JP2659459B2 - 生物学的に安全な植物形質転換システム - Google Patents
生物学的に安全な植物形質転換システムInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、米国農務省（USDA）により認可された登録
番号86−CRCR−１−1991及び88−37234−3665を以て、
政府の援助を受けて行われ、政府が本発明についての権
利を有する。
番号86−CRCR−１−1991及び88−37234−3665を以て、
政府の援助を受けて行われ、政府が本発明についての権
利を有する。
発明の背景 本発明は、トランスポゾンの使用を通じて遺伝子導入
植物を作製する方法に関する。より明確には、最少量の
補助的な外来遺伝物質を含む形質転換した植物を提供す
るシステムに関する。
植物を作製する方法に関する。より明確には、最少量の
補助的な外来遺伝物質を含む形質転換した植物を提供す
るシステムに関する。
遺伝子導入植物の作製は、無数の望ましい特性を植物
界に組み込み得るという見込みによって、画期的な分野
を確実に開くものである。例えば、化学殺虫剤の使用に
より招かれる環境問題及び他の損害のために、害虫に対
して、本来的に、抵抗力を有する植物を開発することは
重要である。
界に組み込み得るという見込みによって、画期的な分野
を確実に開くものである。例えば、化学殺虫剤の使用に
より招かれる環境問題及び他の損害のために、害虫に対
して、本来的に、抵抗力を有する植物を開発することは
重要である。
しかし、通常の形質転換手法の使用では、植物細胞10
0万個当たり約１個の細胞のみが形質転換される。次い
で形質転換の問題は、この形質転換されていない多くの
細胞の中から形質転換された単一細胞の同定に移され
る。この問題は、所望の遺伝子へある遺伝子、典型的に
は抗生物質抵抗性に関したバクテリア遺伝子を物理的に
連結することによって一般的に処理されてきた。所望の
遺伝子を取り込んだ細胞は、次いで特定の抗生物質を含
んだ培地における成長能により選択され得る。形質転換
されていない植物細胞は耐性遺伝子を含まず、従って、
成長しない。
0万個当たり約１個の細胞のみが形質転換される。次い
で形質転換の問題は、この形質転換されていない多くの
細胞の中から形質転換された単一細胞の同定に移され
る。この問題は、所望の遺伝子へある遺伝子、典型的に
は抗生物質抵抗性に関したバクテリア遺伝子を物理的に
連結することによって一般的に処理されてきた。所望の
遺伝子を取り込んだ細胞は、次いで特定の抗生物質を含
んだ培地における成長能により選択され得る。形質転換
されていない植物細胞は耐性遺伝子を含まず、従って、
成長しない。
しかし、最終品種中の抗生物質耐性遺伝子や他の補助
配列の存在は、特に望ましくない。これらの補助配列
は、形質転換過程において必要であるが、それらは最終
品種には積極的に寄与せず、事実上、消費者の要求を損
なう。一般的認識として、かなり離れた分類学上の群の
間での配列の転移は、より近い関連群の間での転移より
も多大の問題を有している。従って、バクテリアからの
配列を産生（bearing）する遺伝子導入品種は、同一属
での野生種からの配列を産生するものよりも異論のある
ところであろう。遺伝子導入植物の一般認識が増えるに
伴い、品種からのバクテリア耐性遺伝子及び他の補助配
列を除去することかかなり重要となっている。望ましく
ない遺伝物質の挿入の生物学的効果はわかっていない。
遺伝子導入植物は、従って、補助的遺伝物質の関連した
不確定さのために、多くの場面で抵抗と懐疑とに直面し
てきた。
配列の存在は、特に望ましくない。これらの補助配列
は、形質転換過程において必要であるが、それらは最終
品種には積極的に寄与せず、事実上、消費者の要求を損
なう。一般的認識として、かなり離れた分類学上の群の
間での配列の転移は、より近い関連群の間での転移より
も多大の問題を有している。従って、バクテリアからの
配列を産生（bearing）する遺伝子導入品種は、同一属
での野生種からの配列を産生するものよりも異論のある
ところであろう。遺伝子導入植物の一般認識が増えるに
伴い、品種からのバクテリア耐性遺伝子及び他の補助配
列を除去することかかなり重要となっている。望ましく
ない遺伝物質の挿入の生物学的効果はわかっていない。
遺伝子導入植物は、従って、補助的遺伝物質の関連した
不確定さのために、多くの場面で抵抗と懐疑とに直面し
てきた。
これらの望ましくない配列の存在は、また、この品種
を市場に投入する際の規制手続を面倒なものにし得る。
通常の公的な規制機関は、ある程度、宿主生物と挿入配
列の源との間の分類学上の差異の点を遺伝子導入生物の
開放に必要な吟味の度合いの基礎としている。
を市場に投入する際の規制手続を面倒なものにし得る。
通常の公的な規制機関は、ある程度、宿主生物と挿入配
列の源との間の分類学上の差異の点を遺伝子導入生物の
開放に必要な吟味の度合いの基礎としている。
望ましくない補助配列を除去する確かな方法は、この
ように一般的な認識の増大と規制手続の単純化によっ
て、商業的な存続能力を改善するであろう。従来の技術
は、この問題の重要性を理解していなかっただけでな
く、解決策を提供するために機能しなかった。
ように一般的な認識の増大と規制手続の単純化によっ
て、商業的な存続能力を改善するであろう。従来の技術
は、この問題の重要性を理解していなかっただけでな
く、解決策を提供するために機能しなかった。
一般に、改良された作物変種（varieties）の開発の
コストは極めて高い。従って、競合する繁殖業者による
使用から商業的品種を守ることが肝要である。変種保護
の通常の方法は、品種の特徴付ける物理的外見及び生化
学的特質の詳細な記述を必要とする。しかし、このタイ
プの特徴付けは主観的であり、生理学的特質が異なる成
長条件下で簡単に変化してしまうため、実施が困難であ
る。更に、ハイブリッドの組み合わせで親株としての保
護変種の使用は、ハイブリッド中で親の特徴が隠されて
しまうため、記述された方法によって検出することは、
事実上不可能である。従って、登録品種を明確に同定す
る確かな方が必要であるが、この技術は得られていな
い。
コストは極めて高い。従って、競合する繁殖業者による
使用から商業的品種を守ることが肝要である。変種保護
の通常の方法は、品種の特徴付ける物理的外見及び生化
学的特質の詳細な記述を必要とする。しかし、このタイ
プの特徴付けは主観的であり、生理学的特質が異なる成
長条件下で簡単に変化してしまうため、実施が困難であ
る。更に、ハイブリッドの組み合わせで親株としての保
護変種の使用は、ハイブリッド中で親の特徴が隠されて
しまうため、記述された方法によって検出することは、
事実上不可能である。従って、登録品種を明確に同定す
る確かな方が必要であるが、この技術は得られていな
い。
発明の概要 本発明は、対象遺伝子（gene of interest）を含み、
かつ、外来生補助核酸を含まない遺伝子導入植物の作製
方法に関するものである。従ってこれらの方法は、所望
の遺伝子を含有するが、植物を形質転換するために使用
されるベクター配列及び／又はマーカー配列を含まない
植物の作製にあてることができる。このような植物を形
質転換するための方法は、Dsエレメントとトランスポゼ
ース遺伝子とが分離したトランスポゾンと外来性補助核
酸とを含む、DNAコンストラクト上の遺伝子の導入によ
り、対象遺伝子で植物を形質転換すること;F1又はより
離れた世代の子孫を得るために、自己交雑（self−cros
sig）を通して又は他の植物とによって、形質転換植物
を交雑すること；及び対象遺伝子を運び、補助核酸を含
まない子孫を選択する方法を利用することを要求する。
このような子孫は、ポリメラーゼ連鎖反応法及び当業の
技術分野において通常の他の方法で使用を経て、サザン
ハイブリダイゼーション法により生化学的に検出され得
る。
かつ、外来生補助核酸を含まない遺伝子導入植物の作製
方法に関するものである。従ってこれらの方法は、所望
の遺伝子を含有するが、植物を形質転換するために使用
されるベクター配列及び／又はマーカー配列を含まない
植物の作製にあてることができる。このような植物を形
質転換するための方法は、Dsエレメントとトランスポゼ
ース遺伝子とが分離したトランスポゾンと外来性補助核
酸とを含む、DNAコンストラクト上の遺伝子の導入によ
り、対象遺伝子で植物を形質転換すること;F1又はより
離れた世代の子孫を得るために、自己交雑（self−cros
sig）を通して又は他の植物とによって、形質転換植物
を交雑すること；及び対象遺伝子を運び、補助核酸を含
まない子孫を選択する方法を利用することを要求する。
このような子孫は、ポリメラーゼ連鎖反応法及び当業の
技術分野において通常の他の方法で使用を経て、サザン
ハイブリダイゼーション法により生化学的に検出され得
る。
対象遺伝子は、トランスポゾン内でクローン化される
こともでき、そのため、転位の際にベクターとマーカー
配列とから切り離される。次いで、ベクターとマーカー
配列が出現しない子孫を選択することによって、ベクタ
ーとマーカー配列を除去するように交雑が行われる。あ
るいは、例えばマーカー配列のような望ましくない配列
は、トランスポゾンの外側のDNAコンストラクト上の対
象遺伝子と共に、トランスポゾン内でクローン化するこ
とができ、そのため、転位の際にマーカー配列は、対象
遺伝子から離される。次いで、特定の子孫を選択するこ
とによって、マーカー配列又は望ましくないDNAを除去
するように交雑が行われ得る。
こともでき、そのため、転位の際にベクターとマーカー
配列とから切り離される。次いで、ベクターとマーカー
配列が出現しない子孫を選択することによって、ベクタ
ーとマーカー配列を除去するように交雑が行われる。あ
るいは、例えばマーカー配列のような望ましくない配列
は、トランスポゾンの外側のDNAコンストラクト上の対
象遺伝子と共に、トランスポゾン内でクローン化するこ
とができ、そのため、転位の際にマーカー配列は、対象
遺伝子から離される。次いで、特定の子孫を選択するこ
とによって、マーカー配列又は望ましくないDNAを除去
するように交雑が行われ得る。
あるいは、ゲノムにDNAフィンガープリンティングコ
ンストラクトを挿入することによって、植物のゲノム内
に分子フィンガープリントを創生すること、ゲノム内の
外来DNAの挿入の特徴部位を検出すること、及び挿入の
特徴部位を記録することを通じて、植物の子孫を同定す
るための方法も提案される。次いで、このような植物か
ら派生されると思われる二次植物（次世代植物）からの
DNAが単離され、挿入の特徴部位の存在又は不在が検出
される。DNAフィンガープリンティングコンストラクト
は、トランスポゾンエレメントを含み得る。
ンストラクトを挿入することによって、植物のゲノム内
に分子フィンガープリントを創生すること、ゲノム内の
外来DNAの挿入の特徴部位を検出すること、及び挿入の
特徴部位を記録することを通じて、植物の子孫を同定す
るための方法も提案される。次いで、このような植物か
ら派生されると思われる二次植物（次世代植物）からの
DNAが単離され、挿入の特徴部位の存在又は不在が検出
される。DNAフィンガープリンティングコンストラクト
は、トランスポゾンエレメントを含み得る。
なお、本発明において「コンストラクト」とは、目的
となる機能を有するように意図的に組み合わせて構築
（コンストラクション）されたDNA構築物をいう。
となる機能を有するように意図的に組み合わせて構築
（コンストラクション）されたDNA構築物をいう。
本発明において「トランスポゾンエレメント」とは転
位因子（転位可能エレメント）と同義であり、細胞内に
おいて一方の部位から他方の部位へ効率よく移動するこ
とができる不連続なDNAセグメントをいう。従って、普
通、転位に必要な機能性物質（タンパク質）をコードし
ている。また、「トランスポゾン」は、転位のための必
要なコード化された機能物質の他に、転位に関係しない
機能を有する遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含
む。従って、トランスポゾンは、転位因子と１以上の別
の遺伝子を含む。
位因子（転位可能エレメント）と同義であり、細胞内に
おいて一方の部位から他方の部位へ効率よく移動するこ
とができる不連続なDNAセグメントをいう。従って、普
通、転位に必要な機能性物質（タンパク質）をコードし
ている。また、「トランスポゾン」は、転位のための必
要なコード化された機能物質の他に、転位に関係しない
機能を有する遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含
む。従って、トランスポゾンは、転位因子と１以上の別
の遺伝子を含む。
図面の簡単な説明 図１ プラスミドpMACに含まれるAcの構造が示されてい
る。プラスミドは、Ac7（ベーレンス（Behrens）ら,Mo
l.Gen.Genet.,194:346−347,1984）を含むSal I−Pst I
制限フラグメントをpMON200（フラリー（Fraley）ら,Bi
otech.3:629−635,1985）のXho部位にクローニングする
ことによってpMON200から得た。ごく少数のキーとなる
制限酵素認識部位及びこれらのマップポジションを示し
た。マップの方向は、植物ゲノムへの挿入後のプラスミ
ドを示している。
る。プラスミドは、Ac7（ベーレンス（Behrens）ら,Mo
l.Gen.Genet.,194:346−347,1984）を含むSal I−Pst I
制限フラグメントをpMON200（フラリー（Fraley）ら,Bi
otech.3:629−635,1985）のXho部位にクローニングする
ことによってpMON200から得た。ごく少数のキーとなる
制限酵素認識部位及びこれらのマップポジションを示し
た。マップの方向は、植物ゲノムへの挿入後のプラスミ
ドを示している。
線の下にボックスは、プラスミドのキーとなる部分を
示している。LB及びRBは、各々、Ｔ−DNAの左及び右境
界線を示している。LIH領域は、無力化した（disarme
d）TiプラスミドpGV3111−SE（フラリーら,1985）に組
み込むために、pMON200に必要なホモロジー領域であ
る。Ac7遺伝子は、pMON200のポリリンカーにクローン化
された全Acエレメントを表している。Ac7の両側の点線
は、Acエレメントに隣接するトウモロコシ（maize）DNA
を表している。NPTIIは、植物細胞中で発現するよう設
計されたネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺
伝子があり、カナマイシン含有培地中で生育を可能にす
る。これは、最終品種中で望ましくない選択マーカー遺
伝子である。SP/SMは、ストレプトマイシン及びスペク
チノマイシン耐性をコードするバクテリア遺伝子で、ア
グロバクテリウム（Agrobacteium）中でpMON200を維持
するために使用される。NOSは、ノパリン合成酵素をコ
ードする遺伝子であり、形質転換現象を確認するために
使用される。これら様々の成分は、フラリーら（1985）
の文献に更に述べられている。
示している。LB及びRBは、各々、Ｔ−DNAの左及び右境
界線を示している。LIH領域は、無力化した（disarme
d）TiプラスミドpGV3111−SE（フラリーら,1985）に組
み込むために、pMON200に必要なホモロジー領域であ
る。Ac7遺伝子は、pMON200のポリリンカーにクローン化
された全Acエレメントを表している。Ac7の両側の点線
は、Acエレメントに隣接するトウモロコシ（maize）DNA
を表している。NPTIIは、植物細胞中で発現するよう設
計されたネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺
伝子があり、カナマイシン含有培地中で生育を可能にす
る。これは、最終品種中で望ましくない選択マーカー遺
伝子である。SP/SMは、ストレプトマイシン及びスペク
チノマイシン耐性をコードするバクテリア遺伝子で、ア
グロバクテリウム（Agrobacteium）中でpMON200を維持
するために使用される。NOSは、ノパリン合成酵素をコ
ードする遺伝子であり、形質転換現象を確認するために
使用される。これら様々の成分は、フラリーら（1985）
の文献に更に述べられている。
図２ プラスミドpDs203は、pMON200の誘導体で、pMON2
00のEcoR I部位での、450bpのDSIエレメント及び隣接す
るトウモロコシDNAを含んでいる。Ds203部分はDsと書か
れたボックスとして示され、Dsに隣接する点線は、トウ
モロコシDNAを示している。
00のEcoR I部位での、450bpのDSIエレメント及び隣接す
るトウモロコシDNAを含んでいる。Ds203部分はDsと書か
れたボックスとして示され、Dsに隣接する点線は、トウ
モロコシDNAを示している。
図３ プラスミドpDs202は、内部のHind III部位を境界
としたAcの中央の1.6kbを、β−ガラクトシダーゼ（Bga
l）をコードしているバクテリア遺伝子と置換すること
によって構築された。pDs202の残りは、実質的にpMACと
同一である。
としたAcの中央の1.6kbを、β−ガラクトシダーゼ（Bga
l）をコードしているバクテリア遺伝子と置換すること
によって構築された。pDs202の残りは、実質的にpMACと
同一である。
図４ ベクターpTs105は、pMON200のポリリンカー部位
にクローン化されたAc7のトランスポゼース（transposa
se）コード化領域を含んでいる。pTs105の両末端は、こ
のトランスポゼース遺伝子の更なる転位を防ぐために、
酵素活性的に除かれている。
にクローン化されたAc7のトランスポゼース（transposa
se）コード化領域を含んでいる。pTs105の両末端は、こ
のトランスポゼース遺伝子の更なる転位を防ぐために、
酵素活性的に除かれている。
図５ プラスミドpTV101は、同一pMON200誘導体上にト
ランスポゼース遺伝子とDs成分の両方を含んでいる。Ds
エレメントの中央部3200の位置に、pTV101のこの領域で
迅速にクローニングすることができるように、ポリリン
カー部位が挿入されている。
ランスポゼース遺伝子とDs成分の両方を含んでいる。Ds
エレメントの中央部3200の位置に、pTV101のこの領域で
迅速にクローニングすることができるように、ポリリン
カー部位が挿入されている。
図６ プラスミドpBT101は、pTV101のポリリンカーにク
ローン化されたバチルス・スリンジエンシス・ヴォー・
カルスタキ（Bacillus thuringiensis var.kurstaki）
から単離された4kbの昆虫制御タンパク質遺伝子（B.t.
k.）を含み得る。このプラスミドは、安定なトランスポ
ゼースコード化遺伝子も、Dsの逆方向反復配列（invert
ed repeats）に隣接したB.k.t.遺伝子も含み得る。
ローン化されたバチルス・スリンジエンシス・ヴォー・
カルスタキ（Bacillus thuringiensis var.kurstaki）
から単離された4kbの昆虫制御タンパク質遺伝子（B.t.
k.）を含み得る。このプラスミドは、安定なトランスポ
ゼースコード化遺伝子も、Dsの逆方向反復配列（invert
ed repeats）に隣接したB.k.t.遺伝子も含み得る。
図７ プラスミドpBT201は、選択マーカーであるNPTII
及びSP/SMが、DSの逆方向反復配列の内部に置かれたベ
クターとして、描かれている。この配座（confomatio
n）は、B.k.t.遺伝子を再配置することなく、所望の遺
伝子導入植物から選択マーカー可能遺伝子の除去を行う
ことができる。
及びSP/SMが、DSの逆方向反復配列の内部に置かれたベ
クターとして、描かれている。この配座（confomatio
n）は、B.k.t.遺伝子を再配置することなく、所望の遺
伝子導入植物から選択マーカー可能遺伝子の除去を行う
ことができる。
詳細な説明 本発明は、所望の外来遺伝子で形質転換した植物か
ら、ベクター配列のような望ましくない核酸の除去のた
めの方法を提供する。従って、これらの方法では、外来
の補助配列を含まない遺伝子導入植物が提供される。こ
の補助核酸は、形質転換中では普通、対象遺伝子に付随
している外来核酸である。形質転換された植物中の補助
核酸配列の削減は、遺伝子導入植物についての一般的な
懸念がかなり減少するであろう。この植物を試験すると
きに遭遇する規制の問題が減らすことができ、この植物
の商業面における安全性についての消費者の懸念を軽減
する事ができるだろう。
ら、ベクター配列のような望ましくない核酸の除去のた
めの方法を提供する。従って、これらの方法では、外来
の補助配列を含まない遺伝子導入植物が提供される。こ
の補助核酸は、形質転換中では普通、対象遺伝子に付随
している外来核酸である。形質転換された植物中の補助
核酸配列の削減は、遺伝子導入植物についての一般的な
懸念がかなり減少するであろう。この植物を試験すると
きに遭遇する規制の問題が減らすことができ、この植物
の商業面における安全性についての消費者の懸念を軽減
する事ができるだろう。
I.一般法 通常、ここで使用の命名法及び後述の組み換えDNA技
術における実験手法は、当業の技術分野でかなりよく知
られ、通常用いられているものである。標準的な技術
が、クローニング、DNA及びRNAの単離、増幅及び精製に
用いられる。DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エン
ドヌクレアーゼ及び類似物を含む通常の酵素的反応は、
製造者規格（manufacture's specifications）に従って
実施された。これらの技術及び多くの他の技術は、サム
ブロック（Sambrook）らのMolecular Cloning−A Labor
atory Manual,コールドスプリングハーバーラボラトラ
ー，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州（19
89）に従って行った。このマニュアルは、以下“サムブ
ロック”呼ぶ。他の一般参考文献はこの文書のいたると
ころに提示される。この中の手法は、当業の技術分野に
おいてよく知られていると信じられており、また読み手
の便宜のために提供される。その中に含まれる全ての情
報は、援用され本文の一部とする。
術における実験手法は、当業の技術分野でかなりよく知
られ、通常用いられているものである。標準的な技術
が、クローニング、DNA及びRNAの単離、増幅及び精製に
用いられる。DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エン
ドヌクレアーゼ及び類似物を含む通常の酵素的反応は、
製造者規格（manufacture's specifications）に従って
実施された。これらの技術及び多くの他の技術は、サム
ブロック（Sambrook）らのMolecular Cloning−A Labor
atory Manual,コールドスプリングハーバーラボラトラ
ー，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州（19
89）に従って行った。このマニュアルは、以下“サムブ
ロック”呼ぶ。他の一般参考文献はこの文書のいたると
ころに提示される。この中の手法は、当業の技術分野に
おいてよく知られていると信じられており、また読み手
の便宜のために提供される。その中に含まれる全ての情
報は、援用され本文の一部とする。
II.植物形質転換 A.DNAコンストラクト 本発明の目的のために、植物形質転換に用いるDNAコ
ンストラクトが作製される。この“DNAコンストラク
ト”とは、対象遺伝子、外来性補助核酸及びトランスポ
ゾン（これらは後で全て定義される）を含み、このよう
な対象遺伝子も望ましくない補助配列も、ひとたび転位
が起こればトランスポゾンと共におそらく転位されるで
あろう。
ンストラクトが作製される。この“DNAコンストラク
ト”とは、対象遺伝子、外来性補助核酸及びトランスポ
ゾン（これらは後で全て定義される）を含み、このよう
な対象遺伝子も望ましくない補助配列も、ひとたび転位
が起こればトランスポゾンと共におそらく転位されるで
あろう。
また、“DNAフィンガープリンティングコンストラク
ト”は、トランスポゾン又は他の外来性DNAを含むもの
が用いられ得る。標的植物のゲノムへのDNAのランダム
な挿入は、この植物の分子フィンガープリントを作製す
るために用いることができる。DNAの特徴的な挿入部位
は、この植物又はその子孫を同定するために用いられ得
るフラグメント長多型（restriction fragment length
polymorphism）を創生するであろう。この方法は、他で
は、分子レベルで同定することができない登録品種を特
徴付けるために特に有効である。
ト”は、トランスポゾン又は他の外来性DNAを含むもの
が用いられ得る。標的植物のゲノムへのDNAのランダム
な挿入は、この植物の分子フィンガープリントを作製す
るために用いることができる。DNAの特徴的な挿入部位
は、この植物又はその子孫を同定するために用いられ得
るフラグメント長多型（restriction fragment length
polymorphism）を創生するであろう。この方法は、他で
は、分子レベルで同定することができない登録品種を特
徴付けるために特に有効である。
植物のゲノムへ所望の遺伝子を挿入することの利益は
無限である。“所望の（望ましい）遺伝子”又は“対象
遺伝子”は、所望の特性又は同定可能な表現型をコード
し、かつ、その植物本来のものでない如何なる遺伝子も
該当する。好ましくは、この遺伝子は、農学的（agrono
mically）に有効な特性又は表現型をコードしている。
例えば、対象遺伝子は、病気抵抗性をコードする遺伝子
（例えば、ウィルス抵抗性、菌類抵抗性又はバチルス・
スリンジエンシスのエンドトキシンの遺伝子）、特殊な
生合成回路（例えば、果実成熟、油、色素生合成又はで
んぷん代謝に関連した遺伝子）に関連した遺伝子、又は
環境抵抗性（例えば、耐塩性、干ばつ抵抗性又は嫌気性
条件に対する抵抗性）に関連する遺伝子を含むことがで
きる。所望の遺伝子自身の性質は、本発明においては重
要でない。これらの遺伝子及びそれらの有効性の例は発
表されており、当業者は、更なる所望の遺伝子もまた同
定し、単離し得るであろう。援用して本文の一部とした
ワイジング（Weising）らのAnn.Rev.Gen.,22:421−478,
（1988）を参照のこと。
無限である。“所望の（望ましい）遺伝子”又は“対象
遺伝子”は、所望の特性又は同定可能な表現型をコード
し、かつ、その植物本来のものでない如何なる遺伝子も
該当する。好ましくは、この遺伝子は、農学的（agrono
mically）に有効な特性又は表現型をコードしている。
例えば、対象遺伝子は、病気抵抗性をコードする遺伝子
（例えば、ウィルス抵抗性、菌類抵抗性又はバチルス・
スリンジエンシスのエンドトキシンの遺伝子）、特殊な
生合成回路（例えば、果実成熟、油、色素生合成又はで
んぷん代謝に関連した遺伝子）に関連した遺伝子、又は
環境抵抗性（例えば、耐塩性、干ばつ抵抗性又は嫌気性
条件に対する抵抗性）に関連する遺伝子を含むことがで
きる。所望の遺伝子自身の性質は、本発明においては重
要でない。これらの遺伝子及びそれらの有効性の例は発
表されており、当業者は、更なる所望の遺伝子もまた同
定し、単離し得るであろう。援用して本文の一部とした
ワイジング（Weising）らのAnn.Rev.Gen.,22:421−478,
（1988）を参照のこと。
本発明に使用のトランスポゾンは、ゲノム内の新しい
位置に移動又はジャンプする能力を有するDNAの配列の
ことを言う。２つの成分、即ち、転位を触媒するトラン
スポゼース酵素と、酵素が働くトランスポゾンの末端に
存在するヌクレオチド配列とが、転位に必要である。ト
ランスポゾンは、自律性（autonomous）と非自律性（no
n−autonomous）との両方である。自律性トランスポゾ
ンは、転位することと非自律性エレメントの転位を触媒
することの両方をすることができるものである。自律性
トランスポゾンの例は、トウモロコシから単離されたAc
エレメントとSpmトランスポゾンであり、これらは全て
クローン化され、当業の技術分野では詳述されている。
例えば、援用して本文の一部とした、米国特許第4,732,
856号及びギール（Gierl）らのPlant Mol.Biol.,13:261
−266（1989）を参照のこと。
位置に移動又はジャンプする能力を有するDNAの配列の
ことを言う。２つの成分、即ち、転位を触媒するトラン
スポゼース酵素と、酵素が働くトランスポゾンの末端に
存在するヌクレオチド配列とが、転位に必要である。ト
ランスポゾンは、自律性（autonomous）と非自律性（no
n−autonomous）との両方である。自律性トランスポゾ
ンは、転位することと非自律性エレメントの転位を触媒
することの両方をすることができるものである。自律性
トランスポゾンの例は、トウモロコシから単離されたAc
エレメントとSpmトランスポゾンであり、これらは全て
クローン化され、当業の技術分野では詳述されている。
例えば、援用して本文の一部とした、米国特許第4,732,
856号及びギール（Gierl）らのPlant Mol.Biol.,13:261
−266（1989）を参照のこと。
自律性トランスポゾンは、トランスポゼースのための
配列とトランスポゾンの末端（“Dsエレメント”）でト
ランスポゼース酵素により認識される配列を含んでい
る。トランスポゼースの配列（又はトランスポゼース遺
伝子）は、末端配列と独立して活性化する。即ち、末端
配列が除去されても、トランスポゼース遺伝子の活性は
保たれ、そして、酵素をコードしているエレメントは、
従ってDsエレメントの転位を引き起こすために、非自律
性又はDsエレメントと共に使用され得る。トランスポゼ
ース遺伝子は、Ts101及びTs105エレメントの中に認めら
れる。
配列とトランスポゾンの末端（“Dsエレメント”）でト
ランスポゼース酵素により認識される配列を含んでい
る。トランスポゼースの配列（又はトランスポゼース遺
伝子）は、末端配列と独立して活性化する。即ち、末端
配列が除去されても、トランスポゼース遺伝子の活性は
保たれ、そして、酵素をコードしているエレメントは、
従ってDsエレメントの転位を引き起こすために、非自律
性又はDsエレメントと共に使用され得る。トランスポゼ
ース遺伝子は、Ts101及びTs105エレメントの中に認めら
れる。
非自律性エレメントの両端に存在するDNA配列のみ
は、トランスポゼース遺伝子の存在下で転位的に活性で
あるために必要である。これらの両端は“トランスポゾ
ン末端”又は“Dsエレメント”と、本文中は呼ぶ。例え
ば、ここで援用して本文の一部としたカプラン（Coupla
nd）らのPNAS,86:9385（1989）を参照こと。ここでは、
転位に必要な配列が記憶されている。トランスポゾン末
端間にあるDNA配列は必須なものではなく、実質的に如
何なるものからの配列を含むことができる。このことに
より、トランスポゾン末端間に外来DNAをクローン化さ
せることができる。遺伝子がトランスポゾン末端間にク
ローン化されると、トランスポゾンエレメントと共に転
位する。このコンストラクトは、トランスポゼース遺伝
子が、遺伝的でも無性的でも同一植物内に導入されるま
で、形質転換植物中で安定である。
は、トランスポゼース遺伝子の存在下で転位的に活性で
あるために必要である。これらの両端は“トランスポゾ
ン末端”又は“Dsエレメント”と、本文中は呼ぶ。例え
ば、ここで援用して本文の一部としたカプラン（Coupla
nd）らのPNAS,86:9385（1989）を参照こと。ここでは、
転位に必要な配列が記憶されている。トランスポゾン末
端間にあるDNA配列は必須なものではなく、実質的に如
何なるものからの配列を含むことができる。このことに
より、トランスポゾン末端間に外来DNAをクローン化さ
せることができる。遺伝子がトランスポゾン末端間にク
ローン化されると、トランスポゾンエレメントと共に転
位する。このコンストラクトは、トランスポゼース遺伝
子が、遺伝的でも無性的でも同一植物内に導入されるま
で、形質転換植物中で安定である。
トランスポゾンエレメント又はDsエレメントは、同一
ゲノム内にトランスポゼースが存在するときのみ転位で
きる非自律性エレメントであり、このような分離（Diss
ociation）（Ds）又はDs1は、クローン化され、当業の
分野では詳述されている。例えば、共に援用して本文の
一部とした、ラスナー（Lassner）らのMol.Gen.Genet.,
218:25−32（1989）及びヨダー（Yoder）らのMol.Gen.G
enet.,213:291−296（1988）を参照のこと。
ゲノム内にトランスポゼースが存在するときのみ転位で
きる非自律性エレメントであり、このような分離（Diss
ociation）（Ds）又はDs1は、クローン化され、当業の
分野では詳述されている。例えば、共に援用して本文の
一部とした、ラスナー（Lassner）らのMol.Gen.Genet.,
218:25−32（1989）及びヨダー（Yoder）らのMol.Gen.G
enet.,213:291−296（1988）を参照のこと。
通常、最も好ましいトランスポゾンシステムは、コー
ン（corn）からのAc/Dsシステムであるが、他の種から
のエレメントでも使用し得る。しかし、多くの植物は、
トランスポゾンを含んでいることが知られている。それ
らは、体細胞突然変異により引き起こされる斑入り（va
riegation）によって典型的には検出される。トランス
ポゾンの総説は、ネヴァース（Nevers）らのAdv.in Bo
t.Res.12:103−203（1987）に見られ、これは援用して
本文の一部としている。
ン（corn）からのAc/Dsシステムであるが、他の種から
のエレメントでも使用し得る。しかし、多くの植物は、
トランスポゾンを含んでいることが知られている。それ
らは、体細胞突然変異により引き起こされる斑入り（va
riegation）によって典型的には検出される。トランス
ポゾンの総説は、ネヴァース（Nevers）らのAdv.in Bo
t.Res.12:103−203（1987）に見られ、これは援用して
本文の一部としている。
トランスポゾンは、記述された方法によって、多くの
植物源から単離され得る。トランスポゾンは、よく特徴
付けられた遺伝子産物をコードしている遺伝子への挿入
によって、最も一般的に単離される。この方法によって
トランスポゾンを単離するために必要なステップは、以
下のものである、即ち、（ａ）所望の表現型をコードす
るための植物遺伝子が、標準的なクローニング方法（サ
ムブロックら、前述）のいずれかによってクローン化さ
れる、（ｂ）トランスポゾンが活性であることが知られ
ている集団でのクローン化遺伝子の不活化によって植物
をスクリーニングすることにより、クローン化遺伝子で
のトランスポゾン誘導性突然変異が得られる、（ｃ）ハ
イブリダイゼーションプローブとしてクローン化遺伝子
を使用し、印付けられた集団から得られた突然変異遺伝
子が得られる、次いで（ｄ）活性遺伝子と突然変異遺伝
子との間で行われるヌクレオチド配列の比較が、トラン
スポゾン挿入の同定に使用される。
植物源から単離され得る。トランスポゾンは、よく特徴
付けられた遺伝子産物をコードしている遺伝子への挿入
によって、最も一般的に単離される。この方法によって
トランスポゾンを単離するために必要なステップは、以
下のものである、即ち、（ａ）所望の表現型をコードす
るための植物遺伝子が、標準的なクローニング方法（サ
ムブロックら、前述）のいずれかによってクローン化さ
れる、（ｂ）トランスポゾンが活性であることが知られ
ている集団でのクローン化遺伝子の不活化によって植物
をスクリーニングすることにより、クローン化遺伝子で
のトランスポゾン誘導性突然変異が得られる、（ｃ）ハ
イブリダイゼーションプローブとしてクローン化遺伝子
を使用し、印付けられた集団から得られた突然変異遺伝
子が得られる、次いで（ｄ）活性遺伝子と突然変異遺伝
子との間で行われるヌクレオチド配列の比較が、トラン
スポゾン挿入の同定に使用される。
自然集団中の転位因子（transposable element）の存
在頻度（prevalence）が、トランスポゾン単離の第二の
方法を成功させる。制限フラグメント長多型（RFLP）マ
ッピングを用いた遺伝子マッピングの過程では、RFLPパ
ターンが、印付けられたDNA配列への挿入と一致するこ
とが時として見られる。この手法は、新しい挿入による
ゲノムをランダムに分析することに基づいて行われ、ト
ランスポゾンの同定に好都合である。
在頻度（prevalence）が、トランスポゾン単離の第二の
方法を成功させる。制限フラグメント長多型（RFLP）マ
ッピングを用いた遺伝子マッピングの過程では、RFLPパ
ターンが、印付けられたDNA配列への挿入と一致するこ
とが時として見られる。この手法は、新しい挿入による
ゲノムをランダムに分析することに基づいて行われ、ト
ランスポゾンの同定に好都合である。
DNAコンストラクトは、また対象遺伝子と共に、形質
転換された植物染色体へ取り込まれることになる外来性
補助核酸も含む。“外来性補助核酸”、“補助核酸”又
は“補助配列”は、形質転換される植物に対して異質
（foreign）であり、望ましくない配列である核酸であ
る。“望ましくない配列”は、形質転換された植物から
除かれる標的となる配列である。対象遺伝子がトランス
ポゾンエレメント内のDNAコンストラクト中にクローン
化されるならば、望ましくない配列はトランスポゾンエ
レメントの外側にあるDNAコンストラクト上の配列であ
り、転位の際にトランスポゾンエレメントから離され
る。対象遺伝子がトランスポゾンエレメント内でないDN
Aコンストラクト中にクローン化されるならば、望まし
くない配列は、トランスポゾンエレメント自身及びトラ
ンスポゾンエレメント内にある配列であり、これらは転
位の際に対象遺伝子から離されるであろう。外来性補助
核酸が“含まれない”植物は、望しくない配列がサザン
ハイブリダイゼーションのような標準的なハイブリダイ
ゼーション手法では抽出されないという植物である。
転換された植物染色体へ取り込まれることになる外来性
補助核酸も含む。“外来性補助核酸”、“補助核酸”又
は“補助配列”は、形質転換される植物に対して異質
（foreign）であり、望ましくない配列である核酸であ
る。“望ましくない配列”は、形質転換された植物から
除かれる標的となる配列である。対象遺伝子がトランス
ポゾンエレメント内のDNAコンストラクト中にクローン
化されるならば、望ましくない配列はトランスポゾンエ
レメントの外側にあるDNAコンストラクト上の配列であ
り、転位の際にトランスポゾンエレメントから離され
る。対象遺伝子がトランスポゾンエレメント内でないDN
Aコンストラクト中にクローン化されるならば、望まし
くない配列は、トランスポゾンエレメント自身及びトラ
ンスポゾンエレメント内にある配列であり、これらは転
位の際に対象遺伝子から離されるであろう。外来性補助
核酸が“含まれない”植物は、望しくない配列がサザン
ハイブリダイゼーションのような標準的なハイブリダイ
ゼーション手法では抽出されないという植物である。
B.ベクターコンストラクト 所望のDNAコンストラクトは、植物内の対象遺伝子の
転写を開始するように考案された発現カセットを含んで
いるトランスポゾンを、より好ましくは含むであろう。
バクテリア又はウィルス起源の補助配列は、バクテリア
又はファージ宿主内にクローン化されるベクターをも典
型的には含有し得る。
転写を開始するように考案された発現カセットを含んで
いるトランスポゾンを、より好ましくは含むであろう。
バクテリア又はウィルス起源の補助配列は、バクテリア
又はファージ宿主内にクローン化されるベクターをも典
型的には含有し得る。
ベクターは、通常、形質転換植物細胞が培養中で同定
するための補助的な選択可能マーカー遺伝子を含んでい
る。通常、マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコード
化している。これらのマーカーは、G418、ハイグロマイ
シン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキシエ
ート（methotrexate）、クロルサルフロン（chlorsulfu
ron）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチ
ノマイシン、フォスフィノトリシン、グリフォサート
（glyphosate）及びゲンタマイシンに対する抵抗性を含
む。植物細胞を形質転換した後、ベクターを有するこれ
らの細胞は、特定の抗生物質を含有する培地での成長能
によって同定されるであろう。
するための補助的な選択可能マーカー遺伝子を含んでい
る。通常、マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコード
化している。これらのマーカーは、G418、ハイグロマイ
シン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキシエ
ート（methotrexate）、クロルサルフロン（chlorsulfu
ron）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチ
ノマイシン、フォスフィノトリシン、グリフォサート
（glyphosate）及びゲンタマイシンに対する抵抗性を含
む。植物細胞を形質転換した後、ベクターを有するこれ
らの細胞は、特定の抗生物質を含有する培地での成長能
によって同定されるであろう。
付加的機能をコードする他の補助的なDNA配列も、当
業の分野では知られているようにベクター内に存在し得
る。例えば、アグロバクテリウムの形質転換の場合に、
Ｔ−DNA配列も、植物染色体への付随転移（subsequent
transfer）に含まれる。
業の分野では知られているようにベクター内に存在し得
る。例えば、アグロバクテリウムの形質転換の場合に、
Ｔ−DNA配列も、植物染色体への付随転移（subsequent
transfer）に含まれる。
バクテリア発現ベクターは、バクテリア中の遺伝子の
発現を望む場合に用いられ得る。バクテリア発現ベクタ
ーの構築は、強力なバクテリアのプロモーターより下流
に遺伝子を位置させることによって通常行われる。使用
され得るバクテリアプロモーターの例には、β−ラクタ
マーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びファージλpLプロモ
ーターが含まれる。バクテリア中でのmRNAの転写効率
は、リボソーム結合部位の存在及び転写開始コドンから
の距離に、かなり依存している。
発現を望む場合に用いられ得る。バクテリア発現ベクタ
ーの構築は、強力なバクテリアのプロモーターより下流
に遺伝子を位置させることによって通常行われる。使用
され得るバクテリアプロモーターの例には、β−ラクタ
マーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びファージλpLプロモ
ーターが含まれる。バクテリア中でのmRNAの転写効率
は、リボソーム結合部位の存在及び転写開始コドンから
の距離に、かなり依存している。
植物内での発現には、組み換え発現カセットは、更
に、所望の配列に加えて、植物プロモーター領域、転写
開始部位（転写される配列がこれを欠いていた場合）及
び転写終止配列を典型的には含み得る。カセットの５′
及び３′末端での特徴的な制限酵素部位は、先在ベクタ
ー（pre−existing vector）への容易な挿入を考慮して
通常含まれる。
に、所望の配列に加えて、植物プロモーター領域、転写
開始部位（転写される配列がこれを欠いていた場合）及
び転写終止配列を典型的には含み得る。カセットの５′
及び３′末端での特徴的な制限酵素部位は、先在ベクタ
ー（pre−existing vector）への容易な挿入を考慮して
通常含まれる。
真核細胞遺伝子発現を調節する配列は、広く研究され
てきている。プロモーター配列エレメントは、TATAボッ
クス共通配列（TATAAT）を含んでおり、これは転写開始
部位から通常は20から30塩基対（bp）上流に存在する。
まず第一にTATAボックスは、正確な転写開始に必要であ
る。慣習上、開始部位は＋１と呼ばれる。５′（上流）
方向に伸びる配列には負の数が与えられ、３′（下流）
方向に伸びる配列には正の数が与えられる。
てきている。プロモーター配列エレメントは、TATAボッ
クス共通配列（TATAAT）を含んでおり、これは転写開始
部位から通常は20から30塩基対（bp）上流に存在する。
まず第一にTATAボックスは、正確な転写開始に必要であ
る。慣習上、開始部位は＋１と呼ばれる。５′（上流）
方向に伸びる配列には負の数が与えられ、３′（下流）
方向に伸びる配列には正の数が与えられる。
植物では、TATAボックスから更に上流の一80から−10
0の位置には、トリヌクレオチドＧ（又はＴ）NGを取り
囲む一連のアデニンを持つプロモーターエレメントが典
型的には存在する。J.メジング（Messig）らのGenetic
Engineering in Plants,221−227（コサージ（Kosag
e）、メレディス（Meredith）及びホーレンダー（Holle
ander）らの編集、1983）参照。組織特異性、環境的な
シグナルに対する反応性又は最大転写効率を与える他の
配列も、プロモーター領域に見受けら得る。このような
配列は、400bp以内の転写開始サイズでしばしば見られ
得るが、2000bp又はそれ以上まで拡張し得る。
0の位置には、トリヌクレオチドＧ（又はＴ）NGを取り
囲む一連のアデニンを持つプロモーターエレメントが典
型的には存在する。J.メジング（Messig）らのGenetic
Engineering in Plants,221−227（コサージ（Kosag
e）、メレディス（Meredith）及びホーレンダー（Holle
ander）らの編集、1983）参照。組織特異性、環境的な
シグナルに対する反応性又は最大転写効率を与える他の
配列も、プロモーター領域に見受けら得る。このような
配列は、400bp以内の転写開始サイズでしばしば見られ
得るが、2000bp又はそれ以上まで拡張し得る。
異種のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築
では、プロモーターは、本来の配置決めでの転写開始部
位から距離と、異種の転写開始部位からの距離がほぼ同
一である位置にあることが好ましい。しかし、当業の技
術分野において知られているように、この距離内でのい
くらかの変化は、プロモーター機能を損失することなく
適用することができる。
では、プロモーターは、本来の配置決めでの転写開始部
位から距離と、異種の転写開始部位からの距離がほぼ同
一である位置にあることが好ましい。しかし、当業の技
術分野において知られているように、この距離内でのい
くらかの変化は、プロモーター機能を損失することなく
適用することができる。
発現カセットで使用される特定のプロモーターは、本
発明の重要な面ではない。植物細胞中で直接転写する如
何なる多数のプロモーターも好適である。プロモーター
は、本質的でも誘発的でも可能である。バクテリア起源
のプロモーターには、オクトピン合成プロモーター、ノ
パリン合成プロモーター及び本来のTiプラスミドから派
生した他のプロモーターが含まれる。ヘルララ−エスト
レラ（Herrara−Estrella）らのNature,303:209−213
（1983）参照。ウィルス起源のプロモーターには、カリ
フラワーモザイクウィルスの35S及び19S（RNA）のプロ
モーターが含まれる。オデル（Odell）らのNature,313:
810−812（1985）参照。可能性のある植物プロモーター
には、リブロース−1,3−ビスフォスフェートカルボキ
シラーゼの小サブユニットのプロモーター、E8遺伝子か
らのプロモーター配列及びファセオリン（phaseolin）
プロモーターが含まれる。
発明の重要な面ではない。植物細胞中で直接転写する如
何なる多数のプロモーターも好適である。プロモーター
は、本質的でも誘発的でも可能である。バクテリア起源
のプロモーターには、オクトピン合成プロモーター、ノ
パリン合成プロモーター及び本来のTiプラスミドから派
生した他のプロモーターが含まれる。ヘルララ−エスト
レラ（Herrara−Estrella）らのNature,303:209−213
（1983）参照。ウィルス起源のプロモーターには、カリ
フラワーモザイクウィルスの35S及び19S（RNA）のプロ
モーターが含まれる。オデル（Odell）らのNature,313:
810−812（1985）参照。可能性のある植物プロモーター
には、リブロース−1,3−ビスフォスフェートカルボキ
シラーゼの小サブユニットのプロモーター、E8遺伝子か
らのプロモーター配列及びファセオリン（phaseolin）
プロモーターが含まれる。
プロモーター配列に加えて、発現カセットは効率よい
終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領
域をも含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同様
の遺伝子から得ることもできるし、また異種遺伝子から
得ることもできる。
終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領
域をも含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同様
の遺伝子から得ることもできるし、また異種遺伝子から
得ることもできる。
構造遺伝子によってコードされるmRNAは効率よく転写
させるためである場合、ポリアデニル化配列もベクター
コンストラクトに通常加えられる。アルバー（Alber）
及びカワサキのMol.and Appl.Genet,1:419−434（198
2）参照。ポリアデニン化配列には、これに制限されな
いが、アグロバクテリウムのオクトピン合成シグナル
（キーレン（Gielen）ら,EMBO J.,3:835−846,1984）又
はノパリン合成シグナル（デピッカー（Depicker）ら,M
ol.and Appl.Genet.,1:561−573,1982）が含まれる。
させるためである場合、ポリアデニル化配列もベクター
コンストラクトに通常加えられる。アルバー（Alber）
及びカワサキのMol.and Appl.Genet,1:419−434（198
2）参照。ポリアデニン化配列には、これに制限されな
いが、アグロバクテリウムのオクトピン合成シグナル
（キーレン（Gielen）ら,EMBO J.,3:835−846,1984）又
はノパリン合成シグナル（デピッカー（Depicker）ら,M
ol.and Appl.Genet.,1:561−573,1982）が含まれる。
ベクターでのトランスポゾンの使用は、所望の遺伝子
を補助配列から離れさせる。DNAコンストラクト中のト
ランスポゾンは、２つの独立した配置（configuratio
n）において使用される。（１）対象遺伝子が、トラン
スポゾン末端間の中心部分、つまりトランスポゾンの非
必須領域でクローン化されるだけでなく、（２）形質転
換植物の選択に用いられる選択マーカー遺伝子配列も、
トランスポゾンの外側にクローン化される所望の遺伝子
と共に、トランスポゾン末端間の非必須領域にクローン
化される。最初の場合では、トランスポゾンの移動化
（mobilization）は、形質転換させるベクター配列から
対象遺伝子を分離することに用いられる。次の場合は、
トランスポゾンの移動化は、対象遺伝子を含むコンスト
ラクトから選択マーカー配列を除去するために用いられ
る。
を補助配列から離れさせる。DNAコンストラクト中のト
ランスポゾンは、２つの独立した配置（configuratio
n）において使用される。（１）対象遺伝子が、トラン
スポゾン末端間の中心部分、つまりトランスポゾンの非
必須領域でクローン化されるだけでなく、（２）形質転
換植物の選択に用いられる選択マーカー遺伝子配列も、
トランスポゾンの外側にクローン化される所望の遺伝子
と共に、トランスポゾン末端間の非必須領域にクローン
化される。最初の場合では、トランスポゾンの移動化
（mobilization）は、形質転換させるベクター配列から
対象遺伝子を分離することに用いられる。次の場合は、
トランスポゾンの移動化は、対象遺伝子を含むコンスト
ラクトから選択マーカー配列を除去するために用いられ
る。
C.直接形質転換 上述したDNAコンストラクトは、組み換えDNAを機械的
に転移するため、マイクロピペットの使用により植物細
胞中へ、直接、微小注射（microinject）させることが
できる。クロスウェイ（Crossway）,Mol.Gen.Genetics,
202:179−185（1985）参照。遺伝物質は、また、クレン
ス（Krens）らのNature,296:72−74（1982）にあるよう
に、ポリエチレングリコールを用いても植物細胞へ転移
され得る。
に転移するため、マイクロピペットの使用により植物細
胞中へ、直接、微小注射（microinject）させることが
できる。クロスウェイ（Crossway）,Mol.Gen.Genetics,
202:179−185（1985）参照。遺伝物質は、また、クレン
ス（Krens）らのNature,296:72−74（1982）にあるよう
に、ポリエチレングリコールを用いても植物細胞へ転移
され得る。
核酸セグメントの他の導入方法は、クライン（Klei
n）らのNature,327:70−73（1987）にあるように、小ビ
ーズ又は小粒子のマトリクス中又はその表面のいずれか
の核酸と共に小粒子による高速バリスティックペネトレ
ーション（high velocity ballistic penetration）法
である。
n）らのNature,327:70−73（1987）にあるように、小ビ
ーズ又は小粒子のマトリクス中又はその表面のいずれか
の核酸と共に小粒子による高速バリスティックペネトレ
ーション（high velocity ballistic penetration）法
である。
更に他の導入方法は、フラリーらのPro.Natl.Acad.sc
i.USA,79:1859−1863（1982）にあるように、他の物体
（entities）、ミニ細胞、細胞、ライソソーム又は融合
性脂質表面体（fusible lipid−surfaced bodies）のい
ずれかのプロトプラストとの融合法である。
i.USA,79:1859−1863（1982）にあるように、他の物体
（entities）、ミニ細胞、細胞、ライソソーム又は融合
性脂質表面体（fusible lipid−surfaced bodies）のい
ずれかのプロトプラストとの融合法である。
DNAはまた、エレクトロポレーションによっても植物
細胞へ導入され得る。フラム（Framm）らのPro.Natl.Ac
ad.sci.USA,82:5824（1985）参照。この技術では、植物
プロトプラストが、発現カセットを含んだプラスミドの
存在下で、エレクトロポレートされる。高い電界強度
（high field strength）の電気インパルスは、プラス
ミドの導入が行われるように生体膜を可逆的に透過可能
にさせる。エレクトロポレートされた植物プロトプラス
トは細胞壁を再構築し、分裂し、再生（regenerate）す
る。
細胞へ導入され得る。フラム（Framm）らのPro.Natl.Ac
ad.sci.USA,82:5824（1985）参照。この技術では、植物
プロトプラストが、発現カセットを含んだプラスミドの
存在下で、エレクトロポレートされる。高い電界強度
（high field strength）の電気インパルスは、プラス
ミドの導入が行われるように生体膜を可逆的に透過可能
にさせる。エレクトロポレートされた植物プロトプラス
トは細胞壁を再構築し、分裂し、再生（regenerate）す
る。
D.ベクターによる形質転換 カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）は、植物細胞
への対象遺伝子の導入に用いるベクターとして使用され
得る。ホーン（Hohn）ら，“Molecular Biology of Pla
nt Tumors",アカデミックプレス社，ニューヨーク,549
−560（1982）及びハウエル（Howell）の米国特許第4,4
07,956号参照。記述された方法に従い、全CaMVウィルス
のDNAゲノムは、バクテリア中で増やすことができる組
み換えDNA分子を創生する親バクテリアプラスミド中に
挿入される。クローニング後、組み換えプラスミドは、
プラスミドのウィルス部分中の特徴的な制限部位内への
所望の配列の導入により、更に修飾される。組み換えプ
ラスミドの修飾されたウィルス部分は、次いで親のバク
テリアプラスミドから除去され、植物細胞又は植物へ植
えつけるために使用される。
への対象遺伝子の導入に用いるベクターとして使用され
得る。ホーン（Hohn）ら，“Molecular Biology of Pla
nt Tumors",アカデミックプレス社，ニューヨーク,549
−560（1982）及びハウエル（Howell）の米国特許第4,4
07,956号参照。記述された方法に従い、全CaMVウィルス
のDNAゲノムは、バクテリア中で増やすことができる組
み換えDNA分子を創生する親バクテリアプラスミド中に
挿入される。クローニング後、組み換えプラスミドは、
プラスミドのウィルス部分中の特徴的な制限部位内への
所望の配列の導入により、更に修飾される。組み換えプ
ラスミドの修飾されたウィルス部分は、次いで親のバク
テリアプラスミドから除去され、植物細胞又は植物へ植
えつけるために使用される。
植物細胞へのDNAの他の導入方法は、遺伝子により事
前に形質転換されたアグロバクテリウム・テュメファシ
エンス（Agrobacteriumu tumefaciens）又はアグロバク
テリウム・リゾジニス（A.rhizogenes）によって細胞を
感染させることである。この技術分野では知られた特定
の条件下で、形質転換植物細胞は、苗条又は根を形成す
るために成長し、更に植物へと生育する。
前に形質転換されたアグロバクテリウム・テュメファシ
エンス（Agrobacteriumu tumefaciens）又はアグロバク
テリウム・リゾジニス（A.rhizogenes）によって細胞を
感染させることである。この技術分野では知られた特定
の条件下で、形質転換植物細胞は、苗条又は根を形成す
るために成長し、更に植物へと生育する。
アグロバクテリウムは、グラム陰性のリゾビウム科の
代表的な層である。この種は、クラウムゴール（アグロ
バクテリウム・テュメファシエンス）及び毛根病（hair
y root disease）（アグロバクテリウム・リゾジニス）
の原因となる。クラウンゴール腫及び毛根中の植物細胞
では、オピンとして知られるアミノ酸誘導体の生産が誘
導される。オピンは、このバクテリアによってのみ異化
される。オピンの発現を支配するバクテリア遺伝子は、
キメラ発現カセットとしての制御因子の簡便な源であ
る。更にオピンの存在の分析は、形質転換組織の同定に
用いることができる。
代表的な層である。この種は、クラウムゴール（アグロ
バクテリウム・テュメファシエンス）及び毛根病（hair
y root disease）（アグロバクテリウム・リゾジニス）
の原因となる。クラウンゴール腫及び毛根中の植物細胞
では、オピンとして知られるアミノ酸誘導体の生産が誘
導される。オピンは、このバクテリアによってのみ異化
される。オピンの発現を支配するバクテリア遺伝子は、
キメラ発現カセットとしての制御因子の簡便な源であ
る。更にオピンの存在の分析は、形質転換組織の同定に
用いることができる。
異種遺伝配列は、アグロバクテリウム・テュメファシ
エンスのTiプラスミド又はアグロバクテリウム・リゾジ
ニスのRiプラスミドを用いて、適当な植物細胞へ導入す
ることができる。Ti又はRiプラスミドは、アグロバクテ
リウムの感染により植物細胞に伝達され、植物ゲノムへ
安定的に組み込まれる。J.シェル（Schell）,Science,2
37:1176−1183（1987）参照。
エンスのTiプラスミド又はアグロバクテリウム・リゾジ
ニスのRiプラスミドを用いて、適当な植物細胞へ導入す
ることができる。Ti又はRiプラスミドは、アグロバクテ
リウムの感染により植物細胞に伝達され、植物ゲノムへ
安定的に組み込まれる。J.シェル（Schell）,Science,2
37:1176−1183（1987）参照。
Ti及びRiプラスミドは、形質転換細胞の作製に必須な
２つの領域を含んでいる。一方は、伝達DNA（transferr
ed DNA）（Ｔ−DNA）と呼ばれるもので、植物核へ伝達
され、腫瘍又は根の形成を誘導する。他方は、ビルレン
ス（virulence）（vir）領域とよばれるもので、Ｔ−DN
Aの伝達には必須であるがそれ自身は伝達されない。Ｔ
−DNAは、vir領域か異なるプラスミド上にあっても植物
細胞へ伝達される。オーケマ（Hoekema）ら,Nature,30
3:179−189（1983）参照。伝達DNA領域は、その伝達能
に影響することなく、異質DNAの挿入によってサイズを
拡張することができる。病源遺伝子が削除されている修
飾されたTi及びRiプラスミドは、特定の植物細胞への本
発明の遺伝子コンストラクトの伝達のためのベクターと
して使用することができる。
２つの領域を含んでいる。一方は、伝達DNA（transferr
ed DNA）（Ｔ−DNA）と呼ばれるもので、植物核へ伝達
され、腫瘍又は根の形成を誘導する。他方は、ビルレン
ス（virulence）（vir）領域とよばれるもので、Ｔ−DN
Aの伝達には必須であるがそれ自身は伝達されない。Ｔ
−DNAは、vir領域か異なるプラスミド上にあっても植物
細胞へ伝達される。オーケマ（Hoekema）ら,Nature,30
3:179−189（1983）参照。伝達DNA領域は、その伝達能
に影響することなく、異質DNAの挿入によってサイズを
拡張することができる。病源遺伝子が削除されている修
飾されたTi及びRiプラスミドは、特定の植物細胞への本
発明の遺伝子コンストラクトの伝達のためのベクターと
して使用することができる。
一般的な組み換えTi及びRiプラスミドのコンストラク
ションは、pBR322のようなより一般的なバクテリアベク
ターを使用する通常の方法による。本来のプラスミドに
時々見受けられ、外来性配列により時々構築される副遺
伝因子（accessory genetic elments）を付加的に使用
することができる。これらには、“シャトルベクター”
（ルブカン（Ruvkun）とアウズベル（Ausubel）,Natur
e,298:85−88（1981））、プロモーター（ロートン（La
wton）ら,Plant Mol.Biol.,9:315−324（1981））及び
選択因子としての抗生物質抵抗性の構造遺伝子（フラリ
ーら,Pro.Natl.Acad.Sci.,80:4803−4807（1983）が含
まれるが、これに制限されない。
ションは、pBR322のようなより一般的なバクテリアベク
ターを使用する通常の方法による。本来のプラスミドに
時々見受けられ、外来性配列により時々構築される副遺
伝因子（accessory genetic elments）を付加的に使用
することができる。これらには、“シャトルベクター”
（ルブカン（Ruvkun）とアウズベル（Ausubel）,Natur
e,298:85−88（1981））、プロモーター（ロートン（La
wton）ら,Plant Mol.Biol.,9:315−324（1981））及び
選択因子としての抗生物質抵抗性の構造遺伝子（フラリ
ーら,Pro.Natl.Acad.Sci.,80:4803−4807（1983）が含
まれるが、これに制限されない。
アグロバクテリウムにより形質転換することができる
と共に植物全体を再生することができる全植物細胞は、
所望の遺伝子を含んだ形質転換された元の（インタクト
（intact））植物を作製するために本発明に従って形質
転換され得る。アグロバクテリウムを用いた植物細胞を
形質転換する２つの一般的な方法がある。即ち、 （１）アグロバクテリウムの、培養として単離したプロ
トプラストとの共培養（co−cultivation）、又は （２）インタクト細胞又は組織の、アグロバクテリウム
による形質転換。
と共に植物全体を再生することができる全植物細胞は、
所望の遺伝子を含んだ形質転換された元の（インタクト
（intact））植物を作製するために本発明に従って形質
転換され得る。アグロバクテリウムを用いた植物細胞を
形質転換する２つの一般的な方法がある。即ち、 （１）アグロバクテリウムの、培養として単離したプロ
トプラストとの共培養（co−cultivation）、又は （２）インタクト細胞又は組織の、アグロバクテリウム
による形質転換。
（１）の方法は、プロトプラストを培養し、培養され
たプロトプラストからの後の植物再生を可能にする確立
された培養システムが必要である。
たプロトプラストからの後の植物再生を可能にする確立
された培養システムが必要である。
（２）の方法は、（ａ）インタクト植物組織例えば子
葉が、アグロバクテリウムにより形質転換され得るこ
と、及び（ｂ）形質転換された細胞又は組織が、植物全
体において再生するように誘導され得ること、が必要で
ある。
葉が、アグロバクテリウムにより形質転換され得るこ
と、及び（ｂ）形質転換された細胞又は組織が、植物全
体において再生するように誘導され得ること、が必要で
ある。
ほとんどの双方葉種はアグロバクテリウムにより形質
転換されることができる。アグロバクテリウムの本来の
植物宿主である全ての種は、in vitroにおいて形質転換
可能である。単子葉類の植物及び特に穀草類（cereal
s）は、アグロバクテリウムの元々の宿主ではない。ア
グロバクテリウムを用いてそれらを形質転換する試み
は、近年まで成功していなかった。ホイカス−ヴァンス
ログテーレン（Hooykas−Van Slogteren）らのNature,3
11:763−764（1984）参照。ある単子葉類がアグロバク
テリウムにより形質転換され得ることについて多くの証
拠が、現在得られてきている。新しい実験的な手法を用
いて、例えばライ麦（デラペナ（de la pena）ら,Natur
e,325:274−276（1987））、コーン（ローデス（Rhode
s）ら、Science,240:204−207（1988）、及び米（シマ
モトら、Nature,338:274−276（1989））といった穀草
類が、現在、形質転換され得る。
転換されることができる。アグロバクテリウムの本来の
植物宿主である全ての種は、in vitroにおいて形質転換
可能である。単子葉類の植物及び特に穀草類（cereal
s）は、アグロバクテリウムの元々の宿主ではない。ア
グロバクテリウムを用いてそれらを形質転換する試み
は、近年まで成功していなかった。ホイカス−ヴァンス
ログテーレン（Hooykas−Van Slogteren）らのNature,3
11:763−764（1984）参照。ある単子葉類がアグロバク
テリウムにより形質転換され得ることについて多くの証
拠が、現在得られてきている。新しい実験的な手法を用
いて、例えばライ麦（デラペナ（de la pena）ら,Natur
e,325:274−276（1987））、コーン（ローデス（Rhode
s）ら、Science,240:204−207（1988）、及び米（シマ
モトら、Nature,338:274−276（1989））といった穀草
類が、現在、形質転換され得る。
好ましいアグロバクテリウム２成分系ベクタープラス
ミド（ファンデンエルゼン（Van den Elzen）ら,Plant
Mol.Biol.,5:149−154（1985））は、形質転換された植
物細胞を選択するため、例えばカナマイシン耐性遺伝子
のような、連結した薬剤耐性遺伝子を含む。この形質転
換ベクターは、形質転換植物の迅速なスクリーニングの
ためにカナマイシン耐性植物を作ることに用いられ得
る。
ミド（ファンデンエルゼン（Van den Elzen）ら,Plant
Mol.Biol.,5:149−154（1985））は、形質転換された植
物細胞を選択するため、例えばカナマイシン耐性遺伝子
のような、連結した薬剤耐性遺伝子を含む。この形質転
換ベクターは、形質転換植物の迅速なスクリーニングの
ためにカナマイシン耐性植物を作ることに用いられ得
る。
III.形質転換植物細胞の選択及び再生 形質転換後に、所望の遺伝子を含んでいる形質転換さ
れた植物細胞又は植物が、同定されなければならない。
前述したような選択可能マーカーが典型的に使用され
る。特定の抗生物質を含有した成長培地で細胞を成長さ
せることによって、形質転換植物細胞を選択することが
できる。オピンの存在もまた、植物がアグロバクテリウ
ムにより形質転換されるのであれば、使用することがで
きる。
れた植物細胞又は植物が、同定されなければならない。
前述したような選択可能マーカーが典型的に使用され
る。特定の抗生物質を含有した成長培地で細胞を成長さ
せることによって、形質転換植物細胞を選択することが
できる。オピンの存在もまた、植物がアグロバクテリウ
ムにより形質転換されるのであれば、使用することがで
きる。
形質転換細胞を選択した後、所望の異種遺伝子の発現
を確認することができる。挿入されたDNAによってコー
ドされたmRNAの簡単な検出は、例えばノザンブロットハ
イブリダイゼーションにような、この技術分野でよく知
られた方法によって達せられる。挿入配列は、同様にサ
ザンブロットハイブリダイゼーションによって同定する
ことができる。例えば、前記サムブロックを参照のこ
と。
を確認することができる。挿入されたDNAによってコー
ドされたmRNAの簡単な検出は、例えばノザンブロットハ
イブリダイゼーションにような、この技術分野でよく知
られた方法によって達せられる。挿入配列は、同様にサ
ザンブロットハイブリダイゼーションによって同定する
ことができる。例えば、前記サムブロックを参照のこ
と。
全再生植物を得るためにプロトプラストが単離され培
養されて得た全植物は、形質転換することができる。幾
つかの好ましい植物がこれに含まれるが、例えば、フラ
ガリア（Fragaria）、ロータス（Lotaus）、メディカー
ゴ（Medicago）、オノブリキス（Onobrychis）、トリフ
ォリウム（Trifolium）、トリゴネラ（Trigonella）、
ヴィグナ（Vigna）、シトラス（Citrus）、リナム（Lin
um）、ゲラニウム（Geranium）、マニホット（Maniho
t）、ドウカス（Daucus）、アラビドプシス（Arabidops
is）、ブラッシカ（Brassica）、ラファナス（Raphanu
s）、シナピス（Sinapis）、アトローパ（Atropa）、カ
プシカム（Capsicum）、ダチュラ（Datura）、ハイオス
サイアマス（Hyoscyamus）、リコパルシコン（Lycopers
icon）、ニコチアナ（Nicotiana）、ソラナム（Solanu
m）、ペチュニア（Petunia）、ジギタリス（Digitali
s）、マジュラナ（Majorana）、シコリウム（Cichoriu
m）、ヘリアンサス（Helianthus）、ラクチュカ（Lactu
ca）、ブロマス（Bromus）、アスパラガス（Asparagu
s）、アンチリナム（Antirrhinum）、ヘルロカリス（He
rerocallis）、ネメチア（Nemesia）、ペラルゴニウム
（Pelargonium）、パニカム（Panicum）、ペンニセタム
（Pennisetum）、ラナンカラス（Ranunculus）、セネシ
オ（Senecio）、サルピグロシス（Salpiglossis）、カ
カミス（Cucumis）、ブロワリア（Browalia）、グリシ
ン（Glysine）、ロリウム（Lolium）、ゼア（Zea）、ト
リチカム（Triticum）、ソルガム（Sorghum）、マラス
（Malus）、アピウム（Apium）及びダチュラ（Datura）
の属からの種が含まれる。
養されて得た全植物は、形質転換することができる。幾
つかの好ましい植物がこれに含まれるが、例えば、フラ
ガリア（Fragaria）、ロータス（Lotaus）、メディカー
ゴ（Medicago）、オノブリキス（Onobrychis）、トリフ
ォリウム（Trifolium）、トリゴネラ（Trigonella）、
ヴィグナ（Vigna）、シトラス（Citrus）、リナム（Lin
um）、ゲラニウム（Geranium）、マニホット（Maniho
t）、ドウカス（Daucus）、アラビドプシス（Arabidops
is）、ブラッシカ（Brassica）、ラファナス（Raphanu
s）、シナピス（Sinapis）、アトローパ（Atropa）、カ
プシカム（Capsicum）、ダチュラ（Datura）、ハイオス
サイアマス（Hyoscyamus）、リコパルシコン（Lycopers
icon）、ニコチアナ（Nicotiana）、ソラナム（Solanu
m）、ペチュニア（Petunia）、ジギタリス（Digitali
s）、マジュラナ（Majorana）、シコリウム（Cichoriu
m）、ヘリアンサス（Helianthus）、ラクチュカ（Lactu
ca）、ブロマス（Bromus）、アスパラガス（Asparagu
s）、アンチリナム（Antirrhinum）、ヘルロカリス（He
rerocallis）、ネメチア（Nemesia）、ペラルゴニウム
（Pelargonium）、パニカム（Panicum）、ペンニセタム
（Pennisetum）、ラナンカラス（Ranunculus）、セネシ
オ（Senecio）、サルピグロシス（Salpiglossis）、カ
カミス（Cucumis）、ブロワリア（Browalia）、グリシ
ン（Glysine）、ロリウム（Lolium）、ゼア（Zea）、ト
リチカム（Triticum）、ソルガム（Sorghum）、マラス
（Malus）、アピウム（Apium）及びダチュラ（Datura）
の属からの種が含まれる。
培養したプロトプラストからの植物再生は、エヴァン
ス（Evans）らの“Handbook of Plant Cell Cultures.V
ol.1:（マクミラン出版社（MacMillan Publishing C
o.），ニューヨーク（1983））；及びヴァジル,I.R.（V
asil I.R.）編のCell Culture and Somatic Cell Genet
ics of Plants,アカデミックプレス社，オーランド（Or
lando）,Vol.I（1984）及びVol.III（1986）に記載され
ている。
ス（Evans）らの“Handbook of Plant Cell Cultures.V
ol.1:（マクミラン出版社（MacMillan Publishing C
o.），ニューヨーク（1983））；及びヴァジル,I.R.（V
asil I.R.）編のCell Culture and Somatic Cell Genet
ics of Plants,アカデミックプレス社，オーランド（Or
lando）,Vol.I（1984）及びVol.III（1986）に記載され
ている。
実験的に全ての植物は、培養細胞又は組織から再生さ
れることができ、さとうきび、てんさい、綿、果樹及び
まめ科植物の主要な種の全てが含まれるが、ここに挙げ
られた以外の種にも適用される。
れることができ、さとうきび、てんさい、綿、果樹及び
まめ科植物の主要な種の全てが含まれるが、ここに挙げ
られた以外の種にも適用される。
再生の方法は、植物の種々によって異なるが、一般的
には、形質転換されたプロトプラストの懸濁液又は形質
転換された外植片を含んだペトリ皿が、まず用意され
る。カルス組織が形成され、苗条がカルスから誘導さ
れ、その後、根付かさせ得る。あるいは、胚形成がカル
ス組織内で誘導され得る。これらの胚は、植物を形成す
る本来の胚として発芽する。培養液は、一般に、外種の
アミノ酸及びオーキシンやサイトカイニンのようなホル
モンを含んでいる。また、特にコーンやアルファルファ
のような種に対しては、培地にグルタミン酸やプロリン
を添加することも有効である。効果的な再生は、培地、
遺伝子型及び培養の履歴に依存する。これら３種の変化
が制御されるならば、再生は、通常、再作製及び反復可
能になる。
には、形質転換されたプロトプラストの懸濁液又は形質
転換された外植片を含んだペトリ皿が、まず用意され
る。カルス組織が形成され、苗条がカルスから誘導さ
れ、その後、根付かさせ得る。あるいは、胚形成がカル
ス組織内で誘導され得る。これらの胚は、植物を形成す
る本来の胚として発芽する。培養液は、一般に、外種の
アミノ酸及びオーキシンやサイトカイニンのようなホル
モンを含んでいる。また、特にコーンやアルファルファ
のような種に対しては、培地にグルタミン酸やプロリン
を添加することも有効である。効果的な再生は、培地、
遺伝子型及び培養の履歴に依存する。これら３種の変化
が制御されるならば、再生は、通常、再作製及び反復可
能になる。
発現カセットが形質転換植物に安定的に組み込まれた
後は、有性交雑により他の植物に転移され得る。どんな
多数の標準育種技術でも、交配させる種に依存して、用
いられ得る。
後は、有性交雑により他の植物に転移され得る。どんな
多数の標準育種技術でも、交配させる種に依存して、用
いられ得る。
IV.対象遺伝子からの外来性補助配列の分離 植物が形質転換されて、対象遺伝子、トランスポゾン
及び外来性補助核酸が植物のゲノム内に組み込まれる
と、形質転換された植物は、当業の技術分野でよく知ら
れF1又はより離れた世代を得るために個々の種に対して
記述される全ての方法によって、有性生殖による交雑さ
れる。交雑は、最終的に植物から補助配列の除去を引き
起こす。更に、後述するようにこの配列は体細胞分離
（somatic segregation）に経て除去され得る。
及び外来性補助核酸が植物のゲノム内に組み込まれる
と、形質転換された植物は、当業の技術分野でよく知ら
れF1又はより離れた世代を得るために個々の種に対して
記述される全ての方法によって、有性生殖による交雑さ
れる。交雑は、最終的に植物から補助配列の除去を引き
起こす。更に、後述するようにこの配列は体細胞分離
（somatic segregation）に経て除去され得る。
前述のようにトランスポゾンと共に挿入される対象遺
伝子又は選択マーカー遺伝子を産生するために、コンス
トラクトが植物へ導入される。形質転換植物では、この
コンストラクトのトランスポゾンエレメントは、トラン
スポゼースをコードする配列が更に同一植物中に導入さ
れなければ、安定である。従って、対象遺伝子及び補助
配列は分離しないであろう。
伝子又は選択マーカー遺伝子を産生するために、コンス
トラクトが植物へ導入される。形質転換植物では、この
コンストラクトのトランスポゾンエレメントは、トラン
スポゼースをコードする配列が更に同一植物中に導入さ
れなければ、安定である。従って、対象遺伝子及び補助
配列は分離しないであろう。
トランスポゼースをコードする配列は、トランスポゼ
ースの配列を含むベクターを用いた無性形質転換によ
り、又はトランスポゼースの配列を含んでいる植物自身
との遺伝的交雑によって形質転換植物に導入することが
できる。次いで、トランスポゼースの存在は、他の挿入
DNAからトランスポゾンを“ジャンプ”して離す。
ースの配列を含むベクターを用いた無性形質転換によ
り、又はトランスポゼースの配列を含んでいる植物自身
との遺伝的交雑によって形質転換植物に導入することが
できる。次いで、トランスポゼースの存在は、他の挿入
DNAからトランスポゾンを“ジャンプ”して離す。
トランスポゼース配列は、宿主植物へ直接形質転換さ
れると、Dsエレメントとして同一のプラスミド上に共存
するか又は二回めの形質転換中で植物へ導入させ得る。
トランスポゼース遺伝子は、また、トランスポゼース遺
伝子を産生する及びDsエレメントを有する２種の異なっ
た遺伝子導入植物を有性交雑することによって、Dsエレ
メントを有する植物へ導入することもできる。トランス
ポゼース遺伝子及びDsエレメントの両方を有する植物で
は、トランスポゾンエレメントは、形質転換DNAコンス
トラクションの位置と異なる新しい染色体上の位置に転
位して、対象遺伝子又は選択可能マーカー遺伝子のいず
れかを有するようになるであろう。時折、転位が遺伝的
に連結した部位へ行われる一方、ゲノムの一層距離のあ
る領域への転位も、しばしば起こることがある。
れると、Dsエレメントとして同一のプラスミド上に共存
するか又は二回めの形質転換中で植物へ導入させ得る。
トランスポゼース遺伝子は、また、トランスポゼース遺
伝子を産生する及びDsエレメントを有する２種の異なっ
た遺伝子導入植物を有性交雑することによって、Dsエレ
メントを有する植物へ導入することもできる。トランス
ポゼース遺伝子及びDsエレメントの両方を有する植物で
は、トランスポゾンエレメントは、形質転換DNAコンス
トラクションの位置と異なる新しい染色体上の位置に転
位して、対象遺伝子又は選択可能マーカー遺伝子のいず
れかを有するようになるであろう。時折、転位が遺伝的
に連結した部位へ行われる一方、ゲノムの一層距離のあ
る領域への転位も、しばしば起こることがある。
トランスポゾンが新しい座（locus）に移動した後、
次のステップは補助配列を除去するために植物を交雑さ
せることである。これは典型的には有性交配を用いて行
われる。交雑は、自己交雑、戻し交雑又は、対象遺伝子
を運んでいる子孫の獲得を目的として有性生殖の点で適
合する他の植物との交雑及び補助核酸を含まない他との
交雑であり得る。このような交雑は、通常、市販の交配
セットによって行われる。
次のステップは補助配列を除去するために植物を交雑さ
せることである。これは典型的には有性交配を用いて行
われる。交雑は、自己交雑、戻し交雑又は、対象遺伝子
を運んでいる子孫の獲得を目的として有性生殖の点で適
合する他の植物との交雑及び補助核酸を含まない他との
交雑であり得る。このような交雑は、通常、市販の交配
セットによって行われる。
上述したように、有性生殖は、子孫群における連続し
ていない遺伝子を個別に類別（assortment）してしま
う。Dsエレメントが開始転移ベクターと連続していない
位置に転位すると、各配列は子孫に独立して類別され
る。そのため、交雑によって得られたある子孫は、トラ
ンスポゾン内に遺伝子がクローン化された場合、補助配
列を伴うことなくトランスポゾン末端間に対象遺伝子を
含むことになる。あるいは、マーカーがトランスポゾン
末端間にクローン化されている場合には、転位現象によ
り対象遺伝子は元々の位置に存在するが、選択可能なマ
ーカー遺伝子は元の位置から除去される。
ていない遺伝子を個別に類別（assortment）してしま
う。Dsエレメントが開始転移ベクターと連続していない
位置に転位すると、各配列は子孫に独立して類別され
る。そのため、交雑によって得られたある子孫は、トラ
ンスポゾン内に遺伝子がクローン化された場合、補助配
列を伴うことなくトランスポゾン末端間に対象遺伝子を
含むことになる。あるいは、マーカーがトランスポゾン
末端間にクローン化されている場合には、転位現象によ
り対象遺伝子は元々の位置に存在するが、選択可能なマ
ーカー遺伝子は元の位置から除去される。
F1世代は、ここでは形質転換された植物とそのメイト
（mate）、即ち交雑対を形成し得る相手との間での交雑
の子孫、及び自己交雑によって得られた子孫を指す。
“より離れた世代の子孫”とは、交雑のメンバーの一方
が対象遺伝子を含んでさえいれば形質転換植物からの系
統となる、その後の交雑から得られる子孫を指す。
（mate）、即ち交雑対を形成し得る相手との間での交雑
の子孫、及び自己交雑によって得られた子孫を指す。
“より離れた世代の子孫”とは、交雑のメンバーの一方
が対象遺伝子を含んでさえいれば形質転換植物からの系
統となる、その後の交雑から得られる子孫を指す。
この手法は、無性生殖された穀物種を用いた遺伝子導
入物の作製にも使用され得る。転位は有系分裂中でも起
こることができ、トランスポゾンは、娘染色分体が変化
することなく、染色分体上に挿入することができる。こ
れらの場合では、体細胞分離は、対象遺伝子を有する細
胞又は植物全体から、補助配列を除去するであろう。対
象遺伝子を運び、かつ、補助核酸を含まない形質転換植
物又はより離れた世代中の体細胞的に分離した細胞の存
在を検出することができる。それから、植物はこのよう
な細胞から再生され得る。
入物の作製にも使用され得る。転位は有系分裂中でも起
こることができ、トランスポゾンは、娘染色分体が変化
することなく、染色分体上に挿入することができる。こ
れらの場合では、体細胞分離は、対象遺伝子を有する細
胞又は植物全体から、補助配列を除去するであろう。対
象遺伝子を運び、かつ、補助核酸を含まない形質転換植
物又はより離れた世代中の体細胞的に分離した細胞の存
在を検出することができる。それから、植物はこのよう
な細胞から再生され得る。
V.補助配列を含まない子孫の同定 対象遺伝子を含むが補助核酸を含まない子孫の選択方
法には、既知の核酸配列の存在の有無を同定可能な有効
方法が含まれる。外来性の補助核酸の検出は、宿主植物
中に残存する微生物由来遺伝物質がないことを確証する
に十分鋭敏な、各種の標準的な核酸ハイブリダイゼーシ
ョン技術によって決定することができる。このような技
術は、双方に相補的な核酸を溶液中に含まない同種間ハ
イブリダイゼーション反応や、ある核酸がスロットブロ
ット（slot blot）又はササンブロット分析のように固
体支持体に結合している異種間アッセイが包含され得
る。この特異的なハイブリダイゼーション技術は特に重
要ではない。いくつかの方法が、ここで援用して本文の
一部とするNucleic Acid Hybridization,A Practical A
pproach,（ハーメス（Hames）,B.D.とヒギンス（Higgin
s）,S.J.編、IRLプレス（1985））に一般的に記述され
ている。
法には、既知の核酸配列の存在の有無を同定可能な有効
方法が含まれる。外来性の補助核酸の検出は、宿主植物
中に残存する微生物由来遺伝物質がないことを確証する
に十分鋭敏な、各種の標準的な核酸ハイブリダイゼーシ
ョン技術によって決定することができる。このような技
術は、双方に相補的な核酸を溶液中に含まない同種間ハ
イブリダイゼーション反応や、ある核酸がスロットブロ
ット（slot blot）又はササンブロット分析のように固
体支持体に結合している異種間アッセイが包含され得
る。この特異的なハイブリダイゼーション技術は特に重
要ではない。いくつかの方法が、ここで援用して本文の
一部とするNucleic Acid Hybridization,A Practical A
pproach,（ハーメス（Hames）,B.D.とヒギンス（Higgin
s）,S.J.編、IRLプレス（1985））に一般的に記述され
ている。
分析の感度を核酸増幅システムを用いることによって
増幅することが望ましい。このようなシステムは、検出
される標的核酸の絶対数を増加させる。特定の増幅シス
テムは、本発明では特に重要ではなく、使用に有効な少
なくとも２種のシステムがある。
増幅することが望ましい。このようなシステムは、検出
される標的核酸の絶対数を増加させる。特定の増幅シス
テムは、本発明では特に重要ではなく、使用に有効な少
なくとも２種のシステムがある。
１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain r
eaction）（PCR）システムである。この増幅手法は、DN
Aの選択配列を複製する鋳型依存性DNAポリメラーゼプラ
イマー伸長（template dependent DNA polymerase prim
er extension）法である。この方法は、DNAポリヌクレ
オチドの特定配列のDNAポリメラーゼによる複製を開始
する過剰の特定プライマーの使用に基づき、それから、
変性（denaturation）とポリメラーゼ伸長を繰り返して
行われる。PCRシステムは、この技術分野ではよく知ら
れている（米国特許第4,683,195号及び4,683,202号を参
照のこと。これらは援用して本文の一部としている）。
PCRを行うための試薬とハードウェアは、コネチカット
州ノーウォーク（Norwalk）のパーキン−エルマー／シ
ータス（Perkin−Elmer/Cetus）インスツルメント（PEC
I）から購入される。
eaction）（PCR）システムである。この増幅手法は、DN
Aの選択配列を複製する鋳型依存性DNAポリメラーゼプラ
イマー伸長（template dependent DNA polymerase prim
er extension）法である。この方法は、DNAポリヌクレ
オチドの特定配列のDNAポリメラーゼによる複製を開始
する過剰の特定プライマーの使用に基づき、それから、
変性（denaturation）とポリメラーゼ伸長を繰り返して
行われる。PCRシステムは、この技術分野ではよく知ら
れている（米国特許第4,683,195号及び4,683,202号を参
照のこと。これらは援用して本文の一部としている）。
PCRを行うための試薬とハードウェアは、コネチカット
州ノーウォーク（Norwalk）のパーキン−エルマー／シ
ータス（Perkin−Elmer/Cetus）インスツルメント（PEC
I）から購入される。
第二の増幅システムは、ライゲース増幅反応（lygase
amplification reaction）（LAR）である。LARは、PCR
と同様に、多くのDNA標的配列を増幅するため、温度交
替の多重サイクルを利用している。PCRと異なり、LARと
鋳型伸長のための個々のヌクレオチドを用いない。LAR
は、標的領域の両ストランドに相補的な過剰のオリゴヌ
クレオチドを、代わりに用いることに基づいている。２
本鎖鋳型DNAの変性の後に、一方の標的ストランドに近
隣の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーの結合（ligation）により、LAR手法が開始される。
いずれかのストランドに対する相補的なオリゴヌクレオ
チドが接合され得る。ライゲーションと二次変性段階の
後、元の鋳型ストランドと２つの新接合産物は、標的配
列の指数関数的な増幅を行うように、更なるライゲーシ
ョンのための鋳型として作用する。この方法は、援用し
て本文の一部としたGenomics,4:560−569（1989）に記
述されている。
amplification reaction）（LAR）である。LARは、PCR
と同様に、多くのDNA標的配列を増幅するため、温度交
替の多重サイクルを利用している。PCRと異なり、LARと
鋳型伸長のための個々のヌクレオチドを用いない。LAR
は、標的領域の両ストランドに相補的な過剰のオリゴヌ
クレオチドを、代わりに用いることに基づいている。２
本鎖鋳型DNAの変性の後に、一方の標的ストランドに近
隣の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーの結合（ligation）により、LAR手法が開始される。
いずれかのストランドに対する相補的なオリゴヌクレオ
チドが接合され得る。ライゲーションと二次変性段階の
後、元の鋳型ストランドと２つの新接合産物は、標的配
列の指数関数的な増幅を行うように、更なるライゲーシ
ョンのための鋳型として作用する。この方法は、援用し
て本文の一部としたGenomics,4:560−569（1989）に記
述されている。
本明細書で記述される検出及び増幅システムは、関連
分野の当業者によって、機械的に実施される。本発明
は、どんな特定の検出又は増幅システムにも制限されな
い。他のシステムが開発された場合には、本発明に使用
することもできるであろう。例えば、サザンハイブリダ
イゼーション法は、制限酵素による目的核酸の分解（di
gest）及び、対象配列に対するプローブ又は対象配列の
存在の有無を他の方法で検出したプローブを用いて、分
解物から調製されたブロットを調査（probing）するこ
とに使用され得る。この方法の例は、援用して本文の一
部としたヨダーらのMol.Gen.Genet.213:291−296（198
8）に見られる。
分野の当業者によって、機械的に実施される。本発明
は、どんな特定の検出又は増幅システムにも制限されな
い。他のシステムが開発された場合には、本発明に使用
することもできるであろう。例えば、サザンハイブリダ
イゼーション法は、制限酵素による目的核酸の分解（di
gest）及び、対象配列に対するプローブ又は対象配列の
存在の有無を他の方法で検出したプローブを用いて、分
解物から調製されたブロットを調査（probing）するこ
とに使用され得る。この方法の例は、援用して本文の一
部としたヨダーらのMol.Gen.Genet.213:291−296（198
8）に見られる。
更に、化学的マーカーが迅速に観察可能な表現型によ
り発現されるならば、配列が存在するかしないかを同定
するのに使用することができる。例えば、カナマイシン
感受性による非破壊分析（nondestrucrive assy）が有
効である。従って、対象遺伝子を産生するか、カナマイ
シン耐性遺伝子を欠損する形質転換植物を簡単に同定で
きる。ウェイド（Weide）らのTheor.Appl.Genet.,78:16
9−172（1989）を参照のこと。これは援用して本文の一
部としている。
り発現されるならば、配列が存在するかしないかを同定
するのに使用することができる。例えば、カナマイシン
感受性による非破壊分析（nondestrucrive assy）が有
効である。従って、対象遺伝子を産生するか、カナマイ
シン耐性遺伝子を欠損する形質転換植物を簡単に同定で
きる。ウェイド（Weide）らのTheor.Appl.Genet.,78:16
9−172（1989）を参照のこと。これは援用して本文の一
部としている。
VI.分子フィンガープリンティング 本発明は、変種保護（varietal protection）に用い
られる穀物（crop）種における遺伝子マーカーとして、
導入外来DNAの使用を含んでいる。導入外来DNAは、植物
において自然に発生する（occuring）配列と区別できる
全ての配列とし得る。このDNAは、サザンハイブリダイ
ゼーション法のような当業の技術分野における標準的な
技術を用いて、より好ましく区別化される。
られる穀物（crop）種における遺伝子マーカーとして、
導入外来DNAの使用を含んでいる。導入外来DNAは、植物
において自然に発生する（occuring）配列と区別できる
全ての配列とし得る。このDNAは、サザンハイブリダイ
ゼーション法のような当業の技術分野における標準的な
技術を用いて、より好ましく区別化される。
実質的に全ての外来性DNAも使用することができる。
前記発明の背景の項で述べた理由により、DNAはより好
ましく植物起源である。より好ましい植物配列は、Dsエ
レメントのようなトウモロコシトランスポゾンを含んで
いる。この場合、Dsエレメント及びトランスポゼース遺
伝子は、上述した如何なる異種遺伝子転移技術（differ
ent gene transfer technologies）を用いて、同一植物
へ導入される。Dsエレメントは、酵素の存在によって、
新しい特徴ある染色体位置に転位する。この植物は、成
熟状態まで成長し、自家受粉するか又は他家交雑するか
して子孫が集められる。上述のようなDNA解析技術によ
り、転位したDsエレメントを含むがトランスポゼース遺
伝子を含まない子孫植物が同定される。典型的には、子
孫から単離されたDNAはいくつかの異なる制限酵素を用
いて分解され、電気泳動し、サザン法によりメンブレン
上に移し取られ（blot）、標識化されたDsエレメントに
よって調査（probe）される。得られた制限パターン
は、挿入部分のランダム性のために、各転位現象によっ
て特徴的となるであろう。従って、制限フラグメント長
多型（RFLP）が品種内で創生される。
前記発明の背景の項で述べた理由により、DNAはより好
ましく植物起源である。より好ましい植物配列は、Dsエ
レメントのようなトウモロコシトランスポゾンを含んで
いる。この場合、Dsエレメント及びトランスポゼース遺
伝子は、上述した如何なる異種遺伝子転移技術（differ
ent gene transfer technologies）を用いて、同一植物
へ導入される。Dsエレメントは、酵素の存在によって、
新しい特徴ある染色体位置に転位する。この植物は、成
熟状態まで成長し、自家受粉するか又は他家交雑するか
して子孫が集められる。上述のようなDNA解析技術によ
り、転位したDsエレメントを含むがトランスポゼース遺
伝子を含まない子孫植物が同定される。典型的には、子
孫から単離されたDNAはいくつかの異なる制限酵素を用
いて分解され、電気泳動し、サザン法によりメンブレン
上に移し取られ（blot）、標識化されたDsエレメントに
よって調査（probe）される。得られた制限パターン
は、挿入部分のランダム性のために、各転位現象によっ
て特徴的となるであろう。従って、制限フラグメント長
多型（RFLP）が品種内で創生される。
RFLPsは、数量的特徴に関した座の正確で規則正しい
マッピングに広く用いられてきた。例えば、援用して本
文の一部としたボツテイン（Botstein）らのAm.J.Hum.G
enet.32:314−331（1980）を参照のこと。しかし、個々
の対象物に検出可能な差異があることを、この技術は必
要とする。既存の方法は、検出可能な差異を生み出すよ
うな方法を提供してきた。次いでRFLP技術は、植物とそ
の子孫のゲノムをフィンガープリンティングする方法に
使用され得る。
マッピングに広く用いられてきた。例えば、援用して本
文の一部としたボツテイン（Botstein）らのAm.J.Hum.G
enet.32:314−331（1980）を参照のこと。しかし、個々
の対象物に検出可能な差異があることを、この技術は必
要とする。既存の方法は、検出可能な差異を生み出すよ
うな方法を提供してきた。次いでRFLP技術は、植物とそ
の子孫のゲノムをフィンガープリンティングする方法に
使用され得る。
多くの種は、品種差となるような遺伝的変異性を有し
ていない。例えば、無性増殖している穀物では、発芽突
然変種として生じる他の品種は、事実上遺伝的には同一
であろう。RFLP遺伝的マーカーを導入することによっ
て、多くの場合において類似している株（line）を迅速
に区別することができる。本発明のいくつかの態様は、
異なる穀物植物で使用することに有効とさせる。異なる
形質転換現象の各々について挿入部位が特徴的であるの
で、同一手法を用いて異なる品種でマーカーを作ること
は容易である。挿入部位がランダムであるので、他の品
種での挿入現象が、実際上重複することは不可能であ
る。分析に用いることができる制限酵素が多く存在する
ので、品種を明白にマークすることができる。
ていない。例えば、無性増殖している穀物では、発芽突
然変種として生じる他の品種は、事実上遺伝的には同一
であろう。RFLP遺伝的マーカーを導入することによっ
て、多くの場合において類似している株（line）を迅速
に区別することができる。本発明のいくつかの態様は、
異なる穀物植物で使用することに有効とさせる。異なる
形質転換現象の各々について挿入部位が特徴的であるの
で、同一手法を用いて異なる品種でマーカーを作ること
は容易である。挿入部位がランダムであるので、他の品
種での挿入現象が、実際上重複することは不可能であ
る。分析に用いることができる制限酵素が多く存在する
ので、品種を明白にマークすることができる。
転位されたDsが、より好ましい最も有効なマーカーで
あり、そのため多数の親遺伝子（multiple parentage）
を含むハイブリッド株において検出することができる。
このことにより、保護株が親として使用されたかについ
て決定することが可能である。エレメントは、トランス
ポゼースの非存在下で安定であり、そのため、この品種
の使用全てにおいて“フィンガープリント”が用いられ
得る。Dsは、存在する全てのコーン株において存在す
る、本来的に発生する配列である。これが如何なるタン
パク質もコードせず、トランスポゼースの非存在下では
何の遺伝効果も持たないので、ほとんど制御問題がな
い。最終品種をマークするために使用され得る場合又は
育種プログラムの初期段階で導入され得る場合に、この
システムは変わりやすい。形質転換手法が、いくつかの
穀物植物に対して、短期間に利用されるようになったの
で、いくつかの異種の保護のための同一のシステムを使
用することも可能である。
あり、そのため多数の親遺伝子（multiple parentage）
を含むハイブリッド株において検出することができる。
このことにより、保護株が親として使用されたかについ
て決定することが可能である。エレメントは、トランス
ポゼースの非存在下で安定であり、そのため、この品種
の使用全てにおいて“フィンガープリント”が用いられ
得る。Dsは、存在する全てのコーン株において存在す
る、本来的に発生する配列である。これが如何なるタン
パク質もコードせず、トランスポゼースの非存在下では
何の遺伝効果も持たないので、ほとんど制御問題がな
い。最終品種をマークするために使用され得る場合又は
育種プログラムの初期段階で導入され得る場合に、この
システムは変わりやすい。形質転換手法が、いくつかの
穀物植物に対して、短期間に利用されるようになったの
で、いくつかの異種の保護のための同一のシステムを使
用することも可能である。
実際問題として、ある繁殖業者が商品化を請け合う有
望な株を同定すると、外来配列はこの変種の植物に導入
される。少なくとも植物へのDNAの導入には３種の異な
る方法を使用することができる。形質転換ベクターは、
トランスポゼース遺伝子とDsマーカーの両方を含むこと
ができる。これらのエレメントは、２種の異なったベク
ターによる同時トランスフォームにより同一の植物へ導
入することができ、又はこの配列を２種の異なった植物
に導入し、遺伝的混成によって結合することができる。
遺伝子導入株は、育種プログラムの段階と同様に種の生
殖性に依存して、成長して、自殖される（selfed）か、
又は形質転換していない同胞種と交雑されるであろう。
Dsエレメントを含むがトランスポゼース遺伝子をない子
孫では、上記したように、Ds挿入部位が特徴づけられ
る。このような挿入部位フィンガープリントが同定され
ると、将来の使用（future use）が記録される。
望な株を同定すると、外来配列はこの変種の植物に導入
される。少なくとも植物へのDNAの導入には３種の異な
る方法を使用することができる。形質転換ベクターは、
トランスポゼース遺伝子とDsマーカーの両方を含むこと
ができる。これらのエレメントは、２種の異なったベク
ターによる同時トランスフォームにより同一の植物へ導
入することができ、又はこの配列を２種の異なった植物
に導入し、遺伝的混成によって結合することができる。
遺伝子導入株は、育種プログラムの段階と同様に種の生
殖性に依存して、成長して、自殖される（selfed）か、
又は形質転換していない同胞種と交雑されるであろう。
Dsエレメントを含むがトランスポゼース遺伝子をない子
孫では、上記したように、Ds挿入部位が特徴づけられ
る。このような挿入部位フィンガープリントが同定され
ると、将来の使用（future use）が記録される。
想定された繁殖業者が有標物から誘導した全ての将来
的に品種として得られる変種も、特徴的なDs挿入部の存
在を簡単に試験することができる。想定株からのDNA
は、保護品種における部位の特徴付けに用いられた同一
組み合わせの酵素によって分解され、Dsエレメントを用
いて調査される。親から得た挿入パターンの再生は、共
通の祖先であることを示している。
的に品種として得られる変種も、特徴的なDs挿入部の存
在を簡単に試験することができる。想定株からのDNA
は、保護品種における部位の特徴付けに用いられた同一
組み合わせの酵素によって分解され、Dsエレメントを用
いて調査される。親から得た挿入パターンの再生は、共
通の祖先であることを示している。
変種保護のこの方法のいくつかの修飾には、トランス
ポゾンの使用が考えられる。トランスポゼース遺伝子と
Dsマーカーとを同一プラスミド上に有する形質転換ベク
ターを作ることは可能であり、これによって導入過程が
単純化される。Dsエレメントは、その診断を簡単にする
ように構築することができる。即ち、このような変更に
は、容易に分析できる遺伝子を、エレメントに又は非放
射性検出を行うことができる他の配列にクローニングす
ることが含まれる。植物あたり１染色体以上マークする
ために多数のDs挿入部分を使用することも、また可能で
ある。
ポゾンの使用が考えられる。トランスポゼース遺伝子と
Dsマーカーとを同一プラスミド上に有する形質転換ベク
ターを作ることは可能であり、これによって導入過程が
単純化される。Dsエレメントは、その診断を簡単にする
ように構築することができる。即ち、このような変更に
は、容易に分析できる遺伝子を、エレメントに又は非放
射性検出を行うことができる他の配列にクローニングす
ることが含まれる。植物あたり１染色体以上マークする
ために多数のDs挿入部分を使用することも、また可能で
ある。
VII.遺伝子発現の最適化（optimizing） 遺伝子発現の変化は染色体である遺伝子の位置に基づ
いて観察される。ジョンズ（Jones）らのEMBO J.,4:241
1−2418（1985）参照。本発明の方法は、対象遺伝子の
発現を最適化するために用いられ得る。対象遺伝子の転
位は、上述したように、所望の遺伝子を有し所望の発現
レベルである遺伝子導入植物を得るために、トランスポ
ゾン末端間に所望の遺伝子を挿入することによって、引
き起こされ得る。トランスポゾン末端間にクローン化さ
れた所望遺伝子を含む形質転換植物が得られる。上述し
た全ての方法によっても転位は引き起こされ、得られた
子孫又は形質転換体から最適な遺伝子発現を有するもの
が選択される。この方法は、特に形質転換することが困
難な植物において有効となり得る。トランスポゾン内に
対象遺伝子を含む形質転換植物が得られると、最適な遺
伝子発現を有する植物が得られるまで、転位は交雑又は
体細胞分裂によって誘導される。最適な遺伝子発現を有
するものを選ぶために、得られた子孫を試験する。最適
な遺伝子発現は、対象遺伝子及びそれがコードする表現
型に基づいて実質的に決定される。
いて観察される。ジョンズ（Jones）らのEMBO J.,4:241
1−2418（1985）参照。本発明の方法は、対象遺伝子の
発現を最適化するために用いられ得る。対象遺伝子の転
位は、上述したように、所望の遺伝子を有し所望の発現
レベルである遺伝子導入植物を得るために、トランスポ
ゾン末端間に所望の遺伝子を挿入することによって、引
き起こされ得る。トランスポゾン末端間にクローン化さ
れた所望遺伝子を含む形質転換植物が得られる。上述し
た全ての方法によっても転位は引き起こされ、得られた
子孫又は形質転換体から最適な遺伝子発現を有するもの
が選択される。この方法は、特に形質転換することが困
難な植物において有効となり得る。トランスポゾン内に
対象遺伝子を含む形質転換植物が得られると、最適な遺
伝子発現を有する植物が得られるまで、転位は交雑又は
体細胞分裂によって誘導される。最適な遺伝子発現を有
するものを選ぶために、得られた子孫を試験する。最適
な遺伝子発現は、対象遺伝子及びそれがコードする表現
型に基づいて実質的に決定される。
VIII.追加定義 本発明の目的において、“植物”とは、植物細胞、植
物種子及び植物の如何なる部分をも含む。“遺伝子導入
植物”とは、ゲノムに外来核酸を組み込んでいる如何な
る植物をも含む。
物種子及び植物の如何なる部分をも含む。“遺伝子導入
植物”とは、ゲノムに外来核酸を組み込んでいる如何な
る植物をも含む。
後述の実施例は例証のために提供され、また、請求項
に基づいた制限に支配されない。
に基づいた制限に支配されない。
実施例 I.ベクターの構築 A.別々のベクターへ対象遺伝子と共にAc及びDsエレメン
トを組み込んだプラスミド 1.pMACの構築 Acエレメントと隣接するwx配列（ボーレンス（Behren
s）ら,Mol.Gen.Gent.,194:346−347（1984）、これは援
用して本文の一部とする）を含むラムダクローンをBg1
IIで分解し、pUC13（メジング（Messing）,J.,Methods
in Enzymology,101（1983））のBam HI部位にサブクロ
ーン化した。この中間ベクターはSal I及びPst Iで切
り、Acを含む6kbのフラグメントを、Tiを基にしたベク
ターpMON200（フラリーら,Biotech,3:629−635（198
5）、これは援用して本文の一部とする）のXho I部位に
クローン化した。これによって得られたコンストラクシ
ョンはpMACの呼ばれた。pMACの形質転換部位の制限マッ
プを図１に示した。
トを組み込んだプラスミド 1.pMACの構築 Acエレメントと隣接するwx配列（ボーレンス（Behren
s）ら,Mol.Gen.Gent.,194:346−347（1984）、これは援
用して本文の一部とする）を含むラムダクローンをBg1
IIで分解し、pUC13（メジング（Messing）,J.,Methods
in Enzymology,101（1983））のBam HI部位にサブクロ
ーン化した。この中間ベクターはSal I及びPst Iで切
り、Acを含む6kbのフラグメントを、Tiを基にしたベク
ターpMON200（フラリーら,Biotech,3:629−635（198
5）、これは援用して本文の一部とする）のXho I部位に
クローン化した。これによって得られたコンストラクシ
ョンはpMACの呼ばれた。pMACの形質転換部位の制限マッ
プを図１に示した。
2.pDs203の構築 pDs203は、隣接するトウモロコシAdh1配列（サットン
（Sutton）ら,Science,223:1265−1268（1984）、これ
は援用して本文の一部とする）と共にDslエレメントを
含むpMON200の誘導体である。これは、pMON200のEcoR I
部位で、pDs2.Aの750bpのHind III−BamH Iフラグメン
トの平滑末端クローン化によって調製した。このコンス
トラクションのマップは図２に示される。
（Sutton）ら,Science,223:1265−1268（1984）、これ
は援用して本文の一部とする）と共にDslエレメントを
含むpMON200の誘導体である。これは、pMON200のEcoR I
部位で、pDs2.Aの750bpのHind III−BamH Iフラグメン
トの平滑末端クローン化によって調製した。このコンス
トラクションのマップは図２に示される。
3.pDs202の構築 プラスミドpDs202は、pMACの誘導体であり、Acの中央
のHind IIIフラグメントと置換しているバクテリアのβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子（Bgal）を含んでいる。これ
は２段階によって構築された。Hind III部位を含んでい
るＴ−DNAの800bp Sac Iフラグメントは、pMACをSac I
で分解すること及び、この誘導プラスミドを再結合する
こと（recircularizing）によって、pMACから削除され
た。Acエレメントの中央から1.6kbフラグメントを除去
するHind IIIによる分解後、pMAC誘導体は、バチルス・
サブチリス（Bucillus subtilis）のpolCプロモーター
（オット（Ott）ら,Mol.Gen.Genet.,207:335−341,198
7）の制御下にある大腸菌（E,coli）のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を含む4.7kb Hind IIIフラグメントと連結
された。このライゲーション混合体は、大腸菌DHα５を
形質転換し、組み換えプラスミドは、Ｘ−gal（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）のプレート上で、スペクチノマイシン及び
ストレプトマイシン耐性の青いコロニーをスクリーニン
グすることによって選択された。Ds202として表されたD
sエレメントは、図３に示されている。
のHind IIIフラグメントと置換しているバクテリアのβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子（Bgal）を含んでいる。これ
は２段階によって構築された。Hind III部位を含んでい
るＴ−DNAの800bp Sac Iフラグメントは、pMACをSac I
で分解すること及び、この誘導プラスミドを再結合する
こと（recircularizing）によって、pMACから削除され
た。Acエレメントの中央から1.6kbフラグメントを除去
するHind IIIによる分解後、pMAC誘導体は、バチルス・
サブチリス（Bucillus subtilis）のpolCプロモーター
（オット（Ott）ら,Mol.Gen.Genet.,207:335−341,198
7）の制御下にある大腸菌（E,coli）のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を含む4.7kb Hind IIIフラグメントと連結
された。このライゲーション混合体は、大腸菌DHα５を
形質転換し、組み換えプラスミドは、Ｘ−gal（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）のプレート上で、スペクチノマイシン及び
ストレプトマイシン耐性の青いコロニーをスクリーニン
グすることによって選択された。Ds202として表されたD
sエレメントは、図３に示されている。
4.トランスポゼースエレメントTs105の構築 安定なトランスポゼースエレメントを構築するため
に、Ac転写物の３′末端に最も近いAc末端部を削除し
た。pJAC（ボーレンス（Behrens）ら,Mol.Gen.Gent.,19
4:346−347（1984））を、pBR322ベクター中の単一部位
を切断するCla Iで分解した。エクソヌクレアーゼIII及
びSlヌクレアーゼは、再結合及び大腸菌への形質転換前
に平滑末端へCla Iリンカーを結合させた以外は、ヘニ
コフ（Henikoff）（1984）によって記述されたように、
プラスミド欠失誘導体（plasmid deletion derivative
s）を作製するために用いた。コロニーから単離されたD
NAを、Acの末端部から約50bp欠失している誘導体を見つ
けるために、制限酵素解析（restriction analysis）に
よって分析した。全Acトランスポゼースコード化領域を
含む4.3kbフラグメントは、Cla I及びBamH Iで分解する
ことにより得られた。トランスポゼース遺伝子を含むBa
m I−Cla Iフラグメントの両末端部は、クレノウ（klen
ow）酵素及びデオキシヌクレオチド三リン酸とで満たさ
れ、このフラグメントは、EcoR Iで分解され平滑末端を
有し脱リン酸化されたpMON200に、クローン化された。T
s105として表されたこのエレメントは図４に示されてい
る。
に、Ac転写物の３′末端に最も近いAc末端部を削除し
た。pJAC（ボーレンス（Behrens）ら,Mol.Gen.Gent.,19
4:346−347（1984））を、pBR322ベクター中の単一部位
を切断するCla Iで分解した。エクソヌクレアーゼIII及
びSlヌクレアーゼは、再結合及び大腸菌への形質転換前
に平滑末端へCla Iリンカーを結合させた以外は、ヘニ
コフ（Henikoff）（1984）によって記述されたように、
プラスミド欠失誘導体（plasmid deletion derivative
s）を作製するために用いた。コロニーから単離されたD
NAを、Acの末端部から約50bp欠失している誘導体を見つ
けるために、制限酵素解析（restriction analysis）に
よって分析した。全Acトランスポゼースコード化領域を
含む4.3kbフラグメントは、Cla I及びBamH Iで分解する
ことにより得られた。トランスポゼース遺伝子を含むBa
m I−Cla Iフラグメントの両末端部は、クレノウ（klen
ow）酵素及びデオキシヌクレオチド三リン酸とで満たさ
れ、このフラグメントは、EcoR Iで分解され平滑末端を
有し脱リン酸化されたpMON200に、クローン化された。T
s105として表されたこのエレメントは図４に示されてい
る。
5.pTV101の構築 pDs202からのDNAはHind IIIで分解され、オーバーハ
ンディン末端（overhanding ends）は、クレノウポリメ
ラーゼ及びデオキシヌクレオチドを用いて満たされる。
分離反応では、プラスミドpUC19（ヤニッシュ−ペロン
（Yanische−Perron）,C.ら,Gene,33:103−119（198
5））をPve IIで切り、ポリリンカーを含む30塩基対（b
p）フラグメントを調製アガロースゲルで単離する。こ
のフラグメントの両末端部を同様にクレノウポリメラー
ゼで満たし、この300bpのフラグメントをpDs202の平滑
末端化したHind III部位に挿入する。この中間ベクター
の確認後、相いれないBgl II末端及びCla I末端を有す
るベクターの直線化になるように、ベクターをBgl II及
びCla Iで分解する。分離反応では、pJACからの4.3kbト
ランスポゼースコード化フラグメントは、上述したよう
に、その後のBamH I及びCla Iによる分解によって単離
される。このフラグメントは、Bgl II及びCla Iで分解
されたpDs202中間体へ接続（ligate）された。このベク
ターpTV101は、その内部にポリリンカーを有した非自律
性Dsエレメントと安定なトランスポゼースコード化配列
を含み、図５に示されている。
ンディン末端（overhanding ends）は、クレノウポリメ
ラーゼ及びデオキシヌクレオチドを用いて満たされる。
分離反応では、プラスミドpUC19（ヤニッシュ−ペロン
（Yanische−Perron）,C.ら,Gene,33:103−119（198
5））をPve IIで切り、ポリリンカーを含む30塩基対（b
p）フラグメントを調製アガロースゲルで単離する。こ
のフラグメントの両末端部を同様にクレノウポリメラー
ゼで満たし、この300bpのフラグメントをpDs202の平滑
末端化したHind III部位に挿入する。この中間ベクター
の確認後、相いれないBgl II末端及びCla I末端を有す
るベクターの直線化になるように、ベクターをBgl II及
びCla Iで分解する。分離反応では、pJACからの4.3kbト
ランスポゼースコード化フラグメントは、上述したよう
に、その後のBamH I及びCla Iによる分解によって単離
される。このフラグメントは、Bgl II及びCla Iで分解
されたpDs202中間体へ接続（ligate）された。このベク
ターpTV101は、その内部にポリリンカーを有した非自律
性Dsエレメントと安定なトランスポゼースコード化配列
を含み、図５に示されている。
6.B.t.k.遺伝子を含むpBT101及びpBT201の構築には、下
記セクションIIIを参照のこと II.遺伝子導入植物の形質転換及び解析 A.植物形質転換 上記の構築は、フラリーら（1985）によって既述され
た三種交配（triparental mating）によって、アグロバ
クテリウム・テュメファシエンスGV311SE（モンサント
（Monsanto），セントルイス，モンタナ州）へ導入され
た。リコパルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon e
sculentum）×リコパルシコン・ペレリ（L.pennelli）
のF1ハイブリッド及びコパルシコン・エスクレンタム品
種のVF36及びVFNTチェリーを、公表された形質転換手法
（コールンニーフ（Koornneef）ら,Plant Sci.,45:201
−208,1986）；フィラッティ（Fillatti）ら,Bio/Techn
ology,5:726−730,1987）に基づいて形質転換した。種
子は市販の50％漂白剤（bleach）中で１時間表面滅菌さ
れ、MSSV培地（フィラッティら,1987）中で発芽させ
た。４から７日齢の子葉を切り取り、2Z培地（トーマス
（Thomas）とプラット（Pratt）,Theor,Appl.Genet.59:
215−219,1981）上に１−2mlの懸濁培地中のタバコ細胞
をデカントして調製された、新鮮なタバコフィーダープ
レート（tobacco feeder plates）中に配置した。48時
間後に、この子葉は、0.1のOD600値まで希釈したアグロ
バクテリウムの一晩培養物の５分間浸された。それら
を、次いでブロットして乾燥させ、フィーダープレート
上に置き戻した。24時間後、外植片を、350mg/lのカル
ベニシリン（ファイザー、ニューヨーク、ニューヨーク
州）及び100mg/lの硫酸カナマイシン（ベーリンガー−
マンハイム、西ドイツ）を添加した2Z培地に移した。切
り取られた苗条は、50mg/lのカナマイシンを含有する培
地に根付かせた。各形質転換体が独立して誘導されたこ
とを確認するため、カナマイシン耐性実生（seedling）
を外植片当たりにただ１つだけ、増殖させた。
記セクションIIIを参照のこと II.遺伝子導入植物の形質転換及び解析 A.植物形質転換 上記の構築は、フラリーら（1985）によって既述され
た三種交配（triparental mating）によって、アグロバ
クテリウム・テュメファシエンスGV311SE（モンサント
（Monsanto），セントルイス，モンタナ州）へ導入され
た。リコパルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon e
sculentum）×リコパルシコン・ペレリ（L.pennelli）
のF1ハイブリッド及びコパルシコン・エスクレンタム品
種のVF36及びVFNTチェリーを、公表された形質転換手法
（コールンニーフ（Koornneef）ら,Plant Sci.,45:201
−208,1986）；フィラッティ（Fillatti）ら,Bio/Techn
ology,5:726−730,1987）に基づいて形質転換した。種
子は市販の50％漂白剤（bleach）中で１時間表面滅菌さ
れ、MSSV培地（フィラッティら,1987）中で発芽させ
た。４から７日齢の子葉を切り取り、2Z培地（トーマス
（Thomas）とプラット（Pratt）,Theor,Appl.Genet.59:
215−219,1981）上に１−2mlの懸濁培地中のタバコ細胞
をデカントして調製された、新鮮なタバコフィーダープ
レート（tobacco feeder plates）中に配置した。48時
間後に、この子葉は、0.1のOD600値まで希釈したアグロ
バクテリウムの一晩培養物の５分間浸された。それら
を、次いでブロットして乾燥させ、フィーダープレート
上に置き戻した。24時間後、外植片を、350mg/lのカル
ベニシリン（ファイザー、ニューヨーク、ニューヨーク
州）及び100mg/lの硫酸カナマイシン（ベーリンガー−
マンハイム、西ドイツ）を添加した2Z培地に移した。切
り取られた苗条は、50mg/lのカナマイシンを含有する培
地に根付かせた。各形質転換体が独立して誘導されたこ
とを確認するため、カナマイシン耐性実生（seedling）
を外植片当たりにただ１つだけ、増殖させた。
遺伝子導入植物はサザンブロット解析を用いて解析さ
れた。ジェノミックDNAを、援用して本文の一部とした
ベルナツキー（Bernatzky）とタンクスレイ（Tanksle
y）のTheor.Appl.Genet.,72:314−321（1986）に記述さ
れているCTAB法によって、凍結植物組織から単離した。
10μｇのジェノミックDNAが、4mMのスペルミジン（シグ
マケミカルズ（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、
ミズーリ州）を添加して、製造者の推薦に従って、制限
酵素で分解した。試料は、0.8％アガロースゲルで電気
泳動的に分離され、ゼータ−プローブ（バイオラドラボ
ラトリーズ（BioRad Laboratories），リッチモンド、
カリフォルニア州）又はハイボンド−Ｎ（Hybond−Ｎ）
（アマシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州）に移
し取られた。プレハイブリダイゼーション（４時間）及
びハイブリダイゼーション（16時間）を、５×SSC、10
×デンハート液（デンハート（Denhardt）、Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,23:641（1966））、50mMのリン酸ナ
トリウムバッファー（pH7.0）、10％硫酸デキストラ
ン、１％SDS、500μg/ml変性サケ精子DNA（シグマ）及
び50％ホルムアミド中で42℃にて処理した。ハイブリダ
イゼーション後、フィルターは、65℃で２時間、0.2×S
SC、１％SDS、0.1％ピロリン酸ナトリウム中で洗った。
この洗浄液は４又は５回交換した。再調査（reprobin
g）前に、フィルターは、洗浄液を用いて95℃で２回15
分間の洗浄を行うことによって、はぎ取られた。
れた。ジェノミックDNAを、援用して本文の一部とした
ベルナツキー（Bernatzky）とタンクスレイ（Tanksle
y）のTheor.Appl.Genet.,72:314−321（1986）に記述さ
れているCTAB法によって、凍結植物組織から単離した。
10μｇのジェノミックDNAが、4mMのスペルミジン（シグ
マケミカルズ（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、
ミズーリ州）を添加して、製造者の推薦に従って、制限
酵素で分解した。試料は、0.8％アガロースゲルで電気
泳動的に分離され、ゼータ−プローブ（バイオラドラボ
ラトリーズ（BioRad Laboratories），リッチモンド、
カリフォルニア州）又はハイボンド−Ｎ（Hybond−Ｎ）
（アマシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州）に移
し取られた。プレハイブリダイゼーション（４時間）及
びハイブリダイゼーション（16時間）を、５×SSC、10
×デンハート液（デンハート（Denhardt）、Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,23:641（1966））、50mMのリン酸ナ
トリウムバッファー（pH7.0）、10％硫酸デキストラ
ン、１％SDS、500μg/ml変性サケ精子DNA（シグマ）及
び50％ホルムアミド中で42℃にて処理した。ハイブリダ
イゼーション後、フィルターは、65℃で２時間、0.2×S
SC、１％SDS、0.1％ピロリン酸ナトリウム中で洗った。
この洗浄液は４又は５回交換した。再調査（reprobin
g）前に、フィルターは、洗浄液を用いて95℃で２回15
分間の洗浄を行うことによって、はぎ取られた。
pJAC−Ｄ（ヨダーら,1988）からの4.3kb Cla I−BamH
Iフラグメントは、Ac特異的プローブとして用いられ
た。wx特異的プローブのためのDNAは、pSALC（シュア
（Shure）ら,Cell,35:235−242（1983））からの3.2kb
Sal Iフラグメントとして単離された。Ds1と隣接トウモ
ロコシAdhl配列に相同の0.75kbフラグメントは、pDS2.A
（サットンら,Science,223:1265−1268（1984））からH
ind III及びBamH Iで分解することによって、単離され
た。１μｇのpDS2.A（サットンら,1984）について、プ
ライマーCGCTCCTCACAGGCTCATCTC及びCCTCCGCAAATCTTCGA
ACAGとのポリメラーゼ連鎖反応（サイキ（Saiki）ら,Sc
ience,239:487−491,1988）を用いて、内部（interna
l）Ds1プローブに用いられる300bpDNAフラグメントが合
成された。DNAは、後述のレジメを用いて30サイクルの
増幅を行った。即ち、（１）96℃２分（２）45℃２分及
び（３）72℃２分。プローブに用いられる全てのDNAフ
ラグメントは、アガロースゲルでの２回の電気泳動を行
い、低融点アガロースゲル中で二次分離を行った。アガ
ロース濃度は、0.5％又はそれ以下にH2Oで希釈され、DN
Aは、市販キット（アマシャム）を用いたランダムプラ
イマー法（ファインベルグ（Feinberg）とフォーゲルシ
ュタイン（Vogelstein）,Anal.Biochem.,132:6−13,198
3）によりラベルされた。
Iフラグメントは、Ac特異的プローブとして用いられ
た。wx特異的プローブのためのDNAは、pSALC（シュア
（Shure）ら,Cell,35:235−242（1983））からの3.2kb
Sal Iフラグメントとして単離された。Ds1と隣接トウモ
ロコシAdhl配列に相同の0.75kbフラグメントは、pDS2.A
（サットンら,Science,223:1265−1268（1984））からH
ind III及びBamH Iで分解することによって、単離され
た。１μｇのpDS2.A（サットンら,1984）について、プ
ライマーCGCTCCTCACAGGCTCATCTC及びCCTCCGCAAATCTTCGA
ACAGとのポリメラーゼ連鎖反応（サイキ（Saiki）ら,Sc
ience,239:487−491,1988）を用いて、内部（interna
l）Ds1プローブに用いられる300bpDNAフラグメントが合
成された。DNAは、後述のレジメを用いて30サイクルの
増幅を行った。即ち、（１）96℃２分（２）45℃２分及
び（３）72℃２分。プローブに用いられる全てのDNAフ
ラグメントは、アガロースゲルでの２回の電気泳動を行
い、低融点アガロースゲル中で二次分離を行った。アガ
ロース濃度は、0.5％又はそれ以下にH2Oで希釈され、DN
Aは、市販キット（アマシャム）を用いたランダムプラ
イマー法（ファインベルグ（Feinberg）とフォーゲルシ
ュタイン（Vogelstein）,Anal.Biochem.,132:6−13,198
3）によりラベルされた。
B.形質転換植物細胞の解析 1.Acに対する反応性を削除されたDs1 Ds1を含んだ２つの一次トマト形質転換体からのDNA
は、Ｔ−DNAの組み込み及び挿入数を決定するため、サ
ザン解析によって試験された。植物T23−03のサザン解
析は、Ｔ−DNAの１つの左境界及び１つの右境界の存在
を示した。これは、この植物がDs1エレメントを１コピ
ー含んでいたことを示唆した。二次植物の解析は、形質
転換体T26−18が２つの左境界及び２つの右境界を含む
ことを示し、タンデムＴ−DNA挿入部中で連結されてい
ない２つのDs1エレメントの存在を示唆した。援用して
本文の一部としたヨダーらのMol.Gen.Genet.,213:291−
296（1988）で記述された戦略を用いた植物T16−03から
単離したDNAの解析は、少なくとも１つの活性Acエレメ
ントの存在を示した。
は、Ｔ−DNAの組み込み及び挿入数を決定するため、サ
ザン解析によって試験された。植物T23−03のサザン解
析は、Ｔ−DNAの１つの左境界及び１つの右境界の存在
を示した。これは、この植物がDs1エレメントを１コピ
ー含んでいたことを示唆した。二次植物の解析は、形質
転換体T26−18が２つの左境界及び２つの右境界を含む
ことを示し、タンデムＴ−DNA挿入部中で連結されてい
ない２つのDs1エレメントの存在を示唆した。援用して
本文の一部としたヨダーらのMol.Gen.Genet.,213:291−
296（1988）で記述された戦略を用いた植物T16−03から
単離したDNAの解析は、少なくとも１つの活性Acエレメ
ントの存在を示した。
Ds1で形質転換された植物は、Ac形質転換体との交雑
に花粉供与体として用られ、F1子孫が成長し、DNAが個
々の子孫の葉組織から単離された。親が導入された遺伝
子としての半接合体であったので、転位因子が、T16−0
3及びT27−03植物の約50％の子孫へ、及びT26−18植物
の約75％の子孫へ転移すると期待した。その子孫がAc、
Ds1又はその双方を受け継いでいるか決定するためにサ
ザン解析を行った。更に、本来の位置からDs1が削除さ
れているかを決定することも可能であった。
に花粉供与体として用られ、F1子孫が成長し、DNAが個
々の子孫の葉組織から単離された。親が導入された遺伝
子としての半接合体であったので、転位因子が、T16−0
3及びT27−03植物の約50％の子孫へ、及びT26−18植物
の約75％の子孫へ転移すると期待した。その子孫がAc、
Ds1又はその双方を受け継いでいるか決定するためにサ
ザン解析を行った。更に、本来の位置からDs1が削除さ
れているかを決定することも可能であった。
ここで述べる転位因子の常在位置（resident locatio
n）は、Ｔ−DNAの本来の位置を指す。因子が転位中に削
除される場合、因子のないＴ−DNAから成る空供与部位
（empty donor site）が残る。植物DNAをBamH I及びHin
d IIIで分解後、Ds1常在位置は2.1kbの制限フラグメン
ト上にあり、即ち、Ds1がその常在位置から削除される
ならば、1.7kbの空供与部位が予想される（図１）。Ac
のBamH I−Hind III同時分解（double digestion）は、
これらの解析に用いたAcプローブに対して相同な３種の
制限フラグメントを産生する。２つの1.6kb制限フラグ
メントは、Acの内部にあり、そのためトマトゲノムでの
Acの位置に拘らず存在する。AcがＴ−DNA中の常在位置
にある場合は、第３の制限フラグメントのサイズは2.4k
bである。Acが転位すると、この第３の制限フラグメン
トは1.2kbのAcと最も近いBamH I又はHind III部位まで
伸長している隣接するトマトDNAとから成り、従ってこ
の制限フラグメントは、トマトゲノム中のAcの各位置に
よって違うサイズとなる。バンドパターン（Acプロー
ブ）の変化は、Acが、全ての子孫が示す常在位置と違う
位置にあることを示唆する。
n）は、Ｔ−DNAの本来の位置を指す。因子が転位中に削
除される場合、因子のないＴ−DNAから成る空供与部位
（empty donor site）が残る。植物DNAをBamH I及びHin
d IIIで分解後、Ds1常在位置は2.1kbの制限フラグメン
ト上にあり、即ち、Ds1がその常在位置から削除される
ならば、1.7kbの空供与部位が予想される（図１）。Ac
のBamH I−Hind III同時分解（double digestion）は、
これらの解析に用いたAcプローブに対して相同な３種の
制限フラグメントを産生する。２つの1.6kb制限フラグ
メントは、Acの内部にあり、そのためトマトゲノムでの
Acの位置に拘らず存在する。AcがＴ−DNA中の常在位置
にある場合は、第３の制限フラグメントのサイズは2.4k
bである。Acが転位すると、この第３の制限フラグメン
トは1.2kbのAcと最も近いBamH I又はHind III部位まで
伸長している隣接するトマトDNAとから成り、従ってこ
の制限フラグメントは、トマトゲノム中のAcの各位置に
よって違うサイズとなる。バンドパターン（Acプロー
ブ）の変化は、Acが、全ての子孫が示す常在位置と違う
位置にあることを示唆する。
Ac（T16−03）とDs1（T27−03及びT26−18）間の交雑
により得られた24のF1子孫についてのサザンハイブリダ
イゼーション解析を表１に示す。表１に示されたAcとDs
の分離は、T27−３での１つのDs1座、T26−18での連結
していない２つのDs1座及びT16−３での１つのAc座の存
在と矛盾しない。５つの子孫は、Ds1を含んでいたがAc
はなかった、即ちこれらの植物では、空供与部位は検出
されなかった。11の同胞細胞はAcとDs1を共に含み、即
ち全てが空供与部位と予想されるサイズのバンドを有し
ていた。空供与部位に対する常在部位の割合は、実施し
た物質が転位した及び転位していないDs1エレメントの
両方を含んでいるならば期待されるように、植物毎に異
なった。これらの結果は、Ds1がAcの非存在下において
安定であることを示している。しかし、Acエレメントが
同一植物中に存在すると、Ds1は削除することができ
た。
により得られた24のF1子孫についてのサザンハイブリダ
イゼーション解析を表１に示す。表１に示されたAcとDs
の分離は、T27−３での１つのDs1座、T26−18での連結
していない２つのDs1座及びT16−３での１つのAc座の存
在と矛盾しない。５つの子孫は、Ds1を含んでいたがAc
はなかった、即ちこれらの植物では、空供与部位は検出
されなかった。11の同胞細胞はAcとDs1を共に含み、即
ち全てが空供与部位と予想されるサイズのバンドを有し
ていた。空供与部位に対する常在部位の割合は、実施し
た物質が転位した及び転位していないDs1エレメントの
両方を含んでいるならば期待されるように、植物毎に異
なった。これらの結果は、Ds1がAcの非存在下において
安定であることを示している。しかし、Acエレメントが
同一植物中に存在すると、Ds1は削除することができ
た。
2.Ds1を活性化した安定Tsエレメント Ts101を含む３つの一次形質転換体は、サザンハイブ
リダイゼーション法によって解析された。Ts101のBamH
I−Hind III同時分解により、Acプローブと相補的な３
つの制限フラグメントを得た。即ち、２つの1.6kbフラ
グメントはエレメントの内部にあり、１つの1.1kbフラ
グメントはＴ−DNA中へ伸びている。Ts101がトマトゲノ
ム中の新しい位置に転位すると、1.1kbフラグメントは
隣接するトマトDNA中の最も近いHind III又はBamH I部
位の位置に依存して、違うサイズとなる。３つの一次形
質転換体を解析したとき、1.6kbと1.1kbのバンドのみが
検出された。
リダイゼーション法によって解析された。Ts101のBamH
I−Hind III同時分解により、Acプローブと相補的な３
つの制限フラグメントを得た。即ち、２つの1.6kbフラ
グメントはエレメントの内部にあり、１つの1.1kbフラ
グメントはＴ−DNA中へ伸びている。Ts101がトマトゲノ
ム中の新しい位置に転位すると、1.1kbフラグメントは
隣接するトマトDNA中の最も近いHind III又はBamH I部
位の位置に依存して、違うサイズとなる。３つの一次形
質転換体を解析したとき、1.6kbと1.1kbのバンドのみが
検出された。
Ds１（T27−03）を含む遺伝子導入植物体は、Ts101
（T16−12）を含む遺伝子導入植物体と交雑され、F1子
孫はサザン解析法により試験された。Ts101とDs１の分
離は表１に示されており、T16−12中での１つのTs101座
の存在と矛盾しない。Acプローブを用いて調査したと
き、1.6kbと1.1kbのフラグメント以外の如何なるバンド
も、どの子孫は示さなかった。Ds１とAdh1配列の両方を
含むフラグメントで調査したとき、TsとDsエレメントの
両方を含む３つの植物体に空供与部位が見られた。即ち
Dsのみを含む３つの同胞細胞体は空供与部位を含まなか
った。Ds１はTs101の非存在下では安定であるが、Ts101
を含む全ての植物での常在位置からは削除された。
（T16−12）を含む遺伝子導入植物体と交雑され、F1子
孫はサザン解析法により試験された。Ts101とDs１の分
離は表１に示されており、T16−12中での１つのTs101座
の存在と矛盾しない。Acプローブを用いて調査したと
き、1.6kbと1.1kbのフラグメント以外の如何なるバンド
も、どの子孫は示さなかった。Ds１とAdh1配列の両方を
含むフラグメントで調査したとき、TsとDsエレメントの
両方を含む３つの植物体に空供与部位が見られた。即ち
Dsのみを含む３つの同胞細胞体は空供与部位を含まなか
った。Ds１はTs101の非存在下では安定であるが、Ts101
を含む全ての植物での常在位置からは削除された。
従って、DsエレメントであるDs202とDs１は、導入ト
ランスポゼースの非存在下において、遺伝子導入トマト
植物中で安定である。これらは、活性トランスポゼース
を含む遺伝子導入植物との交雑によって、遺伝子導入ト
マト中で交差的に作用（transactivated）され得る。Ds
エレメントは、共にＴ−DNA中の常在位置から削除さ
れ、トマトゲノム中の新しい位置に再び組み込まれる。
ランスポゼースの非存在下において、遺伝子導入トマト
植物中で安定である。これらは、活性トランスポゼース
を含む遺伝子導入植物との交雑によって、遺伝子導入ト
マト中で交差的に作用（transactivated）され得る。Ds
エレメントは、共にＴ−DNA中の常在位置から削除さ
れ、トマトゲノム中の新しい位置に再び組み込まれる。
Dsエレメントを活性化するための本来のAcエレメント
の使用に加えて、安定な誘導体であるTs101も使用し
た。Ts101がDsエレメントの転位を触媒するため、Acの
３′末端の50bpはAcのトランス作用機能にとって不必要
である。この発見は、Ac末端から265bpでAcの転写が終
了すると示唆する他の研究者のAc転写マッピングに基づ
いた予想と矛盾しない。
の使用に加えて、安定な誘導体であるTs101も使用し
た。Ts101がDsエレメントの転位を触媒するため、Acの
３′末端の50bpはAcのトランス作用機能にとって不必要
である。この発見は、Ac末端から265bpでAcの転写が終
了すると示唆する他の研究者のAc転写マッピングに基づ
いた予想と矛盾しない。
３つの一次形質転換体とTs101を含む６つの子孫につ
いて試験した。これらの植物体は、その常在位置で1.6k
bと1.1kbのTs101の特徴を示すバンド以外の、如何なる
フラグメントも含まれなかったので、我々はこのエレメ
ントの転位を検出しなかった。
いて試験した。これらの植物体は、その常在位置で1.6k
bと1.1kbのTs101の特徴を示すバンド以外の、如何なる
フラグメントも含まれなかったので、我々はこのエレメ
ントの転位を検出しなかった。
3.トマトゲノムに挿入されたDs1 Dsプローブは、Ds1と隣接するAdh1配列を共に含んで
いた。空供与部位を含む植物が、トマトゲノム中の新し
い位置で組み換えられたDsによって得られる新しいバン
ドも含むと予想された。1/10よりも少ない植物細胞にお
いて存在するバンドの検出が可能な条件においても、こ
のようなバンドは検出されなかった。Ac及びDs1を共に
含むF1植物（88−207B）が、自家受粉された。F2子孫
は、新しいDs1を含んでいるバンドの存在について分析
された。F2接合子が雄性と雌性配偶体の単一細胞の合体
によって形成されるため、接合子に伝達された如何なる
転移Ds１エレメントも、細胞当たり１か２コピー存在し
なければならない。これは多くの場合、サザン解析法に
より簡単に検出することができる。88−207B植物の子孫
は、数ケ所の新しい位置でのDs１の存在について分離し
た。従って、Ds１は、トマトゲノム中で新しい位置に再
び組み込まれていた。F1におけるこれらの新しい位置を
検出できなかったことは、試料とした植物組織における
如何なる特定位置も低い頻度であるためと考えるのが最
も適当であった。
いた。空供与部位を含む植物が、トマトゲノム中の新し
い位置で組み換えられたDsによって得られる新しいバン
ドも含むと予想された。1/10よりも少ない植物細胞にお
いて存在するバンドの検出が可能な条件においても、こ
のようなバンドは検出されなかった。Ac及びDs1を共に
含むF1植物（88−207B）が、自家受粉された。F2子孫
は、新しいDs1を含んでいるバンドの存在について分析
された。F2接合子が雄性と雌性配偶体の単一細胞の合体
によって形成されるため、接合子に伝達された如何なる
転移Ds１エレメントも、細胞当たり１か２コピー存在し
なければならない。これは多くの場合、サザン解析法に
より簡単に検出することができる。88−207B植物の子孫
は、数ケ所の新しい位置でのDs１の存在について分離し
た。従って、Ds１は、トマトゲノム中で新しい位置に再
び組み込まれていた。F1におけるこれらの新しい位置を
検出できなかったことは、試料とした植物組織における
如何なる特定位置も低い頻度であるためと考えるのが最
も適当であった。
4.Ac及びTs101の双方によってDs202が活性化された Ds202が、Acの中央部1.6kbのHind IIIフラグメントと
置換しているバクテリアβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
含むAcの誘導体であるので、両エレメントを含む植物の
解析は、それらの配列類似により複雑化している。しか
し、AcとDs202の常在及び空供与部位は、EcoR I−Sma I
同時分解を用いることによって区別することができる。
Ac202及びDsの両方に隣接している配列に対して相同で
あるwxプローブを用いることによって、Acの常在バンド
は4.3kbであり、空供与部位は2.6kbである。同一プロー
ブを用いると、Ds202は、3.5kbの常在バンドと1.8kbの
空供与部位を有する。
置換しているバクテリアβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
含むAcの誘導体であるので、両エレメントを含む植物の
解析は、それらの配列類似により複雑化している。しか
し、AcとDs202の常在及び空供与部位は、EcoR I−Sma I
同時分解を用いることによって区別することができる。
Ac202及びDsの両方に隣接している配列に対して相同で
あるwxプローブを用いることによって、Acの常在バンド
は4.3kbであり、空供与部位は2.6kbである。同一プロー
ブを用いると、Ds202は、3.5kbの常在バンドと1.8kbの
空供与部位を有する。
Ds202を含むトマト植物は、Ac及びTs101を含む植物と
交雑された。子孫におけるDs202の分離は、Ts20−14植
物の形質転換で導入された単一座と一致した（表１）。
Ac及びDs202について分離している子孫の解析では、Ac
及びDs202を共に含有している２つの系（lane）が、Ds2
02エレメントの空供与部位を示す唯一の系である。Ts10
1及びDs202を含んだ３つのF1子孫は、Ds202エレメント
の空供与部位を示す唯一の系であった。Ts101とDs202を
含む３つのF1子孫は、全て空供与部位を含んでいた。Ds
202のみを含みTs101を含まない２つの同胞細胞は、空供
与部位を含んでいなかった。Ds202は、導入トランスポ
ゼースを欠損している植物において安定であり、またAc
又はTs101のいずれかを含む、試験された全ての植物に
おいて、常在位置から切り取られた。
交雑された。子孫におけるDs202の分離は、Ts20−14植
物の形質転換で導入された単一座と一致した（表１）。
Ac及びDs202について分離している子孫の解析では、Ac
及びDs202を共に含有している２つの系（lane）が、Ds2
02エレメントの空供与部位を示す唯一の系である。Ts10
1及びDs202を含んだ３つのF1子孫は、Ds202エレメント
の空供与部位を示す唯一の系であった。Ts101とDs202を
含む３つのF1子孫は、全て空供与部位を含んでいた。Ds
202のみを含みTs101を含まない２つの同胞細胞は、空供
与部位を含んでいなかった。Ds202は、導入トランスポ
ゼースを欠損している植物において安定であり、またAc
又はTs101のいずれかを含む、試験された全ての植物に
おいて、常在位置から切り取られた。
Ds202を含む植物から単離したDNAをXba Iで分解した
場合、Dsエレメントが常在位置にあるときは、β−ガラ
クトシダーゼプローブは6.7kbフラグメントにハイブリ
ダイズし、Ds202が転位ならば、6.5kb以上の異なったサ
イズのフラグメント上にあることが予想される。Ds202
がトマトゲノム中の新しい位置に組み込んだかどうかを
決定するために、このような解析に、F1植物（Ac×Ds20
2及びTs101×Ds202の子孫）を用いた；我々は、常在位
置にDs202を示す6.7kbのバンドを検出しただけであっ
た。次いで、Ac×Ds202交雑のF2子孫を解析した。Ds202
形質転換体は、多重Ｔ−DNA挿入部を含むF1親株であるT
22−25とDs202の多重座とを作製するために用いられ
た。20のF2植物が試験されると、常在バンドと、Ds202
の１つのコピーがF1親での新しい位置に転位したことを
示唆する新しい8.8kbバンドとを、６つが含有してい
た。
場合、Dsエレメントが常在位置にあるときは、β−ガラ
クトシダーゼプローブは6.7kbフラグメントにハイブリ
ダイズし、Ds202が転位ならば、6.5kb以上の異なったサ
イズのフラグメント上にあることが予想される。Ds202
がトマトゲノム中の新しい位置に組み込んだかどうかを
決定するために、このような解析に、F1植物（Ac×Ds20
2及びTs101×Ds202の子孫）を用いた；我々は、常在位
置にDs202を示す6.7kbのバンドを検出しただけであっ
た。次いで、Ac×Ds202交雑のF2子孫を解析した。Ds202
形質転換体は、多重Ｔ−DNA挿入部を含むF1親株であるT
22−25とDs202の多重座とを作製するために用いられ
た。20のF2植物が試験されると、常在バンドと、Ds202
の１つのコピーがF1親での新しい位置に転位したことを
示唆する新しい8.8kbバンドとを、６つが含有してい
た。
C.遺伝子導入トマト植物のR0からF1世代への転位された
Acエレメントの有性伝達の特徴付け トマト品種VF36は、上記したようにpMACを用いて形質
転換された。一次形質転換体はR0と呼ばれる。即ち、R0
植物の自殖（selfing）により得られた子孫はここで
は、このためF1とする。
Acエレメントの有性伝達の特徴付け トマト品種VF36は、上記したようにpMACを用いて形質
転換された。一次形質転換体はR0と呼ばれる。即ち、R0
植物の自殖（selfing）により得られた子孫はここで
は、このためF1とする。
自己種子（self seed）を30の一次形質転換体から集
め、１族当たり20から100の種子をグリーンハウスに撒
いた。子孫は、表現型染色異常について視覚的に評価さ
れ、対象表現型変異体を有した４つの族を、ここで記述
した分子解析で選択した。これらの４株は、丸葉型（rl
m）に分離した88−01;斑入りした葉の白化（variegated
laaf chlorosis）（var）に分離した88−08;致命的ア
ルビノ変異（lethal albino mutation）（lab）を示す8
8−14及び葉の白化と完全葉形（entire leaf shape）
（bzr）となる変異を含む88−94である。これらの変異
体のうち３つ（88−01、88−08、88−14）は、単純な単
一遺伝子劣性突然変異となるように一致する割合でF1子
孫中に分離した。第４の88−84は、約50実生にただ一度
現れた。遺伝子導入子孫中でのAcの挙動の世代図を得る
ために、表現型的には正常となる６つの族においてAcの
分離も特徴付けた。これら10の族を下記の表２に挙げ
た。
め、１族当たり20から100の種子をグリーンハウスに撒
いた。子孫は、表現型染色異常について視覚的に評価さ
れ、対象表現型変異体を有した４つの族を、ここで記述
した分子解析で選択した。これらの４株は、丸葉型（rl
m）に分離した88−01;斑入りした葉の白化（variegated
laaf chlorosis）（var）に分離した88−08;致命的ア
ルビノ変異（lethal albino mutation）（lab）を示す8
8−14及び葉の白化と完全葉形（entire leaf shape）
（bzr）となる変異を含む88−94である。これらの変異
体のうち３つ（88−01、88−08、88−14）は、単純な単
一遺伝子劣性突然変異となるように一致する割合でF1子
孫中に分離した。第４の88−84は、約50実生にただ一度
現れた。遺伝子導入子孫中でのAcの挙動の世代図を得る
ために、表現型的には正常となる６つの族においてAcの
分離も特徴付けた。これら10の族を下記の表２に挙げ
た。
サザンハイブリダイゼーションを、上記したように10
の選択された一次形質転換体の６から17の子孫に対して
行い、上記表２にその結果を示した。３つの基準によ
り、F1で体細胞的に起こったものから遺伝的に伝達され
るAc挿入部を識別した、即ち、同一の挿入が親と子孫植
物の双方に検出された；少なくとも２つの同胞細胞で同
一の挿入部が同時移入した；又は転位したAcエレメント
を含むがＴ−DNAを含まない子孫を得る有糸分裂組み換
え現象が検出された。
の選択された一次形質転換体の６から17の子孫に対して
行い、上記表２にその結果を示した。３つの基準によ
り、F1で体細胞的に起こったものから遺伝的に伝達され
るAc挿入部を識別した、即ち、同一の挿入が親と子孫植
物の双方に検出された；少なくとも２つの同胞細胞で同
一の挿入部が同時移入した；又は転位したAcエレメント
を含むがＴ−DNAを含まない子孫を得る有糸分裂組み換
え現象が検出された。
Ｔ−DNA配列を欠く子孫中での、転位したAcの存在
は、転位したAcが親から遺伝したものであることを示し
ている。このような現象には、親においてＴ−DNA座か
らAcが離れて転位することが必要である。それからこれ
は、２つの座の組み換え及び類別を起こさせる。そのた
め、Ｔ−DNAを伴わず遺伝されるAcは、親においてまず
転位しなければならない。Ac及びＴ−DNA配列の存在に
ついて子孫を評価するために、Hind III−BamH Iブロッ
トを、4.3kbAcプローブ及びwxプローブによって続いて
調査された。この分解は、Acプローブとハイブリダイズ
する内部の２本の1.6kbフラグメントのため、それらの
位置にかかわりなくAc配列の検出をすることができる。
wxプローブは、2.4kbの常在バンド又は3.0kbの空供与部
位のいずれかを検出した。更にブロットは、形質転換中
でのpMACのコピー数を決定するため、Ｔ−DNA右境界及
び左境界特異的プローブで調査された。常在又は空供与
部位フラグメントのいずれかとしてwx配列を含んだ全て
の子孫は、Ｔ−DNA境界配列も含んでいた。従って、wx
復帰遺伝子（revertant）バンド、pMAC常在バンド又は
Ｔ−DNA境界の存在は、Ｔ−DNA挿入座の同定に用いるこ
とができる。
は、転位したAcが親から遺伝したものであることを示し
ている。このような現象には、親においてＴ−DNA座か
らAcが離れて転位することが必要である。それからこれ
は、２つの座の組み換え及び類別を起こさせる。そのた
め、Ｔ−DNAを伴わず遺伝されるAcは、親においてまず
転位しなければならない。Ac及びＴ−DNA配列の存在に
ついて子孫を評価するために、Hind III−BamH Iブロッ
トを、4.3kbAcプローブ及びwxプローブによって続いて
調査された。この分解は、Acプローブとハイブリダイズ
する内部の２本の1.6kbフラグメントのため、それらの
位置にかかわりなくAc配列の検出をすることができる。
wxプローブは、2.4kbの常在バンド又は3.0kbの空供与部
位のいずれかを検出した。更にブロットは、形質転換中
でのpMACのコピー数を決定するため、Ｔ−DNA右境界及
び左境界特異的プローブで調査された。常在又は空供与
部位フラグメントのいずれかとしてwx配列を含んだ全て
の子孫は、Ｔ−DNA境界配列も含んでいた。従って、wx
復帰遺伝子（revertant）バンド、pMAC常在バンド又は
Ｔ−DNA境界の存在は、Ｔ−DNA挿入座の同定に用いるこ
とができる。
ある植物はAc配列を有するが、wx又はＴ−DNA配列を
含まない。この植物で見られるパターンは、転位Acとド
ナーpMACプラスミドとの間での有糸分裂的組み換えによ
って得られる。９つの試験した他の族におけるこの現象
の頻度は、後述する。
含まない。この植物で見られるパターンは、転位Acとド
ナーpMACプラスミドとの間での有糸分裂的組み換えによ
って得られる。９つの試験した他の族におけるこの現象
の頻度は、後述する。
88−14族からのある植物、植物Ｉは、２つの各Acプロ
ーブを用いることによって決定されるような単一の新し
いAc挿入部を有していた。他の子孫と異なり、この植物
には、2.4kb及び3.6kbの如何なる常在pMACのフラグメン
トも存在しなかった。更に、このブロットをwx又はＴ−
DNA特異的プローブで調査すると、この子孫にはドナー
プラスミドの如何なる証拠も見られなかった。
ーブを用いることによって決定されるような単一の新し
いAc挿入部を有していた。他の子孫と異なり、この植物
には、2.4kb及び3.6kbの如何なる常在pMACのフラグメン
トも存在しなかった。更に、このブロットをwx又はＴ−
DNA特異的プローブで調査すると、この子孫にはドナー
プラスミドの如何なる証拠も見られなかった。
Ac、wx及びＴ−DNA境界プローブによる10の族のサザ
ンブロットを調査した結果得られたデータを、表２にま
とめた。この表は、Ac族及びＴ−DNA配列の両方を有す
る子孫の数、Ac又はＴ−DNA配列のいずれかを有する子
孫の数、及びいずれも持たない子孫の数を示している。
10中５の族において、Acを含むがドナープラスミド配列
を含まない子孫が同定された。これは、少なくとも半数
の族において、組み換えの検出を可能とするのに十分な
遺伝距離を転位したAcをある子孫が遺伝したことを意味
する。まとめると、90中６子孫がAcを有するがＴ−DNA
を有していなかった。このことは、配列が全体的に連結
していないときでさえ9/16の子孫がまだ両方含むため
に、Ac及びＴ−DNAが有糸分裂的に分類する子孫の数の
予想値を下回る。小さい集団サイズのために、転位のマ
ップ距離を概算することはできなかった。
ンブロットを調査した結果得られたデータを、表２にま
とめた。この表は、Ac族及びＴ−DNA配列の両方を有す
る子孫の数、Ac又はＴ−DNA配列のいずれかを有する子
孫の数、及びいずれも持たない子孫の数を示している。
10中５の族において、Acを含むがドナープラスミド配列
を含まない子孫が同定された。これは、少なくとも半数
の族において、組み換えの検出を可能とするのに十分な
遺伝距離を転位したAcをある子孫が遺伝したことを意味
する。まとめると、90中６子孫がAcを有するがＴ−DNA
を有していなかった。このことは、配列が全体的に連結
していないときでさえ9/16の子孫がまだ両方含むため
に、Ac及びＴ−DNAが有糸分裂的に分類する子孫の数の
予想値を下回る。小さい集団サイズのために、転位のマ
ップ距離を概算することはできなかった。
Ｔ−DNAからの有糸分裂的に分離したAcの単一転位コ
ピーを含む子孫植物は、その後のAcの働きにおいて重要
である。88−01の子孫となる植物Ｏがこのような候補で
ある。この植物からの自己種子を撒いて、７子孫からDN
Aを単離した。このDNAをHind IIIで切断し、pJAC−Ｄに
見られる全Ac配列でサザンハイブリダイゼーションの結
果物を調査した。88−01O中の転位因子のHind IIIによ
る分解によって、１つの1.6kb内部フラグメントと2.2kb
及び3.7kbの結合フラグメントが得られる。分離のため
に、７のうち２つの子孫（Ａ及びＦ）はAcを遺伝しなか
った。Acを含んでいる５つの子孫（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び
Ｇ）は、親に存在したものと同一の３つのバンドを示し
ている。しかし、これらの親のバンドに加えて、新しい
Ac挿入部位が明白である。これらのバンドの強度の変化
は、F2におけるAcの体細胞転位（somatic transition）
によって得られたことを強く示唆する。単一コピーAcを
含みＴ−DNAを含まない２つの他のF1植物の子孫（88−0
1C及び88−14 I）も、F2世代において、Acの体細胞転位
を示していた。従って、再生に伴って少なくとも三時世
代までAcは転位し続けると結論される。
ピーを含む子孫植物は、その後のAcの働きにおいて重要
である。88−01の子孫となる植物Ｏがこのような候補で
ある。この植物からの自己種子を撒いて、７子孫からDN
Aを単離した。このDNAをHind IIIで切断し、pJAC−Ｄに
見られる全Ac配列でサザンハイブリダイゼーションの結
果物を調査した。88−01O中の転位因子のHind IIIによ
る分解によって、１つの1.6kb内部フラグメントと2.2kb
及び3.7kbの結合フラグメントが得られる。分離のため
に、７のうち２つの子孫（Ａ及びＦ）はAcを遺伝しなか
った。Acを含んでいる５つの子孫（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び
Ｇ）は、親に存在したものと同一の３つのバンドを示し
ている。しかし、これらの親のバンドに加えて、新しい
Ac挿入部位が明白である。これらのバンドの強度の変化
は、F2におけるAcの体細胞転位（somatic transition）
によって得られたことを強く示唆する。単一コピーAcを
含みＴ−DNAを含まない２つの他のF1植物の子孫（88−0
1C及び88−14 I）も、F2世代において、Acの体細胞転位
を示していた。従って、再生に伴って少なくとも三時世
代までAcは転位し続けると結論される。
III.形質転換ベクターpTV101を用いたトマトへのバチル
ス・スリンジエンシス・ヴァー・カルスタキからの昆虫
制御タンパク質遺伝子の挿入 バクテリアのバチルス・スリンジエンシス・ヴァー・
カルスタキ（B.t.k）は、鱗翅類昆虫（lepidopteran in
sects）に対して優先的に死に至らしめるタンパク質
（B.t.protein）をコードしている。このタンパク質を
コードしている遺伝子をクローン化して、この遺伝子移
植物を発現させるDNA配列を、遺伝子の制御配列に挿入
し、この遺伝子でアグロバクテリウム仲介形質転換によ
ってトマト植物を形質転換した（フィズコフ（Fischof
f）,D.ら,Bio/technology,5:807−813（1987）、これは
援用して本文の一部とした）。このキメラタンパク質を
発現する植物は、鱗翅類の幼虫に対する耐性（toleranc
e）が増大される。
ス・スリンジエンシス・ヴァー・カルスタキからの昆虫
制御タンパク質遺伝子の挿入 バクテリアのバチルス・スリンジエンシス・ヴァー・
カルスタキ（B.t.k）は、鱗翅類昆虫（lepidopteran in
sects）に対して優先的に死に至らしめるタンパク質
（B.t.protein）をコードしている。このタンパク質を
コードしている遺伝子をクローン化して、この遺伝子移
植物を発現させるDNA配列を、遺伝子の制御配列に挿入
し、この遺伝子でアグロバクテリウム仲介形質転換によ
ってトマト植物を形質転換した（フィズコフ（Fischof
f）,D.ら,Bio/technology,5:807−813（1987）、これは
援用して本文の一部とした）。このキメラタンパク質を
発現する植物は、鱗翅類の幼虫に対する耐性（toleranc
e）が増大される。
A.pTV101へのB.t.k.遺伝子のクローニング CaTV35Sのプロモーター及びNOS3′制御配列を結合さ
れたB.t.k.有毒性遺伝子を含む約4kbDNAフラグメント
は、適当な制限酵素を用いてプラスミドpMON9711から分
解された。このフラグメントは次いで、ポリリンカー領
域中で有効ないずれかの制限酵素を用いて、pTV101のDs
部分にクローン化された。アガロースゲルを用いた電気
泳動によって予想された構造の確認後、このベクターを
フラリーらのBio/technology,3:629−635（1985）に記
述されたように、無力化したTiプラスミドを含んだアグ
ロバクテリウム・テュメファシエンス種に導入された。
pBT101の最終コンストラクトは図６に示してある。
れたB.t.k.有毒性遺伝子を含む約4kbDNAフラグメント
は、適当な制限酵素を用いてプラスミドpMON9711から分
解された。このフラグメントは次いで、ポリリンカー領
域中で有効ないずれかの制限酵素を用いて、pTV101のDs
部分にクローン化された。アガロースゲルを用いた電気
泳動によって予想された構造の確認後、このベクターを
フラリーらのBio/technology,3:629−635（1985）に記
述されたように、無力化したTiプラスミドを含んだアグ
ロバクテリウム・テュメファシエンス種に導入された。
pBT101の最終コンストラクトは図６に示してある。
pBT101を含んだアグロバクテリウムは、前記のヨダー
らの文献（1988）に記述されているように、トマト品種
の子葉抽出液と共に培養される。形質転換細胞は、再生
培地に50μg/mlのカナマイシンを含むことによって選択
される。トマト植物体は、記述されたように（ヨダー
ら、前記（1988）と同じ）、成熟値物へ再生される。ジ
ェノミックDNAは、所望のＴ−DNA挿入部を確認するた
め、サザンハイブリダイゼーション法によって分析され
る。
らの文献（1988）に記述されているように、トマト品種
の子葉抽出液と共に培養される。形質転換細胞は、再生
培地に50μg/mlのカナマイシンを含むことによって選択
される。トマト植物体は、記述されたように（ヨダー
ら、前記（1988）と同じ）、成熟値物へ再生される。ジ
ェノミックDNAは、所望のＴ−DNA挿入部を確認するた
め、サザンハイブリダイゼーション法によって分析され
る。
pBT101を産生する一次形質転換体の再生の間に、この
コンストラクトのDs部分は、トランスポゼース遺伝子に
よって触媒された新しいゲノム位置へ転位する。B.t.k.
を産生するDs部分は、植物の生育の間に１回以上転位し
得る。事実、同一一次形質転換の異なる部分に、二次転
位現象を暗示するように、異なるゲノム位置で転位因子
を含み得ることが観察されている（ヨダーら，（198
8））。
コンストラクトのDs部分は、トランスポゼース遺伝子に
よって触媒された新しいゲノム位置へ転位する。B.t.k.
を産生するDs部分は、植物の生育の間に１回以上転位し
得る。事実、同一一次形質転換の異なる部分に、二次転
位現象を暗示するように、異なるゲノム位置で転位因子
を含み得ることが観察されている（ヨダーら，（198
8））。
植物は成熟するとき、自家受粉するか又は交雑可能な
性別の変種との他家交雑するかのいずれかを行う。F1子
孫は、交雑によるハイブリッド子孫であり、又は自殖に
よって一次R0形質転換種子を集め、子孫植物を生育させ
る。
性別の変種との他家交雑するかのいずれかを行う。F1子
孫は、交雑によるハイブリッド子孫であり、又は自殖に
よって一次R0形質転換種子を集め、子孫植物を生育させ
る。
B.t.k.遺伝子を産生するDsが、ドナーベクターpBT101
の挿入部位と遺伝的に異なる染色体上の位置へ転位した
とき、キメラDs及び、今やDsを欠いたpBT101ドナーベク
ターは、独立して子孫へ類別される。戻し交雑の場合に
は、半数のF1子孫はpBT101配列を含み、半数はDs遺伝子
を含む。各々がこの集団においてランダムに分配される
ので、子孫の約1/4はpBT101及びDsを含み、1/4はpBT101
を含むがDsを含まず、1/4はDsを含むがpBT101を含ま
ず、そして1/4はいずれも含まない。異なる割合は、R0
植物が自家受扮するときに見られる。この場合、bBT101
とDsが共にある。DsはなくpBT101がある、bBT101はなく
Dsがある、又はbBT101とDsのいずれもないものの植物の
数は、9:3:3:1となるであろう。両方の場合において、
植物のある形態は、B.t.k.遺伝子を産生するDs配列を含
むであろうが、ドナープラスミドによって得られる他の
如何なる配列も含まない。Ds−B.t.k.部位は、ドナー配
列の残りと共にトランスポゼース遺伝子が除去されてい
るので、今や安定である。
の挿入部位と遺伝的に異なる染色体上の位置へ転位した
とき、キメラDs及び、今やDsを欠いたpBT101ドナーベク
ターは、独立して子孫へ類別される。戻し交雑の場合に
は、半数のF1子孫はpBT101配列を含み、半数はDs遺伝子
を含む。各々がこの集団においてランダムに分配される
ので、子孫の約1/4はpBT101及びDsを含み、1/4はpBT101
を含むがDsを含まず、1/4はDsを含むがpBT101を含ま
ず、そして1/4はいずれも含まない。異なる割合は、R0
植物が自家受扮するときに見られる。この場合、bBT101
とDsが共にある。DsはなくpBT101がある、bBT101はなく
Dsがある、又はbBT101とDsのいずれもないものの植物の
数は、9:3:3:1となるであろう。両方の場合において、
植物のある形態は、B.t.k.遺伝子を産生するDs配列を含
むであろうが、ドナープラスミドによって得られる他の
如何なる配列も含まない。Ds−B.t.k.部位は、ドナー配
列の残りと共にトランスポゼース遺伝子が除去されてい
るので、今や安定である。
B.別プラスミドにおけるB.t.k.遺伝子−Dsコンストラク
ション及びトランスポゼース配列のクローニング 本来の位置からB.t.k.遺伝子−Dsコンストラクション
を移動するための別の案は、別個のプラスミド上にトラ
ンスポゼース遺伝子を導入することである。これは、所
望の遺伝子が新しい位置に移動する前に、安定な位置に
対象遺伝子を含む一次形質転換が、再生できる場合に有
効である。
ション及びトランスポゼース配列のクローニング 本来の位置からB.t.k.遺伝子−Dsコンストラクション
を移動するための別の案は、別個のプラスミド上にトラ
ンスポゼース遺伝子を導入することである。これは、所
望の遺伝子が新しい位置に移動する前に、安定な位置に
対象遺伝子を含む一次形質転換が、再生できる場合に有
効である。
pDs202と類似の構築が、β−galフラグメントの代わ
りにB.t.k.遺伝子を含んで行われる。このコンストラク
トは、植物体へ、そして成熟植物体へ形質転換される。
前の場合と異なり、Ds−B.t.k.部位は、植物体にトラン
スポゼース遺伝子を導入していないので、今や完全に安
定である。
りにB.t.k.遺伝子を含んで行われる。このコンストラク
トは、植物体へ、そして成熟植物体へ形質転換される。
前の場合と異なり、Ds−B.t.k.部位は、植物体にトラン
スポゼース遺伝子を導入していないので、今や完全に安
定である。
活性トランスポゼース遺伝子は、２つの方法のいずれ
かによってDs−B.t.k.コンストラクトを含む植物へ導入
され得る。第１に、トランスポゼース遺伝子を、直接一
次形質転換体又はこの植物子孫に形質転換させることが
できる。例えば、Ds−B.t.k.コンストラクトを含む一次
形質転換体を成熟状態にまで成長させ、自家受粉させ、
種子を集める。これらの種子を発芽させ、現れた実生
を、トランスポゼース遺伝子を含むプラスミドを用いた
二次形質転換のための宿主体として使用する。ある場合
には、例えばハイグロマイシン耐性のような第２の選択
可能なマーカーを使用することが、トランスポゼースを
含む形質転換体を同定するためには有益となり得る。Ds
−B.t.k.コンストラクトとトランスポゼース遺伝子の両
方を含む遺伝子導入植物を、成熟まで成長させ、自家受
粉又は戻し交雑させ、子孫種子を集める。前案のよう
に、転位したDs−B.t.k.フラグメントを含むが、他のド
ナー配列を含まない植物は子孫集団における分離によっ
て同定され得る。
かによってDs−B.t.k.コンストラクトを含む植物へ導入
され得る。第１に、トランスポゼース遺伝子を、直接一
次形質転換体又はこの植物子孫に形質転換させることが
できる。例えば、Ds−B.t.k.コンストラクトを含む一次
形質転換体を成熟状態にまで成長させ、自家受粉させ、
種子を集める。これらの種子を発芽させ、現れた実生
を、トランスポゼース遺伝子を含むプラスミドを用いた
二次形質転換のための宿主体として使用する。ある場合
には、例えばハイグロマイシン耐性のような第２の選択
可能なマーカーを使用することが、トランスポゼースを
含む形質転換体を同定するためには有益となり得る。Ds
−B.t.k.コンストラクトとトランスポゼース遺伝子の両
方を含む遺伝子導入植物を、成熟まで成長させ、自家受
粉又は戻し交雑させ、子孫種子を集める。前案のよう
に、転位したDs−B.t.k.フラグメントを含むが、他のド
ナー配列を含まない植物は子孫集団における分離によっ
て同定され得る。
C.形質転換DNAコンストラクトからの望ましくない遺伝
子の除去 ある場合に、形質転換後に元の挿入部位から対象遺伝
子を移動させることが望ましくないことがあり得る。こ
れは、所望遺伝子の発現が最初の位置で最適である場合
に起こり得る。これらの場合に、対象遺伝子の再移動
（repositioning）が、遺伝子の発現に伴って、効率を
減少し得る。
子の除去 ある場合に、形質転換後に元の挿入部位から対象遺伝
子を移動させることが望ましくないことがあり得る。こ
れは、所望遺伝子の発現が最初の位置で最適である場合
に起こり得る。これらの場合に、対象遺伝子の再移動
（repositioning）が、遺伝子の発現に伴って、効率を
減少し得る。
転位ベクターシステムは、Ds境界間で選択可能マーカ
ー遺伝子を挿入することによって、この場合に組み込む
ことができる。それから、B.t.k.遺伝子をトランスポゼ
ースの活性によって移動しないベクターの領域にクロー
ニングする。このようなコンストラクトは図７に、pBT2
00として表してある。
ー遺伝子を挿入することによって、この場合に組み込む
ことができる。それから、B.t.k.遺伝子をトランスポゼ
ースの活性によって移動しないベクターの領域にクロー
ニングする。このようなコンストラクトは図７に、pBT2
00として表してある。
プラスミドpBT201は植物に形質転換され、形質転換体
の選択はカナマイシン耐性マーカーを利用する。この植
物の再生の間に、形質転換に用いる選択可能マーカーを
産生するDs部分が、新しい位置に転位する。前述の場合
で見られたように、Dsエレメントが連結していない部分
へ転位した場合、B.t.k.遺伝子を産生するドナープラス
ミドと、選択可能マーカーを産生するDsエレメントとの
分離により、B.t.k.遺伝子を含むが選択可能マーカー配
列を含まない植物が結果として得られる。
の選択はカナマイシン耐性マーカーを利用する。この植
物の再生の間に、形質転換に用いる選択可能マーカーを
産生するDs部分が、新しい位置に転位する。前述の場合
で見られたように、Dsエレメントが連結していない部分
へ転位した場合、B.t.k.遺伝子を産生するドナープラス
ミドと、選択可能マーカーを産生するDsエレメントとの
分離により、B.t.k.遺伝子を含むが選択可能マーカー配
列を含まない植物が結果として得られる。
この案も、セクションＢにおいて述べた２プラスミド
システムに組み込むことができる。
システムに組み込むことができる。
D.対象遺伝子を含むが望ましくない配列を含まない植物
の選択 上述したいずれの案においても、遺伝分離は、所望遺
伝子を含むが望ましくない配列を含まない植物を作製す
ることに使用される。これらの植物は、植物において外
来DNAを同定するための多くの全ての標準的な分析手段
によって迅速に同定することができる。更に、低い厳格
度の選択条件が、選択可能マーカーを含まない植物の同
定に使用され得る。これらの条件は、遺伝子がなくても
植物に対して致命的ではない（上記、ウェイド（Weid
e）ら）。
の選択 上述したいずれの案においても、遺伝分離は、所望遺
伝子を含むが望ましくない配列を含まない植物を作製す
ることに使用される。これらの植物は、植物において外
来DNAを同定するための多くの全ての標準的な分析手段
によって迅速に同定することができる。更に、低い厳格
度の選択条件が、選択可能マーカーを含まない植物の同
定に使用され得る。これらの条件は、遺伝子がなくても
植物に対して致命的ではない（上記、ウェイド（Weid
e）ら）。
フロントページの続き (72)発明者 ラスナー、マイケル ダブリュー. アメリカ合衆国 95616 カリフォルニ ア州 デイヴィス チェサピーク ベイ 3226 (56)参考文献 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎ ｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 219 （３），1989 Ｐ461−466 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 123，1989 Ｐ181 −189 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎ ｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 218 （１），1989 Ｐ25−32
Claims (6)
- 【請求項１】対象遺伝子を含むが外来性補助核酸を含ま
ない遺伝子導入植物を作製する方法であって、 （ａ） Dsエレメントとトランスポゼース遺伝子とが分
離したトランスポゾンと外来性補助核酸とを含む、DNA
コンストラクト上の遺伝子の導入により、対象遺伝子を
用いて植物を形質転換する過程と、 （ｂ） F1又はより離れた世代の子孫を得るために、自
己交雑を経て、又は他の植物と、形質転換植物を交雑す
る過程と、 （ｃ） 対象遺伝子を含むが補助核酸を含まない子孫を
選択する手法を利用する過程と、 を含む、上記遺伝子導入植物を作製する方法。 - 【請求項２】該形質転換植物が、トランスポゼース遺伝
子を含まないDNAコンストラクトの導入により形質転換
され、トランスポゼースをコードする遺伝子をそのゲノ
ム内に既に含む植物と交雑される、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】該対象遺伝子が、B.t.k.である請求項１に
記載の方法。 - 【請求項４】該補助核酸が、抗生物質抵抗性をコード化
している請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】分離したDsエレメントとトランスポゼース
遺伝子とが同一のDNAコンストラクト上にある、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項６】該対象遺伝子が該トランスポゾン内でクロ
ーン化される、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US555,271 | 1990-07-19 | ||
| US07/555,271 US5225341A (en) | 1990-07-19 | 1990-07-19 | Biologically safe plant transformation system using a ds transposon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05508993A JPH05508993A (ja) | 1993-12-16 |
| JP2659459B2 true JP2659459B2 (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=24216636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3511955A Expired - Lifetime JP2659459B2 (ja) | 1990-07-19 | 1991-07-01 | 生物学的に安全な植物形質転換システム |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5225341A (ja) |
| EP (1) | EP0577598B1 (ja) |
| JP (1) | JP2659459B2 (ja) |
| AT (1) | ATE233819T1 (ja) |
| AU (1) | AU660620B2 (ja) |
| CA (2) | CA2318024C (ja) |
| DE (1) | DE69133206T2 (ja) |
| DK (1) | DK0577598T3 (ja) |
| ES (1) | ES2197900T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992001370A1 (ja) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP3256952B2 (ja) | 1994-11-09 | 2002-02-18 | 日本製紙株式会社 | 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 |
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