JPH09508008A - 植物におけるｔｆｄＡ遺伝子選択性マーカーおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は一般的に言えば遺伝子導入細胞及び植物に関する。具体的には、本発明は１）ｔｆｄＡ遺伝子で１またはそれ以上の植物細胞を形質転換することを包含する遺伝子導入植物の選択方法、２）他の外来性マーカー遺伝子を有さず、ｔｆｄＡ遺伝子を含有する植物細胞、および３）ｔｆｄＡ遺伝子を含有するフウ植物細胞、に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 植物におけるｔｆｄＡ遺伝子選択性マーカーおよびその用途 関連出願 この出願は１９９４年１月１１日に出願された米国特許出願０８／１７９，６ ６７号の一部継続出願であり、上記出願の内容はこの出願に参考のために引用さ れているものである。 発明の分野 本発明は遺伝子導入植物細胞および遺伝子導入植物に関するものである。具体 的にいうと、本発明は１）ｔｆｄＡ遺伝子で１もしくはそれ以上の植物細胞を形 質転換した遺伝子導入植物細胞の選択法；２）他の異種マーカー遺伝子を有して いない、ｔｆｄＡ遺伝子含有植物細胞；および３）ｔｆｄＡ遺伝子含有フウ（ス ウィートガム、ｓｗｅｅｔｇｕｍ）植物細胞に関するものである。 発明の背景 ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）は広葉雑草を駆除する除草剤 として用いられてきた。２，４−Ｄ分解経路（第１図）における第１番目の酵素 をコードする遺伝子はｔｆｄＡ遺伝子である。この遺伝子は２，４−Ｄから２， ４−ジクロロフェノール（ＤＣＰ）への変換を触媒するモノオキシゲナーゼをコ ードするものである。ｔｆｄＡ遺伝子を含有する遺伝子導入タバコおよび綿植物 は２，４−Ｄに対する耐性を増大することが示されていた〔Ｓｔｒｅｂｅｒ等、 バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７：８１１−８１６（ １９８９）およびＢａｙｌｅｙ等、セオレティカル・アプリケーション・オブ・ ジ ェネティックス（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）８３：６４５−６４９ （１９９２）〕。これまで、形質転換された植物を識別するためにｔｆｄＡ遺伝 子を選択マーカーとして使用する試みはなされたものの、みな失敗に終っていた 。Ｓｔｒｅｂｅｒ等、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） ７：８１１−８１６（１９８９）は、形質転換細胞はキメラ細胞中では過剰成長 または２，４−Ｄの存在下で急速に発育する非形質転換カルスによって抑制され て茎（ｓｈｏｏｔ）を伸ばすことができないと理論付けている。 発明の要旨 本発明は遺伝子導入植物細胞を選択する方法を提供するものである。 本発明は更にａ）植物細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を用いて１またはそ れ以上の植物細胞を形質転換し、ｂ）該形質転換植物細胞を、非形質転換植物細 胞からの不定茎形成（adventitious shoot formation）または再生を防止する量 の２，４−Ｄと共に培養し、次いでｃ）成長を示している植物細胞を選択するこ とを包含する、遺伝子導入植物の選択方法を提供するものである。 本発明はまた、ａ）植物細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を用いて１または それ以上の植物細胞を形質転換し、ｂ）該形質転換植物細胞を、不定茎形成また は非形質転換植物細胞からの再生を防止する量の２，４−Ｄと共に培養し、ｃ） 成長を示している植物細胞を選択し、次いでｄ）該植物細胞を植物へと再生する ことを包含する、遺伝子導入植物の選択方法を提供するものである。 本発明は更に、他の異種マーカー遺伝子が存在しない植物細胞中で発現し得る ｔｆｄＡ遺伝子を含有する植物細胞、該植物細胞から再生された植物；該植物の 子孫(progeny)または零余子(propagule)；および該子 孫により生産された種子を提供するものである。 本発明は更に、植物細胞中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子を含有するフウ植物細 胞、該フウ植物細胞から再生された植物、該植物の子孫；該植物の零余子；およ び該子孫により製造された種子を提供する。フウにおける除草剤耐性（より具体 的には２，４−Ｄ耐性）は立地準備（ｓｉｔｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）コス トを大きく削減することができ、プランテーションにおけるフウ（Ｌｉｑｕｉｄ ａｍｂｅｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ Ｌ．）の成長を経済的に行ない得るもの である。ｔｆｄＡ遺伝子を含有する遺伝子導入タバコおよび遺伝子導入綿植物が ２，４−Ｄ耐性を増大することは示されていたのであるが〔Ｓｔｒｅｂｅｒ等、 バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７：８１１−８１６（ １９８９）およびＢａｙｌｅｙ等、セオレティカル・アプリケーション・オブ・ ジェネティックス（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）８３：６４５−６４ ９（１９９２）〕、この耐性がフウにも表われるかどうかは知られていなかった 。本発明はｔｆｄＡ遺伝子を含有する遺伝子導入フウ植物細胞を提供するもので ある。 本発明はまた、 （ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子を含有するポリヌクレオチドで １もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該植物細胞を植物に再生し； （ｃ）該再生植物を、形質転換されていない植物を殺す量の除草剤と共に培養し ； （ｄ）成長を示している植物を選択し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を誘発し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズ（母株サイズ、スト ック サイズ）まで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り（ｓｈｅａｒｅｄ）、落 葉した場所（ｄｅｆｏｌｉａｔｅｄ ｓｉｔｅ）に植え；そして （ｉ）このプランティング台木が競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒ ｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地に除草剤を撒 いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉）樹プランテーションを得る方法およびプランテーシ ョンを管理する方法に関するものである。 発明はまた、 （ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子および異種選択性マーカーをコ ードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで１もしく はそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、異種選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細胞 の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物に再生し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を導入し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｉ）このプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔ ｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地 に除草剤を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉）樹プランテーションを得る方法およびプランテーシ ョンを管理する方法に関するものである。 本発明はまた、 （ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子および外来性（異種）選択性マ ーカーをコードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチド で１もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物に再生し； （ｅ）該再生植物を、非形質転換植物を殺す量の除草剤と共に培養し； （ｆ）成長を示している植物を選択し； （ｇ）該植物細胞を植物へと再生し； （ｈ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｉ）該植物中に根形成を誘発し； （ｊ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｋ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｌ）このプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地に除草剤 を撤いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉）樹プランテーションを得る方法およびプラ ンテーションを管理する方法に関するものである。 除草剤耐性遺伝子がｔｆｄＡ遺伝子であり、除草剤は２，４−ジクロロフェノ キシ酢酸であり、該除草剤耐性遺伝子はＡｒａｂｉｄｏｐｉｓからの突然変異性 のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子であるもの、又は 除草剤耐性遺伝子が５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートｓｙｎ ｔｈａｓｅ遺伝子であり、除草剤がグリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）であ るものが好ましいものである。 本発明はまた、プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所 に植え；そしてこのプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔ ｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地 に除草剤を撒いて競争成長を抑制する；ことを包含し、該植物が除草剤耐性遺伝 子を有する硬材（広葉）樹である硬材（広葉）樹プランテーションを得る方法お よびプランテーションを管理する方法に関するものである。 本発明はまた、除草剤耐性遺伝子を有する硬材（広葉樹）である硬材（広葉樹 ）プランテーションに関するものである。 除草剤耐性遺伝子がｔｆｄＡ遺伝子、Ａｒａｂｉｄｏｐｉｓからの突然変異性 のアセトヒドロキシ酸シンダーゼ遺伝子、又は５−エノールピルビルシキメート −３−ホスフェートシンターゼ遺伝子であるものが好ましいものである。 本発明の更なる目的および利点は以下に続く記載から明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第１図 ２，４−Ｄの分解経路である。遺伝子の名称は各酵素に対する括弧内に 示されている。 第２図 ｐＵＣＷ１０１の構築図 第３図 ｐＵＣＷ２００の構築図 第４図 ｐＢＩ１２１の構築図 第５図 カナマイシンによって選択されたフウ２０４０のＥＬＩＳＡである。 第６図 ２，４−Ｄまたはカナマイシンによって選択されたフウ２０２７のＥＬ ＩＳＡである。 第７図 Ｓｔｒｅｂｅｒ等、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ）７：８１１−８１６（１９８９）の第３図からのｔｆｄＡ遺伝子の配列で ある。 定義 「植物」とは、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）および裸子植物を包 含し光合成ができる多細胞に分化した有機体に関するものと解すべきである。 「植物細胞」とは植物の構造的および生理学的単位に関するものと解すべきで ある。「植物細胞」は植物の一部または植物由来のいずれの細胞をも指すもので ある。本発明に包含される細胞としては生きている植物の一部である分化細胞； 培養物中の分化細胞；培養物中の未分化細胞；カルスまたは腫瘍のような未分化 組織の細胞が挙げられる。 「植物細胞子孫」はいずれの細胞、カルスを含めて植物細胞由来の組織；茎、 根、果実、葉または花のような植物の一部；植物；植物種子；花粉および植物胚 を指すものである。 「零余子」とは性的にまたは非性的に即ちｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔ ｒｏ で増殖し得る植物性物質を指すものである。零余子は再生植物の原形質体、 細胞、カルス、組織、胚または種子からなるものである ことが好ましい。 「遺伝子導入植物」とはその遺伝子物質中に安定に導入された外来性のＤＮＡ を安定して有している植物を指すものである。この用語はまた、種々の形で細胞 または原形質体中に導入され得る外来性ＤＮＡを包含するものであり、例えば環 状、直線状または多重高次コイル状の裸のＤＮＡ、ヌクレオゾームやクロモゾー ムあるいは核に含有されるＤＮＡまたはそれらの一部、他の分子を複合または結 合しているＤＮＡ、リポソーム中に封入されているＤＮＡ、スフェロプラスト、 細胞またはプロトプラストがその例として挙げられる。 発明の詳細な説明 本発明は遺伝子導入植物細胞を選択する方法に関するものである。本発明の一 つの態様としては、ａ）植物細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を用いて１また はそれ以上の植物細胞を形質転換し、ｂ）該形質転換植物細胞を、不定茎形成ま たは非形質転換植物細胞からの再生を防止する量の２，４−Ｄと共に培養し、次 いでｃ）成長を示している植物細胞を選択することを包含する、遺伝子導入植物 の選択方法に関するものである。 本発明の他の態様としては、ａ）植物細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を用 いて１またはそれ以上の植物細胞を形質転換し、ｂ）該形質転換植物細胞を、不 定茎形成または非形質転換植物細胞からの再生を防止する量の２，４−Ｄと共に 培養し、ｃ）成長を示している植物細胞を選択し、次いでｄ）該植物細胞を植物 へと再生することを包含する、遺伝子導入植物の選択方法に関するものである。 形質転換できる植物はどれも本発明の範囲に包含されるものである（好ましく は双子葉植物）。このような植物としては、例えばオランダ イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ハス（Ｌｏｔｕｓ）、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａ ｇｏ）、（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、シロツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、（ Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、（Ｖｉｇｎａ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ）、アマ（Ｌ ｉｎｕｍ）、ゲンノショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏ ｔ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ）、（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、カラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ） 、（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、チョウセンアサガオ（ Ｄａｔｕｒａ）、（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏ ｎ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ツクバネアサ ガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、（Ｍａｊｏｒａ ｎａ）、チコリ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、 アキノノゲシ（Ｌａｃｔｕｃａ）、キツネガヤ（Ｂｒｏｍｕｓ）、クサスギカズ ラ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、（Ｈｅ ｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、（Ｎｅｍｅｓｉａ）、テンジクアオイ（Ｐｅｌａｒｇ ｏｎｉｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ） 、キンポウゲ（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、（Ｓｅｎｃｉａ）、（Ｓａｌｐｉｇｌ ｏｓｓｉｓ）キウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、（Ｂｒｏｗａｌｉａ）、グリシン（Ｇ ｌｙｃｉｎｅ）、ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、コムギ （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）、 セロリ（Ａｐｉｕｍ）そしてチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ）属からの種が 包含される。 好適な双子葉性森林種（硬材（広葉樹））としては例えばアラビアゴムノキ（ Ａｃａｃｉａ）、イロハモミジ（Ａｃｅｒ）、マタタビ（Ａｃ ｔｉｎｉｄｉａ）、ネムノキ（Ａｌｂｉｚｚｉａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、 （Ａｍｅｌａｎｃｈｉｅｒ）、（Ａｔｒｉｐｌｅｘ）、シラカンバ（Ｂｅｔｕｌ ａ（Ｂｉｒｃｈ））、（Ｂｒａｃｈｙｃｏｍｅ）コウゾ（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔ ｉａ）、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、ペカン（Ｃａｒｙａ）、クリ〔Ｃａｓｔ ａｎｅａ（Ｃｈｅｓｔｎｕｔ）〕、キササゲ（Ｃａｔａｌｐａ）、キナ（Ｃｉｎ ｃｈｏｎａ）、ハシバミ（Ｈａｚｅｌｎｕｔ）、（Ｄｉｏｓｐｙｒｕｓ）、ユー カリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ブナ（Ｆａｇｕｓ（Ｂｅｅｃｈ））、イチジク （Ｆｉｃｕｓ）、トネリコ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ（Ａｓｈ））、（Ｇｌｅｄｉｔｓ ｉａ）、（Ｈａｍａｍｅｌｉａ）、キヅタ（Ｈｅｄｅｒａ）、モチノキ（Ｉｌｅ ｘ）、カルミア（Ｋａｌｍｉａ）、フウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂａｒ（Ｓｗｅｅｔ ｇｕｍ））、ユリノキ（Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）、（Ｍｏｇｈａｎｉａ）、 クワ（Ｍｏｒｕｓ）、キリ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ） 、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）、カシワ（Ｑｕｅｒｃｕｓ（Ｏａｋ））、シャクナゲ （Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ）、シダレヤナ ギ（Ｓａｌｉｘ）、白檀（Ｓａｎｔａｌｕｍ）、ナンキンハゼ（Ｓａｐｉｕｍ） 、（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ）、チーク（Ｔｅｃｔｏｎａ）、（Ｔｕｐｉｄａｎｔ ｈｕｓ）、ニレ（Ｕｌｍｕｓ（Ｅｌｍ））そしてコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ）属からの種が包含される。 植物の形質転換技術はこの分野でよく知られているものであり、直接形質転換 〔マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、モレキュラー・オブ・ジェネ ラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）２０２：１７９ −１８５（１９８５）を包含するが、これに限定されることはない〕、ポリエチ レングリコール形質転換〔Ｋｒｅｎ ｓ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９６：７２−７４（１９８２）〕、高速弾 道侵入(high velocity ballistic penetration)〔Ｋｌｅｉｎ等、ネイチャー（ Ｎａｔｕｒｅ）３２７：７０−７３（１９８７）〕、ミニ細胞、細胞、ライソソ ーム、または他の融合性脂質表面体のような他の単位と原形質体との融合〔Ｆｒ ａｌｅｙ等、プロシーディング・オブ・ナシュナル・アカデミー・オブ・サイエ ンス（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７９：１８５９−１８ ６３（１９８２）〕、電子穿孔法〔Ｆｋｏｍｍ等、プロシーディング・オブ・ナ シュナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．）ＵＳＡ ８２：５８２４（１９８５）〕および米国特許第５，２３１，０ １９号に記載された技術、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ仲介形質転換〔Ｈｏｃｋｅｍａ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０３： １７９（１９８３）、ｄｅ Ｆｒａｍｏｎｄ等、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１：２６２（１９８３）、Ｆｒａｌｅｙ等、ＷＯ８４ ／０２９１３、ＷＯ８４／０２９１９およびＷＯ８４／０２９２０、Ｚａｍｂｒ ｙｓｋｉ等、ＥＰ１１６，７１８、Ｊｏｒｄａｎ等、プラントセルリポーツ（Ｐ ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）７：２８１−２８４（１９８８）、Ｌｅ ｐｌｅ等、プラントセルリポーツ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）１ １：１３７−１４１（１９９２）、Ｓｔｒｕｐ等、プラントフィジオロジー（Ｐ ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）９２：１２２６−１２３２（１９９０）およびＫ ｎａｕｆ等、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）８：４５−５４（１９８２）〕等が ある。形質転換の好ましい１つの方法は、Ｈｏｒｓｃｈ等、サイエンス（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ）２２７：１２２９−１２３０（１９８５）に記載されているリーフデ ィスク(leaf disc)形質転換で ある。 上記の各種形質転換技術はｔｆｄＡ遺伝子又は植物中で発現可能なその一部を 利用することができる。ｔｆｄＡ遺伝子の範疇にはｔｆｄＡ遺伝子の変外来性、 類似化合物、種、対立遺伝子(alleic)および突然変異体の他、その機能的誘導体 が含まれる。 分子の「断片」とはアミノ酸またはヌクレオチド遺伝子配列のいずれの部分を も意味するものである。 配列の「機能的誘導体」とはその蛋白質または核酸配列の生物学的活性と実質 的に同一の生物活性（機能的もしくは構造的）を有する分子である。 核酸の「変外来性」とは該核酸と構造および生物活性において実質的に等しい 分子またはその一部を指すものである。即ち、２つの分子が共通の活性を有し互 いに代替可能である場合：両者はその核酸配列が一致していなくても「変外来性 」と呼ぶことができる。 蛋白質または遺伝子配列の「類似体」とは記載されている蛋白質または遺伝子 配列と機能において実質的に等しい蛋白質または遺伝子配列を意味するものであ る。 「対立遺伝子」とはクロモソーム上に与えられた遺伝子座を占める遺伝子の別 の形態である。 「突然変異」とは遺伝子物質における検出し得る変化で、この変化は娘細胞お よび突然変異細胞または突然変異個体にまで世代を継続して伝達され得るものの いずれかを意味するものである。突然変異細胞の子孫が多細胞有機体における体 細胞にのみ生じる場合には細胞の突然変異点および変異域が起こることになる。 性的に再生産する有機体の生殖細胞系における突然変異は生殖体によって次世代 へと伝達され、体細胞およ び生殖細胞の両者において新しい突然変異状態を有する個体となるのである。突 然変異は識別可能で、化学的もしくは物理的形態、自然のものでない変化、突然 変異性、複製、表現型機能に影響を及ぼす変化のいずれでも、またその組合わせ でもよく、１以上のデオキシリボヌクレオチドの組換えであることもでき、ヌク レオチドが追加、削除、置換、転化もしくは転化を伴うこともある新しい位置へ の転位を指すものである。突然変異は自然に起こることもあり、突然変異原の適 用により実験的に導入することもできる。核酸分子の突然変異体は突然変異から 生ずる。突然異変ポリペプチドは突然変異核酸分子から生ずる。 「種」とは実際にまたは潜在的に自然の個体群を外来性交配するグループであ る。核酸分子または蛋白質の範囲内での種の変化は種の中で生じる核酸またはア ミノ酸配列における変化であり、問題となっている分子のＤＮＡ配列解析によっ て決定することができる。 第７図（配列番号：１）に記載されているｔｆｄＡ遺伝子は機能的に同等の分 子を提供するかぎり、置換、追加または削除によって変更することができる。ヌ クレオチドをコードする配列の縮退のため、第７図（配列番号：２）に記載され ているものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明 の実施に際し用いることができる。これらは第７図（配列番号：１）に記載され たｔｆｄＡ遺伝子の全部または一部を含有するヌクレオチド配列、これらはこの 配列の範囲内で機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なったコドンの置換 により変更されており、これによって外には表われない変化を起こしているもの を包含するが、これらに限定されることはない。 与えられた核酸配列のこのような機能的変更は、それに融合された外来性の核 酸配列によってコードされる外来性蛋白質の分泌を促進し、お よび／又はプロセッシングするチャンスを与えるものである。したがってｔｆｄ Ａ遺伝子およびその一部のヌクレオチド配列の遺伝子コードで許容される全ての 変更が、本発明に包含されるのである。 更に、ｔｆｄＡ遺伝子は、配列番号：１で示される核酸配列またはその誘導体 の５′−末端および／又は３′−末端に少なくとも１つのヌクレオチドの追加、 削除又は置換によって生ずる核酸配列を含むことができる。この追加、削除又は 置換が、この核酸配列によってコードされる配列番号：２のアミノ酸配列を変え ない限り、どのようなヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも使うことができる 。ｔｆｄＡ遺伝子は必要に応じ、その５′−末端および／又は３′−末端に加え られた制限エンドヌクレアーゼ認識部位をもつことができる。 更に、コンドを削除したり、縮退コドン以外のコドンによって１もしくは２以 上のコドンを置換して構造的に変更したポリペプチドで、変更されていない核酸 分子により製造されるポリペプチドと実質的に同じ有用性もしくは活性を有する ものを製造することができる。この分野で認識されているように、この２つのポ リペプチドは、その核酸分子の間の相違が遺伝子コードの縮退に関係しないもの であったとしても、この２つの核酸分子がその製造を行うことに関して、機能的 に等しいと考えられる。 このｔｆｄＡ遺伝子は、植物で機能し得るプロモーター部位、転写開始部位、 および転写停止配列に結合されることが操作的に好ましい。発現装置中で使用さ れる特別のプロモーターは、本発明において臨界的なものではない。植物細胞に おける転写を進めることのできる多くのプロモーターはいずれも本発明で用いる ことができるものである。このプロモーターは構成成分でもいいし、外部から導 入したものでもよい。植物 中で機能し得るプロモーターとしては自然のＴｉプラスミドに由来するノーパリ ン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼプロモーターおよび他のプロモーター、カリ フラワーモザイクウィルスの３５Ｓおよび１９ＳＲＮＡプロモーター（Ｏｄｅｌ ｌ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１３：８１０−８１２（１９８５））お よび種々の植物プロモーターを含むウィルスプロモーターが挙げられる。選択性 マーカーを含有する遺伝子導入植物を選択する一般的な方法はよく知られており 、例えば、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＬおよびＳｉｍｐｓｏｎ，Ｊ. ，“プラント・モレキュラー・バイオロジー、ア・プラクティカル・アプローチ （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｃ．Ｈ．Ｓｈａｗ編、ＩＲ ＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒ ｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８８）における１３１−１６０頁、”Foreign Gene E xpression in plants”に記載されている。選択性マーカーとしてｔｆｄＡ遺伝 子を使用するために、非形質転換植物細胞からの不定茎形成を抑制し、形質転換 した植物細胞の不定茎形式を許容する２，４−Ｄの量は、1)種々の濃度の２，４ −Ｄを含有する培地上に非形質転換植物細胞を植え、次いで２）この植物細胞に よって不定茎形式を抑制する２，４−Ｄの最小濃度を決定することによって、決 定することができる。この最小濃度が続いて形質転換された植物細胞を選択する ために用いることができる。一般的に、溶解された２，４−Ｄが約０．００１〜 ５ｍｇ／ｌ培養培地の範囲の量で存在するべきである。ｔｆｄＡ遺伝子で形質転 換されたフウ植物細胞に関しては、２，４−Ｄは約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｌ 培養培地の範囲の量で存在するのが好ましい。２，４−Ｄの好ましい量は約０． ０１〜０．２ｍｇ／ｌ培養培地である。形質転換茎培養物の選択のために使用さ れる２，４−Ｄの量は不定茎形 成を抑制する最小２，４−Ｄ濃度を見出すことによって決定される。選択された フウクローンから成長した葉の表面を消毒し次いで細かく切断する。この葉の細 片を次いで０．０１〜５．０ｍｇ／ｌの濃度の２，４−Ｄを含有するＷＰＭ０． １ｍｇ／ｌＮＡＡ、２．５ｍｇ／ｌＢＡ上にのせる。この葉の細片を、対照（２ ，４−Ｄなし）細片が茎を再生するまでインキュベートする。形質転換体の選択 のための２，４−Ｄの理想的濃度は再生を許容しない２，４−Ｄの最小濃度であ る。 他の実施形態においては、本発明は植物細胞中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子を 含有し、他の外来性マーカー遺伝子（好ましくは、他の外来性選択マーカー遺伝 子）を有さない植物細胞、この植物細胞から再生される植物；該植物の子孫もし くは零余子；および該子孫により生産される種子；に関するものである。 植物再生技術はこの分野においてよく知られているものであり、次のような文 献に記載されている技術を包含するものである。：ハンドブック・オブ・プラン ト・セル・カルチャー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕ ｌｔｕｒｅ）１−３巻、Ｅｖａｎｓ等編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（各１９８３、１９８４、１９８４） ；Ｐｒｅｄｉｅｒｉ ａｎｄ Ｍａｌａｖａｓｉ、プラント・セル、ティシュー 、アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎ ｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ）１７：１３３−１４２（１９８９）；Ｊａｍ ｅｓ，Ｄ．Ｊ．等ジャーナル・オブ・プラント・フィジオロジー（Ｊ．Ｐｌａｎ ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１３２：１４８−１５４（１９８８）；Ｆａｓｏｌｏ， Ｆ．等、プラント・セル、ティシュー、アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａ ｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃ ｕｌｔｕｒｅ）１６：７５−８７（１９８９）；Ｖａｌｏｂｒａ ａｎｄ Ｊａ ｍｅｓ、プラント・セル、ティシュー、アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａ ｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ）２１： ５１−５４（１９９０）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．Ｓ．等、プラント・サイ エンス（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ）４２：２０９−２１４；Ｒｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｏｇｄｅｎ、ホルト・サイエンス（Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７ ：１１２７−１１２９（１９９２）；Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｓｏｎ、プラント・セ ル、ティシュー、アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉ ｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ）１５：９５−１０５（１９８ ８）；Ｎｏｈ ａｎｄ Ｍｉｎｏｃｈａ、プラント・セル・リポーツ（Ｐｌａｎ ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）５：４６４−４６７（１９８６）；Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ、プラント・サイエンス（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ｅｎｃｅ）５７：１７３−１７９（１９８８）；Ｂｏｚｈｋｏｖ，Ｐ．Ｖ．等、 プラント・セル・リポーツ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）１１：３ ８６−３８９（１９９２）；Ｋｖａａｌｅｎ ａｎｄ ｖｏｎ Ａｒｎｏｌｄ、 プラント・セル、ティシュー、アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａｎｔ Ｃ ｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ）２７：４９−５ ７（１９９１）；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｔｒｅｍｂｌａｙ、プラント・セ ル、ティシュー、アンド・オーガン・カルチャー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉ ｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ）２７：４９−５７（１９９１ ）；Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｐｕｌｌｍａｎ、（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５ ，０３６，００７）；Ｍｉｃｈｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ、プラント・サイエ ンス（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ）７７：１１１− １１８（１９９１）；Ｗｅｔｚｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｙ．等、プラント・サイエンス （Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ）６４：１９３−２０１（１９８９）；ＭｃＧｒ ａｎａｈａｎ，Ｇ．Ｈ．等、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ）６：８００−８０４（１９８８）；Ｇｉｎｇａｓ，Ｖ．Ｍ．、ホルト・サ イエンス（Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ）２６：１２１７−１２１８（１９９１） ；Ｃｈａｌｕｐａ，Ｖ．、プラント・セル・リポーツ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）９：３９８−４０１（１９９０）；Ｇｉｎｇａｓ ａｎｄ Ｌ ｉｎｅｂｅｒｇｅｒ、プラント・セル、ティシュー、アンド・オーガン・カルチ ャー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ，Ｃｕｌｔｕ ｒｅ）１７：１９１−２０３（１９８９）；Ｂｕｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．等、フィジ オロジー・オブ・プラント（Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ）８５：３０−３４（１９９ ２）；そしてＲｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｒ．等、カナディアン・ジャーナル・オブ・ ボタニー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．）６８：１０８６−１０９０（１９９０） 除草剤耐性の植物は農民が除草剤に耐え得る穀物を植えることを可能にし、こ の穀物に悪い影響を与えることなく雑草に対する処理をこの地に施すことを可能 にする。更にこの除草剤耐性植物を用いることにより、除草剤処理をしておいた 土地で穀物を育てることを可能にするものである。これらの除草剤で処理をした 土地は地中にかなりの量の除草剤を含有することになり、「除草剤持ち越し」と いう現象が見られるのである（米国特許第４，９７５，３７４号）。 通常使用される他の外来性マーカー遺伝子（即ち、外部より導入した遺伝子） は、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等、モレキ ュラー・ジーン・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ）１９９：１８３−１８８（１９８５））；バイアラホス（ｂｉａｌ ａｐｈｏｓ）耐性をコードするｂａｎ遺伝子；グリホセート耐性をコードする突 然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Ｈｉｎｃｈｃｅ等、バイオ／テクノロジー（ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６：９１５−９２２（１９８８））；ブロモキ シニル(bromoxynil)に対する耐性を与えるｎｉｔｒｉｌａｓｅ遺伝子（Ｓｔａｌ ｋｅｒ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）２６３：６３１０−６３１４（１９８８））；イミダゾリノンまた はスルホニルウレア耐性を与える突然変異のアセトラクターゼシンターゼ遺伝子 （ＡＬＳ）（ヨーロッパ特許第１５４，２０４号）；メトトレキセート耐性ＤＨ ＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２５００ −１２５０８）のような選択性マーカーを包含し、またβ−グルクロニダーゼ（ ＧＵＳ）またはＲ−ｌｏｃｕｓ遺伝子の単独またはＣ−ｌｏｃｕｓ遺伝子との組 合せ（Ｌｕｄｗｉｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ８６ ：７０９２（１９８９）：Ｐａｇ−Ａｒｅｓ等、エムボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）６：３５５３（１９８７））を包含するスクリーニングし得るマーカー を包含する。 ｔｆｄＡ遺伝子を有し他の外来性マーカー遺伝子は有さない植物は、一旦植物 に挿入されるとｔｆｄＡ遺伝子も除去しないことにはその除去が不可能である外 来性マーカー遺伝子の除去に有利である。発現される外来性遺伝子の数をできる だけ少なくするために外来性マーカー遺伝子のないことが望まれる。 Ｔｉ−プラスミド ｂｏａｒｄｅｒの間にｔｆｄＡのみを含有するプラスミド は種々の方法で構築することができる。１つの方法は、まずプ ラスミドｐＵＣＷ２００をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、ＮＯＳ−ターミネータ ーの右側にあるＥｃｏＲＩ部位（第４図）のみを切断する。次いでその両端を標 準分子法を用いて平滑にする（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等、モレキュラー・クロ ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｋａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８２））。この線状プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ I IIで消化する。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にあるｔｆｄＡ含有断片 を再溶解し低融点アガロースゲルからそれを切り出すことによって精製する。こ のＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳｓｔ IIで消化 しその両端を平滑にした二要素からなるベクターｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，Ｍ ．，ヌクレイック・アッシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ）１５：８７１１−８７２１（１９８４）中に連結し、次いで、Ｈｉ ｎｄIIIで消化する。得られるプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１中にプラ スミドｐＢＩＮ１９上ではあるがＴｉ−プラスミドの左と右の境界の外にあるカ ナマイシン耐性遺伝子によって与えられるカナマイシン耐性を選択しつつ形質転 換する。 このプラスミドを次いでアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ ４４０４中に移動させ、 次いで標的の植物組織を形質転換するために使用する。 他の態様では、本発明は植物細胞中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子を含有するフ ウ植物細胞；該フウ植物細胞から再生される植物；該植物の子孫；該植物の零余 子；および該子孫により製造される種子に関するものである。 歴史的に見て、プランティング前に非常に念入りな場所の準備がなされたとき には、切り倒された森林地帯、古い農地および川沿いの低地での硬材（広葉樹） プランテーションの設立は常に成功している（Ｈｕｎｔ，ハードウッド・ショー ト・コース（Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ）、Ｎｏｒｔｈ Ｃ ａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９７３），６３−７１ 頁）。要求される立地の準備法の例が「ハードウッド・プランテーション・マネ ージメント（Ｎａｒｄｗｏｏｄ Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ）」（Ｍａｌａｃ，Ｂ．Ｆ．およびＨｅｅｒｅｎ，Ｒ．Ｄ．，サザン・ジャーナ ル・オブ・アプライド・フォレストー（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ３：３−６（１９７９））。通常、場 所の準備には刈り込み、かきならし、およびくわを入れまたは苗床にするという 決まりきった操作を必要とする。製造された植える場所を、競合的な制御のため に除草剤を直接まけるようにきれいに平らにする。 除草剤を直接まくことが、硬材（広葉樹）を殺すことを避けるために必要であ る。この集中的な場所の準備が高価につくばかりでなく、重い機械による上の圧 縮やかきならしによる表面土壌（ｔｏｐ ｓｏｉｌ）がなくなることによる場所 の崩壊につながる。この集中的な場所崩壊は低収量ということになるのである。 遺伝子工学的に除草剤耐性とされた硬材（広葉樹）を植えた場合には、場所を 準備する際の要求が大巾に軽減されることになる。除草剤は空中撒布によって適 用することができる。それ故、この場所は平均にならす必要がなくなる。このこ とはくわを入れたりならしたりする必要を排除することになる。競争制御に要求 される草刈り、および耕耘も軽減され ることになる。立地の準備の軽減は土のしめ固めの軽減および表土の喪失、立地 の崩壊の軽減にもつながり、ひいては収量の増大に結びつくのである。 除草剤耐性硬材（広葉樹）を植えることは従来の苗植えまたは根ざしに関して いくつかの利点をももたらす。この利点は手植えおよび１エーカー当りの茎数に も及ぶ。除草剤は空中撒布できるのでトラクターのための真直な列が必要とされ ないため、手植えが可能である。列の間をトラクターが操作していくために要求 される制限が必要でないので１エーカー当りより多くの苗を植えることができ、 それは収量の増大につながるのである。 除草剤２，４−Ｄに対する耐性は、フウ中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子をフウ ゲノム中へ導入することによってフウに与えることができる。このｔｆｄＡ遺 伝子はフウ中に、上記で概要を示した形質転換技術またより好ましくは次の文献 に記載された形質転換技術によって導入することができる。Ｃｈｅｎ，Ｚおよび Ｓｔｏｍｐ．Ａ．（１９９１）「Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｃｅを用いるＬｉｑｕｉｄａｍｂｅｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ（フウ） のトランスフォーメーション（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ｕｓｉｎｇ Ｌｉｑｕｉｄａ ｍｂｅｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ（フウ））Ｉｎ・Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ２ １回Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｃ ｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１９９１年６月１７日〜２０日、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，Ｔ Ｎ．ｔｆｄＡ遺伝子はプラスミド上に植物中で機能するプロモーター領域、転写 開始部位および転写終止配列に操作可能に結合されることが好ましい（これらの 例は上で挙げている）。１つの好ま しい態様においては、ｔｆｄＡ遺伝子は外来性のマーカー遺伝子（上述の）に結 合される。本発明はまた、 （ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子を含有するポリヌクレオチドで １もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該植物細胞を植物に再生し； （ｃ）該再生植物を、形質転換されてない植物を殺す量の除草剤と共に培養し； （ｄ）成長している植物を選択し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を誘発し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｉ）このプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地に除草剤 を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを管理する方法に関するもので ある。 本発明はまた、 （ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子および外来性選択性マーカーを コードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで１もし くはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物へと再生し； （ｅ）該植物を増殖させて沢山の植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を導入し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｉ）このプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地に除草剤 を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを管理する方法に関するもので ある。 本発明はまた、 （ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子および外来性選択性マーカーを コードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで１もし くはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物へと再生し； （ｅ）該再生植物を、非形質転換植物を殺す量の除草剤と共に培養し； （ｆ）成長を示している植物を選択し； （ｇ）該植物細胞を植物へと再生し； （ｈ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｉ）該植物中に根形成を導入し； （ｊ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｋ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｌ）このプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地に除草剤 を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを管理する方法に関するもので ある。 本発明はまた、プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所 に植え；そしてこのプランティングストックが競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔ ｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地 に除草剤を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含し、 該植物が除草剤耐性遺伝子を有する硬材（広葉樹）である硬材（広葉樹）プラ ンテーションを管理する方法に関する。 本発明はまた、除草剤耐性遺伝子を含有する硬材（広葉樹）を有する硬材（広 葉樹）プランテーションに関するものである。硬材（広葉樹）としてはフウが好 ましい。 一般的に、除草剤耐性硬材（広葉樹）は、ｔｆｄＡ遺伝子のような除草剤を解 毒する蛋白質をコードしたり、Ａｒａｂｉｄｏｐｉｓからの突然変異性アセトヒ ドロキシ酸シンターゼ遺伝子（ヨーロッパ特許出願９１１１９２５４．０，アメ リカン・サイアナミッド・カンパニー）のような除草剤の作用に感受性でない蛋 白質をコードする遺伝子を形質転換 することによって構築することができる。除草剤耐性を与えることができる遺伝 子の他の例としては、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシン ターゼ遺伝子（米国特許第４，９４０，８３５号、モンサントコンパニー）が挙 げられ、このものは除草剤グリホセートに耐性である。これらの遺伝子を目的の 植物中に形質転換したものの選択は、カナマイシン耐性遺伝子のような選択性マ ーカー遺伝子の存在下で選択することによって行うことができる。非形質転換細 胞の再生を抑制する濃度のカナマイシンを含有する培地中で標的とする組織をイ ンキュベートすることによって行われる。或いは、非形質転換細胞の再生を抑制 する濃度の除草剤の存在下で再生物を選択することによって、または選択をする ことなく再生を行い、次いで非形質転換植物の成長を抑制する量の除草剤を含有 する培地上で形質転換が推定される形質転換体を成長させることによって除草剤 耐性遺伝子の存在を再生植物についてスクリーニングすることによって行われる 。ｔｆｄＡ遺伝子以外の除草剤耐性遺伝子の形質転換体を選択する好ましい方法 は、まずカナマイシンの存在下で再生物を選択し、次いで非形質転換植物にとっ ては毒性である量の除草剤を含有する培地上でそれらをインキュベートすること により再生植物をスクリーニングするものである。プランテーションというのは 栽培されている大多数の樹の群である。トリプルスーパーホスフェートまたはジ アンモニウムホスフェートのような栄養分をこの場所の土に添加することが好ま しい。Ｄａｖｅｒｙ，Ｃ．Ｄ．Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９７３ ）、Ｐ．Ｐ．７２−７５）、および「Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」（Ｍａｌａｃ，Ｂ．Ｆ．およびＨｅｅｒｅｎ，Ｒ．Ｄ ．、サザン・ジャーナル・ オブ・アプライド・フォレストリー３：３−６（１９７９））を参照されたい。 更に加えて、プランティングストックを植える前にこの場所はくわを入れること ができる。 本発明はまた、刈り込んで落葉した場所にストックサイズで植物を植え、競争 成長抑制なしにプランティングストックが茂ることができるまでその場所全体に 除草剤を適用して競争成長を抑制し、この植物はｔｆｄＡ遺伝子を含有する硬材 （広葉樹）である。硬材（広葉樹）プランテーションの製造方法および該プラン テーションの管理法に関するものである。この植物は好ましくはフウである。 本発明を実施例で更に詳しく説明するが、本発明を限定するものではない。 実施例 プロトコールおよび実験の詳細は次に続く実施例を参照されたい。 ａ．株および成長条件 本実施例で用いられている細菌株およびプラスミドを第１表に、また培地成分 は第２表および第３表に示す。プラスミドｐＲＯ１０１またはプラスミドｐＲＯ １７２７を含有する緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐ ＡＯ１ｃを５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（ＴＣ⁵⁰）を含有するＴＮＡプレ ート上で３７℃で成長させた。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１ｃ（ｐＵＣ Ｗ１０１；第２図）を５００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｃｂ⁵⁰）を含有する ＴＮＡプレート上で３７℃で成長させた。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰＰＯ３００（ｐ ＵＣＷ２００；第３図）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１ ０１（ｐＢＩ１２１；第４図）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（ｐＵＣＷ２０ ０；第３図）を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ⁵⁰）を含 有するＴＮＡ上で成長させた。このＰ．ｐｕｔｉｄａおよびＡ．ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ株は３０℃で成長させ、Ｅ．ｃｏｌｉ株は３７℃で成長させた。 ２，４−ＤのＤＣＰへの変換を分析するために、適当な抗生物質を含有する一 晩放置したＴＮＡプレートからの一白金耳の培養物を有する１ｍＭ ２，４−Ｄ 含有Ｂｕｒｋ’ｓ／ＣＡＡ培地５０ｍｌに播種することによって、Ｐ．ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１ｃ（ｐＵＣＷ１０１）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰＰＯ３０ ０（ｐＵＣＷ２００）およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４（ｐ ＵＣＷ２００）を、成長させた。これら液体培養物を３０℃で４時間振盪し、次 いで濾過消毒した。この消毒した濾過液を以下のようにしてＨＰＬＣにより分析 した。 ｂ．モレキュラー・バイオロジー・メソッズ 適当な抗生物質を含有する１０個のＴＮＡプレートのバクテリア成長物を回収 し、各プレートからの成長物を５ｍｌのＴＥバッファー（５０ｍＭ トリス−Ｈ Ｃｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中に懸濁し、この溶液を２５０ｍｌの 遠心ボトル中に貯蔵し、１０，０００×ｇで５分間遠心分離を行うことによって この細胞をペレット化した。このペレットを２０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍ Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭグルコース， ２ｍｇ／ｍｌリソチーム）に再懸濁し、５分間室温でインキュベートした。新し く製造された（４０ｍｌ）アルカリ性ＳＤＳ溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％Ｓ ＤＳ）を添加した。この細胞をゆるやかに反転させることによって溶解し、氷浴 中で１０分間インキュベートした。酢酸カリウム（５Ｍ溶液 ３０ｍｌ）を添加 し、この溶液を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清をきれい な遠心分離ボトル中にデカンテーションし、２倍容量の９５％エタノールを添加 し、氷浴中１時間インキュベーションしてＤＮＡを沈殿させた。この沈殿物を１ ０，０００×ｇで３０分間、４℃における遠心分離によって回収した。得られた ペレットを氷で冷やしたＴＥバッファー１０ｍｌ中に、該化合物をピペットから ゆっくりと通すことによって再懸濁した。このペレットを再懸濁した後、５ｍｌ の７．５Ｍ酢酸アンモニウムをゆっくりと反転させながら混合した。この溶液を 氷浴中で２０分間インキュベートし、次いで４℃、１０，０００×ｇで１０分間 遠心分離を行った。この上清を５０ｍｌ遠心分離管にデカンテーションし、０． ３１３容量の４２％ポリエチレングリコール（分子量６０００−８０００）をゆ っくり反転することによって混合した。こ のＤＮＡを４℃で１晩放置することによって沈殿させた。このＤＮＡを４℃で１ ０分間、１０，０００×ｇで遠心分離により回収した。このペレットを８ｍｌの 氷冷ＴＥバッファー中に再懸濁し、次いで８ｇの塩化セシウムに添加した。この 塩化セシウムを溶液にした後、０．６ｍｌのエチジウムブロミド１０ｍｇ／ｍｌ 溶液（蒸留水中）を添加した。この溶液をＴｉ５０ローターを用い４０，０００ ｒｐｍで４２時間、２０℃で超遠心により遠心分離した。塩化セシウム−エチジ ウムブロミド勾配からのプラスミドバンドをパスツールピペットを用いて抜き取 った。エチジウムブロミドをｎ−ブタノール飽和水で数回抽出して除去し、次い でＴＥバッファー溶液中で２回バッファーを交換しながら２４時間透析した。こ の精製されたＤＮＡを−２０℃で貯蔵した。 目的とするプラスミドのための株の通常の分析をミニプレプ（ｍｉｎｉ−ｐｒ ｅｐ）で行った。ＴＮＡ抗生物質プレートから得られた培養物の一白金耳を１０ ０μｌの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）中にうずまき回転させな がら懸濁させた。室温で５分間インキュベーションした後、２００μｌのアルカ リ性ＳＤＳ溶液をゆるやかに反転しながら混合し、次いで溶解した細胞を氷浴中 で１０分間インキュベートした。酢酸カリウム（１５０μｌの５Ｍ溶液）をゆっ くり反転させて混合し、氷浴中のインキュベーションを５分間続けた。この溶解 物を４℃で５分間マイクロ遠心分離（ｍｉｃｒｏｆｕｇａｔｉｏｎ）によってき れいにし、その上清を新しい管にデカンテーションした。１ｍｌの９５％エタノ ールを添加し、この混合物を−７０℃で３０分間インキュベートし、次いで、３ ０分間１マイクロ遠心分離によってＤＮＡを沈殿させた。このペレットを氷冷し た殺菌蒸留水１００μｌ中に再懸濁し、この管をゆっくり反転することによって ５０μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを 混合させた。この混合物を氷水浴中でインキュベートし、２分間マイクロ遠心分 離し、次いで上清を新しい管へデカンテーションした。３００μｌの９５％エタ ノールを添加し、−７０℃で３０分間インキュベーションし、３０分間のマイク ロ遠心分離によってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡペレットを１０分間乾燥に より乾燥させ、次いで４０μｌのＴＥバッファー中に再懸濁させた。以下に示す アガロース・ゲル・電気泳動により分析を行った。 精製されたプラスミドＤＮＡを適当なＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍバッファー中、１〜２μｌの必要なＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ 制限酵素と共に３７℃で１時間インキュベートして、制限エンドヌクレアーゼ消 化を行った。７０℃で１０分間インキュベートして不活性化し、更に氷水浴中で １０分間インキュベートした。 制限エンドヌクレアーゼで消化した２つのＤＮＡ断片を混合し、１／１０容量 の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２倍容量の９５％エタノールを添加してＤＮ Ａ連結を行った。この溶液中のＤＮＡを−７０℃で３０分間インキュベートし、 次いでマイクロ遠心分離管中４℃で３０分間遠心分離することによって沈殿させ た。このペレットを１００μｌの氷冷した殺菌蒸留水中に１５秒間渦巻き撹拌し つつ再懸濁した。再懸濁ＤＮＡは上記の酢酸アンモニウム−エタノール法により 再沈殿させた。第２回目の沈殿後、ＤＮＡペレットを１０分間真空乾燥により乾 燥させ、１６μｌの氷冷した殺菌蒸留水中に再懸濁し、４μｌの５×Ｇｉｂｃｏ −ＢＲＬリガーゼバッファーを添加した。この連結混合物を室温で２時間インキ ュベートし、次いで３０μｌの氷冷した殺菌蒸留水を添加することによりインキ ュベートを停止した。 アガロースゲル電気泳動によりプラスミドおよびＤＮＡ断片の分析を 行った。このゲルは、アガロースゲルをＴＡＥバッファー（４０ｍＭトリス−ア セテート、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に、最終濃度０．７％となるまで添加する ことによって製造した。１５ｃｍ²のゲルは総容量１００ｍｌでありミニ−ゲル は総容量２５ｍｌであった。このアガロースバッファー溶液をマイクロウェーブ 中５０℃まで昇温して融解し、次いでゲル型に注ぎ入れ２０分間で固化させた。 この鋳造ゲルをゲルボックス中に入れ、ＴＡＥバッファー中に浸した。上記ＤＮ Ａをウェル中に入れ、１５ｃｍ²ゲルについては１００ボルトで２．５時間電気 泳動し、ミニ−ゲルについては１３０ボルトで４５分間電気泳動した。ＤＮＡは 、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミド溶液を含有する３００ｍｌの水 中で２０分間ゲルを染色し、次いで該ゲルを３０５ｎｍでＵＶ光をあてて可視化 した。このゲルをＦｉｓｈｅｒ Ｂｒａｎｄフォトドキュメンテーションシステ ムでポラロイド６６０フィルムを用いて写真を撮った。 低融点アガロースゲルをこのゲルを１％とし、ゲルを４℃で泳動させるように 変更する以外は上述のようにして電気泳動した。このＤＮＡをエチジウムブロミ ド染色により可視化し、次いで目的とするフラグメントをゲルから切り出した。 １００μｌのＴＥバッファーを添加してゲルマトリックスから切り取ったフラグ メントを流出し、７０℃で１０分間インキュベートした。等容量のＴＥ飽和フェ ノールを添加し、次いでゆっくり撹拌して混合させた。サンプルを４℃で３分間 マイクロ遠心分離して相を分解した。最上の（水性）層を回収し、続いてフェノ ール層を等容量のＴＥバッファーで２回以上抽出した。この水性層をプールしフ ェノール：クロロホルムの１：１混合物で１回、次いでクロロホルムで１回抽出 した。１／１０容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、２倍容量の ９５％エタノールを添加し、−７０℃で３０分間インキュベートし、次いで３０ 分間マイクロ遠心分離することによってＤＮＡを沈殿させた。このペレットを１ ０分間真空乾燥し、次いで１００μｌのＴＥバッファー中に再懸濁させた。 ｃ．形質転換および接合法 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１ｃの形質転換をＭｅｒｃｅｒ等〔Ｍｅｒ ｃｅｒ，Ａ．Ａ．およびＬｏｕｔｉｔ，Ｊ．Ｓ．、ジャーナル・オブ・バクテリ オロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１４０：３７−４２（１９７９）〕に記 載のようにして行った。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１をＭａｎｉａｔｉｓら〔Ｍａ ｎｉａｔｉｓ，Ｔ等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュ アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）〕に記載されたよう にして形質転換を行った。 プラスミドｐＵＣＷ２００をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１からＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰＰＯ３００またはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４への接合に よる転移を、この系を３０℃でＬＢ培地または５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｅ ．ｃｏｌｉＳ１７−１）を含有するＬＢ中成長させ、各培養物を当量ずつ混合し 、該混合物を滅菌した０．２２μｍフィルターを通過し、このフィルターをＬＢ プレート上に置くことによって行った。このプレートを３０℃で１晩インキュベ ートし、続いてフィルターを５ｍｌの殺菌蒸留水で洗浄し、次いで０．２％コハ ク酸塩および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＢｕｒｋ’ｓ塩上にこの細 胞懸濁液の希釈液をプレーティングした。これらプレートを３０℃で４８ 時間インキュベートし、次いでこの接合物を同じ培地に再線状接種することによ って精製した。 ｄ．２，４−ＤおよびＤＣＰに対するＨＰＬＣ分析 Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ８カラム、７０：３０メタノール：水の１ｍｌ／分の移動 層を用い、２０μｌ注入で２８０ｎｍでの検出によりＨＰＬＣ分析を行った。既 知の標準物のピークの保持時間との比較により、ピークを同定した。 実施例１ プラスミドｐＵＣＷ１０１の構築 ｐＵＣＷ１０１（第２図）を構築するために、２，４−Ｄのクロロマレイル酢 酸への崩壊のための全酵素をコードするプラスミドＰＲＯ１０１を制限エンドヌ クレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。ｔｆｄＡ遺伝子を含有す るＤＮＡ断片を低融点アガロースゲルから単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼ で消化したベクタープラスミドＰＲＯ１７２７中に結合させた。この結合ＤＮＡ をＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１ｃ中に形質転換し、目的の挿入物を有す る形質転換体をＴＮＡＣｂ⁵⁰⁰上での成長のためのプレーティングによって選択 し、次いでＤＮＡＴｃ⁵⁰およびＴＮＡＣｂ⁵⁰⁰にレプリカプレーティングした。 Ｔｃ感受性（挿入による不活性化のため）およびＣｂ耐性の正しいフェノタイプ を有する菌株を該プラスミドＤＮＡの単離およびＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII による液化によって更に確認した。この消化されたプラスミドＤＮＡをアガロー スゲル電気泳動により分析し、目的とするフラグメントがクローニングされたこ とを確認した。このプラスミドをｐＵＣＷ１０１と命名した（第２図）。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１ｃ中のプラスミドｐＵＣＷ１０ １上でのｔｆｄＡの発現を、２，４−Ｄの存在下でのこの菌株の成長およびＨＰ ＬＣによるＤＣＰの検出によって確認した。 実施例２ プラスミドｐＵＣＷ２００の構築 Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ベクターｐＢＩ１２ １（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌ ｔｏ，ＣＡ；第４図に示されている）を用いてフウ中へのトランスファーおよび ｔｆｄＡの安定な発現を行った。ｐＢＩ１２１はカリフラワー・モザイク・ウィ ルス３５プロモーターの転写および翻訳スタートコドン、転写終止およびポリア デニル化部位およびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子からの翻訳終止コドン を有している。ｐＢＩ１２１はまた左右のＴ−ＤＮＡ境界（ｂｏｒｄｅｒｓ）（ ＬＢおよびＲＢ）を有し、これらは植物細胞の形質転換のために使用される配列 である（Ｚａｍｂｒｉｓｋｉ等、セル（Ｃｅｌｌ）５６：１９３−２０１（１９ ８９）およびＺａｍｂｒｉｓｋｉ等、アニュアル・レビュー・プラント フィジ オロジー・アンド・モレキュレー・バイオロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎ ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．＆Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：４６５−４９０ （１９９２）を参照されたい。これらの境界の間のＤＮＡが挿入され次いでその 植物の染色体ＤＮＡによって増殖される。 プラスミドｐＵＣＷ２００を創製するプラスミドｐＢＩ１２１中へのｔｆｄＡ のサブクローニングは第３図の流れ図のようにして行われた。プラスミドｐＵＣ Ｗ１０１を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化した。ｔｆｄ Ａ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを低融点アガロースゲルから単離し、次 いで同じ酵素で切断したプラスミド ｐＢＩ１２１中に結合した。この混合物をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１中に形質転 換し、次いで形質転換体をＬＢＫｍ⁵⁰上３７℃で成長させることによって選択し た。形質転換体を取り出して同一の培地で一晩成長させミニ−プレプ分析によっ て挿入物を分析した。正しい挿入物を含有すると考えられる一つの菌株を上述の ようにして該プラスミドＤＮＡを精製することにより更に特徴づけを行い、次い でＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化して挿入体を確認した。このプラスミドをｐＵ ＣＷ２００と命名した（第３図）。このものはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイ ナリーベクターｐＢＩ１２１中にｔｆｄＡ遺伝子を含有している。 プラスミドｐＵＣＷ２００上でのｔｆｄＡの発現を、まず、このプラスミドを Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１からＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰＰＯ３００へと接合により 移転させ、次いで２，４−Ｄの存在下でＰ．ｐｕｔｉｄａ（ｐＵＣＷ２００）を 成長させＨＰＬＣによりＤＣＰを検出させることによってテストした。 プラスミドｐＵＣＷ２００を上述のようにしてＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１から Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４へと移動した。Ａ．ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４におけるプラスミドｐＵＣＷ２００の存在をミニ− プレプ分析により確認した。この菌株中でのｔｆｄＡの発現を２，４−Ｄの存在 下でＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４（ｐＵＣＷ２００）を成長さ せ、次いでＨＰＬＣにより培地中でのＤＣＰの蓄積を示すことによって確認した 。 実施例３ フウに対する２，４−Ｄ毒性 フウ葉片からの外来菌条再生に対する２，４−Ｄの効果を試験した。この２， ４−Ｄ毒性テストの結果を第４表に示す。２種の２，４−Ｄ濃 度を２つのフウクローンでテストした。最高濃度（１．０ｍｇ／Ｌ）ではカルス 組織を形成する葉片となり、一方より低い濃度（０．１ｍｇ／Ｌ）では葉片上に カルスおよび根を形成した。どちらの濃度でも葉片上に茎は認められなかった。 このように、０．１ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄの存在下での不定茎形成は２，４−Ｄ 耐性の指標として用いることができる。 実施例４ フウのｐＢＩ１２１による形質転換 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ仲介形質転換を用いて フウを形質転換した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢ４４０４はベクタープラスミドｐＢＩ１２１（第４図）を植物細胞に転移さ せる能力を有している。一旦植物細胞内に入ると、右（ＲＢ）および左（ＬＢ） 境界の間のＤＮＡはその植物の染色体中に（無作為に）統合される。続いてその 植物のゲノムの一部であるかのようにして複製されていき、この細胞が分裂し茎 に分化されていく と、この不定茎の全細胞は元来の目的とする細胞中に形質転換された遺伝子を含 有している。 本発明で用いられるフウ形質転換法の概略は以下の通りである： １．既知のフウクローンからの広がっている葉を、まず石けん水で洗い、次いで １０％の漂白液（滅菌水中）中で１０分間振とうし、更に滅菌した蒸留水で３回 洗浄（各回２分）して、その表面を殺菌した。 ２．各葉を無菌的に細片（５〜１０ｍｍ）に切断する。細片の内いくらかをＷＰ Ｍ０．１／２．５上に置いた（第２表）。これら細片は再生対照として作用した 。 ３．プラスミドｐＢＩ１２１を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ ＬＢ４４０４を５０ｍｇ／Ｌカナマイシン含有する５０ｍｌの ＬＢ中３０℃で一晩成長させた。翌朝、この培養物を５００ｍｌの同一培地中に 播種し、この菌株を３０℃で４時間成長させた。この細胞を遠心分離（１０，０ ００×ｇで５分）により回収、ＬＢで１回洗浄し、最終的に新鮮なＬＢ１００ｍ ｌに再懸濁した。 ４．葉片をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に３０分間室温で共培養した。この ものを滅菌Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．３フィルターペーパー上に吸い取り乾燥し、 ＷＰＭ０．１／２．５上に置いた。このプレートをパラフィルムで封印し、成長 室でインキュベートした。 ５．３日後、この葉の細片を５００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン（Ｃｂ⁵⁰⁰）を含 有するＷＰＭ０．１／２．５に移した。抗生物質であるカルベニシリンを用いて 残っているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを殺した。 ６．２週間後、非制御葉片を選択性培地に移した。この場合、培地はＷＰＭ０． １／２．５Ｃｂ⁵⁰⁰、カナマイシン７５ｍｇ／Ｌ（Ｋｍ⁷⁵） であった。プラスミドｐＢＩ１２１はカナマイシン耐性遺伝子、ＮＰＴ−II（第 ４図）を含有している。フウは７５ｍｇ／Ｌのカナマイシンに感受性であり、そ の存在下では再生しない。したがってカナマイシンの存在下で生成する不定茎は 耐性遺伝子を含有していると言える。 ７．選択性圧力下再生した茎を葉片から取り出してＷＰＭ０．０１／２．０Ｃｂ⁵⁰⁰ ，Ｋｍ⁷⁵に移した。 ＷＰＭ０．０１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ，２．０ｍｇ／ｌ ＢＡ，Ｃｂ⁵⁰⁰，Ｋｍ^{7 5} 上に成長した、２４個の形質転換されたと推定されるフウ茎が、上記の形質転 換プロトコールにしたがった実験によって得られた。 実施例５ ｐＵＣＷ２００を有するフウの形質転換 フウ形質転換実験をプラスミドｐＵＣＷ２００を有しているＡｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４を用いて、選択（第６段 階）法を変える以外は、上述のようにして行った。葉片の半分を、０．１ｍｇ／ Ｌ ２，４−Ｄを有するＷＰＭ０．１／２．５Ｃｂ⁵⁰⁰上に置き、他の半分を通 常のＷＰＭ０．１／２．５Ｃｂ⁵⁰⁰，Ｋｍ⁷⁵上に置いた。この選択の結果を第５ 表に示す。 実施例６ 形質転換されたフウクローンのＥＬＩＳＡ分析 選択された遺伝子がフウクローン中に転換されていることを確認するために用 いられた分析法は、プラスミドＰＢＩ１２１上にカナマイシン耐性遺伝子により コードされたＮＰＴII蛋白質の検出のための酵素結合免疫吸着検定分析（ＥＬＩ ＳＡ）である。（ＮＰＴＴ II ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，プライムリポート（Ｐｒ ｉｍｅ Ｒｅｐｏｒｔ）３（２）：３（１９９１））。植物組織（１００〜８０ ０ｍｇ新鮮重量）を３ｍｌの抽出バッファー（０．２５Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐ Ｈ７．８，０．１ｍＭ フェニルメチルスルホニル フルオライド）中に置きそ してＴｅｋｍａｒ Ｔｉｓｓｕｉｚｅｒ，モデルＴＲ−１０（マイクロプローブ を具備）を用いて各３０秒間のパルス２回でホモジナイズする。追加の２ｍ ｌの抽出バッファーを添加し、５０，０００ＲＰＭで４℃で２０分間超遠心によ り細胞破片を除去する。上清を回収し４倍容量の氷冷アセトンを加え、続いて− ２０℃で４時間または一晩インキュベートする。沈殿した蛋白質を４℃、１０， ０００ＲＰＭで２０分間遠心分離して回収する。このペレットを１ｍｌの抽出バ ッファー中に再懸濁する。このサンプルを、５ｐｒｉｍｅ−３ｐｒｉｍｅ，Ｉｎ ｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯから購入したＮＰＴ−II ＥＬＩＳＡキットで使用 する。 このＥＬＩＳＡ法は、カナマイシン耐性蛋白質（ネオマイシンホスホトランス フェラーゼ、ＮＰＴ−II）に対して特異的な抗体を使用し、フウ形質転換体と推 定されるものの細胞質分各化画中の蛋白質を検出することを包含する。この蛋白 質の存在は、それをコードする遺伝子がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４ベクタープラスミド ｐＢＩ１２１上に位置し ているので、形質転換の指標となるのである。このプラスミドはＡ．ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４により目的の植物細胞中に形質転換され、この植 物のゲノム中に入り込みその遺伝子を発現する。このプラスミド上の遺伝子は物 理的に結合しているので、該遺伝子産物の１つの存在はこのプラスミド上に位置 する他の遺伝子の存在を証明するものである。例えばプラスミドｐＵＣＷ２００ 、これは２，４−Ｄ耐性プラスミドでありカナマイシン耐性遺伝子も有するが、 で形質転換した植物抽出物中のＮＰＴ−II蛋白質の存在は２，４−Ｄ耐性遺伝子 の存在の明確な証明である。 実施例７ フウ／ｐＢＩ１２１構築のＥＬＩＳＡの結果 ｐＢＩ１２１形質転換実験から得られる上記の２４個の茎の内、１５個だけが カナマイシンに対する更なる選択に生き残った。これら１５個 についてＮＰＴ−IIの存在に対しＥＬＩＳＡにより試験を行った。唯１つのクロ ーン、２０４０．２ｈｒ（ｐＡＧ１２１）だけが、この分析において溶性の結果 を与えた（第５図）。第５図のＥＬＩＳＡの結果はこの抗原希釈液の逆数に対す るＡ₄₀₅ｎｍとして示されている。このケースにおける抗原は植物細胞抽出物で あり、このものは引き続きマイクロタイタープレートにおけるまで希釈する。陽 性反応は、抗原の希釈と関連して吸収が低下していることを示しているものであ る。陽性と考えられる最小限の吸収値は、バックグラウンドの補正後で０．１の Ｏ．Ｄ₄₀₅である。これらの実験の形質転換頻度は６．７％であった。 実施例８ フウ／ｐＵＣＷ２００形質転換体のＥＬＩＳＡの結果 ２，４−Ｄに対し選択されたｐＵＣＷ２００単離物の形質転換頻度測定をカナ マイシンに対し選択された単離体と比較した。ＮＰＴ−IIに対するＥＬＩＳＡを 形質転換頻度の方法として使用した。２，４−Ｄについて選択された４個の単離 体およびカナマイシンについて選択された４個の単離体を測定した。結果を第６ 図に示す。２，４−Ｄで選択したクローンは４個全て〔２０２７（ｐＵＣＷ２０ ０）−ＴＡ，−ＴＣ，−ＴＤおよび−ＴＥと命名〕がＮＰＴ−IIに対し陽性であ り、これらが形質転換されていることを示している。しかしながら、カナマイシ ンで選択したクローンはいずれも〔２０２７（ｐＵＣＷ２００）−ＫＡ，−ＫＢ ，−ＫＣおよび−ＫＤ〕陽性ではなかった。 プラスミドｐＵＣＷ２００は、ｐＢＩ１２１のＧＵＳ遺伝子に代えて２，４− Ｄ耐性遺伝子を持っている点でプラスミドｐＢＩ１２１と異なっている。ｐＢＩ １２１を使用しカナマイシンについて選択する形質転換実験は６．５％の形質転 換頻度を与えたので、この実験で測定した４ つのカナマイシン選択性単離体がいずれも陽性でなかったことは驚くに当らない 。しかしながら、これらの結果はｐＵＣＷ２００のフウ中への形質転換頻度、２ ，４−Ｄについての選択で１００％を確立している。この選択法は標準的なカナ マイシン選択法より非常に良いことは明らかである。 ２，４−Ｄ選択では誤った陽性の単離体を得たことはなかったことは、これが 優れた選択性マーカーであることを示している。また、２，４−Ｄ含有培地上に 置かれたフウ葉片は不定茎を再生しないことを実験は示していた。２，４−Ｄの 存在下で共培養した葉片は不定茎を再生し、１００％のこれら茎は形質転換され ていたので、これらの茎は２，４−Ｄ耐性遺伝子生成物を使用して培地中の２， ４−Ｄを２，４−ジクロロフェノールへ転換した。これらの単離体はこの耐性遺 伝子を発現していることを上記のことは示している。 実施例９ 繁殖方法に関する記載 上記不定茎を０．０１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡおよび２．０ｍｇ／ＬＢＡを含有する ＷＰＭ上で成長させることによりフウを繁殖させた。元来の茎がこの培地上で新 しい茎を形成した。この新しい茎は元来の茎から無菌的に切取り、独立して成長 した。この繁殖は必要とされる数の茎が生成されるまで続けられた。この茎を０ ．５ｍｇ／Ｌ ＢＡ含有するＷＰＭ上でインキュベートすることによって伸長さ せた。１ｃｍ以上の長さに成長した茎を０．１ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ（インドル−３ −酪酸）を含有する１／３の強さのＷＰＭからなる根導入培地（ｒｏｏｔ ｉｎ ｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）上でインキュベートした。根が生成し始めたら、 この小さい植物を、当量の泥炭、パーライトおよびバーミキュライトか らなる無土混合物を含有する栓付きトレー（ｐｌｕｇ ｔｒａｙｓ）に移し、新 しく成長が始まるまで１００％相対湿度中でインキュベートした。この小さい植 物を１０立方インチの濾過チューブ中に移植し、植え付けサイズとなるまで温室 で成長させた。この植物を次いで休眠まで徐々に外気条件にならして行き、上記 チューブから外して準備された場所に植えかえた。この植え付けの前および／ま たは後の一定の時期にこの場所には２，４−Ｄを撒布する。この撒布時期および ２，４−Ｄの濃度は当業者が容易に決められるものである。更に具体的に言えば 、これらの条件はこの場所における形質転換植物以外の植物の成長によって決め られるものである。この場所に撒布される２，４−Ｄの量は１）この場所におけ る非形質転換植物の成長を抑え、そして、２）形質転換植物を成長させるのに充 分な量である。 実施例１０ じゃがいもの形質転換および繁殖 ｔｆｄＡ遺伝子で形質転換したじゃがいも（好ましくはＲｅｓｓｅｔ Ｂｕｒ ｂａｎｋ ｐａｔａｔｏｅｓ）を、１）再生培地が０．１ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ を含有し、２）カナマイシンはこのｔｆｄＡ遺伝子を用いる実験では使用しない という点を除いて、Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ、セオレティカル・アプリケーション・オ ブ・ジュネティクス（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ）７６：７６７−７７ ４（１９８８）に記載されているようにして製造する。 前出のＤｅ Ｂｌｏｃｋに記載された方法を以下に簡単に説明する。： 植物材料 「Ｂｉｎｔｊｅ」、「Ｄｅｓｉｒｅｅ」、「Ｂｅｒｏｌｉｎａ」または「Ｒｕｓ ｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ」の殺菌植物を、その茎の先端または １ｃｍ長さの外植茎（ｓｔｅｍ ｅｘｐｌａｎｔｓ）を補助の芽と共にＳ１培地 に移植してｉｎ ｖｉｔｒｏで繁殖させる。この茎を３０００ルックスの光源Ｏ ｓｒａｍ、ＦＲＧの「ｌｕｍｉｎｅｘ ｗｈｉｔｅ」と「ｎａｔｕｒａ」の混合 物のもと１６時間の日照時間で２３℃で成長させる。 培地 Ｓ１：２０ｇ／ｌシュクロースを有するＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ等、エルスペ リメンタル・セルラー・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．）５０：１５１ −１５８（１９６８））に１５０ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．４％アガ ロースを加えたもの、ｐＨ５．８。 Ｓ２：３０ｇ／ｌシュクロースを有するＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ ｋｏｏｇ、フィジオロジカル・プラント（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ）１５： ４７３−４７９（１９６２））に０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ ｐＨ５．５、２０ｇ／ ｌマンニトールを加えたもの。 Ｓ３：シュクロースを有さないＭＳ培地で２００ｍｇ／ｌグルタミン、０．５ｇ ／ｌ ＭＥＳ ｐＨ５．７、０．５ｇ／ｌ ＰＶＰ、２０ｇ／ｌマンニトール、 ２０ｇ／ｌグルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン-ＳＯ₄、０．５％アガロース、１ ｍｇ／ｌトランス−ゼアチン、０．１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、１ｇ／ｌカルベニシリ ンもしくは０．５ｇ／ｌセホタキシムを加えたもの。 Ｓ４：１０ｍｇ／ｌ ＡｇＮＯ₃を加えたＳ３。 Ｓ５：ＮＡＡを有さず抗生物質の濃度が半分であるＳ３培地。 Ｓ６：１０ｍｇ／ｌ ＡｇＮＯ₃を加えたＳ５。 Ｓ７：０．０１ｍｇ／ｌ ＧＡ３：２５０ｍｇ／ｌカルベニシリンまたは１５０ ｍｇ／ｌセホタキシムを加えたＳ５。 Ｓ８：０．１ｍｇ／ｌ ＧＡ３および１０ｍｇ／ｌ ＡｇＮＯ₃；２５０ｍｇ／ ｌカルベニシリンまたは１５０ｍｇ／ｌセホタキシムを加えたＳ５。 抗生物質、ホルモンおよびＡｇＮＯ₃をオートクレーブで加圧後添加した。Ａｇ₂ Ｓ₂Ｏ₃を１０ｍｇ／ｌ ＡｇＮＯ₃＋１１７ｍｇ／ｌ Ａｇ₂Ｓ₂Ｏ₃・５Ｈ₂Ｏと して添加した。ＭｉｎＡ培地は、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、エクスペリメンツ・ イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ（１９７２））に記載されている。 形質転換、選択および再生 ３〜４週令茎からの葉（３〜１０ｍｍ）を根元で切断した。この葉はこれ以上傷 つけないようにする。約１０枚の傷つけた葉を９ｃｍのペトリ皿中に入れられて いる１０ｍｌの感染培地Ｓ２上に裏を向けて浮かべ、Ｌｕｒｉａブロス培地中で ｌａｔｅ ｌｏｇまで成長させたプラスミドｐＵＣＷ２００を含有する３０μｌ のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４を添 加する。このプレートを次いで低光源（５００ルックス）でインキュベートする 。２日後、この葉を１ｇ／ｌのカルベニシリンまたは０．５ｇ／ｌセホタキシム を含有するＳ２培地で洗浄し、ろ紙上で軽くたたいてかわかし、０．１ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含有するＳ３培地上に裏を向けて置く。このペトリ皿を ガス拡散し得るテープで封印し、次いで高光源（３０００ルックス、Ｏｓｒａｍ 、ＦＲＧからの「ｌｕｍｉｎｅｘ ｗｈｉｔｅ」および「ｎａｔｕｒａ」の混合 物）でインキュベートする。１週間後、これらの葉を新鮮培地に移す。更に２週 間後、沢山の小さなカルスが葉の傷ついた端でつくられ、この葉を「Ｂｅｒｏｌ ｉｎａ」、「Ｂｉｎｔｊｅ」および「Ｄｅｓｉｒｅｅ」のための選択培地Ｓ５お よび「Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ」のための培地Ｓ６に移す。更に２〜３週 間後、カルスを有するこれらの葉を「Ｂｅｒｏｌｉｎａ」、「Ｂｉｎｔｊｅ」お よび「Ｄｅｓｉｒｅｅ」のための培地Ｓ７および「Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎ ｋ」のためのＳ８に移す。この時点から２５０ｍｌのガラスジャーを用いる。 培地中にセホタキシムを使用する際、１０日毎にこれらの葉を新しい培地に移 すことが重要である。２週間後、最初の茎（０．５ｃｍ高さ）を単離し、次いで １００ｍｇ／ｌカルベニシリンまたはセホタキシムを有する根培地Ｓ１に移す。 通常、この茎は約１週間で根を生成する。２週間後にまだ根を生成しない場合、 茎の根元（ｂａｓｅ）から薄いスライスを切り取る。３週間の間に、全ての茎を 刈り取る。同一の茎を単離することを回避するために、同一または近くに結合し たカルスから２つの茎を取ることは決してしない。 根が生成したとき、このような植物を等量の泥炭、パーライトおよびバーミキ ュライトからなる無土混合物を含有するｐｌｕｇトレーに移し、新しい成長が始 まるまで１００％の相対湿度でインキュベートする。この小さい植物を次いで１ ０立方インチの濾過チューブ中に移植し、プランティングサイズとなるまで温室 で成長させた。この植物を次いで休眠まで徐々に外気条件にならして行き、上記 チューブから外して準備され た場所に植えかえた。このプランティングの前および／または後の一定の時期に この場所には２，４−Ｄを撤布する。この撤布時期および２，４−Ｄの濃度は当 業者が容易に決められるものである。更に具体的に言えば、これらの条件はこの 場所における形質転換植物以外の植物の成長によって決められるものである。こ の場所に撒布される２，４−Ｄの量は１）この場所における非形質転換植物の成 長を抑え、そして、２）形質転換植物を成長させるのに充分な量である。 実施例１１ 大豆の形質転換および繁殖 ｔｆｄＡ遺伝子で形質転換した大豆（好ましくはＷｉｎｃｈｅｓｔｅｒ ｓｏ ｙｂｅａｎｓ）を、１）再生培地が０．１ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄを含有し、２） カナマイシンはこのｔｆｄＡ遺伝子を用いる実験では使用しないという点を除い て、Ｈｉｎｃｈｅｅ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９１７−９２１（１ ９８８）に記載されているようにして製造する。 前出のＨｉｎｃｈｅｅ等に記載された方法を以下に簡単に説明する。： 再生 大豆（グリシンｍａｘＣＬ）ウィンチェスター）苗を１６：８の光期間（４０ μＥｍ／ｓでの冷たい白い蛍光色）の下、２５℃で０．８％Ｄｉｆｃｏ生成アガ ール上に４〜１０日間で防腐的に発芽させる。洗剤を入れた水で洗った後、蒸留 水で洗浄、７０％エタノール中に２分間置く；５０％Ｃｈｌｏｒｘに１０〜１３ 分間移し、次いで殺菌蒸留水で５回洗浄する。種を水性Ｃａｐｔａｎ水溶液中に １時間ひたし、次いで発芽培地に移す。発芽後、子葉を除去し軸側を下にしてＢ₅ ＢＡ培地上に置く。Ｂ₅ＢＡ培地はＢ₅塩（Ｇｒａｎｎ等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ．５０： １５２−１５８（１９６８））、２０ｍｇ／ｌシュクロース、１．１５ｍｇ／ｌ ベンジルアデニン（ＢＡ）、０．１ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄおよび８ｇ／ｌ Ｄｉ ｆｃｏ精製アガールからなり、オートクレーブで加圧する前ｐＨ５．８である。 子葉外植を３〜４週間後Ｂ₅Ｏ培地（Ｂ₅ＢＡと同一であるがＢＡを有さない）に 移す。これらおよび他の全ての培養外植は発芽苗と同一の環境条件下に保持され ている。子葉外植製造茎を４週間毎に新しいＢ₅Ｏ培地上で継代培養する。伸長 した茎を取り出し、キャップをしたガラスのバイアル瓶または殺菌した５０ｍｌ の使い捨てプラスチック遠心チューブ中の１／２Ｂ₅Ｏ培地（Ｂ₅Ｏ培地の半分は ｍａｊｏｒ塩および半分はｍｉｎｏｒ塩）上に置く。栄養分体（ｐｌａｎｔｌｅ ｔ）（根の出た茎）を、何枚かの新しい葉が製造された後、２インチのポット中 のバーミキュライトに移す。これらの栄養分体をプラスチック容器に入れ、この 容器の口は徐々に開いて、温室中で成長させる前にこれらをその条件に適応させ る。条件に適応後新しい葉を製造する小さい植物を土に移植し、温室で成長させ 花を咲かせ、種を採る。 培養物スクリーニング（Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｓｃｒｅｅｎ） 大豆の種を０．８％Ｄｉｆｃｏ生成アガール上で５日間防腐的に発芽させる。胚 軸を５ｍｍの切片にカットし、プラスミドｐＵＣＷ２００を含有するＡ．ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４に撒種する（Ｈｏｒｓｃｈ等、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２７：１２２９−１２３１（１９８５）。この胚軸切片を１ ／１０ ＳＨ培地［ＳＨ（ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｒｂｒｅｕｄｔ、カナ ディアン・ジャーナル・オブ・ボタニカ（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．）５０：１９９ −２０４（１９７２））の１／１０ｇのｍａｊｏｒ塩およびｍｉｎｏｒ塩］上で ２時間、 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に共培養し、次いで１００ｍｇ／ｌのカナマイ シンを有することもある５００ｍｇ／ｌカニベニシリンを含有するＭＳ ＮＡＡ ／Ｋ培地上に置く。ＭＳ ＮＡＡ／Ｋ培地はＭＳ塩および有機物より成り（Ｍｕ ｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、フィジオロジー・オブ・プランテーション（ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ）１５：４７３−４９７（１９６２））２．１５ｍ ｇ／ｌカイネチンおよび４．６８ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を有してい る。各ｃｕｌｔｉｖａｒサンプルは２０〜４０切片を有している。胚軸切片はＭ Ｓ ＮＡＡ／Ｋ上に４週間置いてから数える。カルスを製造した胚軸の数を、外 植１つについての独立カルスの数と同様に数える。 子葉外植形質転換 大豆ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒの子葉外植を再生のために準備 する。プラスミドｐＵＣＷ２００を含有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢ Ａ４４０４を用いる形質転換をｃｕｌｔｉｖａｒスクリーニングにおける胚軸に ついて記載されているように行う。撒種した子葉を、Ｂ₅ＢＡ培地が５００ｍｇ ／ｌカルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｌセホタキシムを含有する以外は、子葉 再生のために記載されているように培養する。伸長した茎はＢ₅Ｏ培地中で培養 する。 根が生成し始めたら、この栄養分体を、当量の泥炭、パーライトおよびバーミ キュライトからなる無土混合物を含有する栓付きトレーに移し、新しく成長が始 まるまで１００％相対湿度中でインキュベートした。この栄養分体を１０立方イ ンチの濾過チューブ中に移植し、プランティングサイズとなるまで温室で成長さ せた。この植物を次いで休眠まで徐々に外気条件にならして行き、上記チューブ から外して準備された場所に 植えかえた。このプランティングの前および／または後の一定の時期にこの場所 には２，４−Ｄを撒布する。この撒布時期および２，４−Ｄの濃度は当業者が容 易に決められるものである。更に具体的に言えば、これらの条件はこの場所にお ける形質転換植物以外の植物の成長によって決められるものである。この場所に 撒布される２，４−Ｄの量は１）この場所における非形質転換植物の成長を抑え 、そして、２）形質転換植物を成長させるのに充分な量である。 上記で挙げられている全ての文献は参考のために引用している。 発明を明確にしその理解を容易にするために本発明を詳細に説明してきたが、 この説明に基づき、本発明の範囲から外れない範囲で当業者は種々の変更を加え ることができるものである

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年２月１６日 【補正内容】 １８．種子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項１６記載の零余子から生産され る種子。 １９．その細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を含有するフウ植物細胞。 ２０．請求項１９記載のフウ植物細胞から再生される植物。 ２１．子孫がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項２０記載の植物の子孫。 ２２．零余子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項２０記載の植物の零余子。 ２３．種子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項２１記載の植物の子孫によって 生産される種子。 ２４．（ａ）植物細胞中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子を含有するポリヌクレオチ ドで１もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該植物細胞を植物に再生し； （ｃ）該再生植物を、形質転換されていない植物を殺す量の２，４−ジクロロフ ェノキシ酢酸と共に培養し； （ｄ）成長を示している植物を選択し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を誘発し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズ（母株サイズ、スト ック サイズ）まで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り（ｓｈｅａｒｅｄ）、落 葉した場所（ｄｅｆｏｌｉａｔｅｄ ｓｉｔｅ）に植え；そして （ｉ）このプランティング台木が競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒ ｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用 地に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ２５．（ａ）植物細胞中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子および外来性選択性マーカ ーをコードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで１ もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物に再生し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を誘発し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｉ）このプランティングストックが競争成長制御なしに茂ることができるまで 、全用地に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ２６．（ａ）植物細胞中で発現し得るｔｆｄＡ遺伝子および外来性選択性マーカ ーをコードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで１ もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物に再生し； （ｅ）該再生植物を、非形質転換植物を殺す量の２，４−ジクロロフェノキシ酢 酸と共に培養し； （ｆ）該植物細胞を植物へと再生し； （ｇ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｈ）該植物中に根形成を誘発し； （ｉ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｊ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｋ）このプランティングストックが競争成長制御なしに茂ることができるまで 、全用地に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ２８．硬材（広葉樹）がフウである請求項２６記載の方法。 ３３．立地に栄養素を添加する工程を更に包含する、請求項２４〜２６のいずれ かに記載の方法。 ３４．プランティングストックを植える前に立地をかいてならす工程を更に包含 する、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。 ３５．プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え、そ して このプランティングストックが競争成長制御なしに茂ることができるまで、全用 地に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を撒いて競争成長を抑制し、 上記植物がｔｆｄＡ遺伝子を有するフウである、 ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ３７．硬材（広葉樹）がフウである請求項３５記載の方法。 ４２．除草剤耐性遺伝子を含有する硬材（広葉）樹を含有する硬材（広葉）樹プ ランテーション。 ４４．硬材（広葉）樹がフウである請求項４２記載のプランテーション。 ４９．ｔｆｄＡ以外の外来性選択マーカーを有さない、請求項１９記載の植物細 胞。 ５０．ｔｆｄＡ以外の外来性選択マーカーを有さない、請求項２０記載の植物。 ５１．ｔｆｄＡ以外の外来性選択マーカーを有さない、請求項２１記載の子孫。 ５２．ｔｆｄＡ以外の外来性選択マーカーを有さない、請求項２２記載の零余子 。 ５３．ｔｆｄＡ以外の外来性選択マーカーを有さない、請求項２３記載の種子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，Ｆ Ｉ，ＪＰ，ＭＸ，ＮＺ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）植物細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を含有するポリヌクレオチドを 用いて１またはそれ以上の植物細胞を形質転換し、 ｂ）該形質転換植物細胞を、非形質転換植物細胞の不定茎再生を防止する量 の２，４−Ｄと共に培養し、次いで ｃ）不定茎再生を示している植物細胞を選択する、 ことを包含する、遺伝子導入植物の選択方法。 ２．植物細胞が双子葉植物細胞である請求項１記載の方法。 ３．双子葉植物細胞が硬材（広葉樹）植物細胞である請求項２記載の方法。 ４．硬材（広葉樹）植物細胞がフウ植物細胞である請求項３記載の方法。 ５．ポリヌクレオチドが、蛋白質をコードする少なくとも１個の第２遺伝子を更 に含有する、請求項１記載の方法。 ６．ａ）植物細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を含有するポリヌクレオチドを 用いて１またはそれ以上の植物細胞を形質転換し、 ｂ）該形質転換植物細胞を、非形質転換植物細胞の不定茎再生を防止する量 の２，４−Ｄと共に培養し、 ｃ）不定茎再生を示している植物細胞を選択し、次いで ｄ）該植物細胞を植物へと再生することを包含する、 遺伝子導入植物の選択方法。 ７．植物が双子葉植物である請求項６記載の方法。 ８．双子葉植物が硬材（広葉樹）植物である請求項７記載の方法。 ９．硬材（広葉樹）植物がフウ植物である請求項８記載の方法。１０．ポリヌク レオチドが、蛋白質をコードする少なくとも１個の第２遺伝子を更に含有する、 請求項６記載の方法。 １１．細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を含有し、その際、植物細胞が他の外 来性選択可能なマーカー遺伝子を含有しない、植物細胞。 １２．植物細胞が双子葉植物細胞である請求項１１記載の方法。 １３．双子葉植物細胞が硬材（広葉樹）植物細胞である請求項１２記載の方法。 １４．硬材（広葉樹）植物細胞がフウ植物細胞である請求項１３記載の方法。 １５．請求項１１記載の植物細胞から再生される植物。 １６．子孫(progeney)がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項１５記載の植物の子 孫。 １７．零余子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項１５記載の植物の零余子。 １８．種子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項１６記載の零余子から生産され る種子。 １９．その細胞中で発現可能なｔｆｄＡ遺伝子を含有するフウ植物細胞。 ２０．請求項１９記載のフウ植物細胞から再生される植物。 ２１．子孫がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項２０記載の植物の子孫。 ２２．零余子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項２０記載の植物の零余子。 ２３．種子がｔｆｄＡ遺伝子を含有する、請求項２１記載の植物の子孫によって 生産される種子。 ２４．（ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子を含有するポリヌクレオ チドで１もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該植物細胞を植物に再生し； （ｃ）該再生植物を、形質転換されていない植物を殺す量の除草剤と共 に培養し； （ｄ）成長を示している植物を選択し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を誘発し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズ（母株サイズ、スト ック サイズ）まで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り（ｓｈｅａｒｅｄ）、落 葉した場所（ｄｅｆｏｌｉａｔｅｄ ｓｉｔｅ）に植え；そして （ｉ）このプランティング台木が競争成長制御（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｇｒ ｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）なしに茂ることができるまで、全用地に除草剤を撒 いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ２５．（ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子および外来性選択性マー カーをコードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで １もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物に再生し； （ｅ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｆ）該植物中に根形成を誘発し； （ｇ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｈ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所 に植え；そして （ｉ）このプランティングストックが競争成長制御なしに茂ることができるまで 、全用地に除草剤を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ２６．（ａ）植物細胞中で発現し得る除草剤耐性遺伝子および外来性選択性マー カーをコードする少なくとも１つの第２の遺伝子を含有するポリヌクレオチドで １もしくはそれ以上の植物細胞を形質転換し； （ｂ）該再生植物を、外来性選択性マーカー遺伝子で形質転換されてない植物細 胞の不定茎再生を抑制する量の薬剤と共に培養し； （ｃ）不定茎を再生している植物を選択し； （ｄ）該植物細胞を植物に再生し； （ｅ）該再生植物を、非形質転換植物を殺す量の除草剤と共に培養し； （ｆ）該植物細胞を植物へと再生し； （ｇ）該植物を増殖させて多くの植物をつくり； （ｈ）該植物中に根形成を誘発し； （ｉ）該根の形成された植物をプランティングの台木サイズまで成長させ； （ｊ）該プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え； そして （ｋ）このプランティングストックが競争成長制御なしに茂ることができるまで 、全用地に除草剤を撒いて競争成長を抑制する； ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ２７．除草剤耐性遺伝子がｔｆｄＡ遺伝子であり、除草剤が２，４−ジクロロフ ェノキシ酢酸である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。２８．硬材（ 広葉樹）がフウである請求項２７記載の方法。 ２９．除草剤耐性遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｉｓからの突然変異アセトヒドロキ シ酸シンターゼ遺伝子である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。 ３０．硬材（広葉樹）がフウである請求項２９記載の方法。 ３１．除草剤耐性遺伝子が５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート シンターゼ遺伝子であり、除草剤がグリホセートである、請求項２４〜２６のい ずれかに記載の方法。 ３２．硬材（広葉樹）がフウである請求項３１記載の方法。 ３３．立地に栄養素を添加する工程を更に包含する、請求項２４〜２６のいずれ かに記載の方法。 ３４．プランティングストックを植える前に立地をかいてならす工程を更に包含 する、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。 ３５．プランティング台木サイズの植物を、刈り取り、落葉した場所に植え、そ して このプランティングストックが競争成長制御なしに茂ることができるまで、全用 地に除草剤を撒いて競争成長を抑制し、 上記植物が除草剤耐性遺伝子を有するフウである、 ことを包含する硬材（広葉樹）プランテーションを製造する方法。 ３６．除草剤耐性遺伝子がｔｆｄＡ遺伝子であり、除草剤が２，４−ジクロロフ ェノキシ酢酸である、請求項３５記載の方法。 ３７．硬材（広葉樹）がフウである請求項３６記載の方法。 ３８．除草剤耐性遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｉｓからの突然変異アセトヒドロキ シ酸シンターゼ遺伝子である、請求項３５記載の方法。 ３９．硬材（広葉樹）がフウである請求項３８記載の方法。 ４０．除草剤耐性遺伝子が５−エノールピルビルシキメート−３−ホス フェートシンターゼ遺伝子であり、除草剤がグリホセートである、請求項３５記 載の方法。 ４１．硬材（広葉樹）がフウである請求項４０記載の方法。 ４２．除草剤耐性遺伝子を含有する硬材（広葉）樹を含有する硬材（広葉）樹プ ランテーション。 ４３．除草剤耐性遺伝子がｔｆｄＡ遺伝子である請求項４２記載のプランテーシ ョン。 ４４．硬材（広葉）樹がフウである請求項４３記載のプランテーション。 ４５．除草剤耐性遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｉｓからの突然変異アセトヒドロキ シ酸シンターゼ遺伝子である、請求項４２記載のプランテーション。 ４６．硬材（広葉）樹がフウである請求項４５記載のプランテーション。 ４７．除草剤耐性遺伝子が５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート シンターゼ遺伝子である、請求項４２記載のプランテーション。 ４８．硬材（広葉）樹がフウである請求項４７記載のプランテーション。