JP3256952B2 - 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 - Google Patents

植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法によ
り目的遺伝子を植物に導入して形質転換植物を得る際に
有用な新規ベクター、並びにこのベクターを用いて行
う、マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入植物
の作成方法、及び同一植物体へ２以上の目的遺伝子を導
入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学技術を利用した微生物、培養
細胞などの形質転換は、現在、医薬品として有用な生理
活性物質の生産等の目的に応用され、実産業においても
多大の貢献をなしている。植物育種の分野においては、
植物のライフサイクルが微生物等に比較してはるかに長
いこと等の理由から、遺伝子工学技術の実産業への応用
はやや遅れているが、この技術は、目的とする遺伝子を
直接、育種の対象となる植物に導入することを可能とす
るため、（ａ）改変すべき形質のみが導入できる、
（ｂ）植物以外の種（微生物等）の形質も植物に導入で
きる、（ｃ）育種期間の大幅な短縮ができるなど、交配
を重ねて行う古典的な育種と比べて多くのメリットを有
し、その応用は、植物育種の飛躍的進歩をもたらすもの
と期待され、またこの期待は現実のものとなりつつあ
る。
【０００３】具体的に、目的遺伝子を対象植物に導入
し、遺伝子導入植物を作成するには（１）目的遺伝子の
植物細胞への導入（染色体、核等に導入される場合も含
む。）、（２）目的遺伝子が導入された細胞のみからな
る植物組織の選抜、（３）選抜された植物組織からの植
物体の再生、の３段階を必ず経ることになる。このうち
目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては、一般に、目的
遺伝子の発現している組織（目的遺伝子が発現している
組織は、当然これが導入された細胞からなる組織であ
る。）を、植物体を再生することなく、しかも肉眼で確
認することが困難なことから、目的遺伝子は、細胞培養
の段階でその発現が容易に検出できるマーカー遺伝子と
共に植物細胞に導入され、マーカー遺伝子の発現の有無
（すなわちマーカー遺伝子の導入の有無）が目的遺伝子
導入の指標として用いられるのが普通である。例えば、
このようなマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性を付
与するカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴＩＩ；ネオマ
イシンリン酸化酵素遺伝子）やハイグロマイシン抵抗性
遺伝子（ＨＰＴ；ハイグロマイシンリン酸化酵素遺伝
子）、アミノ酸合成に関与するノパリン合成酵素遺伝子
（ＮＯＳ）やオクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）、農
薬耐性を付与するスルフォニルウレア系抵抗性遺伝子
（ＡＬＳ；アセトラクテート合成酵素遺伝子）などがあ
る。
【０００４】しかしマーカー遺伝子の発現はまた、この
ような遺伝子導入植物を食用等に供することを目的とし
た場合、重大な障害となる。つまり、かかるマーカー遺
伝子が発現することによって生ずる遺伝子産物の、人体
への安全性を担保することが非常に困難だからである。
従って、これらマーカー遺伝子を指標として作成された
遺伝子導入植物を食品として販売する場合には、その遺
伝子産物の人体への影響について詳細な調査が必要とさ
れる。例えば、ＮＰＴＩＩ遺伝子は、すでに１９８０年
代前半から、マーカー遺伝子として実験室レベルでは盛
んに用いられて来たが、１９９４年になってようやく、
その遺伝子産物が米国食品衛生局（ＦＤＡ）により食品
添加物として認可され、これをマーカー遺伝子として用
い、形質転換された遺伝子導入植物が食用等に供される
ようになった。しかし、実際にこれを口にすることにな
る肝心の消費者レベルでは、このようなＮＰＴＩＩ遺伝
子産物への不安感は、依然として拭い去り難く存在し続
けている。
【０００５】また現在、マーカー遺伝子として実用化さ
れているのは、このＮＰＴＩＩ遺伝子をはじめ、植物細
胞に対する成長阻害物質の解毒作用に寄与する遺伝子の
みであり、それ故、目的遺伝子導入組織の選抜にあたっ
ては、これら成長阻害物質を含む培地でその培養を行
い、マーカー遺伝子の発現の有無、つまりはかかる物質
に対する耐性を評価し、これを指標とすることになる。
しかしこの場合、耐性がある、すなわちかかる物質の存
在下で植物組織が増殖するといっても、これは程度の問
題であり、このような阻害物質の存在下での培養が、植
物細胞にとって好ましからぬ影響を与えることは避け難
く、現実に、植物細胞の活性低下に伴う遺伝子導入組織
の増殖、再分化率の低下等の副作用が問題となってい
る。
【０００６】さらに、遺伝子導入組織選抜後の植物細胞
におけるマーカー遺伝子の発現は、遺伝子導入による植
物育種を行うにあたっても、大きな障害を与える。すな
わち、あるマーカー遺伝子を用いて作成された遺伝子導
入植物に対して、さらに別の遺伝子を新たに導入しよう
とする場合には、二度と、同一のマーカー遺伝子を用い
て遺伝子導入を行うことができない。すでにその植物に
はこのマーカー遺伝子が存在しているため、再びこれを
新たな目的遺伝子と共にその同じ植物に導入しても、新
たな目的遺伝子が導入されようがされまいが、その植物
の細胞や組織ではこのマーカー遺伝子が常に発現し、こ
れを目的遺伝子導入の指標とすることはもはやできない
からである。従って、このような遺伝子の多重導入は、
各導入過程を繰り返す毎に異なるマーカー遺伝子を用い
ることになる。しかし、植物種によりマーカー遺伝子の
有効性は異なり、それぞれのマーカー遺伝子の使用に際
しては、その都度条件設定のための予備実験が必要とな
る（例えば、イネではＮＰＴＩＩ遺伝子よりＨＰＴ遺伝
子の方が有効であると報告されている（Ｋ．Ｓｈｉｍａ
ｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）、３３８：２７４、１９８９））。また、そもそも
マーカー遺伝子の種類には限りがあるため、マーカー遺
伝子を換えるだけでは、遺伝子の多重導入を無制限に繰
り返すことは不可能である。つまり、ある植物に対して
遺伝子導入を繰り返すことのできる回数は、その植物に
用いることのできるマーカー遺伝子の種類数によって、
自ずから制約を受けることとなる。しかも、現在実用で
きるマーカー遺伝子の種類は、上記したようにごく限ら
れているのである。従って、遺伝子導入植物組織の選抜
後、その際用いたマーカー遺伝子を、それが存在し、機
能する染色体等のＤＮＡから除去するなどして、これに
よる影響をその細胞、組織、さらには植物体から排除す
る技術は、遺伝子工学技術を用いた植物育種の新たな展
開に必須のものである、と言うことができる。
【０００７】現在、マーカー遺伝子の影響を排除するた
めのこうした技術としては、マーカー遺伝子と植物のト
ランスポゾンを一体として用い、このトランスポゾンと
共にこれを、その導入された植物染色体から除去する方
法（国際公開ＷＯ９２／０１３７０号公報）、及びこの
トランスポゾンに代えてＰ１ファージの部位特異的組換
え系を用いる方法（国際公開ＷＯ９３／０１２８３号公
報）の二つが報告されている。これらの方法によれば、
確率的にはかなり低いが、遺伝子導入後にある一定の割
合でマーカー遺伝子が植物染色体から除去された細胞、
すなわち目的遺伝子だけが染色体に残留して発現し、マ
ーカー遺伝子の機能は消失した遺伝子導入植物細胞を得
ることができる。
【０００８】もっとも、これらの方法により、マーカー
遺伝子がその染色体から除去された植物細胞が生じたと
しても、この細胞は、これがなおそこに存在して発現し
ている細胞中に点在しており、しかも、これら２種類の
細胞は肉眼での識別が不可能なことから、これらをその
ままで分離することはできない。目的遺伝子導入時のよ
うに、マーカー遺伝子が発現している細胞を選抜しよう
とする場合には、これが植物細胞に付与する薬剤耐性・
栄養要求性等を指標とする選抜を行うこともできるが、
この選抜の際、そのマーカー遺伝子の発現がない細胞は
重度の成長障害を起こし、多くは死に至らしめられるの
で、マーカー遺伝子が除去された細胞を得る、というこ
こでの目的には、かかる選抜方法は到底適用することが
できない。
【０００９】そこで、これらの方法により、染色体から
マーカー遺伝子が除去され、目的遺伝子だけが残留した
植物を得るためには、マーカー遺伝子が染色体から除去
された細胞と、これがなおそこに存在している細胞とを
混在させたまま、ある程度培養して増殖させた後、その
培養組織を再分化させて得られた植物体の組織を、サザ
ンハイブリダイゼーション法、またはポリメラーゼ連鎖
反応法などの手法を用いて解析することにより、選抜を
行うことが考えられる。この場合において前提となるの
は、このような再分化個体は単一の細胞に由来し、それ
故これを構成する細胞はすべて等しい性質を持つ、例え
ば、マーカー遺伝子が除去された細胞に由来する個体
は、すべてこうした細胞のみからなる、という仮定であ
ることは言うまでもない。しかし多くの場合、かかる再
分化個体を構成する細胞は必ずしも均一ではないことが
既に良く知られており、マーカー遺伝子にしても、これ
が染色体から除去された細胞と、なおそこに存在してい
る細胞とは、再生された植物の同一個体内、さらには同
一組織内においてすら、全く不規則に共存・分布するこ
ととなる。従ってこれらの方法では、培養組織を再分化
して植物個体を再生しただけの段階で、マーカー遺伝子
が染色体から除去された細胞のみからなる個体を得るこ
とは非常に困難である。また、これを選抜するための解
析においては、たとえどのような手法であっても、上記
の解析手法を始め現在知られている手法ではすべて、そ
の適用に際し、共試試料としてその個体全体でも単一細
胞でもなく、適当なマスを有する組織、例えば一枚の
葉、を用いるため、その結果は、その葉一枚におけるマ
ーカー遺伝子の存在状況等について、全体的傾向を測定
・解析するものに止まる。従って、同一個体・組織内に
おいて、マーカー遺伝子が除去された細胞とこれが存在
している細胞とが、混在しているのがむしろ普通の状態
であるこのような場合において、仮にマーカー遺伝子が
染色体から除去された細胞のみからなる個体が偶発的に
生じたとしても、この解析結果をもってその個体を選抜
することは到底不可能であると言わざるを得ない。この
結果においてマーカー遺伝子の存在等が検出されなかっ
たとしても、その同じ個体の他の部位の組織もそうであ
るとする保証は全くなく、また、そもそもマーカー遺伝
子の存在等が検出されなかったからといって、これはそ
の存在量等が単に検出限界以下であることを示すに過ぎ
ず、その試料中に、マーカー遺伝子の存在する細胞が全
く含まれていないとは、この場合には言い切れないから
である。
【００１０】結局のところ、このような場合には、花
粉、卵細胞等の生殖細胞を経由することにより初めて、
マーカー遺伝子の影響が排除された個体が得られること
となる。すなわち、これらの生殖細胞は単細胞であるの
で、例えばこれが、その細胞の染色体からマーカー遺伝
子が除去された卵細胞であるならば、これを用いて自家
受粉を行った場合、古典的遺伝法則に従う一定の確率
で、マーカー遺伝子をその染色体に含まない受精卵が得
られ、さらにこの受精卵からは、これと同一の特性を有
する細胞のみからなる個体が生ずるであろう。サザンハ
イブリダイゼーション法等の解析手法による選抜は、こ
の個体を対象として行えばよい。つまり、ここで挙げた
報告に記載の方法による場合、マーカー遺伝子が染色体
から除去された細胞が得られたとしても、これが存在す
る培養組織から植物体を再分化し、さらにこの再分化し
た植物体を用いて交配を行い、Ｆ１またはその後代の子
孫を得て初めてかかる細胞のみからなる個体が得られ、
そしてそれをマーカー遺伝子の影響が排除された個体と
して、選抜することができるようになるのである。
【００１１】なお特開平６−２７６８７２では、やはり
マーカー遺伝子の影響を排除するため、遺伝子導入の
際、マーカー遺伝子を目的遺伝子とは別個のプラスミド
ベクターに組込んで用いることにより、導入後にマーカ
ー遺伝子のみを細胞から除去する技術を報告している
が、これにしても、その除去のためには交配過程を必ず
経なければならず、その点では上記の２報と同様であ
る。
【００１２】しかしこのような方法では、生長の遅い木
本植物、不稔個体、もしくはＦ１であること自体に価値
がある雑種個体への適用は難しい。またそうでなくと
も、トランスポゾン等の脱離能を有するＤＮＡ因子は、
これらがその存在し、機能する染色体ＤＮＡやウィルス
ベクターＤＮＡ等から除去される確率が極めて低いこと
が多いため、その除去、つまりはマーカー遺伝子の機能
の消失は、実用上、少なくとも培養組織の段階で容易に
検出できることが要求される。培養組織の再分化、そし
てその再分化個体の交配による後代の作出を経なければ
確実にこれを検出できないのであれば、その実用化は殆
ど不可能である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
細胞の活性を低下させる植物細胞成長阻害物質等を用い
ることなく、遺伝子導入組織の選抜を可能とするマーカ
ー遺伝子を有する、植物への遺伝子導入用ベクターを提
供することにある。
【００１４】
【００１５】さらに本発明は、上記マーカー遺伝子を有
し、かつ、目的遺伝子と共に植物細胞へ導入されたこの
遺伝子を、これが存在し、機能する染色体等のＤＮＡか
ら除去して、その影響を排除する機能を備え、効率的
に、目的遺伝子の導入を何度でも繰り返すことのでき
る、植物への遺伝子導入用ベクターを提供し、加えて、
かかるベクターを用いて行う、交配によるＦ１もしくは
その後代の作出過程を経ることのない、マーカー遺伝子
の影響を排除した遺伝子導入植物の作成方法、及びこれ
を応用した、同一植物体への遺伝子多重導入方法を提供
することをも目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、マーカ
ー遺伝子として形態異常誘導遺伝子を用い、この形態異
常誘導遺伝子が脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つ
にする位置に存在し、また、目的遺伝子は、この脱離能
を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにすることのない位置
に存在するようベクターを構築することにより、達成す
ることができる。
【００１７】ここで形態異常誘導遺伝子とは、植物の組
織に、例えば、矮化、頂芽優勢の崩壊、色素の変化、根
頭癌腫、毛状根、葉の波打ち等の、通常と異なる形態分
化を引き起こす遺伝子を意味する。例えば、これらの形
態異常誘導遺伝子としては、すでに、ｉｐｔ遺伝子
（Ａ．Ｃ．Ｓｍｉｇｏｃｋｉ、Ｌ．Ｄ．Ｏｗｅｎｓ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：
５１３１、１９８８）、ｉａａＭ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａ
ｎ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｈ．Ｊ．Ｋ
ｌｅｅ ｅ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１０：３９
８３、１９９１）、ｇｅｎｅ ６ｂ遺伝子（Ｐ．Ｊ．
Ｊ．Ｈｏｏｙａａｓ ｅｔ ａｌ．、ＰｌａｎｔＭｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：７９１、１９８８）、及びｒｏ
ｌＡ〜Ｄのｒｏｌ遺伝子群（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４：３３、
１９８５）等、それぞれ特異的な遺伝子が、各種の植物
に癌腫、奇形腫（すなわち不定芽・不定根等の形成）を
引き起こす細菌である、アグロバクテリウム等に存在し
ていることが報告されており、また、シュードモナス・
シリンガエの亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉ
ｎｇａｅ ｓｕｂｓｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）ではｉ
ａａＬ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ−ｌｙｓ
ｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子（Ａ．Ｓｐｅｎ
ａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２
２７：２０５、１９９１）の存在が、さらに種々の植物
からもホメオボックス遺伝子やフィトクローム遺伝子等
の存在が報告されている。
【００１８】これらの遺伝子は、いずれも本発明におい
て使用することができるが、中でも特に、頂芽優勢の崩
壊を引き起こすｉｐｔ遺伝子や、毛状根の形成、及び毛
状根から再生した植物の矮化や葉の波打ち等を引き起こ
すｒｏｌ遺伝子群は、種々の形態異常誘導遺伝子の中で
も特徴的な形態の異常を引き起こすことから、本発明に
使用するマーカー遺伝子として好ましい。さらに、これ
らはまた、それを組み合わせることにより、それが導入
された特定の植物に、不定芽・不定根等の特定の構造を
再分化させるよう設計することも可能である。本発明に
おいては、このような遺伝子の組み合わせを利用し、遺
伝子導入のターゲットとなる植物の種類等、遺伝子導入
植物の作成条件に応じて形態異常誘導遺伝子を構築し、
用いることもできる。
【００１９】かかる形態異常誘導遺伝子の細胞への導入
により生じた、異常な形態をした組織は、この遺伝子を
有する細胞のみからなっているので、これをマーカー遺
伝子として目的遺伝子と共にベクターを構築し、このベ
クターを植物細胞に導入してこの細胞を培養しさえすれ
ば、これから生じる異常な形態を示す組織を肉眼で選抜
することのみにより、マーカー遺伝子、つまりは目的遺
伝子が導入された細胞だけからなる組織を選抜できるこ
とになる。なお、ここでベクターとは、外来遺伝子を宿
主細胞に導入する目的に用いられるＤＮＡ配列であっ
て、この外来遺伝子を宿主細胞内で発現させるために必
要な機能を備えているものを指し、外来遺伝子は多くの
場合、これに組み込まれた形で宿主細胞に導入される。
【００２０】すなわち本発明のベクターを用いて遺伝子
導入を行えば、遺伝子導入後の細胞をＭＳ培地等の通常
の培地を用い、通常の培養条件で培養するだけで、目的
遺伝子が導入された細胞のみからなる植物組織の肉眼に
よる選抜が可能となる。従って、その選抜にあたって
は、植物細胞成長阻害物質等、遺伝子導入組織選抜のた
めの特別な物質を使用する必要がないので、作業が簡略
化されるばかりではなく、これらの影響により植物細胞
の活性が低下するおそれもない。
【００２１】
【００２２】一方、脱離能を有するＤＮＡ因子とは、こ
れらが存在し、機能する染色体ＤＮＡ等から、それ自身
が脱離し得る能力を有するＤＮＡ配列をいう。植物では
このような因子として、染色体上に存在するトランスポ
ゾンと呼ばれるものが知られており、その構造と働き、
そしてその挙動もほぼ判明している。すなわち、トラン
スポゾンが機能するためには、原則として、その内部に
ある遺伝子から発現し、それ自身の脱離及び転移を触媒
する酵素（転移酵素）と、やはりその内部の末端領域に
存在し、この転移酵素が結合し作用するＤＮＡ配列とい
う、２つの構成要素が必要とされる。これらの働きによ
り、トランスポゾンはその存在する染色体上から脱離
し、その後、普通はＤＮＡ上の新たな位置に転移する
が、一定の確率で転移できぬままその機能を失い、消失
等する場合も生ずるので、本発明ではこのようなトラン
スポゾンの転移ミスを利用する。なおトランスポゾンに
は、このような自律性トランスポゾン、すなわち、転移
酵素とＤＮＡ結合配列という２つの要素を保持してい
て、トランスポゾン内部から発現する転移酵素が末端領
域に存在するＤＮＡ配列に結合して作用することによ
り、自律的にその存在する染色体上から脱離して転移し
うるものの他、非自律性トランスポゾンと呼ばれるタイ
プもある。この非自律性トランスポゾンとは、転移酵素
が結合し作用する末端のＤＮＡ配列は保持しているもの
の、内部にある転移酵素遺伝子に変異が生じており、転
移酵素の発現がないため、自律的に染色体上から脱離す
ることができないものをいうが、しかし、非自律性トラ
ンスポゾンも、自律性トランスポゾンあるいはこれとは
独立して存在する転移酵素遺伝子から転移酵素が供給さ
れると、自律性トランスポゾンと同様の挙動を示すこと
となる。
【００２３】現在、単離されている自律性トランスポゾ
ンとしては、トウモロコシより単離されたＡｃとＳｐｍ
があり、詳細な解析がなされている（Ａ．Ｇｉｅｒｉ
ａｎｄ Ｈ．Ｓａｅｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．、１９：３９、１９９２）。とりわけＡｃは、
トウモロコシの染色体中、ｗｘ−ｍ７遺伝子座を制限酵
素Ｓａｕ３Ａで切り出すことにより得ることができる
（Ｕ．Ｂｅｈｒｅｎｓｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．、１９４：３４６、１９８４）、植物トラ
ンスポゾンの中では最も解析の進んでいる自律性トラン
スポゾンであり、そのＤＮ Ｇｅｎｅｔ．、１９８：１９、１９８４）当業者が容易
に取得可能なことから、本発明に使用するＤＮＡ因子と
して相応しい。また、非自律性トランスポゾンとして
は、それぞれＡｃ、Ｓｐｍの内部領域が欠損したもので
ある、Ｄｓやｄｓｐｍを始め（Ｈ．−Ｐ．Ｄ にも、キンギョソウ、アサガオ等の多くの植物から単離
されている（例えば、Ｙ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６：３７５、１９９
４）。ちなみに、これらのトランスポゾンは、その由来
する植物と異なる種類の植物の染色体に導入された場合
でも、その能力を発揮して脱離し、転移することが多く
の例で知られている（例えば、Ｂ．Ｂａｋｅｒ ｅｔ
ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８３：４８４４、１９８６）。
【００２４】なお、本発明においては、自律性、非自律
性のいずれのトランスポゾンを使用することもできる。
非自律性のトランスポゾンを用いる場合には、その内部
に、形態異常誘導遺伝子の他、自律性トランスポゾン等
から取得、または合成した転移酵素遺伝子を挿入して使
用すればよい。
【００２５】さらに、植物以外に存在する脱離能を有す
るＤＮＡ因子としては、部位特異的組換え系（ｓｉｔｅ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓ
ｙｓｔｅｍ）に由来するものが知られている。この部位
特異的組換え系は、特徴的なＤＮＡ配列を有する組換え
部位（本発明の脱離能を有するＤＮＡ因子にあた
る。）、及びこのＤＮＡ配列に特異的に結合して、その
配列が２以上存在したとき、その配列間の組換えを触媒
する酵素、という２つの要素からなり、そして、このＤ
ＮＡ配列が同一ＤＮＡ分子上に、同一方向を向いてある
一定の間隔で２か所存在している場合には、これに挟ま
れた領域がこのＤＮＡ分子（プラスミド、染色体等）か
ら脱離し、またこの配列が対向する方向を向いて２か所
存在している場合には、この領域が反転する、という挙
動を示す。本発明では、この前者の脱離作用を利用する
が、このような組換え部位内部の脱離・反転は、部位特
異的組換え系によるいわゆる相同的組換えの結果として
生ずるものであり、これが、転移の過程としてその脱離
を起こす、トランスポゾンを用いた場合の機構ともっと
も異なる点である。なお組換え酵素をコードする遺伝子
は、必ず組換え部位と同一のＤＮＡ分子上に存在する必
要はなく、これと同一細胞内に存在し、発現していさえ
すれば、このＤＮＡ配列間の脱離・反転を生ぜしめ得る
ことが知られている（Ｎ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：７７、１９８８）。
【００２６】現在、部位特異的組換え系はファージ、細
菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離されたＣ
ｒｅ／ｌｏｘ系、ｐＳＲ１系、ＦＬＰ系、ｃｅｒ系、ｆ
ｉｍ系等が知られているが（総説として、Ｎ．Ｌ．Ｃｒ
ａｉｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：１
７、１９８８）、高等生物ではまだその存在を知られて
いない。しかし、これらの微生物から分離された部位特
異的組換え系も、前記した国際公開ＷＯ９３／０１２８
３号公報において、Ｐ１ファージ由来のＣｒｅ／ｌｏｘ
系が植物への遺伝子導入用ベクターに利用されているよ
うに、その由来する生物種と異なる生物種（植物を含
む）に導入された場合でも、そのそもそもの生物内にお
ける挙動と同一の挙動をとることが明らかとなってい
る。ちなみに本発明の一実施例では、酵母（Ｚｙｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）の部位特異
的組換え系であるｐＳＲ１系（Ｈ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ
ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７
２：６１０、１９９０）を、その組換え部位間に組換え
酵素を挿入して利用したが、このｐＳＲ１系もまた、高
等植物においてその本来の機能を維持することがすでに
報告されている（Ｈ．Ｏｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：６３７３、
１９９１）。
【００２７】また本発明において、形態異常誘導遺伝子
を挿入する場所は、脱離能を有するＤＮＡ因子と共に、
これが脱離し得る位置でありさえすればよい。例えば、
脱離能を有するＤＮＡ因子としてトランスポゾンを用い
た場合には、転移酵素遺伝子のプロモーター領域より上
流で、この転移酵素が結合する末端領域よりは下流の、
トランスポゾンの脱離に影響を及ぼさない位置にこれを
挿入することができる。またｐＳＲ１系を用いた場合に
は、組換え部位に挟まれた領域内で、組換え酵素の発現
を阻害しない位置でありさえすれば、これをどこにでも
挿入することができる。
【００２８】形態異常誘導遺伝子を脱離能を有するＤＮ
Ａ因子とこのようにして組合せてベクターを構築すれ
ば、このベクターを用いて植物に遺伝子を導入した場
合、導入後、マーカー遺伝子として用いた形態異常誘導
遺伝子は、脱離能を有するＤＮＡ因子と共に、植物の染
色体等、それらが導入され機能していたＤＮＡ上から脱
離し、その頻度に差はあるものの、ある一定の確率でそ
の機能を失う一方、これとは挙動を一つにしない目的遺
伝子は、おなじＤＮＡ上に残留し続けることになる。そ
れ故このベクターは、導入しようとする目的遺伝子に関
する構成を変更するのみで、ある一つの植物体へ遺伝子
の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返して
用いることができる。しかもこの形態異常誘導遺伝子の
機能の消失は、遺伝子導入の際と同様に、遺伝子導入組
織の培養中に起こる、その形態の変化として肉眼で検出
できるので、目的遺伝子だけが染色体等に残留してその
機能を保持している細胞のみからなる組織を、何ら特別
な操作を行うことなく、その組織を培養するだけで確実
・容易に選抜できることとなる。従って、たとえかかる
細胞が実際に生ずる確率は低くとも、このベクターは十
分に実用に供することができ、これを用いた遺伝子の多
重導入も、ただ何回でも繰り返せるばかりではなく、完
全な植物体を再生する前の培養組織の段階でこれを繰り
返せるため、効率良く行うことができる。また、かかる
細胞だけからなる遺伝子導入個体を得るためには、上記
のようにして選抜した組織から植物体を再生するだけで
よく、交配過程を経る必要もない。そしてこのようにし
て得られた遺伝子導入個体はまさに、マーカー遺伝子の
遺伝子産物がもたらすかもしれない人体への悪影響に対
する危惧から、完全に解放されたものなのである。加え
てこのベクターは、マーカー遺伝子として形態異常誘導
遺伝子を用いたことから由来する他の特徴、すなわち、
遺伝子導入組織の選抜過程で、細胞活性の低下を招くお
それがある細胞成長阻害物質等を用いる必要がないとい
う、前述したメリットをも合わせ持つことは言うまでも
ない。
【００２９】本発明のベクターは、遺伝子工学的手法に
より遺伝子導入が可能な、いかなる植物においても用い
ることができ、また、本発明のベクターにより植物に導
入できる目的遺伝子は、農業的に優れた形質を付与でき
る遺伝子、農業的に優れた形質を付与するとは限らない
が、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、目
的に応じて種々選択することができる。
【００３０】なお一般に、遺伝子から酵素等のタンパク
質が産生されるには、これらポリペプチドの情報をコー
ドしている構造遺伝子配列の他に、構造遺伝子のプロモ
ーター配列（発現開始配列）、ターミネーター配列（発
現終結配列）などの調節配列が必要とされ、例えば、植
物で機能するプロモーター配列としては、カリフラワー
モザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｊ．Ｔ．Ｏｄ
ｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）、３１３：８１０、１９８５）、ノパリン合成酵素
のプロモーター（Ｗ．Ｈ．Ｒ．Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、４：３
５５、１９８５）、リブロース２リン酸カルボキシラー
ゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットのプロモーター
（Ｒ．Ｆｌｕｈｒｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：２３５８、１９８
６）等が、またターミネーター配列としては、ノパリン
合成酵素のポリアデニル化シグナル（Ａ．Ｄｅｐｉｃｋ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎ．、１：５６１、１９８２）、オクトピン合成酵素の
ポリアデニル化シグナル（Ｊ．Ｇｉｅｌｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：８３５、１９８４）等が知
られている。従って、本発明において単に遺伝子とした
場合には、構造遺伝子及び遺伝子発現調節配列を指す。
ちなみに、本発明においては、実施例で使用した遺伝子
発現調節配列に限ることなく、上記のような種々の遺伝
子発現調節配列を使用することができる。さらに、遺伝
子、すなわちＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの
クローニングにより得ることができるが、あらかじめそ
のシーケンスが明らかにされているものであれば、これ
を化学合成して得ることもできる。
【００３１】本発明のベクターは、植物に感染するウイ
ルスや細菌を介して、植物細胞に間接的に導入すること
ができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。この場合、例え
ば、ウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイル
ス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロ
ムモザイクウイルス等が使用でき、細菌としては、アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメフ
ァシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェ
ネス（以下、Ａ．リゾジェネスと略す。）等が使用でき
る。なおアグロバクテリウム属は、一般に単子葉植物に
は感染せず、双子葉植物にのみ感染するとされている
が、最近では、これらを単子葉植物へ感染させて遺伝子
導入を行った例も報告されている（例えば、国際公開Ｗ
Ｏ９４／００９７７号公報）。
【００３２】本発明のベクターはまた、マイクロインジ
ェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレ
ングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレ
ーション法等の物理的・化学的手法によっても、植物細
胞に直接導入することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕ
ｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９
９１）。単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染
しにくい双子葉植物に対しては、遺伝子導入法として汎
用されているアグロバクテリウムを用いた間接導入法が
使用できないため、これらの直接導入法が有効である。
【００３３】
【作用】本発明において、マーカー遺伝子として用いた
形態異常誘導遺伝子は、これが発現することにより、そ
の導入された植物細胞において、植物成長ホルモンの異
常生産等、それぞれ、その細胞内の生理状態に異常をも
たらし、結果としてその増殖・分化の方向を狂わせて様
々な形態異常を引き起こす。つまり、ここで生じる異常
な形態をした組織、例えば頂芽優勢の崩れた無秩序な芽
の集合体（多芽体）や毛状根等は、こうした形態異常誘
導遺伝子が導入された細胞に由来し、これが異常な増殖
・分化をした結果生じたものであるので、この遺伝子を
有する細胞のみからなっている。従って、これをマーカ
ー遺伝子として目的遺伝子と共に植物細胞に導入してこ
の細胞を培養すれば、これから生じる異常な形態を示す
組織を肉眼で選抜することのみにより、マーカー遺伝
子、つまりは目的遺伝子が導入された細胞だけからなる
組織を選抜できることとなるので、植物細胞成長阻害物
質の培地中への添加等、特別な操作は何等行うことな
く、肉眼による遺伝子導入組織の選抜が可能となる。
【００３４】
【００３５】さらに本発明では、脱離能を有するＤＮＡ
因子をこの形態異常誘導遺伝子と組合せ、形態異常誘導
遺伝子が脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする
位置に組み込んで用いる。かかる構成を有するベクター
を用いて植物に遺伝子を導入すれば、導入後、マーカー
遺伝子である形態異常誘導遺伝子は、脱離能を有するＤ
ＮＡ因子と共に、それらが導入され機能していたＤＮＡ
上から、一定の確率で脱離してその機能を失う一方、こ
れとは挙動を一つにしない目的遺伝子は同じＤＮＡ上に
残留して機能を保持し続けることとなる。それ故このベ
クターは、導入しようとする目的遺伝子に関する構成を
変更するのみで、マーカー遺伝子を始めとする他の構成
に何等変更を加えることなく、ある一つの植物体へ遺伝
子の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返し
て用いることができる。マーカー遺伝子が機能を失った
遺伝子導入組織等では、そのマーカー遺伝子の発現はも
はや起こり得ないので、同じマーカー遺伝子の発現を何
度でも繰り返して、新たな目的遺伝子導入の指標とする
ことができるからである。
【００３６】しかもこのマーカー遺伝子、つまり形態異
常誘導遺伝子の機能の消失は、遺伝子導入の際と同様
に、遺伝子導入組織の形態の変化として肉眼で検出でき
ることから、この機能の消失した細胞だけからなる組
織、換言すれば、目的遺伝子のみがその染色体等に残留
して機能を保持している細胞だけからなる組織は、確実
・容易に選抜できることとなる。すなわち、かかる細胞
だけからなる組織を得るためには、まず、遺伝子導入処
理後の細胞を培養して、形態異常誘導遺伝子の発現によ
り生じてくる多芽体、毛状根等、異常な形態を示す組織
を肉眼で選抜し、これを分離してさらに培養を続け、次
いでこれらの形態異常を示す組織から生じてくる、今度
は正常な形態を示す組織をやはり肉眼で選抜すればよ
い。つまり、選抜のための特別な操作は何等行わなくと
も、培養と肉眼による選抜、そして分離を繰り返すだけ
でよく、従って、転移能が大きくＤＮＡからの完全な脱
離が起こり難いトランスポゾンであっても、本発明の脱
離能を有するＤＮＡ因子として十分に実用することがで
き、また遺伝子の多重導入も効率良く行うことができ
る。さらに、かかる細胞だけからなる植物体も、得られ
た遺伝子導入組織から植物体を再生するだけで、交配過
程を経ることなく取得することができる。
【００３７】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を実
施例に基づいて説明する。なお、以下の実施例におい
て、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モ
レキュラー・クローニング第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８９）、又は製造業者の取扱い説明書
に従い行われた。
【００３８】
【実施例】［実施例１］Ｉ．ベクターの作成 病原性Ａ．ツメファシエンスＰＯ２２株のＴ−ＤＮＡ
（我彦広悦、植物の化学調節、２４：３５、１９８９、
（図１参照））上に存在するｉｐｔ遺伝子を制限酵素Ｐ
ｓｔＩで切り出し、これをプラスミドｐＵＣ７（モレキ
ュラー・クローニング第２版、第１巻、４．１０）のＰ
ｓｔＩ制限酵素部位と連結することにより、組換えプラ
スミドｐＩＰＴ１を得た。このプラスミドから、プロモ
ーター及びポリアデニル化シグナルを含むｉｐｔ遺伝子
を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切り出し、これを
プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）より購入）のＢ
ａｍＨＩ−ＰｓｔＩ制限酵素部位間に連結することによ
り、プラスミドｐＩＰＴ２を得、次いで、このｉｐｔ遺
伝子の内、構造遺伝子とポリアデニル化シグナルを制限
酵素ＲｓａＩで切り出し、これをプラスミドｐＵＣ１１
９のＳｍａＩ制限酵素部位と連結することにより、組換
えプラスミドｐＩＰＴ３を得た。そしてさらに、ｐＩＰ
Ｔ３に挿入されたｉｐｔ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及
びＳａｃＩで切り出し、植物への遺伝子導入用ベクター
プラスミドｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購
入）のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ制限酵素部位間に連結する
ことにより、プラスミドｐＩＰＴ４を作成した。このプ
ラスミドを有するＡ．ツメファシエンスを植物に感染さ
せた場合、その構造の内、いわゆるＴ−ＤＮＡ領域と呼
ばれるＬＢサイトとＲＢサイトの内側、ここではＮＰＴ
ＩＩ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を有する約５ｋｂの領域が植
物染色体に組み込まれることになる。
【００３９】なお、このプラスミドｐＩＰＴ４は、大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株
に導入し、この大腸菌をＥ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐ
ＩＰＴ４）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５０６３号）
として、国際寄託に付した。
【００４０】ｐＩＰＴ４の作成スキムを図２〜４に、ま
た、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図５に示す。
図２〜４及び図５中、丸で囲ったＰ、Ｔはそれぞれ、ｉ
ｐｔ遺伝子自身のプロモーター及びポリアデニル化シグ
ナルを、また３５Ｓ−Ｐはカリフラワーモザイクウィル
スの３５Ｓプロモーターを、Ｎｏｓ−Ｐはノパリンシン
ターゼ遺伝子のプロモーターを示し、Ｔ（図４）または
Ｎｏｓ−Ｔ（図５）は、ノパリンシンターゼ遺伝子のポ
リアデニル化シグナルを示す。
【００４１】本実施例では、図５より明らかなように、
マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子のうち、頂芽
優勢の崩壊を引き起こして多芽体形成に寄与するｉｐｔ
遺伝子を、また、目的遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を
モデル的に用いた。ｉｐｔ遺伝子は病原性Ａ．ツメファ
シエンスが保持する腫瘍化遺伝子の一員であり、この遺
伝子を導入された植物細胞は、植物ホルモンの一種であ
るサイトカイニンの過剰発現により、分化の方向が多芽
体形成に向かうことになる。
【００４２】また本実施例では、ｉｐｔ遺伝子の発現調
節配列として、プロモーター配列はカリフラワーモザイ
クウイルスの３５Ｓプロモーターを、ターミネーター配
列はｉｐｔ遺伝子自身のポリアデニル化シグナルを用い
た。
【００４３】ＩＩ．アグロバクテリウムへのｐＩＰＴ４
の導入 Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＣＬＯＮＴＥ
ＣＨ社より購入）を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビー
フエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ
／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２２℃で
のｐＨ７．２（以下、特に示さない場合は、２２℃での
ｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から
０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。培養液
を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した
後、菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０
分間の遠心で集菌し、次いでこの菌体を２００μｌのＹ
ＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液
とした。
【００４４】１５ｍｌチューブ（ファルコン社）内で、
プラスミド導入用菌液２００μｌとＩで作成したプラス
ミドｐＩＰＴ４ ６μｇを混合し、これを、あらかじめ
液体窒素中で３０〜４０分間冷却しておいたエタノール
にチューブごと５分間浸して冷却した後、２９℃の水浴
中に２５分間置き、次いで、７５０μｌのＹＥＢ液体培
地を加えて２９℃で１時間振盪して培養した。この菌液
を、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒
天１．２ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種し
て２８℃で２日間培養し、得られた菌コロニーをＹＥＢ
液体培地に移植してさらに培養した後、その菌体からア
ルカリ法でプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド
を制限酵素ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用い
て切断し、これをアガロースゲル電気泳動にて分析する
ことにより、このＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４
株にプラスミドｐＩＰＴ４が導入されていることを確認
した。
【００４５】ＩＩＩ．アグロバクテリウムからタバコへ
のｐＩＰＴ４の導入 温室内で成育させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａ
ｂａｃｕｍ ｃｖ．ｘａｎｔｈｉ、特に記載する場合を
除き、以下同じ。）の成葉を、１ｖ／ｖ％次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液に５分間浸漬して殺菌し、滅菌水で３回
洗浄した後、中脈を取り除いて約８ｍｍ角の葉片となる
よう調製した。このタバコ葉片を、ＩＩにおいてｐＩＰ
Ｔ４を導入したＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株
の菌液（ＯＤ６３０＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一
夜培養後、滅菌水で稀釈して菌体濃度を調製。）に約１
分間浸してこれに感染させた後、滅菌した濾紙の上に置
いて余分な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍ
ｇ／ｌを添加した植物ホルモンを含まない（ホルモンフ
リー）ＭＳ寒天培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ
Ｆ．Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１
５：４７３、１９６２、但し、寒天０．８ｗ／ｖ％を添
加。）に、葉の裏が上になるように置床した。これを２
５℃、全明（特に記載されない限り、外植片及び植物組
織・植物体の培養はこの条件で行った。）で３日間培養
後、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌのみを含むホルモン
フリーＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、不
定芽２２個が再分化し、この不定芽を分離してさらに同
組成の培地で培養した結果、多芽体６系統が得られた。
これらは１か月ごとに同培地に継代し、さらに３か月目
からはカルベニシリンを含まないホルモンフリーＭＳ寒
天培地で数回継代して、アグロバクテリウムの増殖がな
いことを確認した後、カナマイシン耐性試験およびＰＣ
Ｒ分析に供した。
【００４６】ＩＶ．遺伝子導入を行ったタバコの解析 Ａ．カナマイシン耐性試験 ＩＩＩにおいて得られた６系統の多芽体を、継代せずに
そのまま培養することにより、これから展開してきた葉
を切り取り、これを約３ｍｍ角に調製して、カナマイシ
ン２００ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地（ＢＡ１ｍｇ／
ｌ、ＮＡＡ０．２ｍｇ／ｌ添加）に置床し、培養１か月
後に観察を行った。その結果、同培地においてもこれら
多芽体の系統より得た葉片からはすべて、多芽体形成が
認められた。
【００４７】Ｂ．ＰＣＲ分析 ＩＩＩにおいて得られた多芽体６系統のすべてより染色
体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて導入遺伝子の確認を行
った。
【００４８】染色体ＤＮＡの抽出は、以下の改良ＣＴＡ
Ｂ法を用いて行った。まず、多芽体の葉、約１ｇを液体
窒素下で乳鉢を用いて粉砕し、これをあらかじめ６０℃
に保温しておいた、２ｗ／ｖ％ ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄ
ｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏ
ｍｉｄｅ）、１．４Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｖ／ｖ％ β
−メルカプトエタノール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）よりなる緩衡液５
ｍｌに懸濁した。この懸濁液を６０℃で３０〜６０分
間、緩やかに振盪させながら加温し、次いで室温まで冷
却した後、これに等容のクロロホルム：イソアミルアル
コール（２４：１）を加えて穏やかに混和した。続い
て、１６００×ｇで５分間の遠心分離を行って上清を回
収し、この上清に２／３容のイソプロピルアルコールを
加え、再び穏やかに混和した後、氷上に１０分間静置し
て染色体ＤＮＡを析出させ、これを１６００×ｇで１０
分間の遠心により沈殿させた。沈殿させた染色体ＤＮＡ
は、７０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄した後、真空乾燥
し、３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
【００４９】一方、ｉｐｔ遺伝子をＰＣＲ法にて検出す
るため、ｉｐｔ遺伝子に結合した場合、２つのプライマ
ー間の間隔が約８００ｂｐとなるように、用いるプライ
マー（オリゴヌクレオチド）をＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて合成した。ｉ
ｐｔ遺伝子の増幅のために、抽出した染色体ＤＮＡ１μ
ｇを、このプライマー０．２μＭを含む、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｗ／ｖ％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、及び１．２５
ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＣＥＴＵＳ社より購
入）という組成を有する混合液５０μｌ中に溶解し、こ
れを９４℃で１分３０秒間加温した後、９４℃で１分、
５５℃で２分、７２℃で３分の加温サイクルを３０回繰
り返して反応させた。得られた反応混合物をアガロース
ゲル電気泳動を用いて分析し、染色体ＤＮＡ中のｉｐｔ
遺伝子の存在を、これに由来する約８００ｂｐの遺伝子
が増幅されたことにより確認した。
【００５０】その結果を図６に示すが、図より明らかな
ように、この約８００ｂｐの遺伝子増幅は６系統の多芽
体すべてにおいて認められた。なお図中、左に示した数
値は、ＤＮＡサイズマーカーを泳動した際に検出される
各バンド成分の塩基数を表す。
【００５１】［比較例１］実施例１のＩＩＩにおいて、
Ａ．ツメファシエンス感染葉より再分化した不定芽から
得られた、多芽体形成能のない芽、１６系統についても
解析を行った。すなわち、同ＩＩＩで不定芽２２個を分
離して培養した結果、多芽体６系統が選抜された時点
で、多芽体ではなく正常な芽の形態（以下、正常体とい
う）をしていたものについても、同ＩＩＩ、ＩＶで多芽
体の系統にて行ったのと同様に、除菌し、カナマイシン
耐性試験を行い、さらに、そのうちの９系統につきＰＣ
Ｒ分析を行った。しかし、これら正常体の系統では、カ
ナマイシン添加培地に置床した葉片は約３か月程度です
べて褐変して枯死に至り、またＰＣＲ分析においても、
ｉｐｔ遺伝子の存在を示す約８００ｂｐのＤＮＡ断片の
増幅は、分析した９系統のいずれからも検出することが
できなかった。ＰＣＲ分析の結果を図６に示す。
【００５２】［実施例２］Ｉ．ベクターの作成 プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）より購入）を
制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その切断により生じた突
出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩ（大サブユニット）
にて平滑化した後、この末端を再び連結してプラスミド
ｐＮＰＩ１００を得た。すなわちこのｐＮＰＩ１００
は、ｐＨＳＧ３９８のＢａｍＨＩ制限酵素部位を消失さ
せたものである。また一方、プラスミドｐＣＫＲ９７
（Ｔ．Ｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．、２２７：３９１、１９９１）を制限酵素Ｐ
ｓｔＩで切断し、トウモロコシのトランスポゾンＡｃを
切り出して、これをｐＮＰＩ１００のＰｓｔＩ制限酵素
部位に挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１０２を得た。
【００５３】次に、実施例１で作成したプラスミドｐＩ
ＰＴ４（図５）から、カリフラワーモザイクウイルス３
５Ｓプロモーターとそれに連結されたｉｐｔ遺伝子を、
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで切り出し、その
突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩにて平滑化した
後、これをプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ制限
酵素部位に挿入して、プラスミドｐＮＰＩ１０１を得
た。このプラスミドｐＮＰＩ１０１から、再びカリフラ
ワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとｉｐｔ遺伝
子を、今度は制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで切り出
し、その突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩにより平
滑化した後、これを、制限酵素ＢａｍＨＩで切断して突
出末端を同様に平滑化したプラスミドｐＮＰＩ１０２と
連結させ、プラスミドｐＮＰＩ１０３を得た。すなわち
このプラスミドｐＮＰＩ１０３において、３５Ｓプロモ
ーターに連結されたｉｐｔ遺伝子は、トランスポゾンＡ
ｃ内部の旧ＢａｍＨＩ制限酵素部位に存在することとな
る。
【００５４】目的とするベクターは、このプラスミドｐ
ＮＰＩ１０３から、カリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーター及びｉｐｔ遺伝子を含むトランスポゾン
Ａｃを、制限酵素ＰｓｔＩで切り出し、これを植物への
遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＢＩ１２１のＳｓｅ
Ｉ制限酵素部位に挿入することにより得られ、これをプ
ラスミドｐＮＰＩ１０６とした。
【００５５】なお、このプラスミドｐＮＰＩ１０６もま
た、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＮＰＩ１０６）（受託番号：Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５０６４号）として、国際寄託に付し
た。
【００５６】プラスミドｐＮＰＩ１０６の作成スキムを
図７〜９に、また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図
を図１０に示す。図７〜９及び図１０中、トランスポゾ
ンＡｃの範囲は対向する黒三角形で示した。また図１０
中、Ａｃ−ＰはＡｃに内在するプロモーターを示す。そ
の他の記号は図２〜５と同様である。
【００５７】図１０より明らかなように、このプラスミ
ドはＴ−ＤＮＡ領域、すなわち植物染色体に組み込まれ
ることになる領域内に、マーカー遺伝子としてｉｐｔ遺
伝子を、目的遺伝子のモデルとしてＮＰＴＩＩ遺伝子及
びＧＵＳ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を有してお
り、かつ、ｉｐｔ遺伝子はトランスポゾンＡｃの内部に
挿入された形で存在している。なおこのＧＵＳ遺伝子
は、これを有する細胞が特殊な基質を代謝し、青色の色
素を生産することから、これを検出して遺伝子の発現を
知ることができるので、植物における遺伝子発現の解析
に汎用されている遺伝子である。
【００５８】ＩＩ．タバコへのｐＮＰＩ１０６の導入及
び遺伝子導入を行ったタバコの解析 Ａ．タバコへのｐＮＰＩ１０６の導入及び導入遺伝子の
発現試験 実施例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に、ｐＮＰＩ１０６を
Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入して、こ
のＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染させた後、
感染葉を、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌ添加ホルモン
フリーＭＳ寒天培地にて培養し、次いでカルベニシリン
のみ５００ｍｇ／ｌを添加した同培地で培養して、その
培養２か月目に多芽体６３系統を分離した。
【００５９】これらをさらに、同組成の培地（カルベニ
シリン５００ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培
地）に移植して培養を続け、１か月後に、やや伸長した
多芽体のシュート（以下、多芽体において発生する個々
の芽のことを、シュートと呼ぶこととする。）の中か
ら、他のシュートと比べて２倍程度以上の大きさに伸長
し、かつ、側芽の発達も認められず、ｉｐｔ遺伝子の影
響が弱まっていると思われるシュートを肉眼により９個
選抜し、そのシュートについた葉を用いて、実施例１の
ＩＶ−Ａと同様のカナマイシン耐性試験、及びＪｅｆｆ
ｅｒｓｏｎらの方法に準拠したＧＵＳ遺伝子の発現試験
（ＧＵＳ活性試験）を行った。また、葉を切り出した後
のシュートについても、ホルモンフリーＭＳ寒天培地に
移植してさらに培養を続け、その１か月後の形態を観察
し、そのシュートの多芽体形成能、すなわちｉｐｔ遺伝
子の発現を検定した。
【００６０】結果を表１に示す。
【表１】
【００６１】表１から明らかなように、Ｎｏ．８のシュ
ートでは、これより得られた葉がカナマイシン耐性及び
ＧＵＳ活性を有しているにもかかわらず、これ自体を１
か月培養しても多芽体を形成しない。これは、ここで用
いたベクターｐＮＰＩ１０６において、多芽体の形成に
寄与するｉｐｔ遺伝子はトランスポゾンＡｃの内部に挿
入された形で存在しているため、このベクターを保持す
るＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染させてその
培養を始めた当初は、タバコ染色体中に導入され、発現
していたｉｐｔ遺伝子が、その後の培養中に、このＡｃ
の働きにより、これと共に脱離してその機能を消失した
ためであると考えられる。一方、同じベクター上でも、
ＮＰＴＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子は、Ａｃと挙動を一つ
にすることのない位置に挿入されているので、これらは
Ｎｏ．８のシュートにおいてもなお、その染色体中に残
留して発現しているのである。
【００６２】また、表１中、Ｎｏ．３、５及び６のシュ
ートでは、カナマイシン耐性、多芽体形成能が認められ
るにもかかわらず、ＧＵＳ活性のみが陰性を示してい
る。すなわち、これらのシュートではｐＮＰＩ１０６を
用いて導入した遺伝子のうち、ＧＵＳ遺伝子のみが発現
していないことになるが、これは、これらの遺伝子が植
物染色体に導入される時に起こった組込みミスによるも
のと考えられる。つまり、Ａ．ツメファシエンスを介し
て遺伝子導入を行った場合、ｐＮＰＩ１０６のような構
造を有するプラスミドでは、本来、Ｔ−ＤＮＡ領域、す
なわちＲＢサイトとＬＢサイトの内側領域全体が植物染
色体に組み込まれるはずであるが、時としてこの組込み
が完全には行われず、これがＬＢ末端側のある部分で千
切れたような状態で組み込まれることがある。ここで用
いたｐＮＰＩ１０６では、そのＴ−ＤＮＡ領域に挿入し
た遺伝子の中でＧＵＳ遺伝子が、最もＬＢサイトに近い
位置に存在していることから、このような遺伝子導入時
の組込みミスにより、これが千切れてその機能を失った
状態で染色体に組み込まれたか、あるいは全く組み込ま
れなかったため、これらのシュートではＧＵＳ遺伝子の
発現がなく、その活性も認められないものと考えられ
る。ここで、Ｎｏ．２及びＮｏ．８のシュートの１か月
培養後の形態を図１１、１２に示す。
【００６３】なお、この時Ｎｏ．８のシュートから得ら
れ、カナマイシン耐性試験に供した葉について、試験後
も培養を続けたところ、５個の不定芽がこの葉から得ら
れたが、これらはすべて正常体であった。
【００６４】Ｂ．ＰＣＲ分析 表１におけるＮｏ．１〜９のシュートにつき、その多芽
体形成能を観察した後、実施例１のＩＶ−Ｂと同様にし
てＰＣＲ分析を行い、染色体中のｉｐｔ遺伝子の存在等
についてさらに検討を加えた。ただしここでは、実施例
１のＩＶ−Ｂで用いたプライマーに加えて、ＮＰＴＩＩ
遺伝子とＧＵＳ遺伝子上に結合すべく設計されたプライ
マーも使用したが、これを用いてＰＣＲを行うと、ｐＮ
ＰＩ１０６のＴ−ＤＮＡ領域から、Ａｃ、及びその内部
に挿入されたｉｐｔ遺伝子の脱離が起こった場合、約３
ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されるため、この増幅を指標と
して、Ａｃ及びｉｐｔ遺伝子の染色体ＤＮＡからの脱離
を検出できることとなる。ここで行ったＰＣＲ分析のう
ち、Ｎｏ．８のシュートについての結果を図１３に示
す。なお図中、左に示した数値については図６と同様で
ある。
【００６５】これより明らかなように、Ｎｏ．８のシュ
ートより抽出した染色体ＤＮＡにおいては、ｉｐｔ遺伝
子とＡｃの脱離を示す約３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認
められる一方、ｉｐｔ遺伝子の存在を示す約８００ｂｐ
のＤＮＡ断片の増幅は認められない。これは、ｉｐｔ遺
伝子がＡｃと共に、このシュートの染色体ＤＮＡから脱
離・消失したことを意味するものである。
【００６６】なお、これに対してＮｏ．１〜７、及び９
のシュートでは、このとき、その染色体ＤＮＡ試料のい
ずれからも約３ｋｂのＤＮＡ増幅は検出されず、その一
方で、約８００ｂｐの増幅はすべてにおいて検出され
た。従って、これらのシュートにおいてはｉｐｔ遺伝子
がなお、Ａｃと共にその染色体ＤＮＡ中に存在している
ものと考えられる。
【００６７】［比較例２］実施例２のＩＩ−ＡのＡ．ツ
メファシエンス感染葉の培養において、多芽体と共に分
化してきた正常体のうち３個を分離し、これらについて
実施例２のＩＩと同様に、カナマイシン耐性試験、ＧＵ
Ｓ活性試験、及び培養１か月後の形態観察、さらにＰＣ
Ｒ分析を行った。
【００６８】結果を表１に示すが、これらはいずれもカ
ナマイシン耐性、ＧＵＳ活性、及び多芽体形成能を有さ
ず、さらにＰＣＲ分析においても、約８００ｂｐ及び約
３ｋｂのＤＮＡ断片は、いずれもその増幅が検出されな
かった。
【００６９】［実施例３］実施例２で分離した多芽体６
３系統のそれぞれ一部を、さらにホルモンフリーＭＳ寒
天培地に植え継いで培養を継続し、約２か月後に、２系
統の多芽体から肉眼で識別できる正常な形態、すなわち
頂芽優勢を示すシュート、Ｎｏ．１３−１〜３、１４−
１〜４の計７個を得た。このシュートを分離して同組成
の培地に移植すると正常な形態の伸長発根個体が得ら
れ、そのうち、シュートＮｏ．１３−１及び１４−１よ
り得られた個体について、実施例２のＩＩ−Ｂと同様に
ＰＣＲ分析を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片
の増幅はどちらからも検出されず、その一方、約３ｋｂ
のＤＮＡ断片の増幅は両者で共に検出され、ｉｐｔ遺伝
子がＡｃと共に、これらの個体の染色体ＤＮＡから脱離
・消失していることが確認された。結果を図１４に示
す。図中、左に示した数値については図６と同様であ
る。またＧＵＳ遺伝子の発現は、７個のシュートより得
られたすべての個体において検出された。なお、ここで
多芽体から正常なシュートが分化してきた状態を図１５
に示す。
【００７０】［実施例４］実施例２で選抜した９個のシ
ュートのうち、表１においてＮｏ．７としたシュートよ
り得られた葉を、ホルモンフリーＭＳ寒天培地で約１か
月培養し、そこから分化してきた６個の不定芽より、正
常体１個を肉眼により選抜・分離した。これを同組成の
培地に移植すると正常な形態の伸長発根個体が得られ、
さらに、これについて実施例２のＩＩ−Ｂと同様にＰＣ
Ｒ分析を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片の消
失と約３ｋｂの同断片の増幅により、その染色体ＤＮＡ
からｉｐｔ遺伝子がＡｃと共に脱離・消失したことが確
認された。結果を図１６に示す。図中、左に示した数値
については図６と同様である。また同じ個体について、
ＧＵＳ遺伝子の発現も確認された。
【００７１】［実施例５］Ｉ．酵母からの部位特異的組換え系（ｐＳＲ１系）の分
離 酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘ
ｉｉ、（財）発酵研究所より購入）を５ｍｌのＹＰＡＤ
液体培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプトン２０ｇ
／ｌ、アデニン０．４ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）
に接種し、３０℃で一昼夜培養した。培養液を、６９０
０×ｇ、２０℃、３分間遠心して集菌（以下、菌体の回
収はすべて同条件で行なった。）し、得られた菌体を２
ｍｌの０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５
ｖ／ｖ％ β−メルカプトエタノールに懸濁して、時折
軽く撹拌しつつ２５℃で３０分間放置した後、回収し
た。この菌体に、ザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業
（株）より購入）２．５ｍｇ／ｍｌを含む１０ｗ／ｖ％
ソルビトール−５ｗ／ｖ％ ＫＰＯ４（ｐＨ６．８）
１ｍｌを加えて懸濁し、３０℃、９０分間放置し、再び
遠心分離により集菌した後、これを１ｍｌの溶解液
（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、５ｗ／ｖ
％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．
５）に懸濁し、さらにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０ｍ
ｇ／ｍｌ）を加え混合して、６０℃で１時間放置した。
次いでこの混合液を室温に戻し、フェノール：クロロホ
ルム、クロロホルム抽出により順次精製した後、得られ
た上清にイソプロパノールを等量加え、染色体ＤＮＡ及
びプラスミドｐＳＲ１を析出させ、６９００×ｇ、４
℃、１０分間遠心してこれを沈殿させた。沈殿させたＤ
ＮＡは、７０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄した後、真空乾
燥し、１００μｌのＴＥに溶解した。
【００７２】このようにして抽出したＤＮＡ（染色体Ｄ
ＮＡ及びプラスミドｐＳＲ１の両方を含む）より、ＰＣ
Ｒ法を用い、プラスミドｐＳＲ１に存在している部位特
異的組換え系（これをｐＳＲ１系という。）のみを増幅
した。ｐＳＲ１系は、組換え酵素遺伝子であるＲ遺伝子
と、組換え配列Ｒｓとから構成され、その塩基配列もす
でに明らかとなっている（Ｈ．Ａｒａｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８２：１９１、１９
８５）。本発明においては、Ｒ遺伝子の増幅のため、プ
ラスミドｐＳＲ１の配列中、５５９６〜５６１７番目に
当たる２２塩基の５´位に、ＸｂａＩ制限酵素部位を付
加したプライマー（５´−ＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡ
ＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＴＧ−３´）と、４１
２６〜４１４７番目に当たる２２塩基の５´位に、Ｓａ
ｃＩ制限酵素部位を付加したプライマー（５´−ＣＣＧ
ＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴ
ＣＡ−３´）を合成して使用し、一方、Ｒｓの増幅に
は、２セット各３０塩基（計４種類）のプライマーを合
成・使用した。すなわち１セットは、プラスミドｐＳＲ
１の塩基配列中、２８７〜３１６番目に当たる配列のう
ち３塩基を置換して、ＳｓｅＩ制限酵素部位を導入した
塩基配列を有するプライマー（５´−ＡＧＧＡＴＴＧＡ
ＧＣＴＡＣＴＧＧＡＣＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＣＡ−３
´）と、６９０〜７１９番目に当たる配列のうち４塩基
を置換して、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位とＸｈｏＩ制
限酵素部位を導入したものであるプライマー（５´−Ｃ
ＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＴ
ＡＧＴＣ−３´）とからなり（このプライマーセットで
増幅されるＲｓをＲｓ１と呼ぶ。）、もう１セットは、
同じくプラスミドｐＳＲ１の塩基配列中、２８７〜３１
６番目に当たる配列のうち３塩基を置換して、ＸｈｏＩ
制限酵素部位とＥｃｏＲＩ制限酵素部位を導入した塩基
配列を有するプライマー（５´−ＡＧＧＡＴＴＧＡＧＣ
ＴＡＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡ−３´）
と、６８８〜７１７番目に当たる配列のうち５塩基を置
換して、ＳｓｅＩ制限酵素部位を導入したものであるプ
ライマー（５´−ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＣＣＣＴＧＣ
ＡＧＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡＡ−３´）とからなっている
（このプライマーセットで増幅されるＲｓをＲｓ２と呼
ぶ。）。
【００７３】Ｒ遺伝子とＲｓの増幅のため、ＴＥ溶液と
した抽出ＤＮＡ１００μｌの内１μｌを、それぞれのプ
ライマーセット０．２μＭを含む、実施例１のＩＶ−Ｂ
で使用した混合液各５０μｌ中に混合し、これらを、９
５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分３０秒の
加温サイクル３０回で反応させた。得られた反応混合物
をアガロースゲル電気泳動を用いて分析し、Ｒ遺伝子と
Ｒｓの増幅を確認した。
【００７４】ＩＩ．ベクターの作成 ＰＣＲ法により増幅したＲｓ１を、制限酵素ＰｓｔＩ及
びＸｈｏＩで切断し、これをｐＳＬ１１８０（ファルマ
シア バイオテク（株）より購入）のＰｓｔＩ及びＸｈ
ｏＩ制限酵素部位に挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１２６
を得た。
【００７５】次に、ｐＨＳＧ３９８のＥｃｏＲＩ制限酵
素部位、及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を消失させる
ため、これらの制限酵素による切断、Ｔ４ポリメラーゼ
Ｉ（大サブユニット）による切断末端の平滑化、さらに
その平滑末端の再連結を順次繰り返し、これらの制限酵
素部位が消失したプラスミドｐＮＰＩ１２１を得、その
ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位に、ＰＣＲ法により
増幅したＲｓ２を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩで切断
して挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１２７を作成した。
【００７６】そしてこのｐＮＰＩ１２７のＳｍａＩ及び
ＸｂａＩ制限酵素部位に、ｐＮＰＩ１２６から制限酵素
ＳｍａＩ及びＳｐｅＩで切り出されたＲｓ１を挿入し
て、プラスミドｐＮＰＩ１２８を得た。
【００７７】Ｒ遺伝子は、ＰＣＲ法により増幅したその
断片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断して、ｐ
ＨＳＧ３９８のＸｂａＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位に挿
入した。これにより得られたプラスミドをｐＮＰＩ１２
４とした。
【００７８】次に、ｐＢＩ２２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社
より購入）を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、常法によりそ
の切断末端を平滑化・連結して、そのＳｓｅＩ及びＰｓ
ｔＩ制限酵素部位の消失したプラスミドｐＮＰＩ１１１
を得た。続いて、このｐＮＰＩ１１１のＸｂａＩ及びＳ
ａｃＩ制限酵素部位に、そのＧＵＳ遺伝子と置換する形
で、ｐＮＰＩ１２４より制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩ
で切り出されたＲ遺伝子を挿入して、プラスミドｐＮＰ
Ｉ１２５を作成し、さらに、これから、カリフラワーモ
ザイクウイルス３５Ｓプロモーターとそれに連結された
Ｒ遺伝子、及びノパリンシンターゼのポリアデニル化シ
グナルを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り
出して、これをｐＮＰＩ１２８のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥ
ｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入することにより、プラスミ
ドｐＮＰＩ１２９を得た。
【００７９】また、ｐＮＰＩ１０１は制限酵素ＳｍａＩ
で切断し、その切断部位に５´リン酸化ＨｉｎｄＩＩＩ
リンカー（宝酒造（株）より購入）を挿入し、プラスミ
ドｐＮＰＩ１２２とした。すなわちこのｐＮＰＩ１２２
は、ｐＮＰＩ１０１のＳｍａＩ制限酵素部位をＨｉｎｄ
ＩＩＩ制限酵素部位に置換したものである。さらに、こ
のｐＮＰＩ１２２を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、常法に
よりその切断末端を平滑化・連結して、そのＳｓｅＩ及
びＰｓｔＩ制限酵素部位が消失した、プラスミドｐＮＰ
Ｉ１２３を作成し、次いでこれから、カリフラワーモザ
イクウイルス３５Ｓプロモーターとそれに連結されたｉ
ｐｔ遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切り出して、
ｐＮＰＩ１２９のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に挿入
し、プラスミドｐＮＰＩ１３０を得た。
【００８０】目的とするベクターは、このｐＮＰＩ１３
０から、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモー
ターにそれぞれ連結されたｉｐｔ遺伝子とＲ遺伝子、及
びこれらの両端にあるＲｓを、制限酵素ＰｓｔＩで切り
出して、ｐＢＩ１２１のＳｓｅＩ制限酵素部位に挿入す
ることにより得られ、これをプラスミドｐＮＰＩ１３２
と命名した。
【００８１】なお、このプラスミドｐＮＰＩ１３２もま
た、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．Ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＮＰＩ１３２）（受託番号：Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５０６５号）として、国際寄託に付し
た。
【００８２】ｐＮＰＩ１３２の作成スキムを図１７〜１
９に、また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図２
０に示す。図１７〜１９、及び２０中、網かけした三角
形は酵母のプラスミドｐＳＲ１に由来する組換え配列Ｒ
ｓと、その配列方向を表す。その他は図２〜５と同様で
ある。
【００８３】図２０より明らかなように、このプラスミ
ドは、Ｔ−ＤＮＡ領域にマーカー遺伝子としてｉｐｔ遺
伝子を、目的遺伝子のモデルとしてＮＰＴＩＩ遺伝子及
びＧＵＳ遺伝子を有している点では、ｐＮＰＩ１０６と
同様である。しかしこの場合、脱離能を有するＤＮＡ因
子として機能するのは、酵母の部位特異的組換え系であ
るｐＳＲ１系の組換え配列、Ｒｓ間の領域であり、従っ
て、ｉｐｔ遺伝子は、同一方向を向いたこの二つの組換
え配列Ｒｓに挟まれた形で挿入されている。
【００８４】ＩＩＩ．タバコへのｐＮＰＩ１３２の導入
及び遺伝子導入を行ったタバコの解析実施例１のＩＩ、
ＩＩＩと同様に、ｐＮＰＩ１３２をＡ．ツメファシエン
スＬＢＡ４４０４株に導入して、このＡ．ツメファシエ
ンスをタバコ葉片（ここでは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ ｃｖ．ＳＲ１ を材料として用いた。）
に感染させた後、感染葉を、アセトシリンゴン５０ｍｇ
／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて培養し、次い
でカルベニシリンのみ５００ｍｇ／ｌを添加した同培地
で培養した。これを１か月後に同組成の培地に植え継い
でさらに１か月培養を続け、多芽体４８系統を分離し
た。
【００８５】これらを再び同組成の培地に移植してなお
培養を続けたところ、約１か月後（すなわちＡ．ツメフ
ァシエンス感染後、約３か月）に、その４８系統のうち
７系統から、肉眼で見て正常な形態を示すシュートが生
じ、これを分離してやはり同組成の培地に移植すると、
結局１０株の正常個体を得ることができた。
【００８６】これらについて、実施例２のＩＩ−Ｂと同
様にＰＣＲ分析を行った結果を図２１〜２３、及び表２
に示す。但しここでは、実施例２のＩＩ−Ｂで用いたプ
ライマーの他に、ＧＵＳ遺伝子の存在を確認できるプラ
イマーも併せて使用した。これらを用いてＰＣＲ分析を
行うことにより、ｉｐｔ遺伝子が存在する場合には約８
００ｂｐ、ｉｐｔ遺伝子がｐＮＰＩ１３２のＴ−ＤＮＡ
領域から、Ｒｓに挟まれた部分もろとも脱離した場合に
は約３ｋｂ（ここまでは、実施例２のＩＩ−Ｂで分析を
行った場合と同様である。）、そしてＧＵＳ遺伝子が存
在している場合には約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅さ
れることとなる。なお図２１〜２３中、左に示した数値
については図６と同様である。
【００８７】
【表２】
【００８８】表２より明らかなように、ここで、肉眼に
よりその形態を観察することのみで選抜された個体の染
色体からはいずれも、マーカー遺伝子であるｉｐｔ遺伝
子の存在は検出されず、かわってその脱離を示すＤＮＡ
断片の増幅が検出された。一方、目的遺伝子として用い
たＧＵＳ遺伝子の存在は、すべての個体において検出さ
れた。
【００８９】一方、ここで多芽体４８系統とほぼ同時に
生じた正常体（正常な芽の形態をしたもの）から得ら
れ、正常な伸長・発根を示した個体についても、その頂
芽を用いてカナマイシン耐性を検定したところ（カナマ
イシン２００ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地
使用）、その１６個体のうち２個体がカナマイシン耐性
を有することが判明した。
【００９０】そこで、このカナマイシン耐性個体につい
てさらに検討を加えるため、他のカナマイシン非耐性１
４個体のうちの３個体と共に、多芽体より得られたもの
の場合と同様にしてＰＣＲ分析を行った。この結果を図
２４に示す。図中の左に示した数値については、図６と
同様である。
【００９１】図２４より明らかなように、カナマイシン
耐性を示す２個体では、それぞれ、ｉｐｔ遺伝子を含む
Ｒｓに挟まれた領域の脱離、及びＧＵＳ遺伝子の存在を
示すＤＮＡ断片の増幅が検出され、これらの染色体に
は、ｐＮＰＩ１３２に由来すると考えられる遺伝子が組
込まれていることを確認した。なお、カナマイシン非耐
性の３個体ではかかる増幅は全く検出されず、また、ｉ
ｐｔ遺伝子の存在を示すＤＮＡ断片の増幅は、いずれの
個体からも検出されなかった。
【００９２】本来、多芽体形成能のない系統より得られ
たこれらの個体は、そもそもＡ．ツメファシエンス感染
時に、ｐＮＰＩ１３２が染色体中に導入されなかった細
胞を起源とするはずであるが、そう仮定する以上、この
ベクターに由来する遺伝子がその染色体に存在すること
は考えられない。ましてや、その染色体中に、これに由
来する遺伝子のうち、ｉｐｔ遺伝子のみが存在せず、Ｎ
ＰＴＩＩ遺伝子（これらの個体がカナマイシン耐性を示
すことより、その存在は明らかである。）、ＧＵＳ遺伝
子は完全な形で存在する個体が、かかる頻度で出現する
ことはまず有り得ないことである。
【００９３】従って、これらの個体では、ｐＮＰＩ１３
２が染色体に導入されなかったのではなく、一旦は導入
されたと考えるのが妥当である。つまり、ｐＮＰＩ１３
２のＴ−ＤＮＡ領域は、Ａ．ツメファシエンスの感染に
よってこれらの染色体に導入されたが、ここでマーカー
遺伝子の脱離に利用したｐＳＲ１系の性能が良すぎたた
め、そのＡ．ツメファシエンスの感染後、多芽体を形成
する前に、その働きによってｉｐｔ遺伝子が染色体から
脱離し、結局、ＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子だけ
が、そのままそこに残留し続けることになったのであろ
う。ＰＣＲ分析により、かかるカナマイシン耐性個体に
おいて、ＧＵＳ遺伝子の存在と同時に認められたｉｐｔ
遺伝子を含むＲｓに挟まれた領域の脱離も、これを裏付
けるものである。
【００９４】［実施例６］Ｉ．ベクターの作成 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（東洋紡績（株）
製）のＥｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入された、ｒｏｌ
Ａ、ｒｏｌＢ、及びｒｏｌＣを含む、全長７．６ｋｂの
ｒｏｌ遺伝子群（Ｓ．Ｋｉｙｏｋａｗａ、Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０４：８０１、１９９４）を制限
酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、これをｐＮＰＩ１２９のＥ
ｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入して、プラスミドｐＮＰＩ
７００を作成した。
【００９５】次いでこのｐＮＰＩ７００から、ｒｏｌ遺
伝子群、及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロ
モーターとそれに連結されたＲ遺伝子、及びこれらの両
端にあるＲｓを、制限酵素ＳｓｅＩで切り出し、これを
ｐＢＩ１２１のＳｓｅＩ制限酵素部位に挿入して、目的
とするプラスミドｐＮＰＩ７０２を得た。
【００９６】なお、このプラスミドｐＮＰＩ７０２もま
た、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＮＰＩ７０２）（受託番号：Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５０６６号）として、国際寄託に付し
た。
【００９７】ｐＮＰＩ７０２の作成スキムを図２５に、
また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図２６に示
す。なおこれらの図中、用いた記号は図２〜５と同様で
ある。
【００９８】図２６より明らかなように、このプラスミ
ドはマーカー遺伝子をｐＮＰＩ１３２のｉｐｔ遺伝子か
ら、ｒｏｌ遺伝子群に置き換えたものである。なお、本
実施例で用いたｒｏｌ遺伝子群は、天然にはＡ．リゾジ
ェネスのＴ−ＤＮＡ上に存在し、これが植物細胞に導入
されると、その植物組織に毛状根を発生させ、またこれ
から再生した植物体においても矮化等の形態異常を引き
起こすことが知られている。
【００９９】ＩＩ．タバコへのｐＮＰＩ７０２の導入及
び遺伝子導入を行ったタバコの解析 実施例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に、ｐＮＰＩ７０２を
Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入して、こ
のＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染させ、感染
葉をアセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリー
ＭＳ寒天培地にて３日間暗所で培養した。次いでチカル
シリンのみ４００ｍｇ／ｌを添加した同培地で培養した
ところ、毛状根の分化が培養開始後１５日過ぎ頃より認
められたので、この毛状根を順次分離し、シュート誘導
培地（α−ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、ベンジルア
デニン２．０ｍｇ／ｌ、チカルシリン４００ｍｇ／ｌ添
加ＭＳ寒天培地）に置床・培養して不定芽を分化させ、
そのうち正常な形態をしていると思われるもの１８個体
を肉眼で選抜した。これらについて実施例２のＩＩ−Ｂ
と同様にＰＣＲ分析を行い、そのうちの９個体につい
て、その染色体から、ｒｏｌ遺伝子を含むＲｓで挟まれ
た領域が脱離していることを確認した。なお、ここでは
プライマーとして、かかる脱離が検出されるプライマー
（実施例２〜５、及び比較例２で用いたものと同じ。す
なわち、約３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅により検出。）
と、ｒｏｌ遺伝子の存在を検出するためのプライマー
（約１．１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅により検出）を用い
た。
【０１００】［実施例７］実施例２で作成したベクタ
ー、ｐＮＰＩ１０６を用いて、木本植物である交雑ヤマ
ナラシ（ポプルス・シーボルディ×ポプルス・グランデ
ィデンタータ：Ｐｏｐｕｌｕｓ Ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ×
Ｐｏｐｕｌｕｓ ｇｒａｎｄｉｄｅｎｔａｔａ）への遺
伝子導入を行った。
【０１０１】交雑ヤマナラシＹ６３株（秋田十條化成
（株）内実験林より採取）の無菌フラスコ苗の茎を、節
を含まないように長さ５ｍｍに切断し、これをさらに縦
に二つ割りにして材料として用い、ｐＮＰＩ１０６を導
入したＡ．ツメファシエンスを実施例１のＩＩＩと同様
にして感染させた。感染後、この茎切片を、アセトシリ
ンゴン４０ｍｇ／ｌを添加したホルモンフリー修正ＭＳ
寒天培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、寒天０．８ｗ／
ｖ％）に置床して３日間培養し、次いでカルベニシリン
のみ５００ｍｇ／ｌを添加した同培地に移植して培養を
続けた。なお、ここで用いた修正ＭＳ培地とは、通常の
ＭＳ培地の組成のうち、アンモニア態窒素、及び硝酸態
窒素の濃度を、それぞれ１０ｍＭ、３０ｍＭに変更した
ものである。
【０１０２】約２か月後、この切片から生じた不定芽を
分離し、さらに２か月間培養を行うことにより多芽体６
系統が得られたが、これらについて引き続き継代培養を
行ったところ、約４か月経過後（Ａ．ツメファシエンス
感染より約８か月後）から、この多芽体より伸長する、
正常な形態のシュートが認められ始めた。これらのシュ
ートは、ＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌを添加した２／３倍稀
釈ＭＳジェランガム培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、
ジェランガム０．３ｗ／ｖ％）に移植して培養すること
により、正常な発根個体となすことができ、結局、Ａ．
ツメファシエンス感染１０か月目までには、２系統の多
芽体より、合わせて７個の正常個体を得ることができ
た。
【０１０３】これらについて、実施例５のＩＩＩと同様
にＰＣＲ分析を行ったところ、ｉｐｔ遺伝子はその全て
の個体において検出されず、またＧＵＳ遺伝子に関して
は、このうち２個体においてその存在が検出され、本発
明のベクターが、木本植物においても有効に機能するこ
とが確認された。なお、残りの５個の正常個体について
は、ＧＵＳ遺伝子はその一部分の存在のみしか検出され
なかったが、かかる個体は、ここで用いたベクター、ｐ
ＮＰＩ１０６により導入されたトランスポゾンＡｃが、
ｉｐｔ遺伝子と共にその染色体より脱離する際に、その
近辺にあったＧＵＳ遺伝子をも巻き込み、これを引き千
切るようにして脱離してしまった結果、生じたものであ
ると考えられる。ここで、多芽体から正常なシュートが
分化してきた状態を図２７に示す。
【０１０４】［実施例８］実施例５において、ｐＮＰＩ
１３２により遺伝子を導入された正常個体（多芽体を経
由したもの）に対し、さらに本発明のベクターを用いて
遺伝子導入を行った。
【０１０５】ｐＮＰＩ１３２のＧＵＳ遺伝子のみをＨＰ
Ｔ遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）に置き換
え、これ（ｐＮＰＩ１４０、図２８）を用いて上記正常
個体に対し、実施例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に遺伝子導
入操作を行った。多芽体は、このベクターを導入した
Ａ．ツメファシエンスの感染から４０日後に１０系統を
得ることができ、これを分離し、同組成の培地（カルベ
ニシリン５００ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培
地）に移植してなお培養を続けたところ、２０日後（す
なわち、Ａ．ツメファシエンスの感染から約２か月後）
には、そのうち１系統で、肉眼で見て正常な形態を示す
シュートの分化が認められた。
【０１０６】この分化してきた正常なシュートのうちの
１個について、実施例１のＩＶ−Ｂと同様にＰＣＲ分析
を行った結果を図２９に示す。但しここでは、実施例１
のＩＶ−Ｂで用いたプライマーの他に、ｉｐｔ遺伝子を
含むＲｓに挟まれた領域の染色体ＤＮＡからの脱離を検
出するため、ＮＰＴＩＩ遺伝子とＨＰＴ遺伝子上に結合
すべく設計されたプライマー、及びＨＰＴ遺伝子の存在
を検出するためのプライマーを併せて使用した（それぞ
れ、約４ｋｂ及び約１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅により検
出。）。なお図中、左に示した数値については図６と同
様である。
【０１０７】図２９より明らかなように、このシュート
から抽出した染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析においては、Ｒ
ｓに挟まれた領域と共にｉｐｔ遺伝子が脱離したことを
示す約４ｋｂのＤＮＡ断片、及びＨＰＴ遺伝子の存在を
示す約１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認められる一方、ｉ
ｐｔ遺伝子の存在を示す約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増
幅は認められない。これは、このシュートの染色体ＤＮ
Ａ中に、一旦は導入されたｉｐｔ遺伝子が、その後、Ｒ
ｓに挟まれた領域と共にそこから脱離・消失した一方、
ＨＰＴ遺伝子はそのＤＮＡ中に残留していること、つま
り、先にｐＮＰＩ１３２により目的遺伝子（ＮＰＴＩＩ
遺伝子及びＧＵＳ遺伝子）を導入された個体に対し、そ
の構成のうち目的遺伝子に関する構成のみを変えたベク
ターにより、ｉｐｔ遺伝子という同じ遺伝子をマーカー
として、新たな目的遺伝子（ＨＰＴ遺伝子）が重ねて導
入されたこと、さらには再び同じマーカー遺伝子を用い
て、第３、第４、あるいはそれ以上の目的遺伝子の導入
が可能であることを示すものである。
【０１０８】以上の実施例より明らかなように、ここで
得られた多芽体の系統は、必ずｉｐｔ遺伝子をその染色
体中に有し（図６）、また、この多芽体という、肉眼で
識別可能な顕著な形態異常を示す組織はすべて、ｉｐｔ
遺伝子と共に導入したモデル的な目的遺伝子である、Ｎ
ＰＴＩＩ遺伝子の発現によるカナマイシン耐性を例外な
く示した。これは、かかる形態異常誘導遺伝子が、植物
へ遺伝子導入を行う際のマーカー遺伝子として十分に適
用可能であり、これをマーカー遺伝子とする本発明のベ
クターもまた、植物への遺伝子導入用ベクターとして有
用であることを証明するものである。
【０１０９】また、このｉｐｔ遺伝子をトランスポゾン
Ａｃの内部に組み込んだベクター、ｐＮＰＩ１０６を用
いて植物への遺伝子導入を行うと、遺伝子導入操作を行
った直後の培養当初には多芽体を形成した組織から、目
的遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子及び／またはＧＵＳ遺伝
子）により付与される特性は保持したまま、ｉｐｔ遺伝
子が染色体から消失して多芽体形成能を失ったシュート
等が得られ（表１、図１３、１４、１６）、しかも、か
かるシュート等の形態は肉眼で識別可能であり（図１
５、２７）、これらを選抜・分離して培養することによ
り、正常な形態をした伸長発根個体が得られた。また、
このシュートより得られた組織からさらに再分化した組
織も、すべて多芽体形成能はなく正常な形態を示し、こ
のようなシュート等が均一な細胞からなることを明示し
た。
【０１１０】さらに同様の結果は、脱離能を有するＤＮ
Ａ因子として部位特異的組換え系に由来するものを用い
た場合、形態異常誘導遺伝子としてｒｏｌ遺伝子を用い
た場合にも観察された。すなわち、実施例１〜４、及び
７で用いたベクター中、トランスポゾン、あるいはトラ
ンスポゾンとｉｐｔ遺伝子に関連する構成を、これらの
ものに置き換えたベクターを用いて植物への遺伝子導入
を行った場合（実施例５、６）でも、遺伝子導入操作後
ある時期までは異常な形態を形成した組織から、目的遺
伝子は保持したまま、形態異常誘導遺伝子がその染色体
から消失し、正常な形態を示す組織、そして個体が得ら
れ（図２１〜２３、表２）、しかもこの同じ個体に対
し、目的遺伝子に関する構成のみを変えたベクターによ
り、同じ形態異常誘導遺伝子をマーカーとして、遺伝子
導入操作・培養・肉眼による選抜を繰り返すことによ
り、目的遺伝子を多重に導入することも可能であった
（実施例８、図２９）。
【０１１１】従って、形態異常誘導遺伝子をマーカー遺
伝子とし、これを、脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を
一つにする位置に組込んだ、かかるベクターを用いれ
ば、まず、遺伝子導入操作後の細胞を培養して生じてく
る異常な形態を示す組織を肉眼で選抜し、これを分離し
てさらに培養を続け、次いで生じてくる今度は正常な形
態を示す組織をやはり肉眼で選抜するだけで、目的遺伝
子のみが染色体等に残留してその機能を保持している細
胞のみからなる組織、さらには植物体が得られることと
なる。
【０１１２】しかも脱離能を有するＤＮＡ因子として、
部位特異的組換え系を用いると、かなり高い確率で形態
異常組織から正常個体が得られる。加えて、その脱離も
速やかに起こるため、正常な形態をした組織もまた、よ
り速やかに効率よく検出可能となるのである。
【０１１３】本発明のベクターにおいて、脱離能を有す
るＤＮＡ因子として、トランスポゾンを用いた場合、及
び部位特異的組換え系に由来するものを用いた場合に、
生じた形態異常組織から目的遺伝子を保持した正常個体
が得られる効率を、表３に比較して示す。
【表３】
【０１１４】なお、実施例１〜５においてはいずれの場
合にも、植物ホルモン無添加の条件で、遺伝子導入細胞
を含む組織は増殖し、不定芽を分化し、さらには植物体
を再生したが、これは、マーカー遺伝子として遺伝子導
入細胞の染色体に組込まれた、ｉｐｔ遺伝子の働きによ
るものと考えられる。つまり、これらの遺伝子の発現に
より、その連結されたプロモーターの働きによる多少は
あるものの、植物ホルモンがその細胞内で過剰に生産さ
れるため、その細胞自体が多芽体等の組織を分化するだ
けではなく、これが隣接する組織にもその産生する植物
ホルモンがある程度作用し、結局、培地中に植物ホルモ
ンを人為的に添加したのと同様な状態になったのであ
る。
【０１１５】
【発明の効果】本発明のベクターは、マーカー遺伝子と
して形態異常誘導遺伝子を使用したものである。このた
め、これを用いて植物への遺伝子導入を行った場合、目
的遺伝子導入組織の選抜にあたっては、遺伝子導入操作
後の細胞を通常の培地を用い、通常の培養条件で培養し
て、生じてくる異常な形態をした組織を肉眼により識別
するだけでよく、選抜のため化学物質等を培地中へ添加
する必要がないため、作業が簡略化され、またその選抜
中に植物細胞の活性低下を招くおそれもない。
【０１１６】
【０１１７】また、この形態異常誘導遺伝子としてｉｐ
ｔ遺伝子を用いた場合には、その働きにより、遺伝子導
入細胞を含む組織は増殖し、不定芽等を分化するので、
通常は植物細胞の培養において、その増殖・分化のため
に必須とされる、培地中への植物ホルモン添加も不要と
することができる。
【０１１８】加えて、本発明においては、形態異常誘導
遺伝子を脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする
位置に組み込んで使用する。すると、このマーカー遺伝
子は、植物細胞への遺伝子導入後に一定の確率で、かか
るＤＮＡ因子と共に、これが存在し機能するＤＮＡ上か
ら脱離してその機能を失い、同時に導入されたこれとは
挙動を一つにしない位置に存在する目的遺伝子のみが、
同じＤＮＡ上に発現可能な状態で残留することとなる。
このため、このような構成をとった場合、このベクター
は、導入しようとする目的遺伝子に関する部分を変更す
るのみで、マーカー遺伝子を始めとする他の構成に何ら
の変更をも加えることなく、ある一つの植物体へ遺伝子
の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返して
用いることができる。
【０１１９】しかもこの場合も、マーカー遺伝子である
形態異常誘導遺伝子の機能の消失は、遺伝子導入の際と
同様に、遺伝子導入組織の形態の変化として肉眼で検出
できるので、目的遺伝子のみが染色体等に残留してその
機能を保持している細胞だけからなる組織を、確実・容
易に選抜できることとなる。従って、遺伝子の多重導入
も効率良く行え、また、かかる細胞だけからなる遺伝子
導入個体、すなわちマーカー遺伝子の影響が排除され、
その遺伝子産物がもたらす危惧から完全に解放された個
体も、交配過程を経ることなく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔｉプラスミドの一般的構造、及びＡ．ツメフ
ァシエンスＰＯ２２株Ｔ−ＤＮＡ領域のＰｓｔＩ断片制
限酵素地図を含む概念図である。
【図２】ｐＩＰＴ４作成スキムのうち、ｐＩＰＴ２の作
成までを示す図である。
【図３】ｐＩＰＴ４作成スキムのうち、ｐＩＰＴ２から
ｐＩＰＴ３の作成までを示す図である。
【図４】ｐＩＰＴ４作成スキムのうち、ｐＩＰＴ３から
ｐＩＰＴ４の作成までを示す図である。
【図５】ｐＩＰＴ４の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域の制
限酵素地図である。
【図６】ｐＩＰＴ４を用いて遺伝子導入を行ったタバコ
より生じた、多芽体のＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図７】ｐＮＰＩ１０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１
０２の作成までを示す図である。
【図８】ｐＮＰＩ１０６作成スキムのうち、ｐＩＰＴ４
及びｐＮＰＩ１０２からｐＮＰＩ１０３の作成までを示
す図である。
【図９】ｐＮＰＩ１０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１
０３からｐＮＰＩ１０６の作成までを示す図である。
【図１０】ｐＮＰＩ１０６の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領
域の制限酵素地図である。
【図１１】生物の形態を示す写真であり、実施例２にお
けるＮｏ．２のシュートの１か月培養後の状態を示して
いる。
【図１２】生物の形態を示す写真であり、実施例２にお
けるＮｏ．８のシュートの１か月培養後の状態を示して
いる。
【図１３】実施例２におけるＮｏ．８のシュートのＰＣ
Ｒ分析結果を示す図である。
【図１４】実施例３におけるＮｏ．１３−１、１４−１
のシュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示
す図である。
【図１５】生物の形態を示す写真であり、実施例３にお
いてタバコの多芽体から正常なシュートが分化してきた
状態を示している。
【図１６】実施例４において、実施例２におけるＮｏ．
７のシュートより生じた葉から得られた、正常個体のＰ
ＣＲ分析結果を示す図である。
【図１７】ｐＮＰＩ１３２作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
１２８の作成までを示す図である。
【図１８】ｐＮＰＩ１３２作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
１２８からｐＮＰＩ１２９の作成までを示す図である。
【図１９】ｐＮＰＩ１３２作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
１０１及びｐＮＰＩ１２９からｐＮＰＩ１３２の作成ま
でを示す図である。
【図２０】ｐＮＰＩ１３２の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領
域の制限酵素地図である。
【図２１】実施例５において、系統Ｎｏ．１５〜２１の
シュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す
図のうち、ｉｐｔ遺伝子の存在が検出されるプライマー
を使用して行った結果を示すものである。
【図２２】実施例５において、系統Ｎｏ．１５〜２１の
シュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す
図のうち、ｉｐｔ遺伝子を含むＲｓに挟まれた領域の脱
離が検出されるプライマーを使用して行った結果を示す
ものである。
【図２３】実施例５において、系統Ｎｏ．１５〜２１の
シュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す
図のうち、ＧＵＳ遺伝子の存在が検出されるプライマー
を使用して行った結果を示すものである。
【図２４】実施例５において、多芽体形成能のない系統
より生じた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図２５】ｐＮＰＩ７０２の作成スキムを示す図であ
る。
【図２６】ｐＮＰＩ７０２の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領
域の制限酵素地図である。
【図２７】生物の形態を示す写真であり、実施例７にお
いて交雑ヤマナラシの多芽体から正常なシュートが分化
してきた状態を示している。
【図２８】ｐＮＰＩ１４０の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領
域の制限酵素地図である。
【図２９】実施例８において、遺伝子の多重導入後、多
芽体より分化してきた正常なシュートのＰＣＲ分析結果
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山門 幹子 東京都北区王子５丁目21番１号 日本製 紙株式会社 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平６−261769（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−508993（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502725（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開334383（ＥＰ，Ａ ２) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳ Ａ，Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．14（1989）, ｐ．5131−5135 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１ （1989），ｐ．1157−1164 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 目的遺伝子、マーカー遺伝子として形
    態異常誘導遺伝子、及び脱離能を有するＤＮＡ因子を含
    み、かつ、形態異常誘導遺伝子はこの脱離能を有するＤ
    ＮＡ因子と挙動を一つにする位置に存在し、また目的遺
    伝子は、この脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つ
    にすることがない位置に存在する、植物への遺伝子導入
    用ベクター。
  2. 【請求項２】 形態異常誘導遺伝子が脱離能を有する
    ＤＮＡ因子の内部に存在する、請求項１に記載の植物へ
    の遺伝子導入用ベクター。
  3. 【請求項３】 脱離能を有するＤＮＡ因子がトランス
    ポゾンである、請求項１または２に記載の植物への遺伝
    子導入用ベクター。
  4. 【請求項４】 脱離能を有するＤＮＡ因子が部位特異
    的組換え系に由来するものである、請求項１または２に
    記載の植物への遺伝子導入用ベクター。
  5. 【請求項５】 形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリ
    ウム属細菌の保持する形態異常誘導遺伝子である、請求
    項１、２、３または４に記載の植物への遺伝子導入用ベ
    クター。
  6. 【請求項６】 形態異常誘導遺伝子がサイトカイニン
    合成遺伝子である、請求項１、２、３、４または５に記
    載の植物への遺伝子導入用ベクター。
  7. 【請求項７】 サイトカイニン合成遺伝子がアグロバ
    クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumef
    aciens）のＴ−ＤＮＡ上に存在するｉｐｔ（isopenteny
    ltransferase）遺伝子である、請求項６に記載の植物へ
    の遺伝子導入用ベクター。
  8. 【請求項８】 形態異常誘導遺伝子がｒｏｌ遺伝子群よ
    り選ばれた１以上の遺伝子よりなる、請求項１、２、
    ３、４または５に記載の植物への遺伝子導入用ベクタ
    ー。
  9. 【請求項９】 形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリウ
    ム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）のＴ
    −ＤＮＡ上に存在する遺伝子、ｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ及び
    ｒｏｌＣを含むｒｏｌ遺伝子群よりなる、請求項８に記
    載の植物への遺伝子導入用ベクター。
  10. 【請求項１０】 マーカー遺伝子の影響が排除された遺
    伝子導入植物を作成する方法であって、次の過程
    （Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を経ることを特徴とする方法。 （Ａ）目的遺伝子、マーカー遺伝子として形態異常誘導
    遺伝子、及び脱離能を有するＤＮＡ因子を含み、かつ、
    形態異常誘導遺伝子はこの脱離能を有するＤＮＡ因子と
    挙動を一つにする位置に存在し、また目的遺伝子は、こ
    の脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つにすること
    がない位置に存在する、植物への遺伝子導入用ベクター
    を植物細胞に導入する過程 （Ｂ） このベクターにより遺伝子導入された植物細胞
    を培養し、その培養中に生ずる、植物組織の形態異常を
    検出し、この形態異常を示す組織を選抜する過程 （Ｃ） 前記（Ｂ）で選抜した形態異常を示す組織を培
    養し、その培養中に出現する、正常な形態を有する組織
    を検出して選抜する過程
  11. 【請求項１１】 形態異常誘導遺伝子が脱離能を有する
    ＤＮＡ因子の内部に存在する、請求項１０に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 脱離能を有するＤＮＡ因子がトランス
    ポゾンである、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 脱離能を有するＤＮＡ因子が部位特異
    的組換え系に由来するものである、請求項１０または１
    １に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリ
    ウム属細菌の保持する形態異常誘導遺伝子である、請求
    項１０、１１、１２または１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 形態異常誘導遺伝子がサイトカイニン
    合成遺伝子である、請求項１０、１１、１２、１３また
    は１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 サイトカイニン合成遺伝子がアグロバ
    クテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡ上に存在す
    るｉｐｔ遺伝子である、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 形態異常誘導遺伝子がｒｏｌ遺伝子群
    より選ばれた１以上の遺伝子よりなる、請求項１０、１
    １、１２、１３または１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリ
    ウム・リゾジェネスのＴ−ＤＮＡ上に存在する遺伝子、
    ｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣを含むｒｏｌ遺伝子群
    よりなる、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 同一植物体に２以上の目的遺伝子を導
    入する方法であって、次の過程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）
    を順次繰り返すことを特徴とする方法。 （Ａ）目的遺伝子、マーカー遺伝子として形態異常誘導
    遺伝子、及び脱離能を有するＤＮＡ因子を含み、かつ、
    形態異常誘導遺伝子はこの脱離能を有するＤＮＡ因子と
    挙動を一つにする位置に存在し、また目的遺伝子は、こ
    の脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つにすること
    がない位置に存在する、植物への遺伝子導入用ベクター
    を植物細胞に導入する過程 （Ｂ） このベクターにより遺伝子導入された植物細胞
    を培養し、その培養中に生ずる、植物組織の形態異常を
    検出し、この形態異常を示す組織を選抜する過程 （Ｃ） 前記（Ｂ）で選抜した形態異常を示す組織を培
    養し、その培養中に出現する、正常な形態を有する組織
    を検出して選抜する過程
  20. 【請求項２０】 形態異常誘導遺伝子が脱離能を有する
    ＤＮＡ因子の内部に存在する、請求項１９に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 脱離能を有するＤＮＡ因子がトランス
    ポゾンである、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 脱離能を有するＤＮＡ因子が部位特異
    的組換え系に由来するものである、請求項１９または２
    ０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリ
    ウム属細菌の保持する形態異常誘導遺伝子である、請求
    項１９、２０、２１または２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 形態異常誘導遺伝子がサイトカイニン
    合成遺伝子である、請求項１９、２０、２１、２２また
    は２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 サイトカイニン合成遺伝子がアグロバ
    クテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡ上に存在す
    るｉｐｔ遺伝子である、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 形態異常誘導遺伝子がｒｏｌ遺伝子群
    より選ばれた１以上の遺伝子よりなる、請求項１９、２
    ０、２１、２２または２３に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリ
    ウム・リゾジェネスのＴ−ＤＮＡ上に存在する遺伝子、
    ｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ及びｒｏｌＣを含むｒｏｌ遺伝子群
    よりなる、請求項２６に記載の方法。
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