ES2197900T3 - Sistema de transformacion de plantas biologicamente seguro. - Google Patents
Sistema de transformacion de plantas biologicamente seguro.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS TRANSGENICAS QUE CONTENGAN UN GEN DE INTERES Y QUE NO CONTENGAN ACIDOS NUCLEICOS SECUNDARIOS EXTRAÑOS. CON ESTOS METODOS SE CONSIGUE LA PRODUCCION DE PLANTAS QUE CONTIENEN UN GEN DESEADO, PERO QUE NO TIENEN LAS SECUENCIAS VECTORIALES NI LAS SECUENCIAS MARCADORAS UTILIZADAS PARA TRANSFORMAR LA PLANTE. EL METODO PARA LA TRANSFORMACION DE TALES PLANES CONSISTE EN TRANSFORMAR LAS PLANTAS CON UN GEN DE INTERES MEDIANTE LA INTRODUCCION DEL GEN EN UNA ESTRUCTURA DE ADN QUE CONTENGA UN TRANSPONEDOR Y ACIDOS NUCLEICOS SECUNDARIOS EXTRAÑOS; CRUZAR LA PLANTA TRANSFORMADA MEDIANTE UN AUTOCRUZAMIENTO O CON OTRA PLANTA PARA OBTENER F1 O DESCENDIENTES MAS ALEJADOS; Y UTILIZAR UN ELEMENTO PARA SELECCIONAR ESOS DESCENDIENTES QUE LLEVAN EL GEN DE INTERES Y QUE NO CONTIENEN ACIDOS NUCLEICOS SECUNDARIOS. TALES DESCENDIENTES SE PUEDEN DETECTAR BIOQUIMICAMENTE, MEDIANTE UNA HIBRIDIZACION DE SOUTHERN, MEDIANTE EL USO DE PROCEDIMIENTOS DE REACCION DE UNA CADENA DE POLIMERASA Y A TRAVES DE OTROS METODOS DISPONIBLES EN LA MATERIA.
Description
Sistema de transformación de plantas
biológicamente seguro.
Esta invención se refiere a métodos para crear
plantas transgénicas a través del uso de transposones. Más
específicamente, se refiere a un sistema que proporciona plantas
transformadas que contienen una cantidad mínima de material genético
extraño auxiliar. Además, se proporcionan métodos para someter a la
técnica de la huella dactilar molecular a variedades de cultivo
patentadas usando transposones y otras secuencias de DNA
introducidas.
La producción de plantas transgénicas abre un
campo apasionante con la promesa de que pueden incorporarse
innumerables características deseables a las plantas de las que
depende la sociedad. Por ejemplo, debido a los problemas
medioambientales y otros costes contraídos con el uso de
plaguicidas químicos, la capacidad para desarrollar plantas que sean
naturalmente resistentes a las plagas es primordial.
Sin embargo, usando los procedimientos de
transformación actuales, sólo aproximadamente uno de cada millón de
células de planta se transforma. El problema de la transformación
se traduce a continuación en identificar la única célula que se ha
transformado en este fondo de células no transformadas. El problema
se ha tratado generalmente conectando físicamente un gen,
típicamente un gen bacteriano que confiere resistencia a
antibióticos, al gen deseado. La célula que ha captado el gen
deseado puede seleccionarse a continuación mediante su capacidad
para crecer sobre un medio que contiene el antibiótico particular.
Las células de plantas no transformadas no contienen el gen de
resistencia y, así, no crecen.
La presencia de genes de resistencia a
antibióticos y otras secuencias auxiliares en la variedad de
cultivo final es sin embargo particularmente indeseable. Estas
secuencias auxiliares son necesarias para los procedimientos de
transformación, pero no contribuyen positivamente a la variedad de
cultivo final y de hecho disminuyen su atractivo para el consumidor.
En la percepción del público, la transferencia de secuencias entre
grupos taxonómicos ampliamente separados preocupa más que la
transferencia entre grupos más estrechamente afines. Así, una
variedad de cultivo transgénica que tiene secuencias de una
bacteria puede ser más indeseable que una que tiene secuencias de
una especie salvaje del mismo género. Para incrementar la
aceptación por el público de plantas transgénicas, es
extremadamente importante eliminar genes de resistencia bacterianos
y otras secuencias auxiliares de la variedad de cultivo. Los
efectos biológicos de la inserción de este material genético no
deseado no están claros. Las plantas transgénicas se han encontrado
así con resistencia y escepticismo en gran parte debido a la
incertidumbre asociada con el material genético auxiliar.
La presencia de estas secuencias indeseables
también puede complicar los procedimientos reguladores necesarios
para comercializar la variedad de cultivo. La estructura reguladora
actual basa el grado de escrutinio requerido para la liberación de
organismos transgénicos en parte en la diferencia taxonómica entre
el organismo huésped y la fuente de la secuencia insertada.
Un método fiable para eliminar las secuencias
auxiliares no deseadas mejoraría así la viabilidad comercial
incrementando la aceptación por el público y simplificando el
procedimiento regulador. La especialidad previa no ha reconocido la
importancia de este problema, ni ha trabajado para proporcionar una
solución.
Esta invención se refiere a métodos para producir
plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 1, que
contienen un gen de interés y que están libres de ácidos nucleicos
auxiliares extraños. Estos métodos permiten la producción de plantas
que contienen así un gen deseado, pero que están libres de
secuencias vectoriales y/o secuencias marcadoras usadas para
transformar la planta. El método de transformación de tales plantas
exige transformar las plantas con un constructo de DNA que
comprende un gen de interés, ácidos nucleicos auxiliares extraños
que comprenden secuencias de gen marcador y un transposón que
funciona en las plantas; cruzar la planta transformada a través de
auto-cruzamiento o con otra planta para obtener una
progenie F_{1} o de una generación más separada; y utilizar un
medio para seleccionar las progenies que pueden tener el gen de
interés y están libres de secuencias de gen marcador. Tal progenie
puede detectarse, bioquímicamente, mediante hibridación Southern, a
través del uso de procedimientos de reacción en cadena de la
polimerasa y otros métodos disponibles en la especialidad.
El gen de interés se clona con los extremos del
transposón en las regiones no esenciales centrales del transposón
de modo que, durante la transposición, se separa de las secuencias
vectorial y marcadora. Se hacen a continuación cruces para eliminar
las secuencias vectorial y marcadora seleccionando una progenie en
la que no aparecen. Alternativamente, el ácido nucleico auxiliar
extraño que comprende las secuencias del gen marcador puede
clonarse dentro de los extremos del transposón, con el gen de
interés sobre el constructo de DNA fuera del transposón, de modo que
durante la transposición las secuencias marcadoras se separan del
gen de interés. Pueden realizarse cruces para eliminar las
secuencias marcadoras, o DNA no deseado, seleccionando la progenie
apropiada.
Alternativamente, también se proporcionan métodos
para identificar la progenie de una planta a través de la creación
de una huella dactilar molecular en el genoma de la planta
insertando un constructo de obtención de la huella dactilar de DNA
en el genoma, detectando sitios únicos de inserción del DNA extraño
en el genoma y registrando los sitios únicos de inserción. A
continuación, DNA de una segunda planta que se sospecha que deriva
de tal planta se aísla y se detecta la presencia o ausencia de los
sitios únicos de inserción. El constructo de obtención de la huella
dactilar de DNA puede comprender un elemento transposónico.
Figura 1. Se representa esquemáticamente la
estructura del plásmido pMAC que contiene Ac. El plásmido se derivó
de pMON200 (Fraley y otros, Biotech,
3:629-635, 1985) clonando un fragmento de
restricción Sal I-Pst 1 que contiene Ac7
(Behrens y otros, Mol. Gen. Genet.
194:346-347, 1984) en el sitio Xho de
pMON200. Se muestran unos pocos sitios de reconocimiento de enzimas
de restricción clave y sus posiciones cartográficas. La orientación
del mapa ilustra el plásmido después de la inserción en el genoma
de la planta.
Las cajas debajo de la línea indican porciones
clave del plásmido. LB y RB indican los límites de
T-DNA izquierdo y derecho, respectivamente. La
región LIH es la región de homología requerida para que pMON200 se
integre en el plásmido Ti desarmado PGV3111-SE
(Fraley y otros, 1985). Ac7 representa todo el elemento
Ac clonado en el policonector de pMON200. Las líneas
punteadas en cualquier lado de Ac7 representan DNA de maíz
que flanquea el elemento Ac7. NPTII es el gen de neomicina
fosfotransferasa que se ha manipulado para expresarse en células de
planta y permite su crecimiento en medios que contienen kanamicina.
Este es el gen marcador seleccionable que es indeseable en la
variedad de cultivo final. SPI SM son genes bacterianos que
codifican la resistencia a estreptomicina y espectinomicina y se
usan para mantener pMON200 en Agrobacterium. NOS es el
gen que codifica nopalina sintasa y se usa para confirmar sucesos
de transformación. Estos diversos componentes se describen
adicionalmente en Fraley y otros (1985).
Figura 2. El plásmido pDs203 es un
derivado de pMON200 y contiene el elemento DSI de 450 pb y
DNA de maíz de flanqueo en el sitio EcoRI de pMON200. La porción
Ds203 se muestra como la caja con Ds, las líneas punteadas
que flanquean Ds representan DNA de maíz.
Figura 3. El plásmido pDS202 se construyó
reemplazando la porción central de 1,6 Kb de Ac, limitada
por los sitios HindIII internos, con el gen bacteriano que
codifica \beta-galactosidasa (Bgal). El
resto de pDs202 es virtualmente idéntico a pMAC.
Figura 4. El vector pTs105 contiene la región de
codificación de transposasa de Ac7 clonada en el sitio
policonector de pMON200. Ambos extremos de pTs105 se han retirado
enzimáticamente para evitar la transposición adicional de este gen
de transposasa.
Figura 5. El plásmido pTV101 contiene tanto el
gen de transposasa como el componente Ds en el mismo
derivado de pMON200. En el centro del elemento Ds, como la
posición 3200, se inserta un sitio policonector para permitir la
clonación rápida en esta región de pTV101.
Figura 6. El plásmido pBT101 contendría el gen de
proteína de control de insecto de 4 kb (B.t.k.) aislado de
Bacillus thuringiensis var. kurstaki clonado en el
policonector de pTV101. Este plásmido contendría el gen
B.t.k. flanqueado por las repeticiones invertidas de
Ds así como el gen que codifica transposasa estable.
Figura 7. El plásmido pBT201 ilustra un vector en
el que los marcadores seleccionables NPTII y SP/SM estarían
situados internos a las repeticiones invertidas de Ds. Esta
conformación permitiría la retirada de los genes marcadores
seleccionables de la planta transgénica deseada sin resituar el gen
B.t.k.
Esta invención proporciona métodos para la
retirada de secuencias de ácido nucleico no deseadas, tales como
secuencias vectoriales, de una planta que se ha transformado con un
gen extraño deseado. Estos métodos proporcionan así plantas
transgénicas que están libres de ácido nucleico extraño auxiliar
que típicamente acompaña al gen de interés durante la
transformación. La reducción de secuencias de ácido nucleico
auxiliares en la planta transformada reduciría mucho la preocupación
del público sobre las plantas transgénicas. Los problemas
reguladores encontrados al probar las plantas pueden reducirse y
debe aliviarse la preocupación de los consumidores sobre la
seguridad de consumo de las plantas.
Generalmente, la nomenclatura usada aquí y los
procedimientos de laboratorio en la tecnología de DNA recombinante
descrita más adelante son aquellos bien conocidos y empleados
comúnmente en la especialidad. Se usan técnicas estándar para la
clonación, el aislamiento, la amplificación y la purificación de
DNA y RNA. Se realizan generalmente reacciones enzimáticas que
implican DNA ligasa, DNA polimerasa, endonucleasas de restricción y
similares, de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes.
Estas técnicas y diversas otras técnicas se realizan generalmente de
acuerdo con Sambrook y otros, Molecular Cloning - A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
Nueva York (1989). El manual se denomina aquí en lo sucesivo
``Sambrook''. Otras referencias generales se proporcionan a lo
largo de este documento. Se cree que los presentes procedimientos
son bien conocidos en la especialidad y se proporcionan para la
comodidad del lector.
Para los propósitos de esta invención, se produce
un constructo de DNA que se usa en la transformación de plantas. El
``constructo de DNA'' contendrá el gen de interés, secuencias de
ácido nucleico auxiliares extrañas y un transposón, todos según se
definen más adelante, tal que el gen de interés o las secuencias
auxiliares no deseadas probablemente se transpondrán con el
transposón una vez que se produce la transposición.
Los beneficios de insertar genes deseados en el
genoma de plantas son ilimitados. Un ``gen deseado'' o ``gen de
interés'' es cualquier gen que codifique para una propiedad deseada
para una propiedad o un fenotipo identificable deseados y que no sea
natural de la planta. Preferiblemente, el gen codifica una
propiedad o un fenotipo agronómicamente útiles. Genes de interés,
por ejemplo, podrían incluir genes que codifiquen resistencia a
enfermedades (por ejemplo, resistencia viral, resistencia fúngica o
el gen para la endotoxina de Bacillus thuringiensis, genes
implicados en rutas biosintéticas específicas (por ejemplo, genes
implicados en la maduración de frutos, la biosíntesis de aceites o
pigmentos o el metabolismo del almidón) o genes implicados en la
tolerancia ambiental (por ejemplo, tolerancia a las sales,
tolerancia a la sequía o tolerancia a condiciones anaerobias). La
naturaleza del propio gen deseado no es crítica para esta
invención. Ejemplos de tales genes y su disponibilidad están
publicados y los expertos en la especialidad también pueden
identificar y aislar genes deseados adicionales. Véase Weising y
otros, Ann. Rev. Gen, 22:421-478 (1988).
Transposones de uso en esta invención se refieren
a secuencias de DNA que tienen la capacidad de moverse o saltar
hasta nuevas localizaciones dentro de un genoma. Se requieren dos
componentes para la transposición: la enzima transposasa que
cataliza la transposición y las secuencias nucleotídicas presentes
en el extremo del transposón sobre el que actúa la enzima. Los
transposones son tanto autónomos como no autónomos. Los
transposones autónomos son aquellos que son capaces tanto de
transponerse como de catalizar la transposición de elementos no
autónomos. Ejemplos de transposones autónomos son los elementos
Ac y transposones Spm aislados de maíz, todos los
cuales se han clonado y se han descrito bien en la especialidad.
Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.732.856 y Gierl y
otros, Plant Mol. Biol. 13:261-266
(1989).
Los transposones autónomos comprenden secuencias
para la transposasa y secuencias que son reconocidas por la enzima
transposasa en los extremos del transposón (el ``elemento
Ds''). Las secuencias para la transposasa (o el gen de
transposasa) son activas independientemente de las secuencias
extremas, es decir si las secuencias extremas se eliminan, la
actividad del gen de transposasa se conserva y el elemento que
codifica la enzima puede usarse así junto con un elemento no
autónomo o Ds para activar la transposición del elemento
Ds. El gen de transposasa es evidente en los elementos Ts101
y Ts105.
Sólo se requieren las secuencias de DNA presentes
en los extremos de un elemento no autónomo para que sea
transposicionalmente activo en presencia del gen de transposasa.
Estos extremos se denominan aquí los ``extremos del transposón'' o
el ``elemento Ds''. Véase, por ejemplo, Coupland y otros,
PNAS 86:9385 (1989), que describe las secuencias necesarias
para la transposición. Las secuencias de DNA internas a los
extremos del transposón no son esenciales y pueden estar
comprendidas por secuencias virtualmente de cualquier fuente. Esto
permite clonar DNA extraño entre los extremos del transposón. Si un
gen se clona dentro de los extremos del transposón, se transpondrá
con el elemento del transposón. El constructo será estable en la
unidad de planta transformada hasta que el gen de transposasa se
introduzca, genéticamente o asexualmente, en la misma planta.
Los elementos del transposón o elementos
Ds son aquellos elementos no autónomos que pueden
transponerse sólo cuando está presente un gen de transposasa en el
mismo genoma, tal como la Disociación (DS) o Ds1, que
se han clonado y se han descrito bien en la especialidad. Véanse,
por ejemplo, Lassner y otros, Mol. Gen. Genet.,
218:25-32 (1989) y Yoder y otros, Mol. Gen.
Genet., 213:291-296 (1988).
Actualmente, el sistema transposónico más
preferido es el sistema Ac/Ds de maíz, aunque también pueden
usarse elementos de otras especies. Sin embargo, se sabe que muchas
plantas contienen transpones. Son detectados típicamente mediante
abigarramiento que surge de una mutación somática. Una revisión de
los transposones puede encontrarse en Nevers y otros, Adv. in
Bot. Res. 12: 103-203 (1987).
Los transposones pueden aislarse de diversas
fuentes de plantas mediante métodos descritos. Los transposones se
aíslan lo más comúnmente como una inserción en un gen que codifica
un producto génico bien caracterizado. Las etapas requeridas para
aislar un transposón mediante este método son: (a) un gen de planta
responsable de codificar un fenotipo deseable se clona mediante
cualquiera de los sistemas de clonación estándar (Sambrook y otros,
previamente), (b) una mutación inducida por transposón en el gen
clonado se obtiene rastreando plantas con respecto a la inactivación
del gen clonado en poblaciones en las que se sabe que el transposón
es activo, (c) usando el gen clonado como un sonda de hibridación,
se obtiene el gen mutante obtenido de la población evaluada, a
continuación (d) se usan comparaciones de las secuencias
nucleotídicas hechas entre el gen activo y el gen mutante para
identificar la inserción del transposón.
El predominio de elementos transponibles en
poblaciones naturales ha permitido que sea satisfactorio un segundo
método para aislar transposones. En el procedimiento de cartografía
genética que usa cartografía de polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP), se observan ocasionalmente
modelos de RFLP que son consecuentes con una inserción en la
secuencia de DNA evaluada. Este procedimiento, basado en ensayar
aleatoriamente el genoma con respecto a nuevas inserciones, ha sido
satisfactorio para identificar transposones.
El constructo de DNA también contendrá ácidos
nucleicos auxiliares extraños que también se incorporarán en el
cromosoma de la planta transformada junto con el gen de interés.
``Acidos nucleicos auxiliares extraños'', ``ácidos nucleicos
auxiliares'' o ``secuencias auxiliares'' son los ácidos nucleicos
que son extraños a la planta que se transforma y que son secuencias
no deseadas. ``Secuencias no deseadas'' son las secuencias que se
eligen para la eliminación de una planta transformada. Si el gen de
interés se clona en el constructo de DNA dentro del elemento
transposónico, las secuencias no deseadas son las secuencias en el
constructo de DNA que están fuera del elemento transposónico, que se
separarán del elemento transposónico durante la transposición. Si
el gen de interés se clona en el constructo de DNA de modo que no
está dentro del elemento transposónico, las secuencias no deseadas
son el propio elemento transposónico y las secuencias que están
dentro del elemento transposónico, que se separarán del gen de
interés durante la transposición. Una planta que está ``libre de''
ácidos nucleicos auxiliares extraños es una en la que las
secuencias no deseadas no son detectables mediante procedimientos de
hibridación estándar, tales como mediante hibridación Southern.
El constructo de DNA deseado comprenderá un
transposón que contiene un casete de expresión diseñado para
iniciar la transcripción del gen de interés en plantas. También se
incluyen típicamente secuencias auxiliares, de origen bacteriano o
viral, para permitir que el vector se clone en un huésped
bacteriano o de fágico.
El vector también contendrá típicamente un gen
marcador seleccionable auxiliar mediante el que las células de
plantas transformadas pueden identificarse en el cultivo.
Habitualmente, el gen marcador codificará resistencia a
antibióticos. Estos marcadores incluyen resistencia a G418,
higromicina, bleomicina, kanamicina, metotrexato, clorsulfurón,
lincomicina, clindamicina, espectinomicina, fosfinotricina,
glifosato y gentamicina. Después de transformar las células de
planta, aquellas células que tienen el vector se identificarán por
su capacidad para crecer sobre un medio que contiene el antibiótico
particular.
Otras secuencias de DNA auxiliares que codifican
funciones adicionales también pueden estar presentes en el vector,
como se sabe en la especialidad. Por ejemplo, en el caso de
transformaciones con Agrobacterium, también se incluirán
secuencias de T-DNA para la transferencia
subsiguiente a cromosomas de planta.
Un vector de expresión bacteriano puede usarse si
se desea la expresión de un gen en bacterias. La construcción de un
vector de expresión bacteriano se realiza típicamente poniendo el
gen aguas abajo de un promotor bacteriano fuerte. Ejemplos de
promotores bacterianos que podrían usarse incluyen
8-lactamasa, \beta-galactosidasa y
los promotores del fago \lambdapL. La eficacia de traducción de
mRNA en bacterias depende críticamente de la presencia de un sitio
de unión del ribosoma y su distancia desde el codón de iniciación
de la transcripción.
Para la expresión en plantas, el casete de
expresión recombinante contendrá típicamente, además de la
secuencia deseada, una región promotora de planta, un sitio de
iniciación de la transcripción (si la secuencia que ha de
transcribirse carece de uno) y una secuencia de terminación de la
transcripción. Se incluyen típicamente sitios de enzimas de
restricción únicos en los extremos 5' y 3' del casete para permitir
la inserción fácil en un vector preexistente.
Secuencias que controlan la expresión de genes
eucarióticos se han estudiado intensivamente. Los elementos de la
secuencia promotora incluyen la secuencia de consenso de la caja
TATA (TATAAT), que está habitualmente de 20 a 30 pares de bases (pb)
aguas arriba del sitio de iniciación de la transcripción. En la
mayoría de los casos la caja TATA se requiere para la iniciación de
la transcripción exacta. Por convención, el sitio de iniciación se
denomina +1. A las secuencias que se extienden en la dirección 5'
(aguas arriba) se les dan números negativos y a las secuencias que
se extienden en la dirección 3' (aguas abajo) se les dan números
positivos.
En las plantas, más aguas arriba de la caja TATA,
en las posiciones -80 a -100, existe típicamente un elemento
promotor con una serie de adeninas que rodean el trinucleótido G (o
T) N.G.J. Messing y otros, en Genetic Engineering in Plants,
pp. 221-227 (Kosage, Meredith and Hollaender, eds.
1983). Otras secuencias que confieren especificidad tisular,
respuesta a señales ambientales o eficacia máxima de transcripción
también pueden encontrarse en la región promotora. Tales secuencias
se encuentran a menudo dentro de los 400 pb del sitio de iniciación
de la transcripción, pero pueden extenderse tanto como 2000 pb o
más.
En la construcción de combinaciones heterólogas
de promotor/gen estructural, el promotor se sitúa preferiblemente
aproximadamente a la misma distancia desde el sitio de iniciación
de la transcripción heterólogo que del sitio de iniciación de la
transcripción en su marco natural. Como se sabe en la especialidad,
sin embargo, puede admitirse alguna variación en esta distancia sin
pérdida de la función promotora.
El promotor particular usado en el casete de
expresión es un aspecto no crítico de la invención. Cualquiera de
un número de promotores que dirigen la transcripción en células de
planta es adecuado. El promotor puede ser constitutivo o inducible.
Los promotores de origen bacteriano incluyen el promotor de
octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa y otros promotores
derivados de plásmidos Ti naturales.
Herrara-Estrella y otros, Nature,
303:209-213 (1983). Promotores virales incluyen los
promotores de RNA 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor.
Odell y otros, Nature, 313:810-812 (1985).
Posibles promotores de plantas incluyen el promotor de la subunidad
pequeña de ribulosa-1,3-bisfosfato
carboxilasa, la secuencia promotora del gen E8 y el promotor de
faseolina.
Además de una secuencia promotora, el casete de
expresión también debe contener una región de terminación de la
transcripción aguas abajo del gen estructural para proporcionar la
terminación eficaz. La región de terminación puede obtenerse a
partir del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse a
partir de diferentes genes.
Si el mRNA codificado por el gen estructural ha
de traducirse eficazmente, también se añaden comúnmente secuencias
de poliadenilación al constructo vectorial. Alber y Kawasaki,
Mol. and Appl. Genet, 1:419-434 (1982).
Secuencias de poliadenilación incluyen, pero no se limitan a, la
señal de octopina sintasa de Agrobacterium (Gielen y otros,
EMBO J., 3:835-846, 1984) o la señal de
nopalina sintasa (Depicker y otros, Mol. and Appl. Genet.,
1:561-573 (1982)).
El uso del transposón en el vector permite la
separación del gen deseado de secuencias auxiliares. Los
transposones en el constructo de DNA se usarán en dos
configuraciones independientes. O bien (1) el gen de interés se
clonará dentro de los extremos del transposón en las regiones no
esenciales centrales del transposón o bien (2) las secuencias del
gen marcador seleccionable usadas para seleccionar la planta
transformada se clonarán dentro de los extremos del transposón en
las regiones no esenciales, clonándose el gen deseado fuera del
transposón. En el primer caso, la movilización del transposón se
usará para separar el gen de interés de las secuencias vectoriales
transformantes. En el segundo caso, la movilización del transposón
se usará para eliminar las secuencias marcadoras seleccionables del
constructo que contiene el gen de interés.
El constructo de DNA descrito previamente puede
microinyectarse directamente en células de planta mediante el uso
de micropipetas para transferir mecánicamente el DNA recombinante,
de modo cruzado, Mol. Gen. Genetics
202:179-185 (1985). El material genético también
puede transferirse a la célula de planta usando polietilenglicol,
Krens y otros, Nature 296:72-74 (1982).
Otro método de introducción de segmentos de ácido
nucleico es la penetración balística de alta velocidad por
partículas pequeñas con el ácido nucleico dentro de la matriz de
cuentas o partículas pequeñas o sobre la superficie, Klein y otros,
Nature 327:70-73 (1987).
Otro método más de introducción es la fusión de
protoplastos con otras entidades, bien minicélulas, células,
lisosomas u otros cuerpos con superficie lipídica fusionables,
Fraley y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA
7:1859-1863 (1982).
El DNA también puede introducirse en las células
de planta mediante electroporación, Fromm y otros, Pro. Natl.
Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). En esta técnica, protoplastos de
planta se someten a electroporación en presencia de plásmidos que
contienen el casete de expresión. Impulsos eléctricos de alta
intensidad de campo permeabilizan reversiblemente las biomembranas
permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de
planta sometidos a electroporación reforman la pared celular, se
dividen y se regeneran.
El virus del mosaico de la coliflor (CaMV) puede
usarse como un vector para introducir el gen de interés en células
de planta, (Hohn y otros ``Molecular Biology of Plant
Tumors'' Academic Press, Nueva York, pp. 549-560
(1982): Howell, Patente de Estados de Unidos Nº 4.407.956). De
acuerdo con el método descrito, todo el genoma de DNA viral de CaMV
se inserta en un plásmido bacteriano parental creando una molécula
de DNA recombinante que puede propagarse en bacterias. Después de
la clonación, el plásmido recombinante se modifica adicionalmente
mediante la introducción de la secuencia deseada en sitios de
restricción únicos en la porción viral del plásmido. La porción
viral modificada del plásmido recombinante se corta a continuación
del plásmido bacteriano parental y se usa para inocular las células
de planta o las plantas.
Otro método para introducir el DNA en células de
planta es infectar una célula de planta con Agrobacterium
tumefaciens o A. Rhizogenes previamente transformadas con
el gen. Bajo condiciones apropiadas conocidas en la especialidad,
las células de planta transformadas se hacen crecer para formar
retoños o raíces, y se desarrollan adicionalmente como plantas.
Agrobacterium es un género representativo
de la familia Gram negativa Rhizobiaceae. Sus especies son
responsables del tumor de hernia de raíz (A. tumefaciens) y
la enfermedad de las raíces tomentosas (A. rhizogenes). Las
células de planta en tumores de hernia de raíz y raíces tomentosas
se inducen para producir derivados de aminoácidos conocidos como
opinas, que son catabolizados solamente por las bacterias. Los
genes bacterianos responsables de la expresión de opinas son una
fuente conveniente de elementos de control para casetes de
expresión quiméricos. Además, el ensayo con respecto a la presencia
de opinas puede usarse para identificar tejido transformado. Pueden
introducirse secuencias genéticas heterólogas en células de planta
apropiadas, por medio del plásmido Ti de A. tumefaciens o el
plásmido Ri de A. rhizogenes. El plásmido Ti o Ri se
transmite a células de planta durante la infección mediante
Agrobacterium y se integra establemente en el genoma de la
planta, J. Schell, Science 237:1176-1183,
1987.
Los plásmidos Ti y Ri contienen dos regiones
esenciales para la producción de células transformadas. Una de
estas, denominada DNA transferido (T-DNA) se
transfiere a núcleos de planta e induce la formación de tumores o
raíces. La otra, denominada la región de virulencia (vir),
es esencial para la transferencia del T-DNA pero no
se transfiere ella misma. El T-DNA se transferirá a
una célula de planta incluso si la región vir está sobre un
plásmido diferente, Hoekema y otros, Nature
303:179-189, 1983. La región de DNA transferido
puede incrementarse de tamaño mediante la inserción de DNA
heterólogo sin que se afecte su capacidad para ser transferida. Un
plásmido Ti o Ri modificado, en el que se han suprimido los genes
que provocan la enfermedad, puede usarse como un vector para la
transferencia de los constructos génicos de esta invención a una
célula de planta apropiada.
La construcción de plásmidos Ti y Ri
recombinantes siguen en general métodos usados típicamente con los
vectores bacterianos más comunes, tales como pBR322. Puede hacerse
un uso adicional de elementos genéticos auxiliares encontrados a
veces con los plásmidos naturales y construidos a veces a partir de
secuencias extrañas. Estos pueden incluir, pero no se limitan a,
``vectores lanzadera'', (Ruvkun y Ausubel, Nature
298:85-88 (1981)), promotores (Lawton y otros,
Plant Mol. Biol. 9:315-324 (1981)) y genes
estructurales para la resistencia a antibióticos como un factor de
selección (Fraley y otros, Proc. Nat. Acad. Sci.
80:4803-4807 (1983)).
Todas las células de planta que pueden
transformarse mediante Agrobacterium y de las que pueden
regenerarse plantas enteras pueden transformarse de acuerdo con la
presente invención para producir plantas intactas transformadas que
contienen el DNA deseado. Estos son dos modos comunes de
transformar células de planta con Agrobacterium:
- (1)
- co-cultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados, o
- (2)
- transformación de células o tejidos intactos con Agrobacterium.
El método (1) requiere un sistema de cultivo
establecido que permita cultivar protoplastos y la regeneración de
plantas subsiguiente a partir de protoplastos cultivados.
El método (2) requiere (a) que los tejidos de
planta intactos, tales como cotiledones, puedan ser transformados
mediante Agrobacterium y (b) que las células o los tejidos
transformados puedan introducirse para regenerarse como plantas
enteras.
La mayoría de las especies dicotiledóneas pueden
transformarse mediante Agrobacterium. Todas las especies que
son un huésped de planta natural para Agrobacterium son
transformables in vitro. Las plantas monocotiledóneas, y, en
particular, los cereales, no son huéspedes naturales para
Agrobacterium. Los intentos de transformarlas usando
Agrobacterium han sido insatisfactorios hasta hace poco.
(Hooykas-Van Siogteren y otros, Nature
311:763-764 (1984). Existe una evidencia
creciente de que ciertas monocotiledóneas pueden transformarse
mediante Agrobacterium. Usando nuevos sistemas
experimentales, pueden transformarse ahora especies de cereales
tales como centeno (de la Pena y otros, Nature
325:274-276 (1987)), maíz (Rhodes y otros,
Science 240:204-207 (1988)) y arroz
(Shimamoto y otros, Nature 338:274-276
(1989)).
Un plásmido vectorial binario de
Agrobacterium preferido (Van den Elzen y otros, Plant
Mol. Biol. 5:149-154 (1985)) contendrá un gen de
resistencia a fármacos conectado, tal como uno para la resistencia
a la kanamicina, para seleccionar células de planta transformadas.
Este vector de transformación puede usarse para generar plantas
resistentes a kanamicina para el rastreo fácil de plantas
transformadas.
Después de la transformación, las células de
planta o las plantas transformadas que comprenden el gen deseado
deben identificarse. Se usa típicamente un marcador seleccionable,
tal como los analizados previamente. Las células de planta
transformadas pueden seleccionarse haciendo crecer las células
sobre un medio de crecimiento que contiene el antibiótico apropiado.
La presencia de opinas también puede usarse si las plantas son
transformadas con Agrobacterium.
Después de seleccionar las células transformadas,
puede confirmarse la expresión del gen heterólogo deseado. La
detección simple de mRNA codificado por el DNA insertado puede
alcanzarse mediante métodos bien conocidos en la especialidad, tales
como hibridación por transferencia Northern. La secuencia insertada
también puede identificarse mediante hibridación por transferencia
Southern. Véase, por ejemplo, Sambrook, previamente.
Todas las plantas de las que pueden aislarse y
cultivarse protoplastos para dar plantas regeneradas enteras pueden
transformarse. Algunas plantas adecuadas incluyen, por ejemplo,
especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis,
Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot,
Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum,
Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia,
Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus,
Asparagus. Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum,
Pennisetum, Ranunculus. Senecio, Salpiglossis, Cucumis. Browalia,
Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Malus, Apium y
Datura.
La regeneración de plantas a partir de
protoplastos cultivados se describe en Evans y otros, Handbook
of Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co. Nueva
York (1983)); y Vasil I.R. (ed.) Cell Culture and Somatic Cell
Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984,
y Vol. III (1986).
Se sabe que prácticamente todas las plantas
pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados,
incluyendo, pero no limitadas a, todas las especies principales de
caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, árboles frutales y
legumbres.
Los medios para la regeneración varían de especie
a especie de plantas, pero generalmente se proporciona en primer
lugar una suspensión de protoplastos transformados o una placa
Petri que contiene explantes transformados. Se forma tejido calloso
y pueden inducirse retoños a partir del callo y subsiguientemente
enraizarse. Alternativamente, puede inducirse la formación de
embriones en el tejido calloso. Estos embriones germinan como
embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo
contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como
auxina y fitoquininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico
y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y
alfalfa. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y
de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, a
continuación la regeneración es habitualmente reproducible y
repetible.
Después de que el casete de expresión se
incorpore establemente en plantas transgénicas, puede transferirse
a otras plantas mediante cruzamiento sexual. Puede usarse
cualquiera de un número de técnicas de mejora genética estándar,
dependiendo de la especie que ha de cruzarse.
Una vez que una planta se ha transformado de modo
que el gen de interés, el transposón y los ácidos nucleicos
extraños auxiliares se incorporan en el genoma de la planta, la
planta transformada se cruza mediante reproducción sexual de
cualquier manera bien conocida en la especialidad y descrita para
la especie individual de planta para obtener una generación F_{1}
o una más separada. Los cruces conducen finalmente a la eliminación
de las secuencias auxiliares procedentes de la planta. Además, como
se analizará más adelante, las secuencias pueden eliminarse a través
de segregación somática.
Según se analiza previamente, los constructos que
tienen el gen de interés o el gen marcador seleccionable insertado
con el transposón se introducen en una planta. En la planta
transformada, el elemento transposónico de la construcción es
estable a no ser que se introduzcan en la misma planta secuencias
que codifican transposasa. Así, el gen de interés y las secuencias
auxiliares no se separarán.
Pueden introducirse secuencias que codifican
transposasa en la planta transformada mediante transformación
asexual con un vector que contiene secuencias de transposasa o
cruzando genéticamente con una planta que contiene ella misma
secuencias de transposasa. La presencia de la transposasa permite a
continuación que el transposón ``salte'' desde el otro DNA
insertado.
Cuando las secuencias de transposasa se
transforman directamente en la planta huésped, pueden coexistir en
el mismo plásmido que el elemento Ds o pueden introducirse en
la planta en una transformación secundaria. El gen de transposasa
también puede introducirse en la planta que tiene el elemento
Ds cruzando sexualmente dos plantas transgénicas diferentes,
teniendo una un gen de transposasa y teniendo una el elemento
Ds. En plantas que tienen tanto el gen de transposasa como el
elemento Ds, el elemento transposónico, que tiene el gen de
interés o el gen marcador seleccionable, se transpondrá hasta una
nueva posición cromosómica, distinta de la posición de la
construcción de DNA transformante. Mientras que las transposiciones
van a veces a sitios conectados genéticamente, la transposición a
regiones más distantes del genoma también se recupera
frecuentemente.
Después de que el transposón se haya movido hasta
un nuevo locus, la siguiente etapa es cruzar la planta para
eliminar las secuencias auxiliares. Esto se realiza típicamente
usando cruces sexuales. Los cruzamientos pueden ser
auto-cruzamientos,
retro-cruzamientos o cruzamientos con cualquier
otra planta que sea compatible para la reproducción sexual con el
objetivo de obtener progenies que pueden tener el gen de interés y
que están libre de los ácidos nucleicos auxiliares. Tales
cruzamientos serán típicamente de un programa de mejora genética
comercial.
Según se analiza previamente, los cruzamientos
sexuales dan como resultado la selección independiente de genes no
conectados en poblaciones de progenies. Cuando el elemento
Ds se ha transpuesto hasta una posición no conectada con el
vector transferente inicial cada secuencia se seleccionará
independientemente en la progenie. Por lo tanto, algunas de las
progenies obtenidas en los cruzamientos contendrán el gen de
interés dentro de los extremos del transposón sin las secuencias
auxiliares si el gen se clonaba en el transposón. Alternativamente,
el gen de interés puede estar en su posición original desde la que
se ha retirado el gen marcador seleccionable mediante un caso de
transposición si el marcador se clonaba en los extremos del
transposón.
La generación F_{1} se refiere aquí a la
progenie del cruce entre la planta transformada y su pareja y a la
progenie resultante de auto-cruzamiento. ``Progenies
de una generación más separada'' se refiere a las progenies que
resultan de cruces subsiguientes que descienden de la planta
transformada con tal de que uno de los miembros del cruce contenga
el gen de interés.
Este procedimiento también es compatible para
producir transgénicos con especies de cultivo propagadas
asexualmente. La transposición también puede producirse durante la
mitosis y el transposón puede insertarse en una cromátida dejando la
cromátida hermana inalterada. En estos casos, la segregación
somática eliminará las secuencias auxiliares de las células o las
plantas enteras que tienen el gen de interés. Puede detectarse la
presencia de células segregadas somáticamente en la planta
transformada o la generación más separada que tiene el gen de
interés y está libre de los ácidos nucleicos auxiliares. Una planta
puede regenerarse a continuación a partir de tales células.
Medios para seleccionar la progenie que tiene el
gen de interés y está libre de los ácidos nucleicos auxiliares
incluyen los métodos disponibles que permiten identificar la
presencia o ausencia de ciertas secuencias de ácido nucleico
conocidas. La detección de los ácidos nucleicos extraños auxiliares
puede determinarse mediante una variedad de técnicas de hibridación
de ácidos nucleicos estándar que son suficientemente sensibles para
asegurar que no quede material genético microbiano en las plantas
huésped. Tales técnicas abarcarán reacciones de hibridación
homogéneas en las que ambos ácidos nucleicos complementarios están
libres en solución y ensayos heterogéneos en los que un ácido
nucleico está unido a un soporte sólido tal como transferencia
lineal (``slot-blot'') o un ensayo de transferencia
Southern. La técnica de hibridación específica no es crítica. Un
número de métodos se describe generalmente en Nucleic Acid
Hybridization, A Practical Approach, (Hames, B.D. y Higgins,
S.J., Eds.) IRL Press (1985).
Se prefiere que la sensibilidad del ensayo se
mejore a través del uso de un sistema de amplificación de ácidos
nucleicos. Tales sistemas multiplican los números absolutos del
ácido nucleico diana que se detecta. El sistema de amplificación
específico no es crítico para esta invención y existen al menos dos
sistemas disponibles para el uso.
El primer sistema es el sistema de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Este procedimiento de amplificación
es un método de extensión de cebador con DNA polimerasa dependiente
de una plantilla para replicar secuencias seleccionadas de DNA. El
método se basa en el uso de un exceso de cebadores específicos para
iniciar la replicación con DNA polimerasa de secuencias específicas
de un polinucleótido de DNA seguido por etapas de desnaturalización
y extensión con polimerasa repetidas. El sistema de PCR es bien
conocido en la especialidad (véanse las Patentes de EE.UU. Nº
4.683.195 y 4.683.202). Reactivos y hardware para efectuar la PCR
están disponibles comercialmente a través de
Perkin-Elmer/Cetus Instruments (PECI) de Norwalk,
Connecticut.
El segundo sistema de amplificación es la
reacción de amplificación con ligasa (LAR). La LAR, como la PCR,
usa múltiples ciclos de temperatura alternativa para amplificar los
números de una secuencia diana de DNA. A diferencia de la PCR, la
LAR no usa nucleótidos individuales para la extensión con
plantilla. La LAR se basa en cambio en un exceso de oligonucleótidos
que son complementarios a ambas hebras de la región diana. Después
de la desnaturalización de un DNA de plantilla de doble hebra,
comienza el procedimiento de LAR con la ligación de dos cebadores
oligonucleotídicos complementarios a regiones adyacentes en una de
las hebras diana. Los oligonucleótidos complementarios a cada hebra
pueden enlazarse. Después de la ligación y una segunda etapa de
desnaturalización, las hebras de la plantilla original y los dos
productos recientemente enlazados sirven como plantillas para la
ligación adicional para proporcionar una amplificación exponencial
de las secuencias elegidas como diana. Este método se ha detallado
en Genomics 4:560-569 (1989).
Los sistemas de detección y amplificación
descritos aquí son puestos en práctica habitualmente por los
expertos en la especialidad pertinente. Esta invención no se limita
a ningún sistema de detección o amplificación particular. A medida
que se desarrollan otros sistemas, también pueden encontrar uso en
esta invención. Por ejemplo, pueden usarse métodos de hibridación
Southern digiriendo los ácidos nucleicos en cuestión con enzimas de
restricción y sondeando las transferencias preparadas a partir de
los digestos con sondas para las secuencias de interés o sondas que
de otro modo indican la presencia o ausencia de la secuencia de
interés. Ejemplos de este método pueden encontrarse en Yoder y
otros, Mol. Gen. Genet. 213:291-296
(1988).
Además, pueden usarse marcadores químicos para
identificar si una secuencia está presente o no si el marcador es
expresado por un fenotipo fácilmente observable. Por ejemplo, están
disponibles ensayos no destructivos para la sensibilidad a
kanamicina. Así, las plantas transformadas que tienen el gen de
interés pero han perdido el gen de resistencia a la kanamicina
pueden identificarse fácilmente. Véase, Weide y otros, Theor.
Appl. Genet., 78:169-172 (1989).
Se observa la variación en la expresión génica
basándose en la posición del gen en el cromosoma, Jones y otros,
EMBO 4:2411-2418 (1985). Los métodos de esta
invención pueden usarse para optimizar la expresión del gen de
interés. La transposición del gen de interés puede activarse, según
se describe previamente, insertando el gen deseado dentro de los
extremos del transposón, para obtener plantas transgénicas que
tienen el gen deseado y que tienen niveles de expresión deseados.
Se obtiene una planta transformada que tiene el gen deseado clonado
dentro de los extremos del transposón. La transposición se activa
mediante cualquiera de los métodos descritos previamente y se
seleccionan la progenie o los transformantes resultantes que tienen
una expresión génica óptima. Este método puede ser particularmente
ventajoso para las plantas que son difíciles de transformar. Una vez
que se obtiene una planta transformada que contiene el gen de
interés dentro de un transposón, la transposición se induce
mediante cruzamiento o segregación somática hasta que se obtiene una
planta con expresión génica óptima. La progenie resultante se
examina de modo que se seleccionan aquellas con expresión génica
óptima. La expresión génica óptima es una determinación subjetiva
basada en el gen de interés y el fenotipo que codifica.
Para los propósitos de esta invención, una
``planta'' incluirá una célula de planta, una semilla de planta o
cualquier parte de una planta. Una ``planta transgénica'' es
cualquier planta que ha incorporado en su genoma ácido nucleico
extraño.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustración y no deben considerarse como una limitación de las
reivindicaciones.
Un clon lambda que contiene el elemento
Ac7 y secuencias wx de flanqueo (Behrens y otros,
Mol. Gen. Gent. 194:346-347, 1984) se digirió
con Bg1II y se subclonó en el sitio BamHI de pUC13
(Messing, J. Methods in Ezymology, 101 (1983)). Este vector
intermedio se digirió con SalI y PstI y el fragmento
de 6 kb que contiene Ac se clonó en el sitio XhoI del
vector basado en Ti pMON200 (Fraley y otros, Biotech
3:629-635, 1985). La construcción resultante se
denominó pMAC. Un mapa de restricción de la porción transformante
de pMAC se muestra en la figura 1.
El vector pDS203 es un derivado de pMON200 que
contiene el elemento Ds1 junto con secuencias Adh1
de maíz de flanqueo (Sutton y otros, Science
223:1265-1268, 1984, incorporado aquí mediante
referencia). Se preparó mediante clonación de extremos romos del
fragmento HindIII-BamHI de 750 pb de pDs2.A (Sutton y
otros, Science 223:1265 (1984) en el sitio EcoRI de
pMON200. Un mapa de esta construcción se muestra en la figura
2.
El plásmido pDs202, un derivado de pMAC, contiene
un gen de \beta-galactosidasa (Bgal) bacteriano
que reemplaza al fragmento HindIII central de Ac. Se
construyó en dos etapas. Un fragmento SacI de 800 pb de
T-DNA que alojaba un sitio HindIII se
suprimió de pMAC digiriendo pMAC con SacI y recircularizando
el plásmido derivado. Después de la digestión con HindIII,
que corta un fragmento de 1,6 kb del centro del elemento Ac,
el derivado de pMAC se ligó con un fragmento HindIII de 4,7
kb que contenía un gen de \beta-galactosidasa de
E. coli bajo el control de un promotor polC de
Bacillus subtilis (Ott y otros, Mol. Gen. Genet.
207:335-341, 198). La mezcla de ligación se
transformó en DH5\alpha de E. coli y el plásmido
recombinante se seleccionó rastreando con respecto a colonias azules
resistentes a espectinomicina y estreptomicina sobre placas de
X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido).
El elemento Ds, denominado Ds202, se representa
esquemáticamente en la figura 3.
Para construir un elemento de transposasa
estable, el extremo de Ac más cercano al extremo 3' del
transcrito de Ac se suprimió. Se digirió pJAC con
ClaI, que segmentaba un solo sitio en el vector pBR322. La
exonucleasa III y la nucleasa S1 se usaron para generar derivados de
supresión plasmídicos según se describe por Henikoff (1984),
excepto que los conectores de ClaI se ligaron a los
extremos romos antes de la recircularización y la transformación en
E. coli. DNA aislado de las colonias se ensayó mediante
análisis de restricción para encontrar un derivado con
aproximadamente 50 pb suprimidas del extremo de Ac. Un
fragmento de 4,3 kb que contenía toda la región de codificación de
transposasa de Ac se obtuvo mediante digestión con
Cla y Bam HI. Los extremos del fragmento
BamI-ClaI que contenía el gen de transposasa se
rellenaron con enzima de Klenow y trifosfatos de desoxinucleótido y
el fragmento se clonó en pMON200 digerido con EcoRI, acabado
en extremos romos y desfosforilado. El elemento, denominado
Ts105, se representa esquemáticamente en la figura 4.
DNA de pDs202 se digiere con HindIII y los
extremos sobresalientes se rellenan usando polimerasa de Klenow y
desoxinucleótidos. En una reacción separada, el plásmido pUC19
(Yanische-Perron, C. y otros, Gene
33:103-119 ( 1985)) se digiere con PvuII y el
fragmento de 30 pares de bases que contiene el policonector se
aísla sobre un gel de agarosa preparativo. Los extremos de este
fragmento se rellenan de forma similar con la polimerasa de Klenow y
este fragmento de 300 pb se inserta en el sitio HindIII de
extremos romos de pDs202. Después de la confirmación de este vector
intermedio, el vector se digiere con Bgl2 y Cla1
dando como resultado la linealización del vector con extremos de
Bgl2 y Cla1 incompatibles. En una reacción separada,
la transposasa de 4,3 kb que codifica el fragmento de pJAC se aísla
después de la digestión con BamHI y Cla1 según se
describe previamente. Este fragmento se liga en el producto
intermedio pDs202 digerido con Bgl2, Cla1. Este
vector, pTV101, contiene un elemento Ds no autónomo con un
policonector en su porción interna así como una secuencia de
codificación de transposasa estable, y se representa
esquemáticamente en la figura 5.
Véase la sección 3 más adelante
Las construcciones previas se introdujeron en
GV311SE de A. tumefaciens (Monsanto, St. Louis, Mo.)
mediante apareamiento triparental según se describe por Fraley y
otros (1985). Híbrido F_{1} de Lycopersicon esculentum x
L. pennelli y variedades de cultivo de L. esculentum
de cereza VF36 y VFNT se transformaron mediante una adaptación de
procedimientos de transformación publicados (Koornneef y otros,
Plant Sci. 45:201-208, 1986; Filatti y otros,
Biol/Technology 5:726-730, 1987). Las
semillas se esterilizaron superficialmente durante una hora en lejía
comercial al 50% y germinaban en medio MSSV (Fillatti y otros,
1987). Se cortaron cotiledones de 4 a 7 días de edad y se pusieron
en placas alimentadoras de tabaco preparadas recientemente,
preparadas decantando 1-2 ml de células de tabaco en
cultivo en suspensión sobre medio 2Z (Thomas y Pratt, Theor.
Appl. Genet. 59:215-219, 1981). Después de 48
horas los cotiledones se sumergieron durante 5 minutos en un cultivo
nocturno de Agrobacterium diluido hasta una DO_{600} de
0,1. Se transfirieron a continuación en seco y se volvieron a poner
sobre las placas alimentadoras. Después de 24 horas los explantes
se pusieron en medio 2Z complementado con 340 mg/l de carbenicilina
(Pfizer, Nueva York, Nueva York) y 100 mg/l de sulfato de kanamicina
(Boehringer-Mannheim, Alemania Occidental). Los
retoños cortados se enraizaron en medio que contenía 50 mg/l de
kanamicina. Para asegurar que cada transformante se derivara
independientemente, sólo se propagó una plántula resistente a
kanamicina por explante.
Las plantas transgénicas se analizaron usando
análisis de transferencia Southern. Se aisló DNA genómico de tejido
de planta congelado mediante el método CTAB descrito por Bernatzky
y Tanksley, Theor. Appl. Genet. 72:314-321
(1986). Se digirieron 10 microgramos de DNA genómico con enzimas de
restricción de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con la
adición de espermidina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) 4
mM. Las muestras se separaron electroforéticamente en geles de
agarosa al 0,8% y se transfirieron a Zeta-probe
(BioRad Laboratories, Richmond, California) o
Hybond-N (Amersham, Arlington Heights, Illinois). La
prehibridación (4 h) y la hibridación (16 h) se efectuaron a 42ºC
en 5 x SSC, 10 x solución de Denhardt (Denhardt, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 23:641 (1966)), tampón de fosfato sódico
50 mM (pH 7,0), sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1%, 500
\mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (Sigma) y
formamida al 50%. Después de la hibridación, los filtros se lavaron
durante 2 h a 65ºC en 0,2 x SSC, SDS al 1% y pirofosfato
sódico al 0,1%; la solución de lavado se cambió de 4 a 5 veces.
Antes de resondar, los filtros se separaron con dos lavados de 15
minutos a 95ºC usando la solución de lavado.
Un fragmento ClaI-BamHI de 4,3 kb
de pJAC-D (Yoder y otros, 1988) se usó como la
sonda específica para Ac. DNA para la sonda específica para
wx se aisló como un fragmento SalI de 3,2 kb de
pSALC (Shure y otros, Cell, 35:235-242
(1983)). Un fragmento de 0,75 kb homólogo a Ds1 y que
flanquea secuencias Adh1 de maíz se aisló de pDS2.A (Sutton y
otros, Science 223:1365-1268, 1984) mediante
digestión con HindIII y BamHI. Un fragmento de DNA de
300 pb usado para la sonda Ds1 interna se sintetizó usando
la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki y otros, Science
209:487-491, 1988) sobre 1 \mug de
pDS2.A (Sutton y otros, 1984) con los cebadores
CGCTCCTCACAGGCTCATCTC y CCTCCGCAAATCTTCGAACAG. El DNA se amplificó
durante 30 ciclos usando el siguiente régimen: (1) 2 minutos a
96ºC; (2) 2 minutos a 45ºC y (3) 2 minutos a 72ºC. Todos los
fragmentos de DNA usados para las sondas se sometieron a
electroforesis 2 veces a través de geles de agarosa, realizándose
la segunda separación en agarosa de bajo punto de fusión. La
concentración de agarosa se diluyó hasta 0,5% o menos con H_{2}O
y el DNA se marcó mediante el método del cebador aleatorio
(Feinberg y Vogelstein, Anal. Biochem.
132:6-13, 1983) usando un estuche comercial
(Amersham).
DNA de dos transformantes de tomate primarios que
contenían Ds1 se examinó mediante análisis Southern para
determinar la integridad y el número de inserciones de
T-DNA. El análisis Southern de la planta
T27-03 indicaba la presencia de un límite izquierdo
y un límite derecho de T-DNA, sugiriendo que la
planta contenía una sola copia del elemento Ds1. El análisis
de la segunda planta indicaba que el transformante
T26-18 contenía dos límites izquierdos y dos límites
derechos y sugería la presencia de dos copias del elemento
Ds1 que no eran inserciones de T-DNA
conectadas en tándem. El análisis de DNA aislado de la planta
T16-03, usando una estrategia descrita en Yoder y
otros, Mol. Gen. Genet. 213:391-296 (1988),
incorporado aquí mediante referencia, indicaba aquí la presencia de
al menos un elemento Ac activo.
Se usaron plantas transformadas con Ds1
como donantes de polen en cruces con los transformantes Ac,
la progenie F_{1} se hizo crecer y se aisló DNA de tejido foliar
de una progenie individual. Debido a que los progenitores eran
hemicigóticos para los genes introducidos, se esperaba que los
elementos transponibles se transmitieran a aproximadamente 50% de la
progenie de las plantas T16-03 y
T27-03 y aproximadamente 75% de la progenie de la
planta T26-18. Se realizó un análisis Southern para
determinar qué progenie heredaba Ac, Ds1 o ambos.
Además, era posible determinar si Ds1 se cortaba de su
posición original.
La posición residente de un elemento
transponible, según se describe aquí, se refiere a su posición
original en el T-DNA. Cuando un elemento se corta
durante la transposición, queda un sitio donante vacío que consiste
en el T-DNA sin el elemento. Después de la digestión
de DNA de planta con BamHI y HindIII, la posición
residente de Ds1 está en el fragmento de restricción de 2,1
kb; si Ds1 se corta de su posición residente, se predice un
sitio donante vacío de 1,7 kb (figura 1). Una digestión doble con
BamHI-HindIII de Ac da tres fragmentos de
restricción homólogos a la sonda de Ac usada en estos
análisis. Dos fragmentos de restricción de 1,6 kb son internos a
Ac, y por lo tanto están presentes independientemente de la
localización de Ac en el genoma del tabaco. Cuando Ac
está en su posición residente en el T-DNA, el
tamaño del tercer fragmento de restricción es 2,4 kb. Si Ac
se transpone, este tercer fragmento de restricción consiste en 1,2
kb de Ac y DNA de tomate de flanqueo que se extiende hasta el
sitio BamHI o HindIII más cercano; así, este
fragmento de restricción es de un tamaño diferente para cada
posición de Ac en el genoma del tomate. La variación de los
modelos de formación de bandas (sonda de Ac) sugiere que
Ac está en posiciones distintas de su posición residente en
todas las progenies mostradas.
El análisis de hibridación Southern de 24
progenies F_{1} que resultaban del cruce entre Ac
(T16-03) y Ds1 (T27-03 y
T26-18) se muestra en la Tabla 1. La segregación de
Ac y Ds mostrada en la Tabla 1 está de acuerdo con
la presencia de un locus Ds1 en T27-3, dos
loci Ds1 no conectados en T26-18 y un solo
locus Ac en T16-3. Cinco progenies contenían
Ds1 pero no Ac; no se detectaba un sitio donante
vacío en esas plantas. Once gemelos contenían tanto Ac como
Ds1; todos tenían una banda del tamaño predicho para un
sitio donante vacío. La relación de sitio residente a sitio donante
vacío variaba de planta a planta según se esperaba si el material
examinado contenía elementos Ds1 tanto transpuestos como no
transpuestos. Estos resultados muestran que Ds1 es estable en
ausencia de Ac. Sin embargo, cuando un elemento Ac
está presente en la misma planta, Ds1 puede cortarse.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{6}{|l|}{Segregaclón
de Ac, Ts y Ds en progenies F _{1} }\\\hline Cruce ^{a}
\+\multicolumn{5}{|l|}{Número de progenies}\\\hline \+ Total \+
AclDs ^{b} \+ Acl ^{-b} \+ -lDs \+ - \\\hline
T16-03 x T27-03 \+ 15 \+ 5 \+ 3
\+ 2 \+ 5 \\\hline T16-03 x T26-18
\+ 9 \+ 6 \+ 0 \+ 3 \+ 0 \\\hline T16-12 x
T27-03 \+ 14 \+ 3 \+ 3 \+ 3 \+ 5 \\\hline
T16-03 x T27-14 \+ 14 \+ 2 \+ 3
\+ 6 \+ 3 \\\hline T16-12 x T20-14
\+ 5 \+ 3 \+ 2 \+ 0 \+ 0 \\\hline T16-03 x
88-119 \+ 20 \+ 8 \+ 4 \+ 5 \+ 3
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{a}El progenitor femenino se muestra en primer
lugar y sigue el progenitor masculino. T16-03
contenía Ac, T26-18 y T27-03
contenían Ds1, T16-12 contenía Ts101,
T20-14 contenía Ds202 y
88-119 contenían Ds204.
^{b}Ac se refiere a plantas que
contienen Ac o Ts101.
Tres transformantes primarios que contenían
Ts101 se analizaron mediante hibridación Southern. Un
digesto doble de BamHI-HindIII de Ts101 daba
tres fragmentos de restricción homólogos a la sonda de Ac:
Dos fragmentos de 1,6 kb eran internos al elemento y un fragmento de
1,1 kb se extendía en el T-DNA. Si se transponía
Ts101 a nuevas localizaciones en el genoma del tomate, el
fragmento de 1,1 kb sería de un tamaño diferente dependiendo de la
posición del sitio HindIII o BamHI más cercano en el
DNA de tomate de flanqueo. Se detectaron sólo las bandas de 1,6 kb y
1,1 kb cuando se analizaron los tres transformantes primarios.
Una planta transgénica que contiene Ds1
(T27-03) se cruzó con una planta transgénica que
contiene Ts101 (T16-12) y las progenies
F_{1} se examinaron mediante análisis Southern. La segregación de
Ts101 y Ds1 se muestra en la Tabla 1 y está de acuerdo
con la presencia de un solo locus de Ts101 en
T16-12. Cuando se sondaban con una sonda de
Ac, ninguna de las progenies exhibía bandas además de los
fragmentos de 1,6 kb y 1,1 kb. Cuando se sondaba con un fragmento
que contenía las secuencias tanto Ds1 como Adh1, el
sitio donante vacío se encontraba en las tres plantas que contenían
los elementos tanto Ts como Ds: los tres hijos que
contenían sólo Ds no tenían sitio donante vacío. Ds1
era estable en ausencia de Ts101, pero se cortaba de su
posición residente en todas las plantas que contenían
Ts101.
Así, los elementos Ds, Ds202 y
Ds1, son estables en plantas de tomate transgénicas en
ausencia de una transposasa introducida. Pueden transactivarse en
plantas de tomate transgénicas cruzando con plantas transgénicas
que contienen una transposasa activa. Los elementos Ds se
cortan ambos de sus posiciones residentes en el
T-DNA y se reintegran en nuevas posiciones en el
genoma del tabaco.
Además de usar un elemento Ac natural para
activar los elementos Ds, se usó un derivado estable,
Ts101. Puesto que Ts101 cataliza la transposición de
elementos Ds, los 50 pb en el extremo 3' de Ac no
son necesarios para la función de transacción de Ac. Este
hallazgo está de acuerdo con predicciones basadas en la
cartografía del transcrito de Ac de otros investigadores, que
sugiere que el transcrito de Ac termina a 265 pb del
extremo de Ac.
Se examinaron tres transformantes primarios y
seis progenies que contenían Ts101. Puesto que ninguna de
las plantas contenía ningún fragmento además de las bandas de 1,6 kb
y 1,1 kb, que diagnostican Ts101 en su posición residente,
no se detectó la transposición del elemento.
La sonda de Ds contenía tanto Ds1
como las secuencias de Adh1 de flanqueo. Se espera que las
plantas que contienen un sitio donante vacío también contengan
nuevas bandas resultantes de Ds integrado en nuevas
posiciones en el genoma del tomate. No se detectaron tales bandas
incluso bajo condiciones que podrían permitir la detección de una
banda presente en menos de un décimo de las células de planta. La
planta F_{1} (88-207B) que contenía tanto
Ac como Ds1 se autopolinizó. Las progenies F_{2}
se ensayaron con respecto a la presencia de nuevas bandas que
contienen Ds1. Puesto que los cigotos F_{2} se forman
mediante la unión de células simples de los gametofitos masculino y
femenino, cualesquiera elementos Ds1 transpuestos
transmitidos al cigoto deben estar presentes en una o dos copias
por células, una abundancia que puede detectarse fácilmente mediante
análisis Southern. La progenie de la planta 88-207B
se segregaba con respecto a la presencia de Ds1 en varias
nuevas posiciones. Por lo tanto, Ds1 se reintegraba en
nuevas posiciones en el genoma del tomate. La incapacidad para
detectar estas nuevas posiciones en la F_{1} se debía lo más
probablemente a la baja frecuencia de cualquier posición particular
en el tejido de planta muestreado.
Puesto que Ds202 es un derivado de
Ac que contiene un gen de
\beta-galactosidasa bacteriano que reemplaza el
fragmento HindIII de 1,6 kb central de Ac, el análisis
de plantas que contienen ambos elementos es complicado por su
similitud de secuencia. Sin embargo, los sitios residente y donante
vacío de Ac y Ds202 pueden distinguirse usando
digestiones dobles de EcoRI-SmaI. Usando la sonda
wx, que es homóloga a secuencias que flanquean tanto
Ac como Ds202, la banda residente para Ac es
de 4,3 kb y el sitio donante vacío es de 2,6 kb. Usando la misma
sonda, Ds202 tiene una banda residente de 3,5 kb y un sitio
donante vacío de 1,8 kb.
Plantas de tomate que contienen Ds202 se
cruzaron con plantas que contienen Ac y Ts101. La
segregación de Ds202 en la progenie estaba de acuerdo con un
solo locus que se había introducido en la transformación de la
planta T20-14 (Tabla 1). En el análisis de la
progenie que se segrega con respecto a Ac y Ds202,
las dos trayectorias que contenían tanto Ac como Ds202
son las únicas trayectorias que exhibían el sitio donante vacío
del elemento Ds202. Las tres progenies F_{1} que contenían
Ts101 y Ds202 son las únicas trayectorias que
exhibían el sitio donante vacío del elemento Ds202. Las tres
progenies F_{1} que contenían Ts101 y Ds202
contenían todas un sitio donante vacío. Dos gemelos que contenían
sólo Ds202 y no Ts101 no contenían un sitio donante
vacío. Ds202 era estable en plantas que carecían de una
transposasa introducida y se cortaba de su posición residente en
todas las plantas examinadas que contenían Ac o
Ts101.
Cuando DNA aislado de plantas que contienen
Ds202 se digiere con XbaI, una sonda de
\beta-galactosidasa se hibrida a un fragmento de
6,7 kb cuando el elemento Ds está en su posición residente;
si Ds202 se transpone, se predice que está en un fragmento
de tamaño diferente, mayor que 6,5 kb. Para determinar si
Ds202 se integraba en nuevas posiciones en el genoma del
tabaco, se sometieron las plantas F_{1} (progenie de Ac x
Ds202 y Ts101 x Ds202) a tal análisis: sólo se
detectó la banda de 6,7 kb indicativa de Ds202 en su
posición residente. Subsiguientemente, se analizó la progenie
F_{2} de un cruce Ac x Ds202. El transformante
Ds202 usado para generar el progenitor F_{1},
T22-25, contenía múltiples inserciones de
T-DNA y múltiples loci de Ds202. Cuando se
examinaban 20 plantas F_{2}, 6 contenían la banda residente y
una nueva banda de 8,8 kb que sugería que una copia de Ds202
se había transpuesto a una nueva posición en el progenitor
F_{1}.
La variedad de cultivo de tomate VF36 se
transformó con pMAC como se describe previamente. Los
transformantes primarios se denominan los R_{0}; las progenies que
resultan de autofecundar plantas R_{0} son F_{1} para los
presentes propósitos.
Se recogieron semillas autofecundadas de 30
transformantes primarios y de 20 a 100 semillas por familia se
sembraron en el invernadero. Las progenies se evaluaron visualmente
con respecto a aberraciones del fenotipo, y se seleccionaron cuatro
familias con variantes fenotípicas interesantes para el análisis
molecular descrito aquí. Estas cuatro líneas son
88-01, que se segrega con respecto a una
conformación redonda de la hoja (rlm);
88-08, que se segrega con respecto a una clorosis
foliar con aberración (var); 88-14, para una
mutación albina letal (lab) y 88-94, que
contiene una mutación que da como resultado tanto la clorosis de
las hojas como una conformación foliar entera (bzr). Tres de
estos mutantes (88-01, 88-08,
88-14) se segregaban en la progenie F_{1} en
relaciones de acuerdo con ser mutaciones recesivas monogénicas
simples. La cuarta, 88-94, aparecía sólo una vez en
aproximadamente 50 plántulas. Para obtener una imagen general del
comportamiento de Ac en la progenie transgénica, también se
caracterizó la segregación de Ac en seis familias que
parecían fenotípicamente normales. Estas diez familias se listan en
la Tabla 2 a continuación.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{9}{|c|}{Sumario
de datos de transferencia Southern de F _{1} }\\\hline \+ \+ \+
\+\multicolumn{3}{|c|}{Segregación}\+ \+ \\\hline Familia \+
Fenotipo \+ Nº de \+ Nº de copias \+ T-DNA \+
Ac \+ - \+ - \+ Progenie que \\ \+ \+ progenie \+ de
T-DNA \+ de AC \+ - \+ T-DNA \+
- \+ hereda un Ac \\ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+
transpuesto \\\hline 88-01 \+ rim \+ 17 \+ 1 \+
12 \+ 2 \+ 3 \+ 0 \+ 12 \\ 88-04 \+ wt \+ 6
\+ 1 \+ 4 \+ 0 \+ 2 \+ 0 \+ 0 \\ 88-05 \+ wt
\+ 6 \+ 1 \+ 4 \+ 1 \+ 1 \+ 0 \+ 1 \\ 88-08
\+ var \+ 12 \+ > 2 \+ 0 \+ 0 \+ 9 \+ 3 \+ 0 \\
88-09 \+ wt \+ 6 \+ > 2 \+ 6 \+ 0 \+ 0
\+ 0 \+ 0 \\ 88-10 \+ wt \+ 6 \+ 1 \+ 2 \+ 0
\+ 1 \+ 3 \+ 2 \\ 88-11 \+ wt \+ 6 \+ 1 \+ 5
\+ 0 \+ 0 \+ 1 \+ 0 \\ 88-12 \+ wt \+ 6 \+
> 1 \+ 2 \+ 1 \+ 2 \+ 1 \+ 1 \\ 88-14 \+
lab \+ 12 \+ 4 \+ 10 \+ 1 \+ 0 \+ 1 \+ 5 \\
89-94 \+ bzr \+ 13 \+ 1 \+ 7 \+ 1 \+ 3 \+ 2
\+ 5 \\ Total \+ \+ 90 \+ \+ 52 \+ 6 \+ 21 \+ 11 \+ 26
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se realizaron hibridaciones Southern de las
progenies 6 a 17 de los diez transformantes primarios
seleccionados según se describe previamente, con los resultados
indicados en la Tabla 2. Se distinguieron inserciones de Ac
que se transmitían genéticamente desde las producidas somáticamente
en la F_{1} mediante tres criterios: se detectó la misma
inserción en plantas tanto parentales como de progenie; la misma
inserción comigraba en al menos dos gemelos; o se detectaba un
suceso de recombinación meiótica que daba como resultado una
progenie que contenía un elemento Ac transpuesto pero no
T-DNA.
La presencia de un Ac transpuesto en una
progenie que carece de secuencias de T-DNA indica
que un Ac transpuesto era heredado del progenitor. Tales
presencias requieren que Ac se transponga más allá del
locus de T-DNA en el progenitor. Esto permite a
continuación la recombinación y la selección de los loci. Por lo
tanto, un Ac heredado sin T-DNA tendría que
haberse transpuesto en primer lugar en el progenitor. Para evaluar
la progenie con respecto a la presencia de secuencias de Ac y
T-DNA, una transferencia
HindIII-BamHI se sondó secuencialmente con la sonda
Ac de 4,3 kb y la sonda wx. Esta digestión permitía
la detección de secuencias de Ac independientemente de su
posición gracias al doblete de 1,6 kb interno que se hibrida con
la sonda de Ac. La sonda wx detectaba una banda
residente de 2,4 kb o un sitio donante vacío de 3,0 kb. Las
transferencias se sondaron adicionalmente con sondas específicas
para los límites derecho e izquierdo de T-DNA para
determinar el número de copias de pMAC en los transformantes. Cada
progenie que contenía secuencias de wx, como un fragmento de
sitio residente o donante vacío, también contenía secuencias de
límite de T-DNA. Por lo tanto, la presencia de la
banda reversiva de wx, la banda residente de pMAC o los
límites de T-DNA podía usarse para identificar el
locus de inserción de T-DNA.
Una planta tenía secuencias de Ac pero no
secuencias de wx o T-DNA. El modelo
observado en esta planta debe haber surgido de una combinación
meiótica entre el Ac transpuesto y el plásmido pMAC
donante. La frecuencia de este suceso en las otras nueve familias
examinadas se describe más tarde.
Una planta de la familia 88-14,
planta I, tenía una sola nueva inserción de Ac según se
determinaba usando cada una de las dos sondas de Ac. A
diferencia de la otra progenie, no había fragmentos de pMAC
residentes de 2,4 kb y 3,6 kb en esta planta. Adicionalmente, no
existía evidencia del plásmido donante en esta progenie cuando la
transferencia se sondaba con sondas específicas para wx o
T-DNA.
Los datos obtenidos sondando transferencias
Southern de las diez familias con sondas de Ac, wx y
límites de T-DNA se resumen en la Tabla 2. Esta
tabla indica el número de progenies con las secuencias tanto de
Ac como de T-DNA, el número con las
secuencias de Ac o T-DNA y el número sin
ninguna. En cinco de las diez familias, se identificaron progenies
que contenían Ac pero no secuencias del plásmido donante.
Esto significa que en al menos la mitad de las familias, algunas
progenies heredaban un Ac que se transponía una distancia
genética suficiente para permitir la detección de la recombinación.
En total, 6 de 90 progenies tenían Ac pero no
T-DNA. Esto es una infravaloración del número de las
progenies en las que Ac y T-DNA se
seleccionan meióticamente debido a que incluso cuando las secuencias
están totalmente desconectadas, 9/16 de las progenies contenían
todavía ambas. Debido a los pequeños tamaños de las poblaciones, no
se podían estimar distancias cartográficas de transposición.
Plantas de progenie que contienen una sola copia
transpuesta de Ac que se ha segregado meióticamente del
T-DNA son valiosas para seguir el comportamiento
subsiguiente de Ac. La planta de progenie
88-01 O es un candidato tal. Se mostraron semillas
autofecundadas de esta planta y DNA aislado de 7 progenies. El DNA
se digirió con HindIII y la hibridación Southern resultante
se sondó con la secuencia de Ac entera encontrada en
pJAC-D. La digestión con HindIII del elemento
transpuesto en 88-01 O da como resultado un
fragmento interno de 1,6 kb y fragmentos de unión de 2,2 kb y 3,7
kb. Debido a la segregación, dos de las sietes progenies (A y F) no
heredaban un Ac. Las cinco progenies que alojaban (B, C, D,
E y G) muestran las mismas tres bandas que estaban presentes en el
progenitor. Sin embargo, además de estas bandas parentales, son
evidentes nuevos sitios de inserción de Ac. Las intensidades
variables de estas bandas sugieren fuertemente que resultan de la
transposición somática de Ac en la F_{2}. Las progenies de
otras dos plantas F_{1} que contenían una sola copia de Ac
y no T-DNA (88-01 O y
88-14 I) también exhibían transposición somática de
Ac en la generación F_{2}. Por lo tanto, se concluye que
Ac continúa transponiéndose al menos hasta la tercera
generación después de la regeneración.
La bacteria Bacillus thuringiensis var.
kurstaki (B.t.k.) codifica una proteína (proteína B.t.) que es
preferencialmente letal para insectos lepidópteros. El gen que
codifica esta proteína se ha clonado, las secuencias de DNA que
permiten la expresión de los implantes génicos se han insertado en
la secuencia de control del gen y el gen se ha transformado en
plantas de tabaco mediante transformación medida por
Agrobacterium (Fischoff, D. y otros, Biotechnology
5:807-813 (1987)). Las plantas que expresan esta
proteína quimérica muestran tolerancia incrementada a larvas de
lepidópteros.
El fragmento de DNA de aproximadamente 4 kb que
contenía el gen de toxina de B.t.k. conectado a las
secuencias promotoras 35S de CaMV y reguladora NOS3'
se digiere del plásmido pMON9711 usando las enzimas de
restricción apropiadas. Este fragmento se clona a continuación en
la porción Ds de TV101 usando cualquiera de las enzimas de
restricción disponibles en la región policonectora. Después de la
confirmación de la estructura predicha mediante electroforesis a
través de geles de agarosa, el vector se introduce en cepas de
Agrobacterium tuemefaciens que contiene plásmidos Ti
desarmados según se describe por Fraley y otros, Biotechnology
3:629-635 (1985). La construcción final de
pBT101 se representa esquemáticamente en la figura 6.
La Agrobacterium que contiene pBT101 se
incuba con extractos de cotiledones de las variedades de cultivo
de tomate que se describen en Yoder y otros (1988), previamente.
Las células transformadas se seleccionan incluyendo 50 \mug/ml de
kanamicina en el medio de regeneración. Las plantas de tomate se
regeneran en plantas maduras según se describe (Yoder, previamente
(1988)). El DNA genómico se ensaya mediante hibridación Southern
para confirmar la inserción de T-DNA deseada.
Durante la regeneración del transformante
primario que tiene un pBT101, la porción de Ds de la
construcción se transpone hasta una nueva posición genómica
catalizada por el gen de transposasa. La porción de Ds que
tiene el gen 2B.t.k. puede transponerse más de una vez
durante el crecimiento de la planta. En efecto, se ha observado que
diferentes partes del mismo transformante primario contendrán
elementos transpuestos en diferentes posiciones genómicas,
indicativas de sucesos de transposición secundarios (Yoder y otros
(1988)).
Cuando la planta está madura, se autopoliniza o
se fecunda cruzadamente con una variedad sexualmente compatible.
Las progenies F_{1} son las progenies híbridas de un cruce o
autofecundando el transformante R_{0} primario se recogen semillas
y las plantas de la progenie crecen.
Cuando el Ds que tiene el gen
B.t.k. se ha transpuesto a una posición cromosómica
genéticamente distante del sitio de inserción del vector donante
pBT101, el Ds quimérico y el vector donante pBT101, ahora
carente de Ds, se seleccionará independientemente en la
progenie. En el caso de retrocruzamiento, la mitad de la progenie
F_{1} contendrá secuencias de pBT101 y la mitad contendrá el gen
Ds. Puesto que cada uno se distribuye aleatoriamente en esta
población, aproximadamente 1/4 de la progenie contendrá pBT101 y
Ds, 1/4 contendrá pBT101 pero no Ds, 1/4 contendrá
Ds pero no pBT101 y 1/4 no contendrá ninguno. Se obtiene
una relación diferente cuando la planta R_{0} se autopoliniza. En
este caso el número de plantas que contienen tanto pBT101 como
Ds, pBT101 pero no Ds, Ds pero no pBT101 o ni
pBT101 ni Ds será 9:3:3:1. En ambos casos, una cierta
proporción de las plantas contendrá una secuencia de Ds que
tiene el gen B.t.k. pero no contendrá ninguna otra
secuencia aportada por el plásmido donante. La porción
Ds-B.t.k. es estable ahora debido a que el
gen de transposasa se ha eliminado junto con el resto de las
secuencias donantes.
Un esquema alternativo para mover una
construcción de gen B.t.k.-Ds desde su posición original es
introducir el gen de transposasa en un plásmido separado. Esto tiene
la ventaja de que un transformante primario que contiene el gen de
interés en una posición estable puede regenerarse antes de mover el
gen deseado a una nueva posición.
Se prepara una construcción similar a pDs202 que
contiene el gen B.t.k. en lugar del fragmento de
B-gal. Esta construcción se transforma en una planta
y se regenera a una planta madura. A diferencia del caso previo,
la porción Ds-B.t.k. es ahora completamente
estable debido a que no se ha introducido en la planta gen de
transposasa.
Un gen de transposasa activo puede introducirse
en la planta que contiene la construcción
Ds-B.t.k. en cualquiera de dos modos. En
primar lugar, el gen de transposasa puede transformarse
directamente en el transformante primario o en la progenie de esta
planta. Por ejemplo, el transformante primario que contiene la
construcción Ds-B.t.k. podría hacerse crecer
hasta la madurez, autopolinizarse y recogerse las semillas. Estas
semillas germinarían y brotarían plántulas usadas como materia
huésped para una transformación secundaria usando un plásmido que
contiene el gen de transposasa. En algunos casos, puede ser
beneficioso usar un segundo marcador seleccionable, por ejemplo la
resistencia a la higromicina, para identificar transformantes que
contienen transposasa. Las plantas transgénicas que contienen tanto
el constructo Ds-B.t.k. como el gen de
transposasa se hacen crecer hasta la madurez, se autopolinizan o
se fecundan cruzadamente y las semillas de la progenie se recogen.
Como en el esquema previo, las plantas que contienen un fragmento
Ds-B.t.k. transpuesto pero no otra secuencias
donantes pueden identificarse como segregadoras en las poblaciones
de la progenie.
En algunos casos, puede ser deseable mover el gen
de interés más allá de su sitio de inserción original después de
la transformación. Este será el caso si la expresión del gen
deseado es óptima en su posición inicial. En estos casos, la
recolocación del gen de interés puede disminuir la eficacia con la
que se expresa el gen.
El sistema vectorial de transposición puede
incorporarse en estos casos insertando el gen marcador
seleccionable entre los límites de Ds. El gen B.t.k.
se clona a continuación en una región del vector que no se
moviliza mediante la acción de transposasa. Tal construcción se
representa esquemáticamente en la figura 7 como pBT201.
El plásmido pBT201 se transforma en una planta y
la selección con respecto a transformantes utiliza el marcador de
resistencia a la kanamicina. Durante la regeneración de esta
planta, la porción Ds, que tiene el marcador seleccionable
usado para la transformación, se transpondrá a nuevas posiciones.
Como con los casos previos, cuando el elemento Ds se ha
transpuesto a una posición no conectada, la segregación del
plásmido donante, que contiene el gen B.t.k., y el elemento
Ds, que tiene el marcador seleccionable, dará como
resultado plantas que contienen el gen B.t.k. pero no
secuencias marcadoras seleccionables.
Este esquema también puede incorporar el sistema
de dos plásmidos descrito en la sección B.
En cada uno de los esquemas descritos, se usa
segregación genética para crear plantas que contienen el gen
deseado pero no tienen secuencias indeseables. Estas plantas pueden
identificarse fácilmente mediante cualquiera de un número de
procedimientos de diagnóstico estándar para identificar DNA extraño
en planas. Adicionalmente, pueden usarse condiciones selectivas de
baja restricción para identificar plantas que no contienen el
marcador seleccionable. Estas condiciones no son letales para
plantas sin el gen (Weide y otros, previamente).
Claims (11)
1. Un método para producir una planta transgénica
que comprende un gen de interés que está libre de secuencias de
genes marcadores, comprendiendo dicho método:
- (a)
- proporcionar un constructo de DNA que comprende el gen de interés, ácidos nucleicos auxiliares extraños que comprenden secuencias de gen marcador y un transposón que funciona en plantas, en donde
- (i)
- el gen de interés se clona dentro de los extremos del transposón en las regiones no esenciales centrales del transposón, o
- (ii)
- el ácido nucleico auxiliar extraño que comprende las secuencias de gen marcador está entre los extremos del transposón;
- (b)
- transformar una primera planta con el constructo de DNA, en donde
- (i)
- la primera planta ha sido provista de una secuencia que codifica transposasa, mediante transformación asexual con un vector, o
- (ii)
- la primera planta se cruza con una segunda planta que contiene en su genoma una secuencia que codifica transposasa;
- (c)
- cruzar la planta transformada a través de autocruzamiento o cruzamiento con otra planta para obtener una progenie F_{1} o de una generación más separada; y
- (d)
- seleccionar las progenies que tengan el gen de interés y estén libres de secuencias del gen marcador.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el transposón es un elemento Ds.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el elemento Ds es un sistema Ac/Ds o un transposón Spm,
ambos aislados de maíz.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el gen de interés se selecciona del grupo que consiste
en un gen de endotoxina de Bacillus thuringiensis, un gen de
resistencia a una enfermedad, un gen de resistencia viral, un gen
de resistencia fúngica, un gen de maduración de frutos, un gen de
biosíntesis de aceite, un gen de biosíntesis de pigmento, un gen del
metabolismo del almidón o un gen de tolerancia ambiental.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que el gen de endotoxina de Bacillus thuringiensis es
B.t.k.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que un medio para seleccionar la progenie F_{1} o de una
generación más separada se selecciona del grupo que consiste en
hibridación Southern e hibridación por transferencia lineal.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
comprendiendo el método además un sistema de amplificación de
ácidos nucleicos para mejorar los ensayos de hibridación.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el ácido nucleico auxiliar extraño se selecciona del
grupo que consiste en un gen marcador, además de las secuencias de
origen bacteriano o viral que permiten que el constructo de DNA se
clone en un huésped bacteriano o fágico, o secuencias de
T-DNA de Agrobacterium.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que el gen marcador es un gen de resistencia a
antibióticos.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que las secuencias que codifican transposasa de planta se
introducen en la planta mediante inserción en el constructo de DNA,
o se introducen en la planta con un segundo constructo de DNA que
comprende una secuencia que codifica transposasa en una
transformación secundaria.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que el sistema de amplificación de ácidos nucleicos es la
reacción de amplificación con ligasa.
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