DK175510B1 - Fremgangsmåde til transformation af plantearveanlæg - Google Patents

Description

i DK 175510 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til transformation af plantearveanlæg ved enkle, rent kemiske fremgangsmådeforanstaltninger.

5 Ved indføringen af ny genetisk information i plantemateriale kan der frembringes planter med nye og/eller forbedrede egenskaber. Betragter man eksempelvis den hurtige befolkningstilvækst i verdenen og de dermed forbundne højere næringsmiddel- og råstofbehov, hører 10 udbyttestigningen hos nytteplanter samt den forøgede indvinding af indholdsstoffer i planter, især fremskridtet på området nærings- og lægemidler, til de mest påtrængende opgaver inden for den biologiske forskning. I denne sammenhæng skal eksempelvis nævnes følgende væsentlige 15 aspekter: En resistensforøgelse hos nytteplanter mod ugunstige jordbundsforhold eller klimabetingelser, mod sygdomme og skadeorganismer, en resistensforøgelse mod plantebeskyttelsesmidler, såsom insekticider, herbicider, fungicider og baktericider, og en gunstig forandring af 20 næringsstofindholdet eller høstudbyttet hos planter. Sådanne ønskelige virkninger kan generelt tilvejebringes ved inducering eller forøget dannelse af beskyttelses-stoffer, værdifulde proteiner eller toksiner. En tilsvarende påvirkning af planters arveanlæg kan 25 eksempelvis opnås ved, at man målrettet indfører et bestemt fremmedgen i planteceller uden at gøre brug af konventionelle dyrkningsmæssige foranstaltninger.

Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse anvendes 30 følgende definitioner:

Plantemateriale: I kultur eller som sådan levedygtige plantedele, såsom protoplaster, celler, kallus, væv, embryoner, planteorganer, 35 knopper, frø og andet samt hele plan ter.

H il

I DK 175510 Blj I

I i i I 2 i

I Gen: Strukturgen med flankerende ekspres- I

I sionssignaler. I

I Strukturgen: Proteinkodende DNA-sekvens. i I

I

5 Ekspressions- I

signaler: Promotorsignal og termineringssignal. I

I Plantevirksomt I

I ekspressions- I

I signal: Ekspressionssignal, som er funktions- I

I ! I

I 10 dygtigt i planter. I

I Promotorsignal: Transskriptionsinitieringssignal. I

I Terminerings- I

I signal: Transskriptionstermineringssignal. I

I Forstærkersignal: Transskriptionsforstærkende signal. I

I 15 Replikations- I

I signal: Signal, der muliggør DNA-replikationen. I

I Integrations- il

I signal: DNA-sekvens, som fremmer integreringen | I

I af genet i det genomiske DNA. i I

H ^1

I 20 Hybridgen: Gen opbygget af heterologe DNA-sekven- I

I ser, dvs. af DNA-sekvenser af forskel- I

I lig oprindelse, hvor der kan være tale I

I om såvel naturlige c-DNA- som synteti- I

I ske DNA-sekvenser. I

I 25 Bærer-DNA: Den sidestillede eller flankerende neu- I

I trale DNA-sekvens, som ikke indgår i I

I genets funktion. I

I Carrier-DNA: Neutralt DNA uden transformerende gen, I

I som blandes med det transformerende gen I

I 30 for at beskytte dette mod nucleasér. I

I Isoleret gen: DNA-sekvens, som er udskilt fra det I

I oprindelige DNA,. og som koder for et ι I

I enkelt protein. | I NPT-II-gen: Neomycin-3'-phosphotransf erase-gen,

I 35 type II af transposon Tn 5 I

I [D S.J. Rothstein og W.S. Reznikoff, I

I Cell 23, 191-199, (1981)]. I

3 DK 175510 B1

Genomisk DNA: DNA fra et plantegenom (total eller del deraf).

c-DNA.: Kopi af et m-DNA fremstillet ved hjælp 5 af revers-transskriptase.

Overføringen af DNA-sekvenser i planteceller under anvendelse af genetisk manipulerede plantebakterier er kendt fra publikationer i faglitteraturen, f.eks. 2) Nature, bind. 303, 209-213 (1983), 3) Nature, bind 304, 184-187 10 (1983), Scientific American 248(6), 50-59 (1983), 5) EMBO-Journal 2(6), 987-995 (1983), 6) Science 222, 476-482 (1983), 7> Science 223, 496-498 (1984) eller 8) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803-4807 (1983). Ved de der beskrevne fremgangsmåder udnyttes de naturlige 15 planteinficerende egenskaber hos disse bakterier til indføring af nyt genetisk materiale i plantecellerne. Til dette formål er der hidtil som vektorer i første række anvendt plantepatogener, som f.eks. Agrobacterium tumefaciens eller dens Ti-plasmid eller blomkålsmosaik-20 virus.

De i nyere tid udviklede fremgangsmåder muliggør nu også den direkte indføring af et gen i planteceller uden anvendelse af biologiske vektorer, jævnfør 9) j. protykus et al., Plant Molec. Biol. Rep. 3, 117-128, (1985) og 25 !0) R.D. Shillito et al., Bio/Technology 3, 1099-1103, (1985).

Disse fremgangsmåder, som er blevet kendt under slagordet "direkte gentransfer", muliggør en vektorfri transformation af planteceller uden anvendelse af planteinficerende 30 systemer, som f.eks. plantepatogene bakterier, vira, insekter eller svampe.

Hermed bortfalder også alle de begrænsninger, der skyldes patogenernes værtsspecificitet. Udviklingen af planterne

I DK 175510 B1 I

I 4 I

I fra da transformerede celler generes Ikke af anvendelse af I

I de nye fremgangsmåder til transformation af planteceller. I

I Et hovedproblem ved anvendelsen af gentransformation I

I 5 ligger i vanskeligheden ved at identificere de transforme- I

I rede celler eller væv. I

I Jo mindre transformationshyppigheden ved en gentransfor- I

I mation er, desto vanskeligere og dyrere er det at identi- I

I ficere de få cellekloner, som stammer fra de transforme- I

I 10 rede celler, blandt det enorme antal ikke-transformerede I

I kloner. Anvendelsen af de sædvanlige screeningsmetoder er I

I derfor ved lav transformationshyppighed næsten eller helt I

I umulig, medmindre der er tale om et gen med selektiv I

I markørfunktion, f.eks. resistens mod et bestemt stof. Lav I

I 15 transformationshyppighed kræver altså ved gener uden I

I selekterbar markørfunktion et enormt ressourceforbrug. I

I Ved transformationer med gener uden markørfunktion kan de I

I sædvanlige screeningsmetoder til selektering af transfor- I

I merede cellekloner først hensigtsmæssigt og med godt I

I 20 resultat anvendes, når transformationshyppigheden er af I

I størrelsesordenen 10“3 til 10“2. For tiden kan disse I

I tilstræbté høje transformationsrater kun opnås ved I

I anvendelse af elektroporation, eventuelt i forbindelse med I

I andre i den mikrobiologiske forskning til genoverføring I

I 25 anvendte fremgangsmåder, som eksempelvis poly-L-ornithin- I

I eller poly-L-lysin-behandling, liposomfusion, DNA-protein- I

I kompleksering, ladningsændring ved protopiastmembranen, I

I fusion med mikrobielle protoplaster eller calciumphosphat- I

I copræcipi tering, og især polyethylenglycolbehandling og

I 30 varmechok-metoden (heat shock), jævnfør 10) Shillito et I

I al., Bio/Technology 3, 1099-1103 (1985). I modsætning I

I hertil kan der ved anvendelse af rent kemiske fremgangs- I

I mådeforanstaltninger kun opnås reproducerbare transforma- H

I tionsrater af størrelsesordenen op til 10"5.

5 DK 175510 B1

Ved elektroporation, jævnfør H) E. Neumann et al., The EMBO Journal 7, 841-845 (1982) og 10> Shillito et al., Bio/Technology 3 (1985), pålægges protoplaster i en 5 mannitol/calcium- eller mannitol/magnesium-opløsning ved afladning af en kondensator over suspenslonsvæsken 1 kort tid en spændingsimpuls af høj intensitet. Herved opnår man en polarisering af protoplastmembranen og en reversibel åbning af porerne i membranen, hvilket letter overgangen 10 af DNA i cellen.

Denne fremgangsmåde har dog talrige ulemper og er underkastet visse begrænsninger.

For det første kræves der til gennemførelsen af transformationen ved hjælp af elektroporation et relativt stort 15 apparativt udstyr, som er forbundet med tilsvarende høje udgifter og stort arbejdsforbrug. For det andet er anvendelsen af denne fremgangsmåde som følge af plante-protoplasternes høje følsomhed kun mulig inden for et meget snævert grænseområde. For at sikre de transformerede 20 cellers levedygtighed kan visse parametre, som f.eks. spændingsværdierne, kapacitetsværdierne og feltstyrkeværdierne, kun varieres inden for disse snævre grænser (f.eks. spændingsområde mellem 1400 og 1700 V), jævnfør 10) R.D. Shillito et al., Bio/Technology 3, (1985).

25 Det har vist sig, at man ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen med enkle, rent kemiske fremgangsmådeforanstaltninger kan eliminere disse ulemper.

Undersøgelserne gennemført i forbindelse med den foreliggende opfindelse vedrørende de principper, som er 30 ansvarlige for optagelsen og integrationen af DNA i planteceller, har tydeligt vist, at transformationsprocessen afhænger af et stort antal indbyrdes afhængige parametre. På basis af disse undersøgelser kan transforma-

I DK 175510 B1 I

I 6 I

I tionsfrekvensen ved variation og optimal afstemning af de I

I for transformationen relevante parametre i forhold til de I

I gængse fremgangsmåder hæves i en sådan grad, at de oven- I

I 5 for omtalte tilstræbte transformationsrater på 10"3 til I

I ΙΟ-3 0g derover uden videre kan opnås. I

I Ved hjælp af denne fremgangsmåde, som er baseret på rent I

I kemiske foranstaltninger, kan foruden transformations- I

I frekvensen overraskende også reproducerbarheden samt I

I 10 overlevelsesraten af de behandlede protoplaster forøges I

I meget kraftigt. I

I Medens man hidtil med rent kemiske fremgangsmåder maksi- I

I malt kunne opnå transformationsfrekvenser af størrelses- I

I ordenen 10“3, er det nu muligt ved anvendelse af I

I 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen at opnå reproducerbare I

I transformationsfrekvenser af størrelsesordenen op til I

I nogle få procent, som er sammenlignelige med de transfor- I

I mationsfrekvenser, som opnås ved elektroporation. I

I 1 modsætning til elektroporation er den omhandlede I

I 20 forbedrede fremgangsmåde en metode, som kan gennemføres I

I uden særlige krav til apparatur, og den er derfor pris- I

I billig og mindre arbejdskrævende. En anden fordel sammen- I

I lignet med fremgangsmåder, som kræver en elektroporation I

I består i den nye mulighed for samtidigt at kunne transfor- I

I 25 mere store mængder planteprotoplaster. I

I Sammenlignelige begrænsninger, som tidligere blev diskute- I

I ret for elektroporationsfremgangsmåden i forbindelse med I

I de behandlede cellers overlevelsesrate, findes ikke ved I

I anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. I 1

De for den omhandlede transformation bestemte parametre H

kan varieres inden for vide grænser og påvirker ikke I

transformationseffektiviteten og levedygtigheden hos de H

behandlede protoplaster i uheldig retning i dette område. I

DK 175510 B1

7 I

Desuden er den samlede protoplastpopulation efter I

transformationen under anvendelse af fremgangsmåden ifølge I

opfindelsen langt mindre heterogen end det er tilfældet I

5 ved en transformation ved hjælp af elektroporation, såvel I

med hensyn til levedygtigheden som delingsevnen hos de I

behandlede protoplaster. Således kan der ved anvendelse af I

fremgangsmåden ifølge opfindelsen eksempelvis uden videre I

opnås overlevelsesrater for de behandlede protoplaster på I

I 10 80% og derover, idet samtidigt deres delingsevne og dermed I

I muligheden for dannelse af nye kolonier bibeholdes. De I

I sammenlignelige værdier med hensyn til overlevelsesrate I

I ved anvendelse af elektroporation ligger derimod ved kun I

I ca. 10%. I

I 15 Det har mod forventning vist sig, at blandt et stort antal I

I parametre, der enkeltvis eller indbyrdes kombineret kan I

I påvirke transformationshyppigheden ved direkte genover- I

I førsel i protoplaster, ved det rigtige udvalg og kombina- I

I tion af kun få af disse parametre eller foranstaltninger I

I 20 kan opnås en optimal transformationsrate med lavt teknisk I

I og tidsmæssigt ressourceforbrug. I forbindelse hermed har I

I følgende parametre vist sig at være væsentlige: I 1) DNA-probe: Form, størrelse, koncentration, I applikationstidspunkt.

I 25 2) Carrier DNA: Form, koncentration, størrelse.

I 3) Mg2+: Koncentration, applikationstidspunkt.

I 4) Plasmamembran- I modificerende I middel: Koncentration, applikationstidspunkt.

I 30 Blandt de faktorer, som er essentielle for fremgangsmåden I ifølge opfindelsen, har i første række Mg2+-koncentra- I tionen samt koncentrationen af det plasmamembranmodifice- I rende middel afgørende betydning for den forøgede I transformationseffektivitet. Der iagttages en synergistisk

I DK 175510 B1 I

I 8 I

I vekselvirkning mellem disse to nævnte faktorer, hvilket I

I medfører en kraftig forøgelse af transformationsfrekven- I

I sen. I

I 5 Betydning har endvidere tidspunktet og rækkefølgen for · I

I applikationen af Mg2+-ionerne, modificeringsmidlet samt I

I det transformerende DNA. I

I Denne afgørende forbedring og forenkling af fremgangsmåden I

I til direkte gentransfer i pianteprotopiaster og til sidst I

I 10 til dannelsen af genetisk ændrede planter kan opnås ved I

I hjælp af de nedenfor anførte deltrin, som er væsentlige I

I for opfindelsen: I

I Isolering af protoplasteme fra plantemateriale og even- I

I tuelt inkubering af de isolerede protoplaster i et egnet I

I 15 næringsmedium, I

I resuspendering af de isolerede protoplaster i en standar- I

I diseret saltopløsning, I

I overføring af de isolerede protoplaster fra saltopløs- I

I ningen til et til transformationen optimeret inkubations- I

I 20 medium, som indeholder Mg2+-ioner, I

I tilsætning af DNA'et, som skal indføres, samt et af de I

I plasmamembranmodificerende midler, I

I inkubering af protoplaster og DNA i nærværelse af et stof, I

I som modificerer plasmamembranen, i et tidsrum, der er I

I 25 tilstrækkeligt til, at DNA'et trænger ind i proto- I

I plasterne, I

I isolering af de behandlede protoplaster fra inkubations-

I opløsningen samt eventuelt resuspendering deraf i en I

I vandig CaCl2_opløsning, I

I 30 isolering af protoplasteme fra CaCl2-opløsningen, I

I inkubering i et til den videre protoplastudvikling egnet

I dyrkningsmedium og I

I om ønsket, regenerering af helt transformerede planter. I

9 DK 175510 B1

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen til transformation af plan-tearveanlæg er ejendommelig ved, at man isolerer planteprotoplaster fra vilkårlige plantevæv og dyrker dem i et af de sædvanligvis til dyrkningen af 5 planteprotoplaster anvendte næringsmedier, forinkuberer protoplasterne inden den egentlige transformation i fra 20 minutter til 6 timer i et forinkubationsmedium indeholdende Ca2+-, k+- og Na+-ioner samt en egnet C-kilde ved en temperatur på 4-10eC, 10 isolerer protoplasterne fra forinkubationsmediet og resuspenderer dem i det egentlige transformationsmedium, der som væsentlig bestanddel indeholder 0,1-60 mM Mg2*-ioner i nærværelse eller fraværelse af Ca2+-ioner, umiddelbart derefter sætter en DNA-probe indeholdende et 15 eller flere gener under kontrol af ekspressionssignaler, som er aktive i planter, samt et bærer-DNA til transformationsopløsningen, 0,1-10 minutter senere tilsætter et middel, som modificerer plasmamembranen, og 20 inkuberer protoplaster og DNA-probe i transformationsopløsningen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til optagelse af DNA'et i protoplasterne. 1 2 3 4 5 6

Af denne beskrivelse fremgår det klart, at den omhandlede 2 overførsel af de nye gener til plantecellerne foregår på 3 direkte måde uden anvendelse af et naturligt planteinfice- 4 rende system,' såsom en plantebakterie, en plantevirus 5 eller overføring ved hjælp af insekter eller phytopatogene 6 svampe. Til dette formål behandles planteprotoplasterne, som skal transformeres, direkte med genet, som skal overføres, idet man først indbringer dette i en egnet opløsning, forinkuberer i denne opløsning i et vist tidsrum, derefter sammen med fremmedgenet overfører til det egent-3 5 lige transformationsmedium, som henstår i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til optagelse af fremmedgenet i protoplasterne.

I DK 175510 B1 I

I 10 I

I Som planteprotoplaster anvendes fortrinsvis protoplaster I

I fra en enkelt planteart eller en af arten underordnet I

I systematisk enhed. I

I Isolerede planteprotoplaster, som egner sig som udgangs- I

I 5 materiale for isolerede celler og væv, kan udvindes af I

I vilkårlige plantedele, f.eks. af blade, kim, stængler, I

I blomster, rødder, pollen eller embryoner. Der anvendes I

I fortrinsvis bladprotoplaster. De isolerede protoplaster I

I kan også udvindes af cellekulturer. Metoder til I

I 10 isoleringen af protoplaster er eksempelvis beskrevet i I

I ^-2) i. Potrykus og R.D. Shillito, Methods in Enzymology I

I 118, 449-578 (1986). I

I Som opløsninger, hvori protoplasterne dyrkes, kan I

I 15 fortrinsvis anvendes osmotisk stabiliserede dyrknings- I

I medier, som sædvanligvis anvendes til protoplastkulturer. I

I Der er talrige kulturmedier til rådighed, som adskiller I

I sig med hensyn til de enkelte mediekomponenter eller I

I 20 grupper af sådanne komponenter. Alle medier er dog gene- I

I relt opbygget efter følgende princip: De indeholder en I

I gruppe uorganiske ioner i koncentrationsområdet fra ca. I

I 10 mg/1 op til nogle hundrede mg/1 (såkaldte makro- I

I elementer, som f.eks. nitrat, phosphat, sulfat, kalium, I

I 25 magnesium, jern), en anden gruppe uorganiske ioner i I

I mængder på maksimalt nogle mg/1 (de såkaldte mikro- I

I elementer, som f.eks. kobalt, zink, kobber, mangan), I

I endvidere en række vitaminer (eksempelvis inositol, I

I folsyre, thiamin), en energi- og kulstofkilde, som f.eks. I

I 30 saccharose eller glucose, samt vækstregulatorer i form af I

I naturlige eller syntetiske phytohormoner hørende til I

I klasserne auxiner og cytokininer i koncentrationsområdet I

I fra 0,01 til 10 mg/1. Dyrkningsmedierne er tilmed I

I stabiliseret osmotisk ved tilsætning af sukkeralkoholer I

I 35 (f.eks. mannitol) eller sukker (f.eks. glucose) eller I

I saltioner (eksempelvis CaCl2) og er indstillet på en I

I pH-værdi på 5,6-6,5. I

11 DK 175510 B1

En nærmere beskrivelse af gængse kulturmedier findes eksempelvis i 13) H. Koblitz, Methodische Aspekte der Zell- und Gewebeztlchtung bei Gramineen unter besonderer Berdcksichtigung der Getreide, Kulturpflanze XXII, 1974, 5 93-157.

Inden protoplasterne overføres til det egentlige transformationsmedium foretages først en forinkubation i et medium, som på optimal måde forbereder protoplasterne på 10 den efterfølgende transformering, hvilket kommer til udtryk ved en tydelig forøgelse af de opnåede transformations- og overlevelsesrater fra de behandlede proto-plaster.

15 Under visse forudsætninger er det også muligt at gennemføre transformationen direkte i det pågældende forinkubationsmedium.

Det pågældende medium er en standardiseret saltopløsning, 20 der foruden en egnet C-kilde, som f.eks. en sukker eller en sukkeralkohol, såsom glucose eller mannitol, indeholder forskellige salte, f.eks. NaCl, CaCl2, KC1, i en koncentration fra 1 mM til 200 mM. Denne saltopløsnings pH-værdi ligger fordelagtigt i intervallet fra pH 5 til pH 8.

25

Kort tid inden den tilsigtede transformation overføres protoplasterne fra forinkubationsopløsningen til det egentlige transformationsmedium. Denne er en mannitol-opløsning, som indeholder Mg2+-ioner i en koncentration på 3 0 0,1 mM til 60 mM, fortrinsvis i en koncentration på 10 mM til 30 mM. Inkubationsopløsningens pH-værdi ligger fra 5,6 til 12, især fra 7 til 10.

Umiddelbart efter indføringen af de isolerede protoplaster 35 i inkubationsmediet foretages tilsætning af DNA-proben i en koncentration på 2 /ig/ml til 20 #ig/ml, fortrinsvis i en koncentration fra 5 pg/ml til 10 pg/ml.

I DK 175510 B1 I

I 12 I

I DNA'et, som består af et strukturgen og plantevirksomme I

I ekspressionssignaler, flankeres fordelagtigt af neutrale I

I DNA-sekvenser (bærer-DNA), som muliggør integreringen af I

I genet i plantecellens genomiske DNA. Det er fordelagtigt I

I 5 at anvende genet i lineariseret form. Véd de foretagne I

I eksperimenter har det vist sig særligt velegnet at anvende I

en bærer-DNA-koncentration på fra 50 pg/ml til 70 pg/ml I

I ved en gennemsnitsstørrelse fra 4 kb til 40 kb. I

I 10 Det er endvidere fordelagtigt at anvende neutralt DNA, som I

I f.eks. DNA fra dyr eller planter, lambda-DNA, plasmid-DNA I

eller vilkårligt andet DNA, som er egnet til gennemførel- I

I . sen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, i overskud som I

I carrier-DNA for at beskytte genet mod nedbrydning med I

I 15 nucleaser. I

I Nogle sekunder til 20 minutter, fortrinsvis 0,1 minut til I

I 10 minutter, efter tilsætningen af DNA1et til inkubations- I

I opløsningen gennemføres tilsætningen af polyethylenglycol I

20 til en slutkoncentration på 10-30%. Høje transformations- I

I rater opnår man ved en polyethylenglycol (PEG)-koncentra- I

I tion på 20-28%. I

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der foruden I

I 25 polyethylenglycol imidlertid også anvendes andre højere I

I alkoholer eller alkoholagtige stoffer, som ligeledes I

I modificerer protoplastmembranen, og som eksempelvis I

I anvendes ved cellefusion. Disse er eksempelvis langkædede, I

I polyvalente alkoholer, såsom polypropylenglycol (425 til I

I 30 4000 g/mol), polyvinylalkohol eller polyvalente alkoholer, I

I hvis hydroxygrupper helt eller delvis er forethrede, samt

I planteforligelige detergenter, der almindeligvis anvendes I

I i agrarområdet, og som eksempelvis er beskrevet i følgende I

I publikationer: I

I 35 I

13 DK 175510 B1 14) *»mc Cutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981 og i H. Stache, "Tensid-Taschenbuch", j i

Carl Hanser Verlag, Milnchen/Wien, 1981 5 Såfremt man anvender polyethylenglycol (som i eksemplerne 1 og 2), anvendes fortrinsvis polyethylenglycol med en molekylvægt på fra 1000 g/mol til 10000 g/mol, især fra 3000 g/mol til 8000 g/mol.

10

Blandt de ovenfor omtalte midler foretrækkes stoffet polyethylenglycol selv, især en polyethylenglycolopløsning af CMS-typen, som har et relativt højt indhold af Ca2+-ioner, jævnfør 15) i# Negrutiu et al., Theor. Appl.

15 Genet. 72, 279-86, (1986a).

Det har vist sig særligt fordelagtigt for transformationsforløbet at anvende en inkubationstid med polyethylenglycol på fra 20 minutter til 6 timer.

20

Efter den på den ovenfor beskrevne måde gennemførte behandling resuspenderes protoplasterne i frisk kulturmedium, idet celletætheden fortrinsvis indstilles på en værdi mellem 2 x 10^ og 8 x 10^ protoplaster pr. ml 25 kulturmedium.

Ved anvendelsen af PEG i en koncentration på mere end 20% er det hensigtsmæssigt efter transformationen at fortynde protoplasterne trinvis med det 2-10-dobbelte rumfang af en 30 Ca2+-ionholdig opløsning og således ved efterfølgende sedimentation og resuspension i frisk kulturmedium at udvaske PEG-rester.

For transformationsresultatet har det vist sig særligt 35 fordelagtigt at anvende en vandig CaCl2~opløsning med en Ca2+-ionkoncentration på 0,1 M til 1,0 M.

I DK 175510 B1 I

I I

I Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har praktisk taget I

I ubegrænset anvendelighed. I

I I første række angår den foreliggende opfindelse chimære I

I 5 genetiske konstruktioner, der som central bestanddel I

I indeholder et eller flere strukturgener, som koder for nye I

I nyttige og ønskelige egenskaber, og som på operabel måde I

I er bundet til funktionelle ekspressionssignaler i plante- I celler.

I I

I Til anvendelsen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen I

I egner sig i første række alle de gener, som kan udtrykkes I

I i planteceller og bibringer planterne en nyttig og/éller

I ønsket egenskab, som f.eks. en forøget resistens og I

I 15 tolerance mod patogener, f.eks. phytopatogene insekter,

I svampe, bakterier og vira, over for herbicider, insekti- I

I cider eller andre biocider, over for klimatiske indvirk- I

I ninger og lokale særlige forhold, f.eks. varme, kulde, I

I vind, tørhed, fugtighed, specielt ekstreme jordforhold,

I 20 osmotisk stress osv., eller med en forøget dannelse af I

I reserve- og lagerstoffer i blade, frø, knolde, rødder,

I stængler osv. I

I Strukturgenet kan kode for farmaceutisk acceptable aktive I

I 25 stoffer, f.eks. alkaloider, steroider, hormoner, immunmodu- I

I latorer, og andre fysiologisk aktive stoffer. I 1

Man kan således overføre vilkårlige strukturgener af I

I planteoprindelse, som f.eks. Zein-genet, jævnfør I

I 30 U. Wienand et al., Mol. Gen. Genet. 182, 440-444 I

I (1981), af dyrisk oprindelse, såsom eksempelvis TPA-genet, I

I jævnfør Tissue-type plasminogen activator-Gen, I

I 17) D. pennica et al., Nature 301, 214-221, (1983), af I

I mikrobiel oprindelse, som f.eks. NPT-II-genet, eller af I

I 35 syntetisk oprindelse, som f.eks. insulin-genet, jævnfør I

I 18) P.Stepien et al., Gene 24, 289-297 (1983), til I

0 15 DK 175510 B1 planters arveanlæg under forudsætning af, at strukturgenerne er flankeret af ekspressionsignaler, som er aktive i planter, idet ekspressionssignaleme kan stamme fra planter, dyr, mikroorganismer eller være fremstillet 5 syntetisk.

Ved ekspressionssignaler skal der i forbindelse med den foreliggende opfindelse i første række forstås promotor-og termineringssekvenser, desuden også andre regule-10 ringssekvenser for de 5’- og 31 -ikke-translaterede områder, som befinder sig modstrøms eller medstrøms i forhold til strukturgensekvensen.

Promotorsekvenserne indeholder bl.a. et genkendelsessted 15 for RNA-polymerasen, hvortil dette enzym binder specifikt og således starter transskriptionen.

Ansvarlig for bindingsaffiniteten er bestemte DNA-sekven-ser, som ofte forekommer i prokaryotiske promotorer. Dis-20 se såkaldte "Consensus"-sekvenser finder man i reglen i sekvensområdet -10 til -30, henført til strukturgenets ATG-start-kodon. Der er tale om to hexanucleotid-sekven-ser, der betegnes som "Pribnov-Schaller-box", og hvis nucleotidrækkefølge i disse sekvenser samt deres indbyrdes 25 afstand har afgørende indflydelse på affiniteten af DNA-polymerasen til promotoren.

1 eukaryotiske celler har i denne sammenhæng den såkaldte "TATA"-boks, som er et adenin- og thyminrigt sekvens-30 afsnit, der befinder sig 20-30 nucleotider modstrøms for transskriptionsinitieringsstedet, særlig betydning.

Som gener, der kan anvendes inden for rammerne af den foreliggende opfindelse, kan nævnes såvel homologe som 35 heterologe gen(er) eller DNA samt syntetiske gen(er) eller DNA ifølge den inden for rammerne af den foreliggende opfindelse anførte definition.

I DK 175510 Bl I

I 16 0

Den kodende DNA-sekvens kan være konstrueret udelukkende af genom i sk, af cDNA eller syntetisk DNA. En anden

mulighed består i konstruktionen af en hybrid DNA-sekvens I

bestående såvel af cDNA som af genomisk DNA og/eller I

I 5 syntetisk DNA. I

I dette tilfælde kan cDNA'et stamme fra det samme gen som I

I det genomiske DNA eller såvel cDNA*et som også det I

I genomiske DNA kan stamme fra forskellige gener. 1 alle I

I 10 tilfælde kan imidlertid såvel det genomiske DNA og/eller I

I cDNA'et hver for sig være fremstillet af samme eller af I

forskellige gener. I

Når DNA-sekvensen indeholder dele fra mere end ét gen, kan I

I 15 disse gener enten være fra én og samme organisme, fra I

I forskellige organismer, som hører til mere end én stamme, I

I en varietet eller en art af samme slægt, eller de kan I

I stamme fra organismer, som hører til mere end én slægt I

I eller til en anden taksonomisk enhed (rige). I

I 20 I

I For at sikre ekspressionen af de pågældende strukturgener I

I i plantecellen, skal de kodende gensekvenser først være I

I sammenknyttet operabelt med ekspressionssekvenser, som I

I fungerer i planteceller. I

I 25 I

I De overførte gener, som består af strukturgen og flanke- I

I rende ekspressionssignaler, kan være såvel naturligt I

I forekommende gener som hybridgener. Ved fremgangsmåden

I ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis gener, hvis I

I 30 ekspressionssignaler er af animalsk eller især vegetabilsk I

I eller syntetisk oprindelse. Som eksempler på sådanne gener I

I kan nævnes:

I a) Fuldstændige gener fra planter bestående af struktur- I

I genet med dets naturlige ekspressionssignaler, I

I 35 b) helsyntetiske gener bestående af et strukturgen af I

I syntetisk oprindelse flankeret af ekspressionssignaler af H

I syntetisk oprindelse, 17 DK 175510 B1 c) strukturgener stammende fra planter og flankeret af piantevirksomme ekspressionssignaler, hvor strukturgen og ekspressionssignaler stammer fra forskellige plantearter, d) strukturgener stammende fra planter og flankeret af 5 ekspressionssignaler af syntetisk oprindelse, e) strukturgener af animalsk, mikrobiel eller syntetisk oprindelse flankeret af ekspressionssignaler stammende fra planter eller f) strukturgener af animalsk eller mikrobiel oprindelse 10 flankeret af ekspressionssignaler af syntetisk oprindelse.

De hybride genkonstruktioner indeholder således foruden strukturgenet eller -generne ekspressionssignaler, som omfatter såvel promotor- og terminator-sekvenser som andre 15 regulatoriske sekvenser fra 3'- og 5*-ikke-translaterede områder.

Især foretrækkes strukturgener af bakteriel oprindelse flankeret af ekspressionssignaler stammende fra planter, 20 især stammende fra plantevira.

Der kan anvendes en vilkårlig promotor og en vilkårlig terminator, som er i stand til at bevirke en induktion af ekspressionen af en kodende DNA-sekvens (strukturgen), som 25 bestanddel af den hybride gensekvens. Som eksempler på egnede promotorer og terminatorer kan eksempelvis nævnes sådanne for nopalin-syntase-generne (nos), for octopin-syntase-generne (ocs) samt fra blomkålsmosaikvirusgenet (CaMV).

30

Der foretrækkes 35S- og 19S-ekspressionsignalerne fra CaMV-genomet, som ved hjælp af molekylærbiologiske metoder, der eksempelvis er beskrevet af Maniatis et al., 1982, fra det pågældende genom og kan bindes til den kodende DNA-se-35 kvens.

I DK 175510 B1 I

I 18 I

I I

I Som udgangsmateriale for 35S-transskriptionskontrol- I

I sekvenserne kan ifølge opfindelsen eksempelvis anvendes I

I Scal-fragmentet af CaMV-stammen "S", som omfatter I

I nucleotiderne 6808-7632 i genkortet, jævnfør 20) q, Frank I

I 5 et al., 1980. I

I 19S-Promotorområdet og det 5'-ikke-translaterede område I

I befinder sig på et genomfragment mellem Pstl-stedet I

I (position 5386) og Hindlll-stedet (position 5850) på I

I 10 CaMV-genkortet, jævnfør 21) Hohn et al., 1982. I

I Det tilsvarende terminator- og 3'-ikke-translaterede I

I område ligger på et EcoRV/BgIII-fragmentet mellem I

I position 7342 og 7643 i CaMV-genomet. I

I I

I 195-Promotorområdet er en typisk eukaryotisk promotor, der I

I ligger foran det kodende område af CaMV-genet VI og er I

I ansvarlig for ekspressionen af gen VI-produktet (virus- I

I hylsterprotein). I

I 20 I

I En andet virksomt eksempel på en promotor, som er I

I funktionel i planteceller, og som kan finde anvendelse, er I

I en overprodiicerende plantepromotor. Denne art promotorer I

I skal, såfremt den på operabel måde er bundet til I

I 25 gensekvensen, som koder for et ønsket genprodukt, være i I

I stand til at formidle ' ekspressionen af den pågældende I

I gensekvens. I

I Overproducerende plantepromotorer, som kan anvendes ved frem-

I 30 gangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter I

I promotoren for den lille underenhed (small subunit, ss) af I

I ribulose-1,5-bis-phosphat-carboxylase fra sojabønner, I

I jævnfør 22) Berry-Lowe et al., J. Mol. and Appl. Genet, 1, I

I 483-498 (1982), samt promotoren for klorofyl-a/b- I

I 35 bindingsproteinet. Disse to promotorer er kendt for, at de I

I kan induceres i eukaryotiske planteceller ved hjælp af H

19 DK 175510 B1 lys, jævnfør f.eks. 23) Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, New York 1983, side 29-38, 24) q, Coruzzi et al., The Journal of Biological Chemistry, 258, 1399 (1983) og 25) p. Dunsmuir 5 et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 2, 285 (1983).

Det er særligt fordelagtigt at anvende ekspressionssignaleme for genet VI fra blomkålsmosaikvirus.

10

Specielt foretrukket er ekspressionssignalerne for CaMV stammen CM 1841, hvis fuldstændige DNA-sekvens er blevet beskrevet, jævnfør 26) Gardner et al, 1981.

15 Hybridgeneme fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte mikrobiologiske fremgangsmåder, idet aflæsningsstrukturen for kodningen for de proteiner, som skal produceres af plantecellen, bibeholdes. Sådanne metoder er i kendt og er eksempelvis beskrevet i følgende publikatio-2 0 ner: 27) "Molecular Cloning", τ. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, og 20) "Recombinant DNA Techniques", R.L. Rodriguez og R.C. Tait, Addison-Wesley Publishing Comp., London,

Amsterdam, Don Mills. Ontario, Sydney, Tokyo, 1983.

25

Til integrationen af fremmedgenet i plantecellens genomiske DNA er det fordelagtigt, at genet bestående af strukturgen og plantevirksomme ekspressionssignaler er flankeret af neutrale DNA-sekvenser (bærer-DNA). Bærer-30 DNA'et kan bestå af to lineære DNA-strenge, således at den konstruktion, som skal indføres i plantecellen, er et lineært DNA-molekyle. Den til genoverføringen fremstillede DNA-sekvens kan imidlertid også have ringformet struktur (plasmidstruktur). Sådanne plasmider består af en DNA- ' 35 streng, hvor fremmedgenet er integreret med ekspressionssignalerne. Bærer-DNA'et kan være af syntetisk oprindelse I DK 175510 B1 I 20 o

I eller kan være fremstillet ud fra naturligt forekommende I

I DNA-sekvenser ved behandling med egnede restriktions- I

enzymer. Som bærer-DNA kan således eksempelvis anvendes I

naturligt forekommende plasmider, som er åbnet med et I

I 5 selektivt restriktionsenzym. I

Et eksempel på et sådant plasmid er det frit tilgængelige I

I plasmid pUC8, som er beskrevet i J. Messing og I

J. Vieira, Gene 19, 269-276, 1982. Som bærer-DNA kan I

I 10 endvidere anvendes brudstykker af naturligt forekommende I

I plasmider. Som bærer-DNA kan eksempelvis anvendes I

I sletningsmutanten for gen VI fra blomkålsmosaikvirus. I

I Sandsynligheden for genetisk transformation af en plante- I

I 15 celle kan forøges ved hjælp af forskellige faktorer. Som I

I påvist ved forsøg med gær stiger antallet af vellykkede I

I stabile gentransformationer I

I 1) med stigende antal kopier af de nye gener pr. celle, I

I 2) ved kombination af et replikationssignal med det nye I

I 20 gen, samt I

I 3) ved kombination af integrationssekvenser med det nye I

I gen. I

I Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan således anvendes med I

I 25 særlig fordel, når genet, som skal overføres, er kombine- I

I ret med replikations- og/eller integrationssekvenser, som I

I er virksomme i planteceller. I

I Ekspressionen af et gen i en plantecelle er afhængig af I

I 30 genets transskriptionshyppighed i en Messenger-RNS- I

I sekvens. Det er derfor ligeledes fordelagtigt at kombinere I

I det nye gen med et enhancersignal, som forstærker denne I

I transskription. Især skal fremhæves sådanne fremgangs- H

I måder, ved hvilke der overføres et gen, som er kombineret I

I 35 med replikations-, integrations- og enhancersignaler, som I

I er virksomme i planteceller. I

0 21 DK 175510 B1

Endvidere er det en stor fremgangsmådeteknisk fordel, at genet, som skal overføres, har en selektiv markørfunktion, dvs. at de transformerede planteceller kan adskilles fra de ikke-transformerede planteceller ved en målrettet 5 selektering. En sådan markørfunktion gør det muligt at anvende en rationel arbejdsmåde, idet det kun er nødvendigt at regenerere sådanne planteceller ved hjælp af sædvanlige mikrobiologiske foranstaltninger til kalli eller fuldstændige planter, i hvis arveanlæg der findes et 10 gen, som bliver udtrykt, hvilket muliggør markørspecifikke selekteringsforanstaltninger.

Som planteceller til anvendelse som udgangsmaterialer for en transformation kan anvendes protoplaster, cellekultur-is celler, celler i plantevæv, pollen, pollenslanger, ægceller, embryosække eller zygoter og embryoner på forskellige udviklingsstadier. Imidlertid foretrækkes protoplaster på grund af deres direkte anvendelsesmulighed uden yderligere forbehandlinger.

20

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er velegnet til transformation af alle planter, især planter, som hører til de systematiske grupper Angiospermae og Gymnospermae.

25 Blandt Gymnospermae har især de planter, som hører til klassen Coniferae, Interesse.

Særligt interessante blandt Angiospermae er foruden løvtræerne og buskene planter af familierne Solanaceae, 30 Cruciferae, Compositae, Liliaceae, Vitaceae,

Chenopodiaceae, Rutaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae,

Asparagaceae, Orchidaceae, Palmae, Bromeliaceae,

Rubiaceae, Theaceae, Musaceae eller Gramineae og ordenen Leguminosae og her først og fremmest familien 35 Popilionaceae. Der fortrækkes planter fra familierne Solanaceae, Cruciferae og Gramineae.

I DK 175510 B1 I

I 22 I

I Især skal nævnes planter af slægterne Nicotiana, Petunia,

I Hyoscyamus, Brassica og Lolium, f .eks. Nicotiana t.abacum, I

I Nicotiana plumbagenifolia, Petunia hybrida, Hyoscyamus I

I 5 muticus, Brassica napus, Brassica rapa og Lolium I

I multiflorum.

I Kulturplanterne med stort høstudbytte, såsom majs, ris, I

I hvede, byg, rug, havre eller hirse, arbejdes der i første I

I række med inden for området transformation af plante- I

I 10 celler. I

I Alle planter, som kan dannes ved regenerering af proto- I

I plaster, kan også transformeres under anvendelse af

I fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Planter fra familien I

I Gramineae (græsser), som også omfatter korn, har man I

I 15 hidtil ikke kunnet gensplejse. Det har imidlertid vist I

I sig, at man med den ovenfor beskrevne metode til direkte

I gentransformation også kan foretage genetisk transforma- I

I tion af gramineaeprotoplaster, dvs. også kornceller. På I

I tilsvarende måde er det muligt og ønskeligt at foretage I

I 20 transformation af kulturplanter hørende til slægterne I

I Solanum, Nicotiana, Brassica, Beta, Pisum, Phaseolus, I

I Glycine, Helianthus, Allium, Avena, Hordeum, Oryzae, I

I Setaria, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Musa, Cocos, I

I Cydonia, Pyrus, Malus, Phoenix, Elaeis, Rubus, Fragaria, I

I 25 Prunus, Arachis, Secale, Panicum, Saccharum, Coffea, I

I Camellia, Musa, Ananas, Vitis eller Citrus, selv om også I

I de samlede udbytter og dyrkningsarealer er små på verdens- I

I plan.

I Regenereringen af i kultur holdte protoplaster til hele I

I 30 planter er eksempelvis beskrevet af 29) Evans et al., I

I "Protoplast Isolation and Culture", i Handbook of Plant

I Cell Culture, 1, 124-176 (MacMillan Publishing Co. New I

I York 1983), 30) m.r. Davey, "Recent Developments in the I

I Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Proto- I

DK 175510 B1 I

23 I

plasts, 1983 - Lecture Proceedings, side 19-29, I

(Birkhåuser, Basel 1983), 31) P.J. Dale, "Protoplast I

Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other I

5 Recalcitrant Crops", i Protoplasts 1983 - Lecture I

Proceedings, side 31-41, (Birkhåuser, Basel 1983) og I

32) η. Binding, "Regeneration of Plants", i Plant I

Protoplasts, side 21-37, (CRC Press, Boca Raton 1985) og I

12) X. Potrykus og R.D. Shillito, Methods in Enzymology, I

10 bind 118, Plant Molecular Biology, red. A. og H. Weiss- I

bach, Academic Press, Orlando, 1986. I

Regenereringsfremgangsmåderne er forskellige fra planteart I

til planteart. Sædvanligvis fremstilles imidlertid først I

en suspension af transformerede protoplaster, celler eller I

15 af væv, som indeholder talrige kopier af de indførte I

gener. Ud fra disse suspensioner kan man derpå gennemføre I

induceringen af embryodannelsen. Udviklingen af embryo- I

nerne gennemføres frem til stadiet med modning og kim- I

dannelse, som dette også er tilfældet med naturligt I

20 forekommende embryoner. I reglen stimuleres protoplasterne I

imidlertid i et kendt dyrkningsmedium til deling og I

cellevægdannelse. Der dannes til sidst kalluskulturer, som I

behandles med visse virksomme stoffer, f.eks. auxiner og cytokininer til fremkaldelse af rod- eller spiredannelse.

25 Foruden disse vækststoffer indeholder dyrkningsmedierne i reglen forskellige aminosyrer. Det er fordelagtigt, at mediet indeholder glutaminsyre og prolin, især ved arterne majs og lucerne. Spire- og roddannelsen gennemføres sædvanligvis samtidigt.

30 De på denne måde dannede små planter kan derefter overføres til jord og videredyrkes på samme måde som normale frøplanter.

En effektiv regenerering afhænger i første række af mediet, af genotypen og af kulturens forhistorie. Når dis-

I DK 175510 B1 I

I 24 I

I se tre variable kontrolleres i tilstrækkelig grad, er I

I regenereringen fuldstændig reproducerbar. I

I På grund af den nyeste udvikling inden for området in I

I 5 vitro kultivering af planter, fortrinsvis inden for I

I området planteregenerering, er det imidlertid muligt også I

I ved planter hørende til familien Gramineae at regenerere I

I hele planter ud fra planteprotoplaster. Eksempler på I

I velgennemførte regenereringsforsøg med Gramineae er bl.a. I

I 10 beskrevet af 33) r. Abdulla et al., Bio/Technology, 4, I

I 1087-1090, 1986, 34) -p. Fujimura et al.. Plant Tissue I

I Culture Lett., 2, 74-75, 1985, 35) κ, Toriyama et al., I

I Theor. Appl. Genet., 73, 16-19, 1986, 36) γ. Yamada et I

I al., Plant Cell Rep., 5, 85-88, 1986 (Reis) samt i I

I 15 beskrivelsen til US-patentansøgning USSN 056.506, som er I

I indleveret den 24. juni 1987 med benævnelsen "Regeneration I

I of Zea mays plants from protoplast".

I Man kan derfor også anvende følgende planter: Lolium, Zea, I

I 20 Triticum, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, I

I Hordeum, Secale og Setaria. I

I Påvisningen af transformerede gener kan gennemføres på i I

I og for sig kendt måde, eksempelvis ved krydsningsanalyser I

I 25 og molekylarbiologiske undersøgelser, hvortil især hører I

I "Southern blot"-analysén og enzymaktivitetstests. I

I Ved krydsningsanalysen krydses de modne planter, som er I

I frembragt ud fra de transformerede planteceller, først med I

I 30 sig selv til frøproduktionen. Nogle af frøene indeholder I

I de indsatte gener, som koder for en ny og ønskelig I

I egenskab, i et forhold, der nøjagtigt følger de vedtagne I

I arvelove. Disse frø kan anvendes til produktion af planter I

I med nye og ønskede egenskaber. I

I 35 I

25 DK 175510 B1

Homozygote linier kan udvikles ved gentagen selvbestøvning og fremstilling af indavlslinier. Disse indavlslinier kan derpå anvendes til udvikling af hybrider. Ved denne frem-5 gangsmåde krydses én indavlslinie med en anden indavls-linie.

Dele, som kan fås fra regenererede planter, såsom f.eks. blomster, frø, blade, grene, frugter og lignende, er ligeledes omfattet af opfindelsen, såfremt disse dele 10 indeholder transformerede celler. Afkom (herunder hybrid-afkom), varieteter og mutanter af de regenererede planter er ligeledes omfattet af opfindelsen.

"Southern blot"-analysen kan eksempelvis gennemføres på følgende måde. DNA'et, som er udtaget fra de transforme-15 rede celler eller protoplaster, underkastes efter behandling med restriktionsenzymer en elektroforese i 1%'s agarosegel, overføres til en nitrocellulosemembran, jævnfør 37) E.M. Southern, J.Mol.Biol. 98, 503-517 (1975), og hybridiseres med det DNA, som skal påvises, og 20 som har været underkastet en såkaldt "nick-translation", jævnfør 38) w.J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes og P. Berg, J.Mol.Biol. 113, 237-251, (1977) (DNA-specifik aktivitet på 5 x 10® til 10 x 10® c.p.m./jig). Filtrene vaskes i tre gange 1 time med en vandig opløsning af 25 0,03 M natriumcitrat og 0,3 M natriumchlorid ved 65°C. Det hybridiserede DNA gøres synligt ved sværtning af en røntgenfilm i løbet af 24 til 48 timer.

En undersøgelse for enzymaktivitet kan - nærmere belyst ved testen for aminoglycosidphosphotransferase (enzym til 30 kanamycinspecifik phosphorylering) - eksempelvis gennemføres på følgende måde: Kallus- eller bladstykker (100-200 mg) homogeniseres i 20 μΐ ekstraktionspuffer i et Eppendorf-centri fugerør. Pufferen er en modifikation af den af 3) l. Herrera-Estrella, M. DeBlock, E. Messens,

DK 175510 B1 I

J.-P. Hernalsteens, M. Van Montagu og J. Schell, EMBO J. I

2, 987-995 (1983) anvendte puffer, som ikke er tilsat I

albumin fra okseblod, men som er tilsat 0,1 M saccharose. H

5 Ekstrakterne centrifugeres i 5 minutter ved 12000 G, og I

til supernatanten sættes bromphenolblåt til en slut- I

koncentration på 0,004%. Ved elektroforese i en 10%'s, I

ikke-denaturerende polyacrylamidgel adskilles proteinerne I

fra 35 μΐ supernatantfase. Gelen overlejres med en I

10 agarosegel, som indeholder kanamycin og y-32p-markeret I

ATP, hvorpå der inkuberes, og de phosphorylerede I

reaktionsprodukter overføres på et Whatman-p81-phospho- I

cellulosepapir. Papiret vaskes seks gange med deioniseret H

vand ved 90eC, hvorpå det autoradiograferes. H

15 De efterfølgende eksempler tjener til nærmere illustration I

af opfindelsen. De beskriver konstruktionen af et hybrid- I

gen og dets indføring i bærer-DNA-sekvenser med cyclisk H

karakter, overføringen af dette hybridgen til plante- I

celler, selekteringen af de transformerede planteceller I

20 og regenereringen af fuldstændige planter fra de transfor- H

merede planteceller samt de krydsningsgenetiske og I

molekylarbiologiske analyser deraf. I

I nedenstående eksempler anvendes følgende forkortelser: I

Medier: I

25 HeNa/F [10 mM Hepes, pH 7,1, 5 mM CaCl2, I

150 mM NaCl, 0,2 M mannitol, I

39) m. Fromm et al., (1985)] I

K3 [0,1 mg/1 2,4 D, 1,0 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 BAP, I

40) R.D. Shillito et al. (1981), I

30 41) J.I. Nagy og P. Maliga, (1976)] I

KA^AO [42) p. installe et al., (1985)] I

LS [43) e.M. Linsmaier, F. Skook, Physiologia

Plantarum 18, 100-127, (1965) ] I

27 DK 175510 B1

MaCa [0,4 M mannitol, 15 mM CaCl2x2H20, pH 5,6]

MaMg [0,4-0,5 M mannitol, 15 mM MgCl2, 0,1% MES, pH 5,6 ] 5 M [42) p. installe et al., (1985)] MAPiAO [42) p. installe et al., (1985)] MDs [44) i. Negrutiu et al., (1983) ] RP [42) p. mstalle et al., (1985)] r'SA [42) p. Installe et al., (1985)] 10 T [45) j.p. Nitsch og C. Nitsch, (1969)] w5 [154 mM NaCl, 125 mM CaCl2x2H20, 5 mM KC1, 5 mM glucose, pH 5,6-6,0, 46) Menczel et al., (1981)]

Kemikalier 15 BAP Benzylaminopurin 2,4 D (2,4-Dichlorphenoxy)eddikesyre NAA Naphthyleddikesyre EDTA Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν’-tetraeddikesyre PEG CMS Polyethylenglycol af CMS-typen 20 15) i. Negrutiu et al. (1986a) ] PEG 6R Polyethylenglycol af R-typen 10) R.D. Shillito et al., (1985)]

Tris-HCl ot, or, α-Tris-(hydroxymethyl )-methylamin-hydro- chlorid

25 NPT-II-gen Neomycin-3'-phosphotransferase-gen, type II

Tabelller ATF Absolut transformationsfrekvens GPPL Total-protoplasttal RTF Relativ transformationsfrekvens 30 UE Overlevende protoplaster efter transforma tionsbehandling ZT Antal transformanter

I DK 175510 B1 I

I 28 I

I De i eksemplerne anførte procentangivelser er baseret på I

I vægt/volumenangivelser (v/r, volumetrisk vægt). I

I Opfindelsen forklares endvidere under henvisning til I

I 5 tegningen, hvor I

I fig. 1 viser konstruktionen af plasmidvektoreme pABD I I

I og pABD II, som indeholder NPT-II-strukturgenet, I

I fig. 2 viser indvirkningen af MgCl2~koncentrationen (A) I

I samt af MgCl2/PEG-vekselvirkningen (B) på trans- I

I 10 formationsraterne ved Nicotiana tabacum c.v. I

I Petit Havanna SRi (A og B) samt ved Nicotiana I

I plumbaginifolia (A). I

I Afbildning A kurve a: N. tabacum SR^ I

I kurve b: N. plumbaginifolia I

I 15 Der gøres opmærksom på den halvlogaritmiske skalainddeling I

I ved MgCl2~koncentrationen (abscisse). PEG-koncentration I

I ligger i dette tilfælde på 20% (v/r). I

I Afbildning B kurve a: 15 mM MgCl2 I

I kurve b: 30 mM MgCl2 I

I 20 Eksempel 1 I

I Konstruktion af plasmidet pABDI I

I De frit tilgængelige plasmider pkm 21 og pkm 244 (47)

I E. Beck et al, Gene 1J), 327-336 (1982) skæres med I

I restriktionsendonucleasen Pstl. Plasmidfragmenterne, som I

I 25 anvendes til rekombinationen, renses ved elektroforese i I

I 0,8%'s agarosegel. Det ved sammenbinding af brudstykkerne I

I dannede plasmid pkm 21244 indeholder en kombination af 5'- I

I og 3'-Bal 31-sletningerne af NPT—Il-genet som beskrevet af I

I 47) Beck et al, Gene 19, 327-336 (1982). Til binding af I

I 30 promotorsignalet fra blomkålsmosaikvirus med Hindlll- I

29 DK 175510 B1 fragmentet af plasmidet pkm 21244, konstrueres koblings-plasmidet pJPAX. Koblingsplasmidet pJPAX dannes af plasmiderne pUC8 og pUC9, jævnfør 28) j. Messing og 5 J. Vieira, Gene 19, 269-276 (1982). 10 basepar af koblingssekvensen af plasmidet pUC9 isoleres ved skæring ved Hindlll- og SalI-positionerne og efterfølgende opfyldning af klæbrige ender med polymerase-I-Klenow-fragmentet, jævnfør 48) h. Jacobsen et al., Eur. J.

10 Biochem. 45, 623, (1974) og sammenbinding af poly- nucleotidkæderne, hvorved Hindlll-stillingen atter dannes.

Et syntetisk koblingsled på 8 basepar (Xhol) indføres ved Smal-positionen i den isolerede koblingssekvens. Rekombinationen af de egnede XorI- og Hindlll-fragmenter af 15 plasmidet pUC8 og det modificerede plasmid pUC9 giver plasmidet pJPAX med en delvis asymmetrisk koblingssekvens med de på hinanden følgende restriktionssteder: EcoRI, SMal, BamHI, Sall, PstI, Hindlll, BamHl, Xhol og EcoRI. CaMV-gen-VI-promotor-området, som er bundet til NPT-II-20 strukturgenet, stammer fra genomet for CaMV-stammen CM4 184, en variant af CaMV-stammens CM 1841, hvis fuldstændige nucleotidsekvens er beskrevet af 2^) R.C. Gardner et al., 1981. CaMV-promotor-området klones i det 6kb store cosmid pHC79, som er afledt af E. coli-plasmidet pBR322,

25 jævnfør 49) g, Hohns og J. Colins, 1980, idet CaMV-genomet samt cosmid pHC79 skæres med Bstll og de dannede brudstykker sammenføjes. Sammenbindingen af 5'-ekspressionssignalet fra blomkålsmosåikvirusgenet VI og Hindlll-. fragmentet fra NPT-II-genet gennemføres ved plasmid pJPAX

30 ved indføring af promotorområdet for blomkålsmosaikvirusgenet VI mellem PstI- og Hindlll-positionen. Det således dannede plasmid skæres ved den entydige Hindlll-position, og Hindlll-fragmentet af plasmidet pkm 21244 indbygges på dette skæringssted i de to orienterings-35 retninger, hvorved man får plasmiderne pJPAX Cakm+ og pJPAX Cakm". Til indsætning af en EcoRV-sekvens i nær-

I DK 175510 B1 I

I 30 I

I heden af 3'-termineringssignalet i NPT-II-hybridgenet I

I inkorporeres et BamHI-fragment af plasmidet pJPAX Cakm+ i I

I BamHI-positionen i plasmidet pBR 327, jævnfør 50) χ. I

I 5 Soberon et al., Gene 9, 287-305 (1980). Man får plasmidet I

I pBR 327 Cakm. EcoRV-fragmentet af plasmidet pBR 327 Cakm, I

I som indeholder den nye DNA-konstruktion, anvendes til I

I erstatning af EcoRV-området i blomkålsmosaikvirusgenet I

I VI, som er klonet ved Sall-positionen i plasmidet pUC8, I

I 10 hvorved den proteinkodende DNA-sekvens i NPT-II-genet I

I bringes under kontrol af 5' - og 3'-ekspressionsignalerne I

I fra blomkålsmosaikvirusgenet VI. De således fremstillede

I plasmider betegnes pABDI og pABDIl (se fig. 1). I

I Eksempel 2 I

I 15 Transformation af protoplaster fra Nicotiana tabacum c.v. I

I Petit Havanna SRI ved overføring af NPT-II-genet som en I

I del af plasmidet pABDI ved hjælp af Mq2+/pEG-behandling.

I Tobaksprotoplaster fra Nicotiana tabacum c.v. Petit I

I Havanna fremstilles under anvendelse af gængse fremgangs-

I 20 måder ud fra en tobaks-suspensionskultur, jævnfør I

I 12) χ. Potrykus og R.D. Shillito, Methods in Enzymology, I

I bind 118, Plant Molecular Biology, red. A. og H. Weiss- I

I bach, Academic Press, Orlando, 1986. Helt udfoldede blade I

I fra 6 uger gamle skudkulturer fjernes under sterile I

I 25 betingelser og fugtes grundigt med en enzymopløsning med I

I nedenstående sammensætning. I

31 DK 175510 B1

Enzymopløsning: H2O 70 ml

Saccharose 13 g "Macerozyme R 10" 1 g 5 Cellulase "Onozuka" R 10 (Yakult Co. Ltd,

Japan) 2 g "Drisellase" 10 (Chemische Fabrik

Schweizerhalle,

Schweiz) 0,13 g 2(n-Morpholin)-ethansul fonsyre (MES) 0,5ml 15 pH 6,0

Derefter skæres bladene ud i kvadrater med en kantlængde på 1-2 cm, og de anbringes svømmende på ovennævnte enzymopløsning. Inkubationen gennemføres natten over ved en temperatur på 26eC i mørke. Denne blanding roteres 20 derpå forsigtigt, hvorefter der inkuberes i yderligere 30 minutter til fuldstændig spaltning.

Suspensionen filtreres derpå gennem en stålsigte med en maskevidde på 100 μπι, skylles med 0,6 M saccharose (MES, pH 5,6) og centrifugeres derpå i 10 minutter ved 25 4000-5000 omdrejninger pr. minut. Protoplasterne samler sig på mediets overflade, som derefter fjernes under protoplasterne, f.eks. under anvendelse af en steriliseret injektionssprøjte.

Protoplasterne resuspenderes i et K3A medium [ saccharose 30 (102,96 g/1, xylose (0,25 g/1), 2,4-dichlorphenoxyeddike- syre D (0,10 mg/1), 1-naphthyleddikesyre (1,00 mg/1), 6-benzylaminopurin (0,20 mg/1), pH 5,8], som indeholder 0,4 M saccharose, jævnfør 12) 1. Potrykus og R.D. Shillito et al., 1981.

I DK 175510 B1 I

I 32 I

I Til gennemføring af transformationsforsøgene vaskes I

I protoplasterne først, hvorpå de tælles og derpå I

I resuspenderes i et W5~medium [154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, I

I 5 2H2O, 5 mM KC1, 5 mM glucose, pH 5,6], som sikrer en høj I

I overlevelsesrate for de isolerede protoplaster, i en I

I celletæthed på 1-2,5 x 10& celler pr. ml, jævnfør I

I 46) L. Menczel et al. (1981). Protoplasterne anvendes I

I derefter efter en inkubationstid på 30 minutter ved 6 til I

I 10 8°C til transformationsforsøgene. I

I I

I Kort tid før den egentlige transformation af de isolerede I

I protoplaster erstattes Ws-mediet med det egentlige I

I transformationsmedium. Dette er en mannitol/magnesium-

I opløsning [MaMg-opl.: 0,4-0,5 mM mannitol, 0,1% MES I

I 15 (morpholinethansulfonsyre), pH 5,6] med en Mg2+-koncentra- I

I tion på 12 til 16 mM. Protoplasterne isoleres først fra I

I W5~opløsningen ved centrifugering i 5 minutter ved 100 G, I

I hvorpå de resuspenderes i MaMg-mediet (0,3 ml). Til denne

I suspension sættes derpå 65 μΐ vandig DNA-opløsning, som I

I 20 indeholder 5-10 μg af plasmidet pABDI og 50 μg kalve- I

I thymus-carrier-DNA. . Sidstnævnte stof er et neutralt I

I carrier-DNA uden transformerende insert, der sættes til

I blandingen i overskud til beskyttelse mod en nuclease- I

I spaltning af DNAVet, som skal transformeres. Efter et I

I 25 tidsrum på fra ca. 0,1 til 10 minutter fra DNA-tilsætnin- I

I gen foretages applikation af en vandig 40%'s polyethylen- I

I glycolopløsning (v/r) til en slutkoncentration på 24-28% I

I (v/r). Det er særligt fordelagtigt at anvende PEG af

I CMS-typen. Der er tale om en Ca2+-holdig [0,1 Μ I

I 30 Ca(N03)2*4H20 ] 0,4 M mannitolopløsning, der indeholder PEG I

I med en molekylvægt på fra ca. 1000 til ca. 6000 i en I

I slutkoncentration på 40% (v/r). Denne opløsnings pH-værdi I

I ligger mellem 7 og 9, jævnfør 15) χ. Negrutiu et al. I

I (1986a). I

I 35 I tilfælde af Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SRI I

I anvender man fortrinsvis PEG CMS 4000. Transformations- I

33 DK 175510 B1 mediets pH-værdi indstilles derpå på en pH-værdi på 7.

Denne blanding inkuberes under lejlighedsvis rotation i 30 minutter ved 26°C.

5 Ved anvendelse af høje PEG-koncentrationer på mere end 20% er det fordelagtigt at foretage en trinvis fortynding med det 3- til 5-dobbelte rumfang af en 0,2 M CaCl2~opløsning.

Derefter isoleres de på denne måde behandlede proto-piaster ved centrifugering (5 minutter ved 100 G), hvorpå 10 de resuspenderes i frisk ^-medium (0,3 ml protoplast-opløsning i 10 ml frisk ^-medium). Den fortsatte inkubation gennemføres i 10 ml portioner i petriskåle med en diameter på 10 cm ved 24eC i mørke, hvorved popula-tionstætheden udgør 4-8x10^ protoplaster pr. ml. Efter 15 3 dages forløb fortyndes kulturmediet i hver skål med 0,3 rumfangsdele frisk K3~medium, og der inkuberes i yderligere 4 dage ved 24*C og kunstig belysning på 3000 lux. Efter i alt 7 dage indlejres de af proto-plasterne udviklede kloner i med 1% agarose størknet, 20 50 mg/l kanamycin indeholdende næringsmedium, og der foretages dyrkning ved 24*C i mørke under anvendelse af "bead type"-kulturmetoden, jævnfør 51) R.D. Shillito et al., Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983). Næringsmediet erstattes alle 5 dage med frisk ensartet næringsopløsning.

25 Eksempel 3

Regenerering af kanamyclnreslstent N. tabacum c.v. Petit Havanna SRI

Efter 3-4 ugers fortsat dyrkning i kanamycinholdigt næringsmedium udplantes de resistente kalli med en 30 diameter på 2-3 mm på LS-kulturmedium størknet med agar, I

jævnfør 43) e.M. Linsmaier og F. Skook, Physiol. Plant 18, 100-127 (1965), indeholdende 0,05 mg/l 2,4-dichlor- phenoxyeddikesyre, 2 mg/l 1-naphthyleddikesyre, 0,1 mg/l

I DK 175510 B1 I

I 34 I

I 6-benzylaminopurin, 0,1 mg/1 kinetin og 75 mg/1 kanamycin. I

I Ved skudinduktion på LS-medium Indeholdende 150 mg/1 I

I kanamycin og 0,2 mg/1 6-benzylaminopurin og efterfølgende I

I 5 roddannelse på T-medium, jævnfør 45) y.p. Nitsch og I

I C. Nitsch, Science 163, 85-87 (1969), får man kanamycin- I

I resistente Nicotiana tabacum-planter af sorten Petit

I Havanna SRI. I

I Eksempel 4 I

I 10 Transformation af protoplaster fra Nicotiana plumbagini- I

I folia ved overføring af NPT-II-qenet som del af plasmidet I

I pABDI ved hjælp af Mg2+/PEG-behandling. I

I ' isoleringen af protoplasterne samt forinkubationen af I

I protoplasterne, som skal anvendes til de egentlige I

I 15 transformationsforsøg, gennemføres på nøjagtig samme måde

I som beskrevet for Nicotiana tabacum SRI. I

I Den egentlige transformation af de på den anførte måde I

I forbehandlede N-plumbaginifolia-protoplaster gennemføres i I

I en, mannitol/magnesium-opløsning, jævnfør MaMg-opl.: I

I 20 0,4-0,5 mM mannitol, 0,1% MES (morpholinethansulfonsyre), I

I pH 5,6 med en Mg2+-ionkoncentration på 22-27 mM. Efter I

I tilsætning af en vandig DNA-opløsning (65 μΐ) indeholdende I

5-10 μς af plasmidet pABDI samt 50 pg kalvethymus-carrier- I

DNA, foretages applikation af en vandig 40%'s poly- I

25 ethylenglycolopløsning (v/r) til en slutkoncentration på I

18-22% (v/r). - I

Tidsrummet mellem DNA-tiIsætning og PEG-applikation udgør I

i reglen kun 0,1-10 minutter. Også i tilfælde af I

Nicotiana plumbaginifolia er anvendelsen af PEG CMS 4000 I

30 særlig fordelagtig for opnåelsen af høje transformations- I

rater. Transformationsmediets pH-værdi indstilles der- I

efter på pH 7. Der foretages en ca. 30 minutters inkuba- I

35 DK 175510 B1 tion af denne transformationsopløsning ved en temperatur på 26°C under lejlighedsvis svingning af blandingen.

De isolerede protoplaster dyrkes først i et tidsrum på 5 4-12 dage i et medium med høj hormonkoncentration, KA^AO-medium, 42) P. Installs et al., J. Plant. Physiol.

119, 443-454 (1985) i en celletæthed på 2-3xl04 proto- plaster/ml.

Efter dannelsen af celleaggregater udvælges de overlevende 10 kolonier, som optælles og suspenderes i stærk fortynding (0,5-2xl02 kolonier/ml i et MDs-medium, jævnfør 44) I. Negrutiu et al., Theor. Appl. Genet. 66, 341-347, (1983), eller et MAPiAO-medium, jævnfør 42) P. Installs et al., (1985) med lavt hormonindhold indeholdende 20-40 mg/1 15 kanamycin-sulfat. Derefter indlejres kolonierne i agar I (1% agarose) og dyrkes under anvendelse af "bead-type"- I dyrkningsmetoden, jævnfør 51) R.D.Shillito et al., (1983) I ved en temperatur på 24°C og i mørke. Næringsmediet I erstattes alle 5 dage med frisk ensartet dyrknings- I 20 opløsning.

I Eksempel 5 I Regenerering af kanamycinreslstente N. plumbaginifolia- I planter I Efter en dyrkningstid på 3-4 uger udvælges de resistente I 25 kalli, som har opnået en diameter på 2-5 mm, hvorpå de I videredyrkes på faste medier indeholdende 50 mg/1 I kanamycin i yderligere 3-5 uger.

I Regenereringen af hele planter gennemføres derpå under I anvendelse af fremgangsmåden ifølge 42) P. Installs et al.

I 30 (1985) ved overføring af de resistente kalli fra et I RP-medium til et R'SA og/eller et M-medium.

I DK 175510 B1 I

I 36 I

I Eksempel 6 I

I Påvisning af NPT-II-genet 1 plantearveanlægget. I

I 0,5 g kallus fra de transformerede cellekulturer eller I

I 5 bladvæv fra de deraf regenererede planter homogeniseres I

I ved 0°C i 15%'s saccharoseopløsning indeholdende 50 mmol/1 I

I ethylendiamin-Ν,Ν,Ν,Ν',-tetraeddikesyre, EDTA), 0,25 I

I mol/1 natriumchlorid og 50 mmol/1 or, or, or-tris-(hydroxy- I

I methyl)-methylamin-hydrochlorid (TRIS-HC1) ved pH 8,0. Ved I

I 10 centrifugering af homogenatet i 5 minutter ved 1000 G I

I foretages en grov fraskillelse af cellekernerne. Celle- I

I kernerne resuspenderes i 15%'s saccharoseopløsning I

I indeholdende 50 mmol/1 EDTA og 50 mmol/1 TRIS-HC1 ved pH I

I 8,0, hvorpå der tilsættes natrium-dodecylsulfat til en I

I 15 slutkoncentration på 0,2%, og blandingen opvarmes i I

I 10 minutter til 70eC. Efter afkøling til 20-25°C sættes I

I kaliumacetat til blandingen til en koncentration på I

I 0,5 mol/1. Denne blanding inkuberes i 1 time ved 0°C. Det I

I udfældede bundfald isoleres ved centrifugering i 15 minut- I

I 20 ter ved 4CC i en mikrocentrifuge. Fra supernatanten I

I udfældes DNA'et ved tilsætning af det 2,5-dobbelte rumfang I

I ethanol ved 20-25*C. Det udskilte DNA opløses i en I

I opløsning af 10 mmol TRIS-HC1 indeholdende 10 μg/ml

I ribonuclease A, blandingen inkuberes i 10 minutter ved I

I 25 37°C, hvorpå der tilsættes proteinase K til en koncen- I

I tration på 250 /ig/ml, og blandingen inkuberes i yder- I

I ligere 1 time ved 37°C. Proteinasen K fjernes ved ekstrak- I

I tion med phenol og chloroform/isoamylålkohol. Fra den I

I vandige fase udfældes DNA'et ved tilsætning af 0,6 rum- I

I 30 fangsdele 0,6 molær isopropanolisk natriumacetatopløs- I

I ning, hvorpå det opløses i 50 μ1 opløsning indeholdende I

10 mmol/1 TRIS-HC1 og 5 mmol/1 EDTA ved pH 7,5. Ved denne I

fældning får man DNA-sekvenser, der overvejende indeholder I

mere end 50000 basepar. Restriktion af dette DNA med I

35 EcoRV-endonuclease, hybridisering af fragmenterne med ra- I

37 DK 175510 B1 dioaktivt mærkede HindiII-brudstykker af NPT-II-genet og sammenligning med plasmidet pABDl konstateres ved en "Southern Blot"-analyse tilstedeværelsen af NPT-II-genet i 5 cellekeme-DNA'et fra de transformerede Nicotiana tabacum-celler samt Nicotiana plumbaginifolia-celleme.

Resultater I det følgende diskuteres de opnåede transformationsresultater i sammenhæng med forskellige transformations-10 parametre.

Til dette formål angives de opnåede transformationsrater i form af "relative transformationsfrekvenser" (RTF) eller "absolutte transformationsfrekvenser" (ATF).

Ved de "relative transformationsfrekvenser" forstår man 15 forholdet mellem antallet af transformanter og den overlevende fraktion (der er i stand til at danne kolonier) for en ikke-selekteret dyrket protoplastpopulation. Den "absolutte transformationsfrekvens" er derimod defineret som forholdet mellem det samme antal transformanter og det 20 oprindelige antal protoplaster, som inden transformationen er blevet karakteriseret som levende.

En sammenligning mellem ATF- og RTF-værdieme er et godt udtryk for overlevelsesfaten for protoplasterne efter gennemføring af de enkelte transformations- og selekte-25 ringstrin.

Indflydelse af det anvendte DNA's struktur og koncentration på transformationsraten

Tabel 1; Indflydelsen af DNA-strukturen samt af koncentrationsforholdet mellem plasmid-DNA (pABDl) og 30 carrier-DNA på transformationsraterne (RT og ATF) hos Nicotiana plumbaginifolia-protoplaster.

DK 175510 B1 I

38 I

Transformationsforsøgene gennemføres i en MaCa-opløsning I

ved en PEG CMS4-koncentration på 13%. I

DNA-Jconcentration GPPL UE ZT RTF ATT . I

[ug/ml] xlO6 xlO" xl0~* xlO

Lineært pABDI I

10+20 2 45 4 0,085 0,02 10+50 2 49,6 23 0,464 0,12 50+10 2 46,4 1 0,022 0,005

Cirkulært pABDI I

10+50 2 45,4 0 <0,01 <0,005 50+10 2 41,6 0 <0,01 <0,005

DNA-strukturens indflydelse på transformationsraterne kan I

5 demonstreres ved hjælp af eksemplet med Nicotiana I

plumbaginifolia (tabel 1). I

Det viser i løbet af de gennemførte transformationsforsøg, I

at man ved anvendelse af lineært DNA opnår klart højere I

transformationsfrekvenser, end det er tilfældet med et I

10 cirkulært DNA. De opnåede transformationsrater ligger i I

tilfælde af det lineære DNA op til to tierpotenser højere I

end de tilsvarende værdier ved anvendelse af et cirkulært I

DNA. I

Tabel 1 viser tydeligt, at ikke blot DNA-strukturen men I

15 også forholdet mellem plasmid-DNA og tilsat carrier-DNA I

spiller en rolle for de opnåelige transformations- I

frekvenser. I

De bedste resultater opnår man, når carrier-DNA anvendes i I

klart overskud i forhold til plasmid-DNA, idet et forhold I

20 på 10:50 (plasmid-DNA:carrier-DNA) er særligt fordel- I

agtigt. I

De her opnåede resultater bekræfter resultater, som I

tidligere er blevet opnået med tobak-systernet, jævnfør I

10) R.D. Shillito et al., Bio/Technologie 3, (1985). I

39 DK 175510 B1 2. Indvirkning af PEG-koncentration på transformationsraten.

Tabel 2: Indvirkningen af PEG-koncentrationen på transfor-5 mationsrater (RTF og ATF) for Nicotiana plumbaginifolia og Hicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SRI (C-S.) protoplaster. Transformationsforsøgene gennemføres i en W5~saltopiøsning ved et DNA-koncentrationsforhold mellem plasmid- og carrier-DNA på 1:5.

PEG-koncentration {%, v/rl GPPL S ZT RTF ATF

N. plumbaginifolia PEG CMS4 8 % 0,72 - 2 0,13 0,03 (±0,02) 13% 1,05 - 7 0,26 0,063 (1:0,035) 20 % 0,90 - 22 1,45 0,25 (±0,06) 24 % 1,0 - 32 2,0 0,32 (±0,07) 27 % 1,0 - 46 3,1 0,46 (±0,05) N. tabacum, SRi PEG CMS6 13 % 0,33 - 14 0,28 (±0,15) 20 % 0,33 30 0,90 (±0,05) 26 % 0,33 - 40 - 1,2 (±0,08) 10 Tabel 2 viser tydeligt indvirkningen af forskellige PEG-koncentrationer på de opnåelige transformationsfrekvenser ved N. tabacum SRI og N. plumbaginifolia. I begge tilfælde konstateres en entydig sammenhæng mellem de to parametre. Ved en forøgelse af PEG-koncentration fra 15 henholdsvis 8% til 27% i tilfælde af N. plumbaginifolia og fra 13% til 26% ved N. tabacum SRI indtræder der en stigning i de opnåede transformationsfrekvenser, som stiger fra henholdsvis 0,03 x 10-4 til 0,28 x 10-4 og fra 0,46 x 10“4 til 1,2 x 10"4.

I DK 175510 B1 I

I 40 I

I 3. Indvirkning af MgClo-koncentrationen på transforma- I

I tionsraten I

I Tabel 3: Indvirkning af MgC 12 - ko ncent r at ionen, applika- I

I 5 tionstidspunktet, den anvendte PEG-opløsning samt, ved I

I høje PEG-koncentratloner (> 25%), vaskebetingelserne på I

I transformationsraten for N. tabacum SRI protoplaster. Til I

I transformationsforsøgene anvendes såvel PEG CMS4- som I

I PEG CMS6-opløsninger med en s lutkoncentration på 20% I

I 10 (undtagelser ér anført for sig i tabellen). I

I Transformation GPPL ZT ATF_, I

I xlO6 xlO I

I 1. Kontrol I

I Ws,intet Mg2+ , 0,59 77 0,13 i 0,03 I

I He Na/F, intet0,26 .265 . 1,0 ±0,38

I MaMg 12mM, 8% PEG6R, I

I 1500V, 3 Pulse, 1 KO, 10 nF 0,26 324 1,3 ± 0,26

I MaMg 6mM, intet PEG 0,33 0 I

I Som ovenfor + 0,1M MgCl2 I

I efter tilsætning af DNa 0,33 0 I

I 2. MgCl2-tilsætning umiddelbart inden transformation I

I WS + MaMg(1:1, MgCl2 4mM) 0,37 1033 2,7 ± 0,46 I

I W5 + MaMg(1:1, MgClz 8mM) 0,33 1087 3,3 ± 0,48 I

MaMg 6mM 0,50 2045 4,1+0,51 I

MaMg 12mM · 0,50 2056 4,1 + 0,86

3. MgCl2-tilsætning 2 timer inden transformation I

MaMg 6mM 0,33 382 1,2 ± 0,30 I

4. PEG-sammensætning (MaMg 12mM) I

PEG CMS 4(24%) 0,32 693 2,2 + 0,55 I

PEG R6 (24%) 0,32 474 1,5 ± 0,34

5. Vaskebetingelser (MaMg 12mM; 25% PEG) I

CaCl2.2H20 0,2M 0,32 1127 3,5 ±0,56 I

W5 0,32 686 2,1 ± 0,43

MaMg.... mM angiver MgCl^-koncentration i en MaMg-opløsning. I

41 DK 175510 B1 a) Applikationstidspunkt; Det fremgår af tabel 3, at de bedste resultater opnås med en transformationsrate på 4,1 x 10“3, når tilsætningen af MgCl2 til transforma-5 tionsmediet foretages umiddelbart inden den egentlige transformation.

Hvis transformationen derimod først gennemføres 2 timer efter den foretagne MgC^-applikation, ligger transformationsraterne kun ved værdier på 1,2 x 10“3.

10 Tillige bevirker en kombination af en mannitol/MgCl2“ opløsning (MaMg-opløsning) med en W5-saltopløsning i et blandingsforhold på 1:1 en mere eller mindre kraftig formindskelse af transformationsfrekvensen afhængigt af den molære MgCl2-koncentration. Hvis man eksempelvis 15 halverer MgCl2~koncentrationen i MaMg-opløsningen, medfører dette en formindskelse af transformationsraten med omkring 20%.

Sammenligner man derimod resultaterne af kontrolforsøgene, som kun gennemføres i nærværelse af egnede pufferopløs-20 ninger (W5- eller HeNa/F-opløsning), jævnfør M. Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5842-5848, (1985), men i fravær af Mg2+-ioner, konstateres det, at transformationsfrekvenserne i disse tilfælde ligger mere end en tierpotens lavere. Selv ved anvendelse af elektroparation 25 er det ikke muligt at opnå de tidligere omtalte høje transformationsrater.

PBG/mg2+-synergisme: Den synergistiske virkning ved samtidig applikation af Mg2+-ioner og PEG viser sig meget tydeligt ved en sammenligning af transformationsresulta-30 terne af kontrolforsøg, som er gennemført i nærværelse af MgCl2 (6 mM) men uden tilsætning af PEG, samt de egentlige udførelseseksempler, i hvilke MgCl2 og PEG er anvendt sammen (tabel 3).

I DK 175510 B1 I

I 42 I

I Kontrolforsøgene i nærværelse af MgCl2 i en koncentration I

på 6 iM men uden tilsætning af PEG fører i intet tilfælde I

I til påviselige transformationsresultater. I

5 Derimod opnås ved applikation af PEG (ved en slutkoncen- I

I tration på 20%, v/r) umiddelbart efter (0,1-10 minutter) I

I DNA-tilsætningen til det MgCl2_holdige transformations- I

I medium de ovenfor omtalte høje transformationsrater på 4,1 I

I x 10-3. I

I 10 Disse transformationsrater er således også mere end en I

I tierpotens større end de sammenlignelige resultater af I

I forsøg, hvor der udelukkende anvendes PEG uden MgCl2~ I

I tilsætning (se tabel 2). I

I I modsætning til tobak, hvor maksimale transformations- I

15 rater opnås i et koncentrationsområde på 12-15 mM MgCl2 I

ved en samtidig PEG CMS-koncentration på 28% (fig. 2B), er I

optimumsområdet ved N. plumbaginifolia forskudt til I

højere MgCl2~værdier (se fig. 2A). I

Maksimale transformationsrater opnås i dette tilfælde ved I

20 MgCl2~Koncentrationer i området mellem 20 og 30 mM og en I

PEG-koncentration på 20%. Der opnås transformationsrater I

på 3,9 x ΙΟ"4. I

PEG-sammensætning: Foruden de allerede omtalte parametre I

har også sammensætningen af den anvendte PEG-opløsning I

25 indvirkning på de opnåelige transformationsfrekvenser. Ved I

anvendelse af PEG CMS, jævnfør *5) I. Negrutiu et al., I

(1986a) og PEG 6R, jævnfør 10) r.d. Shillito et al., I

(1985), under ellers samme forsøgsbetingelser (PEG-koncen- I

tration 24%, MgCl2^koncentration 12 mM) opnås der i første I

30 tilfælde klart højere transformationsrater, som er en I

faktor 1,4 større end de andre. H

43 DK 175510 B1

Ved anvendelse af høje PEG-koncentrationer på 24% (20% i tilfælde af N. piumbaginifolia) er det fordelagtigt at eftervaske de behandlede protoplaster med en 0,2 M CaCl2 5 x 2H20-holdig opløsning.

Ved denne foranstaltning kan transformationsraten forøges med en faktor 1,7 sammenlignet med en behandling med en simpel saltopløsning (Wg-opløsning).

4. Påvisning af overføringen af det transformerede gen til 10 de kønnede efterkommere samt dets nedarvning som normalt plantegen

Omfattende genetiske krydsningsanalyser og udførlige molekylarbiologiske undersøgelser (eksempelvis "Southern blot"-analyse af plantegenomets DNA, undersøgelse af 15 enzymaktiviteten for aminoglycosidphosphotransferasen, dvs. enzymet for den kanamycin-specifikke phosphorylering) med de genetisk ændrede planter (første generation og efterkommere) har givet følgende resultater: 1. Det bakterielle gen er stabilt inkorporeret i plante-20 genomet.

2. Det overføres i reglen uændret og regelmæssigt til krydsningsefterkommere.

3. Dets arvegang svarer til arvegangen for et naturligt, enkelt dominant plantegen.

25 4. Den molekylære analyse ved hjælp af DNA-hybridisering og enzymtest bekræfter resultaterne af den genetiske krydsningsanalyse.

5. De genetisk ændrede planter har bibeholdt deres normale, naturlige fænotype under behandlingen, der er 30 således ikke konstateret nogen uønskede ændringer.

Disse resultater viser, at man med fremgangsmåden ifølge opfindelsen til direkte genoverførsel i protoplaster har

I DK 175510 B1 I

I 44 I

I fundet den bedste vej til den målrettede genetiske ændring I

I af plantemateriale. Den genetiske ændring er stabil, og I

I uønskede ændringer af plantens genotype optræder ikke. I

I 5 Litteratur: I

I 1. S.J. Rothstein og W.S. Reznikoff, Cell, 23, 191-199, I

I (1981) I

I 2. L. Herrera-Estrella et al., Nature, 303, 209-213, I

I (1983) I

I 10 3. M.W. Bevan og R.B^ Flavell, Nature, 304, 184-187, I

I (1983) I

I 4. M.-D. Chilton, Scientific American, 248(6), 50-59, I

I (1983) I

I 5. L. Herrera-Estrella et al., EMBO J., 2(6), 987-995, I

I 15 (1983) I

I 6. N. Murai et al, Science, 222, 476-482, (1983) I

I 7. R.B. Harsch et al, Science, 223, 496-498, (1984) I

I 8. R.T. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, I

I 4803-4807, (1983) I

I 20 9. I. Potrykus et al., Plant Molec. Biol. Rep. 3, I

I 117-128, (1985) I

I 10. R.D. Shillito et al., Bio/Technology, 3, 1099-1103, I

I (1985) I

I 11. E. Neumann et al., EMBO J., 7, 841-845, (1982) I

I 25 12. I. Potrykus og R.D. Shillito, Methods in Enzymology, I

I 118, 449-578 (1986), Plant Molecular Biology, red. I

A. & H. Weissbach, Academic Press, Orlando (1986) I

13. H. Koblitz, Methodische Aspekte der Zell- und Gewebe- I

ztichtung bei Gramineen unter besonderer Berticksichti- I

30 gung der Getreide Kulturpflanze XXII, 93-157, (1974) I

14. McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual,

MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, I

H. Stache, "Tensid-Taschenbuch", Carl Hanser Verlag, I

Mtinchen/Wien, 1981 I

35 15. I. Negrutiu et al., Theor. Appl. Genet, 72, 279-86

(1986a) I

45 DK 175510 B1 16. U. Wienand et al., Mol. Gen. Genet, 182, 440-444 (1981) 17. D. Pennica et al., Nature, 301, 214-221, (1983) 5 18. P. Stepien et al., Gene, 24, 289-297, (1983) 19. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 20. G. Franck et al., Cell, 21, 285-294, 1980 21. Hohn et al., Molecular Biology of Plant Tumors", 10 Academic Press, New York, side 549-560, 1982 22. Berry-Lowe et al., J. Mol. Appl. Genet, 1, 483-498, 1982 23. Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, red. A. Cashmore, Plenum, New York 1983, 15 side 29-38 24. G. Coruzzi et al., The Journal of Biological Chemistry, 258, 1399, 1983 25. P. Dunsmuir et al., J. Mol. Appl. Genet, 2, 285, 1983 26. R.C. Gardner et al., Nucl. Acids Res, 9(12), 20 2871-2888, 1981 27. R.L. Rodriguez og R.C. Tait, Recombinant DNA techniques, Addison-Wesley Publishing Corp., London, Amsterdam, Don Mills, Ontario, Sydney, Tokyo, 1983 28. J. Messing og J. Vieira, Gene, 19, 269-276, (1982) 25 29. Evans et al., "Protoplast Isolation and Culture", i

Handbook of Plant Cell Culture, 1, 124-176 (Mac Millan Publishing Co., New York, 1983) 30. M.R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts, 1983 30 - Lecture Proceedings, side 19-29, (Birkhåuser, Basel, 1983) 31. P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and other Recalcitrant Crops", i Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, side 31-41 (Birk- 35 håuser, Basel 1983) 32. H. Binding, "Regeneration of Plants", i Plant Protoplasts, side 21-37, (CRC Press, Boca Raton, 1985)

I DK 175510 B1 I

I 46 I

I 33. R Abdullah et al., Bio/Technology, 4, 1087-1090, 1986 I

I 34. T. Fujimura et al., Plant Tissue Culture Lett., 2, I

I 74-75, 1985 I

I 5 35. K. Toriyama et al., Theor. Appl. Genet, 73, 16-19, I

I 1986 I

I 36. Y. Yamada et al., Plant Cell Rep., 5, 85-88, 1986 I

I 37. E.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517, (1975) I

I 38. W.J. Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237-251, (1977) I

I 10 39. M. Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, I

I 5842-5848, (1985) I

I 40. R.D. Shillito et al., Mutation Research, 81, 165-175, I

I (1981) I

I 41. J.I. Nagy og P. Maliga, Z. Pflanzenphysiologie, 78, I

I 15 453-455 (1976) I

I 42. P. Installe et al., J. Plant Physiol., 119, 443-454, I

I (1985) I

I 43. E.M. Linsmaier og F. Skook, Physiol. Plant, 18, I

I 100-127, (1965) I

I 20 44. I. Negrutiu et al., Theor. Appl. Genet, 66, 341-347 I

I (1983) I

I 45. J.P. Nitsch og C. Nitsch, Science, 163, 85-87, (1969) I

I 46. L. Menczel et al., Theor. Appl. Genet, 59, 191-195, I

I (1981) I

I 25 47. E.Beck et al., Gene, 19, 327-336, (1982) I

I 48. H. Jacobsen et al., Eur. J. Biochem., 45, 623 (1974) I

I 49. B Hohn og J. Collins, Gene, 11, 291-298, 1980 I

I 50. X. Soberon et al., Gene, 9, 287-305, (1980) I

I 51. R.D. Shillito et al., Plant Cell Reports, 2, 244-247, I

I 30 (1983) . I

Claims (33)

1. Fremgangsmåde til transformation af plante-arveanlæg, kendetegnet ved, at man 5 isolerer planteprotoplaster fra vilkårlige plantevæv og dyrker dem i et af de sædvanligvis til dyrkningen af planteprotoplaster anvendte næringsmedier, forinkuberer protoplasterne inden den egentlige transformation i fra 20 minutter til 6 timer i et forinkubations-10 medium indeholdende Ca2+-, K+- og Na+-ioner samt en egnet C-kilde ved en temperatur på 4-10°C, isolerer protoplasterne fra forinkubationsmediet og resuspenderer dem i det egentlige transformationsmedium, der som væsentlig bestanddel indeholder 0,1-60 mM Mg2+-15 ioner i nærværelse eller fraværelse af Ca2+-ioner, umiddelbart derefter sætter en DNA-probe indeholdende et eller flere gener under kontrol af ekspressionssignaler, som er aktive i planter, samt et bærer-DNA til transformationsopløsningen, 20 0,1-10 minutter senere tilsætter et middel, som modifi cerer plasmamembranen, og inkuberer protoplaster og DNA-probe i transformationsopløsningen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til optagelse af DNA'et i protoplasterne. 25 ·

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at transformationsopløsningen indeholder Mg2+-ioner i en koncentration på 10-30 mM. 1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at 35 polyethylenglycolslutkoncentrationen i inkubationsmediet er 10-30%.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det plantemembranmodificerende middel er polyethylen-glycol. I DK 175510 B1 I I 48 I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at I I polyethylenglycolslutkoncentrationen er 20-28%.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I 5 inkubationsopløsningens pH-værdi ligger fra 5,6 til 12. I

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at inkuba- I I tionsopløsningens pH-værdi ligger fra 7 til 10. I I 10 8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I koncentrationen af DNA-proben indeholdende et eller flere I I gener af vilkårlig oprindelse under kontrol af ekspres- I I sionssignaler, som er aktive i planter, og tillige indehol- I I dende en neutral DNA-sekvens, som flankerer genet, dvs. en I I 15 DNA-sekvens, som ikke deltager i genets funktion udgør 2-20 ,' I I Mg/ml· I

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at konce- I I ntrationen af DNA-proben udgør 5-10 /zg/ml. I I 20 I

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I transformationsopløsningen yderligere tilsættes neutralt I I DNA uden transformerende gen som carrrier-DNA i overskud. I I 25 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at I I det neutrale DNA er animalsk DNA, DNA fra planter, X-DNA, I I plasmid-DNA eller et vilkårligt DNA, som er egnet til I I gennemførelse af fremgangsmåden. I I 30 12. Fremgangsmåde ifølge et af kravene -10 eller 11, I I kendetegnet ved, at det neutrale DNA er kalvethymus- I I carrier-DNA. I

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at I I 33 koncentrationen af carrier-DNA*et er 50-70 μg/ml. I 49 DK 175510 B1

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at forinkubationen af protoplasterne gennemføres i et tidsrum på fra 20 minutter til 1 time.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den fælles inkubation af protoplaster og DNA i nærværelse af et middel, som modificerer plasmamembranen, gennemføres i det egentlige transformationsmedium, der som essentielle bestanddele indeholder 0,1-60 mM Mg^+-ioner i nærværelse 10 eller fraværelse af Ca2+-ioner, i et tidsrum på fra 10 minutter til 6 timer.

16. Fremgangsmåde ifølge krav. 1, kendetegnet ved, at man som transformerende gen anvender et gen, hvis 15 strukturdel stammer fra planter, dyr, mikroorganismer, vira eller er af syntetisk oprindelse, og hvis ekspressionssignaler stammer fra planter, dyr eller er af syntetisk oprindelse.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det transformerede gen enten består af genomisk DNA fra et cDNA eller af syntetisk DNA.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at 25 det transformerende gen er sammensat af såvel genomisk DNA som af cDNA og/eller syntetisk DNA.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det transformerende gen er sammensat af genfragmenter fra 30 flere organismer, som hører til forskellige slægter. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det transformerende gen er sammensat af genfragmenter fra mere end én stamme, én varietet eller én art af den samme 35 organisme. I DK 175510 B1 I I 50 I

21. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at I I det transformerende gen er sammensat af dele af mere end ét I I gen fra samme organisme. I I 5 22. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at I I det transformerende gen har en strukturdel, som tilfører I I den plante, som skal transformeres, en nyttig og ønskelig I I egenskab. I I 10 23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at I I strukturgenet bibringer planten en forøget resistens eller I I tolerance over for patogener, herbicider, insekticider og/- I I eller andre biocider. I I 15 24. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at I I strukturgenet forbedrer dannelsen og kvaliteten af reserve- I I og lagerstoffer i blade, frø, knolde, rødder og stængler. I

25. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at I I 20 strukturgenet koder for farmaceutisk acceptable aktive stof- I I fer. I

26. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at I I ekspressionssignalerne stammer fra gener fra planter eller I I 25 plantevira. I

27. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at. I I ekspressionssignalerne stammer fra et plantegen, som koder I I for den lille underenhed af ribulosediphosphatcarboxylasen I I 30 eller for klorofyl-a/b-bindingsproteinet. I

28. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at eks- I I pressionssignalerne stammer fra gener fra plantevira. I I 35 29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at I I der er tale om blomkålsmosaikvirus (CaMV). I 51 DK 175510 B1

30. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved. at der er tale om 35 S-ekspressionssignalerne fra CaMV-genomet.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kendetegnet ved, at * 5 der er tale om 19 S-ekspressionssignalerne fra CaMV-genomet.

32. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man . som planteprotoplaster anvender sådanne fra en enkelt planteart eller fra en systematisk enhed, som er underordnet arten. 10

33. Fremgangsmåde ifølge krav 32, kendetegnet ved, at protoplasterne er udvundet af blade, spirer, stængler, blomster, rødder, pollen eller embryoner.

34. Fremgangsmåde ifølge krav 33, kendetegnet ved, at der er tale om bladprotoplaster.

35. Fremgangsmåde ifølge krav 32, kendetegnet ved, at 20 protoplasterne er udvundet fra cellekulturer.

36. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at protoplasterne stammer fra planter hørende til familierne Solanaceae, Cruciferae, Compositae, Liliaceae, Vitaceae,

25 Chenopodiaceae, Rutaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae, Asparagaceae, Orchidaceae, Palmae, Bromeliaceae, Rubiaceae, Theaceae, Musaceae eller Gramineae eller ordenen Leguminosae.

37. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at protoplasterne hører til familierne Solanaceae, Cruciferae og Gramineae.

38. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 35 protoplasterne er fra majs, ris, hvede, byg, rug, havre eller hirse. --M- I DK 175510 B1 I 52

39. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegne t ved, at protoplasterne er fra slægterne Solanum, Nicotiana, I Brassica, Beta, Pisum, Phaseolus, Glycine, Helianthus, Allium, Avena, Hordeum, Oryzae, Setaria, Secale, Sorghum, I 5 Triticum, Zea, Musa, Cocos, Cydonia, Pyrus, Malus, Phoenix, Elaeis, Rubus, Fragaria, Prunus, Arachis, Secale, I Panicum, Saccharum, Coffea, Camellia, Musa, Ananas, Vitis I eller Citrus. I 10 40. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til transformation af planter, som kan regenereres fra protoplaster.

41. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til transformation af I planter hørende til gruppen Nicotiana tabacum, Nicotiana I 15 plumbaginifolia, Petunia hybrida, Hyoscyamus muticus og Brassica napus ved hjælp af overføring af NPT-II-genet, I kendetegnet ved, at man forsyner NPT-II-genet med I promotor- og termineringssignaler fra CaMV-genet VI, I inkorporerer dette i pUC8-plasmidet og overfører det I 20 dannede kimære plasmid ved hjælp af Mg^Vpolyethylen- H glycolbehandling til isolerede protoplaster fra planter fra de ovenfor anførte grupper. I 25 30 I 35 I