HU204891B - Process for direct transformation of plant protoplasts - Google Patents

Process for direct transformation of plant protoplasts Download PDF

Info

Publication number
HU204891B
HU204891B HU875448A HU544887A HU204891B HU 204891 B HU204891 B HU 204891B HU 875448 A HU875448 A HU 875448A HU 544887 A HU544887 A HU 544887A HU 204891 B HU204891 B HU 204891B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protoplasts
dna
plant
transformation
gene
Prior art date
Application number
HU875448A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
HUT45275A (en
Inventor
Ioan Negrutiu
Ingo Potrykus
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HUT45275A publication Critical patent/HUT45275A/hu
Publication of HU204891B publication Critical patent/HU204891B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

A találmány tárgya tökéletesített eljárás növényi protoplasztok egyszerű, tisztán kémiai úton való direkt transzformálására.
Növényi anyagokban új genetikai információk bevitele által új és/vagy jobb tulajdonságok alakíthatók ki. Ha tekintetbe vesszők például a világ népességének gyors növekedését és az ezzel kapcsolatos megnövekedett élelmiszer- és nyersanyagszükségletet, úgy a haszonnövények hozamának fokozása, valamint a növényi hatóanyagok fokozott kinyerése, különösen az élelmiszerek és gyógyszerek területén való előrelépés a biológiai kutatás legsürgősebb feladatai közé tartozik. Ebben az összefüggésben például a következő alapvető szempontok említendők meg: haszonnövények ellenállásának fokozása kedvezőtlen talaj- vagy környezeti hatásokkal, betegségekkel és kártevőkkel szemben, fokozott ellenállás növényvédő szerekkel, mint rovar-, gyomirtó, gomba- és baktériumölő szerekkel szemben, növények tápanyagtartalmának és begyűjtési hozamának előnyös megváltoztatása. Az ilyen kívánatos hatások általában védőanyagok, értékes fehéqek vagy toxinok indukciója vagy fokozott képzése útján érhetők el. Növények öröklődő tulajdonságainak megfelelő befolyásolása például úgy történhet, hogy egy meghatározott idegen gént célzottan beviszűnk a növényi sejtbe, szokványos tenyésztési módszerek alkalmazásának szükségessége nélkül.
A találmány keretébe tartoznak a következő fogalmak: Növényi anyag: tenyészetben vagy in vivő életképes növényi részek, mint például protoplasztok, sejtek, kallusz, szövetek, embriók, növényi szervek, rügyek, magok, valamint teljes növények. I
Gén: egyetlen tulajdonságot kódoló
DNS-szakasz.
Struktúrgén: fehérjeszerkezetet (aminosav-szekvenciát) meghatározó DNS-szakasz.
Kifejeződési jelek: promotor-és terminátorjel. 2
Növényekben ható kifejeződésijei: növényekben működőképes kifejeződésijei.
Terminátorjel: átírás befejeződés! helyén elhelyezkedő DNS-szakasz. 4 „Enhancer” jel: átírást erősítő jel.
Replikációsjel: DNS-replikációt (megkettőződést) lehetővé tevő jel.
Integrációs jel: a génnek a genomiális DNS-be történő integrációját elősegítő DNS- 5 szakasz.
Hibridgén: heterolőg DNS-szakaszokbóI, azaz különböző eredetű DNS-szekvenciákból felépülő gén, amely úgy a természetes cDNS-ben, mint a 5 szintetikus DNS-szakaszban előfordulhat
Hordozó DNS: a gént szegélyező neutrális, azaz a gén funkciójában részt nem vevő DNS-szakasz. 61 „Carrier” DNS: transzformáló gén nélküli neutrális DNS, amely a transzformáló génhez hozzákeverve azt megvédi a nukleázok hatásától.
Izolált gén: a teljes DNS-ből kihasított DNSszakasz, amely egyetlen fehérjét kódol.
ΝΡΤ-Π-gén: neomidn-3’-foszfotranszferáz gén, transzpozon Tn 5 Π típusa pRoths0 tein SJ, Reznikoff WS, Cell 23,
191-199 (1981)].
Genomiális DNS: növényi genomból származó DNS (az összes vagy annak egy része).
cDNS: m-DNS-rőI reverz transzkriptázzal készített DNS-másolat
Genetikailag manipulált növényfertőző baktériumok DNS-szakaszainak növényi sejtekbe való bevitele ismert a szakirodalomból [például 2Nature 303,209-213 0 (1983); 3Nature 304,184-187 (1983); «Scientific American 24816, 50-59 (1983); 5EMBO-íoumal 216, 987995 (1983); «Science 222, 476-482 (1983); Science 223, 496-498 (1984); vagy 8Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803-4807 (1983)]. A leírt eljárásoknál a 5 baktériumok természetes növényfertőző tulajdonságait használják fel ahhoz, hogy a növényi sejtekbe új genetikai anyagot vigyenek be. Ebből a célból ez ideig elsősorban növényi kórokozókat alkalmaztak vektorokként, mint például az Agrobacterium tumefacienst, ) ill. ennek Ti-plazmidját vagy Cauliflower mozaikvírust.
Most a legújabban kifejlesztett eljárások gének növényi sejtekbe való közvetlen bevitelét is lehetővé teszik, biológiai vektorok alkalmazása nélkül pPoírykus » I. és munkatársai, Plánt Molec. Bioi. Rep. 3, 117-128 (1985); 10Shillito RD. és munkatársai, Bio/Technology
3,1099-1103 (1985)].
Ezek a „direkt géntranszfer” címszó alatt ismertté vált eljárások lehetővé teszik a növényi sejtek vektor nélküli transzformációját növényfertőzo rendszerek, mint például növénykórokozó baktériumok, vírusok, rovarok vagy gombák használata nélkül.
Ezáltal megszűnik mindazon korlátozás is, amely a kórokozó gazdaspecifításáből származik. A növényi sejtek transzformációjához használt eljárások nem károsítják a növények kifejlődését a transzformált sejtekből.
A géntranszformáció alkalmazásának fő nehézségét a transzformált sejtek vagy szövetek azonosítása jelenti.
Géntranszfonnációnál minél kisebb a transzformációs gyakoriság, annál nehezebb felfedezni a transzformált sejtekből származó sejtklónokat a nem transzformáit kiónok óriási száma mellett. Szokásos screeningeljárásokat ezért kis transzformációs gyakoriságnál gyakorlatilag nem lehet alkalmazni, kivéve, ha szelektív markerfunkciőval rendelkező génről van szó (például rezisztencia egy bizonyos anyaggal szemben). A kis transzformációs gyakoriság szelektálható markerfunkciőval nem rendelkező géneknél, tehát óriási fáradságot igényel.
HU 204 891 Β
Ezért markerfunkció nélküli gének transzformációjánál a transzformált sejtklónok kiválasztásához csak akkor ésszerű és hatásos szokványos screening-eljárásokat használni, ha a transzformáció gyakorisága a 10'3-10'2 nagyságrendbe esik. Jelenleg ezek a célul kitűzött magas transzformációs ráták csak elektroporáció útján érhetők el, esetleg a mikrobiológiai kutatásban génátvitelre használt más eljárásokkal összekötve, mint például poli-L-omitin- vagy poli-L-lizin-kezeléssel, liposzómafűzióval, DNS-fehérje komplexképzéssel, a protoplasztmembrán töltésének megváltoztatásával, mikrobiális protoplasztokkal való fúzióval vagy kalcium-foszfát koprecipitációval, és különösen polietilénglikol-kezeléssel és hősokk („heat shock”) eljárással [10Shillito és munkatársai, Bio/Technology 3,1099— 1103 (1985)]. Ezzel szemben tisztán kémiai eljárásokkal mindeddig legfeljebb 10'3 nagyságrendben sikerült reprodukálható transzformációs rátát elérni.
Elektroporációnál [Neumann E. és munkatársai, The EMBO Journal 7, 841-845 (1982); 10Shillito és munkatársai, Bio/Technology 3 (1985)] a protoplasztokat mannit/Ca-, illetve mannit/Mg-oldatban rövid ideig nagy intenzitású feszültségimpulzusoknak teszik ki, a szuszpenziós folyadék felett kondenzátort sütve ki. Ezzel a protoplasztmembrán polarizálása és a membránpórusok reverzibilis felnyílása érhető el, ami megkönnyíti a DNS-nek a sejtbe való bejutását.
Ez az eljárás azonban számos hátránnyal jár és bizonyos korlátái vannak.
Mindenekelőtt az elektroporáció útján történő transzformáció végrehajtása viszonylag nagy készülékigénnyel jár, ami megfelelő költség- és munkaráfordítással párosul. Másrészt a növényi protoplasztok nagy érzékenysége miatt az eljárás csak nagyon szűk határterületen alkalmazható. A transzformált sejtek életképességének biztosítása céljából bizonyos paraméterek, mint például feszültség-, kapacitás- és térerőértékek csak szűk határok között változtathatók [pl. 14001700 V feszültségtartomány; 10Shillito RD. és munkatársai, Bio/Technology 3 (1985)].
Meglepő módon ezek a hátrányok a találmány keretében egyszerű kémiai eljárásokkal kiküszöbölhetők. A DNS növényi sejtekbe való felvételéért és integrációjáért felelős elveket a találmány szerinti vizsgálatokkal kutatva világosság vált, hogy a transzformáció folyamata számos, egymást kölcsönösen befolyásoló tényezőtől függ. E vizsgálatokra támaszkodva a megfelelő paraméterek variálása és optimális összehangolása által a transzformációs gyakoriság - összehasonlítva a hagyományos eljárásokkal - olyan mértékben fokozható, hogy az említett, megvalósítani kívánt 10'3—10*2 transzformációs ráta minden további nélkül elérhető.
E tisztán kémiai alapokon nyugvó találmány szerinti eljárás segítségével a transzformációs gyakoriságon kívül meglepő módon a reprodukálhatóság, valamint a kezelt protoplasztok túlélési rátája is nagymértékben fokozható.
Míg ez ideig tisztán kémiai eljárásokkal legfeljebb 10'3 nagyságrendű transzformációs gyakoriságot értek el, most a találmány szerinti eljárás alkalmazásával magasabb nagyságrendbe eső, néhány %-ot is kitevő reprodukálható transzformációs gyakoriság valósítható meg, amely összemérhető az elektroporáció eredményeivel.
Az elektroporációval szemben a találmány szerinti tökéletesített eljárás olyan módszerre vonatkozik, amely különösebb felszerelési igény nélkül és így költség szempontjából kedvezően, és kevesebb munkaráfordítással hajtható végre. Az elektroporációt igénylő módszerekkel összehasonlítva további előnyt jelent az az újszerű lehetőség, hogy most már egy időben nagy tömegű növényi protoplaszt transzformálható. Hasonló korlátozások, mint aminőket az elektroporációs eljárással összefüggésben a fentiekben megtárgyaltunk a korlátozott túlélési rátákra vonatkozóan, nem jelentkeznek a találmány szerinti eljárás alkalmazásakor.
A találmány szerinti transzformációt meghatározó paraméterek széles tartományban variálhatók és a kezelt protoplasztok transzformációjának hatékonyságát és a protoplasztok életképességét e tartományon nem korlátozzák.
Ezért az egész protoplasztpopuláció a találmány szerinti transzformációs eljárás után sokkal kevésbé heterogén, mint elektroporációs transzformálás esetében, és ugyenez vonatkozik a kezelt protoplasztok élet- és osztódóképességére. így a találmány szerinti eljárás használatakor például minden további nélkül elérhető a kezelt protoplasztok legalább 80% túlélési rátája, ugyanakkor a protoplasztok megtartják osztódási és új kolóniákat képező képességüket. Elektroporáció alkalmazásakor a túlélési rátára vonatkozó összehasonlító értékek körülbelül 10% körül vannak.
A várakozással ellentétben megmutatkozott, hogy számos paraméter közül, amelyek - egyenként vagy egymással kombinálva - protoplasztokba való génátvitelnél befolyásolhatják a transzformáció gyakoriságát, már néhány paraméter, illetve eljárási lépés helyes megválasztása és kombinációja útján, kis technikai és időbeli ráfordítással optimális transzformációs rátát eredményezhet. A következő paraméterek bizonyultak alapvetőnek:
1) DNS-próba: alak, nagyság, koncentráció, alkalmazás időpontja.
2) carrier DNS: alak, koncentráció, nagyság.
3) Mg2+: koncentráció, alkalmazás időpontja.
4) Plazmamembránt módosító szer: koncentráció, alkalmazás időpontja.
A találmány szerinti eljárás alapvető faktorai között elsőrendű fontosságú a Mg2+-koncentráció, valamint a plazmamembránt módosító anyag koncentrációja a transzformáció hatékonysága szempontjából. E két tényező között szinergista kölcsönhatás áll fenn, aminek következtében a transzformáció gyakorisága erősen fokozódik.
Jelentős továbbá a Mg2+-ionok és a módosítószer, valamint a transzformáló DNS alkalmazásának időpontja és sorrendje.
Az eljárás ezen meghatározó tökéletesítése és egyszerűsítése növényi protoplasztokba történő közvetlen génátvitelhez és végeredményképpen genetikailag
I
HU 204891 Β megváltoztatott növények létrehozásához a következő, találmány szerinti részműveletekkel érhető el:
- Protoplasztok izolálása növényi anyagból és adott esetben az izolált protoplasztok inkubálása alkalmas tápközegben, 5
- az izolált protoplasztok újraszuszpendálása standardizált sóoldatban,
- az izolált protoplasztok átvitele a sőoldatból a transzformációhoz optimális, Mg2+-ionokat tartalmazó inkubáló közegbe, 10
- a beépítendő DNS és a plazmamembránt módosító szer hozzáadása,
- a protoplasztok és a DNS inkubálása plazmamembránt módosító szer jelenlétében, a DNS-nek a protoplasztba való behatolásához szükséges ideig, 15
- a kezelt protoplasztok elválasztása az inkubáló közegből, valamint adott esetben vizes CaCU-oldatban történő újraszuszpendálásuk,
- a protoplasztok elválasztása a CaCh-oldatból,
- inkubálás további protoplasztok képződéséhez al- 20 kalmas tápkőzegben és
- kívánt esetben a teljes transzformált növény regenerálása.
így a találmány szerinti eljárás alapjában növényi protoplasztok transzformációjára szolgáló tökéletesített 25 eljárás és - kívánt esetben - teljes, genetikailag módosított növények létrehozása a transzformált protoplasztok regenerálása útján. A találmány szerint
- növényi protoplasztokat izolálunk tetszőleges növényi szövetekből és adott esetben növényi protoplasz- 30 tok tenyésztéséhez használatos tápközegben tenyésztjük őket;
- a protoplasztokat a tulajdonképpeni transzformáció előtt 20 perc - 6 óra időtartamig alkáliföldfémés/vagy alkálifémkationokat, előnyösen Ca2+-, K+- 35 és/vagy Na+-ionokat, valamint alkalmas szénforrást tartalmazó tápoldatban, 4-10 °C-on előinkubáljuk;
- a protoplasztokat elválasztjuk az előinkubáló közegtől és újraszuszpendáljuk az alapvető alkotórészként 0,1-60 mM, előnyösen 10-30 mM Mg2+-iont, adott 40 esetben Ca2+-ionokat tartalmazó tulajdonképpeni transzformációs közegben;
- közvetlenül ezután a transzformációs oldathoz hozzáadjuk a DNS-próbát, amely a transzformáló DNS-t 2-20 pg/ml mennyiségben tartalmazza, to- 45 vábbá a nukleázlebontással szembeni védelemre egy carrier DNS-t adunk a transzformációs oldathoz;
- 0,1-10 perc múlva hozzáadunk 10-30% végkoncentráciőjú polietilénglikolt;
- a protoplasztokat és a DNS-próbát a fenti transzfor- 50 máciős oldatban a protoplasztok DNS-felvételéhez szükséges ideig inkubáljuk; és
- kívánt esetben a transzformált protoplasztokból teljes növényeket regenerálunk.
E leírásbői világosan kitűnik, hogy az új géneket a 55 növényi sejtekbe közvetlenül visszük át, természetes növényfertőző rendszer, mint növényi baktérium, növényi vírus használata, vagy rovarokkal vagy növényi kórokozó gombákkal történő átvitel nélkül. Ebből a célból a transzformálandó növényi protoplasztokat 60 közvetlenül kezeljük a bevitelre szánt génnel; a protoplasztokat először alkalmas oldatba helyezzük, ott bizonyos ideig előinkubáljuk, majd az idegen génnel együtt átvisszük a tulajdonképpeni transzformációs oldatba és ott az idegen gén felvételéhez szükséges ideig tartjuk.
Növényi protoplasztokként előnyösen egyetlen növényfajta, vagy alárendelt rendszertani egység protopIasztját használjuk.
Izolált növényi protoplasztok - amelyek izolált sejtek és szövetek kiindulási anyagai is lehetnek - a növény tetszőleges részeiből nyerhetők, mint például levelekből, csírákból, szárakból, virágokból, gyökerekből, pollenből vagy embriókból. Előnyösen levélprotoplasztokat használunk. Az izolált protoplasztok sejttenyészetből is nyerhetők. Protoplasztok izolálására szolgáló eljárásokat ír le például 12Potrykus I, Shillito RD, Methods inEnzymol. 118,449-578 (1986).
A protoplasztok tenyésztését előnyösen ozmotikusán stabilizált protoplaszttenyészetekhez használatos tápközegekben hajtjuk végre.
Számos tápközeg áll rendelkezésre, amelyek néhány komponensük, vagy a komponensek csoportjai tekintetében eltérnek egymástól. Általában azonban minden tápközeg a következő elvek szerint épül fel: szervetlen ionok egy csoportját tartalmazzák körülbelül 10 mg/1 és néhány száz mg/1 közötti koncentrációtartományban (űn. makroelemek, mint például nitrát, foszfát, szulfáL kálium, magnézium, vas), szervetlen ionok egy további csoportját legfeljebb néhány mg/1 mennyiségben (ún. mikroelemeket, mint kobalt, cink, réz, mangán), továbbá vitaminokat (például inozit, folsav, tiamin), eneigiaés szénforrást, mint szacharózt vagy glükózt, valamint természetes vagy szintetikus fítohormon formájában növekedésszabályozó anyagot (auxinok és citokininek osztályából) 0,01-10 mg/1 koncentrációban. A tápoldatok ozmózisnyomását cukoralkoholok (például mannit) vagy cukor (például glükóz) vagy sőionok (például CaCU) hozzáadása útján stabilizáljuk és pH 5,6-6,5 értékre állítjuk be.
Szokványos tápfolyadékok közelebbi leírása például a következő kézikönyvben található meg: J3Koblitz H, Methodische Aspekte dér Zell- und Gewebezüchtung bei Gramineen unter besonderer Berücksichtigung dér Getreide, Kulturpflanze XXII, 1974,93-157,
Mielőtt a protoplasztokat átvisszük a tulajdonképpeni transzformációs közegbe, előinkubáljuk ókét olyan közegben, ahol a protoplasztok optimális módon előkészülnek a transzformációhoz. Ez kifejezésre jut a kezelt protoplasztok tervezett transzformációs és túlélési rátájának jelentős növekedésében.
Bizonyos feltételek mellett a transzformáció közvetlenül az előinkubáló közegben is végrehajtható.
E közeg standardizált sóoldat, amely alkalmas szénforráson, mint cukron vagy cukoralkoholon, például glükózon vagy manniton kívül különböző sókat, mint NaCl-ot CaCk-ot, KCl-ot tartalmaz 1 mM-200 mM koncentrációban. E sóoldat pH-ja előnyösen 5-8.
Röviddel a tervezett transzformáció előtt a protoplasztokat az előinkubáló oldatból átvisszük a tulajdonképpeni transzformációs közegbe. Ez mannitoldatból
HU 204 891 Β áll, amely 0,1 mM-60 mM, előnyösen 10 mM-30 mM koncentrációban Mg2+-ionokat tartalmaz. Az inkubáló oldat pH-ja 5,6-12, különösen 7-10.
Miután az izolált protoplasztokat ávittük az inkubáló közegbe, azonnal hozzáadjuk a DNS-próbát 2 pg/ml20 pg/ml, előnyösen 5 pg/ml-10 pg/ml koncentrációban.
A struktúrgénből és növényben ható kifejeződési jelekből álló DNS-t előnyösen neutrális DNS-szakaszok (hordozó DNS) szakítják meg, amelyek lehetővé teszik, hogy a gén beépüljön a növényi sejt genomiális DNS-ébe. Előnyösen linearizált formájú gént használunk. A végrehajtott kísérletek során különösen előnyösnek bizonyult a hordozó DNS 50 pg/mI-70pg/ml koncentrációja és 4 kb-40 kb (kilobázis) közötti átlagos mérete.
Előnyös továbbá a semleges DNS-t, mint például állati vagy növényi DNS-t, lambda-DNS-t, plazmid DNS-t vagy a találmány szerinti eljárás végrehajtásához alkalmas más tetszőleges DNS-t fölöslegben alkalmazni carrier DNS-ként, hogy megvédjük a gént a nukleázok hasító hatásától.
A DNS-nek az inkubáló oldathoz történt hozzáadása után néhány másodperc és 20 perc, előnyösen 0,1 perc és 10 perc között alkalmazzuk a polietilénglikolt (PEG) 10-30% végkoncentrációban. Magas transzformációs ráta érhető el 20-28% PEG-koncentrációnál.
Polietilénglikolként előnyös 1000 g/mól10 000 g/mól, különösen 3000 g/mól-8000 g/mól molekulatömeg-tartományba eső vegyület alkalmazása.
Előnyben részesítjük a CMS típusú polietilénglikololdatot, amely viszonylag magas részarányban tartalmaz Ca2+-ionokat [I5Negrutiu I. és munkatársai, Theor. Appl. Génét. 72,279-286 (1986a)].
A transzformáció különösen előnyösen megy végbe, ha a polietilénglikollal 20 perc és 6 óra közötti inkubálást végzünk.
A protoplasztokat a fentiekben megadott kezelés után friss tápfolyadékban újraszuszpendáljuk; előnyösen 2·104 és 8·104 protoplaszt per ml sejtsűrűséget állítunk be.
Ha 20% feletti koncentrációban használunk polietilénglikolt, a transzformáció után célszerű a protoplasztokat 2-10-szeres térfogatú, Ca2+-ionokat tartalmazó oldattal fokozatosan felhígítani és ezután ülepítéssel és friss tápoldatban történő újraszuszpendálással a PEGmaradékot kimosni.
A transzformáció különösen kedvezően megy végbe 0,1 M-1,0 M Ca2+-iont tartalmazó vizes CaCh-oldat alkalmazásakor.
A találmány szerinti eljárás gyakorlatilag korlátozás nélkül alkalmazható.
A találmány elsősorban „kiméra” szerkezetű genetikai konstrukcióra vonatkozik, amelyek központi alkotórészként új és kedvező tulajdonságokat kódoló egy vagy több struktúrgént tartalmaznak, és amelyek működőképes módon a növényi sejtekben funkcionális kifejeződési jelekkel vannak összekötve.
A találmány szerinti eljárásban elsősorban mindazon gének használhatók, amelyek a növényi sejtben kifejeződnek és amelyek a növénynek valamely hasznos és/vagy kedvező tulajdonságot kölcsönöznek, így például kórokozókkal (mint növényi kórokozó rovarok, gombák, baktériumok, vírusok), herbicidekkel, inszekticidekkel vagy más biocidekkel, éghajlati hatásokkal és helyi sajátosságokkal (például hőség, hideg, tél, szárazság, nedvesség, különösen szélsőséges talajviszonyok, ozmotikus stressz) szembeni fokozott ellenállást, vagy tartalék és depóanyagok fokozott képződését segítik elő a levelekben, magokban, gumókban, gyökerekben, szárakban és más növényi részekben.
A találmány kiterjed az olyan génekre is, amelyek gyógyszerészetileg elfogadható hatóanyagokat, mint például alkaloidokat, szteroidokat, hormonokat, immunmodulátorokat és más fiziológiai hatóanyagokat kódolnak.
így a növények genetikai anyagába tetszőleges struktúrgének vihetők be, így növényi eredetűek, mint például a zeingén [16Wlenand V. és munkatársai, Moh Gén. Génét. 182, 440-444 (1981)], állati eredetűek, például a TPA-gén [„tissue-type plasminogen activator” gén; 17Pennica D. és munkatársai, Natúré 301, 214-221 (1983)], mikroba eredetűek, mint például az NPT-II-gén, vagy szintetikus eredetűek, mint például az inzulingén [18Stepien P. és munkatársai, Gene 24, 289-297 (1983)], azzal a feltétellel, hogy a struktúrgéneket növényekben aktív kifejeződési jelek szegélyezik, amelyek növényi, állati mikrobiális vagy szintetikus eredetűek lehetnek.
A találmány keretében kifejeződési jelek (expressziós szignálok) alatt elsősorban promotor- és terminátorszakaszok értendők, de a nem átíródó 5’- és 3’-régiók további szabályozó szakaszai is, amelyek a struktúrgén-szekvenciákkal megegyező vagy ellentétes irányúak.
A promotorszakaszok egyebek között az RNS-polimeráz „felismerő” helyét is tartalmazzák, ahová az enzim specifikusan kötődik és ahonnan a DNS átírása (transzkripció) megindul.
A kötési affinitásért ugyanakkor bizonyos DNS-szakaszok felelősek, amelyek halmozottan fordulnak elő prokarióta-promotorokban. Ezek az ún. „konszenzus”szakaszok általában -10 és a -30 közötti szekvenciatartományban találhatók a struktúrgén ATG-startkodonjára vonatkoztatva. E szakaszok „Pribnov-SchallerBox”-nak nevezett két hexanukleotid-szakaszból állnak, és nukleotidsorrendjük e szakaszon belül, valamint egymástól való távolságuk meghatározóan befolyásolja a DNS-poümeráz affinitását.
Eukariótasejtekben különös jelentősége van ebben a tekintetben az ún. „TATA” Box-nak - egy adenin és timindus szekvenciarészletnek -, amely a transzkripció-iniciátor helyétől 20-30 nukleotidtávolságra helyezkedik el.
A találmány keretében alkalmazható gének között úgy homológ, mint heterológ gén(ek) vagy DNS, valamint szintetikus gén(ek) vagy DNS szóba jönnek a találmány definíciója értelmében.
A kódoló DNS-szakasz kizárólagosan genomiális
DNS-ból, cDNS-bőí, illetve szintetikus DNS-ből állhat, de hibrid DNS-szakaszból is felépülhet, amely úgy cDNS-ből, mint genomiális DNS-ból és/vagy szintetikus DNS-ből áll. 5
Ebben az esetben a cDNS ugyanabból a génből származhat, mint a genomiális DNS, vagy pedig úgy a cDNS, mint a genomiális DNS különböző génekből származhat Mindkét esetben azonban a genomiális DNS és/vagy a cDNS azonos vagy különböző gének- 10 bői állítható elő.
Ha a DNS-szakasz egynél több gént tartalmaz, ezek a gének egyazon szervezetből, azonos nemzetség több, mint egy törzséhez, (faj)változatához tartozó töhh szervezetből, vagy ugyanazon vagy más taxonómiai egy- 15 ség egynél több nemzetségéhez tartozó szervezetekből származhatnak.
Hogy a struktúrgének a növényi sejtben kifejeződhessenek, a kódoló génszakasznak először működőképesen össze kell kapcsolódnia a növényi sejtben fűnk- 20 cionális kifejeződési szakaszokkal.
A struktúrgénekből és közbeékelt kifejeződési jelekből álló, átvitt gének természetes előfordulású gének, vagy hibrid gének lehetnek. A találmány szerinti eljárásban előnyben részesítjük azoknak a géneknek a 25 használatát, melyeknek kifejeződési jelei állati vagy különösen növényi vagy szintetikus eredetűek. Ilyen gének például a következők:
a) növényekből származó teljes gének, amelyek természetes kifejeződési jeleket tartalmazó struktúrgének; 30
b) teljesen szintetikus gének, amelyek szintetikus eredetű struktúrgénekből és azokat kísérő, szintetikus eredetűkifejeződési jelekből állnak;
c) növényekben ható kifejeződési jelek által kísért növényi származású struktúrgének, ahol a struktúrgé- 35 nek és a kifejeződési jelek különböző növényfajtákból származnak;
d) szintetikus eredetű struktúrgének;
e) növényi származású kifejeződési jelek által kísért állati, mikrobiális vagy szintetikus eredetű struktúrgé- 40 nek; vagy
f) szintetikus eredetű kifejeződési jelek által kísért, állati vagy mikrobiális eredetű struktúrgének.
A találmány keretében a hibrid génkonstrukciók, tehát a struktúrgén(ek) mellett kifejeződési jeleket tar- 45 talmaznak, amelyek úgy promotor- és terminátorszakaszokat, mint a nem átíródő 3’- és 5’-régiók további szabályozó szakaszait is magukban foglalják.
Különösen előnyösek a növényi, főként növény vírus eredetű expressziős jelekkel kísért baktérium eredetű 50 struktúrgének.
Minden olyan promotor vagy terminátor alkalmazható a hibrid génszakasz alkotórészeként, amely meg tudja indítani a kódoló DNS-szakasz (struktúrgén) kifejeződését Alkalmas promotorok és tenninátorok pél- 55 dául a nopalin-szintáz-gének (nos), az oktopin-szintázgének (öcs), valamint a Cauh’flower mozaikvímsgének (CaMV) promotorai és íeiminátorai.
A találmány szerint előnyben részesítjük a CaMV genom 35S és I9S expressziős jeleit, amelyek a mole- 60 kuláris biológia módszerei segítségével, például a l9Maniatis és munkatársai által 1982-ben leírtakkal izolálhatok az említett genomból és kapcsolhatók össze a kódoló DNS-szakasszal.
A 35S-transzkripciőszabáIyozó szakaszok kiindulási anyagként a találmány szerint például a CaMV „S” törzsének Seal töredéke használható, amely magában foglalja a géníérkép 6808-7632 nukleotidjait ^“Franké G. és munkatársai, 1980).
A 19S promotorrégiő és a nem átíródó 5'-régió a CaMV géntérkép PstI helye (5386 pozíció) és HindlH helye (5850 pozíció) között található (^Hohn és munkatársai, 1982).
A megfelelő terminátorrégió és a nem átíródő 3'-régió egy EcoRV/BgHH töredéken helyezkedik el a CaMV genom 7342 és 7643 pozíciója között.
A 19S promotorrégiő jellemző eukarióta-promotor, amely a CaMV VI gén kódolt régiója előtt helyezkedik el és a VI géntermék (vírus-burokfehérje) kifejeződéséért felelős.
A használható, növéyi sejtekben működő promtorok további hatékony képviselője a túltermelést okozó növényi promotor. Az ilyen fajta promotorok - ha működőképesen össze vannak kötve a kívánt génterméket kódoló génszakasszal - képesek a génszakasz kifejeződésének megvalósítására.
A találmány keretében használható túltermelést okozó növényi promotorok magukban foglalják a szójabab ribulóz-l,5-bifoszfát-karboxiláz kis alegységének (small subunit ss) promotorját pBerry-Lowe és munkatársai, J. Mól. Appl. Génét 7, 483-498 (1982)], valamint a klorofill-a/b-kötőfehérje promotorját. E két promotor arról ismeretes, hogy eukarióta növényi sejtekben fényhatására indukálódnak [23Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective. A. Cashmore, Plenum, New York 1983,29-38. oldal; 24Coruzzi G. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 258, 1399 (1983) és “Dunsmuir P. és munkatársai, J. Mól. Appl. Genetics 2, 285(1983)].
A találmány szerinti felhasználásra különösen alkalmasnak bizonyultak a Cauliflower mozaikvírus VI génjének kifejeződési jelei.
A találmány keretében különösen előnyösek a CaMV törzs CM 1841 expressziós szignáljai, melynek teljes DNS-szekvenciáját 26Gardner és munkatársai (1981) írták le.
A hibrid gének önmagában ismert mikrobiológiai eljárással állíthatók elő, melynek során a növényi sejtek által termelődő fehérjék kódolására szolgáló leolvasó szakaszok megmaradnak. Az ilyen eljárások ismertek és például a következőközleményekben íqák le őket 27„MoIecular Cloning”, Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, és “„Recombinant DNA Techniques”, Rodriguez RL, Tait RC, Addison-Wesley Publishing Comp., London, Amsterdam, Don Mills. Ontario, Sydney, Tokyo, 1983.
Az idegen génnek a növényi sejt genomiális DNSébe való beépülése szempontjából előnyös, ha a struktúrgénból és növényekben ható kifejeződési jelekből álló gént neutrális DNS-szakaszok (hordozó DNS) kí6
HU 204 891 Β sérik. A hordozó DNS két lineáris DNS-szálból állhat, úgyhogy a növényi sejtbe beépítendő konstrukció egy lineáris DNS-molekula. Az átvitel céljára előállított DNS-szakasz azonban gyűrű alakú (plazmidszerkezet) is lehet. Az ilyen plazmidok olyan DNS-szálból állnak, amelybe az idegen gén a kifejeződési jelekkel integrálódik. A hordozó DNS szintetikus eredetű lehet, vagy alkalmas restrikciós enzimekkel való kezelés útján természetes előfordulású DNS-szakaszokból nyerhető, így például alkalmas hordozó DNS-ek a természetes előfordulású plazmidok, amelyek valamely szelektív restrikciós enzimmel hasíthatók.
Az ilyenfajta plazmidra példa a szabadon beszerezhető pUC8 plazmid [28Messinger J, Vieria J, Gene 19, 269-276 (1982)]. Hordozó DNS-ként alkalmasak a természetes előfordulású plazmidok töredékei is. Hordozó DNS-ként például a Cauliflower mozaikvírus VI génjének deléciós mutánsai is használhatók.
Növénysejtek genetikai transzformációjának valószínűsége különböző tényezőkkel fokozható. így amint az élesztőn végzett kísérletekből ismeretes - a hatásos stabil géntranszformációk fokozhatók
1) az egy sejtre eső új gének kópiáinak növekvő számával,
2) egy replikációs jelnek az új génnel való kombinálásakor, valamint
3) integrációs szekvenciáknak az új génnel való kombinálásakor.
így a találmány szerinti eljárást különösen akkor előnyös alkalmazni, amikor az átviendő gént növényi sejtekben működőképes replikációs és/vagy integrációs szakaszokkal kombináljuk.
Egy génnek valamely növényi sejtben történő kifejeződése függ a génnek egy messenger-RNS-szakaszba való átíródási gyakoriságától. Ezért az is előnyös, ha az új gént e transzkripciót erősítő enhancer-jellel kombináljuk. Különösen kiemelkedők az olyan eljárások, amelyeknél a növényi sejtekben működőképes replikációs, integrációs és enhancer-szignállal kombinált gént viszünk át.
Ezenfelül nagy metodikai előnyt jelent, ha a beépítendő gén szelektív markerfunkcióval rendelkezik, azaz a transzformált növényi sejtek a nem transzformált növényi sejtekből célzott szelektálással elválaszthatók. Az ilyen markerfunkció oly módon segíti elő a racionális munkamódot, hogy a szokásos mikrobiológiai eljárásokkal csak azokat a növényi sejteket kell kalluszokká vagy egész növényekké regenerálni, amelyekben a kifejeződésre jutó gén örökletes anyaga jelen van, lehetővé téve a markerspecifikus szelektáló eljárást.
Míg a transzformációhoz kiindulási anyagokként tekintetbe jövő növényi sejtekként protoplasztok, sejttenyészetek, növényi szövetekben levő sejtek, pollen, pollentömlők, petesejtek, embriózsákok vagy különböző fejlődési stádiumban levő zigőták és embriók említendők meg, előnyben részesítjük a protoplasztokat, minthogy ezek további előkezelés nélkül közvetlenül alkalmazhatók.
A találmány szerinti eljárásból transzformált protoplasztok származnak, ezekből növényi sejtek, sejtaggregátumok, embriók, növények és magok képződnek;
ezek utódai tartalmazzák a transzformáció útján kapott új géneket és az ebből származó előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek.
A találmány szerinti transzformált növényi anyag minden keresztezést és fúziós terméke, amely a transzformáció által kapott új géneket tartalmazza a képződött előnyös tulajdonságokkal rendelkezik.
A találmány szerinti eljárás minden növény, különösen az Angiospermae és Gymnospermae rendszertani csoportjaiba tartozók transzformációjára alkalmas.
A Gymnospermae-k közül különösen fontosak a Coniferae osztály növényei.
Az Angiospermae-k közül a lombos fákon, cserjéken kívül különösen fontos növények a Solanaceae, Cruciferae, Compositae, Liliaceae, Vitaceae, Chenopodiaceae, Rutaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae, Asparagaceae, Orchidaceae, Pálmáé, Bromeliaceae, Ru· biaceae, Theaceae, Musaceae vagy Gramineae család és a Legiminosae rend, mindenekelőtt a Papilionaceae család növényei. Előnyben részesítjük a Solanaceae, Cruciferae és Gramineae családok képviselőit.
Különösen említésre méltóak a Nicotiana, Petúnia, Hyoscyamus, Brassica és Lolium, mint például a Nicotiana tabacum, Nicotiana plumbagenifolia, Petúnia hybrida, Hyoscyamus muticus, Brassica napus, Brassica rapa és Lolium multiflorum nemzetségek.
A különösen nagy terméshozamú kultúrnövények, mint kukorica, rizs, búza, árpa, rozs, kender vagy köles képezik elsősorban a növényi sejtek transzformációjának területén végzett kutatások tárgyát.
A protoplasztokból regenerálással létrehozható minden növény transzformálható a találmány szerinti eljárással. A Gramineae család képviselőit (füvek), amelyek a gabonaféléket is magukban foglalják, eddig genetikai úton nem sikerült manipulálni. Most már kimutattuk, hogy a közvetlen géntranszformáció fentiekben leírt módszerével a GramzTiaceoe-protoplasztok, tehát gabonasejtek genetikai transzformálása is lehetséges. Hasonló módon lehetséges és kívánatos a Solanum, Nicotiana, Brassica, Béta, Pisum, Phaseolus, Glycine, Helianthus, Allium, Avena, Hordeum, Oryzae, Setaria, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Musa, Cocos, Cydonia, Pyrus, Malus, Phoenix, Elaeis, Rubus, Fragaria, Prunus, Arachis, Secale, Panicum, Saccharum, Coffea, Camellia, Musa, Ananas, Vitis vagy Citrus nemezetségek kultúrnövényeinek transzformációja, mégha ezeknél a teljes hozadékok és megművelhető vetésterületek világszerte kisebbek is.
Tenyészetben tartott protoplasztok teljes növényekké történő regenerálását számosán leírták (29Evans és munkatársai, „Protoplast Isolation and Culture”, in Handbook of Plánt Cell Culture, 1,124-176; MacMillan Publishing Co. New York, 1983); (30Davey MR, „Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plánt Protoplasts”, Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, 19-29. oldal, Birkháuser, Bázel 1983); (31Dale PJ, „Protoplast Culture and Plánt Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops”, in Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, 31-41. oldal, Birk7
HU 204891 Β hauser, Bázel 1983); és (^Binding H, „Regeneráción of
Plants”, in Plánt Protoplasts, 21-37. oldal, CRC Press,
Boca Raton 1985) és (12Potrykus I. és Shillito RD,
Methods in Enzymology 118, Plánt Molecular Bxology, eds. A. and H. Weissbach, Academic Press, Orlando, 1986).
A regenerálási eljárások növényfajtánként változnak. Általában először szuszpenziót készítenek a transzformáit protoplasztokból, sejtekből vagy szövetekből, amelyek a bevitt gének számos kópiáját tartalmazzák. E szuszpenziókből kiindulva azután elvégezhető az embrióképződés indukciója. Az embriófejlődést érési és csfrázási stádiumig hagyják előrehaladni, amint ez természetes előfordulású embrióknál is szokásos. Általában azonban a protoplasztokat ismert tápközegben osztódásra és sejtfalképzésre késztetik. Végül kallusztenyészeíek képződnek, amelyeket bizonyos hatóanyagokkal való kezeléssel, mint például auxinokkal vagy citokininekkel gyökér-, illetve szárképzésre késztetik. E növekedést serkentő anyagokon kívül a táptala- 2 jók általában különböző aminosavakat tartalmaznak. Előnyösnek bizonyult a táptalajhoz glutaminsavat és prolint adni, különösen kukorica- és Iucemafajtáknál.
A szár- és gyökerképződés általában egy időben következik be. 2
Az így kapott növénykék végül főidbe vihetők át, és normál csemetékhez hasonlóan tovább tenyészthetők.
A hatásos regeneráció elsősorban a tápközegtől, a genotípustól és a tenyésztés előzményeitől függ. Ha e három változót eléggé ellenőrizzük, a regeneráció tel- 3 jesen reprodukálható és megismételhető.
A növények in vitro tenyésztésének, különösen a növényregenerácíő területén elért újabb fejlődés alapján a Gramineae családképviselőméi is lehetőség nyűt a teljes növények regenerálására növényi protoplasz- 3i tokból kiindulva. A Gramineae család növényeinél hatásosan végrehajtott regenerációs kísérleteket ír le például 33Abdullah R. és munkatársai, Bio/Technology 4, 1087-1090, 1986; 34Fujimara T. és munkatársai, Plánt Tissue Culture Lett. 2, 74-75,1985; 35Toriyama K. és 4£ munkatársai, Theor. Appl. Génét 73, 16-19, 1986; 36Yamada Y. és munkatársai, Plánt Cell Rep. 5, 85-88, 1986 (rizs).
így a találmány keretében a következő növények használhatók: Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Sac- 45 charum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale és Setaria.
A transzformált gének önmagában ismert módon mutathatók ki, például keresztezési elemzésekkel és molekulárbiológiai eljárásokkal, melyek közé elsősor- 50 bán a Southem-féle hibridizálás és enzimaktivitási próbák tartoznak.
A kereszteződési elemzések keretében a transzformáit növényi sejtekből felnevelt érett növényt magtermeléshez először önmagával keresztezik. Némelyik 55 mag tartalmazza az új és kívánt tulajdonságot kódoló bevitt géneket éspedig olyan arányban, amely pontosan megfelel az öröklődés megállapított törvényeinek.
Ezek a magok felhasználhatók az új és kívánt tulajdonságokkal rendelkező növények létrehozásához.
Homozigóta sejtvonalak ismételt önmegtermékenyítés és beltenyésztett vonalak előállítása útján nyerhetők. Ezek a beltenyésztett vonalak azután ismét felhasználhatók hibridek előállítására. Ennél az eljárásnál 5 egy beltenyésztett vonalat egy másik beltenyésztett vonallal kereszteznek.
A regenerált növényekből nyerhető részek, mint például virágok, magok, levelek, ágak, gyümölcsök szintén a találmány körébe tartoznak, amennyiben ezek a [ 0 részek transzformált sejteket tartalmaznak. A regenerált növények utódai (beleértve a hibrid utódokat), fajváltozatai és mutánsai ugyancsak a találmány körébe tartoznak.
A Southem-hibridizálás például a következőképpen 5 hajtható végre: a transzformáit sejtekből vagy protoplasztokből származó DNS-t restrikciós enzimekkel való kezelés után 1%-os agarózgélen elektroforézissel elválasztják, az elválasztott DNS-töredékeket nitrocelIulóz-hártyára szívatják át p’Southem EM, J. Mól. 0 Bioi. 98, 503-517 (1975)], és az előzetesen Nicktranszformációnak [38Rigby WJ, Dieckmann M, Rhodes C, Berg P, J. Mól. Bioi. 113, 237-251 (1977)] alávetett DNS-sel hibridizálják (a DNS fajlagos aktivitása 5·108-10·108 cpm/pg). A szűrőket 0,03 M nátri5 um-citrát-oldattal és 0,3 M nátrium-klorid-oldattal 3*1 óráig 65 ’C-on mossák. A hibridizált DNS-t röntgenfilmen autoradiográfiával (24-48 óra) mutatják ki.
Az enzimaktivitás vizsgálata - amelyet részletesebben az aminoglikozid-foszfotranszferáz próbánál (ka3 namicinspecifikus foszforilálás enzimje) adunk meg például a következőképpen hajtható végre: kalluszvagy levéldarabokat (100-200 mg) 20 pl extraháló pufferben, Eppendorf-centrifugacsőben homogenizálunk. A puffer az ^Herrera-Estrella L, DeBlock M, ) Messens E, Hemalsteens J-P, Van Montagu M, Schell I, EMBO J. 2, 987-995 (1983) által használt puffer módosítása: elhagyjuk a marhaszérum-albumint és 0,1 M szacharózt adunk hozzá. A kivonatokat 5 percig 12 000 g-vel centrifugáljuk és a felülúszóhoz brómfeI nolkéket adunk 0,004% végkoncentráciőíg. 10%-os, nem denaturált poliakrilamidgél elektroforézissel a felülúszó 35 μΐ-éből elválasztjuk a fehérjéket. A gélre kanamicint és gamma-32P-jelzett ATP-t tartalmazó agarózgélt rétegezőnk, inkubáljuk, és a foszforilált reakciőtermékeket Whatman-p81-foszfocellulóz papírra visszük át A papírt 6-szor mossuk 90 ‘C-os ionmentes vízzel, majd autoradiografáljuk.
A következő példák a találmányt közelebbről ismertetik, hatókörének korlátozása nélkül. Leírják egy hibrid gén konstrukcióját és annak beépülését ciklusos jellegi hordozó DNS-szakaszba, e hibrid gén átvitelét növényi sejtekbe, a transzformált növényi sejtek szelektálását és teljes növényekké való regenerálását, valamint a keresztezés! és molekuláris biológiai elemezéseket.
A példákban használt rövidítések:
Közegek
HeNa/F [10 mM Hepes, pH 7. 1,5 mM CaCfe,
150 mM NaCl, 0,2 M mannit; 39JFromm, M. és munkatársai (1985)]
HU 204 891 Β
K3 [0,1 mg/1 2,4 D, 1 mg/1 NAA, 0(2 mg/1
BAP; ^Shillito, R. D. és munkatársai (1981);
41)Nagy J. I. és Maliga P., (1976)]
KAiAO [42)Insta]le, P. és munkatársai (1985)]
LS [43)Linsmaier, Ε. M., Skook, E, Physiologia
Plantarum 18,100-127, (1965)]
MaCa [0,4 M mannit, 15 mM CaCl2«2H2O, pH 5,6]
MaMg [0,4-0,5 M mannit, 15 mM MgCl2, 0,1% MES,pH5,6]
M [42)Installe, P. és munkatársai (1985)]
MAPiAO [42)Installe, P. és munkatársai (1985)]
MDs [^Negrutiu, I. és munkatársai (1983)]
RP [42)Installe, P. és munkatársai (1985)]
R’SA [42)Installe, P. és munkatársai (1985)]
T [45)Nitsch, J. P. and C.Nitsch (1969)]
W5 [154 mM NaCl, 125 mM CaCl2*2H2O, mM KC1, 5 mM glükóz, pH 5,6-6,0; Menczel és munkatársai (1981)]
Vegyszerek:
BAP benzil-amino-purin
2,4 D (2,4-diklór-fenoxi)-ecetsav
NAA naftil-ecetsav
EDTA etilén-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav
PEG CMS CMS típusú polietilénglikol [15>Negrutiu, I. és munkatársai (1986a)]
ΝΡΤ-Π-gén neomicin-3-foszfotranszferáz-gént, H típus
Táblázatok:
ATF abszolút transzformációs frekvencia
GPPL összes protoplasztok száma
RTF relatív transzformációs frekvencia
UE a transzformációs kezelést túlélő protoplasztok száma
ZT transzformánsok száma
A százalékos értékek a példákban tömeg/térfogat (w/v) %-okat jelentenek.
A „relatív transzformációs frekvencia” (gyakoriság) (RTF) és az „abszolút transzformációs frekvencia” (ATF) értékek azt fejezik ki, hogy milyen mértékű átalakulást értünk el.
A „relatív transzformációs frekvencia” a transzformánsok és a túlélő (kolóniák képzésére képes) frakció arányát jelenti egy nem szelektíven tenyésztett protoplasztpopulációban. Az „abszolút transzformációs frekvencia” pedig a transzformánsok és a protoplasztok eredeti számának (vagyis a transzformáció előtt élőként definiált protoplasztok számának) arányát jelenti.
Az egyedi transzformációs és szelekciós lépések végrehajtása után kapott ATF és RTF értékek összehasonlítása jól jellemzi a protoplasztok túlélési arányát.
E transzformációs frekvenciák meghatározására az alábbi kísérleteket legalább háromszor megismételjük. A kapott eredmények statisztikai szignifikánsait a táblázatokban zárójelben feltüntetett standard deviációkkal igazoltuk.
Az 1. ábrán az ΝΡΤ-Π strukturális gént tartalmazó pABDI és pADBH plazmidvektorok szerkezete látható.
A 2. ábra a MgCl2-koncentrációnak (A) és a MgCiyPEG kölcsönhatásnak (B) a Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SRi (A és B) és & Nicotiana plumbaginifolia (A) transzformációs sebességére gyakorolt hatását mutatja.
A rajz: a görbe: N. tabacum SRi b görbe: N. plumbaginifolia
Figyeljük meg, hogy a MgCl2-koncentráció skálabeosztása (az abszcisszán) féllogaritmikus. A PEG koncentrációja itt 20 tömeg/térfogat%.
B rajz: a görbe: 15 mM MgCl2 b görbe: 30 mM MgCl2
1. példa pABDI plazmid felépítése
A szabadon hozzáférhető pkm 21 és pkm 244 plazmidokat [47)Beck, E. és munkatársai, Gene 19,327-336 (1982)] a PstI restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A rekombinációhoz használandó plazmidfragmentumokat 0,8%-os agarózgélben végzett elektroforézissel tisztítjuk. A fragmentumok összekapcsolásával kapott pkm 21244 plazmid az NPT-H-gén 5’- és 3’-Bal 31 delécióinak kombinációját tartalmazza, amint azt 47)Beck és munkatársai [Gene, 19, 327-336 (1982)] leírják. A Karfiol Mozaikvírus promotor szignáljának és a pkm 21244 plazmid Hindin fragmentumának összekapcsolása céljából felépítjük a pJPAX kapcsolóplazmidot. A pJPAX kapcsolóplazmidot a pUC8 és a pUC9 plazmidokból állítjuk elő p’Messing, J. és J. Vieira, Gene, 19, 269-276 (1982)]. A pUC9 plazmid kapcsolószekvenciájának 10 bázispárját elválasztunk oly módon, hogy a Hindin és az Sáli helyeken elvágjuk, a ragadós végeket polimeráz-I-Klenow fragmentummal [48Őacobsen, H. és munkatársai Biochem. 45, 623 (1974)] kezeljük, és a polinukleotidláncot összekapcsoljuk, aminek hatására a Hindin hely újratermelődik. Ezen elválasztott kapcsolószekvencia Smal helyére beépítünk egy 8 bázispárból (Xhol) álló szintetikus kapcsolóelemet. A pUC8 és a módosított pUC9 plazmidok megfelelő Xhol és HindHI fragmentumainak rekombinációjával pJPAX plazmidot kapunk, mely egy részlegesen aszimmetriás kapcsolószekvenciát tartalmaz a következő szukcesszív restrikciós helyekkel: EcoRI, Smal, BamHI, Sáli, PstI, HindlII, BamHI, Xhol és EcoRI. A CaMV gén VI promotoirégiója, mely az NPT-H strukturális génhez kapcsolódik, a CM4 184 törzs CaMV genomjából származik. Ez a CM 1841 törzs CaMV-jének egyik variánsa, melynek teljes nukleotidszekvenciáját 26)Gardener RC és munkatársai (1981) írták le. A CaMV promotor régióját a 6 kb-os kozmid pHC79-ben - mely az E.coli plazmid pBR322 egyik származéka (49)Hohns B. and Collins J., 1980) klónozzuk oly módon, hogy a CaMV genomot és pHC79 kozmidot BstlI-vel lehasítjuk, és a kapott ligátumokat egymással összekötjük. A pJPAX plazmádban a Karfiol Mozaikvírus VI génjének 5’-expressziós szignálját és az NPT-II-gén HindlII fragmentumát úgy kapcsoljuk össze, hogy a Karfiol Mozaikvírus VI gén9
HU 204891 Β jenek promotorrégiójat beiktatjuk a PstI és a HindlH hely közé. A kapott plazmidot csak a Hindin helyen hasítjuk el, és a pkm 21244plazmid a Hindin fragmentumát mindkét irányban beépítjük erre a helyre, így pJPAX Cakm+ és pJPAX Cakm' plazmidot kapunk. 5 Ahhoz, hogy az NPT-H hibrid gén 3’-terminációs szignáljának. szomszédságában egy EcoRV szekvenciát alakítsunk ki, apBR327 [30)Soberon,X és munkatársai, Gene 9, 287-305 (1980)] plazmid BamHI helyére a pJPAX Cakm+ plazmidnak egy BamHI fragmentumát 10 építjük be. így pBR327 Cakm plazmidot kapunk. Ennek az EcoRV fragmentumát, mely az új DNS-szerkezetet tartalmazza, a Karfiol Mozaikvírus Gén VI EcoRV régiójának helyettesítésére használjuk, amely gén a pUC8 plazmid Sáli helyén klónozott, s ennek 15 következtében azNPT-II-gén proteinkódolő szekvenciája a Karfiol Mozaikvírus Gén VI5’- és 3’-expressziós szignáljanak irányítása alatt áll. Az így kapott plazmidokat pABDI-nek, ill. pADBU-nek nevezik (lásd az 1. ábrán). 20
2. példa
Növényi protoplasztok előállítása 2.1 Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SRi növényi protoplasztjainak előállítása 25
A Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna dohányprotoplasztjait a Potrykus I és Shillito RD {^Methods in Enzymology, vol. 118, Plánt MolecularBioIogy, eds. A. and H. Weissbach, Academic Press, Orlando, 1986) által leírt hagyományos módon, egy dohányszuszpenziós tenyészetből állítjuk elő. 6 hetes tenyészetből steril körülmények között teljesen ép leveleket szedünk le, és teljesen átitatjuk őket az alábbi összetételű enzimes
oldattal:
víz 70 ml
szacharóz 13 g
macerozyme R10 lg
celluláz 2g
„Ozonuka”R 10 (Yakult Co. Ltd., Japan)
Drcisellase (Chemische Fabrik
Schweizerhalle, Switzeriand) 0,13 g
2-(n-morfolin)-etánszulfonsav (MES) 0,5 ml
PH 6,0
Ezután a leveleket 1-2 cm-es négyzetekre vágjuk, és a négyzeteket a fenti enzimes oldatba beáztatva egy éjszakán án 26 ’C-on, sötétben inkubáljuk. Ezután a keveréket enyhén felrázzuk, maj'd további 30 percen át inkubáljuk, míg a feltárás teljesen lejátszódik. Ezután a szuszpenziót 50 100 gm lyukbőségű szitán leszűrjük, 0,6 M szacharőzoldattal (MES.pH 5,6) alaposan átmossuk, maj’d 10 percen át 4-5000/perc fordulatszámon centrifugáljuk. Aprotoplasztok a felszínen gyűlnek össze, a közeget azután pl. injekciós tű segítségével eltávolítjuk alóluk. A protoplasz- 55 tokát 0,4 M szacharózt tartalmazó K3A közegben (102,96 g/1 szacharóz; 0,25 g/1 xilóz, 0,10 mg/I2,4-diklór-fenoxi-ecetsav; 1,00 mg/1 l-naftil-ecetsav, 0,20 mg/1 6-benzil-amino-purin; pH 5,8) (12)Potiykus I és Shillito RD és munkatársai, 1981) reszuszpendáljuk. 60
A transzformálás előtt a protoplasztokat először mossuk, számláljuk, majd alkalmas preinkubációs közegben, pl. Ws vagy HeNa/F oldatban 1-2,540¾^. sejtsűrűséggel reszuszpendáljuk. A protoplasztokat azután az alább (így pl. a 6. és 7. példában) részletesen leírt transzformációs kísérletekben alkalmazzuk.
2.2 Nicotiana plumbaginifolia növényi protoplasztjainak előállítása
A protoplasztok izolálását és a transzformálási kísérleteket megelőző inkubálását a Nicotiana tabacum SRinél leírtakkal pontosan megegyező módon végezzük.
3. példa
A transzformált protoplasztok tenyésztése
3.1 Transzformált N. tabacum c.v. Petit Havanna
SRi protoplasztok tenyésztése
A transzformálás után a protoplasztok további inkubálását 10 ml-es adagokban, 4-8404 protoplaszt/ml populációs sűrűséggel, 10 cm átmérőjű Petri-csészékben, 24 ’C-os hőmérsékleten, sötétben végezzük. 3 nap múlva a tenyésztőközeget csészénként 0,3 térfogatiész K3 közeggel hígítjuk, és az inkubálást további 4 napon át 24 ’C-os hőmérsékleten és 3000 lux mesterséges megvilágítás mellett folytatjuk. Összesen 7 nap elteltével a protoplasztokből kifejlődött kiónokat 50 mg/1 kanamicint tartalmazó és 1% agarózzal megszilárdított táptalajba ágyazzuk, majd a Shillito, R. D. és munkatársai [5I)PIant Cell Reports, 2,244-247 (1983)] által leírt „gyöngy típusú” tenyésztési módszerrel 24 ’C-os hőmérsékleten, sötétben tenyésztjük. A tápközeget minden ötödik napon egyébként változtatás nélkül - frissre cseréljük.
3.2 Transzformált N. plumbaginifolia protoplasztok tenyésztése
A kezelt protoplasztokat először 4-12 napon át nagy hormonkoncenírációjú közegben [(KAiAO közeg, 42)Installe, P. és munkatársai J. Plánt Physiol. 119,443454 (1985)], 2-3404 protoplaszt/ml sejtsűrűséggel tenyésztjük.
A sejtaggregátumok kialakulása után a túlélő kolóniákat elválasztjuk, megszámláljuk és erős hígításban (0,52403 kolónia/ml), kis hoimontartalmú, 20-40mg/1 kanamicin-szulfátot tartalmazó MDs közegben [^Negruíiu, I. és munkatársai, Theor. Appl. Génét. 66,341-347 (1983)] vagy MAPiAO közegben [42)Installe, P. és munkatársai (1985)] szuszpendáljuk. Ezután a kolóniákat 1% agaróztartahnú agar táptalajba oltva 24 ’C-os hőmérsékleten, sötétben, „gyöngy típusú” tenyésztési módszerrel [51)Shillito, R. D. és munkatársai (1983)] tenyésztjük. A tápközeget minden ötödik napon - egyébként változtatás nélkül - frissre cseréljük.
4. példa
Növényi protoplasztok regenerálása
4.1 Kanamicinnel szemben ellenálló Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SRi palánták regenerálása
A kanamicint tartalmazó tápközegben 3-4 héten át folyamatosan végzett tenyésztés után ellenállónak bi10
HU 204 891 Β zonyult 2-3 mm átmérőjű kalluszokat agarral megszilárdított, 0,05 mg/12,4-diklór-fenoxi- ecetsavat, 2 mg/I 1-naftil-ecetsavat, 0,1 mg/1 6-benzil-amino-purint, 0,1 mg/I kinetint és 75 mg/1 kanamicint tartalmazó közegbe [43)Linsmaier, Ε. M. and Skook, F., Physiol. Plánt 18, 100-127 (1965)] transzpantáljuk. A sarjadzás beindítását 150 mg/1 kanamicint és 0,2 mg/1 6-benzilamino-purint tartalmazó talajon, majd a gyökereztetést T közegben [45)Nitsch, Y. P. and C. Nitsch, Science 163, 85-87 (1969)] végezve a kanamicinnel szemben ellenálló Nicotiana tabacum növények Petit Havanna SRi változatát kapjuk.
4.2 Kanamicinnel szemben ellenálló Nicotiana plumbaginifolia palánták regenerálása
3-4 heti tenyésztés után a 2-5 mm-es átmérőt elérő ellenálló kalluszokat elválasztjuk, és további 3-5 héten át 50 mg/1 kanamicint tartalmazó szilárd táptalajon tenyésztjük.
A teljes palántákat a 42)Installe, P. és munkatársai (1985) által leírtak szerint regeneráljuk úgy, hogy az ellenálló kalluszokat RP közegből egy R’SA és/vagy M közegbe transzferáljuk.
5. példa
NPT-II-gének kimutatása növényi genomban
Transzformált sejttenyészetekből vagy azokból regenerált növények levélszöveteiből származó 0,5 g kalluszt 0 °C-on, 50 mmól/l etiIén-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsavat (EDTA), 0,25 mól/1 nátrium-kloridot és 50 ml a,a,a-trisz(hidroxi-metil)-meíil-amin-hidrokloridot (TRIS-HC1) tartalmazó pH=8-as 15%-os szacharózoldatban homogenizálunk. A sejtmagokat durván elválasztjuk oly módon, hogy a homogenizátumot 5 percig 1000 g-mal centrifugáljuk. A sejtmagokat 50 mmól/l EDTA-t és 50 mmól/l TRIS-HCl-ot tartalmazó pH=8-as 15%-os szacharózoldatban rehomogenizáljuk, 0,2% végkoncentráció eléréséig nátrium-dodecil-szulfátot adunk hozzá, és az így kapott keveréket 10 pecen át 70 °C-on melegítjük. A keveréket 2025 °C-ra hűtjük, majd 0,5 mól/1 koncentráció eléréséig kálium-acetátot adunk hozzá. Ezután a keveréket 1 órán át 0 °C-on inkubáljuk. A kapott csapadékot mikrocentrifugával 4 °C-on 15 perc alatt elválasztjuk. Az anyalúgból 20-25 °C-on 2,5-szeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsapjuk a DNS-t. Az izolált DNS-t 10 pg/ml ribonukleáz A-t tartalmazó 10 mmólos TRISHCl-oldatban oldjuk, 10 percen át 37 °C-on inkubáljuk, 250 pg/ml koncentráció eléréséig proteináz K-t adunk hozzá, majd az egészet további egy órán át 37 °C-on inkubáljuk. A proteináz K-t fenolos és kloroform/izoamil-alkoholos extrahálással eltávolítjuk. A DNS-t a vizes fázisból 0,6 térfogatrész 0,6 mólos izopropanolos nátrium-acetát-oldat hozzáadásával kicsapjuk, majd 50 pl pH-7,5-ös, 10 mmól/l TRIS-HCl-ot és 5 mmól/l EDTA-t tartalmazó oldatban feloldjuk. Hy módon főleg olyan DNS-szekvenciákat kapunk, melyek több, mint 50 000 bázispárt tartalmaznak. Ha elvégezzük a DNS restrikcióját EcoRV endonukleázzal, a fragmentumokat NPT-II-gének radioaktív úton megjelölt HindlII fragmentumaival hibridizáljuk és pABDI plazmiddal összehasonlítjuk, akkor egy Southern biot analízisben kimutatható az ΝΡΤ-Π-gén jelenléte transzformált Nicotiana tabacum és Nicotiana plumbaginifolia sejtek magjának DNS-ében.
6. példa
Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SR\ növényi protoplasztjainak transzformálására azNPT-ll-gént tartalmazó pABDI plazmiddal
A transzformációs kísérletek végrehajtásához a protoplasztokat mossuk, számláljuk, majd 1-2,5· 106 sejtsúrűséggel W5 közegben [154 mM NaCl, 125 mM CaCl2«2H2O, 5 mM KC1, 5 mM glükóz, pH 5,6; ^Menczel, L. és munkatársai (1981)] reszuszpendáljuk, ami az izolált protoplasztoknaknagy túlélési esélyt biztosít. 30 percen át 6-8 °C-on végzett inkubálás után a protoplasztokat felhasználhatjuk a transzformációs kísérletekhez.
6.1 A PEG-koncentráció hatása a közegben égzett transzformáció mértékére
A fenti W5 közeghez 65 pl vizes DNS-oldatot adunk, mely 10 pg pABDI plazmidot és 50 pg tehén-csecsemőmirigy carrier DNS-t tartalmaz. Az utóbbi DNS egy transzformáló inzert nélküli, neutrális DNS, melyet feleslegben adunk a keverékhez, hogy a transzformálandó DNS-t a nukleázos lebontástól megvédjük, A DNS hozzáadása után körülbelül 0,1-10 perccel 40 tömeg/térfogat%-os vizes polietilénglikol-oldatot adunk hozzá 1326 tömeg/térfogat% koncentráció eléréséig. Különösen előnyösnek bizonyult a CMS típusú PEG alkalmazása. Ez olyan, Ca2+-tartalmú 0,4 M mannitoldat [0,1 M Ca(NO3)2«H2O], mely 40 tömeg/térfogat% végkoncentrációban tartalmazza a körülbelül 1000-6000 molekulatömegű PEG-et. Az oldat pH-ja 7 és 9 közötti [15)Negrutiu, I. és munkatársai (1986a)].
A Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SR\ esetében előnyösen PEG CMS 4000-t alkalmazunk. Ezután a transzformációs közeg pH-ját 7-re állítjuk be. A keveréket 30 percen át 26 °C-on inkubáljuk, időnként felrázva.
Ha 20%-nál nagyobb PEG-koncentrációkat alkalmazunk, akkor előnyös, ha a közeget 3-5-szörös térfogatú 0,2 M CaCl2-oldattal több lépésben meghígítjuk. Az ily módon kezelt protoplasztokat azután 5 percen át 100 gvel lecentrifugáljuk, majd friss K3 közegben reszuszpendáljuk (0,3 ml protoplasztoldat 10 ml friss K3 közegben).
A 2. táblázat világosan mutatja, hogy a különböző PEG-koncentrációk milyen hatást gyakorolnak az N. tabacum SRi-nél elérhető transzformációs frekvenciákra. Ezek az eredmények azt is mutatják, hogy a két paraméter között egyértelmű összefüggés áll fenn. A PEG-koncentrációt 13-ról 26%-ra növelve az elért transzformációs frekvenciák 0,28-10+ről 1,2· lO+re növekednek.
6.2 A MgCk-koncentráció hatása MaMg-oldatban végzett transzformáció mértékére
A protoplasztokat először mossuk, számláljuk, majd Wj közegben [154 mM NaCl, 125 ml CaCl2’2H2O, 5 mM KC1, 5 mM glükóz, pH 5,6; «/Menczel, L. és
HU 204891 Β munkatársai (1981)] -mely az izolált protoplasztoknak nagy arányú túlélést biztosít - 1-2,5·10%η1 sejtsűrűséggel reszuszpendáljuk. 30 percen át 6-8 °C-on végzett inkubálás után a protoplasztokat felhasználhatjuk a transzformációs kísérletekhez.
Az izolált protoplasztok transzformálása előtt a Wj közeget kicseréljük a tényleges transzformációs közegre. Ez egy mannit/magnéziumoldat [MaMg-old.: 0,40,5 mM mannit, 0,1% MES (morfolin-etánszulfonsav), pH 5,6], melyben a Mg2*- koncentráció 0,1-60 mM, előnyösen 12-16 mM (Id. 2. ábra).
A protoplasztokat először 5 percen át 100 g-vel centrifugálva elválasztjuk a Wj oldatból, azután 0,3 ml MaMg-közegben reszuszpendáljuk, majd 65 pl vizes DNS-oldatot adunk hozzá, mely 5-10 gg pABDI plazmidot és 50 [lg tehén-csecsemőmirigy carrier DNS-t tartalmaz. Az utóbbi DNS egy transzformáló inzert nélküli, neutrális DNS, melyet feleslegben adunk a keverékhez, hogy a transzformálandó DNS-t a nukleázos lebontástól megvédjük. A DNS hozzáadása után körülbelül 0,1-10 perccel 40 tömeg/térfogat%-os vizes polietilénglikol-oldatot adunk hozzá 24-28 tömeg/térfogat% koncentráció eléréséig. Különösen előnyösnek bizonyult a CMS típusú PEG alkalmazása. Ez olyan, Ca2*-tartalmú 0,4 M mannitoldat [0,1 M Ca(NO3)2»H2O], mely 40 tömeg/térfogat% végkoncentrációban tartalmazza a körülbelül 1000-6000 molekulatömegű PEG-et. Az oldat pH-ja 7 és 9 közötti [I5)Negrutiu, I. és munkatársai (1986a)].
A transzformációs kísérletek során a következő paraméterek hatását vizsgáltuk:
(a) AMgCl2 alkalmazásának időtartama
A MgCb-ot vagy közvetlenül a transzformáció előtt, vagy 2 órával előbb, a 3. táblázatban megadott körül- menyek között alkalmazzuk.
Amint a 3. táblázatból látható, a legjobb eredmények (4,1*10'3 transzformációs arány) úgy érhető el, ha a MgCfe-ot közvetlenül a transzformáció előtt adjuk a közeghez. 1
Ha viszont a transzformációt nem a MgCI2 hozzáadásától számított 2 órán belül hajtjuk végre, akkor a transzformációs arány csak l,2*10'3 lesz.
Ha a mannit/MgCh-oldatot (MaMg-old.) 1:1 arányban Wj sőoldattal keverjük, a transzformáció gyakori- í sága a MgCl2 moláris koncentrációjától függően ugyancsak tőbbé-kevésbé csökken. Ha például a MaMg-oIdat MgCk-koncentrácíóját megfelezzük, akkor a transzformációs arány kb. 20%-kaI csökken.
(b) A PEG összetétele
A fenti tényezőkön kívül a PEG-oIdat összetétele is befolyásolja az elérhető transzformációs arányokat Ez úgy mutatható ki, ha egyébként azonos vizsgálati körülmények között (PEG-koncentráció 24%, MgCk-kon- 5 centráció 12 mM) összehasonlítjuk a PEG CMS I5)Negrutiu, I. ésmunkatársai (1986a) és aPEG 6R 10)Shillito, R.
D. és munkatársai (1985) hatását. Az előbbi esetben határozottan (1,4-szer) nagyobb mértékű transzformációt érhetünk el, amint az a 3. táblázaton látható. 61
A transzformációs közeg pH-ját 7-re állítjuk be. A keveréket 30 percen át 26 ’C-on inkubáljuk, időnként felrázva.
(c) Mosási körülmények
Ha 20%-nál nagyobb PEG-koncentrációkat alkalmazunk, akkor előnyös, ha a közeget 3-5-szörös térfogatú 0,2 M CaCH-oIdattal több lépésben meghígítjuk. Az ily módon kezelt protoplasztokat azután 5 percen át 0 100 g-vel lecentrifugáljuk, majd friss K3 közegben reszuszpendáljuk (0,3 ml protoplasztoldat 10 ml friss K3 közegben).
Ennek hatására a transzformációs arányok az egyszerű sóoldattal (W5 oldat) történő kezeléshez képest
1,7-szeresre növekedhetnek (Id. 3. táblázat).
(d) Kontroll
A kontrollvizsgálatot a 3. táblázaton feltüntetett módon hajtjuk végre.
A Mffá-ionok hiánya
A fenti eredményeket a kontrollvizsgálatokéval melyeket az alkalmas pufferoldatok (Ws vagy HeNa/Foldat) p^Fromm, M. és munkatársai, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82,5842-5848 (1985)] jelenlétében, de Mg2*ionok nélkül hajtottuk végre — összehasonlítva azt látjuk, hogy az utóbbi esetben kapott transzformációs frekvenciák az előbbieknek 1/10 részét sem érik el. A fent említett magas transzformációs arányok még ) elektroporációval sem érhetők el.
PEGlMffá szinergizmus
A Mg^-ionok és a PEG együttes alkalmazásakor tapasztalható színergetikus hatás világosan látszik, ha í összehasonlítjuk a 6 mM MgCl2 jelenlétében, de a PEG hozzáadása nélkül végzett kontrollvizsgálatok transzformációs eredményeit azokkal, melyeket a tényleges példákban, MgCl2 és PEG együttes alkalmazásával kaptunk (3. táblázat).
A 6 mM MgCl2 jelenlétében, de PEG hozzáadása nélkül végzett kontrollvizsgálatok semmiféle kimutatható transzformációt nem eredményeztek.
Ezzel szemben a már említett nagymértékű (4,l*10'3) transzformációt érhetjük el oly módon, hogy a 20 tömeg/térfogat% végkoncentráció eléréséhez szükséges mennyiségű PEG-et közvetlenül (0, ΙΙΟ perccel) a DNS hozzáadása után adjuk a MgCh-ot tartalmazó transzformációs közeghez.
Az így kapott transzformációs arányok csaknem 10-szer akkorák, mint azok, amelyeket PEG alkalmazásával, de MgCl2 hozzáadása nélkül kaptunk (2. táblázat).
7. példa
A Nlcotiana plumbaginifolia protoplasztjainak átalakítása αζΝΡΤ-Π-gént tartalmazó pABDI plazmáddal végzett transzformáció útján A protoplasztok izolálását és a transzformációs kísérleteket megelőző inkubálást pontosan a Nicotiana tabacum SRi-né\ leírt módon végezzük.
HU 204 891 Β
7.1 Az alkalmazott DNS szerkezetének és koncentrációjának hatása a transzformáció mértékére MaCa-oldatban végzett transzformációnál
A fenti módon előkezelt Nicotiana plumbaginifolia protoplasztok tényleges átalakítását MaCa-oldatban (0,4 M mannit, 15 mM CaCWHjO, pH 5,6) hajtjuk végre. A lineáris vagy cirkuláris plazmid DNS-t és tehén-csecsemőmirigy hordozó DNS-t tartalmazó vizes DNS-oldat hozzáadása után 13 tömeg% végkoncentráció eléréséig 40 tömeg/térfogat%-os vizes polietilénglikol-oldatot adagolunk az elegyhez. A DNS-oldatban a plazmid DNS és a hordozó DNS aránya 1:5 és 5:1 között változik (Id. 1. táblázat).
A DNS és a PEG hozzáadása között eltelő idő általában nem több 0,1-10 percnél. Továbbá a Nicotiana plumbaginifolia esetén különösen előnyös a PEG CMS 4000 alkalmazása, mert ezzel nagymértékű átalakulást érünk el. Ezután a transzformációs közeg pH-ját 7-re állítjuk be. A keveréket 30 percen át 26 °C-on inkubáljuk, időnként felrázva.
Az izolált protoplasztokat először 4-12 napon át nagy hormonkoncentrációjú közegben [KAiAO közeg, 42)Installe, P. és munkatársai J. Plánt Physiol. 119, 443-454 (1985)], 2-3·104 protoplaszt/ml sejtsűrűséggel tenyésztjük. Az átalakított protoplasztok továbbtenyésztését és kanamicinnek ellenálló növények regenerálását a 3.2, ill. 4.2 példában leírtak szerint végezzük.
Amint az az 1. táblázatból látható, lineáris DNS-sel határozottan jobb transzformációs arányok érhetők el, mint cirkuláris DNS-sel. A lineáris DNS-sel kapott transzformációs arányok a cirkuláris DNS-sel kapott érték 102-szorosát is elérhetik.
Az 1. táblázatból látható, hogy nemcsak a DNS szerkezete, hanem a plazmid DNS-nek a hordozó DNS-hez viszonyított aránya is befolyásolja az elérhető transzformációs arányt.
A legjobb eredményeket úgy kapjuk, ha a hordozó DNS határozott feleslegben van a plazmid DNS-hez képest; a plazmid DNS és a hordozó DNS különösen előnyös aránya 10:50.
Eredményeink megerősítik a dohányrendszerekkel kapott korábbi eredményeket [10)Shillito, R. D. és munkatársai, Bio/Technology 3, (1985)].
7.2 A PEG-koncentráció hatása transzformáció mértékére
A transzformációs kísérleteket pontosan a 6.1 példában leírtak szerint hajtjuk végre. Jelen esetben a transzformációt W5 sóoldatban végezzük, a plazmid DNS és a hordozó DNS aránya 1:5, a PEG-et 8-27%-os koncentrációban alkalmazzuk.
A 2. táblázat azt mutatja, hogy a különböző PEGkoncentrációk milyen hatást gyakorolnak a Nicotiana plumbaginifolia-rtá\ elérhető transzformációs arányokra. A két paraméter között világos összefüggés látható. Miközben a PEG-koncentrációt 8-ról 27%-ra növeljük, a transzformáció mértéke 0,03’10'4-ről 0,46«10'4-renő.
7.3 A MgCli-koncentráció hatása transzformáció mértékére
A transzformációs kísérleteket pontosan a 6.2 példában leírtak szerint hajtjuk végre. A 6. példa elején megadott módon előkezelt N. plumbaginifolia protoplasztok átalakítását mannit/magnéziumoldatban [MaMg-oId.: 0,4-0,5 mM mannit, 0,1% MES (morfolin-etánszulfonsav), pH 5,6], melyben a Mg2+-koncentráció 0,1-60 mM, előnyösen 22-27 mM (Id. 2. ábra).
pl vizes DNS-oldat hozzáadása után - mely 510 pg plazmid pABDI-t és 50 pg tehén-csecsemőmirigy hordozó DNS-t tartalmaz -18-22 tömeg/térfogat% végkoncentráció eléréséig 40 tömeg/térfogat%-os vizes polietilénglikol-oldatot adagolunk az elegyhez. 20% fölötti PEG-koncentráció alkalmazá-sa esetén előnyösnek bizonyult a tápközeg hozzáa-dása előtt néhányszor átmosni a kezelt protoplasztokat 0,2 M CaCWHzO-oldattal. Ennek hatására a transzformációs arányok az egyszerű sóoldattal (W5 oldat) történő kezeléshez képest 1,7-szeresre növekedhetnek.
A DNS és a PEG hozzáadása között eltelt idő általában nem több 0,1-10 percnél. Továbbá a Nicotiana plumbaginifolia esetén különösen előnyös a PEG CMS 4000 alkalmazása, mert ezzel nagymértékű átalakulást érünk el. Ezután a transzformációs közeg pH-ját 7-re állítjuk be. A keveréket 30 percen át 26 °C-on inkubáljuk, időnként felrázva.
Amint a 2A ábrán látható, az N. plumbaginifolia esetén az optimum magasabb MgCI2-koncentrációnál jelentkezik, mint az N. tabacumnál.
Ez esetben a maximális transzformációs arányokat 20 mM MgCh- és 20 PEG-koncentrációnál értük el. Ilyen körülmények között 3,940-4 transzformációs arány érhető el, ami lényegesen nagyobb, mint az ezen fajtával eddig kapott érték.
8. példa
Az átalakított génnek a leszármazottakba történő átvitelének és normál növényi örökletes transzmissziójának kimutatása A genetikailag módosított (első generációs és leszármazott) növényeken végzett széles körű genetikai hibridizációs elemzések részletes molekuláris biológiai vizsgálatok (pl. a növényi genomiális DNS Southern biot analízise, az amino-glükozid-foszfotranszferáz vagyis a kanamicinspecifíkus foszforilezést végző enzim vizsgálata) a következő eredményeket adták:
1. A bakteriális gén stabilan beépült a növényi genomba;
2. Általában módosítás nélkül és szabályosan adódik át a hibridizációs leszármazottaknak;
3. Genotípusa megfelel egy természetes, egyszerű, domináns növényi génnek;
4. A DNS-hibridizálással végzett molekuláris elemzés és enzimvizsgálat megerősíti a genetikai hibridizációs elemzési eredményeket;
5. A genetikusán módosított növények a kezelés során megőrizték normális, természetes fenotípusukat, tehát nem kívánt módosulásokat nem tapasztaltunk.
HU 204891 Β
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy növényi anyagok kontrollált genetikai módosítására a legjobb móíiszer a találmány szerinti eljárással végrehajtott közvetlen géntranszfer. A genetikai módosulat stabil, a növényi genotípus nem kívánt módosulásokat szenved.
Táblázatok 1. táblázat
A DNS szerkezetének, valamint a plazmid DNS (pABDR és a hordozó DNS koncentrációarányának hatása az átalakulási arányokra (RTF és ATF) Nicotiana plumbaginifolia protoplasztok esetén. A transzformációs kísérleteket 13% PEG CMS4 koncentrációjú MaCa-oldatban végeztük.
3. táblázat
AMgCh-koncentráció, az alkalmazás időtartama, az alkalmazott PEG-koncentráció, és nagy (>25%) PEGkoncentrációk esetén a mosási körülmények hatása az N. tabacum SRi protoplasztok transzformációjára. A transzformációs kísérletekhez (a táblázaton külön szereplők kivételével) 20%-os PEG CMS4 és PEG CMS6 oldatot használtunk.
Transzformáció
GPPL •105
ZT
ATF •10'3
DNS-koncent- GPPL UE ZT RTF ATF
ráció (pm/ml) •106 •104 •IO-4 •IO-4
lineáris pABDI
10+20 2 45 4 0,085 0,02
10+50 2 49,6 23 0,464 0,12
50+10 2 46,4 1 0,022 0,005
cirkuláris pABDI
10+50 2 45,4 0 <0,01 <0,005
50+10 2 41,6 0 <0,01 <0,005
1. kontrollvizsgálatok
Wj, Mg2* nélkül 0,59 77 0,13±0,03
HeNa/F, Mg2* nélkül 0,26 265 1,0+0,38
MaMg 12 mM, 8% PEG6R
1500 V, 3 impulzus,
IklOnF 0,26 324 l,3±0,2ó
MaMg 6 mM, PEG nélkül 0,33 0
mint fent, +0,1 M MgCl2 0,33 0
a DNS hozzáadása után
2. MgCl2 hozzáadása közvetlenül a transzformáció előtt
Wj+MaMg
2. táblázat
A PEG-koncentráció halásza Nicotiana plumbaginifolia és a Nicotiana tabacum c.v. Petit Havanna SRi (C.S.) protoplasztok átalakulási arányaira. A transzformációs kísérleteket W5 sóoldatban végeztük, a plazmid DNS és a hordozó DNS aránya 1:5 volt
PEG-koncentráció GPPL ZT RTF ATF
(%, w/v) •IO6 •IO-4 •IO-4
PEGCMS4 N. plumbaginifolia
8% 0,72 2 0,13 0,03
(+0,02)
13% 1,05 7 0,26 0,063
(±0,035)
20% 0,90 22 1,45 0,25
(±0,06)
24% 1,0 32 2,0 0,32
(±0,07)
27% 1,0 46 3,1 0,46 í
(±0,05)
PEGCMS6 N. tabacum, SRi
13% 0,33 14 - 0,28
1 (±0,15) í
20% 0,33 30 - 0,90
(±0,05)
26% 0,33 40 - 1,2
(±0,08) c
(l.T, MgCI24mM) 0,37 1033 2,7±0,46
Ws+MaMg
(l:l,MgCl28mM) 0,33 1087 3,3±0,48
MaMgómM 0,50 2045 4,l±0,51
MaMg 12 mM 0,50 2056 4,l±0,86
3. MgCl2 hozzáadása 2 órával a transzformáció előtt
MaMgómM 0,33 382 l,2±0,30
4. PEG-készítmény (MaMg 12 mM)
PEGCMS4(24%) 0,32 693 2,2±0,55
PEGR6(24%) 0,32 474 l,5±0,34
5. Mosási körülmények (MaMg 12 mM; 25% PEG)
CaCI2«2H2O 0,2 M 0,32 1127 3,5±0,56
Wj 0,32 686 2,l±0,43
MaMg... mM aMaMg-oldatMgCl2-koncentráciőját 45 jelenti.
Irodalom:
1. Rothenstein SJ, Reznikoff WS, Cell 23,191-199 (1981)
2. Heirera-Estrella L. és mtsai, Natúré 303,209-213 (1983)
3. Bevan MW, Flavell RB, Natúré 304, 184-187 (1983)
4. Chiltion M.-D., Scientific American 24816,50-59 55 (1983)
5. Herrera-Estrella L. és mtsai, EMBO J. 2/6, 987— 995 (1983)
6. Murai N. és mtsai, Science 222,476-482 (1983)
7. Harsch RB. és mtsai, Science 223, 496-498 60 (1984)
HU 204 891 Β
8. Fraley RT. és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,4803-4807 (1983)
9. Potrykus I. és mtsai, Plánt Molec. Bioi. Rep. 3,
117-128 (1985)
10. Shillito RD. és mtsai, Bio/Technology 3, 1099— 1103 (1985)
11. Neumann E. és mtsai, EMBO J. 7, 841-845 (1982)
12. Potrykus I., Shillito RD, Methods in Enzymology 118, 449-578 (1986), Plánt Molecular Biology, eds. A.+H. Weissbach, Academic Press, Orlando (1986)
13. Koblitz H, Methodische Aspekte dér Zell- und Gewebezüchtung bei Gramineen unter besonderer Berücksichtigung dér Getreide. Kultrurpflanze XXII, 93157 (1974)
14. McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual, Mc Publishing Coip., Ridgewood New Jersey, (1981); Stache H, „Tensid-Taschenbuch”, Cári Hanser Verlag, München/Wien, 1981
15. Negrutiu I. és mtsai, Theor. Appl. Génét. 72, 279-286 (1986a)
16. Wiena nd U. és mtsai, Mól. Gén. Génét. 182, 440-444(1981)
17. Pennica D. és mtsai, Natúré 301, 214-221 (1983)
18. Stepien P. és mtsai, Gene 24,289-297 (1983)
19. Maniatis T. és mtsai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982
20. Franck G. és mtsai, Cell 21,285-294 (1980)
21. Hohn és mtsai, in: „Molecular Biology of Plánt Tumors”, Academic Press, New York, 549-560. oldal,
1982
22. Berry-Lowe és mtsai, J. Mól. Appl. Génét. 1, 483-498 (1982)
23. Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective; ed. A. Cashmore, Plenum, New York, 1983,29-38. oldal
24. Coruzzi G. és mtsai, J. Bioi. Chem. 258, 1399 (1983)
25. Dunsmuir P. és mtsai, J. Mól. Appl. Génét. 2, 285 (1983)
26. Gardner RC. és mtsai, Nucl. Acid Rés. 9/12, 2871-2888 (1981)
27. Rodriguez RL, Tait RC, Recombinant DNA techniques, Addison-Wesley Publishing Coip., London, Amsterdam, Don Mills, Ontario, Sydney, Tokyo,
1983
28. Messing J, Vieira J, Gene 19,269-276 (1982)
29. Evans és mtsai, „Protoplast Isolation and Culture”, in: Handbook of Plánt Cell Culture, 1, 124-176 (Mac Millan Publishing Co., New York, 1983)
30. Davey MR, „Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plánt Protoplasts”, Protoplasts, 1983, - Lecture Proceedings, 19-29. oldal (Birkháuser, Basel, 1983)
31. Dalé PJ, „Protoplast Culture and Plánt Reneration of Cereals and other Recalcitrant Crops”, in: Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, 31-41. oldal (Birkháuser, Basel, 1983)
32. Binding H, „Regeneration of Plants”, in: Plánt Protoplasts, 21-37. oldal (CRC Press, Boca Raton, 1985)
33. Abdullah R. és mtsai, Bio/Technology 4,10871090 (1985)
34. Fujimura T. és mtsai, Plánt Tissue Culture Lett. 2,74-75 (1985)
35. Toriyama K. és mtsai, Theor. Appl. Génét. 73, 16-19 (1986)
36. Yamada Y. és mtsai, Plánt Cell Rep. 5, 85-88 (1986)
37. Southern EM, J. M. Bioi. 98,503-517 (1975)
38. Rigby WJ, és mtsai, J. Mól. Bioi. 113, 237-251 (1977)
39. Fromm M. és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,5842-5848 (1985)
40. Shillito RD. és mtsai Mutation Rés. 81,165-175 (1981)
41. Nagy JI., Maliga P, Z. Planzenphysioogie 78, 453-455 (1976)
42. Installe P. és mtsai, J. Plánt Physiol. 119, 443454 (1985)
43. Linsmaier EM, Skook F, Physiol. Plánt 18,100— 127 (1965)
44. Negrutiu I. és mtsai, Theor. Appl. Génét. 66, 341-347 (1983)
45. Nitsch JP, Nitsch C, Science 163, 85-87 (1969)
46. Menczel L. és mtsai, Theor. Appl. Génét. 59, 191-195 (1981)
47. Beck E. és mtsai, Gene 19,327-336 (1982)
48. Jacobsen H. és mtsai, Eur. J. Biochem. 45, 623 (1974)
49. Hohn B, Collins J, Gene 11,291-298 (1980)
50. Soberon X. és mtsai, Gene 9,287-305 (1980)
51. Shillito RD. és mtsai, Plánt Cell Rep. 2,244-247 (1983)

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás növényi protoplasztok direkt transzformálására, azzal jellemezve, hogy
    - növényi protoplasztokat izolálunk tetszőleges növényi szövetekből vagy sejttenyészetből és táptalajban tenyésztjük őket;
    - a protoplasztokat a transzformáció előtt 20 perc - 6 óra időtartamig Ca2*-, K*- és Na*-ionokat, valamint alkalmas szénforrást tartalmazó tápközegben, 410 ’C hőmérsékleten előinkubáljuk;
    - a protoplasztokat elválasztjuk az előinkubáló közegtől, és újraszuszpendáljuk az alapvető komponensként 0,1-60 mM Mg2+-iont, adott esetben Ca2*-ionokat is tartalmazó transzformációs oldatban;
    - közvetlenül ezután a transzformációs oldathoz hozzáadjuk a DNS-próbát, amely a transzformáló DNS-t tartalmazza 2-20 Rg/ml mennyiségben, továbbá a nukleázlebontással szembeni védelemre carrier DNS-t adunk a transzformációs oldathoz;
    - 0,1-10 perc múlva hozzáadunk 10-30% végkoncentrációjú polietilénglikolt; és
    HU 204891 Β
    - a protoplasztokat és a DNS-próbát a fenti transzformációs oldatban a protoplasztok DNS-felvételéhez szükséges ideig inkubáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat transzformációs oldatként 1030 mM koncentrációban Mg2+-ionokat tartalmazó oldatban szuszpendáljuk újra.
  3. 3. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 20-28% végkoncentrációjú polietilénglikolt adunk a transzformációs oldathoz.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat 5,6-12 pH-éríékú tápközegben inkubáljuk elő.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat 710 pH-értékű tápközegben inkubáljuk elő.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2-10 pg/ml koncentrációjú transzformáló DNS-t tartalmazó DNS-próbát adunk a transzformációs oldathoz.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy canier DNS-ként célszerűen állati DNS-t, növényi DNS-t, lambda-DNS-t vagy plazmid DNS-t adunk a transzformációs oldathoz.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy canier DNS-ként borjútimusz canier DNS-t adunk a transzformációs oldathoz.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy canier DNS-ként 50-70 pg/ml koncentrációjú DNS-t adunk a transzformációs oldathoz.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat 20 perc és 1 óra közötti időtartamig inkubáljuk elő.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat és a DNS-próbát a transzformációs oldatban 10 perc és 6 óra közötti ideig inkubáljuk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi protoplasztokként egyetlen növényfaj vagy növényfajta protoplasztjait izoláljuk.
  13. 13. A12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat levelekből, csírákból, szárakból, virágokból, gyökerekből, pollenből vagy embriókból izoláljuk.
  14. 14. A13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy levélprotoplasztokat izolálunk.
  15. 15. A12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokat sejttenyészetekből izoláljuk.
    HU 204 891 Β Int. Cl.5: C 12 N 015/64 (//////////////777///// ·. NPT II-Strukturgen
    4630 4833 5383 5708 5848 7340 7670
    Bqlll Sáli Pstl EcoRVHindlll EcoRV Bglll | ' 6ENV GÉN VI
    TAA ATG . TGA
    CautiHowcr mozaik-vírus qen-VI r<zgíoja
    Hindui Pali Psil Hindlll
    -Η\\«!— —— pkm Z\ T6A ATG pkm244- 16A
    H>nd Ili Psil Hindlll
    -mWwt1pkm 21244 TGA
    EcoRV.Hindlll Hindlll
    ATG 1 TGA pUPAX Cokm Ps{1 EcoRV Hindlll Hindin Bom
    AT6 TGA
    BamHl [—EcoRV pBR 327 Cokrn
    Sotl PsHEcoRY .Hindlll Hindlll EcoRV^, BgLII
    Sflwwr 5°11
    ATG , TGA pABDl(5.3kb)
    I.abra*. pABDl cspABDIl plozmid előállítása
    HU 204 891 B IntCl.5: C12 N 015/64 transzformált sajt /3,3 Jos protop löszt
    2. abra·· MgCl2-koncentráció (A), valamint a IPEG - interakció ( B) hatosa a transzformációs ratora 5Rt_dohóny-(A.B) ’es N. plumbaginifolia - protoplasztoknal
HU875448A 1986-12-05 1987-12-04 Process for direct transformation of plant protoplasts HU204891B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH486686 1986-12-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT45275A HUT45275A (en) 1988-06-28
HU204891B true HU204891B (en) 1992-02-28

Family

ID=4283920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU875448A HU204891B (en) 1986-12-05 1987-12-04 Process for direct transformation of plant protoplasts

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5508184A (hu)
EP (1) EP0270496B1 (hu)
JP (1) JP3125050B2 (hu)
AT (1) ATE87032T1 (hu)
AU (1) AU613596B2 (hu)
BR (1) BR8706568A (hu)
CA (1) CA1340739C (hu)
DE (1) DE3784860D1 (hu)
DK (1) DK175510B1 (hu)
ES (1) ES2039474T3 (hu)
GR (1) GR3007852T3 (hu)
HU (1) HU204891B (hu)
IL (1) IL84699A (hu)
NZ (1) NZ222792A (hu)
PH (1) PH25945A (hu)
ZA (1) ZA879113B (hu)

Families Citing this family (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE169955T1 (de) * 1987-05-20 1998-09-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellug von transgene zea mays- pflanzen, die aus protoplasten oder aus von protopflasten erhaltenen zellen regeneriert wurden
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US7135282B1 (en) 1999-10-14 2006-11-14 The Dow Chemical Company Viral particles with exogenous internal epitopes
US6580019B1 (en) 2000-03-09 2003-06-17 Dekalb Genetics Corporation Non-reciprocal recombination-mediated transgene deletion in transgenic plants
US6750379B2 (en) 2000-03-09 2004-06-15 Dekalb Genetics Corporation Homologous recombination-mediated transgene alterations in plants
AU2001271614B2 (en) 2000-07-03 2007-05-31 Catalent Pharma Solutions, Llc Host cells containing multiple integrating vectors
AU7025201A (en) * 2000-07-03 2002-01-14 Gala Design Inc Expression vectors
US20040235173A1 (en) * 2000-07-03 2004-11-25 Gala Design, Inc. Production of host cells containing multiple integrating vectors by serial transduction
US20030224415A1 (en) * 2001-06-29 2003-12-04 Gala Design, Inc. Selection free growth of host cells containing multiple integrating vectors
US7384738B2 (en) * 2002-03-28 2008-06-10 Bremel Robert D Retrovirus-based genomic screening
US20040038304A1 (en) * 2002-03-28 2004-02-26 Gala Design, Inc. Antibody libraries
CA2486559C (en) 2002-05-22 2015-07-21 Monsanto Technology Llc Fatty acid desaturases from fungi
CN1836045B (zh) 2003-03-28 2012-05-09 孟山都技术有限公司 用于早期种子发育的新型植物启动子
US20050014932A1 (en) 2003-05-15 2005-01-20 Iogenetics, Llc Targeted biocides
AR045495A1 (es) 2003-08-25 2005-11-02 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de la tubulina para usar en plantas
US20050221429A1 (en) * 2004-01-16 2005-10-06 Cardinal Health Pts, Llc Host cells containing multiple integrating vectors comprising an amplifiable marker
ATE516295T1 (de) 2004-01-20 2011-07-15 Monsanto Technology Llc Chimäre promotoren zur verwendung in pflanzen
WO2005087007A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Monsanto Technology Llc Herbicidal compositions containing n-phosphonomethyl glycine and an auxin herbicide
EP1788861B1 (en) 2004-08-24 2017-04-12 Monsanto Technology, LLC Adenylate translocator protein gene non-coding regulatory elements for use in plants
EP2003206A1 (en) 2004-09-14 2008-12-17 Monsanto Technology, LLC Promoter molecules for use in plants
CN101501199B (zh) 2006-02-10 2016-11-09 孟山都技术有限公司 用于控制植物寄生线虫的靶基因的鉴定和用途
CA2637363C (en) 2006-02-13 2016-04-05 Monsanto Technology Llc Selecting and stabilizing dsrna constructs
EP1984510B1 (en) 2006-02-17 2015-04-08 Monsanto Technology LLC Chimeric regulatory sequences comprising introns from dicotyledons for plant gene expression
BRPI0711634B1 (pt) 2006-05-12 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Método para a preparação de sementes isentas de marcador de uma planta transgênica
EP2027295A2 (en) 2006-05-25 2009-02-25 Monsanto Technology LLP A method to identify disease resistant quantitative trait loci in soybean and compositions thereof
US7855326B2 (en) 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
EP2056667A1 (en) 2006-08-15 2009-05-13 Monsanto Technology, LLC Compositions and methods of plant breeding using high density marker information
EP2053916A2 (en) 2006-10-16 2009-05-06 Monsanto Technology, LLC Methods and compositions for improving plant health
US7939721B2 (en) 2006-10-25 2011-05-10 Monsanto Technology Llc Cropping systems for managing weeds
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
WO2009014782A2 (en) * 2007-04-27 2009-01-29 Dow Global Technologies Inc. Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
CL2008001682A1 (es) 2007-06-08 2008-12-12 Monsanto Technology Llc Metodos para el mejoramiento de plantas mediante el uso de informacion directa de secuencias de acidos nucleicos.
CN101821409B (zh) 2007-08-29 2014-08-27 孟山都技术公司 用于优选性状育种的方法和组合物
CN102027115A (zh) * 2008-03-31 2011-04-20 希尔雷斯股份有限公司 启动子、启动子控制元件以及其组合和用途
WO2009126470A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
WO2010099431A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Monsanto Technology Llc Hydroponic apparatus and methods of use
JP2012523850A (ja) 2009-04-20 2012-10-11 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物中の複数ウイルス抵抗性
US8629329B2 (en) * 2009-05-19 2014-01-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Self-compatible, rapid-cycling Brassica rapa plants lacking inbreeding depression
US20120142532A1 (en) 2009-08-10 2012-06-07 Monsanto Technology Llc Low volatility auxin herbicide formulations
US8937214B2 (en) 2009-10-23 2015-01-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
CA3017321C (en) 2010-01-14 2021-07-20 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
EA031356B1 (ru) 2010-01-22 2018-12-28 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Вырезание трансгенов в генетически измененных организмах
US20110289625A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Rujin Chen Altered leaf morphology and enhanced agronomic properties in plants
AU2011270652B2 (en) 2010-06-24 2015-10-01 Corteva Agriscience Llc Lowering saturated fatty acid content of plant seeds
AR081302A1 (es) 2010-06-24 2012-08-01 Brookhaven Science Ass Llc Acumulacion de acidos grasos omega-7 ( -7) en semillas de plantas
RS57012B1 (sr) 2010-08-30 2018-05-31 Dow Agrosciences Llc Pospešivač bakterijskog virusa šećerne repe (scbv) i njegova upotreba u funkcionalnoj genomici biljke
WO2012061615A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Transcription factors for modification of lignin content in plants
US10407685B2 (en) 2010-12-17 2019-09-10 Monsanto Technology Llc Methods for improving competency of plant cells
US8987552B2 (en) 2010-12-30 2015-03-24 Dow Agrosciences, Llc. Nucleic acid molecules that target the vacuolar ATPase H subunit and confer resistance to coleopteran pests
UY33854A (es) 2010-12-30 2012-07-31 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico que se dirigen a la subunidad c de la atpasa vacuolar y confieren resistencia a las plagas de coleópteros
CN103403162A (zh) 2010-12-30 2013-11-20 陶氏益农公司 赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子
EP2718443B1 (en) 2011-06-06 2017-11-29 Bayer CropScience NV Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
CN103890181A (zh) 2011-08-22 2014-06-25 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
WO2013063357A2 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Monsanto Technology Llc Salts of carboxylic acid herbicides
TWI637054B (zh) 2012-02-01 2018-10-01 陶氏農業科學公司 抗嘉磷賽（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）之植物及相關方法
CN104202966B (zh) 2012-02-02 2017-11-10 陶氏益农公司 植物反式激活互作基序及其用途
KR20140130506A (ko) 2012-02-29 2014-11-10 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 사탕수수 바실루스형 바이러스 (scbv) 인핸서 및 식물 기능성 유전체학에서의 이의 용도
AU2013205557B2 (en) 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
CA2871524C (en) 2012-05-07 2021-07-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
AR091268A1 (es) 2012-06-04 2015-01-21 Monsanto Technology Llc Composiciones herbicidas concentradas acuosas que contienen sales de glifosato y sales de dicamba
MX362498B (es) 2012-06-26 2019-01-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para calidad de forraje mejorada.
MY184660A (en) * 2012-08-15 2021-04-14 Malaysian Palm Oil Board Plant regeneration from protoplasts derived from elaeis sp suspension cultures
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
AU2013312538B2 (en) 2012-09-07 2019-01-24 Corteva Agriscience Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
EP2897454B1 (en) 2012-09-24 2019-11-06 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for extending shelf life of plant products
US10544405B2 (en) 2013-01-16 2020-01-28 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
HUE040466T2 (hu) 2013-02-27 2019-03-28 Monsanto Technology Llc Javított illékonyságú glifozát és dicamba tankkeverékek
WO2015036593A2 (en) 2013-09-13 2015-03-19 University Of Bremen Transgenic plants for nitrogen fixation
AU2014329590B2 (en) 2013-10-04 2017-10-19 Dow Agrosciences Llc Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof
BR102014025574A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e usos dos mesmos
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
EP3066202B1 (en) 2013-11-04 2021-03-03 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
UA120502C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-26 Дау Агросайєнсиз Елелсі Спосіб отримання трансгенної рослини маїсу
RU2019128647A (ru) 2013-11-04 2019-11-05 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Оптимальные локусы кукурузы
TW201525136A (zh) 2013-11-26 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
WO2015095750A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Dow Agrosciences Llc Rnapii-140 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
TW201527313A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
TW201527316A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（五）
TW201527312A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（一）
TW201527314A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）
BR102015000943A2 (pt) 2014-01-17 2016-06-07 Dow Agrosciences Llc expressão aumentada de proteína em planta
TW201538518A (zh) 2014-02-28 2015-10-16 Dow Agrosciences Llc 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現
RU2016146483A (ru) 2014-05-07 2018-06-09 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Молекулы нуклеиновой кислоты dre4, сообщающие резистентность к жесткокрылым вредителям
AU2015346281B2 (en) 2014-11-12 2021-12-02 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
US20160194658A1 (en) 2014-12-22 2016-07-07 Dow Agrosciences Llc Nucampholin nucleic acid molecules to control coleopteran insect pests
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
KR20170136573A (ko) 2015-04-15 2017-12-11 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 트랜스젠 발현을 위한 식물 프로모터
AU2016250065A1 (en) 2015-04-15 2017-10-19 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
CN108473997B (zh) 2015-10-22 2022-04-12 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
US20170121726A1 (en) 2015-11-04 2017-05-04 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
CN109415737A (zh) 2016-05-25 2019-03-01 嘉吉公司 用于在植物中产生突变的工程化核酸酶
US10519459B2 (en) 2016-10-03 2019-12-31 Dow Agrosciences Llc Plant promoter from Panicum virgatum
CN110291199B (zh) 2016-10-03 2023-12-22 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
US20200109408A1 (en) 2017-05-31 2020-04-09 Tropic Biosciences UK Limited Methods of selecting cells comprising genome editing events
GB201708665D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing extractability of solids from coffee beans
GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
US20210054404A1 (en) 2017-08-22 2021-02-25 Napigen, Inc. Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease
CN118531041A (zh) 2017-08-31 2024-08-23 科迪华农业科技有限责任公司 使用来自叶绿素结合Ab基因的调控元件表达转基因的组合物和方法
US11555199B2 (en) 2017-09-19 2023-01-17 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of plant non-coding RNA molecules for silencing gene expression
GB201807192D0 (en) 2018-05-01 2018-06-13 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for reducing caffeine content in coffee beans
EP3906309A2 (en) 2019-01-04 2021-11-10 Cargill, Incorporated Engineered nucleases to generate mutations in plants
GB201903521D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd No title
GB201903520D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing genes in eukaryotic cells
GB201903519D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Introducing silencing activity to dysfunctional rna molecules and modifying their specificity against a gene of interest
CN111019879B (zh) * 2020-01-15 2022-08-09 华南师范大学 一种花生原生质体提取方法及其应用
CN112522177A (zh) * 2020-12-28 2021-03-19 成都极谷基因科技有限公司 高粱原生质体的制备与转化方法
GB202103256D0 (en) 2021-03-09 2021-04-21 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for silencing genes
JP2024524924A (ja) 2021-07-02 2024-07-09 トロピック バイオサイエンシーズ ユーケー リミテッド バナナ果実における褐変の遅延又は防止
GB202109586D0 (en) 2021-07-02 2021-08-18 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for editing banana genes
GB202112866D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to fusarium wilt in a banana
GB202112865D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to black sigatoka disease in banana
GB202305021D0 (en) 2023-04-04 2023-05-17 Tropic Biosciences Uk Ltd Methods for generating breaks in a genome

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8200523A (nl) * 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
DE3416978A1 (de) * 1983-05-12 1984-12-06 Stauffer Chemical Co., Westport, Conn. Durch liposom vermittelte transformation eukaryotischer zellen
EP0429093B1 (de) * 1984-05-11 2001-08-08 Syngenta Participations AG Transformation von Pflanzenerbgut
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
FI864720A (fi) * 1985-11-22 1987-05-23 Ciba Geigy Ag Direkt gentransmission i plasticider och mitokondrier.
US4836556A (en) * 1987-12-11 1989-06-06 Kidde Recreational Products Inc. Dart game target construction

Also Published As

Publication number Publication date
PH25945A (en) 1991-12-19
JP3125050B2 (ja) 2001-01-15
EP0270496A2 (de) 1988-06-08
CA1340739C (en) 1999-09-14
AU8211187A (en) 1988-06-09
GR3007852T3 (hu) 1993-08-31
US5508184A (en) 1996-04-16
JPS63160588A (ja) 1988-07-04
ZA879113B (en) 1988-06-06
HUT45275A (en) 1988-06-28
DK175510B1 (da) 2004-11-15
DK637887D0 (da) 1987-12-04
BR8706568A (pt) 1988-07-12
AU613596B2 (en) 1991-08-08
IL84699A0 (en) 1988-05-31
EP0270496A3 (en) 1990-10-24
NZ222792A (en) 1990-05-28
ATE87032T1 (de) 1993-04-15
ES2039474T3 (es) 1993-10-01
DE3784860D1 (de) 1993-04-22
DK637887A (da) 1988-06-06
IL84699A (en) 1992-11-15
EP0270496B1 (de) 1993-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU204891B (en) Process for direct transformation of plant protoplasts
US20230242926A1 (en) Methods and hybrids for targeted nucleic acid editing in plants using crispr/cas systems
JP6990653B2 (ja) 迅速な植物形質転換のための方法および組成物
US5981840A (en) Methods for agrobacterium-mediated transformation
JP3253071B2 (ja) 植物細胞の中のｄｎａの部位特異的組み換え
US5569597A (en) Methods of inserting viral DNA into plant material
Chai et al. Stable transformation of protocorm-like bodies in Phalaenopsis orchid mediated by Agrobacterium tumefaciens
US6376234B1 (en) Method of inserting viral DNA into plant material
US20210189410A1 (en) Targeted editing of citrus genes for disease resistance
HU215777B (hu) Kukoricasejtek stabil transzformálása elektroporációval
JPH06501380A (ja) 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法
CA2036103A1 (en) Plasmids for the preparation of transgenic plants having a modified habit and yield
HUT58758A (en) New signalsequencies
EP0554273A1 (en) A process for the gene manipulation of plant cells, recombinant plasmids, recombinant bacteria, plants
TW319679B (hu)
JPH01160489A (ja) 植物ゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能にする組換えｄｎａ分子
JPH0339091A (ja) トランスジェニック植物の作製方法
EP0707070B1 (en) Method for enhancing disease and pest resistance of plants
Godwin Gene identification, isolation and transfer
Vinchurkar et al. Study of factors influencing agrobacterium mediated genetic transformation in Vigna unguiculata
Delbreil et al. Genetic Transformation in Asparagus officinalis L.
EP2423316B1 (en) Method for determining meiotic recombination frequencies in plants
Kim et al. Transformation system of rice suspension-cultured microcolonies by electroporation
KR100963692B1 (ko) ｐＦＡＳ3 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를이용한 형질전환체
JP2005046036A (ja) プロモーターｄｎａ断片及び遺伝子発現の制御方法

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NOVARTIS AG, CH

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, CH