RS57012B1 - Pospešivač bakterijskog virusa šećerne repe (scbv) i njegova upotreba u funkcionalnoj genomici biljke - Google Patents

Description

Opis

ZAHTEV ZA PRIZNAVANJE PRIORITETA

[0001] Ova prijava traži priznavanje prioriteta iz provizorne prijave U.S. br. 61/402,570, podnete 30. avgusta 2010.g., koja je ovde ugrađena u vidu reference u potpunosti.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj se opis odnosi na oblast molekularne biologije biljaka i genetski inženjering, i specifično molekule polinukleotida korisne za modulisanje (npr. pospešivanje) ekspresiju gena i/ili proizvodnju proteina u biljkama.

STANJE TEHNIKE

[0003] Postoji stalna potreba za regulatornim elementima u genetici koji usmeravaju, kontrolišu ili na drugi način regulišu ekspresiju nukleinske kiseline koju je moguće transkribovati (npr., transgen), na primer za upotrebu u genetički projektovanom organizmu kao što je biljka. Regulatorni elementi u genetici obično obuhvataju 5’ netranslatirane sekvence kao što su regioni inicijacije transkripcije koji obuhvataju faktor transkripcije i mesta vezivanje polimeraze RNK-a, elemente pospešivača/prigušivača, TATA kutija i CAAT kutija zajedno sa 3’ sekvencama poliadenilacije, signale zaustavljanja transkripcije, signale početka i zaustavljanja translacije i sekvence splajsovanja donatora/primaoca i slične.

[0004] Za potrebe genetskog modifikovanja, regulatorni elementi u genetici su obično obuhvaćeni vektorom ekspresije ili drugim projektovanim konstruktom, da bi se funkcionalo regulisala ekspresija funkcionaltransgena povezanog na regulatorne elemente. Dobro poznati primeri promotera korišćenih na ovaj način su CaMV35S promoter (Nagy i saradnici u: Biotechnology in plant science: relevance to agriculture in the eighties (Biotehnologija u nauci o biljkama: značaj u poljoprivredi osamdesetih). Eds. Zaitlin i saradnici. Academic Press, Orlando, 1985), maize ubiquitin promoter (promoter ubikvitina kukuruza) (Ubi; Christensen & Quail, Transgenic Research 5:213, 1996) i Emu promoter (i Emu promoter) (Last i saradnici, Theor. Appl. Genet. 81 581, 1991), kroz veliki broj drugih su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Isto tako, pospešivači su izolovani iz različitih izvora za upotrebu u genetskom inženjeringu, tu su uključeni pospešivač mozaičkog virusa karfiola (35S CaMV) pospešivač mozaičkog virusa biljke smokve (FMV), pospešivač hlornih brazda kikirikija (PClSV), ili pospešivač mirabilis mozaičkog virusa (MMV).

[0005] Prisutna je potreba da se identifikuju genetski regulatorni elementi, kao što su domeni pospešivača, koje je moguće obuzdati da bi se kontrolisala ekspresija sekvenci funkcionalo povezanih na njih, na primer molekuli heterologne nukleinske kiseline kao što su vektori i drugi projektovani konstrukti.

SAŽETAK OPISA

[0006] Ovaj opis opisuje nove regulatorne regione transkripcije koji obuhvataju domen pospešivača i, pod kontrolom pospešivanja domen pospešivača, regulatorni domen transkripcije. Domen pospešivača obuhvata više (npr. dva do četiri ili više) kopija prirodnih ali prethodno nepoznatih pospešivača SCBV-a raspoređenih u tandemu. Regulatorni regioni transkripcije (promoteri) iz ovog opisa daju pospešenu transkripciju kada se uporedi sa pospešivačem u odsustvu domena pospešivača. U jednom primeru, opisan je regulatorni region himerne transkripcije koji obuhvata jednu ili više kopija elementa SCBV pospešivača prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1; i na njih su funkcionalo povezane, promoter koji obuhvata mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto inicijacije mRNK (iRNK), pri čemu kada je sekvenca nukleotida koja je predmet interesovanja transkribovana pod regulatornom kontrolom regulatornog regiona himerne transkripcije, je količina proizvoda transkripcije povećana u poređenju sa količinom dobijenog proizvoda transkripcije sa regulatornim regionom himerne transkripcije koji obuhvata promoter i ne obuhvata SCBV sekvencu pospešivača

[0007] Takođe su dati DNK konstrukti koji obuhvataju opisani regulatorni region transkripcije i DNK sekvencu koju treba transkribovati. Na jednom primeru, DNK konstrukt obuhvata opisani region imitacije transkripcije koji je funkcionalno povezan na funkcionalno povezan molekul polinukleotida koji je moguće transkripcijom preneti na 3' molekul polinukleotida završetka transkripcije. Ovi DNK konstrukti obezbeđuju pospešenu transkripciju DNK sekvence koju treba transkribovati. Takođe su opisane transgenske biljke, biljne ćelije ili tkiva (kao što su dikotiledone ili monokotiledone biljke, biljne ćelije ili tkiva) transformisane sa opisanim konstruktima. Takođe je dato seme biljke, plod, list, koren, izdanak, cvet, reznica i drugi reproduktivni materijal koji je koristan za seksualno ili aseksualno razmnožavanje, progene biljke uključujući F1 hibride, muške sterilne biljke i sve druge biljke i biljne proizvode koje je moguće izvesti iz opisane transgenske biljke. Ovde su, takođe, dati postupci za proizvodnju opisanih transgenskih biljaka, biljnih ćelija ili tkiva.

[0008] Gore u tekstu navedene i druge karakteristike ovog opisa će postati očiglednije iz sledećeg detaljnog opisa, koji se nastavlja sa pozivom na priložene slike.

KRATAK OPIS SLIKA [0009]

SL. 1 pokazuje sekvencu SCBV promotera (koja odgovara pozicijama 6758-7596 GenBank pristupnog broja AJ277091.1, "Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng" (Kompletan genom IM virusa bakterijskog oblika šećerna repe, izolat Ireng Maleng) koji je ovde u vidu reference u potpunosti ugrađen kako je prikazan na mreži 15. aprila 2010.), ova sekvenca je takođe prikazana u SEK ID BR:

1Sekvence pospešivača definisane u ovoj studiji se nastavljaju od -222 do -503 i podvučene su na slici (odgovaraju poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1).

SLIKE. 2A i 2B ilustruju rezultate analize SCBV promotera. SL. 2A pokazuje fragmente SCBV promotera koji sadrži sekvence od -839 bp, -576 bp i -333 bp uzvodno od mesta početka transkripcije i 106 bp nizvodno od mesta početka transkripcije spojenog na reporter gen luciferaze (LUC). SL. 2B pokazuje histogram odnosa LUC/GUS aktivnosti od HiII-ovih ćelija kotransformisanih gornjim plazmidima i konstruktom UBI::GUS reportera. Rezultati pokazuju da je fragment promoter koji obuhvata sekvencu od -576 bp uzvodno od mesta početka transkripcije imao 60% aktivnost fragmenta promotera koji obuhvata 839 bp uzvodno od mesta početka. Nasuprot tome, fragment promotera obuhvata sekvence od -333 bp uzvodno od mesta početka samo ukoliko je imao 10% aktivnosti promotera pune dužine (od -839 bp uzvodno od mesta početka transkripcije). Tako, sekvence koje učestvuju u aktivnosti promotera borave uzvodno od -333 bp.

SLIKE.3A i 3B ilustruju da ovde opisani elementi SCBV pospešivača pospešuju transkripciju iz promotrera Adh1 kukuruza. Jedna, dve i četiri kopije sekvenci SCBV promotera od -503 do -222 su klonirane uzvodno od zarubljenog promotera kukuruza Adh1, spojenog na gen luciferaze svica (SL.

3A). Poređenja radi, 4 kopije MMV sekvenci pospešivača i 2 kopije MMV pospešivača i 2 kopije SCBV promotera su klonirane uzvodno od zarubljenog promotera kukuruza Adh1 i spojeni na gen luciferaze svica (SL.3A). Ovi konstrukti su bombardovani u suspenziji ćelijske kulture kukuruza Hi-II zajedno sa UBI::GUS reporter konstruktom. Kako je prikazano na SL.3B, konstrukti koji su sadžali 1, 2 i 4 kopije SCBV pospešivača su imali aktivnost koja je bila 5 puta veća, 6 puta veća i 10 puta veća, respektivno, nego ćelije koje su bombardovane zarubljenim Adh1 konstruktom bez ikakvih pospešivača.4X MMV konstrukt je imao 2,5 puta veću aktivnost kao zarubljeni Adh1 konstrukt 2X MMV 2X SCBV konstrukt je imao 6 puta veću aktivnost kao zarubljeni Adh1 konstrukt.

SL. 4 pokazuje akumulaciju transkripata blizu mesta integracije ("Bočnog gena") mesto integracije 4XSCBV kod transgenskih biljaka (T) u poređeju sa netransgenskim kontrolnim bljikama (W), analiziranim korišćenjem reverzne transkripcije i PCR (RT-PCR). Nivo konstitutivnih (houskeeping) gena

GAPDH je prikazan radi poređenja.4XSCBV pospešivač je prouzrokovao povećanu akumulaciju transkripata gena blizu meta gde se integriše; ovo povećanje kada je reč o akumulaciji transkripta verovatno nastaje od povećane brzine transkripcije.

SPISAK SEKVENCI

[0010] Sekvence nukleinske i/ili aminokiseline navedene u spisku sekvenci ispod su prikazane korišćenjem standardnih slovnih skraćenica za baze nukleotida, i tri poslednja koda za aminokiseline, kako je definisano u 37 C.F.R.1.822. Samo jedan lanac svake sekvence aminokiseline je prikazan, ali podrazumeva se da je komplementarni lanac uključen bilo kakvom referencom na prikazani lanac. Sekvence nukleinske kiseline (u spisku sekvenci ili na drugom mestu ovde) su predstavljene u standardnom 5’ do 3’ smeru, i sekvence proteina su predstavljene u standardnom amino (N) terminalnom do karboksi (C) terminalnom smeru.

[0011] SEK ID BR.: 1 pokazuje sekvencu nukleinske kiseline SCBV promotera (koja odgovara pozicijama 6758-7596 GenBank pristupni broj AJ277091.1, "Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng" (Kompletan genom IM virusa bakterijskog oblika šećerna repe, izolat Ireng Maleng) koja je ovde u vidu reference u potpunosti ugrađena onako kako je prikazana na mreži 15. aprila 2010.).

[0012] Elementi pospešivača opisani ovde su od pozicije 337 do pozicije 618 SEKID BR: 1.

DETALJAN OPIS

I. Skraćenice

3’ UTR 3’-lider sekvenca

5’ UTR 5’-lider sekvenca

Adh1 alkohol dehidrogenaza 1

asRNK antisens RNK

cDNK komplementarna DNK

dsRNK dvolančana RNK

GAPDH gliceraldehid3-fosfat dehidrogenaza

KB kilobajt

kbp kilobazni parovi

LUC luciferaza (svitaca)

miRNK mikroRNK

nt Nukleotid

ORF otvoreni okvir čitanja

PCR polimerazna lančana reakcija

RT- reverzna transkripcija i PCR

SCBV bakterijski oblik virusa šećerne repe

siRNK mala interferirajuća RNK

ssRNK jednolančana RNK

Tm tačka topljenja na toploti vodeće

UTR sekvence thermal melting point

II. Pojmovi

[0014] Osim ako nije drugačije napomenuto, tehnički pojmovi se koriste prema uobičajenoj upotrebi. Definicije uobičajenih pojmova u molekularnoj biologiji je moguće naći kod Benjamin Lewin, Genes V (Geni V), izdanje Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew i saradnici. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology (Enciklopedija molekularne biologije), izdanje Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i u sveobuhvatnom priručniku za molekularnu biologiju i biotehnologiju: Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, izdavač VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0015] Da bi se olakšao pregled različitih izvođenja ovog pronalaska, daju se sledeća objašnjenja specifičnih pojmova:

5’ i/ili 3’: Smatra se da molekuli nukleinske kiseline (kao što je DNK i RNK) imaju "5’ krajeve" i "3’ krajeve" zbog toga što se mononukleotidi dovode u reakciju da bi napravili polinukleotide na način da je 5’ fosfat jednog mononukleotidnog pentoznog prstena spojen na 3’ kiseonik svog suseda u jednom smeru preko fosfodiesterne veze. Samim tim, jedan kraj polinukleotida se pominje kao "5’ kraj" kada njegov 5’ fosfat nije povezan na 3’ kiseonik mononukleotidnog pentoznog prstena. Drugi kraj polinukleotida se pominje kao "3’ kraj" kada njegov 3’ kiseonik nije povezan na 5’ kiseonik mononukleotidnog pentoznog prstena. Bez obzira na to što je 5’ fosfat, jedan mononukleotidni pentozni prsten spojen na 3’ kiseonik svog suseda, može da se kaže da interna sekvenca nukleinske kiseline takođe ima 5’ i 3’ krajeve.

[0016] U linearnom ili cirkularnom molekulu nukleinske kiseline, diskretni interni elementi se pominju kao "uzvodni" ili 5’ "nizvodi" ili 3’ elementi. U vezi sa DNK, ova terminologija odražava da se transkripcija nastavlja u 5’ do 3’ smeru duž DNK lanca. Elementi promotera i pospešivača, koji usmeravaju transkripciju povezanog gena, su generalno locirani 5’ ili uzvodno od kodirajućeg regiona. Međutim, elementi pospešivača mogu da ispolje svoje dejstvo čak i kada su locirani 3’ od elementa promotera i kodirajućeg regiona. Signali završetka transkripcije i poliadenilacije su locirani 3’ ili nizvodno od kodirajućeg regiona.

[0017] Agronomske osobine: Karakteristika biljke, čije karakteristike obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, morfologiju biljke, fiziologiju, rast i razvoj, prinos, nutritivna pospešivanja, bolesti ili otpornost na štetočine, ili ekološku ili hemijsku toleranciju su agronomske osobine. "Pospešena agronomska osobina" se odnosi na merljivo poboljšanje agronomske osobine koje obuhvata, ali se ne ograničava na, povećanje prinosa, uključujući povećani prinos pri uslovima u kojima nema stresa i povećani prinos pri uslovima ekološkog stresa. Uslovi stresa mogu da obuhvate, na primer, suše, hladovinu, gljivične bolesti, virusne bolesti, bakterijske bolesti, najezdu insekata, najezdu nematoda, izloženost niskoj temperaturi, izloženost toploti, osmotski stres, smanjenu dostupnost azotnog nutrijenta (hraniva), smanjenu dostupnost fosfornog nutrijenta i visoku gustinu biljke. "Prinos" može da bude pod uticajem brojnih svojstava uključujući bez ograničenja, visinu biljke, broj mahuna, položaj mahuna na biljci, broj delova stabla između čvorova za rast lista (intermodova), učestalost oštećene mahune, veličina zrna, efikasnost nodulacije i fiksacije azota, efikasnost asimilacije nutrijenta, otpornost na biotski i abiotski stres, asimilaciju ugljenika, arhitekturu biljke, otpornost na seobu, procenat klijanja semena, jačina semena, i osobine podmlađivanja. Prinos može takođe da bude pod uticajem efikasnosti klijanja (uključujući klijanje u uslovima stresa), brzinu rasta (uključujući brzinu rasta u stresnim uslovima), broj klasova, broj semena po klasu, veličina semena, sastav semena (skrob, ulje, protein) i karakteristike punjenja semena. Povećani prinos može kao rezultat postati od poboljšanog korišćenja ključnih biohemijskih jedinjenja, kao što je azot, fosfor i karbohidrat, ili iz poboljšanih odgovora na okolne stresove, kao što je hladnoća, toplota, suša, so, i napad štetočina ili patogena. Rekombinantna DNK korišćena u ovom opisu može biti korišćena da se dobiju biljke koje imaju poboljšan rast i razvoj, i na kraju povećani prinos, kao rezultat modifikovane ekspresije regulatora rasta biljke ili modifikacije ciklusa ćelije ili putanja fotosinteze. Dodatni primeri agronomskih osobina, i menjanje takvih osobina kod biljaka, su dati ovde i/ili će biti poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0018] Modifikacije: Promene u polinukleotidu (na primer, polipeptid koji je kodirala nukleinska kiselina iz ovog pronalaska), kao ovaj pojam se ovde koristi, obuhvata brisanja, umetanja, i mutacije tačke u toj sekvenci polinukleotida. Obuhvaćene ovom definicijom su promene na genomskoj DNK sekvenci koja obuhvata polipeptid. Slično tome, pojam "alteracija" moguće je koristiti da se odnosi na brisanja, umetke, i druge mutacije u sekvenci polipeptida.

[0019] Menjanje nivoa proizvodnje ili ekspresije: Promena, bilo povećanjem ili smanjenjem, nivoa proizvodnje ili ekspresije molekula nukleinske kiseline ili molekula aminokiseline (na primer siRNK, miRNK, iRNK, gena, polipeptid, peptid), kada se uporedi sa kontrolnim nivoom proizvodnje ili ekspresije.

[0020] Amplifikacija: Kada se koristi u vezi sa nukleinskom kiselinom ovo se odnosi na tehnike koje povećavaju broj kopija molekula nukleinske kiseline u uzorku ili predstavniku vrste. Primer pojačavanja je polimerazna lančana reakcija, u kojoj je biološki uzorak prikupljen od subjekta doveden u dodir sa parom oligonukleotidnih početnica (prajmera), pri uslovima koji dozvoljavaju hibridizaciju početnica na šablon nukleinske kiseline u tom uzorku. Početnice su produžene pod pogodnim uslovima, razdvojene od uzorka, i zatim ponovo spojene, produžene, i razdružene da pojačaju broj kopija nukleinske kiseline. Proizvod in vitro pojačavanja može da karakteriše elektroforeza, modeli cepanja restrikcione endonukleaze, hibridizacija ili ligacija oligonukleotida, i/ili sekvenciranje nukleinske kiseline, korišćenjem standardnih tehnika. Drugi primeri in vitro tehnika pojačavanja obuhvataju pojačavanje izmeštanja lanca (videti U.S. patent br. 5,744,311); izotermičku amplifikaciju bez transkripcije (videti U.S. patent br.

6,033,881); amplifikacija reakcije popravke lanca (videti WO 90/01069); amplifikaciju reakcije ligaze (spajanja enzimom) lanca (videti EP-A-320308); amplifikacija reakcije ligaze punjenja razmaka (videti U.S. patent br.5,427,930); detekciju uparene ligaze i PCR (videti U.S. patent br.6,027,889); i NASBA™ RNK amplifikacija bez transkripcije (videti U.S. patent br.6,025,134).

[0021] Antisens, sens, i antigen: DNK ima dva antiparalelna lanca, 5’ → 3’ lanac, koji se pominje kao plus lanac, i 3’ → 5’ lanac, koji se pominje kao minus lanac. Zato što RNK polimeraza dodaje nukleinske kiseline u 5’ → 3’ smeru, minus lanac DNK služi kao uzorak za RNK tokom transkripcije. Dakle, RNK transkript će imati sekvencu komplementarnu na minus lanac, i identičnu plus lancu (izuzev što je U supstituisan za T).

[0022] Antisens molekuli su molekuli koje je specifično moguće hibridizovati ili su specifično komplementarni na bilo RNK ili plus lanac DNK. Sens molekuli su molekuli koje je specifično moguće hibridizovati ili su specifično komplementarni na minus lanac DNK. Antisens molekuli su bilo antisens ili sens molekuli usmereni na DNK cilj. Antisens RNK (asRNK) je molekul RNK komplementaran na sens (kodirajući) molekul nukleinske kiseline.

[0023] Antisens inhibicija: Ovaj se pojam odnosi na klasu regulacije genom na osnovu inhibicije citoplazme, nuklarne inhibicije, ili inhibicije organele ekspresije gena (npr. ekspresija genoma ćelije domaćina ili genoma patogena, kao što je virus) usled prisustva ćelije RNK molekula komplementarnog na barem deo iRNK koji se translatira.

[0024] kDNK (komplementarna DNK): Deo DNK koji nema interne nekodirajuće segmente (introne) i transkripcione regulatorne sekvence. kDNK može takođe da obuhvati netranslatirane regione (UTRe ) koji su odgovorni za translacionu kontrolu u odgovarajućem RNK molekulu. kDNK je obično sintetisan u laboratoriji reverznom transkripcijom iz informacione RNK ekstrahovane iz ćelija ili drugih uzoraka.

[0025] Himerni ili himera: Proizvod spajanja delova dva ili više različita polinukleotidna ili polipeptidna molekula. Na primer, fraze "himerna sekvenca" i "himerni gen" se odnose na sekvence nukleotida izvedene iz barem dva heterologna dela. Himerna sekvenca može da obuhvati DNK ili RNK.

[0026] Regulatorni region himerne transkripcije: Niz kontrole nukleinske kiseline ili regulatornih sekvenci koje usmeravaju transkripciju nukleinske kiseline funkcionalno povezanu na njega, čiji niz se sklapa iz različitih izvora polinukleotida. Na primer, regulatorni regioni himerne transkripcije kako je ovde opisano mogu biti proizvedeni putem manipulacije poznatih promotera ili drugih molekula polinukleotida. Regulatorni regioni himerne transkripcije mogu da kombinuju jedan ili više domena pospešivača sa jednim ili više promotera, na primer, spajanjem heterolognog domena pospešivača od prvog nativnog promotera do drugog promotera sa njegovim sopstvenim delimičnim ili potpunim nizom regulatornih elemenata. Ovaj opis obezbeđuje, između ostalog, regulatorne regione himerne transkripcije koji obuhvataju barem jedan SCBV domen pospešivača spojen (koji je funkcionalno povezan) na promoter aktivan u biljci(kama).

[0027] Konstrukt: Bilo koji rekombinantni molekul polinukleotida kao što je plazmid, kozmid, virus, autonomno umnožavanje molekula polinukleotida, fag, ili linearni ili cirkularni jednolančani ili dvolančani DNK ili RNK molekul polinukleotida, izveden iz bilo kog izvora, koji je sposoban za genomsku integraciju ili autonomnu replikaciju, koja obuhvata molekul polinukleotida gde je jedan ili više molekula polinukleotida koje je moguće transkripcijom preneti, funkcionalno povezan.

[0028] Kontrolna biljka: Biljka koja ne sadrži rekombinantnu DNK koja daje (na primer) pospešenu ili izmenjenu agronomsku osobinu transgenske biljke, se koristi kao osnova za poređenje, na primer da bi se identifikovala pospešena ili izmenjena agronomska osobenost kod te transgenske biljke. Pogodne kontrolne biljke mogu da budu netransgenske biljke roditeljske linije korišćene da se generiše transgenska biljka, ili biljka koja barem nije transgenska za određenu osbinu koja se ispituje (to jest, kontrolnu biljku je moguće projektovati da obuhvati druge heterologne sekvence ili rekombinantne DNK molekule). Dakle, kontrolna biljka može u nekim slučajevima da bude transgenska biljna linija koja obuhvata prazan vektor ili marker gen, ali ne obuhvata rekombinantnu DNK, ili ne obuhvata sve rekombinantne DNK, u testiranoj biljci.

[0029] Kosupresija: Ekspresija stranog (heterolognog) gena koja ima znatnu homologiju na endogeni gen, koja kao rezultat daje potiskivanje ispoljavanja i stranog i endogenog gena.

[0030] DNK (dezoksiribonukleinska kiselina): DNK je polimer dugog lanca koji obuhvata genetski materijal većine organizama (neki virusi imaju gene koji obuhvataju ribonukleinsku kiselinu (RNK)). Jedinice koje se ponavljaju u DNK polimerima su četiri različita nukleotida, svaki od njih obuhvata jedan od četiri baze, adenin, guanin, citozin i timin vezan na dezoksiribozni šećer na koji se spaja fosfatna grupa. Tripleti koda nukleotida (koji se nazivaju kodonima) za svaku amino kiselinu u polipeptidu, ili za signal zaustavljanja. Pojam kodon se takođe koristi za odgovarajuće (i komplementarne) sekvence tri nukleotida u iRNK u kojima je transkribovana DNK sekvenca.

[0031] Osim ako nije drugačije navedeno, bilo kakvo upućivanje na DNK molekul obuhvata reverzni komplement tog DNK molekula. Izuzev tamo gde je jednolančanost neophodan uslov koji se ovde u tekstu zahteva, DNK molekuli, iako su napisani da prikažu samo jedan lanac, obuhvataju oba lanca dvolančanog DNK molekula.

[0032] Kodirati: Smatra se da polinukleotid kodira polipeptid ako, u svom prirodnom stanju ili kada je manipulisan metodama poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, molekul polinukleotida može biti transkribovan i/ili translatiran da proizvede iRNK za i/ili polipeptid ili njegov fragment. Antisens lanac je komplement takve nukleinske kiseline, i kodirajuću sekvencu je moguće izvesti iz njega.

[0033] Domen pospešivača: Transkripcioni regulatorni element koji deluje sa cis dejstvom (a.k.a cis element) koji daje aspekt ukupne kontrole ekspresije gena. Domen pospešivača može da funkcioniše tako da veže faktore transkripcije, koji su faktori transdelujućeg proteina koji regulišu transkripciju. Neki domeni pospešivača vezuju više od jednog faktora transkripcije, i faktori transkripcije mogu da međusobno deluju sa različitim afinitetima sa više od jednim domenom pospešivača. Domeni pospešivača mogu da budu identifikovani izvesnim tehnikama, uključujući analizu brisanja (brisanje jednog ili više nukleotida iz 5' kraja ili interno na promoter); analiza DNK vezujućeg proteina koristi DNase I štampanje otiska, interferencija metilacije, ogledi promene mobilnosti elektroforeze, in vivo štampanje genomskog otiska putem ligacijom posredovane PCR, i drugi uobičajeni ogledi; ili putem poređenja DNK sekvence sa poznatim motivima cis elementa korišćenjem uobičajenih metoda poređenja DNK sekvence. Fina struktura domena pospešivača može dalje da bude proučavana mutagenezom (ili supstitucijom) jednog ili više nukleotida ili drugim uobičajenim metodama. Domene pospešivača moguće je dobiti hemijskom sintezom ili izolacijom iz promotera koji obuhvataju takve elemente, i oni mogu biti sintetisani sa dodatnim bočnim nukleotiima koji sadrže korisna mesta restrikcionog enzima da bi se lakše manipuolisalo podsekvencom.

[0034] Ekspresija (gena): Transkripcija DNK molekula u transkribovani RNK molekul. Uopštenije, procesi kojima se kodirana informacija nekog gena pretvara u strukture prisutne i funcionalne u toj ćeliji. Izraženi geni obuhvataju one koji se transkribuju u iRNK i zatim se translatiraju u protein i one koji su transkribovani u RNK ali nisu translatirani u protein (na primer, siRNK, transfer RNK i ribozomna RNK). Dakle, ekspresija ciljne sekvence, kao što je gen ili region promoter gena, može kao rezultat imati ekspresiju iRNK, protein, ili oba. Ova ekspresija ciljne sekvence može biti inhibirano ili pospešeno (smanjeno ili povećano). Ekspresija gena može biti opisana tako da se odnosi na vremenske, prostorne, razvojne, ili morfološke kvalitete kao i kvantitativne ili kvalitativne indikacije.

[0035] Regulatorna aktivnost gena: Sposobnost polinukleotida da utiče na transkripciju ili translaciju funkcionalo povezanog molekula polinukleotida koji je moguće transkribovati ili translatirati. Izolovani molekul polinukleotida koji ima regulatornu aktivnost gena može da obezbedi vremensku ili prostornu ekspresiju ili da moduliše nivoe i brzine ekspresije funkcionalo povezanog molekula polinukleotida koji je moguće transkribovati. Izolovani molekul polinukleotida koji ima regulatornu aktivnost gena može da obuhvati promoter, intron, lider, ili 3' region terminacije (završetka) transkripcije.

[0036] Utišavanje gena: Utišavanje gena se odnosi na nedostatak (ili smanjenje) ispoljavanja gena kao rezultat, iako nije ograničen na, utiče na genomski (DNK) nivo kao što je restrukturiranje hromatina, ili posttranskripcioni nivo putem dejstava na stabilnost transkripcije ili translacije. Sadašnji dokaz ukazuje da RNK interferencija (RNKi) jeste veći proces koji je uključen u transkripciono i posttranskripciono utišavanje gena.

[0037] Zato što RNKi ispoljava svoja dejstva na transkripcionom i/ili post-transkripcionom nivou, veruje se da je RNKi moguće koristiti da se specifično suzbiju alternativni transkripti iz istog gena.

[0038] Heterolozi: Tip sekvence koji se normalno ne nalazi (npr. u sekvenci divljeg tipa) susednoj drugoj sekvenci. U jednom izvođenju, sekvenca je iz različitog genetskog izvora, kao što je virus ili organizam ili vrste, u odnosu na drugu sekvencu.

[0039] Hibridizacija: Oligonukleotidi i njihovi analozi hibridizuju vezivanjem vodonika, što obuhvata Watson-Crick (Votson-Krik), Hoogsteen (Hogsten) vezivanje vodonika, između komplementarnih baza. Generalno, nukleinska kiselina se sastoji od tri azotne baze koje su bilo pirimidini (citozin (C)), uracil (U), i timin (T)) ili purini (adenin (A) i guanin (G)). Te azotne baze čine vodonične veze između pirimidina i purina, i vezivanje pirimidina na purin se pominje kao bazno uparivanje. Specifičnije, A će hidrogenom vezati na T ili U, i G će vezati na C. U RNK molekulima, G će takođe vezati na U. Komplementarno se odnosi na bazno uparivanje koje nastaje između dve distinktivne sekvence nukleinske kiseline ili dva distinktivna regiona iste sekvence nukleinske kiseline.

[0040] Uslovi hibridizacije koji kao rezultat daju određene stepene strogosti će se razlikovati zavisno od prirode metoda hibridizacije koja je predmet izbora i sastava i dužine sekvenci hibridizujuće nukleinske kiseline. Generalno, temperatura hibridizacije i jonska snaga (posebno Na<+>koncentracija) puferskog sredstva hibridizacije će odrediti strogost hibridizacije. Proračuni u vezi uslova hibridizacije koji su neophodni za postizanje određenih stepena strogosti su razmatrali u laboratorijskom priručniku za molekularno kloniranje Sambrook (Sambruk) i saradnici. ((ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), poglavlja 9 i 11, su ovde ugrađena putem reference.

[0041] Sledi niz uslova hibridizacije kao primer i nije predviđen da bude ograničenje.

Veoma visoka strogost (detektuje sekvence koje dele 90% identičnost sekvence) Hibridizacija: 5x SSC na 65°C tokom tokom 16 sati

Oprati dvaput: 2x SSC na sobnoj temperaturi (RT) tokom 15 minuta svaki Oprati dvaput: 0,5x SSC na 65°C tokom 20 minuta svaki

Visoka strogost (detektuje sekvence koje dele 80% identičnost sekvence ili veću) Hibridizacija: 5x-6x SSC na 65°C-70°C tokom 16-20 sati Oprati dvaput: 2x SSC na sob. temp (RT) tokom 5-20 minuta svaki Oprati dvaput: 1x SSC na 55°C-70°C tokom 30 minuta svaki

Niska strogost (detektuje sekvence koje dele identičnost sekvence veću od 50%) Hibridizacija: 6x SSC na RT do 55°C tokom 16-20 sati Oprati barem dvaput: 2x - 3x SSC na RT do 55°C tokom 20 -30 minuta svaki.

[0042] Za cis: Označava da su te dve sekvence pozicionirane na istom delu RNK ili DNK.

[0043] Za trans: Označava da su te dve sekvence pozicionirane na dva različita dela RNK ili DNK.

[0044] Industrijski usev: Usevi koji se gaje primarno za potrošnju od strane ljudi ili životinja ili za upotrebu u industrijskim procesima (na primer, kao izvor masnih kiselina za proizvodnju ili šećere za proizvodnju alkohola). Jasno je da u velikom broju primera bilo biljka ili proizvod koji ta biljka proizvede (na primer, zaslađivači, ulje, brašno, ili obrok) moguće njihovo konzumiranje; dakle, podskup industrijskih useva su usevi za hranu. Primeri useva za hranu obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, kukuruz, sojino zrno, pirinač, pšenicu, uljanu repicu, pamuk, ovas, ječam, i krompiraste biljke. Drugi primeri industrijskih useva (uključujući useve za hranu) su navedeni ovde u spisku.

[0045] Intervenisanje ili suzbijanje (ekspresija ciljne sekvence): Ova fraza se odnosi na sposobnost male RNK, kao što je siRNK ili miRNK, ili drugi molekul, da merljivo smanji ekspresiju i/ili stabilnost molekula koji nose ciljnu sekvencu. Ciljna sekvenca može da obuhvati DNK sekvencu, kao što je gen ili region promotera nekog gena, ili RNK sekvencu, kao što je miRNK. "Intervenisanje ili suzbijanje" ekspresije razmatra smanjenje krajnjeg proizvoda gena ili sekvence, npr. ekspresija ili funkcija kodiranog proteina ili nekog proteina, nukleinske kiseline, drugog biomolekula, ili biološke funkcije koja je pod uticajem ciljne sekvence, i tako obuhvata smanjenje količine ili dugotrajnost miRNK transkripta ili druge ciljne sekvence. Kod nekih izvođenja, mala RNK ili drugi molekul vodi modifikacije hromatina koje suzbijaju ekspresiju ciljne sekvence. Jasno je da je ta fraza relativna, i da ne zahteva apsolutno suzbijanje (supresiju) sekvence. Dakle, kod izvesnih izvođenja, intervenisanje ili suzbijanje ekspresije ciljne sekvence zahteva da, se sledeća primena male RNK ili drugog molekula (kao što je vektor ili drugi konstrukt koji kodira jednu ili više malih RNK), ta sekvenca je izražena barem 5% manje nego pre primene, barem 10% manje, barem 15% manje, barem 20% manje, barem 25% manje, ili čak i više smanjena. Dakle, kod nekih specifičnih izvođenja, primena male RNK ili drugog molekula smanjuje ekspresiju ciljne sekvence za oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, ili više. U specifičnim primerima, gde je mala RNK ili drugi molekul posebno delotvoran, ekspresija je smanjena za 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili čak više.

[0046] Izolovano: "Izolovana" biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina, peptid ili protein) je u znatnoj meni odvojena, proizvedena nezavisno od, ili prečišćena od drugih bioloških komponenata u ćeliji organizma gde se ta komponenta prirodno javlja, npr. druge hromozomne i ekstrahromozomne DNK i RNK, i proteine. Nukleinske kiseline, peptidi i proteini koji su "izolovani" samim tim obuhvataju nukleinske kiseline i proteine prečišćene standardnim metodama prečišćavanja. Ovaj pojam takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine dobijene rekombinantnom ekspresijom u ćeliji domaćinu kao i hemijski sintetisanim nukleinskim kiselinama.

[0047] Metabolom: Komplement molekula relativno niske molekularne težine (metaboliti) koji su prisutni u jednom organizmu, uzorku, tkivu, ćeliji, ili bilo koja druga podela se deli. Primera radi, metabolomi mogu obuhvatiti metaboličke intermedijare, hormone i druge signalne molekule, i sekundarne metabolite. Reprezentativni metabolomi obuhvataju komplement metabolita pronađen u biološkom uzorku, kao što je biljka, deo biljke, ili uzorak biljke, , ili u suspenziji ili ekstraktu navedenog. Primeri takvih molekula obuhvataju, ali se ne ograničavaju na: kiseline koje su povezane sa jedinjenjima; mono-, di-, i trikarboksilne kiseline (zasićene, nezasićene, alifatične i ciklične, aril, alkaril); aldo kiseline, keto kiseline; oblike laktona; giberelini; abscizinska kiselina; alkoholi, polioli, derivati, i srodna jedinjenja; etil alkohol, benzil alkohol, metanol; propilen glikol, glicerol, fitol; inozitol, furfuril alkohol, mentol; aldehidi,ketoni, hinoni, derivati, i srodna jedinjenja; acetaldehid, butiraldehid, benzaldehid, akrolein, furfural, glioksal; aceton, butanon; antrahinon; karbohidrati; mono-, di-, tri-saharidi; alkaloidi, amini i druge baze; piridini (uključujući nikotinska kiselina, nikotinamid); pirimidini (uključujući citidin, timin); purin (uključujući guanin, adenin, ksantini/hipoksantini, kinetin); piroli; kvinolini (uključujući izokvinolini); morfinani, tro pani, drvao kinina; nukleotidi, oligonukleotidi, derivati i srodna jedinjenja; guanozin, citozin, adenozin, timidin, inozin; aminokiseline, oligopeptidi, derivati, i srodna jedinjenja; estri; fenoli i srodna jedinjenja; heterociklična jedinjenja i derivati; piroli, tetrapiroli (korinoidi i porfini/porfirini, sa/bez jona metala); flavonoidi; indoli; lipidi (uključujući masne kiseline i trigliceride), derivati, i srodna jedinjenja; karotenoidi, fitoeni; i steroli, izoprenoidi uključujući terpene.

[0048] MikroRNK (miRNK): Mali, proizvodi nekodirajućeg RNK gena od približno 21 nukleotida dužine i postoje u različitim organizmima, uključujući životinje i biljke. miRNK strukturno su slični siRNK izuzev što nastaju iz strukturisanih transkripata prekursora koji formiraju presavijanja unazad izvedenih iz miRNK gena. Primarni transkripti miRNK gena iz struktura ukosnice koje obrađuje višestruki domen RNaseIII sličnoj nukleazi DICER i DROSHA (kod životinja) ili DICER-LIKE1 (DCL1; kod biljaka) da bi se dobio prinos miRNK dupleksa. Zrela miRNK je ugrađena u RISC komplekse posle dvostrukog odmotavanja. miRNK biljke međusobno reaguju sa njihovim RNK ciljevima sa savršenom ili skoro savršenom komplementarnošću.

[0049] Nukleotid: Pojam nukleotid obuhvata, ali se ne ograničava na, monomer koji obuhvata bazu spojenu na šećer, kao što je pirimidin, purin ili njihovi sintetički analozi, ili bazu povezanu na amino kiselinu, kao kod peptidne nukleinske kiseline (PNA). Nukleotid je jedan monomer u oligonukleotidu/polinukleotidu. Sekvenca nukleotida se odnosi na sekvencu baza u oligonukleotidu/polinukleotidu.

[0050] Glavni nukleotidi DNK su deoksiadenozin 5’-trifosfat (dATP ili A), deoksiguanozin 5’-trifosfat (dGTP ilir G), deoksicitidin 5’-trifosfat (dCTP ili C) i deoksitimidin 5’-trifosfat (dTTP ili T). Glavni nukleotidi RNK su adenozin 5’-trifosfat (ATP ili A), guanozin 5’-trifosfat (GTP ili G), citidin 5’- trifosfat (CTP ili C) i uridin 5’-trifosfat (UTP ili U). Inozin je takođe baza koju je moguće integrisati u DNK ili RNK u nukleotid (dITP ili ITP, prema opisnom redosledu).

[0051] Vrste (biljaka) za proizvodnju ulja: Biljne vrste koje proizvode i skladište triacilglicerol u specifičnim organima, prvenstveno u semenju. Takve vrste obuhvataju ali se ne ograničavaju na zrno soje (Glicin nizaks), seme repe i kanola (kao što je Brassica napus, Brassica rapa i Brassica campestris), suncokret (Helianthus annus), pamuk (Gossypium hirsutum), kukuruz (Zea mays), kakao (Theobroina cacao), šafran (Carthamus tinctorius), ulje palme (Elaeis guineensis), kokosova palma (Cocos nucifera), lan (Linum usitatissimuin), ricinus (Ricinus commiunis) i kikiriki (Arachis hypogaea).

[0052] Oligonukleotid: Oligonukleotid je više od nukleotida spojenih fosfodiestarnim vezama, između oko 6 i oko 300 nukleotida dužine. Oligonukleotidni analog se odnosi na jedinjenja koja funkcionišu slično oligonukleotidima ali imaju neprirodno nastale delove. Na primer, analozi oligonukleotida mogu da sadrže delove koji ne nastaju prirodno, kao što su promenjeni delovi šećera ili međušećerne veze, kao što je fosforotioat oligodeoksinukleotid. Funkcionalni analozi polinukleotida koji se prirodno javljaju mogu da se vežu na RNK ili DNK

[0053] Funkcionalno povezani: Ovaj se pojam odnosi na suprotstavljanje komponenata, posebno sekvenci nukleotida, tako da je moguće izvesti normalnu funkciju komponenata. Tako je prva sekvenca nukleinske kiseline funkcionalno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada se prva sekvenca nukleinske kiseline postavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter je funkcionalno povezan na kodirajuću sekvencu ako taj promoter utiče na transkripciju ili ekspresiju sekvence kodiranja. Generalno, funkcionalno povezane DNK sekvence su susedne jedna drugoj i, tamo gde je neophodno da se spoje dva regiona za kodiranje proteina, u istom okviru čitanja. Kodirajuća sekvenca koja je ''funkionalno povezana" na regulatorne sekvence se odnosi na konfiguraciju sekvenci nukleotida pri čemu sekvenca kodiranja može biti izražena pod regulatornom kontrolom (npr. transkripciona i/ili translaciona kontrola) regulatornih sekvenci.

[0054] ORF (otvoreni okvir čitanja): Niz tripleta nukleotida (kodoni) kodiranje za aminokiseline bez bilo kakvih kodona završetka. Ove sekvence je obično moguće prevesti u peptid.

[0055] Procenat identičnosti sekvence: Procenat identičnih nukleotida u linearnoj sekvenci polinukleotida referentnog ("traženog") molekula polinukleotida (ili njegovog lanca komplementarnosti) u poređenju sa testom ("predmetni") molekula polinukleotida (ili njegovim lancem komplementarnosti) gde su dve sekvence optimalno poravnate (sa odgovarajućim umecima, brisanjima, ili prazninama nukleotida čiji je zbir manji od 20 procenata referentne sekvence u prozoru poređenja). Optimalno poravnanje sekvenci za poravnanje prozora poređenja su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti i moguće ga je sprovesti korišćenjem alata kao što je lokalni algoritam homologije koji su dali Smith (Smit) i Waterman (Vaterman), algoritam homolognog poravnanja Needleman (Nidlman) i Wunsch (Vunš), metode pretrage sličnosti koju su dali Pearson (Pearson) i Lipman (Lipman). Takva poređenja se preporučljivo izvode korišćenjem kompjuterizovanih implementacija ovih algoritama, kao što je GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA dostupnih kao deo GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, Mass.). "Frakcija identičnosti" za poravnate segmente sekvence koja se testira i referentene sekvence je broj identičnih komponenata koje dele te dve poravnate sekvence podeljene ukupnim brojem komponenata u tom segmentu referentne sekvence (to znači, cela referentna sekvenca ili manji definisani deo referentne sekvence). Procenat identičnosti sekvence je predstavljen kao frakcija identičnosti pomnožena sa 100. Poređenje jedne ili više sekvenci polinukleotida može da bude na sekvenci polinukleotida pune dužine ili jednom delu te sekvence, ili prema dužoj sekvenci polinukleotida. Znatna procentualna identičnost sekvence je barem oko 80% identičnosti sekvence, barem oko 90% identičnosti sekvence, ili čak veća identičnost sekvence, na primer oko 98% ili oko 99% identičnosti sekvence.

[0056] Biljka: Bilo koja biljka ili njen izdanak. Pojam takođe obuhvata delove biljke, uključujući seme, krhotine, opiljke, lukovice, plod, cvetove, itd. Kod različitih izvođenja, pojam biljka se odnosi na kultivisane biljne vrste, kao što je kukuruz, pamuk, kanola, suncokret, zrna soje, sirak, alfalfa, pšenica, pirinač, biljke koje proizvode voćke (plodove) i biljke, i treset (travnjak) i ukrasne biljne vrste. Pojam biljna ćelija, kako se ovde koristi, odnosi se na strukturnu i fiziološku jedinicu biljaka, koja obuhvata protoplast i okolni zid ćelije. Pojam organ biljke, kako se ovde koristi, odnosi se na distinktivan i vidljivo izdiferenciran deo biljke, kao što je koren, stablo, list ili embrion.

[0057] Uopštenije, pojam biljno tkivo se odnosi na bilo koje tkivo biljke u biljci ili u kulturi. Ovaj pojam obuhvata celu biljku, biljnu ćeliju, organ biljke, protoplast, kulturu ćelije, ili bilo koju grupu ćelija biljke organizovanu u strukturnu i funkcionalnu jedinicu.

[0058] Polinukleotidni molekul: Jednolančana il dvolančana DNK ili RNK genomskog ili sintetičkog porekla; to jest, polimer dezoksiribonukleotida ili ribonukleotidne baze, prema opisanom redosledu čitati od 5’ (uzvodnog) kraja do 3’ (nizvodnog) kraja.

[0059] Polipeptidni molekul: Polimer u kom su monomeri ostaci aminokiseline koji su spojeni amidnim vezama. Kada su aminokiseline alfa aminokiseline, moguće je koristiti bilo L optički izomer ili D optički izomer, preporučuju se L izomeri. Pojam polipeptid ili protein kako se ovde koristi obuhvata bilo koju sekvencu aminokiseline i obuhvata modifikovane sekvence kao što su glikoproteini. Pojam polipeptid je specifično predviđen da obuhvati proteine koji prirodno nastaju, kao i one koji se proizvode rekombinantno ili sintetički.

[0060] Posttranskripciono utišavanje gena (PTGS): Oblik utišavanja gena u kom se javlja inhibitorni mehanizam posle transkripcije. Ovo može kao rezultat imati da je u postojanom stanju bilo smanjeni nivo specifične RNK ciljne ili inhibicije translacije (Tuschl, ChemBiochem, 2: 239-245, 2001). U literaturi, pojmovi RNK interferencija (RNKi) i postranskripciona zajednička supresija se često koriste da označe posttranskripciono utišavanje gena.

[0061] Promoter: Niz kontrolni sekvenci nukleinske kiseline koje usmeravaju transkripciju nukleinske kiseline, priznavanjem i vezivanjem npr. RNK polimeraze II i drugih proteina (trans-regulatorni (iz drugog molekula) faktori transkripcije) da se pokrene transkripcija. Promoter obuhvata neophodne sekvence nukleinske kiseline blizu početnog mesta transkripcije, kao što je u slučaju propotera polimeraze tipa II, TATA element. Minimalno, promoter obično obuhvata barem RNK mesto vezivanja polimeraze zajedno i može takođe da obuhvati jedan ili više mesta vezivanja faktora transkripcije koji modulišu transkripciju kao odgovor na prisustvo faktora transkripcije. Reprezentativni primeri promotera (i elemenata koji mogu biti sklopljeni da proizvedu promoter) su opisani ovde u tekstu. Promoteri mogu biti definisani prema svom vremenskom obrascu, prostornom obrascu, ili obrascu koji se odnosi na razvojnu ekspresiju.

[0062] Promoter biljke je prirodni i neprirodni promoter koji je funkcionalan u biljnim ćelijama.

[0063] Protein: Biološki molekul, na primer polipeptid, izražen genom i napravljen od amino kiselina.

[0064] Protoplast: Izolovana ćelija bez zida ćelije, koja ima potencijal da se transformiše i/ili oporavi u kulturu ćelije ili celu biljku.

[0065] Prečišćeno: Pojam prečišćen ne zahteva apsolutnu čistoću; pre je predviđen kao relativni pojam. Dakle, na primer, preparat proteina prečišćenom fuzijom je onaj kod kog je protein fuzije obogaćeniji od proteina u njegovom okruženju u kom nastaje, na primer unutar ćelije ili u komori biohemijske reakcije. Preporučljivo, preparat proteina fuzije se prečišćava tako da protein fuzije predstavlja barem 50% ukupnog sadržaja proteina koji se proizvodi.

[0066] Rekombinantno: Rekombinantna nukleinska kiselina je ona koja ima sekvencu koja nepostoji prirodno ili ima sekvencu koja je napravljena veštačkom kombinacijom dva na drugi način odvojena segmenta sekvence. Ova veštačka kombinacija se često izvršava hemijskom sintezom ili, još češće, veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata nukleinske kiseline, npr. tehnikama genetičkog inženjeringa.

[0067] Slično tome rekombinantni protein je onaj za koji se kodiranje vrši pomoću molekula rekombinantne nukleinske kiseline.

[0068] Promoter koji je moguće regulisati: Promoter čija se akivnost reguliše (direktno ili indirektno) putem agensa, kao što je faktor transkripcije, hemijsko jedinjenje, uslovi životne sredine, ili molekul nukleinske kiseline.

[0069] Regulisanje ekspresije gena: Procesi kontrolisanja ekspresije gena povećanjem ili smanjenjem ekspresije, proizvodnje, ili aktivnosti agensa koji utiče na ekspresiju gena. Taj agens može da bude protein, kao što je faktor transkripcije, ili molekul nukleinske kiseline, kao što je miRNK ili siRNK molekul, koji kada je u kontaktu sa genom ili njegovim uzvodnim regulatornim sekvencama, ili sa mRNK kodiranom pomoću tog gena, bilo da povećava ili smanjuje ekspresija gena.

[0070] Regulatorne sekvence ili elementi: Ovi pojmovi se generalno odnose na klasu molekula polinukleotida (kao što su DNK molekuli, koji imaju DNK sekvence) koje utiču ili kontrolišu transkripciju ili translaciju funkcionalo povezanog molekula polinukleotida koji je moguće transkribovati, i ekspresiju gena. Uključeni u taj pojam su promoteri, pospešivači, lideri, introni, regioni LCR funkcije (regioni kontrole lokusa), granični elementi/izolacije, utišivači, regioni povezivanja matrice (takođe se pominju i kao regioni montaže - S/MAR), represor, transkripcioni terminatori (a.k.a. regioni završetka transkripcije), poreklo replikacije, centromeri, i žarišne tačke mejotske rekombinacije. Promoteri su sekvence DNK blizu 5' kraja gena koji deluje kao mesto vezivanja za polimerazu RNK-a, i od kojih se transkripcija i započinje. Pospešivači su kontrolni elementi koji ublažavaju nivo transkripcije iz promotera, obično nezavisno od usmeravanja pospešivača ili rastojanja od promotera. Regioni za kontrolu lokusa (LCR) daju za tkivo specifično i privremeno regulisana ekspresija gena na koje su povezani. LCR funkcionišu nezavisno od njihovog položaja u vezi sa genom, ali su zavisne od broja kopija. Veruje se da oni funkcionišu da otvore strukturu nukleozoma, tako da drugi faktori mogu da se vežu na DNK. LCR mogu takođe da utiču na vremensko usklađivanje replikacije i upotrebu prema poreklu. Izolatori (takođe poznati kao granični elementi) su DNK sekvence koje sprečavaju aktivaciju (ili inaktivaciju) transkripcije nekog gena, blokiranjem dejstava okolnog hromatina. Utišivači i potiskivači su elementi kontrole koji potiskuju ekspresiju gena; oni deluju na gen nezavisno od njihovog usmerenja ili rastojanja od tog gena. Regioni pripajanja matrice (MAR), su takođe poznati kao regioni pripajanja fiksnog dela, koji su sekvence unutar DNK koje se vezuju na nuklearni fiksni ili noseći deo. Oni mogu da utiču na transkripciju, po mogućstvu odvajanjem hromozome u regulatorne domene. Veruje se da MAR posreduje u višim redovima, unutar zatvorenih struktura u hromozomima. Završeci transkripcije su regioni u blizini tog gena koje polimeraza RNK otpušta iz uzorka. Poreklo replikacije su regioni genoma koji, tokom DNK sinteze ili faza replikacije podele ćelije, počinju proces replikacije DNK. Mejotska žarišna mesta rekombinacije su regioni genoma koji se rekombinuju češće nego što je prosek tokom mejoze. Specifični nukleotidi unutar regulatornog regiona mogu da služe većem broju funkcija. Na primer, specifični nukleotid može da bude deo promotera i da učestvuje u vezivanju proteina aktivatora transkripcije.

[0071] Izolovani regulaotrni elementi koji funkcionišu u ćelijama (na primer, u biljkama ili biljnim ćelijama) su korisni za modifikovanje biljnih fenotipova, na primer putem genetskog inženjeringa.

[0072] RNK: Najčešće linearni polimer monomera ribonukleinske kiseline, povezan na fosfodiestarne veze. Prirodno postojeći RNK molekuli padaju u tri opšte klase, informacione (iRNK, koja kodira proteine), ribozomne (rRNK, komponente ribozoma), i transferne (tRNK, molekule odgovorne za prenos monomera aminokiseline do ribozoma tokom sinteze proteina). Informaciona RNK obuhvata heteronuklearnu (hnRNK) i sa membranom povezanu polizomnu RNK (spojenu na grubi endoplazmni retikulum). Ukupna RNK se odnosi na heterogenu mešavinu svih tipova RNK molekula.

[0073] RNK interferencija (RNKi): Mehanizmi utišavanja gena koji obuhvataju male RNK (uključujući miRNK i siRNK) se često pominju pod širim pojmom RNKi. Prirodne funkcije RNKi obuhvataju zaštitu genoma od invazije mobilnih genetskih elemenata kao što su transpozoni i virusi, i regulaciju ekspresije gena.

[0074] RNK interferencija daje kao rezultat inaktivaciju ili potiskivanje ekspresije gena unutar nekog organizma. Okidač za RNKi može da bude jedna od dve opšte rute. Prvo, može da bude aktivirana direktnom ćelijskom isporukom kratko intervenišućih RNK (siRNK, obično ∼21 nukleotida u dužini i isporučeni u obliku dsRNK dupleksa sa dva neuparena nukleotida na svakom 3’ kraju), koji imaju komplementarnost sekvence na RNK koja je cilj za potiskivanje. Drugo, RNKi moguće je aktivirati jednom od nekoliko metoda u kojima se formiraju siRNK in vivo iz različitih tipova projektovanih, izraženih gena. Ovi geni obično izražavaju molekule RNK koji formiraju intramolekularne ili intermolekularne duplekse (dsRNK) koje procesiraju prirodni enzimi (DICER ili DCL) za formiranje siRNK. Kod nekih slučajeva, ovi geni izražavaju RNK transkripte formiranja "ukosnice" sa savršenim ili skoro savršenim baznim uparivanjem; neki od nesavršenih transkripata formiranja ukosnice daju kao prinos specijalan tip male RNK, pod nazivom mikro RNK (miRNK). U bilo kojoj opštoj metodi, siRNK (ili miRNK) su ti koji funkcionišu kao "vodeće sekvence" da se usmeri RNK degradirajući enzim (pod pojmom RISC) da se odvoji ili utiša ciljna RNK. Kod nekih slučajeva, korisno je integrisati RNK indukujući gen u genom ili transgeni organizam. Primer bi bila biljka koja je modifikovana da potisne specifični gen putem RNKi indukujućeg transgena. Kod većine metoda koje su trenutno u primeni, RNKi se aktiviraju u transgenim biljkama putem transgena koji izražavaju dsRNK (bilo intramolekularnu ili ukosnicu, ili intermolekularnu gde se dva transkripta temperiraju da formiraju dsRNK).

[0075] Utišavanje RNA: Opšti pojam koji se koristi da označi na RNK zasnovano utišavanje gena ili RNKi.

[0076] Identičnost sekvence: Sličnost između dve sekvence nukleinske kiseline, ili dve sekvence aminokiseline je izražena u smislu sličnosti između sekvenci, pominje se kao identičnost sekvence. Identičnost sekvence se često meri u smislu procentualne identičnosti (ili sličnosti ili homologije); što je viši procenat; to su sličnije te dve sekvence. Homolozi sekvenci navedenih ili opisanih ovde, kao što su homolozi elementa SCBV pospešivača, će posedovati relativno visok stepen identičnosti sekvence kada se poravnaju korišćenjem standardnih metoda.

[0077] Metode poravnavanja sekvenci za poređenje su dobro poznate u ovoj oblasti. Različiti programi i algoritmi poravnanja su opisani u: Smith and Waterman (Adv. Appl. Math.2: 482, 1981); Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970); Pearson and Lipman (PNAS. USA 85: 2444, 1988); Higgins and Sharp (Higins i Šarp) (Gene, 73: 237-244, 1988); Higgins and Sharp (CABIOS 5: 151-153, 1989); Corpet (Korpet) i saradnici. (Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988); Huang i saradnici. (Comp. Appls Biosci. 8: 155-65, 1992); i Pearson (Pirson) i saradnici (Methods in Molecular Biology 24: 307-31, 1994). Altschul (Altšul) i saradnici (Nature Genet., 6: 119-29, 1994) predstavljaju detaljno razmatranje metoda poravnavanja sekvence i proračune homologije.

[0078] Alate poravnavanja ALIGN (Myers (Majers) i Miller, CABIOS 4: 11-17, 1989) ili LFASTA (Pearson i Lipman, 1988) moguće je koristiti da se izvedu poređenja sekvence (Internet Program © 1996, W. R. Pearson i the University of Virginia, "fasta20u63" verzija 2.0u63, datum objave decembar 1996.). ALIGN poredi celokupne sekvence jednu naspram druge, dok LFASTA poredi regione lokalne sličnosti. Ovi alati poravnavanja i za njih odgovarajuća i relevantna uputstva su dostupni na Internet stranici biology.nsca.uiuc.edu.

[0079] Ortolozi ili paralozi (uopštenije, homolozi) opisanih sekvenci obično se karakterišu posedovanjem identičnosti sekvence veće od 75% u poravnanju pune dužine sa sekvencom na koju se porede korišćenjem ALIGN postavljenog na zadate parametre. Sekvence sa čak većom sličnošću sa referentnim sekvencama će pokazati povećanje procenutalne identičnosti kada se procenjuju putem ove metode, kao što je identičnost sekvence barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 92%, barem 95%, ili barem 98%. Pored toga, identičnost sekvence može da bude upoređena na celoj dužini jednog ili više domena vezivanja opisanih proteina fuzije. U takvom primeru, procentualne identičnosti će biti u suštini slične onima opisanim za sekvence identične celom dužinom.

[0080] Kada je značajno manje od cele sekvence koja se poredi za identičnost sekvence, homolozi će obično posedovati barem 80% identičnosti sekvence tokom kratkih intervala od 10-20 amino kiselina, i mogu posedovati identičnosti sekvence od barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili barem 99% zavisno od njihove sličnosti sa referentnom sekvencom. Identičnost sekvence tokom takvih kratkih prozora moguće je odrediti korišćenjem LFASTA; metoda moguće ih je naći na veb adresi biology.ncsa.uiuc.edu. Stručnjak u ovoj oblasti će shvatiti da ovi opsezi identičnosti sekvence jesu dati samo kao uputstvo; sasvim je moguće da se izrazito značajni homolozi dobiju a da oni budu izvan datih opsega vrednosti. Ovaj pronalazak obezbeđuje ne samo homologe peptida koji su opisani gore, već takođe molekule nukleinske kiseline koji kodiraju takve homologe.

[0081] Moguća indikacija da su dva molekula nukleinske kiseline blisko povezana je da dva molekula hibridizuju jedan sa drugim pod strogim uslovima. Strogi uslovi zavise od sekvence i različiti su pod različitim parametrima okoline. Generalno, strogi uslovi se biraju da budu oko 5°C do 20°C niži od termičke tačke topljenja (Tm) za specifičnu sekvencu pri definisanoj jonskoj jačini i pH. Tm je temperatura (pod definisanom jonskom jačinom i pH) u tom slučaju 50% ciljne sekvence hibridizuje u savršeno kompatibilni u sondu. Uslove za hibridizaciju nukleinske kiseline i proračune strogosti moguće je naći kod Sambrook i saradnika (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) and Tijssen (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Part I,Ch. 2, Elsevier, New York, 1993). Molekuli nukleinske kiseline koji hibridizuju pod strogim uslovima na opisane sekvence SCBV pospešivača će tipično hibridizovati na sondu zasnovanu na bilo celoj kodirajućoj sekvenci proteina fuzije, celom domenu vezivanja, ili drugim izabranim delovima kodirajuće sekvence pod uslovima pranja od 0,2 x SSC, 0,1% SDS na 65°C.

[0082] Sekvence nukleinske kiseline koje ne pokazuju visok stepen identičnosti mogu bez obzira na to da kodiraju slične sekvence aminokiseline, zbog degeneracije genetskog koda. Jasno je da su moguće promene u sekvenci nukleinske kiseline korišćenjem ove degeneracije da se proizvede više sekvenci nukleinske kiseline koji svaka kodira pretežno isti protein.

[0083] Malo ometajuća RNK (siRNK): RNK od približno 21-25 nukleotida koja se dobija iz dsRNA putem DICER enzima (kod životinja) ili DCL enzima (kod biljaka). Početni DICER ili DCL proizvodi su dvolančani, kod kojih su dva lanca najčešće 21-25 nukleotida u dužini i sadrže dve neuparene baze na svakom 3’ kraju. Pojedinačni lanci unutar dvolančane siRNK strukture su odvojeni, i obično jedan od siRNK se zatim udružuju sa kompleksom sa više podjedinica, RNKi indukovanim kompleksom utišavanja (RISC). Uobičajena funkcija siRNK je da vodi RISC do cljne baze na komplementarnosti baznog para.

[0084] Molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati: Bilo koji molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati iz RNK u molekul. Postupci su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti, za uvođenje konstrukata u ćeliju na način da se transkribuje molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati u funkcionalni iRNK molekul koji je translatiran i samim tim izražen kao proizvod proteina. Konstrukti mogu biti konstruisani tako da mogu da izražavaju antisens RNK molekule, da bi se suzbila translacija specifičnog RNK molekula koji je predmet interesovanja. Uobičajene supstance i metode za dobijanje i korišćenje konstrukata i ćelija domaćina su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti (videti na primer, priručnik za laboratorijsko kloniranje (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000).

[0085] Transkripcija: Proizvodnja RNK molekula putem RNK polimeraze kao kopija komplementarnosti DNK sekvence.

[0086] Region završetka transkripcije: Sekvence koje kontrolišu formiranje 3' kraja transkripta. Samocepajuće sekvence ribozima i sekvence poliadenilacije su primeri transkripcije sekvenci završetka.

[0087] Transkripciono utišavanje gena (TGS): Fenomen koji se aktivira formiranjem dsRNK koja je homologna sa regionima promotera gena i ponekad kodirajućim regionima. TGS daje kao rezultat DNK i preoblikovanje metilacije histona hromatina, čime dovodi do transkripcione inhibicije pre nego do RNK razgradnje. I TGS i PTGS zavise od dsRNK, koja se cepa u male (21-25 nukleotide) koji ometaju RNK (Eckhardt, Plant Cell, 14:1433-1436, 2002; Aufsatz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99:16499-16506, 2002).

[0088] Transgenski: Ovaj se pojam odnosi na biljku/gljivu/ćeliju/drugi entitet ili organizam koji sadrži rekombinantni genetski materijal koji se uobičajeno ne nalazi u entitetima ovog tipa/vrste (to znači, heterologni genetski materijal) i koji se uvodi u celinu koja se ispituje (ili u progenitore tog entiteta) ljudskom intervencijom. Dakle, biljka koja raste iz ćelije biljke u koju je rekombinantna DNK uvedena transformacijom (transformisana ćelija biljke) je transgena biljka, kao što su svi izdanci te biljke koji sadrže uvedeni transgen (bilo da je proizveden seksualno ili aseksualno).

[0089] Transformacija: Proces kojim eksogena DNK ulazi i menja ćeliju primaoca. Može nastati u prirodnim uslovima, ili veštačkim uslovima korišćenjem različitih metoda dobro poznatih u ovoj oblasti. Transformacija se može osloniti na bilo koju poznatu metodu za umetanje stranih sekvenci nukleinske kiseline u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina. Na izbor postupka utiče ćelija domaćin koja se transformiše i može da obuhvati, ali se ne ograničava na, virusnu infekciju, elektroporaciju, lipofekciju, i bombardovanje česticom.

[0090] Transformisano: Transformisana ćelija je ćelija u koju je uveden molekul nukleinske kiseline tehnikama molekularne biologije. Transformisane ćelije obuhvataju stalno transformisane ćelije u kojima je umetnuta DNK koja može da se replikuje bilo kao autonomno replikujući plazmid ili kao deo hromozoma domaćina. Oni takođe obuhvataju ćelije koje tranzijentno izražavaju umetnutu DNK ili RNK tokom ograničenih perioda vremena. Kako se ovde koristi, transformacija pojma obuhvata sve tehnike kojima molekul nukleinske kiseline može da bude uveden u takvu ćeliju, uključujući transfekciju sa virusnim vektorima, transformaciju sa vektorima plazmida, i uvođenje gole DNK elektroporacijom, lipofekcijom, i pištoljem za ubrzavanje čestica.

[0091] Transpozon: Sekvenca nukleotida kao što je DNK ili RNK sekvenca koja može da prenese lokaciju ili da se pomeri unutar gena, hromozoma ili genoma.

[0092] Transgena biljka: Biljka koja sadrži stranu (heterolognu) sekvencu nukleotida umetnutu u bilo njen nuklearni genom ili organelarni genom.

[0093] Transgen: Sekvenca nukleinske kiseline koja je umetnuta u ćeliju domaćina ili ćelije domaćina tehnikom transformacije.

[0094] Vektor: Molekul nukleinske kiseline kako je uveden u ćeliju domaćina, čime proizvodi transformisanu ćeliju domaćina. Vektor može da obuhvati sekvence nukleinske kiseline koje dozvoljavaju da se umnože u ćeliji domaćinu, kao što je poreklo replikacije. Vektor može takođe da obuhvati jedan ili više terapijskih gena i/ili selektibilnih marker gena i drugih genetskih elemenata poznatih u ovoj oblasti. Vektor može da transdukuje, transformiše ili zarazi ćeliju, čime prouzrokuje da ćelija izrazi nukleinske kiseline i/ili proteine koji nisu prirodno vezani za tu ćeliju. Vektor opciono obuhvata materijale da bi pomogao da se postigne ulaz nukleinske kiseline u tu ćeliju, kao što je virusna čestica, lipozom, obloga proteina ili slično.

[0095] Osim ako nije drugačije objašnjeno svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kako ga najčešće shvata prosečan stručnjak u ovoj oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Oblici jednine ("a," "an," i "the") obuhvataju odgovarajuće oblike množine osim ako kontekst jasno ne navodi drugačije. Slično, reč "ili" je predviđena da obuhvati "i" osim ako kontekst ne navodi drugačije. Otuda "obuhvata A ili B" znači uključivanje A, ili B, ili A i B. Još je potrebno razumeti da sve veličine baza ili veličine aminokiseline, i sve vrednosti molekularne težine ili molekularne mase, date za nukleinske kiseline ili polipeptide su približne, i date su za opis. Iako metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koje su ovde opisani mogu da se koriste u praksi ili testiranju ovog pronalaska, pogodni metodi i materijali su opisani dole u tekstu. U slučaju sukoba, ovaj spis, uključujući objašnjenja pojmova, se smatra relevantnim. Pored toga, materijali, metode, i primeri su samo ilustrativni i nisu predviđeni da budu ograničavajući.

III. Pregled nekoliko izvođenja

[0096] Ovaj opis opisuje nove regione inicijacjie transkripcije koji obuhvataju domen pospešivača i, pod kontrolom pospešivanja domena pospešivača, regulatorni domen transkripcije. Domen pospešivača obuhvata više (npr., dva do četiri ili više) kopija prirodnog ali prethodno neprepoznatog SCBV pospešivača raspoređenih u tandemu. Regulatorni regioni transkripcije (promoteri) iz ovog opisa daju pospešenu transkripciju u poređenju sa promoterom u odsustvu domena pospešivača. U jednom izvođenju, regulatorni region himerne transkripcije je opisan da obuhvata jednu ili više kopija elementa SCBV pospešivača prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1 (ili njegov homolog); i funkcionalno povezan na njega, promoter obuhvata mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto inicijacije iRNK, pri čemu kada je transkribovana sekvenca nukleotida koja je predmet ispitivanja pod regulatornom kontrolom regulatornog regiona himerne transkripcije, količina proizvoda transkripcije je pospešena u poređenju sa količinom proizvoda transkripcije dobijenog sa regulatornim regionom himerne transkripcije koji obuhvata promoter i ne obuhvata sekvence SCBV pospešivača. Kod nekih izvođenja, regulatorni region himerne transkripcije obuhvata promoter dobijen iz uzvodnog regiona gena biljnog virusa, bakterijskog gena, gena gljive, gena biljnog nukleusa, vannukleusnog gena biljke, gena beskičmenjaka, ili gena kičmenjaka.

[0097] Takođe su dati DNK konstrukti koji obuhvataju opisani regulatorni region transkripcije i DNK sekvencu koju treba transkribovati. Kod nekih izvođenja, DNK konstrukt je opisan tako da obuhvata region započinjanja transkripcije koji je funkcionalno povezan na molekul polinukleotida koji je moguće transkripcijom preneti funkcionalno povezan na 3' molekul polinukleotida završetka transkripcije. U jednom izvođenju, molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati daje agronomski trag biljci u kojoj je izražen.

[0098] Takođe su date transgenske biljke. U jednom izvođenju, transgenska biljka je stabilno transformisana sa opisanim DNK konstruktom. Kod nekih izvođenja, transgenska biljka je dikotiledon. Kod nekih izvođenja, transgenska biljka je monokotiledon. U jednom specifičnom izvođenju, transgenska biljka je biljka kukuruza.

[0099] Dato je još i seme opisane transgenske biljke. U jednom izvođenju, seme obuhvata opisani DNK konstrukt.

[0100] Dodatno je data i ćelija ili tkivo transgenske biljke. U jednom izvođenju, transgenska biljna ćelija ili tkivo obuhvata opisani regulatorni region himerne transkripcije. Kod nekih izvođenja, ćelija biljke ili tkivo je izvedeno iz dikotiledona. Kod drugih izvođenja, ćelija biljke ili tkivo je iz monokotiledona. U jednom specifičnom izvođenju, ćelija ili tkivo biljke je iz biljke kukuruza.

[0101] Takođe su date metode proizvodnje opisane transgenske biljke, ćelije, semena ili tkiva biljke. Kod nekih izvođenja, postupak obuhvata transformisanje ćelije biljke ili tkiva biljke sa opisanim DNK konstruktom.

[0102] Još su dati biljka, ćelija, voće, list, koren, izdanak, cvet (plod), seme, reznica i drugi reproduktivni materijal koristan za bespolno i vegetativno razmnožavanje, progene biljke, uključujući F1 hibride, muške sterilne biljke i sve druge biljke i proizvode biljaka koje je moguće izvesti iz opisanih transgenih biljaka.

[0103] Takođe je opisana ćelija, tkivo ili biljka kukuruza koja obuhvata jednu ili više kopija elementa SCBV pospešivača prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1 i funkcionalno povezan na njega heterologni promoter koji obuhvata mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto pokretanja iRNK. U jednom izvođenju, ćelija, tkivo biljke kukuruza ili biljka, obuhvata jednu ili više kopija elementa SCBV pospešivača prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1 u kom se jedna ili više kopija elementa SCBV pospešivača umeće u genom ćelije biljke kukuruza, tkiva biljke kukuruza ili biljku kukuruza na nekoj slučajno izabranoj lokaciji. Kod nekih izvođenja, SCBV pospešivač učestvuje u pospešenoj transkripciji sekvence nukleotida koja je predmet interesovanja koja je pod regulatornom kontrolom SCBV pospešivača u poređenju sa transkripcijom sekvence nukleotida koja je predmet interesovanja u odsustvu SCBV pospešivača.

IV. SCBV pospešivač i njegove upotrebe

[0104] Ovaj opis obezbeđuje prethodno neprepoznat region pospešivača iz genoma šećerne repe Bacilliform badnavirus (SCBV), čiji je pospešivač koristan za pospešivanje efikasnosti transkripcije što može kao rezultat imati pospešenu transkripciju DNK sekvenci pod kontrolom pospešivača. Od posebnog interesovanja je pospešena transkripcija sekvenci gena koje mogu da budu od istog genetskog porekla kao domaćin ili nekog stranog porekla, bilo da su sekvence koje se prirodno nalaze (i u sens i antisens orijentacijama) ili sintetički pripremljene sekvence. Pospešivači koji su predmet razmatranja obuhvataju više od dve ili više kopija prethodno neprepoznatog domena prirodnog SCBV pospešivača koji je dat u SEK ID BR: 1, na pozicijama 337 do 618). Pospešivač obuhvata barem dve kopije sekvence domena pospešivača, kod nekih izvođenja tri ili četiri ili više kopija, raspoređenih u tandemu.

[0105] Takođe se razmatraju homologni pospešivači. Bez namere da se na bilo koji način ograniče, reprezentativne homologne sekvence mogu da obuhvate one iz drugih SCBV promotera, na primer iz različitih SCBV izolata kakve su opisali Braithwaite i saradnici (Plant Cell Rep. 23:319-326, 2004; a ugrađeni su ovde u vidu reference u celini) ili u U.S. patentu br. 5,994,123 (ugrađenom ovde u vidu reference u celini).

[0106] Prirodni pospešivač obuhvata DNK sekvencu kojase u svom prirodnom okruženju nalazi uzvodno od i unutar rastojanja od oko 600 bp od promotera. Ako se početni nukleotdi iRNK uzme kao 0, sekvenca koja obuhvata pospešivač je od oko -50 do oko -1.000 bp, obično od oko -50 do -950 bp, generalno obuhvata oko -100 do -800 bp. Domen pospešivača je cis regulatorni i poželjno je da je smešten unutar rastojanja od oko 10.000 bp, obično oko 2.000 bp, još uobičajenije susedan ili unutar rastojanja od oko 1.000 bp od sekvence započinjanja transkripcije koju treba pospešiti. Pospešivač može da bude bilo koje orijentacije u odnosu na sekvencu započinjanja transkripcije i može da bude smešten uzvodno ili nizvodno u odnosu na promoter koji pospešuje, iako je obično uzvodno.

[0107] Domen pospešivača iz ovog opisa nalazi upotrebu u veoma raznovrsnim sekvencama inicijacije, uključujući promotere koji se prirodno nalaze pod kontrolom pospešivača, npr. na cis poziciji (susednoj i homolognoj) kao i onim koje se normalno povezuju sa određenim pospešivačem (npr., heterolognoj). Domen pospešivača i domen započinjanja transkripcije mogu da budu od istog ili različitog carstva, porodice ili vrste. Vrste koje su predmet interesovanja obuhvataju prokariote i eukariote, kao što su bakterije, biljke, insekti, sisari, itd. Kombinacije obuhvataju opisan(e) SCBV (virusne) domene pospešivača sa regionom započinjanja transkripcije strukturnog gena od: domaćina za SCBV (npr. iz šećerne repe), druge biljne vrste (npr. iste ili različite familije), insekta, kičmenjaka, bakterije, gljive, i tako dalje.

[0108] Ovaj opis još razmatra DNK konstrukte koji obuhvataju region pokretanja transkripcije koji je predmet razmatranja i, pod kontrolom regiona koji započinje transkripciju, DNK sekvencu koju treba transkribovati. DNK sekvenca može obuhvatiti prirodni otvoreni okvir čitanja uključujući transkribovane 5' i 3' bočne sekvence. Alternativno, može da obuhvati antisens sekvencu u tome da kodira komplement RNK molekula ili njegov deo. Kada konstrukt obuhvata otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira protein, dobija se pospešena brzina započinjanja transkripcije, obično se dobija povećana količina proizvoda ekspresije polipeptida iz tog gena. Kada taj konstrukt obuhvata antisens sekvencu, pospešena transkripcija RNK komplementarne sa divljim tipom potiskuje ekspresiju divljeg tipa iRNK, čime se smanjuje količina proizvoda koji izražava polipeptid, razmatra se da divlji tip iRNK o kome se govori može da odgovara prirodnoj iRNK ćelije domaćina ili iRNK patogena, kao što je virus ili gljiva.

[0109] U različitim izvođenjima, DNK sekvenca koju treba transkribovati obuhvata: sekvence za kodiranje proteina nekog gena (npr. iz biljke, životinje, bakterije, virusa, ili gljive), što može da obuhvati: prirodne otvorene okvire čitanja koji kodiraju proizvod proteina; komplementarnu DNK (kDNK) sekvence izvedene iz iRNK kodirane putem gena; sintetisane DNK daje željene kodirajuće sekvence; sekvence kodiranja proteina izvedene iz eksona prirodnog gena, kao što je otvoreni okvir čitanja, proizveden ligacijom eksona; i/ili kombinacijama bilo koja dva ili više navedena. Spojene na ove sekvence su odgovarajuće sekvence terminacije (završetka)/poliadenilacije transkripcije; sekvence iz prirodnog gena (npr. iz biljke, životinje, bakterije, virusa, ili gljive) koja kodira primarni RNK proizvod, koji obuhvata eksone i introne (npr. prirodne polimeraza II i polimeraza III transkribovane gene eukariota); sintetičke DNK sekvence koje kodiraju specifičnu RNK ili proizvod proteina; sekvence DNK modifikovane iz poznate kodirajuće sekvence (npr. prirodna sekvenca gena) mutagenezom (kao što je za mesto specifična mutageneza) i/ili druga tehnologija genetskog inženjeringa; himere bilo kog od gore navedenog do kojih se došlo ligacijom DNK fragmenata, uključujući himere koje kodiraju proteine fuzije; i/ili DNK sekvence koje kodiraju komplement RNK molekula ili njegove delove.

[0110] Pospešena transkripcija kod biljaka može naći upotrebu u pospešivanju proizvodnje proteina karakterističnih za biljku (endogeno - to jest, normalno se nalaze u domaćinu divljeg tipa) ili one proteine iz čijih se genetskih izvora (eksogenih - to znači, ne nalaze se normalno u domaćinu koji pripada divljem tipu). Primeri tipova sekvenci koje treba da budu izražene iz pospešivača i regulatornih regiona himerne transkripcije koji su ovde opisani obuhvataju: antisens ili male inhibitorne RNK (za potiskivanje gena); nutriciono važne proteine; faktore pospešivanja rasta; proteine koji daju zaštitu biljkama pod izvesnim uslovima okoline npr. proteini koji daju otpornost na metal, so, ili drugu toksičnost; proteini povezani sa stresom koji daju toleranciju na ekstremne uslove temperature, zamrzavanja, itd.; proteini koji daju biljci zaštitu od štetočina ili protiv infekcija, npr. proteini koji daju otpornost na bakterijsku, gljivičnu, ili drugu mikrobnu infekciju, ili otpornost na to da ih prožderu insekti (npr. B. thuringiensis toksin) ili na druge beskičmenjake ili kičmenjake; jedinjenja od medicinskog značaja izvan biljke, npr. antimikrobni, antitumorni, itd.; proteini ili druga jedinjenja koja imaju specifičnu komercijalnu vrednost; povećani nivo proteina, npr. enzimi metaboličnih putanja (npr. putanja za proizvodnju polifenolnih jedinjenja ili drugih sekundarnih metabolita); povećani nivoi proizvodnje strukturna vrednost na biljku domaćina; i tako dalje. Sekvence koje su predmet interesovanja koje su transkribovane će biti barem oko 8 bp, barem oko 12 bp, barem oko 20 bp, i mogu imati dužinu od jednog ili više kilobaznih parova (kbp).

V. Konstrukti

[0111] Konstrukti iz ovog opisa obično obuhvataju regulatorni region himerne transkripcije obuhvataju jednu ili više kopija datog elementa SCBV pospešivača funkcionalno povezanog na promoter (obično obuhvata barem mesto vezivanja RNK polimeraze i iRNK mesto započinjanja), čiji je region funkcionalno povezan na molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati a koji je funkcionalno povezan na molekul polinukleotida 3’ završetka (terminacije) transkripcije. Pored toga, konstrukti mogu da obuhvate ali nisu ograničeni na dodatne regulatorne molekule polinukleotida iz 3’ netranslatiranog regiona (3’ UTR) gena biljke (npr.3’ UTR da se poveća stabilnost iRNK iRNK kao što je PI-II region terminacije krompir ili oktopin ili nopalin sintaze 3’ završnih regiona). Konstrukti mogu da obuhvate ali se ne ograničavaju na 5’ netranslatirane regione (5’ UTR) iRNK molekul polinukleotda koji može da igra važnu ulogu u započinjanju translacije i može trakođe da bude genetska komponenta u konstruktu ekspresije biljke. Na primer, netranslatirani 5' vodeći molekuli polinukleotida izvedeni iz gena proteina toplotnog udara su pokazali da se povećava ekspresija gena u biljkama (videti na primer, U.S. patenti brojevi 5,659,122 i 5,362,865 svaki od ovih brojeva je ugrađen ovde kao referenca u celini). Takvi dodatni molekuli uzvodnog i nizvodnog regulatornog polinukleotia kao što je prisutno u ovom konstruktu mogu da budu izvedeni iz izvora koji je nativan ili heterologan u odnosu na druge elemente prisutne na tom konstruktu.

[0112] Tako, jedno izvođenje jeste konstrukt koji obuhvata regulatorni region himerne transkripcije sam po sebi koji obuhvata jednu ili više kopija (npr., dve, tri, četiri ili više kopija) elementa SCBV pospešivača prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1 (ili njegov homolog) funkcionalno povezan na promoter, funkcionalno povezan na molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati tako da se usmeri transkripcija pomenutog molekula polinukleotida koji je moguće transkribovati na željeni nivo i/ili u željeno tkivo ili razvojni obrazac posle uvođenja konstrukta u ćeliju biljke. Molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati u nekim primerima obuhvata region kodiranja proteinom nekog gena, i regulatorni region himerne transkripcije obezbeđuje transkripciju funkcionalnog iRNK molekula koji je preveden i izražen kao proizvod proteina iz tog konstrukta. U drugom izvođenju, molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati obuhvata antisens region gena, i regulatorni region himerne transkripcije utiče na transkripciju antisens RNK molekula ili drugog sličnog inhibitornog RNK da bi se suzbila ekspresija specifičnog RNK molekula koji je predmet interesovanja u ciljnoj ćeliji domaćina.

[0113] Još nekoliko primera konstrukata iz ovog opisa obuhvata dvostruke granične DNK konstrukte Ti plazmida koji imaju desni granični (RB ili AGRtu.RB) i levi granični (LB ili AGRtu.LB) region Ti plazmida izolovanog iz Agrobacterium tumefaciens koji obuhvata T-DNK, koja zajedno sa molekulima transfera koje su dale Agrobacterium ćelije, omogućava integraciju T-DNK u genom ćelije biljke. Ti konstrukti mogu takođe da sadrže DNK segmente okosnice plazmida koji omogućavaju funkciju replikacije i antibiotsku selekciju bakterijskih ćelija, na primer, Escherichia coli porekla replikacije kao što je ori322, širok opseg porekla domaćina replikacije kao što je oriV ili oriRi, region kodiranja za marker koji je moguće izabrati, kao što je Spec/Strp koji kodira Tn7 aminoglikozid adeniltransferazu (aadA) koja daje otpornost na spektinomicin ili streptomicin, ili gentamicin (Gm, Gent) marker gen, koji je moguće selektovati. Za transformaciju biljke, reprezentativni bakterijski sojevi domaćina obuhvataju Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, ili LBA4404; međutim, i druge sojeve poznate stručnjaku u ovoj oblasti transformacije biljke moguće je koristiti.

[0114] Takođe se razmatraju konstrukti koji obuhvataju barem jedan element SCBV pospešivača (opciono u kontekstu regulatornog regiona himerne transkripcije), čiji je konstrukt u stvari konstrukt obeležavanja aktivacije. Obeležavanje aktivacije je postupak po kom se geni nasumično i snažno regulišu uzvodno u celom genomu, posle čega je moguće snimiti i izabrati specifične fenotipe. Komponente korisne za različite tipove konstrukata obeležavanja aktivacije su poznate; videti, na primer: Walden et al., Plant Mol. Biol. 26: 1521-8, 1994 (gde je opisana T-DNK konstrukt označavanje aktivacije koje ji korišćen da se aktiviraju geni u kulturi ćelije duvana što bi omogućilo ćelijama da rastu u odsustvu hormona za rast biljke); Miklashevichs et al., Plant J.12: 489-98, 1997; Harling et al., EMBO J.16: 585566, 1997; Walden et al., EMBO J. 13: 4729-36, 1994 (izveštaji o genima izolovanim iz genomskih sekvenci biljke bočno susednih T-DNK oznaci i navodno uključenih u odgovore hormona rasta biljke); Schell i saradnici, Trends Plant Sci. 3: 130, 1998 (razmatranje istraživanja grupe srodnih studija); Kardailsky i saradnici, Science 286: 1962-1965, 1999 (gde je opisana T-DNK označavanje aktivacije te provera i izbor biljaka za fenotip za rano cvetanje); Koncz i saradnici, Proc Natl Acad Sci U S A 86(21):8467-71, 1989 (gde je opisana oznake aktivacije korišćenjem Agrobacterium gena 5 promotera (pg5), koji je aktivan samo u ćelijama razmnožavanja i mora biti umetnut direktno odmah do gena biljke kako bi uticao na njegovu ekspresiju); Wilson i saradnici, Plant Cell 8: 659-671, 1996 (oznaka aktivacije koja koristi modifikovani Ds transpozon koji nosi CaMV 35S promoter i nos::hpt kasetu izbora) i Schaffer i saradnici, Cell 93: 1219-1229, 1998 (gde je ilustrovan isti sistem, korišćen da uzvodno reguliše susedne gene biljke koji daju kao rezultat dominantne mutacije pospešene funkcijom 1996); i Weigel i saradnici, Plant Physiology, 122:1003-1013, 2000 (ilustruje vektore označavanja aktivacije koji su korisni za proveru i izbor desetina hiljada transformisanih biljaka za morfološke fenotipe).

VI. Sekvence nukleotida za pospešenje transkripcije

[0115] Primeri molekula polinukleotida koje je moguće transkribovati za pospešivanje transkripcije ugradnjom u konstrukte kako je ovde dato, obuhvataju, na primer, molekule polinukleotida ili gena iz vrsta koje nisu ciljne vrste ili gena koji potiču sa ili su prisutni u tim istim vrstama, ali su ugrađeni u ćelije primaoca metodama genetskog inženjeringa pre nego tehnikama klasične reprodukcije ili uzgajanja. Taj tip molekula polinukleotida može da obuhvata ali se ne ograničava na molekul polinukleotida koji je već prisutan u ciljnoj ćeliji biljke, molekul polinukleotida iz druge biljke, molekul polinukleotida iz različitog organizma, ili spoljno generisan molekul polinukleotida, kao što je molekul polinukleotida koji obuhvata antisens informaciju o genu, ili molekul polinukleotida koji kodira veštački, sintetički, ili drugačije modifikovanu verziju transgena.

[0116] U jednom izvođenju, molekul polinukleotida kaošto je prikazano na pozicijama 337 do 618 SEK ID BR.: 1 (ili dva ili više kopija iste) (za primer, u kontekstu regiona incijacije himerne transkripcije) na primer, u kontekstu regiona incijacije himerne transkripcije) je inkorporiran u konstrukt tako da je opisana SCBV sekvenca pospešivača (ili serije dve ili više sekvenci) funkcionalno povezana na molekul polinukleotida koji je moguće transkr bovati koji je gen od agronomskog interesa ili neka druga sekvenca ekspresije (još uopštenije, sekvenca nukleotida od interesa). Kako se ovde koristi, pojam ''gen od agronomskog interesa'' se odnosi na molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati i koji obuhvata, ali se ne ograničava na gen koji obezbeđuje poželjnu karakteristiku povezanu sa morfologijom biljke, fiziologijom biljke, rastom i razvojem, prinosom, nutritivnim poboljšanjem, bolešću ili otpornošću na štetočine, ili tolerancijom biljke prema uslovima životne sredine ili hemijskom tolerancijom biljke. Ekspresija gena od agronomskog interesa je poželjno da bi se dobilo agronomski važno svojstvo, na primer. Gen od agronomskog interesa koji obezbeđuje korisno agronomsko svojstvo za biljke useva može da bude, na primer, jedna ili više sekvenci koje daju biljku koja izražava taj gen: otpornost na herbicid (videti, npr. U.S. Pat. br.6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 5,463,175; i objave patenata U.S. US20030135879 i US20030115626), povećani prinos (videti, npr. U.S. Patent USRE38,446; U.S. Pat. br. 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 5,716,837), kontrola insekata (videti, npr. U.S.

Pat. br. 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 5,763,241), otpornost na gljivične bolesti (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 6,506,962), otpornost na virus (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 5,304,730), otpornost na nematode (videti, npr. U.S. Pat. br.6,228,992), otpornost na bakterijske bolesti (videti, npr. U.S. Pat. br.

5,516,671), rast i razvoj biljaka (videti, npr. U.S. Pat. br.6,723,897; 6,518,488), proizvodnja skroba (videti, npr. U.S. Pat. br.6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), proizvodnja modifikovanih ulja (videti, npr. U.S. Pat. br.6,444,876; 6,426,447; 6,380,462), visoka proizvodnja ulja (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 6,476,295), modifikovan sadržaj masnih kiselina (videti, npr. U.S. Pat.br. 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 6,459,018), proizvodnja vlakna (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 5,869,720), visoka proizvodnja proteina (videti, npr. U.S. Pat. br.6,380,466), zrenje voća (ploda) (videti, npr. U.S. Pat. br.5,512,466), bolja svarljivost (videti, npr. U.S. Pat. br.6,531,648), poboljšan ukus (videti, npr. U.S. Pat. br.6,011,199), niska rafinoza (videti, npr. U.S. Pat. br.6,166,292), poboljšana hranljivost za životinje i/ili ljude (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,723,837; 6,653,530; 6,541,259; 5,985,605; 6,171,640), otpornost na stres nametnut uslovima životne sredine (videti, npr. U.S. Pat. br.6,072,103), poželjni peptidi (npr. farmaceutski ili sekretabilni peptidi) (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 6,080,560), poboljšana svojstva obrade (videti, npr. U.S. Pat. br. 6,476,295), industrijska proizvodnja enzima (videti, npr. U.S. Pat. br. 5,543,576), fiksacija azota (videti, npr. U.S. Pat. br. 5,229,114), proizvodnja hibridnog semena (videti, npr. U.S. Pat. br.5,689,041), biopolimeri (videti, npr. U.S. Pat. br. USRE37,543; U.S. Pat. br. 6,228,623; 5,958,745 i U.S. objava br. US20030028917) i proizvodnja biogoriva (videti, npr. U.S. Pat. br.5,998,700).

[0117] Alternativno, molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati može da utiče na gore pomenute (ili druge) karakteristike ili fenotipove biljke kodiranjem antisens ili RNK molekula koji prouzrokuje ciljano suzbijanje ekspresije endogenog gena, na primer preko antisens, inhibitornih RNK (RNKi), ili kosupresijom posredovanih mehanizama. Ova RNK bi mogla trakođe da bude katalitički RNK molekul (ribozom) projektovan da rascepi deljenjem željeni proizvod iRNK. Tako, bilo koji molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati i koji kodira transkribovani molekul RNK koji utiče na fenotip, biohemijsku ili morfološku promenu koja je predmet interesovanja, može imati koristi od transkripcionog pospešivanja omogućenog sekvencama i konstruktima datim ovde.

[0118] Taj opisani SCBV pospešivač ili regulatorni region himerne transkripcije koji obuhvata jednu ili više kopija, može biti ugrađen u konstrukt sa jednim ili više marker gena (bilo koji molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati i čiju je ekspresiju moguće snimiti ili dobiti kao rezultat na neki način) i koji je testiran u tranzijetnoj ili stabilnoj analizi biljke da bi se dobila indikacija obrasca ekspresije gena regulatornog elementa u stabilnim transgenskim biljkama. Marker geni za upotrebu u praksi takvih izvođenja obuhvataju, ali se ne ograničavaju na molekule polinukleotida koje je moguće transkribovati i koji kodiraju β- glukuronidazu (GUS opisano u U.S. Pat. br.5,599,670) i zeleni fluorescentni protein (GFP opisan u U.S. Pat. br.5,491,084 i 6,146,826), proteine koji daju antibiotsku otpornost, ili proteine koji daju toleranciju na herbicid. Korisni antibiotski markeri otpornosti, uključujući i one proteine kodiranja koji daju otpornost na kanamicin (nptII), higromicin B (aph IV), streptomicin ili spektinomicin (aad, spec/strep) i gentamicin (aac3 i aacC4) su poznati u ovoj oblasti. Herbicidi za koje je pokazana tolerantnost transgenske biljke i postupak iz ovog pronalaska mogu biti primenjeni, i obuhvataju ali se ne ograničavaju na: glifozat, glufozinat, sulfoniluree, imidazolinon, bromoksinil, delapon, ciklohezandion, inhibitore protoporfirionogen oksidaze, i herbicide izoksasflutola. Proteini kodiranja molekula polinukleotida uključeni u toleranciju herbicida su poznati u ovoj oblasti, i obuhvataju, ali se ne ograničavaju na molekul polinukleotida koji kodira sintazu 5-enolpiruvilšikimat-3-fosfata (EPSPS opisanu u U.S. Pat. br. 5,627,061, 5,633,435, 6,040,497 i u U.S. Pat. br. 5,094,945 za toleranciju glifozata); polinukleotide koji kodiraju oksidoreduktazu glifozata i transferazu glifozat N acetila (GOX opisanu u U.S. Pat. br. 5,463,175 i GAT opisanu u U.S. objavi br. 20030083480); molekul polinukleotida koji kodira bromoksinil nitrilazu (Bxn opisano u U.S. Pat. br. 4,810,648 za toleranciju bromoksinila); molekul polinukleotida koji kodira fitoen desaturazu (crtI) opisali su Misawa (Misava) i saradnici. (Plant J. 4:833-840, 1993) i Misawa i saradnici. (Plant J. 6:481-489, 1994) za toleranciju norflurazona; molekul polinukleotida koji kodira sintazu acetohidroksikiseline (AHAS, aka ALS) što su opisali Sathasiivan (Satasivan) i saradnici (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990) za toleranciju na herbicide sulfoniluree; molekul polinukleotida koji kodira dikamba razgrađujući enzim oksigenaze (opisano u američkoj objavi patenta U.S. US20030135879 i US20030115626, za dikamba toleranciju); i bar gen opisan od strane DeBlock i saradnika (EMBO J. 6:2513-2519, 1987) za toleranciju na glufozinat i bialafos. Regulatorni elementi ovog opisa mogu da izraze molekule polinukleotida koje je moguće transkribovati i koji kodiraju fosfinotricin acetiltransferazu, na glifosfat otporan EPSPS, aminoglikozid fosfotransferazu, hidroksifenil piruvat dehidrogenazu, higromicin fosfotransferazu, neomicin fosfotransferazu, dalapon dehalogenazu, na bromoksinil otpornu nitrilazu, sintazu antranilata, glifosat oksidoreduktazu i glifosat-N-acetil transferazu.

[0119] Konstrukti koji sadrže barem jedan SCBV pospešivač (na primer, u kontekstu regulatornog regiona himerne transkripcije) funkcionalno povezan na marker gen ili drugu sekvencu nukleotida koja je predmet interesovanja, mogu biti isporučeni u tkiva (npr. transformisan) i tkiva analizirana odgovarajućim mehanizmom, zavisno od markera ili sekvence koja se transkribuje. Takva kvantitativna ili kvalitativna analiza može da se koristi kao alat za procenu potencijalnog profila ekspresije regulatornog elementa kada je funkcionalno povezan na gen od agronomskog interesa u stabilnim biljkama. Marker gen može da se koristi u prelaznom ogledu; postupci testiranja za ekspresiju marker gena kod prelaznih ogleda su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Tranzijentna ekspresija marker gena je prijavljeno korišćenjem raznovrsnih biljaka, tkiva, i DNK sistema isporuke. Na primer, sistemi analiza tranzijentnog stanja obuhvataju ali se ne ograničavaju na isporuku gena preko elektroporacije ili bombardovanja česticama tkiva u bilo kom ogledu biljke u tranzijentnom stanju korišćenjem bilo koje vrste biljaka koja je predmet interesovanja. Takvi tranzijentni sistemi bi obuhvatili ali bez ograničenja na elektroporaciju protoplasta iz raznovrsnih izvora tkiva ili bombardovanja česticama specifičnog tkiva koje je predmet interesovanja. Ovaj opis obuhvata upotrebu sistema tranzijetne ekspresije da se procene regulatorni elementi funkcionalno povezani na bilo koji molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati, uključujući ali bez ograničavanja na marker gene ili gene od agronomskog interesa. Primeri tkiva biljke predviđenih za testiranje u tranzijentima preko odgovarajućeg sistema isporuke bi obuhvatili ali se ne bi ograničavali na tkiva osnove lista, zadebljanje, kotiledone, korene, endosperm, embione, biljno tkivo, polen, i epidermalno tkivo.

VII. Transformacija biljke

[0120] Konstrukt transformacije biljke koji obuhvata element pospešivača (ili više njegovih kopija) ili regulatorni region himerne transkripcije kao što je opisano ovde može da bude uveden u biljke korišćenjem bilo koje metode transformacije biljke. Metode i materijali za transformisanje biljaka uvođenjem konstrukta ekspresije biljke u genom biljke u praksi ovog pronalaska može da obuhvati bilo koji od dobro poznatih i prikazanih postupaka uključujući elektroporaciju (npr. U.S. Pat. br. 5,384,253), bombardovanje mikroprojektilima (npr. U.S. Pat. br. 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; i 6,403,865), agromaterijom posredovanu transformaciju (npr. U.S. Pat. br. 5,824,877; 5,591,616; 5,981,840; i 6,384,301), i transformaciju protoplasta (npr. U.S. Pat. br.5,508,184). Stručnjaku u ovoj oblasti će biti jasno da je neke metodologije transformacije moguće koristiti i modifikovati za proizvodnju stabilnih transgenskih biljaka iz bilo kog broja ciljnih useva koji su od interesa.

[0121] Specifične metode za transformisanje dikolitedona su poznate stučnjaku u ovoj oblasti. Primera radi, metode transformacije i regeneracije biljke su opisane za jedan broj useva uključujući, ali bez ograničenja na, pamuk (Gossypium hirsutum), zrno soje (Glycine max), kikiriki (Arachis hypogaea), i članove roda Brassica (kupus).

[0122] Slično, specifične metode za transformisanje dikolitedona su takođe poznate stučnjaku u ovoj oblasti. Primera radi, metode transformacije i regeneracije biljke su opisane za neke useve uključujući, ali bez ograničenja, na ječam (Hordeum vulgarae); kukuruz (Zea mays); ovas (Avena sativa); trava iz voćnjaka (Dactylis glomerata); pirinač (Oryza sativa, uključujući sorte indica i japonica varieties); sirak (Sorghum bicolor); šećernu repu (Saccharum sp); trstikasta vlasulja (Festuca arundinacea); vrste trave za travnjake (npr. Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); pšenica (Triticum aestivum), i alfalfa (Medicago sativa).

[0123] Transformisane biljke je moguće analizirati na prisustvo gena od interesa i nivo ekspresije i/ili profil koji daju regulatorni regioni himerne transkripcije opisani ovde. Brojne metode su dostupne prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti za analizu transformisanih biljaka. Na primer, metode za analizu biljke obuhvataju južnu i severnu blot analizu, na PCR-u zasnovane (ili na pojačavanju druge nukleinske kiseline zasnovanim) pristupe, biohemijske analize, metode fenotipske provere i izbora, procene oblasti, i imunodijagnostičke oglede (npr. za detektovanje, lociranje i/ili kvantifikaciju proteina).

[0124] Pospešena ekspresija gena korišćenjem opisanog SCBV pospešivača je pokazana u kukuruzu, ali se očekivalo da pospešivač funkcioniše i u drugim vrstama biljke, po mogućstvu diotiledonima kao i kod monokotiledona. Element pospešivača sa četiri kopije SCBV uzvodnog regiona je dao najviši nivo ekspresije ovde proučenih kombinacija. Manje ili više kopija od uzvodnog regiona, kao i kombinacije sa elementima pospešivača iz drugih izvora bi mogle takođe da omoguće prednosti za modulisanje ekspresije gena. Isti aktivatori, konstrukti i pristupi mogu biti korisni za druge vrste biljaka za koje je moguće identifikovati gene jer je sekvenca genoma dostupna ili se na njoj radi (uključujući sirak Sorghum (Sorghum bicolor), pšenicu (Triticum aestivum), ječam (Hordeum vulgare), proso lisičiji rep (Setaria italica), Sugarcane (Saccharum officinarum), Miscanthus giganteus ili za koje ’aktivirani geni’ mogu da budu identifikovani radom na sekvenciranju genoma u budućnosti ili možda sintenijom (očuvanost poretka gena) hromozoma (uključujući vrste ječma (Avena sativa), Raž (Secale cereale), biserni proso (Pennisetum glaucum), indijski/afrički proso (Eluesine coracana), sirak (metlaš) proso (Panicum miliaceum), etiopsko proso (Eragrostis tef)), ili za model vrsta trava za koje je genomska sekvenca dostupna ili se na njoj radi (uključujući Purple False Brome (Brachypodium distachyon), muhar zeleni (Setaria viridis)).

[0125] Dati su sledeći primeri da bi se ilustrovale određene karakteristike i/ili izvođenja. Ovi primeri ne bi trebalo da budu konstruisani tako da ograniče pronalazak na određene karakteristike ili opisana izvođenja.

PRIMER 1

Identifikacija sekvenci koje obuhvataju element pospešivača promotera virusa šećerne repe Bacilliform (SCBV)

[0126] Ovaj primer prikazuje identifikaciju sekvenci koje obuhvataju element pospešivača SCBV promotera.

[0127] Fragment promotera izveden iz genoma SCBV (GenBank pristupni br. AJ277091, i opisan od strane Geijskes i saradnika, Arch. Virol., 147: 2393-2404, 2002) je prvo bio ispitan putem ogleda tranzijentne ekspresije da bi se odredilo koji regioni sekvence promotera obuhvataju sekvence elementa pospešivača. U studiji analize promotera, fragmenti izvedeni iz SCBV promotera (SEK ID BR: 1) koji obuhvataju sekvence od -839 do 106 bp (plazmid pSCBV839), od -576 do 106 bp (plazmid pSCBV576), i od -333 do 106 bp (plazmid pSCBV333) od mesta početka transkripcije (definisano kao 1 pozicija) su klonirani uzvodno od kodirajućeg region za protein reporter luciferaze svitaca (LUC). Transkripcija je završena kopijom sintaze nopalina (Nos) 3’ UTR region (kako je opisano u bazama 1847 do 2103 za GenBank pristupni broj V00087.1, koji je ovde ugrađen u potpunosti u vidu reference i SL.1). Tranzijentne transkripcione aktivnosti ovih konstrukata su testirane njihovim transformisanjem pomoću bombardovanja čestice u ćelije suspenzije kukuruza Hi-II (opisane detaljno u Primeru 2 dole) i nadgledanje aktivnosti LUC gena reportera. Aktivnost luciferaze je normalizovana u svakom eksperimentu kotransformacijom sa ekvimolarnom količinom DNK plazmida koji sadrži SCBV:LUC konstrukt i DNK referentnog plazmida koji podržava konstrukt koji obuhvata gen promoter ubikvitina 1 kukuruza (ubi1) (kao što je opisano u U.S. patentu br.5,510,474 koji je ovde u potpunosti obuhvaćen u vidu reference; esencijalno baze 7 do 1990 za GenBank pristupni broj S94464.1, koji je ovde obuhvaćen u vidu reference u potpunosti) daje ekspresiju GUS (beta-glukuronidaze) kodirajućeg regiona, i završen je sa kukuruz Per53’ UTR terminator sekvencom (kako je opisano u U.S. patentu br.

6,699,984, koji je ovde u celini obuhvaćen; npr. konstrukt ubi1:GUS). Dva dana posle bombardovanja, ukupan protein koji je izolovan iz transformisanih ćelija i LUC enzimske aktivnosti (izražen u jedinicama luciferaze (LU)/mg protein) i GUS aktivnosti enzima (izražen u GUS jedinicama aktivnosti (GU)/mg protein) su izmerene postupcima pronađenim u, na primer, (Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. (Maliga i saradnici, Metode u molekularnoj biologiji biljaka.

Priručnik za predmet laboratorija.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Relativne aktivnosti testiranih promotera za tri SCBV:LUC konstrukta su upoređene normalizovanjem LUC nivoa prema GUS nivoima kao odnos LU/mg proteina:GU/mg proteinu. Rezultati prelaznog testiranja su pokazali da se LUC aktivnost povećava linearno sa povećanjem koncentracija plazmida bombardovane DNK, što ukazuje na to da je LUC aktivnost dovedena u vezu sa nivoima transkripta. Pored toga, SCBV fragment promotera koji sadrži sekvence od -576 bp uzvodno do 106 nizvodno od mesta početka transkripcije imao je 66% 62% aktivnosti fragmenta promotera pune dužine (ovde je definisan tako da sadrži sekvence od -839 bp uzvodno do 106 nizvodno od mesta početka). Nasuprot tome, fragment promotera koji obuhvata sekvence od -333 bp uzvodno do 106 nizvodno od mesta početka transkripcije imao je samo 17% ± 1% aktivnosti promotera pune dužine. Zato, su sekvence za većinu SCBV aktivnosti promotera locirane uzvodno od -333 bp od mesta početka transkripcije.

[0128] Deo SCBV sekvence promotera koji može da pospeši transkripciju pogonjenu heterolognom sekvencom minimalnog promotera je ispitivan. Kako je definisano u ovim eksperimentima, element pospešivača je funkcionalno identifikovan kao kratka (200 do 300 bp) cis delujuća DNK sekvenca, bez TATA kutije, koja, kada se stavi 5’ blizu heterologne minimalne sekvence promotera, povećava aktivnost ekspresije heterolognog minimalnog promotera tako da ju je moguće reprodukovati i izmeriti kada se testira u bilo tranzijentnom ili stabilnom sistemu transformacije. Pored toga, duplikacije u istom genu (tandem) elementa pospešivača omogućavaju čak više nivoe aktivnosti ekspresije heterolognog minimalnog promotera nego pojedinačne kopije elementa pospešivača. Heterologni element minimalnog promotera koji je korišćen u ovom Primeru obuhvata baze od -100 do 106 alkohola dehidrogenaze 1 kukuruza (Adh1) promotera gena (odgovaraja bazama 997 do 1202 za GenBank pristupni br. X04049, koji je ovim ugrađen putem reference u celini jer je javno objavljen 30. avgusta 2010.).

[0129] Dva fragmenta izvedena iz SCBV promotera, koji obuhvataju sekvence od -503 do -222 bp i od -758 do -222 bp u odnosu na mesto početka transkripcije, i klonirani su 5’ do sekvenci obuhvataju minimalni kukuruz Adh1 promoter spojen na region kodiranja koji kodira region kodiranja proteina luciferaze svitaca (LUC). Himerna transkripcija gena je završena pomoću Nos 3’UTR kako je gore opisano. Ćelijske kulture suspenzije kukuruza Hi-II su transformisane bombardovanjem čestica sa DNK plazmidima koji obuhvataju LUC i GUS konstrukte, i enzimske aktivnosti su izmerene i upoređene kao gore. Plazmidi koji obuhvataju LUC konstrukte koji imaju -503 do -222 sekvenci ili -758 do -222 sekvenci postavljenih na 5’ do minimalno Adh1 promotera pokazali su 6-struko, i 4-struko, prema opisanom redosledu, veću LUC aktivnost u odnosu na minimalni Adh1 promoter bez dodatih SCBV sekvenci. Tako, sekvence unutar ovih fragmenata SCBV promotera pospešuju aktivnosti transkripcije posredovane pomoću heterolognog promotera kukuruza.

[0130] Sposobnosti više kopija -503 do -222 bp SCBV regiona pospešivača da povećaju posredovanu ekspresiju pomoću minimalnog Adh1 promotera su testirane kloniranjem jedne, dve ili četiri kopije -502 do -222 bp sekvenci 5’ do minimalnog kukuruz Adh1 promotera spojenog na LUC kodirajući region (SL.

3A). DNK plazmida koje obuhvataju konstrukte (kao i DNK plazmid koji ima referentni ubi1:GUS konstrukt) su bombardovane u kulturi ćelija suspenzije kukuruza Hi-II, i LUC i GUS aktivnosti su izmerene i upoređene kao gore u tekstu. Ćelije bombardovane konstruktima koji obuhvataju 1 kopiju, 2 kopije, ili 4 kopije SCBV regiona pospešivača sekvence su imale više od 5 puta, 6 puta i 10 puta, prema opisanom redosledu, veću LUC aktivnost nego što su imale ćelije bombardovane analognim minimalnim Adh1 konstruktom promotera bez SCBV sekvenci pospešivača (SL.3B).

[0131] Baze nukleinske kiseline obuhvataju -502 do -222 bp SCBV promotera, kako je dato u SEK ID BR: 1, kodira transkripcionu aktivnost aktivacije koja može da omogući superiorne karakteristike ekspresije za promoter biljke. Pored toga, aktivnost transkripcione aktivacije je povećana nagomilavanjem više tandem kopija baza koje obuhvataju -502 do -222 bp SCBV promotera, kako je dato u SEK ID BR: 1. Pored toga, postupci i reagensi dati ovde mogu još biti ispitani i korišćeni da se dobiju i kraće sekvence koje zadržavaju aktivnost transkripcione aktivacije, ili mogu biti kombinovani sa drugim elementima transkripcionog aktivatora i promoterima biljke u novim kombinacijama.

PRIMER 2

Testiranje tranzijentne ekspresije SCBV:LUC i ub1:GUS konstrukata za kulturu ćelija suspenzije kukuruza Hi-II

[0132] Ovaj primer opisujte tranzijentno testiranje ekspresije SCBV:LUC i ub1:GUS konstrukata kukuruza Hi-II.

[0133] Suspenzija ćelijske kulture kukuruza Hi-II (Armstrong et al., Maize Genet. Coop. Newslett., 65:92-93, 1991) su transformisane bombardovanjem čestica sa DNK plazmida koji obuhvataju LUC i GUS konstrukte napravljene kao što je gore opisano, i enzimske aktivnosti su izmerene i upoređene. Velike količine preparata DNK plazmida su pripremljene korišćenjem QiAfilter™ Plasmid Maxi Kits (Qiagen, Germantown, Maryland) i količina i kvalitet su analizirani korišćenjem standardnih postupaka za molekule.

[0134] Preparat od suspenzije ćelijske kulture kukuruza Hi-II za bombardovanje. Hi-II ćelije su zadržane na vibracionom uređaju na 125 ob./min u H9CP+ podlozi na 28° u mraku (H9CP podloga se sastoji od MS soli 4,3 gm/L, saharoze 3%, Kazamino kiselina 200 mg/L, mioinozitola 100 mg/L, 2.4-D 2 mg/L, NAA 2 mg/L, 1000X MS vitamina 1 mL/L, L prolina 700 mg/L, i kakao vode (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 62,5 mL/L, pH 6,0). Pre bombardovanja, 2 dana stare kulture Hi-II su prenete na G-N6 medijum (CHU N6 medijum 3,98 g/L, CHU N6 vitamina 1 mL/L (obe CHU komponente iz PhytoTechnology Laboratories®, Lenexa, KS), Mioinozitol 100 mg/L, 2,4-D 2 mg/L i saharoza 3%, pH 6,0) i ostavljene su da rastu tokom 24 sata. Na dan bombardovanja, G-N6 strare ćelije (2,5 gm ćelija) su prenete na sterilne Whatman br.1 filter diskove (55 mm) postavljene na G-N6 podlogu koja sadrži 0,5 M D-sorbitol i 0,5 M D-manitol i inkubirane tokom 4 sata. Osmotski podešene ćelije su korišćene za bombardovanje.

[0135] Preparat od zlatnih čestica sa DNK plazmida i ogledom bombardovanja. Zlatne čestice (1 mm prečnik, BioRad, Hercules, CA) su oprane sa 70% etanolom tokom 10 minuta, zatim tri puta sa sterilnom vodom. Čestice su raspršene u 50% glicerola pri koncentraciji od 120 mg/mL. Za uobičajen eksperiment, 150 mL (18 mg) zlatnih čestica, približno 5 mg DNK plazmida, 150 mL 2,5 M CaCl2 i 30 mL 0,2 M spermidina su kombinovane. Ova reakcija (ukupna količina 375 mL) je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta sa povremenim pažljivim vrtloženjem. Ove zlatom obložene čestice DNK su kratko centrifugirane, oprane sa 420 mL od 70% etanola i zatim sa 420 mL 100% etanola. Finalni pelet je vraćen u suspenziju u 110 mL 100% etanola i podvrgnut kratkoj sonikaciji (tri praska svaki od 3 sekunde, sa 1 minutom između prasaka) sa sonikatorom Branson 1450. Alikvoti od 12,2 mL zlatom obloženih čestica sa DNK su rasprostrti na svaki od devet makronosača (BioRad, Hercules, CA) i korišćeni u ogledima bombardovanja korišćenjem BioRad PDS1000/He sistema. Ćelije kulture suspenzije su transformisane na ciljnom rastojanja od 9 cm korišćenjem 3510 psi diskova i svaka ploča je bombardovana 3 puta. Posle bombardovanja, ćelije su inkubirane u mraku na 28° C, prvo tokom 12 sati na G-N6 koji sadži D sorbitol i D manitol medijum, zatim na G-N6 pločama tokom dodatnih 36 sati. Ćelije su prikupljene iz ploča, blotovane da se ukloni pufersko sredstvo i ekstrahovane sa 300 mL 2x CCLT LUC ekstrakcionog puferskog sredstva (Promega Corporation, Madison, WI). Posle centrifugiranja, prikupljeno je oko 600 mL ekstrakta proteina. Koncentracije proteina su procenjene korišćenjem Bradford-ovog ogleda.

[0136] LUC enzimska aktivnost (izražena u jedinicama luciferaze (LU)/mg protein) i GUS aktivnosti enzima (izražen u GUS jedinicama aktivnosti (GU)/mg protein) su izmerene postupcima pronađenim u, na primer, Maliga et al. (Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. (Maliga i saradnici, Metode u molekularnoj biologiji biljaka. Priručnik za predmet laboratorija.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Relativne aktivnosti testiranih promotera za SCBV:LUC konstrukte su upoređene normalizovanjem LUC nivoa prema GUS nivoima kao odnos LUC/mg proteina:GU/mg proteinu.

PRIMER 3

Plazmidi za aktivaciju označavanja u biljkama kukuruza

[0137] Ovaj primer opisuje proizvodnju Agrobacterium superbinarnih plazmida.

[0138] Taj superbinarni sistem je specijalizovan primer Agrobacterium prenosni vektor/homologni sistem rekombinacije (Komari i saradnici, Meth. Mol. Biol. 343:15-41, 2006, Komari i saradnici, Plant Physiol.

114:1155-1160, 2007; videti takođe evropski patent br. EP604662B1 i U.S. patent br.7,060,876 od kojih je svaki ugrađen kao referenca u potpunost Agrobacterium tumefaciens bakterije iz zemljišta obuhvataju soj korišćen sa superbinarnim sistemom je LBA4404(pSB1). Soj LBA4404(pSB1) obuhvata dva nezavisno replikujuća plazmida, pAL4404 i pSB1. pAL4404 je iz Ti plazmida izveden pomoćni plazmid koji sadrži nedirnuti komplet vir gena (iz Ti plazmida pTiACH5), ali koji nema T-DNK region (i samim tim nema sekvencu ponavljanja leve i desne granice T DNK). pSB1 plazmid napaja dodatni delimični komplet vir gena izvedenih iz pTiBo542. Jedan primer prenosnog vektora korišćenog u superbinarnom sistemu je pSB11, koji obuhvata klonirajući polilinker koji služi kao mesto uvođenja za gene koji su predodređeni za transformaciju ćelije biljke, koja bočno ima desne i leve granične ponovljene regione T-DNK. Prenosni vektor pSB11 nije sposoban za nezavisnu replikaciju u Agrobacterium, ali je unutra stabilno održan kao kointegrantni plazmid kada je integrisan u pSB1 pomoću homologne rekombinacije između zajedničkih sekvenci prisutnih na pSB 1 i pSB11. Tako, na potpuno modifikovan T-DNK region uveden u LBA4404(pSB1) na modifikovanom pSB11 vektoru je produktivno delovano i prenet je u ćelije biljke pomoću Vir proteina izvedenih iz dva različita Agrobacterium Ti izvora plazmida (pTiACH5 i pTiBo542). Superbinarni sistem se pokazao posebno korisnim za transformaciju biljnih vrsta (Videti Hiei i saradnici, Plant J.6:271-282, 1994, i Ishida i saradnici, Nat. Biotechnol.14:745-750, 1996).

[0139] Plazmid transformacije za proizvodnju aktivacije označenih biljaka kukuruza može da obuhvati kointegrantni plazmid formiran homolognom rekombinacijom između superbinarnog plazmida pSB1 i pEPP1088, koji ima pSB11 vektorsku ukosnicu (videti evropski patent br. EP604662B1 i U.S. patent br.

7060876 od kojih je svaki ovde ugrađen putem reference). Kointegrantni plazmid se pominje kao pSB1::pEPP1088 ili kao ZeaTAG vektor. Struktura pEPP1088 je potvrđena analizom restrikcionog enzima i DNK određivanjem sekvence izabranih regiona konstrukta. pEPP1088 obuhvata, pozicioniran između leve (LB) i desne (RB) T-DNK granične sekvence koje su dobile pSB11 plazmid, 4 kopije -502 do - 222 bp SCBV sekvenci pospešivača opisanih iznad i selektibilni marker gen koji je sadržao pirinač (Oryza sativa) promoter gena aktina sa povezanim intronom 1 i 5’ UTR (u suštini kako je opisano kao baze 12 do 1411 za GenBank pristupni broj EU155408.1 koji je ovde u celini ugrađen kao referenca), kodirajuća sekvenca za AAD-1 protein tolerancije herbicida kako je opisano u U.S. prijavi patenta br.

20090093366, 3’ UTR terminator-sekvenca iz gena lipaze kukuruza u suštini kako je opisano kao baze 921 do 1277 za GenBank pristupni broj gb|L35913.1|MZELIPASE i u U.S. patentu br.7,179,902 od kojih je svaki ovde ugrađen kao referenca u celini.

[0140] T-DNK za pEPP1088 (i kako je prisutna u pSB1::pEPP1088) se integriše na nasumičnim lokacijama u hromozomima kukuruza kada je uvedena u ćelije kukuruza pomoću Agrobacteriumposredovane transformacije. Izbor za transformisane ćelije kukuruza je dat pomoću konstitutivno izraženog AAD1 selektibilnog marker gena u T-DNK. T-DNK koja nosi tandem kopije snažnog -502 do -222 bp SCBV transkripcionog pospešivača elementa aktivatora prouzrokuje nepravilnu ekspresiju prirodnih gena u blizini mesta integracije, čime, u nekim primerima, obezbeđuje nove crte koje je moguće identifikovati za biljke koje su regenerisane iz transformisanih tkiva. Moderne metode molekularne biologije su dostupne i olakšavaju izolaciju i identifikaciju ugroženih gena u blizini mesta akceptora, čime se obezbeđuju izolovani geni za dalje iskorišćavanje.

PRIMER 4

Agrobacterium- posredovana transformacija kukuruza

[0141] Ovaj primer opisuje generisanje Agrobacterium-posredovane transformacije kukuruza [0142] Proizvodnja nezrelog embriona Immature Embryo Production._ Semena iz B104 prirodne linije su u 15-litarske posude (saksije) koje sadrže Sunshine Custom Blend® 160 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA). Biljke su uzgajane u plasteniku korišćenjem kombinacije natrijum i metal halid lampi pod visokim pritiskom sa fotoperiodom od 16:8 sati svetlo:mrak. Da bi se dobili nezreli embrioni za transformaciju, izvedene su kontrolisana sib-oprašivanja (oprašivanje sa srodne biljke). Nezreli embrioni su izolovani 10 do 13 dana posle oprašivanja kada su embrioni bili približno 1,4 do 2,0 mm veličine.

[0143] Infekcija i kokultivacija. Kukuruzni klipovi su bili sterilisani na površini potapanjem u 50% komercijalno belilo sa Tween 20 (1 ili 2 kapi po 500 mL) tokom 10 minuta i triput isprano sa sterilnom vodom. Suspenzija Agrobacterium ćelija koje sadrže superbinarni vektorski kointegrantni plazmid je pripremljena prenošenjem 1 ili 2 petlje bakterija uzgajanih na YEP čvrstoj podlozi koja sadrži 50 mg/L Spektinomicina, 10 mg/L Rifampicina, i 50 mg/L Streptomicin na 28 °C tokom 3 dana ili 25 °C tokom 4 dana u 5 mL tečne infekcione podloge (MS soli, ISU modifikovani MS vitamini, 3,3 mg/L dikamba, 68,4 gm/L saharoze, 36 gm/L glukoze, 700 mg/L L prolina, pH 5.2) koji obuhvata 100 mM acetosiringon. Rastvor je pažljivo pipetom nanet gore i dole korišćenjem sterilne 5 mL pipete sve dok nije postignuta ravnomerna suspenzija, i koncentracija je podešena na optičku gustinu od 0,3 do 0,5 na 600 nm (OD600) korišćenjem merača gustine ćelije Ultrospec 10 Cell Density Meter (GE Healthcare/Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Nezreli embrioni su izolovani direktno u mikro cev centrifuge koja sadrži 2 mL medijuma infekcije. Medijum je uklonjen i zamenjen dva puta sa 1 do 2 mL sveže infekcione podloge, zatim je uklonjen i zamenjen sa 1,5 mL rastvora Agrobacterium. Agrobacterium i embrio rastvor je inkubiran tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi i zatim je prenet na medijum kokultivacije koji je sadržao MS soli, ISU modifikovane MS vitamine, 3,3 mg/L d kamba, 30 gm/L saharoze, 700 mg/L L-prolina, 100 mg/L mioinozitola, 100 mg/L enzimski hidrolizat kazeina, 15 mg/L AgNO3, 100 mM acetosiringona, i 2,3 do 3 gm/L Gelzan™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), na pH 5,8. Inkubacija kokultivacijom je bila 3 do 4 dana na 25 °C u uslovima pod bilo tamom ili 24 sata belog fluorescentnog svetla (približno 50 mEm-2s-1).

[0144] Odmaranje i selekcija. Posle kokultivacije, embrioni su preneti na neselekcioni MS baziran medijum za odmaranje koji sadrži MS soli, ISU modifikovane MS vitamine, 3,3 mg/L dikambu, 30 gm/L saharozu, 700 mg/L L-prolin, 100 mg/L mioinozitol, 100 mg/L enzimski hidrolizat kazeina, 15 mg/L AgNO3, 0.5 gm/L MES monohidrat (2-(N-morfolino)etanesulfonske kiseline; PhytoTechnologies Labr., Lenexa, KS), 250 mg/L Carbenicillin, i 2.3 gm/L Gelzan™, na pH 5,8. Inkubacija je nastavljena tokom 7 dana na 28 °C u uslovima bilo mraka ili 24-satnog belog fluorescentnog svetla (približno 50 mEm-2s-1). Posle 7 dana perioda odmora, embrioni su preneti na selektivni medijum. Za odabir transformisanih tkiva kukuruza sa superbinarnim plazmidom koji sadrži AAD1 selektibilni maker gen koji se izražava u biljkama, na MS zasnovan medijum odmaranja (gore u tekstu) je korišćen dopunjen sa Haloxyfop. Embrioni su prvo preneti na izabrani medijum koji sadrži 100 nM Haloxyfop i inkubirani tokom 1 do 2 nedelje, i zatim su preneti na 500 nM Haloxyfop i inkubirani tokom dodatne 2 do 4 nedelje. Transformisani izolati su dobijeni tokom približno 5 do 8 nedelja na 28 °C u uslovima bilo mraka ili 24-satnog belog fluorescentnog svetla (približno 50 mEm-2s-1). Oporavljeni izolati su u tako rasutom stanju preneti na sveć izabrani medijum u intervalima na 1 do 2 nedelje za regeneraciju i dalju analizu.

[0145] Stručnjak u ovoj oblasti transformacije kukuruza će razumeti da drugi postupci odabira transformisanih biljaka jesu dostupni kada se koriste druge biljke koje mogu da izražavaju marker gene koje je moguće izabrati (npr., geni tolerancije na herbicid).

[0146] Predregeneracija. Posle postupka odabira, kulture izložene režimu 24-satnog svetla su prenete na MS zasnovan predregeneracioni medijum koji sadrži MS soli, ISU modifikovane MS vitamine, 45 gm/L saharozu, 350 mg/L L prolina, 100 mg/L mio-inozitola, 50 mg/L enzimski hidrolizat kazeina, 1 mg/L AgNO3, 0,25 gm/L MES, 0,5 mg/L naftalensirćetne kiseline, 2.5 mg/L abscizinske kiseline, 1 mg/L 6-benzilaminopurina, 250 mg/L karbenicilina, 2.5 gm/L Gelzan™, i 500 nM Haloxyfop, na pH 5.8. Inkubacija je nastavljena tokom 7 dana na 28 °C u uslovima pod bilo mrakom ili 24-satnim belim fluorescentnim svetlom (približno 50 mEm-2s-1).

[0147] Regeneracija i izolacija mlade biljke. Za regeneraciju, kulture su prenete na MS zasnovan primarni medijum regeneracije koji sadrži MS soli, ISU modifikovane MS vitamine, 60 gm/L saharoze, 100 mg/L mioinozitola, 125 mg/L karbenicilina, 2,5 gm/L Gelzan™, i 500 nM Haloxyfop, na pH 5,8. Posle 2 nedelje na 28° u uslovima bilo mraka ili 24-satnog belog fluorescentnog svetla (približno 50 mEm-2s-1), tkiva su preneta na MS zasnovani sekundarni medijum regeneracije sastavljen od MS soli, ISU modifikovanih MS vitamina, 30 gm/L saharoze, 100 mg/L mioinozitola, 3 gm/L Gelzan™, na pH 5,8, sa, ili bez, 500 nM Haloxyfop. Regeneracija/selekcija je nastavljena tokom 2 nedelje na 28° u uslovima pod bilo 16-satnim ili 24-satnim belim fluorescentnim svetlom (približno 50 mEm-2s-1). Kada su mlade biljke dostigle 3 do 5 cm dužine, uklonjene su i prenete na sekundarni medijum regeneracije (kao gore, ali bez Haloxyfop) i inkubirane na 25° u uslovima pod 16-satnim belim fluorescentnim svetlom (približno 50 mEm-2s-1) da se dozvoli dalji rast i razvoj mladica i korenja.

[0148] Proizvodnja semena. Biljke su prenete na Metro-Mix® 360 medijum za rast bez zemlje (Sun Gro Horticulture) i stvrdnut je u prostoriji za rast. Biljke su zatim prenete u Sunshine Custom Blend 160 mešavinu zemljišta i uzgajane do cvetanja u plasteniku. Sprovedeno je kontrolisano oprašivanje za proizvodnju semena.

PRIMER 5

Aktivnost SCBV pospešivača u stabilno transformisanim ćelijama kukuruza

[0149] Genomska DNK je izolovana (Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit; Qiagen, Germantown, Maryland) iz deset T0 biljaka regenerisanih iz transformisanih B104 nezrelih embriona, i genomskih lokacija integrisanih T-DNK prenetih iz pSB1::pEPP1088 su određene inverznim PCR kloniranjem i DNK sekvenciranje inverznom PCR pojačanim proizvodima. Identiteti gena predstavljenih prirubnim kodirajućim regionima pozicioniranim unutar 10 kb 4xSCBV pospešivača su određeni putem BLAST pretraga (Altschul i saradnici, J. Mol. Biol., 215: 403-410, i Karlin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990) korišćenje bočnih sekvenci kao traženih sekvenci. Analize BLAST rezultata su otkrile da T-DNK, i otuda 4XSCBV pospešivači, su integrisani na različitoj genomskoj lokaciji u svakom od 10 linija, i samim tim su 4XSCBV pospešivači prirubljeni različitim genima u svakoj liniji (tabela 1).

[0150] Ukupna RNK je izolovana (Qiagen RNeasy® Plant Mini Kit, Qiagen, Germantown, Maryland) iz tkiva lista deset T0linija. Akumulacija transkripta identifikovanih bočnih gena je upoređena između odgovarajućih T0biljaka i netransformisanih kontrolnih biljaka reverznom transkripcijom i RT-PCR (PCR u realnom vremenu), korišćenjem početnica specifičnih za relevantne prirubne gene 4XSCBV pospešivača. Kao kontrola, akumulacija transkripta za endogeni GAPDH gen je takođe određena.

[0151] RT-PCR proizvodi su otkrili povećano nagomilavanje transkripta koji potiču iz tri različita bočna gena u ovim linijama. Proveriti da li ima prirubnih umesto bočnih 4XSCBV pospešivača su smešteni 2,6 kb i 2,8 kb uzvodno od ugroženih prirubnih gena u dve od T0linija, i 478 bp nizvodno od ugroženih prirubnih gena u trećoj T0 liniji. Tako, ovi rezultati ukazuju da 4XSCBV pospešivači koji su dobijeni pomoću T-DNK, prouzrokuju povećanu, od lanca nezavisnu, akumulaciju transkripata gena u blizini mesta integracije. Tabela 1 označava da su prirubni geni identifikovani i da su rezultati analiza njihovih nivoa transkripcije.

Tabela 1. Dejstvo 4XSCBV pospešivača na RNK nagomilavanje prirubnih gena za 10 T0 biljaka.

[0152] Stručnjak u oblasti genetike kukuruza i molekularne biologije biljke će shvatiti da, zavisno od prirode pogođenih gena, povećana ekspresija susednih gena jeste indukovana pomoću 4XSCBV pospešivača će u nekim slučajevima dati transgenskoj biljci nove i vredne crte. Kolektivno, biljke koje imaju 4XSCBV pospešivače predstavljaju ZeaTAG označenu populaciju. Crte mogu da budu rezultati povećanog nagomilavanja kodiranog proteina ugroženog gena per se, kao na primer, povećana akumulacija nutritivno poželjnog proteina u semenu, ili rezultat nizvodnog dejstva pri čemu proizvod gena neposredno ugroženog gena kontroliše ekspresiju jednog ili više drugih gena (kao u slučaju, na primer, transkripcionog aktivatornih/represornih gena). Nasumična priroda mesta integracije uvedenih T-DNK, spojena sa standardnim postupcima uzgoja biljke, može da bude korišćena da se uspostave velike populacije biljaka koje obuhvataju biblioteku biljaka koje nose T-DNK a imaju elemente aktivatora pozicionirane unutar delotvornog rastojanja svih ili većine gena unutar genomu kukuruza, i time se obezbeđuje mogućnost za sve ili većinu gena kukuruza da budu transkripciono aktivirani.

[0153] Provera i izbor za fenotipove na nivou biljke je od ekonomskog značaja je moguć pod komorom rasta, plastenikom, ili u polju. Kako je ovde prikazano, metode molekularne biologije kao što je inverzna PCR, omogućavaju izolaciju integrisane T-DNK i začajne dužine genomske DNK prirubne integrisanoj T-DNK iz biljaka koje ispoljavaju poželjni fenotip. Pored toga, postupci kao što su tehnike šetanja genoma dozvoljavaju određivanje još širih regiona genomske DNK sekvence, čime se omogućava identifikacija gena prisutnih u blizini uvedenih elemenata aktivatora. Metode sa visokim učinkom kao što je analiza mikroniza i analitičke metode specifičnije za gen omogućavaju identifikaciju i kvantifikaciju ugroženih nivoa transkripta. Geni kandidati uključeni u relevantne agronomske crte mogu tako identifikovani, izolovani, i dalje karakterizovani i iskorišćeni da obezbede nove i dragocene vrednosti useva.

[0154] Suprotno, nova crta može da bude rezultat prekida funkcije gena kukuruza usled integracije T-DNK koja ima 4XSCBV pospešivače u kodirajući region ili regulatorne regione ekspresije gena kukuruza. Ako je to slučaj, T-DNK ima 4XSCBV pospešivače i okolne genomske regione koji mogu da budu izolovani i dalje karakterisani.

PRIMER 6

Genetska provera i izbor unapred ZeaTAG populacije

[0155] Ovaj primer opisuje genetsku proveru i izbor unapred za populaciju ZeaTAG za pronalaženje promenjenih fenotipova.

Provera i izbor na stres od suše

[0156] Da bi se identifikovale ZeaTAG linije koje sadrže mutacije koje pokazuju toleranciju suše, biljke iz pjedinačnih ZeaTAG rezultata posađene su u otvorenom polju. Voda je zadržana da se prouzrokuje stres u obliku suše tokom reproduktivne faze ciklusa rasta; grubo 2 nedelje pre cvetanja do približno 2 nedelje posle cvetanja. Cilj je da se postignu 4 nedelje perioda stresa u fazi cvetanja. Oblikovanje okoline se koristi da se predvidi precizna potreba evapotranspiracije kukuruza na osnovu nadziranja vlažnosti zemljišta i podataka vremenske prognoze (temperatura vazduha, nedostatak pritiska isparavanja, brzina vetra, i neto zračenje). Biljke se nadgledaju u pogledu simptoma suše kao što je savijanje lista vizuelnim pregledanjem, povećana temperatura lista infracrvenim termometrima, smanjena fotosinteza putem fluorescencije hlorofila i smanjeni prinos merenjem proizvodnje useva. Biljke koje pokazuju značajno manje uvijanje lista, nižu temperaturu lista, veće brzine fotosinteze ili imaju značajno veći prinos pri uslovima stresa sa vodom su prepoznate i korišćene u dole prikazanim proverama.

[0157] ZeaTAG rezultati prikazuju značajno manju toleranciju na sušu, posađene su u replikovano ogledno polje da bi se potvrdio fenotip tolerantan na sušu. Ovi rezultati su posađeni u konstrukciji bloka nasumično podeljenoj sa barem 3 replikacije. Jedan blok je napajan vodom dovoljnom da se spreči stres izazvan vodom. Drugi blok raste u uslovima nedovoljne vode kako je opisano gore. Biljke se nadgledaju za uvijanje lista, povećanu temperaturu lista, smanjenu fotosintezu i smanjeni prinos kako je gore opisano. Za biljke sa značajno manjim uvijanjem lista, nižom temperaturom lista, većom fotosintezom ili većim prinosom od netransformisanih kontrolnih biljaka su, smatra se, prošle sekundarnu proveru i odabir.

Provera i odabir efikasnosti upotrebe azota

[0158] Da bi se identifikovali ZeaTAG rezultati sa većom efikasnošću upotrebe azota nego kod netransgenskih kontrolnih biljaka, izvodi se primarna analiza provere i izbora. Biljke koje sadrže približno 40.000 ZeaTAG sa rezultata su uzgajane u polju u uslovima nedovoljnog azota. Biljke su rasle u poljima sa manje od 35 lbs (15,87 kg) azota po akeru (oko 40,46 ari) biljke su nadgledane na hlorozu (žutica kod biljaka) u vizuelnom proverom, povećana temperatura lista infracrvenim termometrima, i smanjeni prinos žetvom useva. Ovi parametri su upoređeni sa netransgenim kontrolnim biljkama. ZeaTAG linije su pokazivale manju hlorozu, manju temperaturu lista, veće brzine fotosinteze ili veće prinose nego netransgenske kontrolne linije su procenjene tokom sekundarnih provera.

[0159] Kao sekundarna provera, ZeaTAG rezultati koji su pokazali značajno veću efikasnost uptorebe azota su posađeni u replikovano ogledno polje da bi se potvrdio fenotip. Ovi rezultati su posađeni u konstrukciji bloka nasumično podeljenoj sa barem 3 replikacije. Jedan blok je napajan vodom sa dovoljnom količinom veštačkog azotnog đubriva da se spreči stres izazvan azotom. Drugi blok raste u uslovima nedovoljnog azota kako je opisano gore u tekstu. Biljke se nadgledaju za hlorozu vizuelnom proverom, povećanu temperaturu lista infracrvenim termometrima, i smanjeni prinos u vidu žetve useva. Biljke sa značajno manjom hlorozom, nižom temperaturom lista, većom fotosintezom ili većim prinosom nego što su netransformisane kontrolne biljke se smatra da su prošle sekundarnu proveru.

[0160] Pošto se potvrdi fenotip u sekundarnoj proveri, taj fenotip se testira za genetsku povezanost sa ZeaTAG umetkom proverom potomaka ukrštanja između netransformisane roditeljske linije i ZeaTAG linije. Kada biljke koje sadrže ZeaTAG element prikažu fenotip i biljke koje ne sadrže ZeaTAG element ne prikažu, taj fenotip se smatra genetski povezanim sa umetkom i da će verovatno da bude prouzrokovan ZeaTAG elementom. Da bi se identifikovali geni čija ekspresija može da bude pod uticajem ZeaTAG elementa, lokacija ZeaTAG elementa unutar genoma je određena.

[0161] Genomska lokacija ZeaTAG elementa je određena izolovanjem genomskih sekvenci na obodu ZeaTAG elementa i poređenje ovih sekvenci sa genomskom sekvencom kukuruza. Sekvence koje subočno susedne ZeaTAG elementu mogu da budu određene izvesnim brojem tehnika molekularne biologije, uključujući ali ne ograničavajući se na, inverznu PCR (iPCR) (Ochman i saradnic, Genetics, 120: 621-6231988), TAIL (Liu i saradnici, Plant Journal 8: 457-463, 1995) i ligacijom posredovana PCR (LMPCR) Prod’hom i saradnici, FEMS Microbiol Lett.158: 75-81, 1998). Ove sekvence se porede sa genomskim sekvencama pomoću alata poravnavanja sekvence kao što je BLAST da bi se odredila lokacija ZeaTAG elementa unutar tog genoma.

[0162] Geni koji su bočno susedni ili koji su prekinuti ZeaTAG elementom su određeni ispitivanjem označenog genoma. Transkripcija gena prirubnih ZeaTAG elementu može biti odgovorna za fenotip mutanta. Ovi geni mogu biti prekomerno izraženi u kukuruzu divljeg tipa da se testira da li mogu da daju sličan fenotip. Da bi se ovo testiralo, geni su klonirani u vektore transformacije pogonjeni jakim promoterima ili njihovim sopstevnim promoterom sa sekvencama pospešivača koje su im prirubne da se pospeši transkripcija. Ovi vektori su uvedeni u kukuruz divljeg tipa transformacijom i biljke nastale iz ove transformacije su testirane za taj fenotip.

[0163] Slično, geni prekinuti ZeaTAG elementom mogu da prouzrokuju taj fenotip. Da bi se potvrdilo da je neki gen prekinut tim elementom koji je odgovoran za taj fenotip, ekspresija gena može da bude ometeno i biljke koje sadrže ovaj prekdi mogu da budu testirane za taj fenotip. Prekid ekspresije specifičnih gena može biti izveden izvesnim brojem postupaka poznatim stručnjaku u ovoj oblasti uključujući ali ne ograničavajući se na antisens RNK, veštačke mikro RNK i identifikovanje mutacija u genu postupkom ciljanja indukovanih lokalnih lezija u genomu poznatom kao TILLING.

PRIMER 7

Reverzna genetska provera i odabir ZeaTAG populacije

[0164] Ovaj primer opisuje reverznu genetsku proveru i odabir ZeaTAG populacije za mutacije.

[0165] Reverzna genetska provera i odabir traže mutacije koje utiču na specifične gene i naknadno testiranje identifikovane linije za fenotip mutanta. ZeaTAG populacija može da bude korišćena u reverznoj genetskoj analizi na nekoliko načina uključujući ali ne ograničavajući se na generisanje zbirke oznaka bočnih sekvenci za tu populaciju (Jeong i saradnici, The Plant Journal 45: 123-132, 2006) i generisanje indeksirane zbirke grupnih uzoraka DNK iz ZeaTAG populacije (May i saradnici, Molecular Biotechnology 20: 209-221, 2002).

[0166] Zbirka oznaka bočno susednih sekvenci je generisana uzorkovanjem levog tkiva iz ZeaTAG populacije, izolovanje DNK iz svake, identifikacija sekvenci prirubnih umetku i skladištenje sekvenci u pretraživoj bazi podataka gde su sekvence povezane na rezultate (slučajeve) iz kojih dolaze. Genomska DNK je izolovana korišćenjem DNK lakog kompleta za biljke Qiagen DNAeasy Plant Kit (Qiagen, Germantown, Maryland) korišćenjem protokola preporučenog od strane proizvođača. Sekvence koje su bočno susedne umetku su identifikovane korišćenjem ligacijom posredovane PCR (Mueller i saradnici, Science 246: 780-786, 1989) u modifikaciji koju su dali Yephremov (Jefremov) i Saedler (Sadler) (Plant Journal 21: 295-305, 2000). Ukratko, genomska DNK iz ZeaTAG linije je restrikcionim razlaganjem fragmentisan i denaturisan enzim. Biotinilisana oligonukleotidna početnica komplementarna sekvenci na kraju ZeaTAG elementa je hibridizovana sa fragmentovanim DNK i produžena DNK polimerazom. Streptavidinom obložene magnetne perlice su dodate u mešavinu da vežu DNK fragmente koji obuhvataju DNK fragmente produžene iz ove početnice. Dvolančani adapter DNK poznate sekvence se lizira do nepoznatog kraja. Ovi fragmenti su PCR pojačani korišćenjem oligonukleotida komplementarno sekvencama unutar ZeaTAG elementa i DNK adaptera na drugom kraju. Sekvenca PCR fragmenta je zatim određena i mapirana do genomske sekvence kukuruza pomoću BLAST. Ove sekvence lociraju mesto umetka ZeaTAG elementa. Geni unutar ∼10 kbp mogu da budu uzvodno regulisane sekvencama pospešivača unutar ZeaTAG elementa.

[0167] Biljke koje sadrže umetke u ili blizu gena za koje se pretpostavlja da prouzrokuje fenotip mogu da bude identifikovane pretragom baze podataka. Biljke koje sadrže ove rezultate mogu da budu testirane za fenotip.

[0168] U svetlu brojnih mogućih izvođenja na koja se principi opisani u ovom pronalasku mogu primeniti, treba da budu prepoznati da su ilustrovana izvođenja samo preporučeni primeri ovog pronalaska i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće obimom pronalaska. Više od bilo čega drugog, obim ovog pronalaska se definiše putem sledećih patentnih zahteva.

SPISAK SEKVENCI

[0169]

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Regulatorni region himerne transkripcije obuhvata:

jednu ili više kopija elementa pospešivača bacilliform firusa šećerne repe (SCBV) prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1, ili njegov homolog koji ima barem 90% identičnosti sa pozicijom 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1; ifunkcionalno je povezan na njega, heterologni promoter koji obuhvata mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto pokretanja iRNK,pri čemu kada je sekvenca nukleotida od interesa transkribovana pod regulatornom kontrolom regulatornog regiona himerne transkripcije, količina proizvoda transkripcije je povećana u poređenju sa količinom proizvoda transkripcije dobijenog sa regulatornim regionom himerne transkripcije koja obuhvata promoter i ne obuhvata sekvencu(e) pospešivača SCBV.

2. Regulatorni region himerne transkripcije iz patentnog zahteva 1, pri čemu je promoter dobijen iz uzvodnog regiona gena virusa biljke, bakterijskog gena, gena gljivice, nuklearnog gena biljke, ekstra nuklearnog gena biljke, gena beskičmenjaka, ili gena kičmenjaka.

3. Konstrukt koji obuhvata regulatorni region transkripcije iz patentnog zahteva 1 funkcionalno povezan na molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati funkcionalno povezan na 3' molekul polinukleotida završetka transkripcije.

4. Konstrukt iz patentnog zahteva 3, pri čemu pomenuti molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati daje agronomsko svojstvo biljci u kojoj je izražen.

5. Transgenska biljka je stabilno transformisana sa konstruktom iz patentnog zahteva 3, ili biljna ćelija ili tkivo transformisano sa konstruktom iz patentnog zahteva 3.

6. Transgenska biljka iz patentnog zahteva 5, pri čemu taj molekul polinukleotida koji je moguće transkribovati daje agronomsko svojstvo biljci u kojoj je izražen.

7. Seme transgenske biljke iz patentnog zahteva 5, pri čemu to seme obuhvata taj konstrukt.

8. Transgenska biljka iz patentnog zahteva 5, pri čemu je ta biljka biljka kukuruza.

9. Ćelija transgenske biljke koja obuhvata regulatorni region himerne transkripcije iz patentnog zahteva 1.

10. Postupak proizvodnje transgenske biljke koji obuhvata transformisanje ćelije biljke ili tkiva sa konstruktom iz patentnog zahteva 3.

11. Postupak iz patentnog zahteva 10, pri čemu je ta transgenska biljka dikotiledon, ili monokotiledon.

12. Biljna ćelija ili tkivo iz patentnog zahteva 5, pri čemu ta biljna ćelija ili tkivo jeste iz dikotiledona, ili monokotiledona.

13. Biljna ćelija, plod, list, koren, izdanak, cvet, seme, izrezak i drugi reproduktivni materijal koristan za seksualno ili aseksualno razmnožavanje, progenih biljaka uključujući F1 hibride, muške sterilne biljke i sve druge biljke i biljne proizvode koje je moguće izvesti iz transgenske biljke iz patentnog zahteva 6, pri čemu je ćelija biljke, plod, list, koren, izdanak, cvet, seme, izrezak i drugi reproduktivni materijal koristan za seksualno ili aseksualno razmnožavanje, progene biljke uključujući F1 hibride, muške sterilne biljke i sve druge biljke i biljne proizvode obuhvataju konstrukt iz patentnog zahteva 3.

14. Ćelija biljke kukuruza, tkivo biljke kukuruza ili biljka kukuruza sa regulatornim regionom himerne transkripcije sa jednom ili više kopija elementa pospešivača bacilliform firusa šećerne repe (SCBV) prikazanog na poziciji 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1, ili njegov homolog koji ima barem 90% identičnosti sa pozicijom 337 do pozicije 618 SEK ID BR: 1; i funkcionalno povezan na njega heterologni promoter koji obuhvata mesto vezivanja polimeraze RNK i mesto pokretanja iRNK, gde je regulatorni region himerne transkripcije umetnut u genom ćelije biljke kukuruza, tkivo biljke kukuruza ili biljku kukuruza na proizvoljnoj lokaciji.

15. Ćelija, biljke kukuruza, tkivo biljke kukuruza ili biljka kukuruza iz patentnog zahteva 14, pri čemu SCBV pospešivač učestvuje u pospešenoj transkripciji sekvence nukleotida koja je predmet interesovanja koja je pod regulatornom kontrolom SCBV pospešivača u poređenju sa transkripcijom sekvence nukleotida koja je predmet interesovanja u odsustvu SCBV pospešivača.