SK56997A3 - Vector and methods for introducing at least two genes into a plant - Google Patents

Description

Vektor na zavedenie génu do rastliny a spôsoby na produkciu transgénnych rastlín a mnohonásobné zavedenie génov do rastliny pri použití vektora

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nového vektora k zavedeniu požadovaného génu do rastliny pri použití metód genetického inžinierstva k získaniu transgénnej rastliny; spôsobu na produkciu transgénnej rastliny neovplyvnenej markerovým génom pri použití tohto vektora; a spôsobu na zavedenie aspoň dvoch požadovaných génov do rastliny pri použití tohto vektora.

Doterajší stav techniky

Transformácia mikroorganizmov a kultivovaných buniek pri použití genetického inžinierstva je teraz používaná na produkciu fyziologicky aktívnych substancií využiteľných ako lieky a tak významne prispieva v priemysle. V oblasti kríženia rastlín je priemyselná aplikácia genetického inžinierstva pozadu, pretože životný cyklus rastlín je o mnoho dlhší než životný cyklus mikroorganizmov. Napriek tomu, že táto technológia umožňuje zavedenie požadovaného génu priamo do rastliny, ktorá má byť šlachtená, boli nasledujúce výhody porovnávané s klasickým šľachtením, ktoré vyžaduje mnohé kríženie.

A) Je možné zaviesť iba tú charakteristiku, ktorá má byť vylepšená.

B) Je možné zaviesť charakteristiku druhov iných než rastlinných (ako sú mikroorganizmy a podobne).

C) Je možné o mnoho skrátiť periódu šľachtenia.

Preto sú spôsoby genetického inžinierstva na šľachtenie rastlín intenzívne skúmané.

Produkcia transgénnych rastlín vyžaduje nasledujúce tri kroky:

1) Zavedenie požadovaného génu do rastlinnej bunky (vrátane zavedenia požadovaného génu do chromozómov, jadier a podobne) .

2) Vybranie rastlinného tkanivá tvoreného iba bunkami, do ktorých bol zavedený požadovaný gén.

3) Regeneráciu rastliny z vybraného rastlinného tkaniva.

ktorom novej tkaniva, regenerácie

K vybraniu transgénneho tkaniva, do ktorého bol zavedený požadovaný gén je potrebná vizuálna identifikácia je požadovaný gén exprivovaný bez rastliny. K dosiahnutiu tohto je požadovaný gén typicky zavedený do rastlinnej bunky spolu s markerovým génom, ktorého expresia môže byť ľahko detekovaná v štádiu kultivácie buniek. To znamená, že expresia markerového génu je použitá ako znamenie zavedenia požadovaného génu. Príklady bežných markerových génov antibiotickú rezistenciu, ako je gén zahŕňajú gény na rezistencie na fosfotransférasový neomycin hygromycín syntetázové kanamycín (t.j. NPTII; gén), gén rezistencie na (t.j. HPT; hygromycín fosfotransférasový gén), gény aminokyselín, ako je nopalín syntetázový gén (NOS), octopín syntetázový gén (OCS) a sulfonylurea - rezistencia gén (t.j., ALS; acetoactate syntetázový gén), ktoré udávajú rezistenciu na poľnohospodárske chemikálie.

Napriek tomu, expresia markerového génu môže spôsobiť vážne problémy, pokial je transgénna rastlina použitá k jedlu. To znamená, že je dosť obtiažne zaistiť, aby génový produkt produkovaný expresiou markerového génu bol bezpečný pre ludské telo. Nasledovne, pokial je transgénna rastlina obsahujúca markerový gén predávaná ako jedlo, musí byť uskutočnený podrobný výskum vplyvu markerového génu na ľudské telo. Napríklad, NPTII gén je používaný ako markerový gén na laboratórnej úrovni od roku 1980. V roku 1994 bol produkt tohto génu konečne akceptovaný ako potravinový doplnok U.S. Fond and Drug Administration (FDA). Od toho času môžu byť transgénne rastliny obsahujúce NPTII gén ako markerový gén používané ako potrava. I tak sa niektorí konzumenti produktov obsahujúcich NPTII gén stále obávajú týchto génových účinkov.

Okrem toho, markerovými génmi, ktoré sú prakticky používané, sú iba tie gény, ako je NPTII gén, ktoré udelujú detoxifikačné vlastnosti substanciám inhibujúcim rast rastlinnej bunky. Preto k vybraniu transgénneho rastlinného tkaniva, do ktorého bol požadovaný gén zavedený, je tkanivo v kultivačnom médiu rast a kultivované inhibuj úcu rezistenciu hodnotená a rezistenciu, substancie viesť rastlinné bunky, tkaniva obsahujúcom substanciu expresiu markerového génu, menovite na substanciu inhibujúcu rast, je použitá ako index. I môže kultivácia za k nežiadúcim keď má tkanivo takúto prítomnosti inhibičnej vedľajším účinkom na ako je zníženie proliferácie rediferenciácie transgénneho tkaniva.

Ďalej, expresia markerového génu v rastlinnej bunke po selekcii transgénneho tkaniva vážne bráni šľachteniu rastliny nasledujúcim zavedením génu. To znamená, že pokial je iný gén zavedený do transgénnej rastliny obsahujúcej markerový gén, potom zavedenie génu musí byť monitorované iným markerovým génom. Predsa len účinnosť markerového génu sa líši podľa druhu rastlín. Preto je vyžadovaný predbežný test na zadanie podmienok ku každému markerovému génu (napríklad, je popísané, že HPT gén je účinnejší než NPTII gén u ryže (K. Shimamoto et al., náture (London), zväzok 338, str. 274, 1989)). Ešte ďalej, pretože varianty markerových génov sú obmedzené, mnohonásobné zavedenie génu nemôže byť donekonečna opakované zmenou markerového génu. To znamená, počet zavedení génu do rastliny je obmedzený škálou markerových génov, ktoré môžu byť použité v tejto rastline. Okrem toho, typ markerového génu, ktorý môže byť použitý, je obmedzený ako bolo uvedené vyššie. V súlade s tým je žiadúce nájsť spôsob na odstránenie markerového génu z chromozómu po selekcii transgénneho rastlinného tkaniva na vylúčenie vplyvu markerového génu na bunku, tkanivo a rastlinu.

K eliminácii vplyvu markerového génu boli popísané dva spôsoby. V jednom spôsobe je markerový gén. a transpozón rastliny zavedený na chromozóm rastliny a nasledovne je z neho odstránený spolu s transpozónom (International LaidOpen č. WO 92/01370) . v druhom spôsobe je miesto transpozónu použitý miestne špecifický rekombinantný systém PI fágu (International Laid-Open č. WO 93/01283) . Pri použití týchto spôsobov je možné získať bunku, v ktorej bol markerový gén odstránený z chromozómu v danom stupni po zavedení génu. Nanešťastie je pravdepodobnosť toho, že markerový gén bude odstránený, veľmi nízka.

Ďalej, rastlinné bunky, z ktorých bol markerový gén odstránený z chromozómu pri použití týchto spôsobov sú rozptýlené medzi bunkami, v ktorých sú markerové gény stále prítomné a exprivované. Tieto dva druhy buniek nemôžu byť odlíšené vizuálne.

Rastlinné bunky obsahujúce markerové gény a požadovaný gén môžu byť selektované na základe ich chemickej rezistencie, nutričných požiadaviek a podobne. Predsa ale, v dobe selekcie, bunky postrádajúce markerové gény vykazujú vážnu inhibiciu rastu a v mnohých prípadoch sú zničené. V súlade s tým nemôže byť selekcia použitá k získaniu buniek postrádajúcich markerové gény.

K získaniu rastlín, ktoré postrádajú markerové gény a ktoré obsahujú požadovaný gén pri použití vyššie uvedených spôsobov je tkanivo rastliny, v ktorej sú zmiešané bunky postrádajúce markerový gén a bunky obsahujúce markerové gény proli ferované, regenerované a potom analyzované k selekcii, pri použití metód ako je Southern hybridizácia alebo polymerázová reťazová reakcia. Táto metóda je založená na predpoklade, že regenerácia jednotlivca je odvodená od jednej bunky a preto by všetky bunky rastliny mali mať rovnaké charakteristiky. Preto jednotlivec odvodený od bunky postrádajúcej markerový gén je tvorený iba takýmito bunkami. Bohužiaľ, bunky vytvárajúce takéto regenerované jednotlivce nemusia byť nevyhnutne uniformné. Bunky postrádajúce chromozóm markerového génu a bunky obsahujúce markerový gén sú koexistujúce a sú dosť nepravidelne distribuované v jednej jednotlivej regenerovanej rastline a jej tkanive. Tak je extrémne ťažké získať jednotlivca tvoreného iba bunkami postrádajúcimi markerový gén v štádiu, kedy je kultivované tkanivo rediferencované k regenerácii jednotlivca.

Okrem toho, známe analytické metódy selekcie využívajú tkanivo, ako je list, ako testovaciu vzorku (nie celé indivíduum alebo jednu bunku). Z toho vyplýva, že akákoľvek celková tendencia je analyzovaná s ohľadom na stav markerového génu v jednom liste.

Okrem toho, v tomto prípade je bežné, že bunky bez markerového génu a bunky obsahujúce markerový gén boli prítomné v rovnakom jednotlivcovi alebo tkanive. Tak, i napriek tomu, že je jedinec vytvorený iba z buniek post rádaj úci ch markerový gén, je obtiažne ho vybrať. I keď prítomnosť markerového génu nie je detekovaná v tomto tkanive, tkanivá alebo iné miesta jedinca môžu obsahovať markerový gén, alebo to iba ukazuje, že prítomnosť markerového génu je pod detekováte Inou hranicou. Preto nie je možné určiť, či nie je testovaná vzorka úplne bez buniek, obsahujúcich markerový gén.

Pri použití vyššie uvedených spôsobov je jednotlivec postrádajúci markerový gén získaný iba zo zárodočnej bunky, ako je pel, vaječná bunka a podobne. Pokiaľ je realizované samoopelenie pri použití vaječnej bunky postrádajúcej markerový gén, potom je získané fert i 1izované vajíčko, ktorému chýba markerový gén vo fixnom pomere danom klasickými zákonmi dedičnosti a z tohto fertilizovaného vajíčka je vytvorený jednotlivec, ktorý má iba bunky s rovnakými charakteristikami ako ferti 1 izované vajíčko. Bežné analytické metódy, ako je Souther hybridizácia, môžu byť realizované pri použití tohto jednotlivca. Menovite, i keď je predkladanou metódou produkovaná bunka, ktorej chýba markerový gén, jednotlivec tvorený iba takýmito bunkami je získaný najskôr rediferenciácou rastliny z kultivovaného tkaniva obsahujúceho takúto bunku, uskutočnením kríženia regenerovanej rastliny a získania Fl potomstva alebo ďalších generácií. Takto získaný jednotlivec môže byť selektovaný ako jednotlivec, ktorému chýba markerový gén.

K odstráneniu markerového génu z transgénnej rastliny popisuje JP-A-6-276872 techniku na zavedenie génu, v ktorej je markerový gén inzertovaný do separátneho plazmidového vektora obsahujúceho požadovaný gén. Plazmid obsahujúci markerový gén je odstránený z bunky po dokončení zavedenia génu (termín JP-A ako je tu použitý znamená japonskú publikovanú patentovú prihlášku). Táto technika však vyžaduje krok kríženia k odstráneniu markerového génu. V tomto ohlade je technika rovnaká ako vyššie uvedené dve správy.

Vyššie uvedené metódy je obtiažne aplikovať na dreviny, vzhladom k ich dlhej rastovej perióde, na sterilné jedince alebo na hybridné jedince, u ktorých je F1 sama hodnotná. Ďalej, pokiaľ sú použité odstrániteľné DNA elementy, ako je transpozón a podobne, potom pomer, v ktorom sú tieto elementy odstránené z chromozomálnej DNA, DNA vírového kde sú tieto elementy prítomné a extrémne nízky.

aby odstránenie týchto génu) mohlo byť lahko najmenej v štádiu kultivovaného tkaniva. Pokiaľ toto nemôže byť detekované pred rediferenciáciou kultivovaného tkaniva a tvorbou ďalších generácií cestou kríženia regenerovaného jednotlivca, potom je táto metóda nepraktická.

vektora a ďalšími, fungujú, je typicky nevyhnutné, markerového s tým, je (menovite detekované

V súlade elementov aktuálne

Podstata vynálezu

V súlade s tým je predmetom vynálezu poskytnutie vektora obsahujúceho gén, ktorý má byť zavedený do rastliny a markerový gén, kde rastlina, ktorá obsahuje tento gén, nemá nežiadúce účinky na ľudské telo, pokiaľ je trávená, i keď je markerový gén exprivovaný.

Iným predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie vektora na zavedenie požadovaného génu do rastliny, kde vektor obsahuje markerový gén, ktorý umožňuje selekciu transgénneho tkaniva bez použitia inhibičných substancií rastu rastlinných buniek, ktoré znižujú aktivitu rastlinných buniek.

Ešte iným predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie vektora na zavedenie požadovaného génu do rastliny, kde vektor obsahuje markerový gén a účinkuje tak, že vylučuje vplyv markerového génu odstránením markerového génu z DNA, kde je markerový gén prítomný a účinkuje. Pri • použití tohto vektora môže byť požadovaný gén opakovane účinne zavedený.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie metódy na produkciu transgénnych rastlín pri použití takého vektora, ktorý vylučuje vplyv markerového génu, bez nutnosti kroku produkce Fl alebo neskorších generácií krížením a metódu k zavádzaniu génu do rastlín pri použití vyššie uvedenej metódy.

Tieto a iné predmety predkladaného vynálezu môžu byť dosiahnuté pri použití vektora, ktorý obsahuje požadovaný • gén a aspoň jeden gén na indukciu morfologickej abnormality (tu označený ako MAI) ako markerový gén.

r

Ďalej, tieto a iné predmety predkladaného vynálezu môžu byť dosiahnuté pri použití vektora, v ktorom je markerový gén odstránený z DNA po svojej expresii. Expresia markerového génu a stratu jeho účinku je možné detekovať morfologickými zmenami tkaniva, do ktorých bol markerový gén zavedený.

Okrem toho, tieto a iné predmety predkladaného vynálezu môžu byť dosiahnuté pri použití vektora, ktorý obsahuje požadovaný gén, aspoň jeden MAI gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element. MAI gén je umiestnený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom. Požadovaný gén je umiestnený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom.

Ešte ďalej,, tieto a iné predmety predkladaného vynálezu môžu byť dosiahnuté pri použití metódy k produkcii transgénnych rastlín bez ovplyvnenia markerovým génom, kde táto metóda obsahuje nasledujúce kroky:

A) zavedenie vektora do rastlinnej bunky, kde uvedený vektor obsahuje požadovaný gén, aspoň jeden MAI gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, kde uvedený MAI gén je umiestený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a kde požadovaný gén je umiestený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom,

B) kultiváciu rastlinnej bunky získanej v A) , detekciu morfologicky abnormálneho rastlinného tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selekcii uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva, a

C) kultiváciu uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva selektovaného v B) , detekciu morfologicky normálneho tkaniva, ktorá sa objaví v priebehu kultivácie a selekcii uvedeného morfologicky normálneho tkaniva.

Ešte ďalej, tieto a iné predmety predkladaného vynálezu môžu byť dosiahnuté pri použití metódy k zavedeniu aspoň dvoch požadovaných génov do rastliny, kde táto metóda obsahuje realizáciu nasledujúcich krokov aspoň dvakrát:

A) zavedenie vektora do rastlinnej bunky, kde uvedený vektor obsahuje požadovaný gén, aspoň jeden MAI gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, kde uvedený MAI gén je umiestnený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a kde požadovaný gén je umiestnený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom.

B) kultiváciu rastlinnej bunky získanej v A), detekciu morfologicky abnormálneho rastlinného tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selekciu uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva, a

C) kultiváciu uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva se 1ektovaného v B), detekciu morfologicky normálneho tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selekcii uvedeného morfologicky normálneho tkaniva.

Okrem toho, tieto a iné predmety predkladaného vynálezu môžu byť dosiahnuté pri použití rastliny regenerovanej kultiváciou vyššie uvedeného morfologicky normálneho tkaniva.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obrázok 1 je diagram Ti plazmidu a mapa reštrikčných

endonukleáz kmeňa P022 .		Pst I	fragmentu na T-DNA	regióne	A. tumefaciens
Obrázok	2	je	diagram	konštrukcie	pIPT2.	1
Obrázok	3	je	diagram	konštrukcie	pIPT3 z	pIPT2.
Obrázok	4	je	diagram	konštrukcie	pIPT4 z	pIPT3.

Obrázok 5 je mapa reštrikčných endonukleáz T-DNA regiónu v štruktúre pIPT4.

Obrázok 6 sú výsledky PCR analýz extrémnych fenotypov výhonkov tabaku, do ktorých bol zavedený gén pri použití piPT4 .

Obrázok 7 je diagram konštrukcie pNPI102.

Obrázok 8 je diagram konštrukcie pNPI103 z pIPT4 a PNPI1O2.

Obrázok 9 je diagram konštrukcie ρΝΡΙΙΟβ z pNPIlO3.

Obrázok 10 je mapa reštrikčných endonukleáz T-DNA regiónu v štruktúre ρΝΡΙΙΟβ.

Obrázok 11 je fotografia výhonku č. 2 po jednom mesiaci kultivácie v príklade 2.

Obrázok 12 je fotografia výhonku č. 8 po jednom mesiaci kultivácie v príklade 2.

Obrázok 13 ukazuje výsledky PCR analýzy výhonku č. 8 v príklade 2.

Obrázok 14 ukazuje výsledky PCR analýzy normálnych jedincov získaných z výhonkov č. 13-1 a 14-1 v príklade

3. · t

Obrázok 15 je fotografia normálnych výhonkov diferencovaných z extrémneho fenotypu tabaku v príklade .

Obrázok 16 ukazuje výsledky PCR analýzy normálnych jedincov, ktoré boli získané z listu tvoreného z výhonku č. 7 v príkladu 2.

Obrázok	17	je	diagram	konš trukcie	pNPI128.
Obrá zok	18	je	diagram	konštrukcie	PNPI129 z pNPI128.
Obrázok	19	je	diagram	konštrukcie	pNPI132 z pNPHOl a

pNPI129 .

Obrázok 20 je mapa reštrikčných endonukleáz T-DNA regiónu v štruktúre pNPI132.

Obrázok 21 ukazuje výsledky PCR analýzy normálnych jedincov získaných z výhonkov č. 15 až 21 v príklade 5 pri použití primérov, v ktorých bola detekovaná existencia ipt génu .

Obrázok 22 ukazuje výsledky PCR analýzy normálnych jedincov získaných z výhonkov č. 15 až 21 v príklade 5 pri použití primérov, v ktorých bola detekovaná eliminácia regiónu udržiavaného spojením Rs obsahujúceho ipt gén.

Obrázok 23 ukazuje výsledky PCR analýzy normálnych jedincov získaných z výhonkov č. 15 až 21 v príklade 5 pri použití primérov, v ktorých bola detekovaná existencia GUS

I génu.

Obrázok 24 ukazuje výsledky PCR analýzy normálnych jedincov získaných z línie, ktorá nemohla tvoriť extrémny fenotyp výhonkov v príkladu 5.

Obrázok 25 je diagram konštrukcie pNPI7O2.

Obrázok 26 je mapa reštrikčných endonukleáz T-DNA regiónu v štruktúre pNPI7O2.

Obrázok 27 diferencovaných z extrémneho osiky v príkladu 7.

je fotografia normálnych výhonkov fenotypu výhonkov hybridnej

Obrázok 28 je mapa reštrikčných endonukleáz regiónu v štruktúre pNPI14O.

T-DNA

Obrázok 29 ukazuje výsledky PCR analýzy normálneho výhonku diferencovaného z výhonku s extrémnym fenotypom po mnohom zavedení génu v príklade 8.

Ako je tu použité, MAI gén je gén, ktorý indukuje v rastlinnom tkanive morfologické abnormality ako je zakrslosť, deštrukcia apikálnej dominancie, zmena pigmentácie, tvorba vrúbkovaných hálok, tvorba plstnatých koreňov, vlnenie listu a podobne. S ohladom na preferovaný MAI gén, tieto gény izolované z rodu Agrobacterium alebo podobného, ktorý indukuje tumor alebo teratom (napr. tvorí vedlajšie výhonky alebo vedľajšie korene) u rôznych rastlín môžu byť použité. Príklady týchto rôznych génov zahŕňajú gény na syntéziu cytokinínu (napr.

(izopentenyltransferasa) gén (A.C. Smigocki, L. D Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zväzok 85, str 5131, ip t Owens, 1988)), iaaM (tryptofan monooxygená z a) gén (H. J. Klee et al., GENES and DEVELOPMENT, zväzok 1,, 'Str. 8 6, 1987), gén 5 (H.

Kôrber et al., EMBO Journal, zväzok 10, str. 3983, 1991), gén 6b (P. J. J. Hoyaas et al., Plánt. Mol. Biol., zväzok 11, str. 791 , 1988) a rot gény ako je rolA, rolB, rolC a rolD (F. F. White et al., J. Bacteriol . , zväzok 164, str. 33, 1985). Okrem toho, ich príklady zahŕňajú iaaL (kyselina indoloctová-lyzin syntetáza) gén v Pseudomonas subsp. savastanoi (A. Spena et al., Mol. Gen syringae Genet., zväzok 227 , str. 205, 1991), homeo box gény a phytochrom gény v rôznych rastlinách. Preferovane sú použité ipt gén alebo aspoň jeden gén vybraný z rol génov (lepšie, rol génov obsahujúcich gény rolA, rolB a rolC) . Ipt gén je prítomný v T-DNA Agrobacterium tumefaciens a indukuje deštrukciu apikálnej dominancie. Rol gény obsahujúce gény rolA, rolB a rolC sú prítomné v T-DNA Agrobacterium rhizogenes a aspoň jeden z nich indukuje tvorbu vlasatých koreňov, zakrslosti, krútenia listov a podobne u rastlín regenerovaných z vlasových korienkov.

Pri použití techník podía predkladaného vynálezu je možné neprojektovať kombináciu týchto markerových génov tak, že sú rediferencované špecifické štruktúry, ako sú vedľajšie výhonky alebo vedľajšie korene a podobne, v špecifickej rastline, do ktorej bol markerový gén zavedený. V predkladanom vynáleze môže byť takáto kombinácia MAI génu použitá, v súlade s podmienkami produkcie transgénnych rastlín, ako je druh rastliny, do ktorej sú gény zavedené.

Morfologicky abnormálne tkanivo produkované zavedením MAI génu do bunky je tvorené iba bunkami obsahujúcimi tento gén. Preto, pri použití tohto génu ako markerového génu je konštruovaný vektor spolu s požadovaným génom. Pokial je vektor zavedený do rastlinnej bunky a transgénna rastlina je kultivovaná, potom môže byť tkanivo tvorené iba týmito bunkami, do ktorých bol zavedený markerový gén a požadovaný gén, selektované vizuálnou selekciou morfologicky abnormálneho tkaniva tvoreného týmito bunkami.

Vhodné vektory poúžitelné podlá predkladaného vynálezu majú DNA sekvenciu, ktorá zavádza cudzorodý gén do hostiteľskej bunky a ktorá exprivuje cudzorodý gén v hostiteľskej bunke.

Pokial je gén zavedený pri použití vektora podlá predkladaného vynálezu, potom rastlinné tkanivo vytvorené iba transformovanými bunkami môže byť vizuálne selektované iba kultivovaním bunky po operácii zavedenia génu v bežnom kultivačnom médiu, ako je MS (Murashige - Skoog) kultivačné médium pri riadnych kultivačných podmienok. Pretože tu neexistuje potreba použitia špeciálnych substancií ku selekcii transformovaného tkaniva, ako substancie rastu rastlinných buniek, je nielen zjednodušená, ale tiež nie rastlinnej bunky takouto substanciou má zdedený MAI gén, alebo je MAI gén spontánne zavedený do rastliny prostredníctvom infekcie baktérií a podobne. V súlade s tým, rastlina získaná pri použití vektora podľa predkladaného vynálezu sa nelíši od prirodzene sa vyskytujúcich rastlín, ktoré majú tieto morfologické abnormality.

sú inhibičné táto procedúra je znížená aktivita Okrem toho, rastlina

Vhodné vektory podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú vektor, v ktorom je uvedený MAI gén umiestnený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a kde požadovaný gén je umiestnený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom.

Jak je tu použité, odstrániteľný DNA element je element DNA sekvencie, ktorý je sám o sebe odstrániteľný z DNA, kde je DNA element prítomný a kde pôsobí. U rastlín je transpozón prítomný v chromozóme známy ako tento element. Štruktúra, aktivita a chovanie transpozónu boli už takmer úplne identifikované. Pre funkciu transpozónu sú nevyhnutné v zásade dve zložky: (1) enzým, ktorý je exprivovaný génom tu prítomným a ktorý katalyzuje excisiu a transpozíciu (transposasa) a (2) DNA väzobné prítomné v terminálnom regióne s amotného ktoré sú transpozónu sekvencie, transpozónu a pod ktorými je transpozón účinný. Týmito elementárni je transpozón excidovaný z chromozómu, v ktorom existuje a potom je obyčajne prenesený do novej pozície v DNA. Napriek tomu, v istej miere, transpozóny tiež miznú bez toho, že by boli niekam prenesené. Predkladaný vynález poskytuje použitie takýchto transpozičných chýb transpozónu.

Transpozón môže byť jedným z dvoch typov, buď autonómny transpozón, alebo neautonómny transpozón. Autonómny transpozón si udržiava dva elementy, transposasu a DNA väzobnú sekvenciu. V autonómnom transpozóne je transpozasa exprivovaná a viaže sa pri svojom účinku na DNA väzobnú sekvenciu, kde je transpozón autonómne excidovaný z chromozómu. Neautonómny transpozón si uchováva terminálnu DNA väzobnú sekvenciu, na ktorú sa pri svojom účinku viaže transpozasa. V neautonómnom transpozóne podlieha gén na transposasu mutácii, preto transpozasa nie je exprivovaná; preto nemôže byť transpozón excidovaný z chromozómu autonómne. Predsa len, pokiaľ je transpozasa dodaná k neautonómnemu transpozónu od autonómneho transpozónu, alebo od nezávislého génu pre transposasu, potom sa neautonómny transpozón chová podobne ako autonómny transpozón.

Príklady autonómnych transpozónov zahŕňajú Ac a Spm izolované z kukurice (A. Gieri a H. Saedler, Plánt. Mol. Biol., zväzok 19, str. 39, 1992). Ac môže byť získaný trávením wx-m7 génového lokusu v chromozóme kukurice reštrikčnou endonukleázou Sau3A (U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet., zväzok 194, str. 346, 1984). Tento autonómny transpozón je najčastejšie analyzovaný zo všetkých rastlinných transpozónov. DNA sekvencia bola už určená (M. Muller-Neumann et al., Mol. Gen. Genet., zväzok 198, str. 19, 1984 ) .

Príklady neautonómnych transpozónov zahŕňajú Ds a dSpm získané delením vnútorných regiónov Ac a Spm, v príslušnom

Starlinger, Ann. Rev. Genet., a tie, ktoré sú izolované z je kukurica, ako je pupenec, inagaki et al., Pokial sú tieto poradí (H.-P. Doring a P. zväzok 20, str. 175, 1986) mnohých rastlín, iných než papuľka väčšia a podobne (napríklad, Y.

Plánt Celí, zväzok 6, str. 375, 1994) .

transpozóny zavedené do chromozómu exogénnych rastlín, potom sú tieto transpozóny tiež excidované z chromozómu a transponované pri vykázaní aktivity (napríklad, B. Baker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zväzok 83, str. 4 84 4 , 1986) .

V predkladanom vynáleze môžu byť použité ako autonómne transpozóny, tak neautonómne transpozóny. Neautonómne transpozóny môžu byť použité po inzercii do funkčného génu pre transposasu.

Iným odstrániteľným DNA elementom, ktorý nie je prítomný v rastlinách, ale ktorý môže predkladaného vynálezu, je element Špecifického rekombinantného systému byť použitý podľa odvodený od miestne

Miestne špecifický rekombinantný systém sa skladá z dvoch elementov, (1) rekombinantného odstrániteľnému miesta (korešpondujúceho

DNA elementu podľa predkladaného vynálezu), ktoré má charakteristickú DNA sekvenciu, a (2) enzýmu, ktorý sa špecificky viaže na DNA sekvenciu a katalyzuje rekombináciu medzi DNA· sekvenciami, pokial. existujú dve alebo viac sekvencií (rekombinasa). Pokial sú dve DNA orientované v rovnakom smere v danom intervale na rovnakej molekule DNA, potom je región vymedzený týmito dvomi molekulami excidovaný z molekuly DNA, ako je plazmid, chromozóm a podobne. Pokiaľ sú dve molekuly DNA orientované v opačných smeroch na rovnakej molekule DNA, potom je región vymedzený týmito dvomi molekulami invertovaný.

Predkladaný vynález preferovane používa skoršie excízie. Ako excízie, tak inverzie vo vnútri rekombinantného miesta sa vyskytujú ako výsledok homolognej rekombinácie vďaka miestne špecifickému rekombinačnému systému, ktorý je odlišný od mechanizmu využívaného pre transpozóny. Je známe, že gén na rekombinázu nemusí byť nutne prítomný v rovnakej DNA molekule, v ktorej je umiestené rekombinačné miesto. Gén na rekombinázu iba musí byť prítomný v rovnakej bunke a musí byť exprivovaný na excidovanie alebo invertovanie regiónu vymedzeného dvomi DNA sekvenciami (N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., zväzok 22, str. 77 , 198 8) .

Teraz boli identifikované miestne špecifické rekombinačné systémy v mikroorganizmoch ako sú fágy, baktérie (ako napríklad E. coli), kvasinky a podobne. Ich príklady zahŕňajú Cre/lox systém, pSRl systém, FLP systém, car systém a fim systém (napríklad N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., zväzok 22, str. 17 , 1988) . Pokial je miestne špecifický rekombinačný systém separovaný z týchto mikroorganismov pri použití Cre/lox systému odvodeného od PI fágu (WO 93/01283) zavedený do organizmu (vrátane rastlín) odlišných od organizmov, z ktorých bol systém odvodený, potom sa chová rovnakým spôsobom ako v pôvodnom organizme. Miestne špecifický rekombinačný systém kvasinky (Zygosacchromyces rouxii) (pSRl systém (H. Matsuzaki et al., J. Bacteríology, zväzok 172, str. 610, 1990)) môže byť tiež použitý podlá predkladaného vynálezu. Tento pSRl systém si tiež udržiava svoju zdedenú funkciu vo vyšších rastlinách (H. Onouchi et al., Nucleic Acid Res., zväzok 19, str. 6373, 1991) .

V predkladanom vynáleze môžu byť gény na indukciu morfologických abnormalít (MAI) inzertované do miesta, kde je gén excidovaný spolu s odstrániteľným DNA elementom. Napríklad, pokiaľ je použitý ako odstrániteľný DNA element transpozón, potom môže byť MAI gén inzertovaný do pozície, ktorá neovplyvňuje excisiu transpozónu a ktorá je upstream od promotorového regiónu génu pro transposasu, ale ktorá je downstream od terminálneho regiónu, na ktorý sa transpozasa viaže. Pokiaľ je použitý pSRl systém, potom môže byť MAI gén inzertovaný do akejkoľvek pozície vo vnútri regiónu vymedzeného charakteristickými DNA sekvenciami, ktoré neinhibujú expresiu rekombinázy.

V predkladanom vynáleze je MAI gén preferovane prítomný vo vnútri odstrániteľného DNA elementu. Na druhú stranu, umiestnenie požadovaného génu nie je presnejšie obmedzené; predsa len je preferované, aby bol požadovaný gén mimo odstrániteľný DNA element.

Pri použití vektora takejto štruktúry po zavedení požadovaného génu môže byť MAI gén odstránený v určitej frekvenci, spolu s odstrániteľným DNA elementom, z DNA, do ktorej je zavedený a v ktorej účinkuje. Požadovaný gén, ktorý sa nechová integrálne s markerovým génom, zostáva v rovnakej DNA. Vektor môže byť použitý na mnohonásobné zavedenie požadovaného génu do určité rastliny. Okrem toho, pretože strata funkcie tohto MAI génu môže byť vizuálne detekovaná ako morfologická zmena transgénneho tkaniva v priebehu kultivácie, môže byť tkanivo tvorené iba bunkami s požadovaným génom, ale bez markerového génu, selektované lahko a bez nutnosti špeciálnych postupov. Z toho vyplýva, že i keď je takáto bunka aktuálne tvorená v nízkom stupni, môže byť takáto bunka dostatočne selektovaná na vytvorenie prakticky použiteľných postupov. Ďalej, nielen že môže byť mnohonásobné zavedenie génu pri použití tohto vektora mnohokrát opakované, ale tiež môže byť opakované pred tým, než je zrelá rastlina regenerovaná. Tak môže byť mnohonásobné zavedenie génu realizované účinne. Na získanie jednotlivej transgénnej rastliny tvorenej iba takýmito bunkami môže byť rastlina regenerovaná z takto vybraného tkaniva bez toho, že by musel prebehnúť krok kríženia. Takto získaná jednotlivá transgénna rastlina je bez akýchkoľvek vedľajších účinkov na ludské telo spôsobených markerovým génom, ktoré boli uvedené vyššie. Okrem toho, použitie tohto vektora nevyžaduje substanciu inhibujúcu rast buniek, ktoré môžu znižovať aktivitu bunky v kroku selekcie transgénneho tkaniva.

Vektor podľa predkladaného vynálezu môže byť použitý v akejkoľvek rastline, do ktorej môže byť gén zavedený metódami genetického inžinierstva. Požadovaný gén podľa predkladaného vynálezu môže byť akýkoľvek gén, ktorým môžu byť vylepšené hlavné poľnohospodárske charakteristiky a akýkoľvek gén, ktorý umožňuje štúdium mechanizmu génovej expresie a podobne, i keď hlavné polnohospodárske charakteristiky nemusia byť nevyhnutne vylepšené.

Na produkciu preteínu, ako je enzým z génu, sú všeobecne vyžadované sekvencie štrukturálneho génu kódujúce informácie o polypeptídu a regulačné sekvencie štrukturálneho génu, ako je promotorová sekvencia (expresná iniciačná sekvencia), terminačná sekvencia (expresná terminačná sekvencia) a podobne. Príklady vhodných promótorových sekvencií, ktoré účinkujú v rastlinách, zahŕňajú 35S promotor víru karfiolovej mozaiky (J. T. Odeli Náture, (London), zväzok 313, str

810, 1985), et a 1 . , promotor nopalin syntetasy (W

R.

Langridge et al.,

Plánt Celí Rep., zväzok 4, str. 355, 1985) a promotor malej podjednotky ribulosa difosfát Fluher et al., Proc.Natl. Acad karboxylaza/oxygenazy (R. Sci. USA, zväzok 83, str.

2358, 1986). Príklady vhodných terminátorových sekvencií zahŕňajú polyadenylačný signál nopalín syntetázy (A. Depicker et al., J. Mol. Appl . Gen., zväzok 1, str. 561, 1982) a polyadenylačný signál octopín syntetázy (J. Gielen et al. , EMBO J., zväzok 3, str. 835, 1984) . V súlade s tým, pokial je to nutné, obsahuje gén na vektore podlá predkladaného vynálezu štrukturálny gén a gén jeho expresnej regulačnej sekvencie. Gén, alebo gény a regulačné sekvencie, môžu byť získané chemickou syntézou alebo klonovaním cDNA alebo genomovej DNA.

Vektor podľa predkladaného vynálezu môže byť nepriamo zavedený do rastlinnej bunky prostredníctvom víru alebo baktérií, ktorými sú rastliny infikované (I. Potrykus, Annu. Rev. Plánt Physiol. Plánt Mol. Biol., zväzok 42, str. 205, 1991). Príklady vhodných vírov zahŕňajú vírus karfiolovej mozaiky, geminivírus, vírus tabakovej mozaiky a vírus bróme mozaiky. Príklady vhodných baktérií zahŕňajú Agrobacterium tumefaciens (tu označované ako A. tumefaciens) a Agrobacterium rhizogenes (tu označované ako A. rhizogenes) . 0 dvojklíčnych rastlinách je všeobecne známe, že sú infikované baktériami rodu Agrobacterium. Zavedenie génu do jednoklíčnych rastlín infikovaním týchto rastlín týmito baktériami bolo tiež popísané (napríklad International Laid-Open č. WO 94/00977).

Vektor podľa predkladaného vynálezu môže byť priamo zavedený do ra.stliny fyzikálnymi a chemickými metódami ,ako sú mikroinjekcie, elektroporacie, polyethylenglykolová metóda, fúzna metóda a vysoko rýchlostná balistická penetrácia (I. Potrykus, Annu. Rev. Plánt Physiol. Plánt Mol. Biol., zväzok 42, str. 205, 1991). Pretože všeobecná nepriama metóda zavedenia génu pri použití rodu Agrobacterium nemôže byť aplikovaná na mnoho jednoklíčnych rastlín a dvojklíčnych rastlín, ktoré sú rezistentné na infekcii Agrobacterium, sú vyššie uvedené metódy priameho zavedenia účinné pro tieto rastliny.

Vektor na použitie podía predkladaného vynálezu nie je jednotlivo obmedzený podlá toho, ako sú požiadavky predkladaného vynálezu uspokojené. Napríklad, vektor nepriamo zavedený do rastlinnej bunky, byť vektorom Ti vektor alebo vírový vektor pokial je potom môže Príklady Ti vektora na použitie podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú Binl9 (M. Bevan et al., Nucleic Acids Res., zväzok 12, str. 8771, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema et al., Plánt Mol. Biol., zväzok 5, str. 85 , 198 5), pGA492 a pGA4 82 (G. An et al . , Plánt physiol., zväzok 81, str. 86, 1986), pL22 (C. Simoens et al., Nucleic Acids Res., zväzok 14, str. 8075, 1986), pAGSlll (P. Van den Elzen et al., Plánt Mol. Biol., zväzok 149, str. 5, 1985), pEND4K (H. J. Klee et al.,

Bio/Technology, zväzok 3, str 637, 1985), pGV831 (R. De

Blaere et al., Nucleic Acids Res., zväzok 13, str.

4777,.1985) a pM0N200 (R. T. Fraley et al., Bio/Technology, zväzok 3, str. 629, 1985). Príklady vírových vektorov na použitie podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú vektor víru karfiolovej mozaiky (N. Brisson et al. , Náture (London), zväzok 310, str. 511, 1984), geminivírový vektor (R. J.

Hayes et al., Náture (London), zväzok 334, str. 179, 1988), vektor bróme mozaikového víru (R. (zväzok 231, str. 1294, 1986), mozaiky (N. Takamatsu et al., EMBO

French et al vektor víru , Science tabakovej zväzok 6, str. 307,

1987) ,a agroinfekčný vektor (N. Grimsley et al., Náture (London), zväzok 325, str. 177, 1987). Predsa len, vektory na použitie podľa predkladaného vynálezu nie sú obmedzené na tieto vektory.

Okrem toho, požadovaný predkladaného vynálezu nie Charakter požadovaného génu gén na použitie podľa je jednotlivo obmedzený, samotného nie je pre predkladaný vynález zásadný. Príklady požadovaného génu na vynálezu zahŕňajú gény k gén na endotoxin Bacillus k rezistencii na herbicídy syntetazu, WO 92/08794)), použitie podľa predkladaného rezistencii na choroby (napr. thuringiensi s, WO 92/20802)), (mutantný gén na acetolaktát semenný zásobný proteín (napr. gén na glutelín, WO 93/18643)), syntézu mastných kyselín (napr. gén na acyl-ACP thioesterazu, WO 92/20236)), hydrolýzu bunečnej steny (napr. gén na polygalakturonázu (D. Grierson et al., Nucl. Acids Res., zväzok 14, str. 8595, 1986)), anthocyaninu (napr. gén na chalcon syntetázu (H.

al., Mol. Gen. Genet., zväzok 199, str. 208, 1985)), biosyntézu ethylénu (napr. ACC oxidazový gén (A. Slater et al., Plánt. Mol. Biol., zväzok 5, str. 137, 1985)), aktívny kyslík vychytávajúci systém (napr. reduktázu (S. Greer and R. N. Perham, biosyntézu J . Re i f et gén na glutathion Biochemistry, zväzok

25, str. 2736, 1986) ) biosyntézu lignínu (napr. gén na fenylalaninamonium-lyázu, gén na cinnamyl alkohol dehydrogenázu, gén na o-methyltransferázu, gén na cinnamate

4-hydroxylázu, gén na 4-kumarát-CoA ligázu, gén na cinnamoyl CoA reduktázu (A. M. Boudet et al . , New Phytol., zväzok 129, str. 203, 1995)). Predsa však, požadované gény k použitiu podľa predkladaného vynálezu nie sú obmedzené na tieto gény.

Okrem toho, hostiteľská rastlina k použitiu podľa predkladaného vynálezu nie je jednotlivo obmedzená. Príklady ' rastlín použiteľných ako , hostiteľská rastlina zahŕňajú tabak (Tobacum), rajčinu (Lycopers icom) , batáty (Impoea), zemiak (Solanum), mrkvu (Dacus), hlávkový šalát (Lactuca), karfiol (Brassica), kapustu (Brassica), pyštek (Brassica), slnečnicu (Helianthus), cukrovú repu (Beta), asparágus (Asparágus), banán (Musa), bavlnu (Gossypium), arabidopsis (Arabidopsis), lucernu (Medicago), hrach (Pisum), sojové bôby (Glycine), ryžu (Oryta), kukuricu (Zea) a raž (Secale) . Príklady drevnatých rastlín použitých ako hostiteľská rastlina zahŕňajú topoľ (Populus), eukalyptus (Eucalyptus), akáciu (Acacia), hrušku (Pyrus), jabloň (Malus), vinnú révu (Vitis), orech (Juglans), slivku (Prunus) , ružu (Rosa) a smrek (Picea) . Predsa len, hostiteľské rastliny k použitiu podľa predkladaného vynálezu niesú obmedzené na uvedené rastliny.

V predkladanom vynáleze je MAI gén exprivovaný tak, aby tvoril v bunkách fyziologické abnormality. Fyziologické abnormality obsahujú produkciu rastlinného rastového hormónu v rastlinných bunkách, ktorý vedie k proliferácii a diferenciácii buniek obsahujúcich MAI gén a v nich sú indukované rôzne morfologické abnormality. Napríklad, súbor onemocnení výhonkov s porušenou apikálnej dominancie (fenotyp extrémnych výhonkov, ESP), vlasaté korene a podobne, môže byť odvodený od bunky, do ktorej bol zavedený takýto gén ako je MAI gén. Tento fenotyp je tvorený abnormálnou proliferáciou a diferenciáciou vyššie uvedených buniek. Tak je morfologicky abnormálne tkanivo vytvorené iba z buniek, ktoré obsahujú tento gén. V súlade s tým, pokial je konštruovaný vektor pri použití tohto génu ako markerového génu spolu s požadovaným génom a je zavedený do rastlinnej bunky a bunka je kultivovaná, potom môže byť tkanivo tvorené iba bunkami, do ktorých bol zavedený markerový gén a požadovaný gén selektovaný iba vizuálnou selekciou morfologicky abnormálneho tkaniva tvoreného rastlinnou bunkou. Tak je .možné vizuálne selektovať transgénne tkanivo bez realizácie akýchkoľvek špeciálnych postupov, ako je pridanie substancie inhibujúcej rast rastlinných buniek a podobných substancií do kultivačného média.

Zatiaľ čo bežné markerové gény, ako je NPTII gén, nie sú zavádzané do rastlín bez spracovania genetickým inžinierstvom, je MAI gén pódia predkladaného vynálezu génom, ktorý rastliny dedične obsahujú, alebo ktorý je prirodzene zavedený do rastlín infekciou baktérií a podobne. Z tohto dôvodu je považovaná bezpečnosť tohto génového produktu pre ludské telo za dosť vysokú.

Ďalej, v predkladanom vynáleze je MAI gén inzertovaný do pozície, kde sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom. Potom, čo je vektor majúci takúto štruktúru zavedený do rastliny, je MAI gén použitý ako markerový gén odstránený z DNA spolu s odstrániteľným DNA elementom v danej frekvencii, čo vedie ku strate jeho funkcie. Oproti gén, ktorý sa nechová integrálne s zostáva v rovnakej DNA a Tak expresia rovnakého tomu požadovaný odstrániteľným DNA elementom uchováva si svoju funkciu, markerového génu môže byť použitá ako index k zavedeniu požadovaného génu opäť a opäť. V súlade s tým, tento vektor spôsobuje mnohonásobné zavedenie génu do určitej rastliny ľahkou zmenou štruktúry týkajúcej sa požadovaného génu, ktorý má byť zavedený bez nutnosti akejkoľvek zmeny v štruktúre markerového génu alebo iných štruktúr. Z tohto dôvodu môže byť vektor opakovane použitý po neobmedzenú dobu.

Pretože strata funkcie markerového génu, t.j. strata funkcie MAI génu, môže byť vizuálne detekovaná, môže byť tkanivo tvorené bunkami markerového génu a obsahujúce požadovaný gén získaný ľahko a isto. To znamená, kultivácie, vizuálne selekcie a separácie môžu byť opakované bez potreby akýchkolvek špeciálnych postupov k získaniu takéhoto tkaniva. Ďalej, rastliny tvorené iba vyššie uvedenými bunkami môžu byť získané iba regeneráciou rastliny zo získaného tkaniva, bez nutnosti realizácie kroku kríženia. Ešte ďalej, i keď je obtiažne úplne odstrániť transpozón z DNA, pretože tento element má vysokú transposabilitu, môže byť vynález dostatočný na praktické použitie, pretože selekcia je vysoko účinná.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález bude teraz ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré neslúžia ako obmedzenie rozsahu vynálezu.

V nasledujúcich príkladoch boli pokusy uskutočnené podľa inštrukcií v Molecular Cloning, 2. vydaní (Sambrook et al, vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) alebo podľa návodu výrobcu, pokiaľ nie je inak uvedené.

Príklad 1

I. Konštrukcia vektora

Ipt gén prítomný v T-DNA patogénneho kmeňa A. tumefaciens P022 (H. Wabiko, Chemical Regulation of Plants, zväzok 24, str. 35, 1989 (viď obrázok 1)) bol nastrihaný reštrikčnou endonukleázou PstI a bol získaný plazmid pIPTl ligáciou ipt génu do PstI miesta na reštrikčnú endonukleázu plazmidu pUC7 (Molecular Cloning, 2. vydanie, zväzok 1, 4.10). Z tohto plazmidu bol ipt gén obsahujúci natívny promotor a , natívny polyadenylačný signál vystrihnutý reštrikčnými endonukleázami BamHI a PstI a bol získaný plazmid pIPT2 ligáciou ipt génu do BamHI-Pstl miesta na reštrikčnú endonukleázu plazmidu pUC119 (získaný od Takara Shuzo Co . , Ltd.). Z tohto plazmidu bol štrukturálny gén a natívny polyadenylačný signál ipt génu vystrihnuté reštrikčnou endonukleázou Rsal a bol získaný plazmid pIPT3 ligáciou ipt génu do Smal miesta na reštrikčnú endonukleázu plazmidu pUC119. Ďalej, ipt gén inzertovaný do pIPT3 bol vystrihnutý reštrikčnými endonukleázami BamHI a Sací a bol získaný plazmid pIPT4 ligáciou fragmentu do BamHI-SacI miesta na reštrikčnú endonukleázu plazmidového vektora p B112 1 (získaný od Clontech Co.), ktorý je použiteľný k zavedeniu génu do rastliny. Pokial je rastlina infikovaná A. tumefaciens nesúci plazmid pIPT4, potom sa T-DNA región, ktorý existuje medzi LB miestom a RB miestom, tu región o približne 5kb majúci NPTII gén a ipt gén, stane integrovaným do chromozómu rastliny.

Tento plazmid bol zavedený do kmeňa JM109 E. coli (Escherichia coli) a bol uložený podlá Budapeštianskej zmluvy ako E. coli JM109 (pIPT4) pod prírastkovým číslom FERM BP-5063.

Stratégia konštrukcie plazmidu pIPT4 je schematicky znázornená na obrázkoch 2 až 4. Mapa reštrikčných endonukleáz jeho T-DNA regiónu je ukázaná na obrázku 5. Na obrázkoch 2 až 4 a 5 ukazujú zakrúžkované P a T natívny promotor a natívny polyadenylačný signál ipt génu samotného, v príslušnom poradí. 35S-P ukazuje 35S promotor víru karfiolovej mozaiky a Nos-P ukazuje promotor génu na nopalin syntetázu. T (obrázok 4) alebo Nos-T (obrázok 5) ukazuje polyadenylačný signál génu na nopalin syntetázu.

V tomto príklade, ako je ukázané na obrázku 5, pre MAI gén ako markerový gén, bol použitý ipt gén, ktorý udeľuje tvorbu ESP indukcou deštrukcie apikálnej dominancie a NPTII gén bol použitý ako modelový požadovaný gén. Ipt gén je členom onkogénov, ktoré obsahujú patogény A. tumefaciens. U rastlinnej bunky, do ktorej je zavedený ipt gén, sa vyvíja diferenciácia, ktorá vedie k tvorbe ESP vďaka nadprodukcii cytokinínu, ktorý je rastlinným hormónom.

V tomto príklade bol použitý 35S promotor víru karfiolovej mozaiky na promotorovú sekvenciu ipt génu a natívny po1yadeny1 ačný signál ipt génu samotného bol použitý k terminačnej sekvencii.

II. Zavedenie pIPT4 do Agrobacterium

A.tumefaciens kmeň LBA4404 (získaný od Clontech Co.) bol inokulovaný do 10 ml YEB kvapalného kultivačného média (obsahuj úceho kvasinkového sacharózy a 2 pH pri 22°C, g/liter extraktu, 1 hovädzieho extraktu, 1 g/liter g/liter peptónu, 5 g/liter mM MgSO₄, pH 7,2 pri 22°C (ďalej je používané pokiaľ nie je inak uvedené)), a bol kultivovaný pri 28°C pokiaľ nebola hodnota 0D₆₃₀ v rozmedzí od 0,4 do 0,6. Potom bola kultúra centri fugovaná pri 6900xg počas 10 minút pri 4°C na odber buniek. Bunky boli suspendované v 20ml lOmM Tris-HCl (pH 8,0) a suspenzia bola centri f ugovaná pri 6900 x g počas 10 minút pri 4° C. Potom boli odobrané bunky resuspendovaná v 200μ1 YEB kvapalného kultivačného média a táto suspenzia bola použitá ako roztok buniek na zavedenie plazmidu.

V 15 mililitrovej trubičke (vyrobenej Falcon) bolo 200 μΐ bunečného roztoku na zavedenie plazmidu zmiešané s 6 μg plazmidu pIPT4 získaného vo vyššie popísanom kroku I a zmes bola ochladená namočením na 5 minút v ethanole, ktorý bol ochladený kvapalným dusíkom na asi 30 až 40 minút. Takto ochladený roztok bol spolu s trubičkou postavený do vodného kúpeľa o 29°C počas 25 minút. Potom bolo k nemu pridaných 750μ1 YEB kvapalného kultivačného média a zmiešaný roztok bol inkubovaný pri 29°C počas 1 hodiny pri trepaní. Tento roztok buniek bol umiestnený na YEB agarové kultivačné médium (obsahujúce 1,2 hmotnosť/objem % agar a rovnaké prísady ako vyššie uvedené kultivačné médium), ku ktorému bolo pridané 50 mg/liter kanamycínu a tento bol kultivovaný pri 28°C počas 2 dní. Takto získané kolónie buniek boli inokulované na YEB kvapalné kultivačné médium a boli ďalej kultivované alkalickou

Potom bol metódou a extrahovaný z buniek štiepený reštrikčnými Takto získané fragmenty plazmid bol endonukleázami PstI, BamHI a EcoRI plazmidu boli analyzované agarozovou gélovou elektro forézou a bolo potvrdené, že plazmid pIPT4 bol zaveden do A. tumefaciens kmeň LBA4404.

III. Zavedenie plPT4 z Agrobacterium do tabaku

Zrelé listy tabaku (Nicotiana tabacum cv. xanthi, ako je tu uvedené znamená tabak tento variant, pokial nie je inak uvedené) kultivované v skleníku boli ponorené do 1% objem/objem vodného roztoku hypochloridu sodného k sterilizácii a boli trikrát premyté sterilnou vodou. Potom bolo stredné rebro listu odstránené na vytvorenie listových diskov s plochou približne 8mm štvorcových. Takto získané listové disky boli ponorené do bunečnej suspenzie A. tumefaciens kmeňa LBA4404, do ktorého bol vo vyššie popísanom kroku II zavedený pITP4 na asi 1 minútu, a boli ním infikované (kde suspenzia bola riedená sterilizovanou vodou na OD₆3o = 0,25 po kultivácii cez noc v YEB kvapalnom kultivačnom médiu) a boli ním infikované. Infikované listové disky boli umiestnené na sterilizovaný filtračný papier k odstráneniu akýchkoľvek extracelulárnych bunečných suspenzií. Potom boli umiestené na MS agarové kultivační médium neobsahujúce hormóny (T. Murashige a F. Skoog, Physiol. Plánt., zväzok 15, str.

že 0,8 % hmotnosť/objem agar obsahujúce 50 mg/liter acetosyringónu tak, že zadná strana listu bola hore a boli kultivované počas 3 dní, pri 25°C pri plnom svetle (kultivácie explantátu, rastlinného tkaniva a rastliny boli vykonané pri tejto teplote a svetelných podmienok, pokiaľ nie je uvedené inak). Takto

473, 1962 (vyrobený tak, bol k nemu pridaný) ) kultivovaný listový disk bol potom transplantovaný do MS agarového kultivačného média neobsahujúceho hormóny, ale obsahujúceho iba 500 mg/liter karbencilínu a kultivácia pokračovala. Nakoniec bolo rediferencovaných 22 vedlajších výhonkov. Tieto vedlajšie výhonky boli separované a ďalej kultivované v kultivačnom médiu majúcom vyššie uvedené zloženie pri získaní 6 ESP línií. Tieto ESP línie boli subkultivované v rovnakom kultivačnom médiu každý mesiac a boli subkultivované v MS agarovom kultivačnom médiu, ktorý neobsahuje hormóny ani karbencilín niekoľkokrát 3 mesiace po infekcii. Po proliferácii nebolo Agrobacterium pozorované a bol uskutočnený test na rezistenciu na kanamycín a PCR analýzy.

IV. Analýzy tabaku, do ktorého bol gén zavedený

A. Test na rezistenciu na kanamycín

ESP línií získaných vo vyššie uvedenom kroku III bolo kultivovaných bez subkultivácie. Listy vytvorené týmito ESP líniami boli vystrihnuté počas tvorby listových diskov o ploche približne 3mm štvorcových. Takto získané listové disky boli umiestené na MS agarové kultivačné médium (k nemu bol pridaný 1 mg/liter benzyl adenínu a 0,2 mg/liter kyseliny a-naftalénoctovej) obsahujúce 200 mg/liter kanamycínu. Po kultivácii v tomto kultivačnom médiu obsahujúcom kanamycín počas 1 mesiaca bola tvorba ESP línií tiež pozorovaná na listových diskoch získaných od týchto ESP linií.

B. PCR analýzy

Chromozornálne DNA boli získané od všetkých 6 ESP línií získaných vo vyššie uvedenom kroku III a gény do nich zavedené boli analyzované PCR metódou.

______ extrahovaná pri nasledujúcim spôsobom modifikovanej CTAB metódy.

Chromo zomálna

DNA bola použití

Najskôr bolo približne rozmelených pri použití suspendovaný v 5 ml pufri vyvinutých z ESP paličky a bol 2% hmotnosť/objem lg listov mažiara a (obsahuj úce

CTAB (hexadecyltrimethylammónium bromid), 1,4 M NaCl, 0,2% objem/objem β-merkaptoethanol, 20 mM EDTA a 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)), ktorý bol zahriaty na 60°C. Táto suspenzia bola zahriata na 60°C od 30 do 60 minút pri miernom trepaní a potom bola ochladená na izbovú teplotu. K tejto suspenzii bola pridaná zmes chloroformu a izoamyl alkoholu v rovnakom objeme a suspenzia bola jemne premiešaná. Potom bola zmes centri fugovaná pri 1600 x g počas 5 minút k získaniu supernatantu. Potom boli pridané 2/3 objemu izopropyl alkoholu k supernatantu a opäť sa všetko jemne premiešalo. Zmes bola umiestnená na lade počas 10 minút k precipitácii chromozomálnej DNA. Táto chromozomálna DNA bola zhromaždená centrifugáciou pri 1600 x g počas 10 minút. Takto získaná chromozomálna DNA bola premytá 70% objem/objem ethanolom, potom sušená vákuom a rozpustená v 300μ1 TE (obsahujúcom 10 mM Tris-HCl a 1 mM EDTA).

Medzitým, na detekciu ipt génu PCR metódou boli použité páry primérov (oligonukletídy) k syntéze pri použití DNA syntezátoru (vyrobeného Applied Biosystems Co.). Pokial boli naviazané na ipt gén, potom bola vzdialenosť medzi dvomi primérmi približne 800 bp. K amplifikácii ipt génu bol lgg extrahovanej chromozomálnej DNA rozpustený v 50μ1 zmiešaného roztoku obsahujúceho 0,2μΜ týchto primérov, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8 pri 25°C) , 50 mM KC1, 1,5 mM MgCL₂, 1% hmotnosť/objem Triton X-100, 0,1 mM dNTP a 1,25 jednotiek

Taq polymerázy (získanej od Cetus CO.) . Potom bola zmes zahriata na 94°C počas 1 minúty a potom boli opakované zahrievacie cykly, konkrétne 94°C počas 1 minúty, 55°C počas 2 minút a 72°C počas 3 minút celkom 30-krát k uskutočnení reakcie. Získaná reakčná zmes bola analyzovaná agarozovou gélovou elektroforézou na detekciu prítomnosti ipt génu v chromozomálnej DNA ampli fikáciou génu s približne 800 bp.

Výsledky sú ukázané na obrázku 6. Ako je zrejmé z obrázku 6, amplifikácia génu s približne 800 bp bola pozorovaná vo všetkých 6 ESP. Na obrázku 6, hodnoty ukázané na ľavej strane ukazujú dĺžku basí, ktoré boli detekované na pridaných prúžkoch (tu označovaných ako prúžky) v e1ektro foréze markeru DNA veľkosti.

Porovnávací príklad 1

Analýza bola uskutočnená s ohľadom na 16 výhonkov, ktoré nemali schopnosť tvorby ESP a boli získané od vedľajších výhonkov rediferencovaných z A. tumefaciens-infikovaných listov v kroku III príkladu 1. To znamená, že v dobe, kedy bolo 22 vedľajších výhonkov kultivovaných a bolo selektovaných 6 ESP línií v kroku III príkladu 1, boli tie, ktoré vykazovali morfologicky normálne výhonky (tu označované ako non-ESP) tiež zbavené A.tumefaciens a podrobené testu rezistencie na kanamycín rovnakým spôsobom, ako v krokoch III a IV príkladu 1. Ďalej, 9 non-ESP línií bolo podrobených PCR analýze. Predsa však, s ohľadom na tieto non-ESP línie, listové disky umiestnené do kultivačného média obsahujúceho kanamycín všetky zhnedli a zvädli po približne 3 mesiacoch. Ďalej, v PCR analýze, amplifikácie DNA fragmentu s približne 800 bp, ktorý určoval prítomnosť ipt génu, nebola detekovaná v žiadnej z analyzovaných deviatich bunečných línií.

Výsledky PCR analýz sú ukázané na obrázku 6.

Príklad 2

I. Konštrukcia vektora

Plazmid pHSG398 (získaný od Takara Shuzo Co . , Ltd.) bol trávený reštrikčnou endonukleázou BamHI. Lepivé konce produkované trávením boli pozmenené na tupo zakončené konce T4 DNA polymerázou I (veľkou podjednotkou) a lígáciou týchto koncov bol získaný plazmid pNPIlOO. To znamená, že plazmid pNPIlOO bol pHSG398 bez BamHI miesta na reštrikčnú endonukleázu. Medzitým, plazmid pCKR97 (T. Izawa et al., Mol. Gen. Genet., zväzok 227 , str. 391, 1991) bol trávený reštrikčnou endonukleázou Pstl. Transpozón Ac kukurice bol vystrihnutý a inzertovaný do Pstl miesta na reštrikčnú endonukleázu pNPIlOO pri získaní plazmidu pNPI102.

Potom z plazmidu pIPT4 skonštruovaného v príklade 1 bol vystrihnutý 35S promotor víru karfiolovej mozaiky a na neho naviazaný ipt gén reštrikčnou endonukleázou HindlII a Sací. Lepivé konce takto získaného fragmentu boli pozmenené na tupo zakončené konce T4 DNA polymerázou I a fragment bol inzertovaný do HincII miesta na reštrikčnú endonukleázu plazmidu pUC119 pri získaní plazmidu pNPIlOl. Z tohto plazmidu pNPIlOl bol znovu vystrihnutý 35S promotor víru karfiolovej mozaiky a ipt gén reštrikčnou endonukleázou Pstl a EcoRI a lepivé konce fragmentu boli pozmenené na tupo zakončené konce T4 DNA polymerázou I . Ďalej plazmid pNPI103 bol získaný ligáciou fragmentu do tupo zakončeného miesta na reštrikčnú endonukleázu BamHI pNPI102. To znamená, že v plazmide pNPI103 existuje 35S promotor a ipt gén na neho naviazaný v starom BamHI mieste na reštrikčnú endonukleázu bez transpozónu Ac.

Požadovaný vektor bol získaný roztrihnutím transpozónu Ac obsahujúceho 35S promotor víru karfiolovej mozaiky a ipt gén z plazmidu pNPIlO3 s reštrikčnou endonukleázou PstI a inzerciou tohto transpozónu Ac do miesta na reštrikčnú endonukleázu Ssel vektorového plazmidu pBI121. Tento bol označený ako plazmid ρΝΡΙΙΟβ.

Tento plazmid bol tiež zavedený do kmeňa JM109 E. coli a bol uskladnený podľa Budapeštianskej zmluvy ako E. coli JM109 (ρΝΡΙΙΟβ) pod prírastkovým číslom FERM BP-5064.

Stratégia pre konštrukciu plazmidu ρΝΡΙΙΟβ je schematicky znázornená na obrázkoch 7 až 9. Mapa reštrikčných endonukleáz jeho T-DNA regiónu je ukázaná na obrázku 10. Na obrázkoch 7 až 9 a 10 je terminálny región transpozónu Ac ukázaný obrátenými čiernymi trojuholníčkami, podľa príslušnosti. Na obrázku 10 je Ac-P natívny promotor prítomný v Ac. Ostatné symboly sú rovnaké ako na obrázkoch 2 až 5.

Ako je jasné z obrázku 10 má tento plazmid ipt gén ako markerový gén a NPTII gén a GUS (β-galaktosidáza) gén ako model požadovaného génu v T-DNA regióne, konkrétne v regióne, ktorý je integrovaný do chromozómu rastliny. Ďalej, ipt gén je prítomný ako inzert v transpozóne Ac. Pretože bunky majúce GUS gén metabolizujú špeciálny substrát za produkcie, modrého pigmentu, môže byť expresia génu identifikovaná detekovaním tohto pigmentu. Tak je GUS gén často používaný na expresiu génu v rastline.

II. Zavedenie ρΝΡΙΙΟβ do ktorého bol gén zavedený.

tabaku a analýza tabaku, do

A. Zavedenie ρΝΡΙΙΟβ do tabaku expresiu zavedeného génu.

testovanie na

Rovnakým spôsobom ako v krokoch II a III príkladu 1 bol ρΝΡΙΙΟβ zavedený do A. tumefaciens kmeňa LBA4404, a listové disky tabaku boli infikované A. tumefaciens. Takto infikované tabakové listy boli inkubované MS agarovým kultivačným médiom bez hormónov, obsahujúcim 50 mg/liter acetosyringónu a potom v MS agarovom kultivačnom médiu bez hormónov, do ktorého bolo pridané .00 mg/liter karbenci 1 ínu. Po dvoch mesiacoch takejto kultivácie bolo separovaných 63 ESP línií.

Tieto ESP línie boli transplantované v kultivačnom médiu kultivačné médium bez karbenci1 ínu) . 0 jeden s rovnakým zložením (MS agarové hormónov obsahujúce 500 mg/liter mesiac neskôr bolo medzi malými výhonkami ESP vizuálne selektovaných 9 výhonkov (tie, ktoré sú generované z ESP sú tu nazývané jednoducho výhonky), ktoré narástli dvakrát alebo viackrát viac v porovnaní s ostatnými výhonkami, u ktorých nebol rast postranných výhonkov pozorovaný a u ktorých sa zdalo byť ovplyvnenie ipt génom znížené. Listy týchto výhonkov boli podrobené rovnakému testu na rezistenciu na kanamycín ako bol realizovaný v kroku IV-A príklade 1 a testu na expresiu GUS génu (test na GUS aktivitu) založený na metóde podía Jefferson et al. Výhonky získané po odstrihnutí listu boli transplantované do MS agarového kultivačného média bez hormónov a boli kultivované. 0 jeden mesiac neskôr bol pozorovaný tvar k zisteniu schopnosti tvoriť ESP výhonky, čo ukazuje na expresiu ipt génu.

Výsledky sú ukázané v tabulke 1.

Tabuľka 1

Výsledky testu na expresiu génu zavedeného do tabaku vektorom ρΝΡΙΙΟβ:

príklad 2

Výhonok č.	Rezistencia na kanamycín	GUS aktivita	Morfológia 1 mesiac po kultivácii
1	+	+	ESP
2	+	+	ESP
3	+	-	ESP
4	+	+	ESP
5	+	-	ESP
6	+	-	ESP
7	+	+	ESP
8	+	+	normálna
9	+	+	ESP

porovnávací príklad 2

Výhonok č.	Rezistencia na kanamycín	GUS aktivita	Morfológia 1 mesiac po kultivácii
10	-	-	normálna
11	-	-	normálna
12	-	-	normálna

Poznámky:

1. Pre rezistenciu na kanamycín, + je rezistentný a - je nerezistentný

2. Pre GUS aktivitu + je aktívny a - je inaktívny

3. normálny znamená jedinec, u ktorého sa vyvíja dominantný rast apikálneho výhonku a tvorba koreňov.

Ako je zrejmé z tabulky 1, i keď má list. výhonku č. 8 rezistenciu na kanamycín a GUS aktivitu, ESP nie je tvorený ani keď je list kultivovaný počas 1 mesiaca. To je pravdepodobne spôsobené tým, že ipt gén, ktorý spôsobuje tvorbu ESP je prítomný v inzertovanej forme v transpozóne Ac v plazmide ρΝΡΙΙΟβ. To znamená, ipt gén, ktorý je zavedený do chromozómu v tabaku infekciou A. tumefaciens obsahujúcom plazmid do tkaniva a je exprivovaný v počiatočnom štádiu kultivácie tkaniva ihneď po infekcii je odstránený spolu s Ac účinkom Ac v priebehu nasledujúcej kultivácie. Pokial sú v rovnakom vektore NPTII gén a GUS gén insertované do pozície, kde sa nechovajú integrálne s Ac, potom zostávajú tieto gény stále v chromozóme rastliny a sú exprivované.

I keď je v tabuľke 1 u výhonkov č. 3, 5 a 6 pozorovaná rezistencia na kanamycín a tvorba ESP, je iba GUS aktivita negatívna. To znamená, že u týchto výhonkov nie je iba GUS gén z génu zavedených pri použití ρΝΡΙΙΟβ exprivovaný. Toto je považované za následok chybnej integrácie, ktorá prebehla v čase, keď boli tieto gény integrované do chromozómu rastliny obsahujúceho plazmid, ktorý mal štruktúru ρΝΡΙΙΟβ alebo podobnú. To znamená, pokial je gén zavedený prostredníctvom A. tumefaciensT-DNA región, menovite celý vnútorný región medzi RB a LB miestom musí byť normálne integrovaný do chromozómu rastliny.

₍ 1

Tento región však nie je niekedy úplne integrovaný, ale je roztrhnutý a je integrovaná deficitná časť postrádajúca určitú časť LB koncov. V T-DNA regióne ρΝΡΙΙΟβ je GUS gén prítomný v najbližšej pozícii k LB miestu. V súlade s tým sa usudzuje, že vďaka chybnej integrácii pri zavedení génu je GUS gén integrovaný do chromozómu v stave, v ktorom je GUS gén roztrhaný na kúsky a jeho funkcia je stratená, alebo že GUS gén nie je plne inzertovaný do svojho miesta, preto GUS gén nie je exprivovaný v týchto výhonkoch a jeho aktivita nie je pozorovaná.

Fotografie výhonkov č. 2 a č. 8 po jednomesačnej kultivácii sú ukázané na obrázkoch 11 a 12.

S ohľadom na rast listu z výhonku č. 8 a na podrobenie sa testu rezistencie na kanamycín pokračovala kultivácia ďalej po teste. Bolo získaných päť vedľajších výhonkov z tohto listu a všetky tieto boli non-ESP.

B. PCR analýzy

Na výhonkoch č. 1 až 9 podľa tabuľky 1, po pozorovaní schopnosti tvoriť ESP, boli realizované PCR analýzy rovnakým spôsobom ako v kroku IV-B príkladu 1 k ďalšiemu vyšetreniu prítomnosti ipt génu v chromozóme, čo bolo uskutočnené tak, že páry priméru, ktoré boli projektované k naviazaniu na NPTII gén a GUS gén v príslušnom poradí boli použité spolu s primérmi použitými v kroku IV-B v príklade

1. V prípade, že tieto priméry boli použité, potom ak je Ac a ipt gén do neho inzertovaný (Ac-ipt génový komplex) excidovaný z T-DNA regiónu ρΝΡΙΙΟδ, je ampli fikovaný DNA fragment s približne 3kb v PCR. V súlade s tým, excisia Acipt génového komplexu z DNA môže byť detekovaná pri použití tejto amplifikácie ako indexu.

Výsledky PCR analýzy výhonku č. 8 sú ukázané na obrázku 13, v ktorom sú hodnoty ukázané na ľavej strane tie isté ako hodnoty na obrázku 6.

Z výsledkov je zrejmé, že v chromozomálnej DNA extrahovanej z výhonku č. 8 je pozorovaná amplifikácia DNA fragmentu s približne 3kb, ktorý označuje excisiu Ac-ipt génového komplexu, zatiaľ čo amplifikácia DNA fragmentu s približne 800bp, ktorý označuje prítomnosť ipt génu pozorovaná nieje. Toto znamená, že ipt gén je excidovaný z chromozomálnej DNA tohto výhonku spolu s Ac a že mizne.

Na druhé strane, s ohľadom na výhonky č. 1 až 7 a 9, amplifikácia DNA fragmentu s približne 3kb nebola detekovaná v žiadnych vzorcoch chromo zornáInej DNA z týchto výhonkov, zatiaľ čo amplifikácia DNA fragmentu s približne 800 bp bola detekovaná vo všetkých vzorcoch chromozomálnej DNA z týchto výhonkov. V súlade s tým sa súdi, že v týchto výhonkoch je ipt gén stále prítomný v chromozomálnej DNA spolu s Ac.

Porovnávací príklad 2

Kultivácia A. tumefaciens infikovaných listov v kroku II-A príkladu 2 boli separované 3 non-ESP rediferencované listy spolu s ESP a boli podrobené testu rezistencie na kanamycín, testu GUS aktivity a vizuálnemu pozorovaniu počas 1 mesiaca kultivácie a PCR analýze rovnakým spôsobom ako v II príkladu 2.

Výsledky sú ukázané v tabuľke 1. Výhonky získané z týchto non-ESP nemali akúkoľvek rezistenciu na kanamycín, GUS aktivitu ani ESP vytvárajúci schopnosť. Okrem toho, amplifikácia DNA fragmentu s približne 800 bp a približne 3kb nebola detekovaná v PCR analýze.

Príklad 3

Ďalej, kultivácia 63 ESP linií separovaných v príklade 2 pokračovala v MS agarovom kultivačnom médiu bez hormónov. Asi o dva mesiace neskôr po separácii bolo z 2 ESP línií získaných celkom sedem výhonkov č. 13 - 1 až 13-3 a 14 - 1 až 14 - 4, čo boli normálne výhonky, ktoré bolo možné identifikovať vizuálne, to znamená, že vykazovali apikálnu dominanciu. Tieto výhonky boli separované k transplantácii do kultivačného média majúceho vyššie uvedené zloženie a potom boli normálne kultivované a zakorenené. Z týchto boli jedinci získaní z výhonkov č. 13 - 1 a 14 - 1 podrobení PCR analýze rovnakým spôsobom ako v kroku II-B príkladu 2. Výsledkom bolo, že amplifikácia DNA fragmentu s približne 800bp nebola pozorovaná ani v jednom z výhonkov č. 13 - 1 a 14 - 1 .

Okrem toho, amplifikácia DNA fragmentu s približne 3kb výhonkoch. Tým bolo z chromozomálnej DNA že nie je prítomný. Výsledky bola pozorovaná v obidvoch týchto určené, že ipt gén bol excidovaný týchto jedincov spolu s Ac a sú ukázané na obrázku 14, v ktorom sú hodnoty ukázané na ľavej strane tie isté ako hodnoty na obrázku 6. Ďalej, expresia GUS génu bola detekovaná u všetkých jedincov získaných zo siedmich výhonkov.

Obrázok 15 ukazuje stav normálneho výhonku diferencovaného z ESP .

Príklad 4

List získaný z výhonku, ktorý je ukázaný ako výhonok č. 7 v tabulke 1 spolu s 9 výhonkami vybranými v príklade 6 bol kultivovaný v MS agarovom kultivačnom médiu bez hormónov počas asi 1 mesiaca. Jeden normálny výhonok bol vizuálne separovaný zo 6 vedľajších výhonkov, ktoré boli rediferencované z kultivovaného listu. Tento výhonok bol transplantovaný do kultivačného média majúceho vyššie uvedené zloženie a potom bol normálne kultivovaný a zakorenený. Ďalej, tento jedinec bol podrobený PCR analýze rovnakým spôsobom ako v kroku II-B príkladu 2 a na základe toho, že nebol objavený DNA fragment s približne 800bp a amplifikácia DNA fragmentu s približne 3kb bolo určené, že ipt gén bol excidovaný z chromozomálnej DNA týchto jedincov spolu s Ac a že nie je prítomný. Výsledky sú ukázané na obrázku 16, v ktorom sú hodnoty ukázané na ľavej strane tie isté ako hodnoty na obrázku 6. Ďalej, expresia GUS génu bola tiež detekovaná u rovnakého jedinca.

Príklad 5

I. Separácia miestne špecifického re kombinačného systému (pSRl systému) z kvasinky

Kvasinka (Zygosaccharomysces rouxii (získaná od Inštitúte far Fermentation)) bola inokulovaná do 5 ml YPAD kvapalného kultivačného média (obsahujúceho 10 g/liter kvasinkového extraktu, 20 g/liter polypeptónu, 0,4 g/liter adenínu a 20 g/liter glukózy) a bola kultivovaná pri 30°C počas 24 hodín. Kultivačný roztok bol centri fugovaný pri 6900 x g počas 3 minút pri 20°C k odberu buniek (ďalej boli bunky odoberané za rovnakých podmienok). Získané bunky boli suspendované v 2 ml roztoku obsahujúceho 0,2m Tris-HCI (pH 8,0) a 5% objem/objem mercaptoethanol. Bunečná suspenzia bola umiestená na 30 minút do 25°C občas bola jemne premiešaná a potom boli bunky odobraté. Ďalej, odobraté bunky boli suspendované v roztoku (pH 6,8) obsahujúcom 2,5 mg/ml Zaimolyeis-20T (získaný od SEIKAGAKU CORPORATICON) , 10% hmotnosť/objem sorbitol a 5% hmotnosť/objem KPO₄ . Suspenzia bola umiestnená v 30°C po 90 minútach recentrifugovaná k opätovnému získaniu buniek. Získané bunky boli resuspendované v 1 ml roztoku obsahujúceho 0,2 M NaCl, 0,1 M EDTA, 5% hmotnosť/objem SDS, 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) a bolo pridané 20 Proteinázy K do koncentrácie 20 mg/ml. Zmiešaný roztok bol umiestený do 60°C počas 1 hodiny, potom vrátený do izbovej teploty a extrahovaný zmesou fenolu a chloroformu a potom chloroformom do čistoty. Takto získaný supernatant bol pridaný ku rovnakému objemu izopropanolu na precipitáciu chromozomálnej DNA a plazmidu pSRl. Zmes bola centri fugovaná pri 6900 x g počas 10 minút pri 4°C na odber DNA a odobratá DNA bola premytá 70% objem/objem ethanolom, potom sušená vákuom a rozpustená v 10 0 μΐ T E .

Pri použití takto extrahovanej DNA (zmesi chromozomálnej DNA a plazmidu pSRl) ako templátu bol iba miestne špecifický rekombinačný systém, ktorý bol prítomný v plazmide pSRl (tu označovaný ako pSRl systém amplifikovaný PCR metódou. pSRl systém sa skladá z R génu, čo je rekombinazový gén a rekombinačná sekvencia, Rs, a ich DNA sekvencia, ktorá už bola určená (H. Araki et al . , J. Mol. Biol., zväzok 182, str. 191 , 1985) . V predkladanom vynáleze bol na ampli fikácii R génu syntetizovaný primér, v ktorom bolo pridané Xbal miesto na reštrikčnú endonukleázu na 5'-polohu 22 báz, konkrétne 5596.-5617. báz v sekvencii plazmidu pSRl (5'-CCTCTAGAATGCAATTGACCAAGGATACTG-3') a primér, v ktorom bolo pridané Sací miesto na reštrikčnú endonukleázu na 5'-polohu 22 báz, konkrétne 4126.-4147. báz v sekvencii plazmidu pSRl

CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3’). Na druhej amplifikácii Rs boli syntetizované dva páry primérov každý obsahujúci 30 báz (celkom štyroch typov). To znamená, že jeden pár bol zložený z priméru, v ktorom tri z báz 287 316 sekvencie plazmidu pSRl boli odstránené a bolo zavedené (5 ’ strane, k

Ssel miesto na reštrikčnú AGGATTGAGCTACTGGACGGGAATCCTGCA-3' ) a štyri z báz 690 - 719 sekvencie odstránené a bolo zavedené HindlII endonukleázu (5'priméru, v ktorom plazmidu pSRl boli miesto na reštrikčnú endonukleázu a Xhol miesto na reštrikčnú endonuklaázu (5*— CAACTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3 ' ) . Rs, ktorý bol amplifikovaný s touto sadou primérov bol nazvaný Rsl. Druhý pár bol zložený z priméru, v ktorom tri z báz 287 42

316 sekvencie plazmidu pSRl boli odstránené a bolo zavedené Xhol miesto na reštrikčnú endonukleázu a EcoRI miesto na reštrikčnú endonukleázu (5'AGGATTGAGCTACTCGAGGGGAATTCTGGA3') a priméru, v ktorom päť z báz 68 8 - 7 17 sekvencie plazmidu pSRl bolo odstránených a bolo zavedené Ssel miesto na reštrikčnú endonukleázu (5*— ACTGGACCAATCCCTGCAGGTCGTAGTCAA-3 ' ) . Rs, ktorý bol ampli fikovaný s touto sadou primérov bol nazvaný Rs2.

Na amplifikáciu R génu a Rs bol Ιμΐ extrahovaného roztoku DNA pridaný ku každým 50 μΐ zmiešaného roztoku použitého v kroku IV-B príkladu 1, ktorý obsahoval 0,2 μΜ každej sady primérov v príslušnom poradí. Cyklus zahrievania s tromi zložkami, menovite, pri 95°C počas 30 sekúnd, pri 55°C počas 30 sekúnd a pri 72°C počas 1,5 minúty bol so zmesou opakovaný celkom 30-krát. Takto získaná reakčná zmes bola analyzovaná agarozovou gélovou elektrolýzou na potvrdenie amplifikácie R génu a Rs .

II. konštrukcia vektora

Rsl amplifikovaný PCR metódou bol trávený reštrikčnými endonukleázami PstI a Xhol a plazmid pNPI126 bol získaný inzerciou tohto Rsl do Pstl-Xhol miesta na reštrikčnú endonukleázu pSL1180 (získaný od Pharmacia Biotech Co.).

Potom, k eliminácii EcoRI miesta na reštrikčnú endonukleázu a HindlII miesta na reštrikčnú endonukleázu pHSG398 bolo v sekvencii opakované trávenie týmito reštrikčnými endonukleázami, zmena trávených koncov na tupo zakončené konce T4 polymerázou I (veľkou podjednotkou) a ligácie tupo zakončených koncov. Týmto spôsobom bol získaný plazmid pNPI121, v ktorom boli tieto miesta na reštrikčné endonukleázy eliminované. Plazmid pNPI127 bol produkovaný trávením Rs2 amplifikovaného PCR metódou reštrikčnou endonukl eá zou Xhol a PstI a inzerciou tohto Rs2 do SallPstl miesta na reštrikčnú endonukleázu plazmidu pNPI121.

Plazmid pNPI128 bol získaný vystrihnutím Rsl z pNPI126 reštrikčnými endonukleázami Smal a Spel a inzerciou tohto fragmentu do Smal-Xbal miesta na reštrikčnú endonukleázu pNPI127 .

R gén amp1 i fikovaný PCR metódou bol trávený reštrikčnými endonukleázami Xbal a Sací a bol inzertovaný do Xbal-SacI miesta na reštrikčnú endonukleázu pHSG398. Takto získaný plazmid bol označený pNPI124.

Potom bol pBI221 (získaný od reštrikčnou endonukleázou PstI. pozmenené na tupo zakončené konce

Clon te ch Trávené

Co.) trávený konce boli a potom ligované vyššie uvedeným spôsobom. Tak bol ktorom boli eliminované Ssel endonukleázu. Potom bol R reštrikčnými endonukleázami získaný plazmid pNPIlll, v a PstI miesta na reštrikčnú gén vystrihnutý z pNPI124

Xbal a Sací inzertovaný do

Xbal-SacI miesta na reštrikčnú endonukleázu pNPIlll nahradzujúceho GUS gén pri produkcii plazmidu pNPI125. Ďalej, 35S promotor víru karfiolovej mozaiky, R gén nadviazaný na promotor a polyadenylačný signál nopalin syntetázy boli vystrihnuté reštrikčnými endonukleázami HindlII a EcoRI a boli inzertované do HindIII-EcoRI miesta na reštrikčné endonukleázy pNPI128 pri získaní plazmidu pNPI129.

pNPHOl bol trávený reštrikčnou endonukleázou Smal a 5'fos forylovaný HindlII linker (získaný od Takara Shuzo Co., Ltd.) bol inzertovaný do miesta trávenia a bol získaný plazmid pNPI122. To znamená, že tento pNPI122 je plazmidom, v ktorom bolo Smal miesto na reštrikčnú endonukleázu pNPHOl nahradené HindlII miestom na reštrikčnú endonukleázu. Ďalej, pNPI122 bol trávený reštrikčnou endonukleázou PstI a trávené konce boli pozmenené na tupo zakončené konce a potom ligované pri produkcii plazmidu pNPI123, v ktorom boli eliminované Ssel a PstI miesta na reštrikčnú endonukleázu. Z tohto plazmidu bol 35S promotor víru karfiolovej mozaiky a ipt gén na neho naviazaný vystrihnutý reštrikčnou endonukleázou HindlII a bol inzertovaný do HindlII miesta na reštrikčnú endonukleázu pNPI129 pri získaní plazmidu pNPI13O.

Požadovaný vektor bol získaný vystrihnutím fragmentu obsahujúceho ipt gén a R gén, na ne naviazaný 35S promotor víru karfiolovej mozaiky, v príslušnom poradí a Rs prítomné na obidvoch koncových častiach týchto génov reštrikčnou endonukleázou PstI a inzerciou tohto fragmentu do Ssel miesta na reštrikčnú endonukleázu v pBI121. Takto získaný plazmid bol označený pNPI132.

Tento plazmid bol tiež zavedený do kmeňa JM109 E. coli (Escherichia coli) a bol uložený podlá Budapeštianskej zmluvy ako E. coli JM109 (pNPI132) pod prírastkovým číslom FERM BP-5065.

Stratégia konštrukcie plazmidu pNPI132 je schematicky znázornená na obrázkoch 17-19. Mapa reštrikčných endonukleáz jeho T-DNA regiónu je ukázaná na obrázku 20. Na obrázkoch 17 až 19 a 20 ukazujú šrafované troj uholníčky rekombinačnú sekvenciu Rs odvodenú od plazmidu pSRl kvasinky a orientáciu tejto sekvencie. Ostatné symboly sú rovnaké ako na obrázkoch 2 až 5.

Ako je jasné z obrázku 20, plazmid pNPI132, rovnako ako plazmid ρΝΡΙΙΟβ, má ipt gén ako markerový gén a NPTII gén a GUS gén ako model požadovaného génu v T-DNA regióne. Predsa však, v tomto prípade, región medzi dvomi rekombinačnými sekvenciami Rs pSRl systému sa chová ako odstrániteľný DNA element. Preto, ipt gén je inzertovaný tak, aby bol udržiavaný dvomi rovnako smerovanými sekvenciami.

III. Zavedenie pNPI132 do tabaku a analýza tabaku, do ktorého bol gén zavedený

Rovnakým spôsobom ako v krokoch II a III príkladu 1 bol plazmid pNPI132 zavedený do A. tumefaciens kmeňa LBA4404 a listové disky tabaku (Nicotiana tabacum cv. SR1) boli infikované A. tumefaciens. Takto infikované tabakové listy boli inkubované MS agarovým kultivačným médiom bez hormónov obsahujúcom 50 mg/liter acetosyringónu a. potom v MS agarovom kultivačnom médiu bez hormónov, do ktorého bolo pridaných 500 mg/liter karbencilínu.

mesiac neskôr boli kultivované listy transplantované do kultivačného média rovnakého zloženia a kultivácia pokračovala počas 1 mesiaca. Potom bolo separovaných 48 ESP linií.

Tieto ESP línie boli opäť transplantované v kultivačnom médiu rovnakého Približne o jeden zloženia a kultivácia pokračovala, mesiac neskôr (menovite, približne 3 mesiace po infekcii A. tumefaciens) boli výhonky, u ktorých bolo vizuálne detekované, že majú normálnu morfológiu, generované zo siedmich z 48 ESP línií. Tieto výhonky boli separované a transplantované do kultivačného média s rovnakým zložením a potom mohli j edinci.

byť získaní normálni

Títo jedinci boli podrobení PCR analýze rovnakým spôsobom ako v kroku II-B príkladu 2, pri použití páru primérov k detekcii GUS génu spolu s primérmi použitými v kroku II-B príkladu 2. Realizáciou PCR pri použití týchto primérov bol DNA fragment s približne 800 bp ampli fi kovaný, pokial bol ipt gén prítomný; DNA fragment s približne 3kb bol ampl i f i kovaný, pokiaľ bol ipt gén excidovaný z T-DNA regiónu plazmidu pNPI132 vďaka excisii časti vymedzenej Rs (tieto výsledky sú rovnaké ako v analýze kroku II-B v príklade 2); a DNA fragment s približne 1,7 kb bol amp1 i fikovaný, pokial bol prítomný GUS gén. Výsledky sú ukázané na obrázkoch 21 - 23 a tabulke 2. V obrázkoch 21 23 sú hodnoty ukázané na ľavej strane tie isté ako hodnoty na obrá z ku 6 .

Tabuľka 2

Výsledky analýzy transgénneho génu v tabaku, do ktorého bol gén zavedený vektorom pNPI132 príklad 2

ESP línia	Jednotlivá	r e	ipt	re GUS
č .	rastlina č.	800 bp	3 kb	1,7 kb
15	1	-	+	+
	2	-	+	+
16	1	-	+	+
17	1	-	+	+
18	1	-	+	+
19 ,	1	-	+	+
	2	-	+	+
20	1	-	+	+
	2	-	+	+
21	1	-	+	+

Poznámky:

+ ukazuje, že je amplifikovaný korešpondujúci fragment a - ukazuje, že nie je amplifikovaný korešpondujúci fragment.

Ako je zrejmé z tabuľky 2, prítomnosť ipt génu, ktorý bol markerovým génom, nebola detekovaná v žiadnom chromozóme od jednotlivcov, ktorí boli vybraní iba vizuálnym pozorovaním ich morfológie a miesto toho bola detekovaná amplifikácia DNA fragmentu, ktorý ukazuje excisiu ipt génu. Okrem toho, prítomnosť GUS génu použitého ako požadovaný gén bola detekovaná u všetkých jednotlivcov.

Na druhej strane bola vyšetrovaná rezistencia na kanamycín pri použití koncových pupeňov od jednotlivcov, ktorí boli získaní z non ESP diferenciácie simultánne so 48 ESP líniami a vykazovali normálne predlžovanie a zakoreňovanie, kedy toto vyšetrenie bolo realizované pri použití MS agarového média bez hormónov obsahujúceho 200 mg/1 kanamycínu. Bolo zistené, že dva z týchto 16 jedincov majú rezistenciu na kanamycín.

Ďalej, títo na kanamycín rezistentní jedinci boli ďalej vyšetrovaní podrobením PCR analýze spolu s tromi jedincami vybranými zo 14 na kanamycín citlivých jedincov rovnakým spôsobom ako bol použitý na jedince získané z ESP. Obr. 24 ukazuje výsledky, kde sú hodnoty ukázané na ľavej strane tie isté ako hodnoty na obrázku 6.

Ako obrázok 24 jasne ukazuje, každý z týchto dvoch na kanamycín rezistentných jedincov vykazoval amplifikáciu DNA fragmentu, ktorý ukazoval excisiu regiónu obsahujúceho ipt gén a vymedzeného Rs a prítomnosť GUS génu. Tak bolo overené, že gény pochádzajúce z pNPI132 boli integrované do chromozómu. Oproti tomu, žiadna takáto amplifikácia nebola pozorovaná u troch na kanamycín citlivých jedincov. Dalej, žiadny z týchto jedincov (menovite, ani na kanamycín rezistentní jedinci, ani na kanamycín citliví jedinci) nevykazoval amplifikáciu · DNA fragmentu ukazujúceho prítomnosť ipt génu.

Je predpokladané, že títo na kanamycín rezistentní jedinci získaní z kmeňa postrádajúceho schopnosť tvoriť ESP, rovnako ako na kanamycín citliví jedinci, pochádzajú z buniek, do ktorých chromozómu nebol zavedený pNPI132 infekciou A. tumefaciens. Na základe tohto predpokladu, nie je možné, aby pochádzajúce z tohto vektora boli obsiahnuté v chromozóme. Okrem toho, je nezmyselné, aby sa jedinci, ktorí nemajú ipt gén, ale obsahujú NPTII gén (ako je ukázané skutočnosťou, že títo jedinci boli rezistentní na kanamycín) a GUS gén, obidva v úplnej forme v chromozóme, objavovali v takej frekvencii s ohľadom na tieto gény pochádzajúce z rovnakého vektora.

Je možné súdiť, že u týchto na kanamycín rezistentných jedincov bol pNPI132 niekedy zavedený do chromozómov. To znamená, je myslené, že T-DNA región pNPI132 bol niekedy zavedený do chromozómu infekciou A. tumefaciens, ale že excesívne účinná funkcia pSRl systému použitého na tento vektor indukovala excisiu ipt génu pred tvorbou ESP po infekcii A. tumefaciens. Výsledkom je, že NPTII gén a GUS gén exkluzívne zostávajú v chromozóme kanamycín rezistentní jedinci vykazovali excisiu regiónu obsahujúceho ipt gén a vymedzeného Rs tiež podporuje tento záver. ¹

Fakt, že na v PCR analýze

Príklad 6

I. Konštrukcia vektora

Rol gény (S. Kiokawa, Plánt Physiol., zväzok 104, str. 801, 1994) obsahujúce rolA, rolB a rolC a majúce celkovú veľkosť 7,6 kb, ktoré boli inzertované do EcoRI miesta na reštrikčnú endonukleázu pBluescriptII SK+ (vyrobeného Toyobo Co . , Ltd.), boli vystrihnuté reštrikčnou endonukleázou EcoRI. Tento fragment bol inzertovaný do miesta na reštrikčnú endonukleázu EcoRI pNPI129 pri vzniku pNPI7OO.

Z tohto plazmidu pNPI7OO boli rol gény, 35S promotor víru karfiolovej mozaiky, R gén naviazaný na promotor a Rs prítomný na obidvoch koncoch týchto génov vystrihnuté reštrikčnou endonukleázou Ssel a boli inzertované do miesta na reštrikčnú endonukleázu Ssel pBI121 pri získaní požadovaného plazmidu pNPI7O2.

Plazmid pNPI7O2 bol tiež zavedený do kmeňa JM109 E. coli (Escherichia coli) a bol uložený podlá Budapeštianskej zmluvy ako E. coli JM109 (pNPI7O2) pod prírastkovým číslom FERM BP-5066.

Stratégia ku konštrukcii plazmidu pNPI7O2 je schematicky znázornená na obrázku 25. Mapa reštrikčných endonukleáz jeho T-DNA regiónu je ukázaná na obrázku 26. Symboly na obrázkoch 25 a 26 sú rovnaké ako symboly na obrázkoch 2 až .

Ako je jasné z obrázku 26 je plazmid pNPI7O2 podobný plazmidu pNPI132, iba markerový gén bol zamenený z ipt génu na rol gény. Rol gény použité pre tento vektor sú prirodzene prítomné v T-DNA A. rhizogenes. Je známe, že pokial sú rol gény zavedené do rastlinnej bunky, potom sú generované vlasaté korene v rastlinnom tkanive a že rastliny regenerované z týchto vlasových korienkov vykazujú morfologické abnormality ako je zakrslosť a podobne.

II. Zavedenie pNPI7O2 do tabaku a analýza tabaku, do ktorého bol gén zavedený

Rovnakým spôsobom ako v krokoch II a III príkladu 1 bol plazmid pNPI7O2 zavedený do A. tumefaciens kmeňa LBA4404 a listové disky tabaku boli infikované A. tumefaciens.

Takto infikované tabakové listy boli inkubované MS agarovým kultivačným médiom bez hormónov obsahujúcim 50 mg/liter acetosyringónu na tmavom mieste počas 3 dní a potom v MS agarovom kultivačnom médiu bez hormónov, do ktorého bolo pridaných 400 mg/liter ticarcilínu. Po asi 15 dňoch od počiatku kultivácie bola pozorovaná diferenciácia vlasových koreňov. Vlasové korienky boli separované jeden za druhým, umiestené do kultivačného média indukujúceho výhonky (MS agarové kultivačné médium obsahujúce 0,1 mg/liter a - na ftalenacetoctovej benzyladenínu a 400 mg/liter rediferencovanými výhonkami bolo vizuálne vybraných 18, o ktorých sa súdilo, že majú normálnu morfológiu a ktoré boli podrobené PCR analýze rovnakým spôsobom ako v kroku II-B príkladu 2, pri použití primérov na regiónu obsahujúceho rol gény a prostredníctvom amplifikácie DNA fragmentu s približne 3kb (s rovnakými primérami ako boli použité v príkladoch 2 až a v porovnávacom príklade 2) a primérov na detekciu prítomnosti rol génov prostredníctvom amplifikácie DNA fragmentu s približne 1,1 kb. Výsledkom bolo potvrdené, že región obsahujúci rol gény a vymedzený Rs bol excidovaný z chromozómov 9 výhonkov.

kyseliny, 2,0 mg/liter ticarcilínu) . Medzi detekciu excisie vymedzeného Rs

Príklad 7

Pri použití vektora ρΝΡΙΙΟβ konštruovaného vo vyššie uvedenom príklade 2 bola hybridná osika (Populus Sieboldii x Populus grandidentata; drevina) podrobená zavedeniu génu.

Kmeň hybridnej osiky kmeňa Y63 (získáné z pokusného lesa Akita Jujo Chemicals Co., Ltd.) kultivovaný v sterilnej nádobke bol narezaný bezchybným rezom dĺžky 5mm. Potom bol ďalej vertikálne narezaný na dva kusy k použitiu ako vzoriek a vzorky boli infikované A. tumefacens kmeňa LBA4404 so zavedeným ρΝΡΙΙΟβ rovnakým spôsobom ako v kroku príkladu 1. Po infekcii bol rez kmeňa umiestený v MS agarovom kultivačnom médiu bez hormónov (obsahujúcom 2% hmotnosť/objem sukrosu a 0,8% hmotnosť/objem agar), ku ktorému bolo pridaných 40 mg/liter acetosyringónu a tu bol kultivovaný počas 3 dní. Potom bol transplantovaný do rovnakého média, ktoré obsahovalo 500 mg karbencilínu miesto acetosyrigónu a tu bol ďalej kultivovaný. Modifikované MS kultivačné médium tu použité je pripravené zmenou koncentrácií amoniakového dusíka dus ičnanového dusíka, ktoré sú zvyčajné pre MS kultivačné médium v príslušnom poradí na 10 mM a 30 mM, v príslušnom poradí.

Po asi dvoch mesiacoch boli náhodné očká rastúce z tohto rezu separované a ďalej kultivované počas 2 mesiacov. Tak bolo získaných 6 ESP línií. Tieto kmene boli ďalej subkultivované a o asi 4 mesiace neskôr (t.j. asi 8 mesiacov po infekcii A.tumefaciens) boli prvýkrát pozorované morfologicky normálne výhonky rastúce z ESP. Potom boli tieto výhonky transplantované do 2/3 riedeného MS gellan gum média (obsahuje 2 % hmotnosť/objem sacharózu a 0,3 % hmotnosť/objem gellanová guma), do ktorého bolo pridaných 0,05 mg/liter IBA (kyselina indolmaslová) a tu boli kultivované. Tak bolo získaných celkom sedem normálnych jednotlivo rastúcich odnoží zo 2 ESP línií v priebehu 10 mesiacov po infekcii A. tumefaciens.

Títo jedinci boli potom podrobení PCR analýze rovnakým spôsobom ako v kroku III príkladu 5.

Výsledkom bolo, že ipt gén nebol dete kovaný u ani jedného z nich. Na druhú stranu, prítomnosť GUS génu bola detekovaná u dvoch z týchto jedincov. Tak bolo potvrdené, že vektor podlá predkladaného vynálezu bude účinne fungovať tiež u drevín.

Mimochodom, u zostávajúcich piatich normálnych jedincov bola detekovaná iba časť GUS génu. Zdá sa, že u takýchto jedincov, kedy bol transpozón Ac zavedený vektorom ρΝΡΙΙΟβ excidovaný z chromozómu spolu s ipt génom, bol GUS gén, lokalizovaný v ich susedstve, zahrnutý do excisie a tak bol roztrhnutý.

Obrázok 27 ukazuje stav normálneho výhonku diferencovaného z ESP.

Príklad 8

Normálni jedinci (získaní cestou ESP) majúci gény zavedené pNPI132 v príklade 5 boli ďalej podrobení zavedeniu génu pri použití vynálezu.

vektora podlá predkladaného

GUS gén pNPI132^! bol rezistencie na hygromycín).

nahradený HPT génom (gén Pri použití takto získaného vektora (pNPI14O, obrázok 28) boli vyššie uvedení normálni jedinci podrobení zavedeniu génu rovnakým spôsobom ako v kroku II a III príkladu 40 dní po infekcii A. tento vektor. Tieto

1. Tak bolo získaných 10 ESP línií tumefaciens, ktoré mali zavedený ESP línie boli separované, transplantované do kultivačného média rovnakého zloženia (MS agarové kultivačné médium bez hormónov obsahujúce 500mg/liter karbenci 1ínu) a tu boli ďalej kultivované. Výsledkom bolo, že diferenciácia výhonkov, ktoré mali vizuálne normálnu morfológiu, bola pozorovaná v jednej z týchto línií za 20 dní (menovito, asi 2 mesiace po infekcii A . tume faciens) .

Jeden z takto diferencovaných normálnych podrobený PCR analýze rovnakým spôsobom ako príkladu 1. Obrázok 29 ukazuje výsledky.

výhonkov bol v kroku IV-B

Je potrebné zaznamenať, že tu bolo využitý pár primérov projektovaných na väzbu na NPTII gén a HPT gén, v príslušnom poradí, k detekovaniu excisie regiónu obsahujúceho ipt gén a vymedzeného Rs, z chromozomálnej DNA a iného páru primérov k detekovaniu prítomnosti HPT génu prostredníctvom amplifikácie DNA fragmentov a približne 1kb, v príslušnom poradí), použitých v kroku IV-B príkladu 1.

ukázané na lavej strane rovnaké obrázku 6 .

(dete kovaného s približne 4kb okrem primérov

Na obrázku 29 sú hodnoty ako hodnoty ukázané na

Ako j e vykazovala na obrázku 29 chromo zomálna jasne ukázané, v PCR analýze DNA extrahovaná z výhonkov amplifikáciu DNA fragmentu s približne 4kb, ktorý ukazuje, že ipt gén bol excidovaný vďaka excisii regiónu vymedzeného Rs a amplifikácie DNA fragmentu s približne lkb, ktorý ukazuje na prítomnosť HPT génu. Na druhej strane, DNA fragmentu s približne 800 bp, ktorý ampli f i kácia ukazuje na prítomnosť ipt génu, nebola v tejto DNA detekovaná. Tieto výsledky naznačujú, že ipt gén, ktorý bol zavedený do chromozomálnej DNA tohto výhonku, bol excidovaný vďaka excisii regiónu vymedzeného Rs a tak zmizol, zatial čo HPT gén stále zostal v DNA. To znamená, že do jednotlivca so zavedenými požadovanými génmi (t. j. HPT génom a GUS génom) prostredníctvom pNPI132 bol ďalej zavedený nový požadovaný gén (t.j. HPT gén), pri použití vektora, kde konštrukcia týkajúce sa požadovaného génu bola jedinečná (t.j. rovnaký ipt gén použitý ako markerový gén) s opakovaním kultivácie, vizuálnej selekcie a separácie. Okrem toho, výsledky ukázali, že je možné tretieho, štvrtého alebo ďalších požadovaných použití rovnakého markerového génu.

zavedenie génov pri

Ako je jasné z vyššie popísaných príkladov, získané ESP línie už mali ipt gén vo svojich chromozómoch ako je to ukázané na obrázku 6. Ďalej, ESP, ktoré vykazovali značné morfologické abnormality, preto mohli byť vizuálne identifikované, vykazovali rezistenciu na kanamycín, bez výnimky, pri expresii NPTII génu, ktorý bol modelovým požadovaným génom a ktorý bol zavedený spolu s ipt génom. Toto dokazuje, že takýto MAI gén je plne dostupný ako markerový gén k zavedeniu génu do rastliny, a že vektor podía predkladaného vynálezu obsahujúci tento MAI gén ako markerový gén je tiež použiteľný ako vektor k zavedeniu génu do rastliny.

Pokiaľ je gén zavedený do rastliny pri použití vektora ρΝΡΙΙΟβ, v ktorom bol ipt gén integrovaný v transpozóne Ac, potom boli získané výhonky, ktoré stratili svoju ESP vytvárajúcu schopnosť v dôsledku chýbania ipt génu v chromozóme, zatial čo si uchovávali charakteristiky dané požadovaným génom (NPTII gén a/alebo GUS gén), z tkaniva, ktoré tvorilo ESP v počiatočnom štádiu kultivácie ihneď po zavedení génu, ako je ukázané v tabuľke 1 a obrázkoch 13, 14 a 16. Okrem toho, morfológia tohto získaného tkaniva (t.j. výhonkov a podobne, ktoré stratili schopnosť tvoriť ESP) môže byť vizuálne identifikovaná ako je ukázané na obrázkoch 15 a 27. Ďalej, pokiaľ boli tieto selektované, separované a kultivované, potom boli získaní zakorenení jedinci s normálnou morfológiou. Ďalej, tkanivá, ktoré boli rediferencované z tkaniva získaného z výhonkov, ktoré stratili schopnosť vytvárať ESP, tiež vykazovali normálne morfológie bez schopnosti tvoriť ESP. Toto potvrdzuje, že takéto výhonky a podobne sa skladajú z uniformných buniek.

Rovnaké výsledky boli použitý odstrániteľný DNA konštrukcia transpozónov tiež pozorované, pokiaľ bol element odvodený od miestne špecifického rekombinačného systému a pokial boli použité rol gény ako MAI gény. To znamená, že pokial bol gén zavedený do rastliny pri použití vektora, v ktorom bola vektorov, týkajúcich sa transpozónu alebo a ipt génu použitých v príkladoch 1 až 4 a 7 nahradená týmto príbuzným vyššie uvedeným rekombinačným systémom a/alebo rol gény ako je popísané v príkladoch 5 a 6, potom boli získané morfologicky normálne tkanivá a rastliny, v ktorých nebol MAI gén prítomný v ich chromozóme, zatial čo požadovaný gén bol zachovaný, z tkaniva, ktoré vykazovalo abnormálnu morfológiu ihneď po zavedení génu (obrázky 21 - 23, tabuľka 2). Ďalej, je tiež možné mnohonásobné zavedenie rovnakého jedinca opakovaním kultivácie ktorom je j edinečne požadovaných génov do krokov zavedenia génu, a vizuálnej selekcie pri použití vektora, v konštrukcia týkajúca sa požadovaného génu zmenená, zatial čo je použitý rovnaký morfologickú abnormalitu indukujúci gén ako markerový gén (príklad 8, obrázok 29).

V súlade s tým, pokial je takýto vektor použitý, v ktorom je MAI gén použitý ako markerový gén a je inzertovaný do pozície, kde sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom, potom je získané tkanivo tvorené iba bunkami, v ktorých požadovaný gén zostáva sám v chromozóme a podobne a uchováva si svoju funkciu, pri uskutočnení nasledujúcich krokov:

(1) kultivácia buniek ihneď po zavedení génu a vizuálna selekcia morfologicky abnormálneho tkaniva, ktorá sa objaví v priebehu kultivácie, (2) ďalšia kultivácia morfologicky abnormálneho tkaniva a vizuálna selekcia morfologicky normálneho tkaniva, ktorá sa objaví v priebehu kultivácie.

Ďalej, rastlina tvorená iba takýmito bunkami môže byť tiež získaná z morfologicky normálneho tkaniva.

Okrem toho, pokial bol použitý odstrániteľný DNA element odvodený od miestne špecifického rekombinačného systému, preto tým, že sa jeho excisia vyskytovala rýchlo a v dosť vysokej frekvencii, mohlo byť morfologicky normálne tkanivo, ktoré vzniklo z morfologicky abnormálneho tkaniva detekované rýchlo a bolo z neho získaných mnoho normálnych jedincov s dobrou účinnosťou.

Tabuľka ukazuje účinnosť, akou boli získaní normálni jedinci z pokiaľ bol použitý morfologicky abnormálneho tkaniva, transpozón alebo odstrániteľný DNA element odvodený od miestne špecifického rekombinačného systému vo vektore podlá predkladaného vynálezu.

Tabuľka 3

Rozdiely v účinnosti získania normálnych jedincov v závislosti na type odstrániteľného DNA elementu.

	vektor	odstrániteľný DNA element	počet ESP línií	počet línií, v ktorých regeneruj ú normálni jedinci
príklad 3	pNPI10 6	Ac (transpozón)	63	2 (7 jedincov)
príklad 5	PNPI132	región vymedzený RS pSRl systému (miestne špecifický re kombinačný systém)	48	7 (10 j edincov)

Pozn. :

1. ESP bola separovaná 2 mesiace po kultivácii.

2. Normálne výhonky mohli byť detekované po 4 mesiacoch kultivácie v príklade 3 a po 3 mesiacoch kultivácie v príklade 5.

3. Každý z vyššie uvedených normálnych jedincov obsahoval GUS gén ako model požadovaného génu.

V príkladoch 1 až 5, za neprítomnosti hormónov, tkanivo obsahujúce transgénne bunky proli ferovalo, diferencovalo náhodné výhonky a regenerovalo rastlinu. Toto je pravdepodobne možné pripísať účinku ipt génu, ktorý bol zavedený do chromozómu v transgénnej bunke ako markerový gén. To znamená, že pri expresii tohto génu je rastlinný hormón nadprodukovaný v bunke. Následkom toho, rastlinný hormón produkovaný v bunke obsahujúcej ipt gén ovplyvňuje nielen bunku samotnú k diferenciácii tkaniva ako je ESP a podobne, ale tiež tkaniva susediaceho s bunkou v rovnakom rozsahu, rovnakým spôsobom, ako keď je do kultivačného média pridaný arteficiálne rastlinný hormón.

Vo vektore podľa predkladaného vynálezu je MAI gén použitý ako markerový gén. Preto, pokial je uskutočnené zavedenie génu do rastliny pri použití tohto vektora, potom môže byť tkanivo, do ktorého je požadovaný gén zavedený, selektované kultivovaním buniek podrobených zavedeniu génu v bežnom kultivačnom médiu pri bežných kultivačných podmienok bez pridania akýchkoľvek chemických substancií na selekciu a je možná vizuálna identifikácia vzniknutého morfologicky abnormálneho tkaniva. V súlade s tým, postup je zjednodušený a aktivita rastlinnej bunky sa neznižuje v priebehu selekcie.

Ďalej, takýto MAI gén je v rastline dedený alebo je zavedený do rastliny prirodzenou infekciou baktérií a podobne.

Z tohto dôvodu, i keď je MAI gén exprivovaný v rastlinnej bunke, do ktorej bol gén zavedený, je jeho bezpečnosť významne vysoká, pokiaľ je rastlina trávená v ľudskom tele.

Ešte ďalej, pokial je ipt gén použitý ako MAI gén, potom tkanivo obsahujúce transgénne bunky proliferuje a diferencuje náhodné výhonky pôsobením tohto génu, čo umožňuje eliminovať potrebu pridania rastlinných hormónov do kultivačného média, ktoré je všeobecne považované za nedostačujúce na proliferáciu a diferenciáciu pri kultivácii rastlinných buniek.

Claims (31)

1. Vektor na zavedenie požadovaného génu do rastliny, ktorý obsahuje požadovaný gén a aspoň jeden morfologickú abnormalitu indukujúcu gén ako markerový gen .

’tt

2. Vektor podľa abnormalitu mikroorgani zrnu nároku 1, kde uvedený indukujúci gén je rodu Agrobacterium.

morfologickú získaný z

Vektor podľa nároku 1, kde uvedený abnormalitu indukujúci gén je gén cytokinínu.

morfologickú na syntézu

4. Vektor podľa nároku 3, kde uvedený gén na syntézu cytokinínu je ipt, izopenteny1transferázový gén, ktorý je prítomný v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.

5. Vektor podlá nároku 1, kde uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je aspoň jeden gén vybraný z rol génov.

6. Vektor podľa nároku 5, kde uvedené rol gény sú rol gény obsahujúce rolA, rolB a rolC, ktoré sú prítomné v T-DNA Agrobacterium rhizogenes.

7. Vektor na zavedenie požadovaného génu do rastliny spolu s markerovým génom, kde uvedený markerový gén je odstránený z DNA, v ktorej je prítomný a kde účinkuje k odstráneniu jeho funkcie po jeho expresii a kde expresia uvedeného markerového génu a odstránenie jeho účinku je detekovatelné morfologickou zmenou tkaniva odvodeného od rastlinnej bunky, do ktorej je uvedený markerový gén zavedený.

8. Vektor na zavedenie požadovaného génu do rastliny, ktorý obsahuje uvedený požadovaný gén, aspoň jeden morfologickú abnormalitu indukujúci gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, v ktorom je uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén umiestený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a v ktorom je uvedený požadovaný gén umiestený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom.

9. Vektor podľa nároku 8, kde uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je prítomný v uvedenom odstrániteľnom DNA elemente.

10. Vektor podľa nároku 8, kde uvedený odstrániteľný

DNA element je transpozón 11. Vektor podľa nároku 8, kde je uvedený odstrániteľný DNA element odvodený od miestne špeci fického re kombinačného systému. 12. Vektor pódia nároku 8, kde je uvedený morfologickú

abnormalitu indukujúci gén získaný z mikroorganisrnu rodu Agrobacterium.

13. Vektor podľa nároku 8, kde uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je gén na syntézu cytokinínu.

14. Vektor podľa nároku 13, kde uvedený gén na syntézu cytokinínu je ipt, izopentenyltransferázový gén, ktorý je prítomný v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.

15. Vektor podľa nároku 8, kde uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je aspoň jeden gén vybraný z rol génov.

16. Vektor podľa nároku 15, kde uvedené rol gény sú rol gény obsahujúce rolA, rolB a rolC, ktoré sú prítomné v T-DNA Agrobacterium rhizogenes.

17. Spôsob k produkcii transgénnej rastliny neovplyvnenej markerovým génom, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje nasledujúce kroky:

A) zavedenie vektora do rastlinnej bunky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gén, aspoň jeden morfologickú abnormalitu indukujúci gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, v ktorom je uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén umiestený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a v ktorom je uvedený požadovaný gén umiestnený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom,

B) kultivovanie rastlinnej bunky získané detekovanie morfologicky abnormálneho tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu selektovania uvedeného morfologicky tkaniva, a v kroku (A) , rastlinného kultivácie a abnormálneho

C) kultivovanie uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva selektovaného v (B), detekovanie morfologicky normálneho rastlinného tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selektovania uvedeného morfologicky normálneho tkaniva.

18. Spôsob podlá nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je prítomný v uvedenom odstrániteľnom DNA elemente.

19. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený odstrániteľný DNA element je transpozón.

20. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci s a t ý m, že uvedený odstrániteľný DNA element je odvodený od miestne špecifického rekombinačného systému.

21. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci s a t ý m, že uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je získaný z mikroorganizmu rodu Agrobacte rium.

22. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je gén na syntézu cytokinínu.

23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený gén na syntézu cytokinínu je ipt, izopentenyltransferázový gén, ktorý je prítomný v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.

24. Spôsob podlá nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že kde uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je aspoň jeden gén vybraný z rol génov.

25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci s a t ý m, že uvedené rol gény sú rol gény obsahujúce rolA, rolB a rolC, ktoré sú prítomné v TDNA Agrobacterium rhizogenes.

26. Spôsob k zavedeniu aspoň dvoch požadovaných génov do rastliny, vyznačujúci sa tým, že obsahuje realizáciu nasledujúcich krokov:

A) zavedenie vektora do rastlinnej bunky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gén, aspoň jeden morfologickú abnormalitu indukujúci gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, v ktorom je uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén umiestený tak, že sa elementom a umi e s tený chová integrálne s odstrániteľným v ktorom je uvedený požadovaný l

tak, že sa nechová integrálne

DNA gén s

odstrániteľným DNA elementom,

B) kultivovanie rastlinnej bunky získanej v kroku (A), detekovanie morfologicky abnormálneho rastlinného tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selektovania uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva, a

C) kultivovanie uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva selektovaného v (B), detekovanie morfologicky normálneho rastlinného tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selektovania uvedeného morfologicky normálneho tkaniva.

27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že uvedený m o rfologickú abno rma1i tu indukujúci gén je prítomný v uvedenom odstrániteľnom DNA elemente.

28 . Spôsob podľa nároku 26, vyznač u j ú c i s a tým, že uvedený odstrániteľný DNA e1ement je transpozón. 29 . Spôsob podľa nároku 26, vyznač u j ú c i s a tým, že uvedený odstrániteľný DNA e 1ement

je odvodený od miestne špecifického rekombinačného systému.

30. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je získaný z mikroorganizmu rodu Agrobacterium.

31. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci s a t ý m, že uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je gén na syntézu cytokinínu.

32. Spôsob s a je ipt, prítomný podľa nároku 31, v y tým, že uvedený gén na syntézu cytokinínu izopentenyltransferázový gén, ktorý je v T-DNA

Agrobacterium tumefaciens.

33. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa t ý m, že kde uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén je aspoň jeden gén vybraný z rol génov.

34. Spôsob podlá nároku 33, v sa t ý ώ, že uvedené obsahujúce rolA, rolB a rolC, yznačujú rol gény sú rol ktoré sú prítomné c i gény v TDNA Agrobacterium rhizogenes.

35. Transgénna rastlina bez vplyvu markerového génu produkovaná spôsobom obsahujúcim nasledujúce kroky:

A) zavedenie vektora do rastlinnej bunky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gén, aspoň jeden morfologickú abnormalitu indukujúci gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, v ktorom je uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén umiestnený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a v ktorom je uvedený požadovaný gén umiestnený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom,

B) kultivovanie rastlinnej bunky získanej v kroku (A), detekovanie morfologicky abnormálneho rastlinného tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu kultivácie a selektovania uvedeného morfologicky abnormálneho tkaniva, a sa objaví uvedeného

C) kultivovanie uvedeného morfologicky tkaniva selektovaného v (B), detekovanie normálneho tkaniva, ktoré kultivácie a selektovania normálneho tkaniva, a abnormálneho morfologicky v priebehu morfologicky

D) kultivovanie uvedeného morfologicky normálneho tkaniva na regeneráciu rastliny.

36. Rastlina obsahujúca dva alebo viac požadovaných génov produkovaných spôsobom obsahujúcim nasledujúce kroky:

A) zavedenie vektora do rastlinnej bunky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gén, aspoň jeden morfologickú abnormalitu indukujúci gén ako markerový gén a odstrániteľný DNA element, v ktorom je uvedený morfologickú abnormalitu indukujúci gén umiestnený tak, že sa chová integrálne s odstrániteľným DNA elementom a v ktorom je uvedený požadovaný gén umiestnený tak, že sa nechová integrálne s odstrániteľným DNA elementom,

B) kultivovanie rastlinnej bunky získanej detekovanie morfologicky abnormálneho tkaniva, ktoré sa objaví v priebehu selektovania uvedeného morfologicky tkaniva, a v kroku (A), rastlinného kultivácie a abnormálneho

C) kultivovanie uvedeného morfologicky tkaniva selektovaného v (B), detekovanie normálneho tkaniva, ktoré a selektovania kultivácie sa objaví uvedeného abnormálneho morfologicky v priebehu morfologicky normálneho tkaniva,

D) uskutočnenie krokov A) a C) aspoň jedenkrát, a

E) kultivovanie uvedeného morfologicky tkaniva na regeneráciu rastliny.

normálneho