CN109929872A - 一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法。本发明首先设计了用于对L2基因进行CRIPSR/Cas9基因编辑的sgRNA靶点序列，然后构建了含有两个上述靶点序列的基因编辑载体。通过实验证明：将该基因编辑载体转化番茄粉果材料可对其L2基因进行精确编辑，获得番茄白果材料，并从其自交子代中可筛选得到L2基因纯合突变的非转基因番茄白果材料。本发明的方法适用于不同品种的番茄粉果或红果材料，且编辑效率高。与传统的l2位点回交转育相比，该方法可以极大地缩短转育时间，1年内实现亲本果色性状的快速精准转化，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。

Description

一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法。

背景技术

番茄是蔬菜和水果兼用类作物，在世界范围内广泛种植并深受喜爱。番茄的果色非常丰富，有红色、粉色、黄色、橙色、咖啡色、绿色和白色等。但目前市场销售的番茄以红色和粉红色两种为主。白果番茄在市场上非常稀少，且价格昂贵。Lutescent2(L2)是控制白果性状的重要基因，其编码一个叶绿体定位的锌金属蛋白酶。l2突变体果实叶绿体积累显著下降，果实呈白色。白果番茄的培育主要靠l2基因位点的高代回交。该法周期长，一般需要5-10年，且受连锁累赘等因素的影响。

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术是近年来分子育种领域的热点技术，为白果番茄材料的快速创制提供了新思路。与l2位点的回交转育相比，基因编辑技术可打破生殖隔离、连锁累赘等因素的限制，1年内实现亲本目标性状的快速精准改良，且不涉及转基因安全问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种创制番茄白果材料的方法。

本发明提供的创制番茄白果材料的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对番茄粉果或红果材料基因组中的果皮颜色调控基因Lutescent2进行编辑，进而使所述果皮颜色调控基因Lutescent2功能丧失，得到番茄白果材料；

所述CRISPR/Cas9系统中包括sgRNA；

所述sgRNA识别的靶序列为所述番茄粉果或红果材料基因组中编码Lutescent2蛋白的DNA片段。

本发明的果皮颜色调控基因Lutescent2的核苷酸序列为序列1，其编码一个叶绿体定位的锌金属蛋白酶。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄粉果或红果材料基因组中编码Lutescent2蛋白的DNA片段。

在发明的具体实施例中，所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列相同；所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为序列2所示的DNA分子。

上述方法中，所述编辑的方法为向所述番茄粉果或红果材料中导入番茄基因组编辑的载体；所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因；

所述sgRNA1的编码基因为序列3第719-814位所示的DNA分子；

所述sgRNA2的编码基因为序列3第1268-1363位所示的DNA分子；

所述Cas9蛋白的编码基因为序列3第2591-6691所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，所述番茄基因组编辑的载体为重组载体L2-PTX041。所述重组载体L2-PTX041的核苷酸序列如序列3所示，依次包括用于启动sgRNA1的编码基因表达的番茄U6启动子(TU6)(序列3第458-718位)、sgRNA1的编码基因(序列3第719-814位)、用于终止sgRNA1编码基因的U6终止子(序列3第815-1006位)，用于启动sgRNA2的编码基因表达的番茄U6启动子(TU6)(序列3第1007-1267位)、sgRNA2的编码基因(序列3第1268-1363位)、用于终止sgRNA2编码基因的U6终止子(序列3第1364-1555位)，用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的2x35S启动子(序列3第1977-2321位)、Cas9蛋白的编码基因(序列3第2591-6691位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的rbcSE9终止子(序列3第6747-7381位)、T-DNA区的LB识别序列(序列3第8022-8046位)、T-DNA区的RB识别序列(序列3第16612-16636)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子(序列3第16792-16975位)、抗性筛选基因NPTII(序列3第16996-17790位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的NOS终止子(序列3第18180-18432位)。其中，sgRNA1的编码基因如序列3第719-814位所示，sgRNA1的靶点序列为序列3第719-738位所示；sgRNA2的编码基因如序列3第1268-1363位所示，sgRNA2的靶点序列为序列3第1268-1287位所示。sgRNA1的靶点序列与sgRNA2的靶点序列相同。

所述编辑的具体步骤如下：将所述重组载体L2-PTX导入农杆菌LBA4404，得到重组菌；再将所述重组菌转化番茄红果材料外植体，然后在含1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生番茄植株。

所述方法还包括筛选Lutescent2纯合突变体的步骤。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的Lutescent2基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，Lutescent2纯合突变体是指两条同源染色体的Lutescent2基因发生了相同突变的植株。所述筛选的具体方法如下：采用由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成的引物对对T0代再生番茄植株进行PCR扩增和测序。

上述方法中，所述番茄粉果或红果材料的品种可以是番茄常规品种。在本发明的具体实施例中，所述番茄粉果材料具体可为番茄粉果材料TB0728和TB0748。

本发明利用上述方法，获得的Lutescent2纯合突变体为TB0748-2号L2基因纯合打靶植株。TB0748-2号L2基因纯合打靶植株为将野生型番茄粉果材料TB0748的两条同源染色体的Lutescent2基因第6919位和第6920位之间均插入碱基T，且保持野生型番茄粉果材料TB0748的基因组其他序列不变后得到的植株，该植株的成熟果实为白色。

本发明的第二个目的是提供一种非转基因番茄白果材料的获得方法。

本发明的非转基因番茄白果材料的获得方法包括如下步骤：将上述方法获得的番茄白果材料自交，得到自交子代，选择Lutescent2纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为非转基因番茄白果材料。

所述选择的方法如下：采用由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成的引物对对所述自交子代中的外源基因(cas9基因)进行PCR扩增和电泳，选择不携带外源DNA片段的子代；采用由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成的引物对对所述不携带外源DNA片段的子代的Lutescent2基因片段进行PCR扩增和测序，选择PCR扩增仅含有序列11所示的DNA片段且不携带外源DNA片段的子代，即为Lutescent2纯合突变且不携带外源DNA片段的非转基因番茄白果材料。

上述方法在培育番茄白果杂交种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供如下(1)-(4)中任一种生物材料：

(1)上述番茄基因组编辑的载体；

(2)含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；

(3)上述靶序列；

(4)序列6所示的白果调控基因Lutescent2的突变序列。

上述生物材料中，所述含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体为含有所述重组载体L2-PTX041的农杆菌LBA4404。

上述生物材料中，所述果实颜色调控基因Lutescent2的突变序列为序列6所示的DNA分子。与野生型Lutescent2基因相比，果色调控基因Lutescent2的突变序列为将野生型番茄Lutescent2基因第6919位和第6920位之间插入碱基T，且保持其他序列不变后得到的序列。

本发明的第四个目的是提供上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述生物材料在培育番茄白果材料中的应用；

本发明还提供了上述生物材料在番茄育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄白果材料或其子代的方法。

本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄白果材料或其子代的方法包括如下步骤：采用引物对1和引物对2分别对待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物判断待测番茄是否为上述番茄白果材料或其子代；

若引物对1仅扩增得到序列11所示的DNA片段，且引物对2没有PCR扩增产物，则待测番茄为或候选为上述方法获得的番茄白果材料或其子代；

若引物对1和引物对2不满足上述条件，则待测番茄不为或候选不为上述方法获得的番茄白果材料或其子代；

所述引物对1由引物1和引物2组成；

所述引物对2由引物3和引物4组成；

所述引物1为序列9所示的DNA分子；

所述引物2为序列10所示的DNA分子；

所述引物3为序列7所示的DNA分子；

所述引物4为序列8所示的DNA分子。

本发明的第六个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄白果材料或其子代的产品。

本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述番茄白果材料或其子代的产品为如下1)-3)中的任一种：

1)上述引物对1和引物对2；

2)含有1)所述的引物对1和引物对2的PCR试剂；

3)含有1)所述的引物对1和引物对2或2)所述的PCR试剂的试剂盒。

本发明首先设计了用于对Lutescent2基因进行CRIPSR/Cas9基因编辑的sgRNA靶点序列，然后构建了含有两个上述靶点序列的基因编辑载体。通过实验证明：将该基因编辑载体转化番茄粉果材料可对其Lutescent2基因进行精确编辑，获得番茄白果材料，并从其自交子代中可筛选得到Lutescent2基因纯合突变的非转基因番茄白果材料。本发明的基因编辑方法适用于不同品种的番茄粉果或红果材料，且编辑效率高，可以快速将番茄粉果或红果材料转变为白果材料。与传统的l2位点回交转育相比，该方法可以极大地缩短转育时间，1年内实现亲本果色性状的快速精准转化，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。

附图说明

图1为Lutescent2基因的结构和CRIPSR/Cas9基因编辑sgRNA靶点的位置信息。其中，E1-E10为1-10号外显子。

图2为重组载体的结构示意图。

图3为T0代植株Lutescent2基因的PCR检测电泳结果。其中，-为阴性空白对照，WT为未转化的野生型植株，其余为T0代番茄植株。

图4为T0代植株Lutescent2基因的测序结果。其中，WT为未转化的野生型植株，其余为T0代番茄植株。

图5为T0代纯合打靶植株田间表型(左：背景材料TB0748，右：白果突变体)。

图6为T0代纯合打靶植株果实表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中使用的番茄品种TB0728和TB0748均为番茄粉果材料，均来自北京市农林科学院，公众可从京研益农(北京)种业科技有限公司购买获得。

下述实施例中的PTX载体记载于文献“Deng,L.,Wang,H.,Sun,C.,Li,Q.,Jiang,H.,Du,M.,Li,C.-B.,Li,C.,Efficient generation of pink-fruited tomatoes usingCRISPR/Cas9system,Journal of Genetics and Genomics(2017),doi:10.1016/j.jgg.2017.10.002.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中使用的2x Taq DNA redmix聚合酶为Genstar公司的产品，DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1为TaKaRa公司的产品；限制性内切酶为NEB公司的产品；PCR产物纯化试剂盒为Omega公司的产品；快捷型植物基因组DNA提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品；引物为Thermo Fisher Scientific公司合成；测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。

实施例1、CRIPSR/Cas9基因编辑载体L2-PTX041的构建

一、Lutescent2基因sgRNA靶点序列的获得

根据SGN数据库(http://solgenomics.net/)登录的Lutescent2(简称L2)基因序列(登录号为Solyc10g081470.1.1，核苷酸序列为序列表中的序列1)，对L2基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，L2基因有10个外显子(分别标注为E1-E10)和9个内含子构成。由于自然突变发生在第10外显子，于是将外显子10的序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)进行CRIPSR/Cas9靶点设计，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz 1706genome SL2.50。最终选定的sgRNA靶点如图1所示，L2基因sgRNA靶点序列如下：5’-GAGGAAAGCAGCTCTTGGTG-3’(序列2)。

二、CRIPSR/Cas9基因编辑载体L2-PTX041的构建

1、sgRNA扩增引物的设计

根据选定的靶点序列，设计构建sgRNA扩增引物，引物序列具体如下：L2-g1：5’-ATATATGTTTGAGGAAAGCAGCTCTTGGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(序列4)，框内为Bsa I酶切位点；L2-g2：5’-ATTATTGAAACCACCAAGAGCTGCTTTCCTCAAACTACACTGTTAGATTC-3’(序列5)，框内为BsaI酶切位点。

2、CRIPSR/Cas9基因编辑载体L2-PTX041的构建

(1)重组质粒L2-PTX041的构建

以质粒043为模板，以序列4和序列5所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，获得两侧均带有Bsa I酶切位点的靶点sgRNA核苷酸片段。

PCR反应体系为：2×Taq PCR StarMix 25ul、前后引物各1.0μL、质粒模板30ng、加双蒸水至50μL。PCR反应条件为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共32个循环。

PCR扩增产物纯化后用Bsa I酶切，再与经同样酶切的PTX载体在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒L2-PTX041，并对其进行测序。

测序结果表明：重组质粒L2-PTX041的核苷酸序列如序列3所示。重组质粒L2-PTX041的结构图如图2所示。从图中可以看出：依次包括用于启动sgRNA1的编码基因表达的番茄U6启动子(TU6)(序列3第458-718位)、sgRNA1的编码基因(序列3第719-814位)、用于终止sgRNA1编码基因的U6终止子(序列3第815-1006位)，用于启动sgRNA2的编码基因表达的番茄U6启动子(TU6)(序列3第1007-1267位)、sgRNA2的编码基因(序列3第1268-1363位)、用于终止sgRNA2编码基因的U6终止子(序列3第1364-1555位)，用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的2x35S启动子(序列3第1977-2321位)、Cas9蛋白的编码基因(序列3第2591-6691位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的rbcSE9终止子(序列3第6747-7381位)、T-DNA区的LB识别序列(序列3第8022-8046位)、T-DNA区的RB识别序列(序列3第16612-16636)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子(序列3第16792-16975位)、抗性筛选基因NPTII(序列3第16996-17790位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的NOS终止子(序列3第18180-18432位)。其中，sgRNA1的编码基因如序列3第719-814位所示，sgRNA1的靶点序列为序列3第719-738位所示；sgRNA2的编码基因如序列3第1268-1363位所示，sgRNA2的靶点序列为序列3第1268-1287位所示。sgRNA1的靶点序列与sgRNA2的靶点序列相同

实施例2、一种通过基因编辑将番茄粉果材料转变为白果材料的方法

一、将基因编辑载体L2-PTX041转化农杆菌

取1μg实施例1制备的基因编辑载体L2-PTX041置于100μL LBA4404感受态细胞(北京华越洋生物，NRR01270)中，液氮中速冻3分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mL YEB培养基(YEB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蔗糖1g/L)，28℃培养2-4小时；10000×g离心30秒，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃黑暗培养2-3天；挑单菌落，接种于含有50μg/mL卡那霉素，500μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，得到转化子。将转化子进行菌液PCR鉴定，以序列7和序列8所示的核苷酸序列为引物，得到大小为1172bp的扩增片段的即为阳性重组菌，并将该重组菌命名为L2-PTX041/LBA4404，-80℃冻存备用。引物序列如下：

PTX-F：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(序列7)；

PTX-R：5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCT-3’(序列8)。

二、T0代L2基因编辑植株的获得及鉴定

1、T0代再生植株的获得

将重组菌L2-PTX041/LBA4404分别转化番茄材料TB0728和TB0748外植体，然后在含有1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基(北京华越洋生物，M519)中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生植株。

2、T0代L2基因编辑植株的获得

采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒提取上述T0代再生植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以序列9和序列10所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，对L2基因进行克隆和测序。PCR反应体系为：Premix Taq DNA聚合酶Mix 10μL、前后引物各0.8μL、基因组DNA1.5μL、加双蒸水至20μL；PCR反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环。引物序列如下：

crL2-F：5’-CCTTCCTCCTTTTGCTTGATGT-3’(序列9)；

crL2-R：5’-ACTGGAGAAACTAGGAAGACAATGG-3’(序列10)。

PCR产物电泳结果如图3所示。PCR产物测序结果如图4所示。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，纯合突变体是指两条同源染色体的L2基因发生了相同的突变的植株。从图中可以看出：TB0748-2号T0代L2基因编辑植株为L2基因纯合打靶植株，其为将野生型番茄粉果材料TB0748的两条同源染色体的L2基因第6919位和第6920位之间均插入碱基T，且保持野生型番茄粉果材料TB0748的基因组其他序列不变后得到的植株，将TB0748-2号T0代L2基因编辑植株记作TB0748-2号L2基因纯合打靶植株，序列6所示的核苷酸序列记作L2基因突变序列。其它T0代再生植株均为L2基因被编辑的植株，打靶效率(L2基因被编辑的植株数/全部转化的植株数)为100％。

TB0748-2号L2基因纯合打靶植株的成熟果实为白色(图5、图6)。

实施例3、非转基因番茄白果材料的获得及鉴定

一、外源DNA片段的检测

将TB0748-2号L2基因纯合打靶植株自交，获得F1代种子；将F1代种子进行播种；待长出真叶后，得到TB0748-2号L2基因纯合打靶植株的子代(F1代)。以TB0748-2号L2基因纯合打靶植株的子代的基因组DNA为模板，以序列7和序列8所示的核苷酸序列为引物，对外源DNA片段(cas9)进行PCR扩增和电泳。选择没有PCR扩增产物的子代，即为不携带外源DNA片段的TB0748-2号L2基因纯合打靶植株的子代。

经检测：12株TB0748-2号L2基因纯合打靶植株的子代中共有3株不携带外源DNA片段。

二、L2基因突变序列的检测

以不携带外源DNA片段的TB0748-2号L2基因纯合打靶植株的子代的基因组DNA为模板，以序列9和序列10所示的核苷酸序列为引物对L2基因片段进行PCR扩增和测序分析。

PCR扩增仅含有序列11所示的大小为547bp的DNA片段的子代即为L2纯合突变且不携带外源DNA片段的非转基因番茄白果材料。

经检测：3株不携带外源DNA片段的TB0748-2号L2基因打靶植株的子代均为L2纯合突变且不携带外源DNA片段的非转基因番茄白果材料。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京市农林科学院

<120>一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法

<160>11

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>7011

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgaacttac ggtttcgtat gaatcctccg attagttgta agttcagtcg gagaatccaa 60

atgaagagaa tgtcgaaacg gagtttgggt agattgatta ttagttgtag tagtggtagt 120

ggtggtggtg gtggtggtgg aagtagtagt aatgataatg gaagtagtaa tgataggaag 180

ctggaaaaag attcttctaa tttagctact gtaactgaag agacggcggg agaaaggaac 240

agcggtggtg aggcgagtga ttcggaggat tcttcggtgt caatttcatc cagggtgagt 300

tagtattttg tttttgcttt gagaaattga agaagacttt tgaatttcgt gatgttaaat 360

taaatataca tgaaatgtag gtggtggcag aaagttgaaa ttaaagagtt gtaaaaaagg 420

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aagtttgttt agagatgttt atgttagtgt tgggacaagt gcaaatcttt taaaagttaa 780

taactaaatg agcattagta gcaagttcaa ggaagtgaag caaagatgag caactctcta 840

atttgcttaa ctgagtattt aaatgaagtg cattgaaata gagcagaaat ggatataaag 900

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tgaatttttg aagtttcttg ttacttattt aaagttcggt gcagaagaaa ggaggaaatt 1020

ttggggggaa attatagaaa gaatgtttat ttaactgata attgatatag ttattagtat 1080

attgatgttg ttcttcatac tgctggttgt tggaccatgt catagacttc taaaatagga 1140

aaactgattc tgccagctac gtattcaatg cctctaatcc tggctagtgg ctactgactt 1200

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gcaagtattt tgcttgaaat ttcccttttc tgtttccctt tgttccttat ccttgagaga 1320

attaaggggt taggttgttc tgttgcagtg tgttcttgga agcaacctcc tggtacaatt 1380

gcagtgtgtt tttggaaaca acctcctagt actgtgaata tctaacccgt tttagactat 1440

gcaatattgg aatgcatagg caatcttgat tagttgaaat ctgatcttga atagaatgct 1500

tagaagcaaa tgcctactgg gaatcttaca actagttact ttggagattg caataccaaa 1560

ggttctttac ccttatataa tgtttagttt caactgttaa attattttga ctagtataag 1620

aaaaagggtt ctggcctgag acatgtgtga attttaagaa acttatctgg tcattaagat 1680

agcaaaaaaa gtgtcaaata gctatccttt attacattgt agtcagaaaa tggtcaagta 1740

atctatgtcg agtcaaaaca agcttgccag aggtgtttct atgatgatta aaaaaaagag 1800

tagctgcagg attttaagaa tcattaaact aatgaagaag aaattccggt gtactgaata 1860

tgtttacttt cttggcagcc aacaatatcc actgttggat caacttataa caattttcaa 1920

gtagattctt ttaagttgat ggaacttctt ggacccgaaa aggttgatcc cagtgaggtg 1980

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<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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tttgtgaagt acatagtttt tgcatttcct catgccaatc agaagattcc ttaattgatt 3780

taaaaacata ttcataagtt ctgcctttcc tcctgccaat tagaagattc gttaattgat 3840

ttaaactcat attcagctga cctagtgcat tgttttgaaa gatgcaagac ctgaaaatga 3900

aagtaaattt gttgaaacta taagtaaggt cacagaacca ggtagaattt gtccgtggtt 3960

aagatataaa tgaaaggtca aggattcttc taagtaacag aaggaagcta taacttatta 4020

gacaccttca gttattgtcg gaagttactg taaaatattg tgctcgaaca tgtagaagag 4080

acaattgtat gcacatattt tatacctcaa cttttattac cctactcctc catgttcgat 4140

tctacatcaa tagttgattt attgcaggaa attgggcatt ttctggctgc atttcctagg 4200

aatgtgaaac taagcattcc ttacttcatt ccaaacatca ctcttggaag ctttggagca 4260

ataactcagg ttagcatatt ttgttatcac ttgtcaatgc tggaaacaga aaagttggca 4320

gctgaggatt ttgaattctc ttagagattt gtgcatgtag atccaatatt ctggatagtt 4380

ctcaaaagtg ttgttttctt caggagagtc atgaatgatt acattctcat tacatgttgg 4440

ttatatacat taaaagtggt gcttctgcat gacttgtttt cattgttaaa gcttaaaccc 4500

tgtcttacgc aatacactct ccctggtcat caaagatgca ctagttctta ataactattc 4560

ttcaaagcag taatcatttt ttttggtgta gcagggaggg ggtaaatttc atttctccag 4620

aggagggcgt gatggcaaaa tacatttagt actggggatt gttgtggagt gttttttttt 4680

aaatgaagta agagagaggt tgtcaatgta acacttcaag caatgtcaat gtgtaataca 4740

ctgacatgct ttccctactt aagtatcaca tattttgtta aagtcatatg gagtctagca 4800

tggagaggga ttgtactaga ttaacttcat caaccttgct attccaccaa attcatcatc 4860

agtctatcaa gtataaaaca tacgcattaa tcatcttctc ttggttcctg cagttcaaat 4920

ccattcttcc tgatcgcaaa gcaaaggtag acatttctct tgcgggtcct tttgctggtg 4980

ctgcattgtc ttcttccatg tttgcagttg ggctgttact gtcatccaat ccttctgctg 5040

ctgcagagtt ggttcaggtt cctagcacac tttttcaggg ctctttgctt cttgggctta 5100

ttagcagagc cactcttggt tatgggtaag tgtagccctc cattgggagc aaaaatatga 5160

agtacttgga aaataatttt cagaatgtgt atttgaatta tttttctact ataatatgaa 5220

aattcccttt gtcaaaaccg ctatatctgt atgctaatca ctttaaagta cataaatata 5280

gttgtttttc aaaagaatac cttaacagtt gcgtgcttga aggccagtga actttttgct 5340

tttttcaagt tggcaatata tattttgttt cacttatttg aatctttagc atatgaaatt 5400

ttgagctaat atgcattcat ttccacagag caatgcatgc agcagtggtt tcaatccacc 5460

cccttgtgat tgctggctgg taaatttgag tagttgcaag tacatttgtt gggtaatttt 5520

cagcatgctt ggtctaagtt ccattttgca ggtgtggctt gactacgtca gcttttaata 5580

tgctaccagt tggatgtctt gatggtggga gagctgtgca ggtgaccttt gcattcttta 5640

ctttatgaat tagtttttaa ctttttgtga acttggggac tatcaaggtt tatctcaaag 5700

tatagtcaac aacatcctac gaaatataaa tgaatgacaa gccagtagcc ttgaagtaga 5760

ctgtcgttta catagtatta gatgattgaa cagtgtaaag cttgagaagt taatactggt 5820

agatgtatgg gtcctaagtg attctagtat ttcaaacagg tgcaggcgtg cagctcctag 5880

cgctatagga actgttgaga cattttagca tgcatagaga aattggtttc gctaaacatt 5940

ttgctgacct ttttataaag aatcatgacc tcttggaaaa tgaagagctt tccttggcta 6000

agagataatt ggttgtccca gataaagtat gacagctctc tacttcatgt tttgtttttg 6060

acagggagct ttcggaaaag gttcactggt tggttttggg ttagcaactt actcgcttct 6120

gggcttgggt gtggtaagca ttcttttgtc atttgttttt tggatagagc ttactataaa 6180

cctttacatt gctctaaagt tttccaacta atatgttttc ttagtttgat atgcatatgt 6240

agatcaaatg cctgtgattc tcacatatcc aatcattgtc cagtgttgta gacttgtagt 6300

aatagtatta gtattctctc tgtttcaatt tgttttactt tcttttttag tccattaaaa 6360

aaacgtcttt ctcctttttc gacaactcca aatttccaca tgacatgttt attagaccac 6420

aagattaaag agcgtttttg atacatttca catatcttta gttaaagaac ataagattca 6480

aaagtctttt agctttatta aactccgtgt caagtcaaaa tcaggcaaac aaattgaagc 6540

gggagaagta ttaggttgtc aatcctagaa acgttgtttc cttattccat gcgcgtatga 6600

aggacaaatt gcttattgcc atttacatat caatccttcc tccttttgct tgatgttgca 6660

aattgtagaa tcaatcactc agtaactttg tgtttctgtt cgatcagctt ggtggacctc 6720

tatcacttcc ttggggatta tatgtgctta tatgtcaggt aataaaaata caatgctata 6780

tctccgtcct attacatggt atgagagtta tcgtcatcta gaagtttaaa tcgtggatca 6840

tttgacgtac agaggtcacc agagaaacca tgcttgaacg atgtaacaga ggtcggaact 6900

tggaggaaag cagctcttgt gtgtggctat attcctggta ttactgactc tccttcctgt 6960

atgggatgaa cttgctgagg aacttggtat aggtcttgta accacctttt ga 7012

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

agcggataac aatttcacac agga 24

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

gacctgcagg catgcaagct 20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

tgttcgatca gcttggtgga c 21

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

actggagaaa ctaggaagac aatgg 25

<210>11

<211>547

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

tgttcgatca gcttggtgga cctctatcac ttccttgggg attatatgtg cttatatgtc 60

aggtaataaa aatacaatgc tatatctccg tcctattaca tggtatgaga gttatcgtca 120

tctagaagtt taaatcgtgg atcatttgac gtacagaggt caccagagaa accatgcttg 180

aacgatgtaa cagaggtcgg aacttggagg aaagcagctc ttgtgtgtgg ctatattcct 240

ggtattactg actctccttc ctgtatggga tgaacttgct gaggaacttg gtataggtct 300

tgtaaccacc ttttgatttt tagagagtgg aaccttagcc aatttttcat gttgccgccg 360

cgatctctac gtagtattta tattgatctt tgatggactt agtatatact atttatacat 420

gtatatagat cactatagtg agtttttttt tcattcattt ttttggctgg aaacaaaatt 480

tttaatctgc aatttttttc ttatttttaa tgaaatataa ttccattgtc ttcctagttt 540

ctccagt 547

Claims (10)

1.一种番茄白果材料的制备方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对番茄粉果或红果材料基因组中的果皮颜色调控基因Lutescent2进行编辑，进而使所述果皮颜色调控基因Lutescent2功能丧失，得到番茄白果材料；

所述CRISPR/Cas9系统中包括sgRNA；

所述sgRNA识别的靶序列为所述番茄粉果或红果材料基因组中编码Lutescent2蛋白的DNA片段。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为所述番茄粉果或红果材料基因组中编码Lutescent2蛋白的DNA片段。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列相同；

所述sgRNA1和所述sgRNA2识别的靶序列均为序列2所示的DNA分子。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：

所述编辑的方法为向所述番茄粉果或红果材料中导入番茄基因组编辑的载体；

或，所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA1的编码基因、所述sgRNA2的编码基因和Cas9蛋白的编码基因；

或，所述sgRNA1的编码基因为序列3第719-814位所示的DNA分子；

或，所述sgRNA2的编码基因为序列3第1268-1363位所示的DNA分子；

或，所述Cas9蛋白的编码基因为序列3第2591-6691所示的DNA分子；

或，所述方法还包括筛选Lutescent2纯合突变体的步骤。

5.一种非转基因番茄白果材料的获得方法，包括如下步骤：将权利要求1-4任一所述方法获得的番茄白果材料自交，得到自交子代，选择Lutescent2纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为非转基因番茄白果材料。

6.权利要求5所述的方法在培育番茄白果杂交种中的应用。

7.如下(1)-(4)中任一种生物材料：

(1)权利要求4中所述的番茄基因组编辑的载体；

(2)含有权利要求4中所述的番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；

(3)权利要求1-3中任一所述的靶序列；

(4)序列6所示的果色调控基因Lutescent2的突变序列。

8.权利要求7所述的生物材料在培育番茄白果材料中的应用；

或，权利要求7所述的生物材料在番茄育种中的应用。

9.一种鉴定或鉴定待测番茄是否为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄白果材料或其子代的方法，包括如下步骤：采用引物对1和引物对2分别对待测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物判断待测番茄是否为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄白果材料或其子代；

若引物对1仅扩增得到序列11所示的DNA片段，且引物对2没有PCR扩增产物，则待测番茄为或候选为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄白果材料或其子代；若引物对1和引物对2不满足上述条件，则待测番茄不为或候选不为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄白果材料或其子代；

所述引物对1由引物1和引物2组成；

所述引物对2由引物3和引物4组成；

所述引物1为序列9所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列10所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列7所示的单链DNA分子；

所述引物4为序列8所示的单链DNA分子。

10.一种鉴定或鉴定待测番茄是否为权利要求1-4中任一所述方法获得的番茄白果材料或其子代的产品，为如下1)-3)中的任一种：

1)权利要求9中所述的引物对1和引物对2；

2)含有1)所述的引物对1和引物对2的PCR试剂；

3)含有1)所述的引物对1和引物对2或2)所述的PCR试剂的试剂盒。