CN112779282A - 一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料的方法。本发明对番茄材料中的PSY1、MYB12、SGR1基因进行精确编辑，获得番茄果色编辑材料，并从其自交子代中可筛选得到PSY1、MYB12、SGR1基因中不同基因突变组合纯合突变体的无外源基因片段的番茄多种果色材料。本发明的基因编辑方法适用于不同品种的番茄材料，且编辑效率高，可以将番茄背景材料转变为多种果色材料。与传统的PSY1、MYB12、SGR1三个位点回交转育相比，可以极大地缩短转育时间，1‑2年实现亲本果色性状的精准转化，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。

Description

一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料 的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料的方法。

背景技术

番茄是世界范围内广泛种植的果实和蔬菜兼用类作物。果色作为番茄重要的商品品质之一，对番茄产业影响较大。番茄果实颜色种类丰富多样，有红色、粉色、黄色、绿色、橙色、咖啡色和紫色等，然而目前市场上销售的番茄多为红果材料，因为红果番茄育种工作开展早，育种资源更加丰富，育种水平更高，其丰产性、抗病性、抗逆性和商品性等相关特征优于其他果色的番茄材料。

番茄果实的颜色由果皮和果肉颜色共同决定，目前番茄中已克隆多个与果皮和果肉颜色相关的基因。其中，粉果番茄的表型由YELLOW(Y)基因突变导致，该基因编码的MYB12蛋白为类黄酮合成途径的核心转录因子，y突变体果皮不能正常积累黄色的类黄酮类物质柚皮素查尔酮(NarCh)而呈现透明，使红色果肉的番茄外观呈现粉红色。番茄的黄果表型由八氢番茄红素合成酶基因PSY1突变导致，其突变体名为yellow fresh(r)，果肉不能积累番茄红素。编码镁离子去鳌合酶的STAY GREEN(SGR)基因突变会导致果实在成熟过程中叶绿素降解不完全，与番茄红素同时存在，使得果实颜色呈现锈红色到棕色，突变体名为greenflesh(gf)。此外，尚有其他影响果色的基因，如CRTISO基因突变果实呈现橙色，lutescent1(L1)、L2突变果实成熟期呈现白色等。然而CRTISO与PSY1基因在同一合成途径，存在上下位性关系，L1、L2基因突变后会延迟成熟。

传统育种中，想要得到某一种稀有果色的番茄材料需要将果色调控位点进行高代回交，以保持果色以外的农艺性状与轮回亲本相当，通常整个过程需要4-5年，耗费大量人力、物力，且无法避免连锁累赘等问题。因此，如何缩短育种年限、减少工作量，一次性获得多种稀有果色的番茄材料一直是育种家关注的问题。CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术为作物的遗传改良提供了强有力的工具，由于其靶点的高度特异性，它可以保留原始材料的优良性状，与传统的杂交、回交育种相比，改良性状需要的时间和精力更少，并且可以避免连锁累赘。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种番茄多果色材料的制备方法。

本发明提供的一种番茄多果色材料的制备方法，为如下方法1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：降低受体番茄材料基因组中的果实颜色调控蛋白PSY1、MYB12和SGR1中至少一种的活性或含量，得到目的番茄多果色材料；

2)所示的方法包括如下步骤：对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1中至少一种进行基因编辑(使这些基因发生突变无法翻译出正常功能蛋白)，得到目的番茄多果色材料。

上述方法中，所述降低受体番茄材料基因组中的果实颜色调控蛋白PSY1、MYB12和SGR1中至少一种的活性或含量，或，所述对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1中至少一种进行基因编辑，均通过CRISPR/Cas9系统对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1中至少一种进行基因编辑。

在本发明的实施例中，是对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1这3个基因进行基因编辑。

上述方法中，所述蛋白PSY1为序列1所示的PSY1基因编码的蛋白；

所述蛋白MYB12为序列2所示的MYB12基因编码的蛋白；

所述蛋白SGR1为序列3所示的SGR1基因编码的蛋白；

或，所述基因PSY1的核苷酸序列为序列1；

或，所述基因MYB12的核苷酸序列为序列2；

或，所述基因SGR1的核苷酸序列为序列3。

上述中，本发明的果实颜色调控基因PSY1的核苷酸序列为序列1，其编码一个八氢番茄红素合成酶。本发明的果皮颜色调控基因MYB12的核苷酸序列为序列2，其编码一个MYB类的转录因子。本发明的果实颜色调控基因SGR1的核苷酸序列为序列3，其编码一个叶绿素镁离子去鳌合酶。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统中，PSY1基因编辑的sgRNAP1、PSY1基因编辑的sgRNAP2、MYB12基因编辑的sgRNAM1、MYB12基因编辑的sgRNAM2、SGR1基因编辑的sgRNAS1和SGR1基因编辑的sgRNAS2；

所述sgRNAP1的靶序列为序列6所示的DNA分子；

所述sgRNAP2的靶序列为序列7所示的DNA分子；

所述sgRNAM1的靶序列为序列8所示的DNA分子；

所述sgRNAM2的靶序列为序列9所示的DNA分子；

所述sgRNAS1的靶序列为序列4所示的DNA分子；

所述sgRNAS2的靶序列为序列5所示的DNA分子。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括含有sgRNAP1编码基因、sgRNAP2编码基因、sgRNAM1编码基因、sgRNAM2编码基因、sgRNAS1编码基因、sgRNAS2编码基因和cas9基因的重组载体；

所述sgRNAS1编码基因为序列10第5237-5312位所示的DNA分子；

所述sgRNAS2编码基因为序列10第5410-5485位所示的DNA分子；

所述sgRNAP1编码基因为序列10第5583-5658位所示的DNA分子；

所述sgRNAP2编码基因为序列10第5754-5829位所示的DNA分子；

所述sgRNAM1编码基因为序列10第5926-6001位所示的DNA分子；

所述sgRNAM2编码基因为序列10第6099-6174位所示的DNA分子；

或，所述Cas9蛋白的编码基因为序列10第7282-11553所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，所述重组载体为PMS6T-pTX041，其核苷酸序列如序列10所示。依次包括用于启动sgRNA1的编码基因表达的番茄U6启动子(TU6)(序列10第4956-5217位)、sgRNAS1的编码基因(序列10第5237-5312位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5313-5389位)，sgRNAS2的编码基因(序列10第5410-5485位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5486-5562位)，sgRNAP1的编码基因(序列10第5583-5658位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5659-5735位)，sgRNAP2的编码基因(序列10第5754-5829位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5830-5906位)，sgRNAM1的编码基因(序列10第5926-6001位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第6002-6078位)，sgRNAM2的编码基因(序列10第6099-6174位)、用于终止sgRNA6编码基因的U6终止子(序列10第6175-6366位)，用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的2x35S启动子(序列10第6387-7132位)、Cas9蛋白的编码基因(序列10第7282-11553位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的rbcSE9终止子(序列10第11558-12192位)、T-DNA区的LB识别序列(序列10第12833-12857位)、T-DNA区的RB识别序列(序列10第2454-2478)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子(序列10第2602-2781位)、抗性筛选基因NPTII(序列10第2838-3632位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的NOS终止子(序列10第4022-4274位)。其中，sgRNAS1的靶点序列为序列10第5218-5236位所示；sgRNAS2的靶点序列为序列10第5390-5409位所示；sgRNAP1的靶点序列为序列10第5563-5582位所示；sgRNAP2的靶点序列为序列10第5736-5753位所示；sgRNAM1的靶点序列为序列10第5907-5925位所示；sgRNAM2的靶点序列为序列10第6079-6098位所示。

上述方法中，所述编辑为向所述受体番茄材料中导入所述重组载体。

上述方法中，每种所述方法中，在向所述受体番茄材料中导入所述重组载体后还包括如下步骤：选取PSY1、MYB12、SGR1三个基因至少一个突变的植株，为目的番茄多果色材料；

所述突变为杂合突变或纯合突变；

或，所述受体番茄材料为PSY1、MYB12、SGR1任意一个基因未突变的材料，在本发明的实施例中具体为番茄红果材料，该番茄红果材料中PSY1、MYB12、SGR1基因均未突变(基因与AC番茄一致或高同源性)。

上述选取PSY1、MYB12、SGR1三个基因至少一个突变的植株的方法为分别用扩增PSY1、MYB12、SGR1三个基因的引物对目的番茄进行PCR扩增，得到扩增产物，再进行测序，比对野生型PSY1基因(序列1)、MYB12基因(序列2)、SGR1基因(序列3)，选择PSY1、MYB12、SGR1三个基因至少一个突变的植株作为目的番茄：

扩增PSY1的引物由序列11和序列12所示的DNA分子组成；

扩增MYB12的引物由序列13和序列14示的DNA分子组成；

扩增SGR1的引物由序列15和序列16所示的DNA分子组成；

上述第一个目的的方法中，PSY1、MYB12、SGR1三个基因至少一个突变中，突变形式可以为杂合突变也可以为纯合突变。

所述编辑的具体步骤如下：将所述重组载体PMS6T-pTX041导入农杆菌LBA4404，得到重组菌；再将所述重组菌转化番茄背景材料外植体，然后在含1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH 5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生番茄植株。

本发明第2个目的是提供一种无外源基因插入的番茄多果色材料的获得方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)从上述方法获得目的番茄多果色材料中选取PSY1、MYB12、SGR1这3个基因均为突变(纯合突变或杂合突变均可)的T0代植株种子，播种，得到T1代植株；再从所述T1代植株中选取无外源DNA片段且PSY1、MYB12、SGR1三个基因均为纯合突变的植株，记作T1代PSY1、MYB12、SGR1三个基因纯合突变植株；

2)再将所述T1代PSY1、MYB12、SGR1三个基因纯合突变植株与其背景受体番茄(即获得目的番茄采用的受体番茄)杂交，得到F1代，再自交，得到F2代；从F2代中选取PSY1、MYB12、SGR1三个基因均纯合，且至少一个突变的植株，作为无外源基因插入的番茄多果色材料。

在本发明的实施例中，得到无外源基因插入的番茄多果色材料中：3株三基因纯合且MYB12单基因突变(PSY1 myb12 SGR1)，4株三基因纯合且PSY1单基因突变(psy1MYB12SGR1)，4株三基因纯合且SGR1单基因突变(PSY1 MYB12 sgr1)，2株三基因纯合且PSY1、MYB12双突变(psy1 myb12 SGR1)，1株三基因纯合且MYB12、SGR1双突变(PSY1 myb12sgr1)，2株三基因纯合且PSY1、SGR1双突变(psy1 MYB12 sgr1)，3株三基因纯合且PSY1、MYB12、SGR1三基因突变(psy1 myb12 sgr1)的子代，这些突变组合植株分别对应粉色、黄色、棕红色、浅黄色、棕粉色、黄绿色、绿色7种颜色的材料(其中，小写为突变)。

上述选取PSY1、MYB12、SGR1三个基因均纯合，且至少一个突变的方法均为分别用扩增PSY1、MYB12、SGR1三个基因的引物对目的番茄进行PCR扩增，得到扩增产物，再进行测序，与野生型PSY1基因(序列1)、野生型MYB12基因(序列2)、野生型SGR1基因(序列3)进行比对，选择各种形式的突变。

在本方面的实施例中选取无外源DNA片段的方法为选取无Cas9基因的植株，具体为用扩增Cas9的引物对(序列20和序列21)待测植株进行PCR扩增，选取无扩增产物的植株。

上述的方法在培育番茄多果色杂交种中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还有1个目的是提供如下(1)-(3)中任一种生物材料：

(1)上述第一个目的中的CRISPR/Cas9系统；

(2)上述第一个目的中的重组载体；

(3)含有上述重组载体的微生物转化体。

所述生物材料在培育番茄多果色材料中的应用也是本发明保护的范围；

所述生物材料在番茄育种中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还提供了一种鉴定或鉴定待测番茄是否为番茄多果色材料或其子代的产品，包括如下1)-3)中的任一种：

1)引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；

所述引物1由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；

所述引物2由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；

所述引物3由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；

所述引物4由序列20所示的单链DNA分子和序列21所示的单链DNA分子组成；

2)含有1)所述的引物对1、引物对2、引物对3和引物对4的PCR试剂；

3)含有1)所述的引物对1、引物对2引物对3和引物对4或2)所述的PCR试剂的试剂盒。

上述方法中，所述番茄材料的品种可以是番茄常规品种。在本发明的具体实施例中，所述番茄材料可为红果材料，具体为Solanum lycopersicum cv Ailsa Craig(AC)。

在本发明的实施例中，制备获得三基因编辑突变体为PMS6T-4#-3，该植物中，PSY1基因第139位和第144位之间删除4个碱基(见序列17)，MYB12基因第35位和第39位之间删除3个碱基，第103位和第109位之间删除5个碱基(见序列18)，SGR1基因第1673位和第1674位之间插入1个碱基(见序列19)，该植株的成熟果实为绿色。

本发明首先设计了用于对PSY1、MYB12、SGR1基因进行CRIPSR/Cas9基因编辑的sgRNA靶点序列，然后构建了含有六个上述靶点序列的基因编辑载体。通过实验证明：将该基因编辑载体转化番茄背景材料可对PSY1、MYB12、SGR1基因进行精确编辑，获得番茄果色编辑材料，并从其自交子代中可筛选得到PSY1、MYB12、SGR1基因中不同基因组合纯合突变的无外源基因插入的番茄多种果色材料。本发明的基因编辑方法适用于不同品种的番茄材料，且编辑效率高，可以将背景材料转变为多种果色材料。与传统的PSY1、MYB12、SGR1三个位点回交转育相比，该方法可以极大地缩短转育时间，1-2年实现亲本果色性状的精准转化，且不受连锁累赘和转基因安全等因素的限制，具有极大的育种应用前景和经济价值。

附图说明

图1为PSY1、MYB12、SGR1三个基因的结构和CRIPSR/Cas9基因编辑sgRNA靶点的位置信息。

图2为重组载体的结构示意图。

图3为T1代植株PSY1、MYB12、SGR1基因的PCR检测电泳结果。其中，-为阴性空白对照，WT为未转化的野生型植株。

图4为PMS6T-4#-3植株PSY1、MYB12、SGR1基因的测序结果。

图5为获得去转基因标记多果色番茄材料流程。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中使用的番茄品种AC、TB0333、TB0509、TB0244、TB0249来自北京市农林科学院，公众可从京研益农(北京)种业科技有限公司购买获得。

下述实施例中的pTX041载体记载于文献“Deng,L.,Wang,H.,Sun,C.,Li,Q.,Jiang,H.,Du,M.,Li,C.-B.,Li,C.,Efficient generation of pink-fruited tomatoesusing CRISPR/Cas9system,Journal of Genetics and Genomics(2017),doi:10.1016/j.jgg.2017.10.002.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中使用的2x Taq DNA redmix聚合酶为Genstar公司的产品，DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1为TaKaRa公司的产品；限制性内切酶为NEB公司的产品；PCR产物纯化试剂盒为Omega公司的产品；快捷型植物基因组DNA提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品；引物为Thermo Fisher Scientific公司合成；测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。

实施例1、CRIPSR/Cas9基因编辑载体PMS6T-pTX041的构建

一、基因sgRNA靶点序列的获得

1)PSY1基因sgRNA靶点序列的获得

根据SGN数据库(http://solgenomics.net/)登录的PSY1基因序列(登录号为Solyc03g031860，核苷酸序列为序列表中的序列1，对PSY1基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，PSY1基因有6个外显子(分别标注为E1-E6)和5个内含子构成。将序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)进行CRIPSR/Cas9靶点设计，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz1706genome SL2.50。最终选定的sgRNA靶点如图1所示，PSY1基因sgRNA靶点序列如下：5’-TCTCCTTGTGACGTCTCAAA-3’(target1)；5’-GAGAATCAATAGAGGTGG-3’(target2)。

2)MYB12基因sgRNA靶点序列的获得

根据SGN数据库(http://solgenomics.net/)登录的MYB12基因序列(登录号为Solyc01g079620，核苷酸序列为序列表中的序列2，对MYB12基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，MYB12基因有4个外显子(分别标注为E1-E4)和3个内含子构成。将序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)进行CRIPSR/Cas9靶点设计，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz1706genome SL2.50。最终选定的sgRNA靶点如图1所示，MYB12基因sgRNA靶点序列如下：5’-GGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’(target1)；5’-CTAATGGAGAAGGCTCTTGG-3’(target2)。

3)SGR1基因sgRNA靶点序列的获得

根据SGN数据库(http://solgenomics.net/)登录的SGR1基因序列(登录号为Solyc08g080090，核苷酸序列为序列表中的序列3，对SGR1基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，SGR1基因有4个外显子(分别标注为E1-E4)和3个内含子构成。将序列提交到CRISPRdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)进行CRIPSR/Cas9靶点设计，PAM序列设定为NGG，物种数据设定为Tomato(Solanum lycopersicum)str.Heinz1706genome SL2.50。最终选定的sgRNA靶点如图1所示，SGR1基因sgRNA靶点序列如下：5’-TTGCCACATTAGTGGAGGCC-3’(target1)；5’-CTTCTGCAAAGAACTCCCTG-3’(target2)。

二、CRIPSR/Cas9基因编辑载体PMS6T-pTX041的构建

1、sgRNA扩增引物的设计

根据选定的靶点序列，设计构建sgRNA扩增引物，引物序列具体

PMS1F:

(序列22)，框内为Bsa I酶切位点；

PMS 2R：

(序列23)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 2F：

(序列24)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 3R：

(序列25)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 3F：

(序列26)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 4R：

(序列27)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 4F：

(序列28)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 5R：

(序列29)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 5F：

(序列30)，框内为Bsa I酶切位点。

PMS 6R：

(序列31)，框内为Bsa I酶切位点。

2、CRIPSR/Cas9基因编辑载体PMS6T-pTX041的构建

(1)重组质粒PMS6T-pTX041的构建

以质粒043为模板，以序列22和序列23所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，以序列24和序列25所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,以序列26和序列27所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,以序列28和序列29所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,以序列30和序列31所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物，获得5条两侧均带有Bsa I酶切位点的sgRNA核苷酸片段。

PCR反应体系为：2×Taq PCR StarMix 25ul、前后引物各1.0μL、质粒模板30ng、加双蒸水至50μL。PCR反应条件为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共32个循环。

PCR扩增产物纯化后，同时与pTX041载体用Bsa I酶切，并在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒PMS6T-pTX041(序列10，18973bp)，其中第5218-6102位为通过酶切连接替换载体pTX041的TU6和sgRNA位点间的片段，重组质粒的核苷酸序列如序列10所示，结构图如图2所示。从图中可以看出：PMS6T-pTX041依次包括用于启动sgRNA的编码基因表达的番茄U6启动子(TU6)(序列10第4956-5217位)、sgRNAS1的靶点序列(序列10第5218-5237位)、sgRNAS1的编码基因(序列10第5328-5313位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5314-5390位)，sgRNAS2的靶点序列(序列10第5391-5410位)、sgRNAS2的编码基因(序列10第5411-5486位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5487-5563位)，sgRNAP1的靶点序列(序列10第5564-5583位)、sgRNAP1的编码基因(序列10第5584-5659位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5660-5736位)，sgRNAP2的靶点序列(序列10第5737-5756位)、sgRNAP2的编码基因(序列10第5757-5832位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第5833-5909位)，sgRNAM1的靶点序列(序列10第5910-5929位)、sgRNAM1的编码基因(序列10第5930-6005位)、用于自剪切的tRNA编码基因(序列10第6006-6082位)，sgRNAM2的靶点序列(序列10第6083-6102位)、sgRNAM2的编码基因(序列10第6103-6178位)、用于终止sgRNA编码基因的U6终止子(序列10第6179-6370位)，用于启动Cas9蛋白的编码基因表达的2x35S启动子(序列10第6391-7136位)、Cas9蛋白的编码基因(序列10第7286-11557位)、用于终止Cas9蛋白的编码基因表达的rbcSE9终止子(序列10第11558-12192位)、T-DNA区的LB识别序列(序列10第12833-12857位)、T-DNA区的RB识别序列(序列10第2454-2478)、用于启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子(序列10第2602-2781位)、抗性筛选基因NPTII(序列10第2838-3632位)、用于终止抗性筛选基因NPTII表达的NOS终止子(序列10第4022-4274位)。

实施例2、一种通过基因编辑将番茄背景材料转变为多种果色材料的方法

一、将基因编辑载体PMS6T-pTX041转化农杆菌

取1μg实施例1制备的基因编辑载体PMS6T-pTX041置于100μl LBA4404感受态细胞(北京华越洋生物，NRR01270)中，液氮中速冻3分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基(YEB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蔗糖1g/L)，28℃培养2-4小时；10000×g离心30秒，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/ml卡那霉素，500μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的YEB平板上，28℃黑暗培养2-3天；挑单菌落，接种于含有50μg/ml卡那霉素，500μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，得到转化子。将转化子进行菌液PCR鉴定，以序列32和序列33所示的核苷酸序列为引物，得到大小为1483bp的扩增片段的即为阳性重组菌，并将该重组菌命名为PMS6T-pTX041/LBA4404，-80℃冻存备用。引物序列如下：

pTX-F：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(序列32)；

pTX-R：5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCT-3’(序列33)。

二、T0代PSY1、MYB12、SGR1三个基因编辑植株的获得及鉴定

1、T0代再生植株的获得

将重组菌PMS6T-pTX041/LBA4404分别转化番茄材料AC、TB0333、TB0509、TB0244、TB0249和w11-1外植体(子叶)，然后在含有1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素核苷、pH为5.8的MS固体培养基(北京华越洋生物，M519)中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、200mg/L特美汀和75mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为T0代再生植株。

2、T0代PSY1、MYB12、SGR1三个基因编辑植株的获得

采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒分别提取上述T0代再生植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以序列11和序列12所示的核苷酸序列为引物1，以序列13和序列14所示的核苷酸序列为引物2，以序列15和序列16所示的核苷酸序列为引物3，分别以上述引物1、引物2和引物3进行PCR扩增，得到PSY1扩增产物、MYB12扩增产物和SGR1扩增产物。

PCR反应体系为：Premix Taq DNA聚合酶Mix 10μL、前后引物各0.8μL、基因组DNA1.5μL、加双蒸水至20μL；PCR反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环。

引物序列如下(如下引物是各个基因中2个sgRNA靶序列两端的侧翼序列)：

PSY1-crTestF：GTTGGTTTGCCTGTCTGTGGTC(序列11)；

PSY1-crTestR：ATATGCTTCACTCAACAAGCCCA(序列12)；

MYB12-crTestF：ATCAAAGAGTGACATGCAATGCAA(序列13)；

MYB12-crTestR：CCTCTTGAGAAGTAATGTTCCCTC(序列14)；

SGR1-crTestF：ATCCGTGCCGTCTATTGTTCT(序列15)；

SGR1-crTestR：ACACTCACTGGGGGAAAGCAA(序列16)。

将不同背景获得的T0代再生植株的PSY1扩增产物、MYB12扩增产物和SGR1扩增产物分别送去测序，与PSY1(序列1)、MYB12(序列2)和SGR1(序列3)相比，有突变的株数，进行统计。不同背景的材料打靶结果如表1所示。

表1

上述表1中，

第2列总出苗株数为各个背景下T0代再生植株出苗株数；

第3列为各个背景下T0代再生植株中PSY1基因有突变的株数；

第4列为各个背景下T0代再生植株中MYB12基因有突变的株数；

第5列为各个背景下T0代再生植株中SGR1基因有突变的株数；

第6列为各个背景下T0代再生植株中PSY1基因、MYB12基因和SGR1基因均突变的株数；

第7列为各个背景下T0代再生植株中PSY1基因、MYB12基因和SGR1基因均未突变的株数；

第8列打靶率为(该行第3、4、5列的总株数/该行第2列的株数)*100％；

最后一行的打靶率为(第3-7列中对应列的总株数/58)*100％；

最后一行最后一列的打靶率为(2-6行第3、4、5列中全部株数/58)*100％；

由结果可见，PMS6T-pTX041载体在串连多个靶点对3个基因进行同时编辑时，仍然具有较高的效率，其中三个基因同时打靶的材料占总数的27.58％，三个基因任一打靶的材料占总数的87.94％，三个基因均未打靶的材料占总数的12.06％。其编辑效率与基因或靶点的设计有关(51.72％-74.13％)，背景材料也有一定的影响(57.14％-100％)。

由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，纯合突变是指两条同源染色体的同一基因发生了相同的突变的植株；杂合突变为两条同源染色体中仅一条染色体的基因发生突变，且另一条同源染色体的基因无突变的植株。

从AC背景下T0代再生植株中的全打靶的6株中选取一株PMS6T-4#T0代基因编辑植株，分析该株系用引物1、引物2和引物3进行扩增的各个基因扩增产物的测序结果，结果该株系中PSY1基因杂合打靶，MYB12、SGR1两个基因纯合打靶植株，具体测序分析如下：

PMS6T-4#植物中，PSY1基因杂合打靶(杂合突变)，将野生型番茄材料AC的两条同源染色体的PSY1基因序列1第139位和第144位之间删除4个碱基(引物1扩增产物的部分序列见序列17)；MYB12基因纯合打靶，将野生型番茄材料AC的两条同源染色体的MYB12基因序列2第35位和第39位之间删除3个碱基，且序列2第103位和第109位之间删除5个碱基(引物2扩增产物的部分序列见序列18)；SGR1基因纯合打靶，在野生型番茄材料AC的两条同源染色体的SGR1基因序列3第1674位和第1675位之间插入1个碱基(引物3扩增产物的部分序列见序列19)，三个基因的In/Del突变均会导致阅读框移码，蛋白翻译提前终止，该植株的成熟果实为棕粉色。

其他AC背景下T0代再生植株的3个基因突变形式和成熟果实颜色如表2所示：

表2

实施例3、无外源基因插入的番茄多果色材料的获得及鉴定

以实施例2获得的PMS6T-4#T0代基因编辑植株(背景为AC，PSY1杂合突变，MYB12、SGR1两个基因均纯合突变)为例，进行如下无外源基因插入的番茄多果色材料的制备：

一、去除外源DNA片段获得无外源基因插入的材料

1、去除外源DNA片段

PMS6T-4#T0代基因编辑植株收获种子播种，得到PMS6T-4#T1植株。

2、鉴定

1)外源DNA片段的检测

以序列20和序列21所示的核苷酸序列为引物，以PMS6T-4#T1植株子叶基因组DNA为模板，对外源DNA片段(Cas9)进行PCR扩增和电泳，目的片段为Cas9基因的其中一小段，具体为序列10的第7944-8345位。

结果如图3所示，选择没有PCR扩增产物的子代，即为不携带外源DNA片段的植株的子代，命名为PMS6T-4#无外源基因插入的T1植株(PMS6T-4#-3、PMS6T-4#-4、PMS6T-4#-7、PMS6T-4#-9、PMS6T-4#-10)。

2)3基因纯合植株鉴定

以PMS6T-4#无外源基因插入的T1植株子叶基因组DNA为模板，采用序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子作为引物对1对PSY1基因片段进行PCR扩增，序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子作为引物对2对MYB12基因片段进行PCR扩增，由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子作为引物对3对SGR1基因片段进行PCR扩增，扩增产物送去测序。

根据PCR扩增产物测序结果判断待测番茄PSY1、MYB12、SGR1三基因编辑情况。

选取PSY1、MYB12、SGR1三基因均为纯合突变的植株，记作PMS6T-4#无外源基因插入的T1纯合突变植株(PMS6T-4#-3)。

PMS6T-4#-3无外源基因插入的T1纯合突变植株结果如图4所示。

二、无外源基因插入的番茄多果色材料的获得

将上述一获得的PMS6T-4#-3无外源基因插入的T1纯合突变植株与其背景AC杂交，得到杂交F1代，F1代自交得到150株PMS6T-4#-3无外源基因插入的F2代(命名为PMS6T-4#xAC F2；目的是得到不同基因突变形式组合)。

150株PMS6T-4#无外源基因插入的F2代植株子叶基因组DNA为模板，采用序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子作为引物对1对PSY1基因片段进行PCR扩增，序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子作为引物对2对MYB12基因片段进行PCR扩增，由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子作为引物对3对SGR1基因片段进行PCR扩增，扩增产物送去测序。

根据PCR扩增产物测序结果判断待测番茄PSY1、MYB12、SGR1三基因编辑情况。

结果如下：F2代所有的150株材料中选取PSY1、MYB12、SGR1三基因均为纯合的株系，其中，3株三基因纯合且MYB12单基因突变(PSY1 myb12 SGR1)，4株三基因纯合且PSY1单基因突变(psy1 MYB12 SGR1)，4株三基因纯合且SGR1单基因突变(PSY1MYB12 sgr1)，2株三基因纯合且PSY1、MYB12双突变(psy1 myb12 SGR1)，1株三基因纯合且MYB12、SGR1双突变(PSY1 myb12 sgr1)，2株三基因纯合且PSY1、SGR1双突变(psy1 MYB12 sgr1)，3株三基因纯合且PSY1、MYB12、SGR1三基因突变(psy1 myb12sgr1)的子代(其中，小写为突变)，这些突变组合植株分别对应粉色(对应PSY1 myb12SGR1突变)、黄色(对应psy1 MYB12 SGR1突变)、棕红色(对应PSY1 MYB12 sgr1突变)、浅黄色(对应psy1 myb12 SGR1突变)、棕粉色(对应PSY1myb12 sgr1突变)、黄绿色(对应psy1 MYB12 sgr1突变)、绿色(对应psy1 myb12 sgr1突变)7种颜色的材料，且不携带外源DNA片段。

番茄多果色材料的获得、筛选及鉴定流程如图5所示。

将上述筛选的突变组合植株观察田间的生长状态和坐果情况、果实大小等农艺性状，均与AC野生型番茄相当，因此对3个基因进行编辑，仅改变果实颜色，对其他农艺性状无显著影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京市农林科学院 山东农业大学

<120>一种通过基因编辑技术从番茄背景材料中创制多种果色材料的方法

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3302

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgtctgttg ccttgttatg ggttgtttct ccttgtgacg tctcaaatgg gacaagtttc 60

atggaatcag tccgggaggg aaaccgtttt tttgattcat cgaggcatag gaatttggtg 120

tccaatgaga gaatcaatag aggtggtgga aagcaaacta ataatggacg gaaattttct 180

gtacggtctg ctattttggc tactccatct ggagaacgga cgatgacatc ggaacagatg 240

gtctatgatg tggttttgag gcaggcagcc ttggtgaaga ggcaactgag atctaccaat 300

gagttagaag tgaagccgga tatacctatt ccggggaatt tgggcttgtt gagtgaagca 360

tatgataggt gtggtgaagt atgtgcagag tatgcaaaga cgtttaactt aggttagctt 420

cttcaatcta ttcattcgtt taccaaatat tatttggtaa gcactaatta tgaatatata 480

tatgttcatg ttattgatga agacaaaatt tgatctttgt ttgtttattc aggaactatg 540

ctaatgactc ccgagagaag aagggctatc tgggcaatat atggtgaggt ttctagccat 600

ttaataacag ttacgcgcac aaacacatat gattaatcgg ggacgagaaa aaaagaaatg 660

aagtttgagt tttgagggtc atatgtaata ggtaaatccg agcttgacta gcttgagatg 720

tttattgtca tatcatgctc aatactaacc aaaacactga aaaagaactt gattatattt 780

acatactaat attttcattt gcgttgctgt tcacattttt acctatggaa ctggtttttg 840

tgatttgtta tacttcatat tcgatgttaa taaaatatat cattcctccc tttttctcca 900

cttcaagctt tactgtagtg ttgaaagggg aaactccttt taatgattgc atatataaac 960

gaacttcttg agttgaatag tttctcatta tgatctgttt aaacagtatg gtgcagaaga 1020

acagatgaac ttgttgatgg cccaaacgca tcatatatta ccccggcagc cttagatagg 1080

tgggaaaata ggctagaaga tgttttcaat gggcggccat ttgacatgct cgatggtgct 1140

ttgtccgata cagtttctaa ctttccagtt gatattcagg ttagtctacc aattctatgg 1200

tctttatatt tgttcaattt gcgtttgatg tcacttttgc tgagggcttt tctaatagct 1260

tacttcagcc tagcggaaat gtttgtagtt gaatctctag ttctgtctcc tatatctgtt 1320

tctctcgtcc tagatactac acatacttca tttctgtttt aacattttat tcgtcttttg 1380

gtgttgtttt gtatgtgaat catatatttg gaacagaatc attattagtt cacatgattt 1440

catttgcttt cttcaatagc gtaattgtct aaccttccaa tatatgttgc agccattcag 1500

agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gagaaaatcg agatacaaaa acttcgacga 1560

actatacctt tattgttatt atgttgctgg tacggttggg ttgatgagtg ttccaattat 1620

gggtatcgcc cctgaatcaa aggcaacaac agagagcgta tataatgctg ctttggctct 1680

ggggatcgca aatcaattaa ctaacatact cagagatgtt ggagaagagt aagtacaaag 1740

ctgtgtttta cgcacataat tttttttgct aatatttaca tatcaaaata taggaaaatg 1800

agctcttcgg ttatccggtt tatatttttt ttatgtcaac ataatagtat aaagtaatta 1860

gtatcagtcg ttctgggaat aaaattgcag aactcaattt agccgtgttg tgaaatcctg 1920

cttgttttga gagcttaaag ctcattagtt agtcgttaga gacgaagaaa ttcttcgttg 1980

tccatcttta ttccacctta aagttgtgat attttcatta ttggtacatt tggcaaaaac 2040

acctgaacaa atttatgacg gatgcctttt gaaagtcact atacctgtct agtcggcgtt 2100

tatcacattt ctttgacata ttgaactttg aaacatgata tcagctctag acagtgacga 2160

gccatgatca atttctttcc tttattcttt ctttggaagt gccgtattta ggcttccgtt 2220

gttcttatat attgctttcc ctgcagtgcc agaagaggaa gagtctactt gcctcaagat 2280

gaattagcac aggcaggtct atccgatgaa gatatatttg ctggaagggt gaccgataaa 2340

tggagaatct ttatgaagaa acaaatacat agggcaagaa agttctttga tgaggcagag 2400

aaaggcgtga cagaattgag ctcagctagt agattccctg taagcattcg taaactcttt 2460

agttttatga aatgattctt ttttcgcgtt attagatgaa tatggttgct tgtgttgagt 2520

atttctaggt cgatgaagtt gagacaaggg tttttaagtt ttaacgactt ttacggggtg 2580

ccatgttatc tgctacctaa tcttaggtag ttgaccggaa gggctagaat tttaacctca 2640

tgttcaccct accaaccaag aaatgaacct cgcatagagc tcgtagttat gaatatttgc 2700

tttggcatga cattgtgcgg atcatgaaat gtcttagatt atatggaaaa atcattctat 2760

tacatcgaat agatacatta gatctaagaa gcacgccgtg ttgtaaatga gaaattctat 2820

agctcagatc tttagttttc tctgaacgac ctacaaacca acggataacc ttgtattgag 2880

cttgtcgttc tcagtatttg cactaacatt acgtcgtgtg gatcctgaaa tggcttggat 2940

tgctattatt ctggatatgg caaaaccatt ttattagtac tagatatcga ataactacat 3000

ttgaccctac aagtaccctg ggttggagtt acaatatccc atacctcgta tctttagtgt 3060

tctcttattt atcacctttg tctactattc tggcaaaata acctcactcg ttactcggtg 3120

ttttccaggt atgggcatct ttggtcttgt accgcaaaat actagatgag attgaagcca 3180

atgactacaa caacttcaca aagagagcat atgtgagcaa atcaaagaag ttgattgcat 3240

tacctattgc atatgcaaaa tctcttgtgc ctcctacaaa aactgcctct cttcaaagat 3300

aa 3302

<210> 2

<211> 3137

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgggaagaa caccttgttg tgaaaaagtg ggcatcaaga gaggcagatg gactgcagaa 60

gaagatcaaa ttctcactaa ttatattatt tctaatggag aaggctcttg gaggtcgtta 120

cctaaaaatg ccggtacgat tacctactaa tcttttattt taatttgaaa tttaaaattt 180

ttttcttcgt ttaacagttt ttttataata ttttatttcg aaggattatt gagatgcgga 240

aagagttgta gactacgatg gattaattat ttgaggtctg atctcaagag agggaacatt 300

acttctcaag aggaagatat aattataaag ttacatgcaa ctttgggtaa caggtaatta 360

gtcaattact tgattggact ttttagcttg ctaattaaac cactcatttt gtttcttttt 420

agtctaggtc cagaaaaaaa tgtctccttt aaaatcaagt actttcttcg tttaaaaaat 480

aataatttta tttttattta gtctgtttta taaagaatga cttttttttt agtaatatgt 540

taaatttaat ttttcacatg acatctttaa aattataaaa ttagagatag tttgatacat 600

ttgacataac tttaatttag aatcacttct ttcttttctt aaaatccgtt tcaagtcaaa 660

taggtcattc ttttttatac gcaagaagta tttttttctt taaaaataaa tctgaaactc 720

attttaggtt ataaacattg tcacaataat ttggtgcccg atctaacaac acttcttata 780

tcattttagt gtgtgaatag tgttacacca aatttaatac aacaaaatta ctcatcaaaa 840

ttattactat tcatgataac atagtgtaat ggattcgagc tagagaaaga ataaataata 900

tgttttaggt aaataatatt aatggattcg agctagagaa agaataaata atatgtttta 960

ggtaaataat attccatttg cttaaaaaaa taatcttttt ttttaaaaaa agaatgattt 1020

cttttacttt cagatatatt ttaatctcag ctgttgttcg tgtgataagt ttaatatcat 1080

ataatacttt gctttatttg acataatttt aatttagatt tataaaatta ataatttttt 1140

ttattttctt aaatatcgtg ttaaattaaa ctaggtcaat ggtataattg attgaagtag 1200

atgccctaat aaataaaagt gagatcaatg caattataat taacttaaat tcatcacttc 1260

ttttttacta cttgaattca tcacataaaa caaatgaatt tttcttcttc ttttatttca 1320

tgtttactcc agtacttaat agtttatagt tatgtttgcc tggaaaaagg agaaaagttt 1380

tggtcacttt aatttgtagg gtattatttt ctacattcat tatttgtgct aatgaattaa 1440

taagttaatt aaattggtcc cctcgagtaa gttcaatatt actctttttt ttttcttttt 1500

catatgacga gtgacatatt catgctttaa aaacaattca tcctttctat tattagtcat 1560

ataccaagtc tagaaaataa aacagtgaca atttaaagta ttttttcaaa ctagaaaacg 1620

tatcttaagt tggatgtata cacaaatata tcaaataatt tcaacaaaga aaaaatttag 1680

aaaagatgtg ttagttgtga gttgtgacat taaatatgat tgattaatac aatataccat 1740

cgatctagtt tctaacattt tctagtatca tcgacttttt aaaattacag atggtctctt 1800

atagcagaac atttatcagg tagaacagac aatgagataa aaaactattg gaactctcat 1860

ctaagtcgaa aagttgatag cttaaggata ccaagcgatg agaagttacc taaagccgta 1920

gttgatttgg ctaaaaaagg tataccgaag ccaattaaaa aatcatcgat tagtcgacca 1980

aaaaataaaa agtcaaactt attagaaaaa gaagcattgt gttgtacaaa tatgccagct 2040

tgtgatagtg ccatggaatt aatgcaagaa gatctagcaa agatagaggt gccaaattct 2100

tgggcaggac ctatagaggc caagggaagc cttagttcag gtacaaattt cgatgttttg 2160

actatttttt attgtgaaat ttgattttaa aaaatatttt ttgatattaa agtgaaaaat 2220

aatattcaaa atttatttaa gttgtgtttg gttatgaata tgaattagag ttgttttttt 2280

cattttttcc tcaattattt cgagtaaacc tttttttttc tttaaagaat tgaaatttta 2340

ttgtcaaata tgattctctg agttttaact atcgaaaaaa gcgaaaaaga tcaaacaccc 2400

tctaatagtt tttattaatc aattaaatac attttcaata gtgactatga cgacataata 2460

tttatatatt gaaatatatg attattttat caaaaaactt aaaatttaat tttcacgtct 2520

ttcttttctt ttgaaacgtc attttttata tgtacctttt agatccaata tctatctatg 2580

gatagacgtt gcgaagtact ttttgttatt ttcaattatt aggcacaaat aattgaatct 2640

agcacctctt gtatgtacaa aattttaaac tgtagcaata aataaatata ttttttaatt 2700

tttttaaatt tttatttttt tttgtctgag cagatagtga tatcgaatgg ccaagactcg 2760

aggagattat gccagacgtg gtgattgatg atgaagataa gaacacaaat ttcatattga 2820

attgtttcag agaagaagta acgagcaata atgtagggaa tagttattca tgtatcgagg 2880

aaggtaataa aaagatatca agcgacgatg aaaaaatcaa attattaatg gattggcaag 2940

ataatgatga gttagtatgg ccaacgttac catgggaatt agaaacggat atagttccca 3000

gttggccaca atgggacgat actgacacta acttacttca aaattgcacc aatgataata 3060

ataattatga agaagcaaca acaatggaaa ttaataacca aaatcatagt accattgtat 3120

cttggctttt gtcttag 3137

<210> 3

<211> 2204

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgggaactt tgactacttc tctagtggtt ccatctaagc tcaacaatga acaacagagc 60

tctattttta tacacaaaac tagaaggaaa tgcaagaaga atcaatccat agtacctgta 120

attaatttcc accatctttt ttcttcttct taagattctt ctattggttt gatattgttt 180

acttaatagt ttttatttgt ttgttgaatg aaaataggtg gcaaggttat ttggaccagc 240

tatatttgaa gcttcaaaat tgaaggtact ttttttggga gttgatgaag aaaagcatcc 300

aggaaagttg ccaagaacat atacactgac tcatagtgat attacttcta aacttacttt 360

ggctatctcc caaaccatca ataattctca ggtaatcaaa tatttctctt tagaaatttt 420

gatgacatat tattctgtgt gagaaatagt cgaggtctat cagaaactct cttttaaggt 480

aggactaagg ttgcgtaaac accactctct tcatacttta gagtctagcc ctttaattta 540

aattttgagt ttatttctcc aatgatcact caaataataa tagttattat ctcggaaaat 600

tatttttctt gtcgattcca attttcttcg gcaaagaaag ttaataagat aataattact 660

attagagtga accctttaaa tttggtggca ataagaatat ggaggtcctt gattagttga 720

tcattcttct cgaattatta gttgaatgac tatttgaaaa atcaaatctt taatttggtg 780

gcaataagaa tatggagttc cttgattagt tgatcatact tctctattcc aatttccttt 840

ggcaaagaaa gtgactttac gagatactag taattattag ttgaatggtt atttgaaaaa 900

tcaactcttt aaatttgatg gcaataagaa tatggaggtc cttgataagt tgatcgttct 960

tctcgatttc aatttccttc agcaaagaaa gtgatctgat gagataataa ttattagttg 1020

aataaccatt agagaaatca acttcttaca cttggtggca ataagaatat gggattcttg 1080

attagttgat cttcatctat tgctgattcg gagtataggc gaattcaaga tttgatcttt 1140

atgagttttg aattttagga cagcaaactc aagtactagt aacttggaat ttgaatttga 1200

ttcttgtaca tatttaatga atttctaaac atagggtctg ggccaaaact actaaattct 1260

acattcggtg gataatggat ccgtgccgtc tattgttctc aacttaaata ctattatcta 1320

aagcaatatc aagctcatga cgcatgtcga aatcccacac atcacatgct atacttttac 1380

cactaaatta ttagctgcat attcatttag agaagttcga aaatatgttt tttttaaatc 1440

ttgaatctgc atctacatcg tagtagaact tctgttgaga aaagtggaaa tggtatgttt 1500

gatttgcagt tgcaaggttg gtataacaga cttcaaagag atgaagttgt tgcagagtgg 1560

aagaaagtaa aagggaagat gtcacttcat gtccattgcc acattagtgg aggccatttt 1620

atgttagact tatttgctag actcagaaac tacatcttct gcaaagaact ccctgtggta 1680

agttcataat aaattgccac catatctatg tatgtatgtc gttcgaactt cccaaaattg 1740

ttattggtcc tgtgtcagat ccttcttttg gaggatcaaa cacacaacca taggttaata 1800

gtaccatatt ttcataactt gtgtttttat tttgtttgca ttaggttctc aaggcttttg 1860

ttcatggaga tgagaattta ctaaggaatt atccagagtt acaagaagct ttagtttggg 1920

tatattttca ttcaaacatt caagaattca acaaagtaga atgttggggt ccactcagag 1980

atgcaacttc cccctcatct tcttctggtg gggtaggtgg ggtgaagagt acaagtttta 2040

caagcaatag caacaaaaaa tgggaattac caaagccttg tgaagaggct tgtgcctgtt 2100

gctttccccc agtgagtgtt atgccttggc tttcttcaaa tcttgatggg gtaggtgagg 2160

aaaatgggac catccaacaa ggcttgcaag agcagcaaag ttga 2204

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggcctccact aatgtggcaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cttctgcaaa gaactccctg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

tctccttgtg acgtctcaaa 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gagaatcaat agaggtgg 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gggcatcaag agaggcaga 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ctaatggaga aggctcttgg 20

<210> 10

<211> 18973

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc 60

gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120

cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 180

gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 240

atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag 300

gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 360

cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc 420

cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 480

gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc 540

ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 600

agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 660

ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 720

tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 780

tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 840

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 900

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 960

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1020

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1080

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1140

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg 1200

aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga 1260

cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg 1320

ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac 1380

gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc 1440

cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg 1500

ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc 1560

cccaacagtg aagtagctga ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc 1620

cgcctcgcag aggaagcgaa gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg 1680

cgtgccggca tggatgcgcg cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg 1740

ggcattcccg atcagaaatg agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg 1800

attctccgcc agcatggctt cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg 1860

ccagtaaagc gccggctgct gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc 1920

gtctacgccg acctcgttca acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa 1980

ctttgtcatg cttgacactt tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg 2040

ataaagaatc cgcgcgttca atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa 2100

cccaacatac ccctgatcgt aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc 2160

ctgattatgc cggtgctgcc gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc 2220

gcccactatg gcattctgct ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg 2280

ctgggcgcgc tgtcggatcg tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc 2340

gccagatctg gggaaccctg tggttggcat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct 2400

tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct taggtttacc 2460

cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga 2520

tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc gggacaagcc 2580

gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga gccactcagc cgcgggtttc 2640

tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca gaaaccatta ttgcgcgttc aaaagtcgcc 2700

taaggtcact atcagctagc aaatatttct tgtcaaaaat gctccactga cgttccataa 2760

attcccctcg gtatccaatt agagtctcat attcactctc aatccaaata atctgcaccg 2820

gatctggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 2880

gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 2940

ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 3000

gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 3060

ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 3120

gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 3180

tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 3240

accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 3300

aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 3360

aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 3420

atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 3480

cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 3540

aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 3600

ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 3660

ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 3720

gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 3780

catgctggag ttcttcgccc acgggatctc tgcggaacag gcggtcgaag gtgccgatat 3840

cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc ctgagcgaca atatgatcgg 3900

gcccggcgtc cacatcaacg gcgtcggcgg cgactgccca ggcaagaccg agatgcaccg 3960

cgatatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggatgatccc 4020

cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4080

gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4140

catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4200

cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4260

tatgttacta gatcgggcct cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg 4320

gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggag 4380

gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta 4440

ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca 4500

aacttgattc tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt 4560

ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg 4620

ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt 4680

ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttgg cccaatacgc aaaccgcctc 4740

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 4800

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 4860

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4920

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttataaa tctttttaat ttatagtata 4980

tttatgtaag ttttcacgtt gagtaaatag cgaagaagtt gggcccaacc aagtaaaata 5040

agaaggccgg gccattacaa ttaagtcgtc acacaactgg gcttcattga aaaaagcgca 5100

aaaccgattc caggcccgtg ttagcatgaa gactcaactc aaccagagat ttctccctca 5160

tcgcttacag aaaaaagcta tatgctgttt atattgcgaa tctaacagtg tagtttgggc 5220

ctccactaat gtggcaagtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 5280

tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaacaaag caccagtggt ctagtggtag 5340

aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc ggctggtgca cttctgcaaa 5400

gaactccctg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 5460

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta 5520

ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt gcatctcctt gtgacgtctc 5580

aaagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 5640

agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc 5700

acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcagaga gaatcaatag aggtgggttt 5760

tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 5820

ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac 5880

agacccgggt tcgattcccg gctggtgcat gggcatcaag agaggcagag ttttagagct 5940

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 6000

ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg 6060

ggttcgattc ccggctggtg cactaatgga gaaggctctt gggttttaga gctagaaata 6120

gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 6180

ttttttgcaa aattttccag atcgatttct tcttcctctg ttcttcggcg ttcaatttct 6240

ggggttttct cttcgttttc tgtaactgaa acctaaaatt tgacctaaaa aaaatctcaa 6300

ataatatgat tcagtggttt tgtacttttc agttagttga gttttgcagt tccgatgaga 6360

taaaccaata agcttgcatg cctgcaggtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 6420

tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 6480

agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 6540

aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 6600

atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 6660

atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgataac 6720

atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac 6780

caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat 6840

tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa 6900

tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc 6960

aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 7020

tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac 7080

tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacctcg 7140

acctcaacac aacatataca aaacaaacga atctcaagca atcaagcatt ctacttctat 7200

tgcagcaatt taaatcattt cttttaaagc aaaagcaatt ttctgaaaat tttcaccatt 7260

tacgaacgat actcgagtaa tctagatgga ttacaaggac cacgacgggg attacaagga 7320

ccacgacatt gattacaagg atgatgatga caagatggct ccgaagaaga agaggaaggt 7380

tggcatccac ggggtgccag ctgctgacaa gaagtactcg atcggcctcg atattgggac 7440

taactctgtt ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgccctcaa agaagttcaa 7500

ggtcctgggc aacaccgatc ggcattccat caagaagaat ctcattggcg ctctcctgtt 7560

cgacagcggc gagacggctg aggctacgcg gctcaagcgc accgcccgca ggcggtacac 7620

gcgcaggaag aatcgcatct gctacctgca ggagattttc tccaacgaga tggcgaaggt 7680

tgacgattct ttcttccaca ggctggagga gtcattcctc gtggaggagg ataagaagca 7740

cgagcggcat ccaatcttcg gcaacattgt cgacgaggtt gcctaccacg agaagtaccc 7800

tacgatctac catctgcgga agaagctcgt ggactccaca gataaggcgg acctccgcct 7860

gatctacctc gctctggccc acatgattaa gttcaggggc catttcctga tcgaggggga 7920

tctcaacccg gacaatagcg atgttgacaa gctgttcatc cagctcgtgc agacgtacaa 7980

ccagctcttc gaggagaacc ccattaatgc gtcaggcgtc gacgcgaagg ctatcctgtc 8040

cgctaggctc tcgaagtctc ggcgcctcga gaacctgatc gcccagctgc cgggcgagaa 8100

gaagaacggc ctgttcggga atctcattgc gctcagcctg gggctcacgc ccaacttcaa 8160

gtcgaatttc gatctcgctg aggacgccaa gctgcagctc tccaaggaca catacgacga 8220

tgacctggat aacctcctgg cccagatcgg cgatcagtac gcggacctgt tcctcgctgc 8280

caagaatctg tcggacgcca tcctcctgtc tgatattctc agggtgaaca ccgagattac 8340

gaaggctccg ctctcagcct ccatgatcaa gcgctacgac gagcaccatc aggatctgac 8400

cctcctgaag gcgctggtca ggcagcagct ccccgagaag tacaaggaga tcttcttcga 8460

tcagtcgaag aacggctacg ctgggtacat tgacggcggg gcctctcagg aggagttcta 8520

caagttcatc aagccgattc tggagaagat ggacggcacg gaggagctgc tggtgaagct 8580

caatcgcgag gacctcctga ggaagcagcg gacattcgat aacggcagca tcccacacca 8640

gattcatctc ggggagctgc acgctatcct gaggaggcag gaggacttct accctttcct 8700

caaggataac cgcgagaaga tcgagaagat tctgactttc aggatcccgt actacgtcgg 8760

cccactcgct aggggcaact cccgcttcgc ttggatgacc cgcaagtcag aggagacgat 8820

cacgccgtgg aacttcgagg aggtggtcga caagggcgct agcgctcagt cgttcatcga 8880

gaggatgacg aatttcgaca agaacctgcc aaatgagaag gtgctcccta agcactcgct 8940

cctgtacgag tacttcacag tctacaacga gctgactaag gtgaagtatg tgaccgaggg 9000

catgaggaag ccggctttcc tgtctgggga gcagaagaag gccatcgtgg acctcctgtt 9060

caagaccaac cggaaggtca cggttaagca gctcaaggag gactacttca agaagattga 9120

gtgcttcgat tcggtcgaga tctctggcgt tgaggaccgc ttcaacgcct ccctggggac 9180

ctaccacgat ctcctgaaga tcattaagga taaggacttc ctggacaacg aggagaatga 9240

ggatatcctc gaggacattg tgctgacact cactctgttc gaggaccggg agatgatcga 9300

ggagcgcctg aagacttacg cccatctctt cgatgacaag gtcatgaagc agctcaagag 9360

gaggaggtac accggctggg ggaggctgag caggaagctc atcaacggca ttcgggacaa 9420

gcagtccggg aagacgatcc tcgacttcct gaagagcgat ggcttcgcga accgcaattt 9480

catgcagctg attcacgatg acagcctcac attcaaggag gatatccaga aggctcaggt 9540

gagcggccag ggggactcgc tgcacgagca tatcgcgaac ctcgctggct cgccagctat 9600

caagaagggg attctgcaga ccgtgaaggt tgtggacgag ctggtgaagg tcatgggcag 9660

gcacaagcct gagaacatcg tcattgagat ggcccgggag aatcagacca cgcagaaggg 9720

ccagaagaac tcacgcgaga ggatgaagag gatcgaggag ggcattaagg agctggggtc 9780

ccagatcctc aaggagcacc cggtggagaa cacgcagctg cagaatgaga agctctacct 9840

gtactacctc cagaatggcc gcgatatgta tgtggaccag gagctggata ttaacaggct 9900

cagcgattac gacgtcgatc atatcgttcc acagtcattc ctgaaggatg actccattga 9960

caacaaggtc ctcaccaggt cggacaagaa ccggggcaag tctgataatg ttccttcaga 10020

ggaggtcgtt aagaagatga agaactactg gcgccagctc ctgaatgcca agctgatcac 10080

gcagcggaag ttcgataacc tcacaaaggc tgagaggggc gggctctctg agctggacaa 10140

ggcgggcttc atcaagaggc agctggtcga gacacggcag atcactaagc acgttgcgca 10200

gattctcgac tcacggatga acactaagta cgatgagaat gacaagctga tccgcgaggt 10260

gaaggtcatc accctgaagt caaagctcgt ctccgacttc aggaaggatt tccagttcta 10320

caaggttcgg gagatcaaca attaccacca tgcccatgac gcgtacctga acgcggtggt 10380

cggcacagct ctgatcaaga agtacccaaa gctcgagagc gagttcgtgt acggggacta 10440

caaggtttac gatgtgagga agatgatcgc caagtcggag caggagattg gcaaggctac 10500

cgccaagtac ttcttctact ctaacattat gaatttcttc aagacagaga tcactctggc 10560

caatggcgag atccggaagc gccccctcat cgagacgaac ggcgagacgg gggagatcgt 10620

gtgggacaag ggcagggatt tcgcgaccgt caggaaggtt ctctccatgc cacaagtgaa 10680

tatcgtcaag aagacagagg tccagactgg cgggttctct aaggagtcaa ttctgcctaa 10740

gcggaacagc gacaagctca tcgcccgcaa gaaggactgg gatccgaaga agtacggcgg 10800

gttcgacagc cccactgtgg cctactcggt cctggttgtg gcgaaggttg agaagggcaa 10860

gtccaagaag ctcaagagcg tgaaggagct gctggggatc acgattatgg agcgctccag 10920

cttcgagaag aacccgatcg atttcctgga ggcgaagggc tacaaggagg tgaagaagga 10980

cctgatcatt aagctcccca agtactcact cttcgagctg gagaacggca ggaagcggat 11040

gctggcttcc gctggcgagc tgcagaaggg gaacgagctg gctctgccgt ccaagtatgt 11100

gaacttcctc tacctggcct cccactacga gaagctcaag ggcagccccg aggacaacga 11160

gcagaagcag ctgttcgtcg agcagcacaa gcattacctc gacgagatca ttgagcagat 11220

ttccgagttc tccaagcgcg tgatcctggc cgacgcgaat ctggataagg tcctctccgc 11280

gtacaacaag caccgcgaca agccaatcag ggagcaggct gagaatatca ttcatctctt 11340

caccctgacg aacctcggcg cccctgctgc tttcaagtac ttcgacacaa ctatcgatcg 11400

caagaggtac acaagcacta aggaggtcct ggacgcgacc ctcatccacc agtcgattac 11460

cggcctctac gagacgcgca tcgacctgtc tcagctcggg ggcgacaagc ggccagcggc 11520

gacgaagaag gcggggcagg cgaagaagaa gaagtgagct cagagctttc gttcgtatca 11580

tcggtttcga caacgttcgt caagttcaat gcatcagttt cattgcgcac acaccagaat 11640

cctactgagt ttgagtatta tggcattggg aaaactgttt ttcttgtacc atttgttgtg 11700

cttgtaattt actgtgtttt ttattcggtt ttcgctatcg aactgtgaaa tggaaatgga 11760

tggagaagag ttaatgaatg atatggtcct tttgttcatt ctcaaattaa tattatttgt 11820

tttttctctt atttgttgtg tgttgaattt gaaattataa gagatatgca aacattttgt 11880

tttgagtaaa aatgtgtcaa atcgtggcct ctaatgaccg aagttaatat gaggagtaaa 11940

acacttgtag ttgtaccatt atgcttattc actaggcaac aaatatattt tcagacctag 12000

aaaagctgca aatgttactg aatacaagta tgtcctcttg tgttttagac atttatgaac 12060

tttcctttat gtaattttcc agaatccttg tcagattcta atcattgctt tataattata 12120

gttatactca tggatttgta gttgagtatg aaaatatttt ttaatgcatt ttatgacttg 12180

ccaattgatt gacaacgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 12240

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 12300

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgcccgct 12360

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 12420

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 12480

cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 12540

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 12600

aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggaaccacca 12660

tcaaacagga ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc 12720

agggccaggc ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca 12780

ccccagtaca ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt 12840

acaccacaat atatcctgcc accagccagc caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca 12900

aaatcaccac tcgatacagg cagcccatca gtccgggacg gcgtcagcgg gagagccgtt 12960

gtaaggcggc agactttgct catgttaccg atgctattcg gaagaacggc aactaagctg 13020

ccgggtttga aacacggatg atctcgcgga gggtagcatg ttgattgtaa cgatgacaga 13080

gcgttgctgc ctgtgatcaa atatcatctc cctcgcagag atccgaatta tcagccttct 13140

tattcatttc tcgcttaacc gtgacaggct gtcgatcttg agaactatgc cgacataata 13200

ggaaatcgct ggataaagcc gctgaggaag ctgagtggcg ctatttcttt agaagtgaac 13260

gttgacgata tcaactcccc tatccattgc tcaccgaatg gtacaggtcg gggacccgaa 13320

gttccgactg tcggcctgat gcatccccgg ctgatcgacc ccagatctgg ggctgagaaa 13380

gcccagtaag gaaacaactg taggttcgag tcgcgagatc ccccggaacc aaaggaagta 13440

ggttaaaccc gctccgatca ggccgagcca cgccaggccg agaacattgg ttcctgtagg 13500

catcgggatt ggcggatcaa acactaaagc tactggaacg agcagaagtc ctccggccgc 13560

cagttgccag gcggtaaagg tgagcagagg cacgggaggt tgccacttgc gggtcagcac 13620

ggttccgaac gccatggaaa ccgcccccgc caggcccgct gcgacgccga caggatctag 13680

cgctgcgttt ggtgtcaaca ccaacagcgc cacgcccgca gttccgcaaa tagcccccag 13740

gaccgccatc aatcgtatcg ggctacctag cagagcggca gagatgaaca cgaccatcag 13800

cggctgcaca gcgcctaccg tcgccgcgac cccgcccggc aggcggtaga ccgaaataaa 13860

caacaagctc cagaatagcg aaatattaag tgcgccgagg atgaagatgc gcatccacca 13920

gattcccgtt ggaatctgtc ggacgatcat cacgagcaat aaacccgccg gcaacgcccg 13980

cagcagcata ccggcgaccc ctcggcctcg ctgttcgggc tccacgaaaa cgccggacag 14040

atgcgccttg tgagcgtcct tggggccgtc ctcctgtttg aagaccgaca gcccaatgat 14100

ctcgccgtcg atgtaggcgc cgaatgccac ggcatctcgc aaccgttcag cgaacgcctc 14160

catgggcttt ttctcctcgt gctcgtaaac ggacccgaac atctctggag ctttcttcag 14220

ggccgacaat cggatctcgc ggaaatcctg cacgtcggcc gctccaagcc gtcgaatctg 14280

agccttaatc acaattgtca attttaatcc tctgtttatc ggcagttcgt agagcgcgcc 14340

gtgcgtcccg agcgatactg agcgaagcaa gtgcgtcgag cagtgcccgc ttgttcctga 14400

aatgccagta aagcgctggc tgctgaaccc ccagccggaa ctgaccccac aaggccctag 14460

cgtttgcaat gcaccaggtc atcattgacc caggcgtgtt ccaccaggcc gctgcctcgc 14520

aactcttcgc aggcttcgcc gacctgctcg cgccacttct tcacgcgggt ggaatccgat 14580

ccgcacatga ggcggaaggt ttccagcttg agcgggtacg gctcccggtg cgagctgaaa 14640

tagtcgaaca tccgtcgggc cgtcggcgac agcttgcggt acttctccca tatgaatttc 14700

gtgtagtggt cgccagcaaa cagcacgacg atttcctcgt cgatcaggac ctggcaacgg 14760

gacgttttct tgccacggtc caggacgcgg aagcggtgca gcagcgacac cgattccagg 14820

tgcccaacgc ggtcggacgt gaagcccatc gccgtcgcct gtaggcgcga caggcattcc 14880

tcggccttcg tgtaataccg gccattgatc gaccagccca ggtcctggca aagctcgtag 14940

aacgtgaagg tgatcggctc gccgataggg gtgcgcttcg cgtactccaa cacctgctgc 15000

cacaccagtt cgtcatcgtc ggcccgcagc tcgacgccgg tgtaggtgat cttcacgtcc 15060

ttgttgacgt ggaaaatgac cttgttttgc agcgcctcgc gcgggatttt cttgttgcgc 15120

gtggtgaaca gggcagagcg ggccgtgtcg tttggcatcg ctcgcatcgt gtccggccac 15180

ggcgcaatat cgaacaagga aagctgcatt tccttgatct gctgcttcgt gtgtttcagc 15240

aacgcggcct gcttggcctc gctgacctgt tttgccaggt cctcgccggc ggtttttcgc 15300

ttcttggtcg tcatagttcc tcgcgtgtcg atggtcatcg acttcgccaa acctgccgcc 15360

tcctgttcga gacgacgcga acgctccacg gcggccgatg gcgcgggcag ggcaggggga 15420

gccagttgca cgctgtcgcg ctcgatcttg gccgtagctt gctggaccat cgagccgacg 15480

gactggaagg tttcgcgggg cgcacgcatg acggtgcggc ttgcgatggt ttcggcatcc 15540

tcggcggaaa accccgcgtc gatcagttct tgcctgtatg ccttccggtc aaacgtccga 15600

ttcattcacc ctccttgcgg gattgccccg actcacgccg gggcaatgtg cccttattcc 15660

tgatttgacc cgcctggtgc cttggtgtcc agataatcca ccttatcggc aatgaagtcg 15720

gtcccgtaga ccgtctggcc gtccttctcg tacttggtat tccgaatctt gccctgcacg 15780

aataccagcg accccttgcc caaatacttg ccgtgggcct cggcctgaga gccaaaacac 15840

ttgatgcgga agaagtcggt gcgctcctgc ttgtcgccgg catcgttgcg ccacatctag 15900

gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata atattttatt ttctcccaat caggcttgat 15960

ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga 16020

ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat 16080

aaagccactt actttgccat ctttcacaaa gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga 16140

aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc 16200

tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc gcaatccaca tcggccagat cgttattcag 16260

taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc taagctattc gtatagggac aatccgatat 16320

gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc cgcatacagc tcgataatct tttcagggct 16380

ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt 16440

gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag gacctttgga acaggcagct ttccttccag 16500

ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg gtccctttat accggctgtc 16560

cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga 16620

cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc agttttttca attccggtga 16680

tattctcatt ttagccattt attatttcct tcctcttttc tacagtattt aaagataccc 16740

caagaagcta attataacaa gacgaactcc aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt 16800

aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg 16860

acggagccga ttttgaaacc acaattatgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta 16920

tgatggtgtt tttgaggtgc tccagtggct tctgtgtcta tcagctgtcc ctcctgttca 16980

gctactgacg gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg ctatctctgc 17040

tctcactgcc gtaaaacatg gcaactgcag ttcacttaca ccgcttctca acccggtacg 17100

caccagaaaa tcattgatat ggccatgaat ggcgttggat gccgggcaac agcccgcatt 17160

atgggcgttg gcctcaacac gattttacgt cacttaaaaa actcaggccg cagtcggtaa 17220

cctcgcgcat acagccgggc agtgacgtca tcgtctgcgc ggaaatggac gaacagtggg 17280

gctatgtcgg ggctaaatcg cgccagcgct ggctgtttta cgcgtatgac agtctccgga 17340

agacggttgt tgcgcacgta ttcggtgaac gcactatggc gacgctgggg cgtcttatga 17400

gcctgctgtc accctttgac gtggtgatat ggatgacgga tggctggccg ctgtatgaat 17460

cccgcctgaa gggaaagctg cacgtaatca gcaagcgata tacgcagcga attgagcggc 17520

ataacctgaa tctgaggcag cacctggcac ggctgggacg gaagtcgctg tcgttctcaa 17580

aatcggtgga gctgcatgac aaagtcatcg ggcattatct gaacataaaa cactatcaat 17640

aagttggagt cattacccaa ttatgataga atttacaagc tataaggtta ttgtcctggg 17700

tttcaagcat tagtccatgc aagtttttat gctttgccca ttctatagat atattgataa 17760

gcgcgctgcc tatgccttgc cccctgaaat ccttacatac ggcgatatct tctatataaa 17820

agatatatta tcttatcagt attgtcaata tattcaaggc aatctgcctc ctcatcctct 17880

tcatcctctt cgtcttggta gctttttaaa tatggcgctt catagagtaa ttctgtaaag 17940

gtccaattct cgttttcata cctcggtata atcttaccta tcacctcaaa tggttcgctg 18000

ggtttatcgc acccccgaac acgagcacgg cacccgcgac cactatgcca agaatgccca 18060

aggtaaaaat tgccggcccc gccatgaagt ccgtgaatgc cccgacggcc gaagtgaagg 18120

gcaggccgcc acccaggccg ccgccctcac tgcccggcac ctggtcgctg aatgtcgatg 18180

ccagcacctg cggcacgtca atgcttccgg gcgtcgcgct cgggctgatc gcccatcccg 18240

ttactgcccc gatcccggca atggcaagga ctgccagcgc tgccattttt ggggtgaggc 18300

cgttcgcggc cgaggggcgc agcccctggg gggatgggag gcccgcgtta gcgggccggg 18360

agggttcgag aagggggggc accccccttc ggcgtgcgcg gtcacgcgca cagggcgcag 18420

ccctggttaa aaacaaggtt tataaatatt ggtttaaaag caggttaaaa gacaggttag 18480

cggtggccga aaaacgggcg gaaacccttg caaatgctgg attttctgcc tgtggacagc 18540

ccctcaaatg tcaataggtg cgcccctcat ctgtcagcac tctgcccctc aagtgtcaag 18600

gatcgcgccc ctcatctgtc agtagtcgcg cccctcaagt gtcaataccg cagggcactt 18660

atccccaggc ttgtccacat catctgtggg aaactcgcgt aaaatcaggc gttttcgccg 18720

atttgcgagg ctggccagct ccacgtcgcc ggccgaaatc gagcctgccc ctcatctgtc 18780

aacgccgcgc cgggtgagtc ggcccctcaa gtgtcaacgt ccgcccctca tctgtcagtg 18840

agggccaagt tttccgcgag gtatccacaa cgccggcggc cgcggtgtct cgcacacggc 18900

ttcgacggcg tttctggcgc gtttgcaggg ccatagacgg ccgccagccc agcggcgagg 18960

gcaaccagcc cgg 18973

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gttggtttgc ctgtctgtgg tc 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

atatgcttca ctcaacaagc cca 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

atcaaagagt gacatgcaat gcaa 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

cctcttgaga agtaatgttc cctc 24

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

atccgtgccg tctattgttc t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

acactcactg ggggaaagca a 21

<210> 17

<211> 564

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gttggtttgc ctgtctgtgg tctttttata atctttttct acagaagaga aagtgggtaa 60

ttttgtttga gagtggaaat attctctagt gggaatctac taggagtaat ttattttcta 120

taaactaagt aaagtttgga aggtgacaaa aagaaagaca aaaatcttgg aattgtttta 180

gacaaccaag gttttcttgc tcagaatgtc tgttgccttg ttatgggttg tttctccttg 240

tgacgtctca aatgggacaa gtttcatgga atcagtccgg gagggaaacc gtttttttga 300

ttcatcgagg cataggaatt tggtgtccaa tgagagaatc aatatggtgg aaagcaaact 360

aataatggac ggaaattttc tgtacggtct gctattttgg ctactccatc tggagaacgg 420

acgatgacat cggaacagat ggtctatgat gtggttttga ggcaggcagc cttggtgaag 480

aggcaactga gatctaccaa tgagttagaa gtgaagccgg atatacctat tccggggaat 540

ttgggcttgt tgagtgaagc atat 564

<210> 18

<211> 506

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

atcaaagagt gacatgcaat gcaaaaaagc ttattaagtc aacctttggt acgttattaa 60

gttcacataa aattaactag actaaagtga agagcggggt ccatttattt gtgttgtctc 120

tctatttatt ggcatttcta ttggtgaaat gagactaatt ttcattgcct tttgcttctc 180

cattttgtga taataataat aatgggaaga acaccttgtt gtgaaaaagt gggcatgaga 240

ggcagatgga ctgcagaaga agatcaaatt ctcactaatt atattatttc taatggagaa 300

gtggaggtcg ttacctaaaa atgccggtac gattacctac taatctttta ttttaatttg 360

aaatttaaaa tttttttctt cgtttaacag tttttttata atattttatt tcgaaggatt 420

attgagatgc ggaaagagtt gtagactacg atggattaat tatttgaggt ctgatctcaa 480

gagagggaac attacttctc aagagg 506

<210> 19

<211> 842

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

atccgtgccg tctattgttc tcaacttaaa tactattatc taaagcaata tcaagctcat 60

gacgcatgtc gaaatcccac acatcacatg ctatactttt accactaaat tattagctgc 120

atattcattt agagaagttc gaaaatatgt tttttttaaa tcttgaatct gcatctacat 180

cgtagtagaa cttctgttga gaaaagtgga aatggtatgt ttgatttgca gttgcaaggt 240

tggtataaca gacttcaaag agatgaagtt gttgcagagt ggaagaaagt aaaagggaag 300

atgtcacttc atgtccattg ccacattagt ggaggccatt ttatgttaga cttatttgct 360

agactcagaa actacatctt ctgcaaagaa ctcccctgtg gtaagttcat aataaattgc 420

caccatatct atgtatgtat gtcgttcgaa cttcccaaaa ttgttattgg tcctgtgtca 480

gatccttctt ttggaggatc aaacacacaa ccataggtta atagtaccat attttcataa 540

cttgtgtttt tattttgttt gcattaggtt ctcaaggctt ttgttcatgg agatgagaat 600

ttactaagga attatccaga gttacaagaa gctttagttt gggtatattt tcattcaaac 660

attcaagaat tcaacaaagt agaatgttgg ggtccactca gagatgcaac ttccccctca 720

tcttcttctg gtggggtagg tggggtgaag agtacaagtt ttacaagcaa tagcaacaaa 780

aaatgggaat taccaaagcc ttgtgaagag gcttgtgcct gttgctttcc cccagtgagt 840

gt 842

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

ttgacaagct gttcatccag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 21

ccttcgtaat ctcggtgttc 20

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

atatatggtc tcgtttggcc tccactaatg tggcaagttt tagagctaga aatagc 56

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

attattggtc tcgctttgca gaagtgcacc agccgggaat cgaa 44

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

attattggtc tcgaaagaac tccctggttt tagagctaga aatagc 46

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

attattggtc tcggtcacaa ggagatgcac cagccgggaa tcgaa 45

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

attattggtc tcgtgacgtc tcaaagtttt agagctagaa atagc 45

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

attattggtc tcgtgattct ctctgcacca gccgggaatc gaa 43

<210> 28

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

attattggtc tcgatcaata gaggtgggtt ttagagctag aaatagc 47

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

attattggtc tcggcccact ttttctgcac cagccgggaa tcgaa 45

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

attattggtc tcggggcatc aagaggtttt agagctagaa atagc 45

<210> 31

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

attattggtc tcgaaaccca agagccttct ccattagtgc accagccggg aatcgaa 57

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

gacctgcagg catgcaagct 20

Claims (10)

1.一种番茄多果色材料的制备方法，为如下方法1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：降低受体番茄材料基因组中的果实颜色调控蛋白PSY1、MYB12和SGR1中至少一种的活性或含量，得到目的番茄多果色材料；

2)所示的方法包括如下步骤：对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1中至少一种进行基因编辑，得到目的番茄多果色材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述降低受体番茄材料基因组中的果实颜色调控蛋白PSY1、MYB12和SGR1中至少一种的含量，或，所述对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1中至少一种进行基因编辑，均通过CRISPR/Cas9系统对所述受体番茄材料基因组中的果实颜色调控基因PSY1、MYB12和SGR1中至少一种进行基因编辑。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述蛋白PSY1为序列1所示的PSY1基因编码的蛋白；

所述蛋白MYB12为序列2所示的MYB12基因编码的蛋白；

所述蛋白SGR1为序列3所示的SGR1基因编码的蛋白；

或，所述基因PSY1的核苷酸序列为序列1；

或，所述基因MYB12的核苷酸序列为序列2；

或，所述基因SGR1的核苷酸序列为序列3。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统中，PSY1基因编辑的sgRNAP1、PSY1基因编辑的sgRNAP2、MYB12基因编辑的sgRNAM1、MYB12基因编辑的sgRNAM2、SGR1基因编辑的sgRNAS1和SGR1基因编辑的sgRNAS2；

所述sgRNAP1的靶序列为序列6所示的DNA分子；

所述sgRNAP2的靶序列为序列7所示的DNA分子；

所述sgRNAM1的靶序列为序列8所示的DNA分子；

所述sgRNAM2的靶序列为序列9所示的DNA分子；

所述sgRNAS1的靶序列为序列4所示的DNA分子；

所述sgRNAS2的靶序列为序列5所示的DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统包括含有sgRNAP1编码基因、sgRNAP2编码基因、sgRNAM1编码基因、sgRNAM2编码基因、sgRNAS1编码基因、sgRNAS2编码基因和cas9基因的重组载体；

所述sgRNAS1编码基因为序列10第5237-5312位所示的DNA分子；

所述sgRNAS2编码基因为序列10第5410-5485位所示的DNA分子；

所述sgRNAP1编码基因为序列10第5583-5658位所示的DNA分子；

所述sgRNAP2编码基因为序列10第5754-5829位所示的DNA分子；

所述sgRNAM1编码基因为序列10第5926-6001位所示的DNA分子；

所述sgRNAM2编码基因为序列10第6099-6174位所示的DNA分子；

或，所述Cas9蛋白的编码基因为序列10第7282-11553所示的DNA分子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编辑为向所述受体番茄材料中导入所述重组载体。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：

每种所述方法中，在向所述受体番茄材料中导入所述重组载体后还包括如下步骤：选取PSY1、MYB12、SGR1三个基因至少一个突变的植株，为目的番茄多果色材料；

所述突变为杂合突变或纯合突变。

8.一种无外源基因插入的番茄多果色材料的获得方法，包括如下步骤：

1)从权利要求1-7任一所述方法获得目的番茄多果色材料中选取PSY1、MYB12、SGR1这3个基因均突变的T0代植株种子，播种，得到T1代植株；再从所述T1代植株中选取无外源DNA片段且PSY1、MYB12、SGR1三个基因均为纯合突变的植株，记作T1代PSY1、MYB12、SGR1三个基因纯合突变植株；

2)再将所述T1代PSY1、MYB12、SGR1三个基因纯合突变植株与其背景受体番茄杂交，得到F1代，再自交，得到F2代；从F2代中选取PSY1、MYB12、SGR1三个基因均纯合，且至少一个突变的植株，作为无外源基因插入的番茄多果色材料。

9.权利要求1-7任一所述的方法或权利要求8所述的方法在培育番茄多果色杂交种中的应用。

10.如下(1)-(3)中任一种生物材料：

(1)权利要求4中所述CRISPR/Cas9系统；

(2)权利要求5中所述重组载体；

(3)含有权利要求5中所述重组载体的微生物转化体；

或，所述生物材料在培育番茄多果色材料中的应用；

或，所述生物材料在番茄育种中的应用；

或，一种鉴定或鉴定待测番茄是否为番茄多果色材料或其子代的产品，包括如下1)-3)中的任一种：

1)引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；

所述引物1由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；

所述引物2由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；

所述引物3由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；

所述引物4由序列20所示的单链DNA分子和序列21所示的单链DNA分子组成；

2)含有1)所述的引物对1、引物对2、引物对3和引物对4的PCR试剂；

3)含有1)所述的引物对1、引物对2引物对3和引物对4或2)所述的PCR试剂的试剂盒。

Images