和pRGEB31-PF-EIF4E-1_gRNA2转基因叶色表型及编辑效率统计

从表1可以得知，T0代转基因阳性植物的叶色可以作为评判能否高效率发生基因编辑的一个重要指标。紫色或深紫色转基因阳性T0代植株发生基因编辑事件的效率显著高于绿色或淡紫色T0代转基因阳性植株，在实际操作中可以将绿色或淡紫色T0代转基因阳性植株丢弃，不进行基因编辑事件的筛选。

4、含有PF Cassete表达元件的T0代基因编辑的植物留种时间

将上述步骤3中筛选的基因发生编辑的紫色或深紫色T0代转基因阳性植株移栽到带有基质的育苗盘中，在25度光照培养室内常规方法育苗盆栽T1植株，自交收种获得T1代种子。如图2所示，含有PF Cassete表达元件的紫色或深紫色T0代转基因阳性植株可以在植株很小的时候就开花，结实。经过统计，从组培瓶中移栽到育苗盘中小苗到结实收种的时间及从开始组培转化实验到收获T1代种子的时间见下表

表2.含有PF Cassete表达元件的T0代基因编辑的植物与常规基因编辑载体T0代基因编辑的植物留种时间对比

转化载体	愈伤到生根苗	移栽到育苗盘至收获T1代种子	合计
				pRGEB31-PF-EIF4E-1_gRNA1	92±12	29±7	121±15
pRGEB31-PF-EIF4E-1_gRNA2	93±10	28±7	121±16
				常规基因编辑载体	93±12	92±9	185±18

从表2可以得知，含有PF Cassete表达元件的T0代基因编辑的植物留种时间显著短于常规基因编辑载体的植物留种时间。利用含有PF Cassete表达元件的T0代基因编辑的植物从开始转基因工作到收获T1代种子共计需要121天左右，而利用常规的基因编辑载体则需要185天左右，可以节约64天时间，效率明显提高。

5、利用PF Cassete表达元件产生的T1代基因编辑的植物非转基因成分的筛选效率：

将获得的T1代种子随机选取5份播种于育苗盘里，每份播种80-100颗。播种25天后，在3-4片真叶期，统计绿色和紫色的植物的株数并记录。同时每株单独编号、取样提取基因组DNA，利用Cas9基因的特异性引物对：

hCAS9F CCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAG

hCAS9R GTTCACTCTCAGGATGTCGCTCAG

进行PCR，凝胶电泳并统计PCR条带。结果统计见表3。

表3.通过叶色观测和PCR检测T1代基因编辑的植物非转基因成分的筛选效率对比

结果如表3所示，在每个突变系中都表现出一定比例的绿色植株，这些绿色植株在利用Cas9基因的引物检测中均表明为阴性，证明这些植株不含转基因成分，表明利用颜色筛选无转基因成分的准确性和利用基于PCR的检测方法准确性一致，但本发明的方法更简便，无需任何试剂和仪器，节约大量人力，物力。该方法可以在幼苗期得到鉴定结果，节约大量育苗时间和空间。

但也需要注意的是，每个突变系的比例并不相同(如表3所示)，取决于T-DNA整合进植物基因组的拷贝数及位置。绿色植株占比率最大的是第18个系，30.4％；而第22号突变系表现几乎全部为紫色，绿色植株占比率为9.1％，这很有可能是插入的拷贝数过多引起的，这样的情况需要种植更多的植株来筛选，以便获得理想的植株。另外一个角度，正是因为需要大群体来筛选，因此更能体现出此方法的优势所在。

以上阐述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域技术人员应该理解，以上实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

如无特殊说明，上述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草材料为云烟87(N.tabacum CV.Yun87)，来自云南省烟草农业科学研究院。

农杆菌EHA105购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH 5α、限制性内切酶DNA Marker、T4DNA聚合酶及T4DNA连接酶、卡拉霉素、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。ClonExpres重组试剂盒购自南京诺唯赞生物技术公司。

核苷酸序列表

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2977

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

agcttaagga atctttgatt ccttaagcta cgtaggtacc gatctagtaa catagatgac 60

accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa 120

atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca taaataacgt catgcattac 180

atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt atatgataat catcgcaaga 240

ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atctcgcgat 300

caatcggcag accttctacg tccaccactg ccactctctc tttgacaatt aaaatagaca 360

gcagcaactg gtaaaccaag attatagagt tcagcaaaat cttttgtatt gaaattctga 420

cgccatcctg gagcatacac tgtctgccga cccaattgtc taaacaatac gaatacaaag 480

cgatgtattc ccattgttgg ccttggactt tcatagcaca caatttcctg gccaaaactt 540

gcacctgtgg tagctggaat atcagtgacc aaccaatgga ggtattctct tagatttgga 600

tcacttggac ttggagcatc agggtccacc ataaccagag tgtaaaaggt acgaaggtca 660

tctccaccaa cttcaaccct gggctggtta ataacttggg aaggcctaag ctcacaccca 720

ttattaactt ctctatccct ataaataact cctagtccaa tagatcttgt gaaagggtcc 780

aatacatccc ctatcactcg accaactacc agaggttcac gttctcttgg catgtcgaca 840

gctgttaatc agaaaaactc agattaatct acaaattcga tcgcacaaac tagaaactaa 900

caccagatct agatagaaat cacaaatcga agagtaatta ttcgacaaaa ctcaaattat 960

ttgaacaaat cggatgatat ctatgaaacc ctaatcgaga attaagatga tatctaacga 1020

tcaaacccag aaaatcgtct tcgatctaag attaacagaa tctaaaccaa agaacatata 1080

cgaaattggg atcgaacgaa aacaaaatcg aagattttga gagaataagg aacacagaaa 1140

tttaccttga tcacggtaga gagaattgag agaaagtttt taagattttg agaaattgaa 1200

atctgaattg tgaagaagaa gagctctttg ggtattgttt tatagaagaa gaagaagaaa 1260

agacgaggac gactaggtca cgagaaagct aaggcggtga agcaatagct aataataaaa 1320

tgacacgtgt attgagcgtt gtttacacgc aaagttgttt ttggctaatt gccttatttt 1380

taggttgagg aaaagtattt gtgctttgag ttgataaaca cgactcgtgt gtgccggctg 1440

caaccacttt gacgccgttt attactgact cgtcgggtac ccctaggggc gcgccgtcac 1500

tggattttgg ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata 1560

catactaagg gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctataaga accctaattc 1620

ccttatctgg gaactactca cacattattc tggagaaaaa tagagagaga tagatttgta 1680

gagagagact ggtgattttt gcggacttaa ttaactaatc aagttcaaca gtctctccat 1740

cgaaaagact ccaaagttga tcaacgtcaa aagccaaggt gtcccccttt tctgttgtcg 1800

tcgcttcagg aaccaaaata tctacctctt ggctttcctc taggaatttc tctaaccaca 1860

tattatctcc atcaatcaaa ttattcacta gttggtcttt cttcttatct ttgttgtata 1920

tgatactatt gtcacaaaca ttattgatgt taagtccaag gcatggagga ttaacgtcaa 1980

cttttggtgg ggcattgaga tggttgcagt cgttgttaac tgtgaaggat cgaggtcgag 2040

gcttataaac attgtttttt agtgccggtg ttgtaggaat gggcgtaatg tctctctttt 2100

tcatctttat cttacaacac ggttcatgtt tcttactcag atgagtgttc cagtaattct 2160

tgacgtcatt tgcggtccga ccaggtaatc ttccagcaat taaagaccac ctattcccta 2220

gaagcctatg aaggcgaaga agaagatcga cttcatcaga gctaagtttt cctctcttga 2280

tacttggctt caaatagttc aaccatctta atctacaact tttcctgcac cggtttagcc 2340

cagctcttac aggaacttgg tgccatttgc cttctccata cttattaatg cactgtctca 2400

agagactatc ttcttcagta gtccaagcac cttttcgcag ccctttggac gaaccctcca 2460

taagcttagc tcttacctgt tttcgtcgtc ttggcttttc ttcttcctgg ccacctgcct 2520

gaatacttcg ccgccttgac tacttctagg ctacttgctc tctttctctc tctaggacta 2580

tctctctgag attttgctcc cttaacaatg agggaggggc taagtattta tagactgacg 2640

ggtgagtgga catttcccaa actaccctta cttatttcgt aagcccttac gtcattgctc 2700

cattattgga gtctgaagat gccttcacat ggtggacccc cacctgtcgg ccacgaatct 2760

tatttgttcg tcagaaaaag ccaaaccgac tgcacagttt ttccatcgtg gtagggacca 2820

ctttggtatt gattaaaggc agccgaccta acctttgtca gacgcattat ttcacgcgtt 2880

ttcttttaca gattccatct tcatttgtgg gacagtatgt ctgccacgga tccagcttgg 2940

cgtaatcatg gtcatagctg tggcgtaatc atggtca 2977

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> EIF4E-1_gRNAF1

<400> 2

ggcagaagta gaagtagtcg acga 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> EIF4E-1_gRNAR1

<400> 3

aaactcgtcg actacttcta cttc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> EIF4E-1_gRNAF2

<400> 4

ggcagtcgac gatggacctg aaga 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> EIF4E-1_gRNAR2

<400> 5

aaactcttca ggtccatcgt cgac 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> EIF4E-1Test_primerF

<400> 6

ttagccacta atattccacc gtcctg 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> EIF4E-1Test_primerR

<400> 7

actcgcttcg tcccaattta cattag 26

Claims

1.快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体，其特征在于，该重组载体携带有NtFT和PAP1表达元件；所述重组载体是在原始载体中插入含有PAP1和NtFT表达元件，该表达元件命名为PFCassete，其核苷酸序列如SEQ ID No.1；所述原始载体为含有sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因的用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9的载体；所述NtFT表达元件产生促进植物早花的蛋白，所述PAP1表达元件产生促进植物花青素生物合成的蛋白。

2.如权利要求1所述无转基因基因编辑植株重组载体的使用方法，其特征在于，方法如下：

(1)以野生型烟草云烟87为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的烟草转化实验，将所述含有PFCassete的重组载体转入野生型烟草云烟87植株中，培养获得T0代转基因植株，转基因植株中含有PFCassete和原始载体中的sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因；

(4)继续培养T0代植株直至获得T1代种子；

3.如权利要求2所述无转基因基因编辑植株重组载体的使用方法，其特征在于，上述步骤(3)所述筛选过程包括：