JP3209744B2 - 結実能力のある遺伝子変換コーン - Google Patents

結実能力のある遺伝子変換コーン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Zea mays種の繁殖力のあるトランスジェ
ニック植物（この中で、メイズもしくはコーンというこ
とが多い）に関連するものである。
本発明はさらに、粒子砲撃法及びその後の選択技術に
よる、繁殖力のあるトランスジェニック植物の生産と関
連するものである。
発明の背景 遺伝物質（通常はDNAまたはRNAの型）の分離及び操
作、ならびにその後、その遺伝物質を植物もしくは植物
細胞に導入することを必要とする植物の遺伝子工学は、
最新の農業及び植物の品質改良に少なからぬ将来性を約
束する。穀物価値の上昇、高収量、飼料価値、生産原価
の低減、害虫抵抗性、ストレス耐性、干ばつ抵抗性、医
薬品、科学物質及び生物学的分子の生産、ならびにその
他の有益な特色も、遺伝子工学テクニックによってなし
遂げられる可能性がある。遺伝子が同定され、クローン
化され、さらに巧みに処理されても、結果として生じる
植物が結実能力を有するとともに、その子孫に遺伝子を
伝える様な方法で、それを関連植物に導入することがや
はり必要である。
DNAを用いて様々な植物及び植物細胞を形質転換する
ため、種々の方法が開発されており現在利用することが
できる。一般に、このような植物は双子葉植物である
が、ある種の単子葉植物の穀類を用いた幾つかの成功例
が報告されている。しかし一部の種は、これまではどの
様な方法を用いても、形質転換できなかった。このよう
に、本発明以前は、導入された組み換えDNAが最低１回
の完全な性周期を通して伝達される、しっかりと形質転
換されたZea mays植物の生産を可能にする科学技術は
何も開発されていなかった。本技術におけるこの不首尾
は、文献に十分に記録されており、最近の総説で数多く
検討されている。（I.Potrykus,Trends in Biotechnolo
g（生物工学の動向）,7,269（1989）、K.Weizingら、An
n.Rev.of Genetics,22,421（1988）、F.Cookingら、Sci
ence,236,1259（1987）。
DNAをコーン細胞に導入するために試みた、あるいは
計画したテクニックの中には、エレクトロポレーショ
ン、微量注射法、微小投射物砲撃法、リポソーム融合、
アグロバクテリウム属介在トランスファー、大量注射
法、及び溶液中でむきだしのDNAに暴露する方法などが
ある。
例えば、J.Dewetら、Experimental Manipulation of
Ovule Tissue（胚珠組織の実験操作）、G.Chapmanら
編、ニューヨークLongman社（1985）、197−269ページ
及び、Y.Ohta、PNAS USA,83,715（1986）は、花粉粒とD
NA溶液を混合した後、この花粉をメイズの毛に塗ること
によりDNAをメイズに導入する方法を報告した。これら
の論文には、外因性DNAがコーン細胞に導入されたこと
を確認する分子のデータが皆無である。
Arntzenらは、公告した欧州特許出願第275,096号に、
DNAとメイズの花粉をインキュベートした後、メイズ雌
穂を受粉し、種子を作ったと記述している。この種子を
起源とする植物は導入されたDNAを含有すると報告され
たが、導入されたDNAが完全な性周期を通して伝達され
ることを示唆するものは何も無い。
A.GravesらはPlant Mol.Biol.３,43（1986）に、Zea
Mays種苗のアグロバクテリウム属介在形質転換間を報告
した。その証拠は、時に信頼できないこともある検定方
法に基づいていた。今までのところ、花粉及びアグロバ
クテリウム属介在トランスファー技法で成功した例は、
それ以上何も報告されていない。
形質転換コーン細胞を生じるための最小投射物砲撃法
が報告されている。本技法は、SanfordらのPart.Sci.＆
Techn.,５,27（1987）及び、1988年２月29日に提出し
た合衆国出願番号07/151,807に基づいてJ.C.Sanfordら
の公告した欧州特許出願第331,855号で開示されてい
る。
Kleinらは、Plant Physiol.,91,440（1989）に、微小
投射物砲撃法を用いた形質転換コーン細胞の生産を記述
している。しかし、使用した細胞は植物に再生すること
ができなかった。したがって、何らかの種類の再生でき
るメイズ細胞の培養に、砲撃法によってDNAを導入した
ことを記述しているプロトコールは何一つ発表されてい
ない。安定した遺伝子の導入で、メイズカルス砲撃法の
後、結実可能な植物の再生及び最低１回の性周期を通し
て導入した遺伝子の伝達により生じる結果を報告してい
るものは皆無である。
D.McCabeら、公告した欧州特許出願第270,356号で、D
NAによるメイズ花粉の砲撃法、その花粉をメイズの毛に
塗ること、ならびに伝えるところによれば外因性DNAを
含有している種子の形成を開示している。しかし、完全
な性周期を通してDNAが伝達される証拠は皆無で、この
研究グループによるそれ以上の結果は報告されていな
い。
M.E.Prommらは、Nature,319 791（1986）で、コーン
原形質体のエレクトロポレーションの結果、形質転換細
胞を生じると、報告しているが、この細胞では再生植物
はできなかった。コーン原形質体のエレクトロポレーシ
ョンは、C.Rhodesらにより、Science,240,204（1988）
にも報告されている。後者の場合、レシピーエント細胞
が伝達され、植物に再生され得るが、植物自身は結実し
ない。加えて、Rhodesらが使用した細胞株の生産方法
は、再現性が無かった。
繁殖力のあるトランスジェニックメイズ植物を首尾よ
く生産することによって、その他に障害となるものは、
形質転換細胞の再生能力（原形質体もしくは培養細胞の
場合）も結実能力も破壊されない様な方法では、ほんの
僅かな形質転換細胞しか選択されていなかったことにあ
る。一般に低水準の形質転換細胞が形質転換技法によっ
て生産されるため、ある種の選択手順が必要になる場合
が多い。しかし、選択には一般にいくらか有毒な薬剤、
例えば、再生能力あるいは結果として生じる植物の結実
能力のどちらかに有害と思われる除草薬や抗生物質を使
用することが必要である。
一方、形質転換していないコーン細胞の原形質体、及
びカルスは、少なくとも再生して成熟した植物を形成す
ること、また結果として生じた植物はしばしば結実能力
を有することが判明している。例えば、R.D.Shilliteら
はBio/Technology,７,581（1989）で、またL.M.Prioli
らはBio/Technology,７,589（1989）で、細胞培養から
原形質体を生産する方法ならびに、それから結実能力の
ある植物を回収する方法を検討している。C.A.Rhodesら
は、Bio/Technology,５,56（1988）に、胚形成のメイズ
細胞培養から分離した原形質体から、メイズ植物を再生
する試みを発表している。
しかし、外因性DNAにとって、どのメイズ組織あるい
は培養組織が適切なレシピーエントであるか、例えば外
因性DNAを受入れやすく、また安全に統合し、しかも同
時に、胚芽株の一部、即ち次の植物世代に導く細胞直線
の一部である細胞、を有効数含有しているかを、技術研
究者は決定することができなかった。
このように、本技術はジレンマに直面している。ま
た、ある形質転換技法は、メイズの形質転換細胞を生産
することが計画もしくは報告されており、ある細胞及び
組織は植物再生能力があるため、レシピーエントの可能
性があると提唱されてきたが、この技術では、１回の完
全な性周期を通して導入されたDNAを伝達することがで
きるメイズの形質転換植物を首尾よく生産するテクニッ
クの組合せを発見できなかった。
それゆえ、結実能力のある、安定したトランスジェニ
ック、Zea mays植物及び導入された遺伝子を子孫に伝達
する種子を生産することが本発明の目的である。また砲
撃法及び形質転換細胞の少なくとも一部については、高
水準の生育能力を生じる選択処理により、安定したトラ
ンスジェニック植物及び種子を生産することも本発明の
目的である。メイズ以外にも、他のイネ科の穀類の繁殖
力のある、安定したトランスジェニック植物を生産する
ことも本発明の目的である。
引用文献 以下に列挙した参考文献は、この中に組込まれてい
る。
Armstrong.CL,ら（1985）164:207−214 Callis,J,ら（1987）Genes＆Develop１:1183−1200 M.Bevanら（1983）Nuc Acids Res11:36a Chu,CC.ら（1975）Sci Sin（北京）18:659−668 Cooking,F.ら（1987）Science236:1259−1262 DeWetら（1985）Proc Natl Sci USA82:7870−7873 Freeling,JC,ら（1976）Maydica XXI:97−112 Graves,A,ら（1986）Plant Mol Biol７:43−50 Green,C,ら（1975）Crop Sci15:417−421 Green,C,ら（1982）Maize for Biological Research
（生物学的調査のためのメイズ）、Plant Mol.Biol.Ass
oc.,pp367−372 Gritz,L,ら（1983）Gene25:179−188 Guilley,H,ら（1982）Cell30:763−773 Hallauer,AR,ら（1988）Corn and Corn improvement
（コーン及びコーンの改良）、第３版、Agronomy Socie
ty of America,pp469−564 Jefferson,R,ら（1987）EMBO J６:3901−3907 Kamo,K,ら（1985）Bot Gaz146:327−334 Klein,T,ら（1989）Plant Physiol91:440−444 Klein,T,ら（1988a）Proc Natl Acad Sci USA85:4305−
９ Klein,T,ら（1988b）Bio/Technology６:559−563 Lu,C,ら（1982）Theor Appl Genet62:109−112 McCabe,D,ら（1988）Bio/Technology６:923−926 Murashige,T,ら（1962）Physiol Plant15:473−497 Neuffer,M,（1982）Maize for Biological Research
（生物学的調査のためのメイズ）、Plant Mol.Biol.Ass
oc.,pp19−30 Phillips,R,ら（1988）Corn and Corn improvement（コ
ーン及びコーンの改良）、第３版、Agronomy Society o
f America,pp345−387 Potrykus,I（1989）Trends in Biotechnology（生物工
学の動向）７:269−273 Rhodes,Ca,ら（1988）Science240:240−７ Sambrook,J.ら（1989）Molecular Cloning:A Laborator
y Manual（分子クローニング；実験室マニュアル）、第
２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press Sanford,J,ら（1987）Part Sci ＆ Techn５:27−37 Weising,K,ら（1988）Ann Rev of Genetics22:421−478 Yanisch−Perron,L,ら（1985）Gene33:109−119 発明の要約 本発明は、その子孫に受け継がれる組み換えDNAを含
む、繁殖力のあるトランスジェニックZea mays植物に
関連するもので、染色体に統合された組み換えDNAが望
ましい。
本発明はさらに、トランスジェニックZea mays植物、
植物細胞、植物の一部、ならびに種子から得られる全て
の生産物に関連するものである。
本発明はまた、組み換えDNAを含有する種子、ならび
にその組み換えDNAを受け継いだ子孫に関連するもので
ある。本発明はさらに、トランスジェニック植物の品質
改良ならびに、その後、組み換えDNAをZea mays植物も
しくは系統に組み込むことに関連するものである。
本発明はまた、組み換えDNAを含有する、結実能力の
ある、Zea maysトランスジェニック植物の生産過程に関
連するものである。その過程は、微小投射物砲撃法、選
択、植物再生、ならびに従来の戻し交雑法に基づくもの
である。
本発明はさらに、エレクトロポレーション、アグロバ
クテリウム属、注射法ならびに以前の弾道学的方法の様
な定型の方法で確実に形質転換されていないZea mays以
外のイネ科の、結実能力のある形質転換植物を生産する
過程に関連するものである。
本発明はまた、形質転換胚形成組織、それから生産さ
れたトランスジェニック種子ならびに、RI及びその後の
世代から得られた、結実能力のある成熟メイズ植物再生
に関連するものである。
本発明の望ましい実施態様は、種子貯蔵蛋白、例えば
10kDのゼイン蛋白として発現する組み換えキメラ遺伝子
で、少なくとも１個のアミノ酸濃度が、親の非形質転換
株に存在している以上に上昇するように、しっかりと形
質転換された、結実能力のあるトランスジェニックコー
ン植物である。上述の遺伝子の多様なコピーの発現もし
くはその過剰発現は、リジン、メチオニン、スレオニン
などの、ある一定のアミノ酸の仁全体の濃度を実質的に
上昇させる。この中で使用する、“実質的に上昇した”
という表現は、ある特定のアミノ酸が、上述の種子貯蔵
蛋白遺伝子が形質転換されていない対応する植物もしく
は植物の一部に存在しているより、10−20％多いことを
意味する。
望ましい実施態様では、本発明は組み換えDNAでコー
ティングした、砕けやすい胚形成カルス凝集塊の微小投
射物砲撃法の後で、形質転換カルス株を選択するための
コントロールした方法を用いて、結実能力のある、遺伝
子変換植物を生産する。
図面に関する簡単な記述 図1Aは、実施例Ｉに使用したプラスミドベクターpHYG
I 1の地図を表している。
図1Bは、HPTコーティング配列及び関連調節成分を包
含する直線化したpHYG I 1の関連部分を表している。こ
の塩基対番号は、指示された制限酵素の認識配列の５′
ヌクレオチドから出発し、CaMV 35Sプロモーターの
５′末端のEcoR I部位で始っている。
図2Aは、実施例Ｉで使用したプラスミドベクターpB I
I 221の地図を表している。図2Bは、直線化したpB II 2
21、例えばHind III開裂部位からEcoR I開裂部位までを
描いている。
図３は、PH1カルス株及び非形質転換のコントロール
カルス株から分離したDNAのサザンブロット法及び、検
定に使用したpHYG I 1プローブの図解である。
図４は、PH1及び非形質転換カルスから再生したRO植
物から分離した葉のDNAのサザンブロット法及び、検定
に使用したpHYG I 1プローブの図解である。
図５は、PH1 RO植物の子孫及び非形質転換RO植物か
ら分離した葉のDNAのサザンブロット法及び、検定に使
用したpHYG I 1プローブの図解である。
図６は、PH2カルス株及び非形質転換のコントロール
カルス株から分離したDNAのサザンブロット法及び、検
定に使用したpHYG I 1プローブの図解である。
図7Aは、実施例IIに使用したプラスミドベクターpZ27
Z10の地図を表している。図7Bは、z10コーティング配列
及び関連調節成分を包含する、直線化したプラスミドpZ
27Z10を表している。
図８は、キメラz27−z10遺伝子内のPCRプライマーの
位置の図解である。
望ましい実施態様に関する記述 本発明はZea mays種の、繁殖力のあるトランスジェニ
ック植物及び種子を生産すること及びトランスジェニッ
ク植物などから得られる植物、植物組織及び種子、なら
びにその後の子孫及びそれから得れれる生産物を目指す
もので、食料あるいは飼料価値が改良されたトランスジ
ェニックZea mays植物が望ましい。ここで生産されるト
ランスジェニック植物には、フィールドコーン、ポップ
コーン、スイートコーン、フリントコーン及びデントコ
ーンを含め、この種の全植物が含まれる。
“トランスジェニック”には、全細胞、細胞株、カル
ス、組織、植物の一部もしくは植物、組み換えDNAの存
在により部分的に変えられた遺伝子型が含まれ、そのDN
Aは、遺伝子工学の技術で“異種DNA",“外因性DNA",あ
るいは“外来DNA"として言及されており、ここで該当す
るDNAは遺伝子工学処理により遺伝子型に導入される
か、或いはそのような処理で最初に親植物の遺伝子型に
導入されたもので、その後有性交配もしくは無性生殖に
よって後の世代にトランスファーされる。ここで使用す
る“遺伝子型”は、細胞内、狭くは染色体あるいは染色
体外、の遺伝物質の統計のことを言う。従って、ここで
使用する“トランスジェニック”は、従来の植物品種改
良法もしくは無作為交配量産化、ウィルス乾癬もしくは
自然発生突然変異のような自然に起きる事象によるZea
maysの遺伝子型の一部変更を認めない。
“遺伝可能な”は、最低１回の完全な有性サイクルを
介してDNAが伝達されること、即ち１つの植物からその
生殖子を通して子孫植物に伝えられることを意味する。
本発明のトランスジェニック植物は、下記の方法で生
産することができる。（ｉ）再生可能な細胞培養を確立
すること。砕けやすい胚形成カルスが望ましい。（ii）
微小投射物砲撃法で上述の細胞培養を形質転換するこ
と。（iii）形質転換細胞を同定もしくは選択するこ
と。（iv）形質転換細胞から結実能力があるトランスジ
ェニック植物を再生すること。組み換えDNAを含有する
トランスジェニックのエリート株及び変種、あるいは市
販用交雑種種子を開発するために、本発明の植物の一部
は、従来の交配育種法を使用して、結実能力のあるトラ
ンスジェニック植物からトランスジェニック種子を生産
することもできる。
I.植物株及び組織培養 この中で、結実能力があるトランスジェニックメイズ
植物の生産に特に有用なことが判明している細胞は、以
下に詳述する選択方法にかける前にも後にも、再生でき
るカルス細胞である。一般に、このような細胞はまだ最
後に分化していない細胞を含有する分裂組織から得られ
る。一般にイネ科穀類、特にメイズのこの様な組織に
は、若葉の根元部分、未熟な雄穂、未熟な胚、ならびに
子葉鞘節に見られる組織を含める。未熟な胚を子葉する
ことが望ましい。このような組織及び植物型からカルス
を調製もしくは維持する方法は、本技術では周知であ
り、これに関する詳細はPhillipsら（1988）の文献で入
手することができ、その内容は参考文献により、ここに
組み込まれている。
使用する特異的なカルスは、結実能力がある植物に再
生することができなければならない。選択中及び選択後
に再生能が著しく低下することもあるため、ここで使用
する砲撃法／選択処理が成功するためには、特定の細胞
の特異的再生能が重要である。したがって、できる限り
再生能が高い培養細胞で開始することが重要である。約
３ヵ月以上、約36ヵ月までの月齢のカルスは十分高いレ
ベルの再生能を有していることが判明しており、従って
これが望ましい。そのサンプルを再生培地にトランスフ
ァーし、新芽、根、及び苗木をモニタリングすることに
より、特定の培養細胞の再生能を容易に測定できる。ペ
トリ皿当たりの、あるいは組織の最新グラム重量当たり
の、発生した苗木の総対数を、再生能の粗定量的推定に
使用してもよい。一般に、カルス組織当たり最低１本の
植物を生じる培養が望ましい。
メイズカルス培養は、多数の様々な植物組織から開始
することができるが、この中で有用な培養は、胚の長さ
が約１−3mmの時に、雌穂の仁から採った未熟なメイズ
胚から得ることが望ましい。一般に、受粉後約９−14日
にこの長さになる。無菌条件下で、胚軸を下にして（胚
盤を上にして）この胚を従来の固形培地上に置く。数日
ないし２〜３週間後に、胚盤からカルス組織が現れる。
カルスが十分に生育した後で、砕けやすい堅さ及び明確
に限定された胚の存在について、胚盤からの細胞増殖を
評価する。“砕けやすい堅さ”とは、細胞に傷害を起こ
さずに組織が容易に消散することを意味する。次に、こ
の形態を有する組織を新たな培地に移し、約２週間毎の
ルーチンベースで継代培養する。凝集を減らすため、ま
た場合により細胞表面積を増加するため、継代培養期間
中にふるい分けを用いる。
カルス開始培地は固定が望ましい。望ましい実施態様
では、開始／維持培地は一般にArmstrongら（1985）が
記述したChuら（1975）のN6塩あるいはMurashigeら（19
62）のΜＳ塩を基本にしている。基本培地には、スクロ
ース及び2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4−Ｄ）を補
足する。Ｌ−プロリン及びカゼイン加水分解物のような
補足成分は、カルス培養の開始頻度、形態及び増殖を改
善することが認められている。培養は一般に暗がりに保
つが、低光度を用いることもある。維持及び増殖に必要
な合成ホルモン、2,4−Ｄの濃度は、一般に約0.3〜3.0m
g/である。
この中で、砕けやすい胚形成カルスを用いて形質転換
及び再生が成功しているが、これは、本発明の結実能力
があるトランスジェニック植物の生産に、形質転換でき
る他の再生可能な細胞、組織、あるいは器官を使用でき
ないことを暗示する意味ではない。形質転換された細胞
にとって唯一の実際上の必要事項は、形質転換後、実際
に用いる特定の選択もしくはスクリーニング手順の後
で、組み換えDNAを含有する植物を再生できなければな
らないことである。
例えば、液体懸濁液培養で増殖した細胞を使用しても
よい。このような培養を確立するためには、４−６ヵ月
後に、II型カルスを液体増殖培地にトランスファーす
る。再生可能な懸濁液細胞培養の生産に関する方法及び
参考文献は、C.E,GreenらがMaize for Biological Rese
arch（生物学的調査のためのメイズ）,Plant Molec.Bio
l.Assoc（1982）,367−372ページに、R.Phillipsらが、
Corn andcorn Improvement（コーン及びコーン改良）,A
gronomy Soc.Amer.（第３版、1988）345−387ページ
に、またI.VasilがCell Culture and Somatic Cell Gen
etics of Plants（植物の細胞培養及び体細胞の遺伝子
学），第Ｉ巻、Laboratory Procedure and Their Appli
cations（研究室手順とその応用）、Academic Press（1
984）152−158ページに、表している。一般に、懸濁液
培養用液体増殖培地は、固体のカルス誘導培地の処方に
類似している。再生能を増強し、培地の活力を高めるた
め、液体増殖培地にABA（アブシジン酸）（10-7M）を加
えてもよい。液体培地に導入する前にふるい分けないほ
うが望ましい。
液体培地中の培養は、活発な増殖及びその再生する特
性に適した継代培養を行う。望ましい実施態様では、１
週間に１度、この培養を新たな増殖培地で1:8−９に希
釈して継代培養する。
II.形質転換に使用するDNA この中で使用する“組み換えDNA"はある起源から誘導
もしくは分離され、場合によってはその後科学的に一部
変化され、後にZea maysに導入される、DNAを言う。あ
る起源から“誘導された”組み換えDNAの例は、ある特
定の生物内で有用なフラグメントとして同定され、しか
もその後、実質的に純粋な型で科学的に合成されるDNA
配列であろう。ある起源から“分離された"DNAの例は、
本発明で使用するため、遺伝子工学の方法論でさらに操
作、例えば増幅、できるように、化学的手段によって、
例えば制限エンドヌクレアーゼを使用して、上述の起源
から摘出もしくは除去されるDNA配列であろう。
従って“組み換えDNA"には、完全な合成DNA,半合成DN
A,生物学的起源から分離するDNA、導入されたRNAから誘
導されるDNAが含まれる。一般に、組み換えDNAは、DNA
のレシピーエントであるZea mays遺伝子型にはもともと
存在しないが、例えば、貯蔵蛋白など、ある特定の遺伝
子産物の生産を高めるために、ある特定のZea mays遺伝
子型から遺伝子を分離すること、ならびにその遺伝子の
多様なコピーを同一遺伝子型にその後導入することは、
本発明の範囲内である。
組み換えDNAは、植物遺伝子、ならびに細菌、酵母、
動物あるいはウィルス由来の遺伝子の様な非植物遺伝
子、同一もしくは異なるZea mays遺伝子型の遺伝子を含
め、修飾した遺伝子、遺伝子蛋白、キメラ遺伝子のDNA
を含むが、これに制限されるものではない。
この中で、形質転換に使用する組み換えDNAは、環状
でも直線でも、また二重鎖でも一重鎖でもよい。一般に
DNAは、プラスミドDNAの様に、結果として生じるコーン
植物に存在する組み換えDNAの発現を促進する調節配列
によって側面を防御されているコーティング領域も含有
する、キメラDNAの型である。例えば、組み換えDNA自身
は、Zea maysで活性であるか、あるいは形質転換の標的
であるZea mays遺伝子型に既に存在しているプロモータ
ーを使用すると考えられる、プロモーターを包含もしく
は含有する。
ある一定の植物を形質転換できる組み換えDNAを構成
する組成及び方法は、本技術に熟練した者には周知のこ
とであり、この中で有用なDNAの生産に、組成及び方法
が同一の構成を使用してもよい。DNAの特定の組成は本
発明にとって主要ではないので、本発明は使用する特定
の組み換えDNAの組成に左右されない。
K.Weisingら、Ann.Rev.Genetics,22,421（1988）に、
適するDNA成分、選択可能なマーカー遺伝子、レポータ
ー遺伝子、エンハンサー、イントロンなどを記述すると
共に、それから構成するために適切な参考文献を提供し
ている。J.Sambrookらは、Μolecular Cloning:A Labor
atory Mannual（分子クローニング。研究室マニュア
ル）,Cold Spring Harbor Laboratory Press（第２版、
1989）で、適切な構成方法を提供している。DNAが大き
くなるにつれて増大することが判明している、物理学
的、化学的もしくは酵素的分解の受けやすさを最小限に
するため、一般に、組み換えDNAは、比較的小さく、即
ち、30kD未満である。
この中での使用に適する組み換えDNAは、結果として
生じるトランスジェニックコーン植物の有益な特徴を提
供、もしくは増強する全てのDNAを含む。食料価値の上
昇、高収量、害虫抵抗性、病気耐性、除草薬耐性などを
促進するために、このDNAは、蛋白もしくはアンチセン
スRNA転写をコード化すると考えられる。例えば、このD
NAは、danA遺伝子と同様、リジン産生増加のためのDHDP
シンターゼを、また害虫抵抗性のためのBacillus thuri
ngiensis（Bt），δ−エンドトキシンもしくはプロテア
ーゼインヒビターを、さらにグリフォセート除草薬耐性
のための細菌EPSPシンターゼ、ならびに殺真菌性のため
のキチナーゼもしくはグルカンエンド−1,3−β−グル
コシダーゼを、コード化できる。
食料もしくは飼料価値の向上で重要なものは、高濃度
必須アミノ酸を含有する蛋白をコード化している遺伝子
である。例えば、栄養的に適切であり、しかもニワトリ
の最適な成長を支えるために、コーン−大豆ミール飼鳥
類飼料には、一般に合成メチオニンもしくはメチオニン
類似体が補足されている。高濃度のメチオニンを供給す
るコーンの株を開発すれば、メチオニン補足品の必要性
を減らすことができる。この様な高メチオニンコーン株
の開発は、高メチオニン蛋白をコードしている、高度に
発現した遺伝子もしくは遺伝子群をコーンのゲノムに導
入することによって達成される。
高メチオニン蛋白をコード化している遺伝子の例に
は、下記のものがある。1.）メイズの15kDコイン蛋白
（メチオニン11％）をコード化している遺伝子、（Pede
rsenら、J.Biol.Chem,261,6279（1986））,2.）ブラジ
ルナッツ貯蔵蛋白（メチオニン18％）をコード化してい
る遺伝子、（Altenbachら、Plant Mol.Biol.,８;239（1
987））ならびに3.）メイズの10kD−ゼイン蛋白（メチ
オニン22.5％）をコード化している遺伝子、（Kirihara
ら、Gene,71,359（1988））。望ましい遺伝子は10kD−
ゼイン蛋白であるが、それは、この蛋白生成物が通常は
仁に蓄積されるので、メチオニンが15kD−ゼイン蛋白の
２倍の高さの内因性のメイズ遺伝子であるためである。
高レベルの発現を種子に得るために、高度に発現した、
種子特異的遺伝子の調節配列に、そのコーティング配列
を随意に融合させてもよい。代わりに、無傷の、内因性
の10kD−ゼイン遺伝子の追加コピーをコーンゲノムに導
入しても、コーンの種子のメチオニン含有量を増加させ
ることができる。
ヒト及び単胃動物の食餌に不可欠なアミノ酸であるリ
ジンは、主要な農作物、特に穀類、の大部分における３
種の最大制限アミノ酸の中に入っている。結果的に、穀
類を基本にした食餌には、合成リジンもしくはリジン含
有脂肪種子蛋白ミールを補足しなければならない。さら
に、ほとんどの脂肪種子ミールは、それ自身、リジン源
が不十分であるため、リジンのために飼料混合物を頻繁
に調整すると、結果としてその他の、あまり望ましくな
い栄養が余りにも高いミールとなる。したがって、穀類
もしくは脂肪種子農作物のいずれか、あるいはその両方
のリジン含有量を増加させる方法は、結果として著しい
栄養価値を加えるとともに、ブタや食用飼鳥類生産者な
どの最終消費者の経費を著しく節減することになる。
穀類のリジン含有量を改良する１つのアプローチは、
生合成経路の制限を解除して、フリーのリジンを蓄積す
ることである。大腸菌のdapA遺伝子は、植物における活
性がリジンによって強くフィードバック阻害される重要
な調節酵素である、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
（DHDPS）をコード化している。この細菌の酵素は、リ
ジンによる阻害に対して約200分の１の感度である。dap
A遺伝子の植物細胞における導入及び発現により、本来
の植物DHDPSが完全に阻害されてしまった後でも、フリ
ーのリジン合成を続けることができる。
コーン植物からの収量を維持すること、ならびにコー
ン栽培の経費抑制に重大な貢献をする際に特に重要なこ
とは、害虫による攻撃から保護することである。合衆国
では、アワノメイガ、ネキリムシ、トウモロコシの果穂
を食害する幼虫など、種々の鱗翅目害虫、ならびにDiab
rotica種の様な鞘翅目が、コーンの主要な害虫に含まれ
る。害虫の攻撃からコーンを保護することは栽培者にと
って高価であり、また時節に合わせて適用する有害な化
学殺虫剤を使用することが必要である。定型的な品種改
良及び選択方法では、主要な害虫に対して実質的に抵抗
性がある新しいコーン株を開発する見込がなかったた
め、本発明に従って、害虫抵抗遺伝子もしくは配列を植
物に導入あるいは遺伝させると、栽培者の経費を低減
し、有毒な化学殺虫剤の使用を減らし、害虫のもっと有
効な管理を提供することになる。
本発明に不可欠な要素は、害虫抵抗遺伝子をコーン細
胞に導入すること、ならびにその遺伝子がコーン植物全
体に組み込まれ、有糸分裂及び減数分裂の過程を経て植
物のその後の孫により最終的に受け継がれるための、遺
伝子の有糸分裂複製である。
Bacillus thuringiensis（即ち“Bt"）は、広く様々
な昆虫種に摂取された時に有毒な、エンドトキシンポリ
ペプチドを産生する細菌のほぼ20の既知の亜種を含む。
エンドトキシン蛋白（Bt蛋白）及び対応する遺伝子（Bt
遺伝子）の生物学及び分子生物学を、H.R.WhitelyらがA
nn.Rev.Microbiol.,40,549で、またH.HofteらがMicrobi
ol.Rev.,53,242（1989）で、最近、再検討している。種
々のBt蛋白をコード化している遺伝子は、クローン化及
び配列決定されている。Btポリペプチドのセグメント
は、種々の鱗翅目害虫に対する毒性に不可欠なこと、ま
たBtポリペプチド分子の初めの約50％の中に含まれてい
ることが、調査で明らかにされた。結果的に、切断Bt遺
伝子にコード化された切断Btポリペプチドは、多くの場
合、多数の鱗翅目害虫に対する毒性を保持している。HD
73及びHD1 Btポリペプチドは、アワノメイガ、ネキリ
ムシ、トウモロコシの果穂を食害する幼虫など、合衆国
におけるコーン植物の重要な鱗翅目害虫の幼虫に有毒で
あった。M.GeisterらがGene,48,109（1986）で、またM.
J.AdangらがGene,36,289（1985）で、それぞれHD1及びH
D73 Btポリペプチドをコード化している遺伝子を、ク
ローン化及び配列しており、培養コレクション（例え
ば、オハイオ州コロンバスのBacillus Genetic Stock
Senter、イリノイ州ピオリアのUSDA Bt stock collect
ion）から得られるHD1及びHD73種から、標準的なプロト
コールを用いてクローン化できる。
新しい、以前には特性化されていなかったBtトキシン
類をコード化しているDNAは、Bt遺伝子のクローン化に
以前用いられていたプロトコールを用いて、宿主バチル
ス菌からクローン化してもよい。この中には、適切なプ
ラスミドもしくは適当な宿主に複製されるファージベク
ターでの、バチルス菌から分離したDNAバンクの構成、
ならびにBt蛋白もしくは同種Bt遺伝子配列から分離され
たDNAに対して生じる抗体の使用が含まれる。クローン
化DNAの検出分析法を用いて、Btコーディング配列のお
およその位置を最初に決定することもある。Btコーディ
ング配列の正確な位置は、クローン化したDNAセグメン
トの配列決定、Bt蛋白をコード化できる本配列の大きな
読み取り枠の存在を決定すること、ならびにDNA配列か
ら得られたアミノ酸配列をBt蛋白の部分的アミノ酸配列
から得られたものと比較することにより、DNA配列の性
質をコード化しているBtの確認を含め、様々な標準方法
を用いて決定する。
本発明に有用なキメラBt遺伝子は、転写の開始（“プ
ロモーター”）及びコーン植物のBt配列の位置が確認さ
れた下流の翻訳ができるDNA配列を包含する、５′DNA配
列を含む。キメラBt遺伝子は、コーンに発現され得る遺
伝子の３′非コード領域から得られる配列を含む３′DN
A配列も含んでいる。最も重要なことは、キメラBt遺伝
子が、Bacillus thuringiensisが産生する有毒なBtポリ
ペプチドもしくはその有毒な部分をコード化している
か、あるいはそれと相同の実質的なアミノ酸配列を持つ
DNA配列を含むことである。Btコーディング配列は下記
のものを含む。（ｉ）コーンの害虫に対して有効なBtエ
ンドトキシンと実質的に相同な殺虫剤的に有効な蛋白を
コード化するDNA配列、例えばHD73あるいはHD1 Bt配
列、（ii）Btエンドトキシンポリペプチドの殺虫剤的に
有効なセグメントをコード化しているDNA配列、例えば
殺虫剤的に有効な、カルボキシ及び／或いはアミノ末端
から切断したHD73あるいはHD1ポリペプチド、（iii）切
断したBt配列、下記のような補足的利点を提供するポリ
ペプチドをコード化する配列とフレーム内で融合した、
切断したBt配列。（ａ）選択可能な遺伝子、例えば抗生
物質もしくは除草薬に対する耐性を与える遺伝子、
（ｂ）生成物の検出もしくは検定が容易なレポーター遺
伝子、例えばルシフェラーゼあるいはβ−グルクロニダ
ーゼ、（ｃ）Bt蛋白の分解に対する、安定化に補足的に
使用する、あるいは害虫に対するBt蛋白の有効性を増強
するポリペプチド配列をコード化するDNA配列、例えば
プロテアーゼインヒビター、ならびに（ｄ）Bt蛋白をコ
ーン細胞内外の特定の成分に向けるのを助ける配列、例
えばシグナル配列。
コーンでBt蛋白の最適な合成を得るために、Bt遺伝子
のDNA配列を、コーンに有効に発現する遺伝子にもっと
類似するように調整することも適切と考えられる。HD73
及びHD1遺伝子を含め、多くのBt遺伝子のコドンを使用
する方法は、バチルス種が使用する方法により類似して
おり、メイズに発現される遺伝子が使用する方法とは異
なるため、メイズ細胞におけるBt遺伝子の発現は、この
様にめったに使用されないバチルスコドンを、メイズ植
物でより頻繁に使用されるものと置き換えることで改良
することができる（E.Murrayら、Nucl.Acid Res.,17,47
7（1989）参照）。そのようなコドンの置き換えには、
結果として生じるBtポリペプチドのアミノ酸配列を変え
ずに、塩基を置換することが必要である。Btポリペプチ
ドは、その配列が細菌遺伝子もしくはそのセグメントと
同一である。望ましいメイズのコドン含有率がもとの細
菌遺伝子より高い、完全なBtコーディング配列、もしく
はその切片は、標準的な化学合成プロトコールを用いて
合成することも可能で、特定部位の突然変異誘発やDNA
重合及び結紮など、標準的なプロトコールを用いてBt遺
伝子に導入あるいは集合することができる（F.Murray
ら、Nucl.Acids Res.,17,477（1989）参照）。
転写ユニットもしくはその一部として作動する組み換
えDNA配列は別として、有用な組み換えDNAは調節もしく
は構造機能を果たし、転写されないと考えられる。また
突然変異種を作る遺伝子の道具として作動し、また場合
により同定、遺伝子付加、あるいはコーンDNAセグメン
トの分離に役立つために、このDNAは導入される。以前
に引用した、Weisingに追加例が見られる。
形質転換細胞の同定及び選択を容易にするために、植
物細胞に導入される組み換えDNAはさらに、選択可能な
マーカーもしくはセプター遺伝子あるいはその両方を一
般に含有する。二者択一的に、選択可能なマーカーは別
の部分に載っており、同時形質転換手順に用いられる。
選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子、は植物に発
現することができる様に、両者とも適切な調節配列で側
面を防御される。有用な選択可能なマーカーは、本技術
では周知であり、例えば、抗生物質及び除草薬耐性遺伝
子が含まれる。
以前に引用したWesingらに、選択可能なマーカー遺伝
子の特異的な例が示されている。望ましい、選択可能な
マーカー遺伝子は、ヒグロマイシン・ホスホトランスフ
ェラーゼ（HPT）コーディング配列で、これは大腸菌か
ら得られ、抗生物質ヒグロマイシンＢに対する耐性を与
える。他の選択可能なマーカーには、抗生物質カナマイ
シン、ネオマイシン及びG14Bに対する抵抗性をコード化
するトランスポゾンTn5（Aph II）のアミノグリコシド
・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ならびにグリホセ
ート、2,2−ジクロロプロピオン酸、メトトレキサー
ト、イミダゾリノン除草薬、スルホニルウレア除草薬、
プロモキシニル、ホスフィノトリシン及びその他の除草
化合物に対する抵抗性もしくは耐性をコード化する遺伝
子が含まれる。このようなフィトトキシン化合物に対す
る抵抗性もしくは耐性を与える、これらの選択可能なマ
ーカー遺伝子には、結果として生じる形質転換植物に商
業上の有用性がある。フォトトキシン化合物に対する抵
抗性を伝える酵素をコード化している、選択可能なマー
カー遺伝子を、下記の表１に挙げる。
表１ 選択可能な、マーカー遺伝子 抵抗性遺伝子もしくは酵素 ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（neo） ヒゴマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（hptあるい
はhyg） ジヒドロフォレート・リダクターゼ（dhfr） ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ba
r） 2,2−ジクロロプロピオン酸・デハロゲナーゼ アセトヒドロキシアシッド・シンターゼ ５−エノルピルビルシキメート−ホスフェート・シンタ
ーゼ（aroA） ハロアリルニトリラーゼ アセチル−コエンザイムＡ・カルボキシラーゼ ジヒドロプテロエート・シンターゼ（su1 I） 32kDフォトシステムIIポリペプチド（pshA） アンスラニレート・シンターゼ ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dapA） 抵抗性を示す対象 G41B、ネオマイシン、カナマイシン ヒゴマイシンＢ メトトレキサート ホスフィノトリシン 2,2−ジクロロプロピオン酸（Dalapon） スルフォニルウレア・イミダゾリノン及びトリアゾロピ
リミジン除草薬 グリフォスフェート ブロモキシニル セトキシジン、ハロキシフォップ スルフォナミド除草薬 トリアジン除草薬 ５−メチルトリプトファン アミノエチルシステイン 参考文献 （10〜29行目まで省略） P.C.Audersonら。（合衆国特許第4,761,373号）:G.V.Ha
ughnら。Mol.Gen.Genet.,211,266（1900） （35〜39行目まで省略） D.M.Stalkerら。PCT出願公開WO87/04181 （43行目〜50行目まで省略） K.Hibbardら。（合衆国特許第4,581,847号） K.Glassmanら。PCT出願公開WO89/11789 レポーター遺伝子は、潜在的に形質転換した細胞の同
定及び調節配列の機能性の評価に使用される。容易に検
定できるマーカー蛋白をコード化するレポーター遺伝子
は、本技術では周知である。一般に、レポーター遺伝子
はレシピーエント生物もしくは組織に存在あるいは発現
せず、また表現型の変化もしくは酵素活性など、容易に
検出できる特性によって発現が明示される蛋白をコード
化する遺伝子である。前述のWeisingらが、そのような
遺伝子の例を提供している。望ましい遺伝子には、大腸
菌のTn9のクロラムフェニコール・アセチル・トランス
フェラーゼ遺伝子（cat）、大腸菌のuidA座のβ−グル
クロニダーゼ遺伝子（gus）及びホタルPhotinus pyrali
sのルシフェラーゼ遺伝子がある。DNAをレシピーエント
細胞に導入した後、適当な時にレポーター遺伝子の発現
を検査する。そのような望ましい検定法には、大腸菌β
−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子が必要である。（R.J
wffersonら、BNBO J.,16,3901（1987））。この遺伝子
を形質転換し、発現しているメイズ細胞は、細胞外媒体
の中で、基質５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−GLUC）に暴露すると青色に
染色する。
この中で有用な調節配列には、特定の植物細胞に発現
できる、あらゆる構造性の、誘導可能な、組織もしくは
器官特異的な、あるいは発生段階特異的なプロモーター
が含まれる。前述のWeisingらに、そのような適切なプ
ロモーターが発表されている。以下は、この中で使用す
るのに適するプロモーターを代表するリストの一部であ
る。マンノピン・シンターゼ、ノパリック・シンター
ゼ、オクトピン・シンターゼを含めたAgrobacuterium t
umefaciensのＴ−DNAの調節遺伝子、コーンのアルコー
ル・デヒドロゲナーゼ・プロモーター、様々な種に由来
するリブロース−ビスホスフェート−カルボキラーゼ／
オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子の様な光誘導性プ
ロモーター、ならびにマジョア・クロロフィルa/b結合
蛋白遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウィル
ス（CaMV）の35S及び19Sプロモーター、メイズの蝋、ゼ
インもしくはブロンズプロモターのような発生的に調節
されるプロモーター、ならびに器官特異的発現もしくは
植物の特定の発生段階におる発現を示すプロモーターを
含め、誘導可能な、あるいは構造性の、合成もしくは他
の天然プロモーター。
イントロン、エンハンサー、ポリアデニレーション配
列など、その他の成分も組み換えDNAの一部である。こ
の様な成分は、DNAの機能に必要なことも不必要なこと
もあるが、転写やmRNAの安定性などに作用することによ
ってDNAの発現改善を提供すると考えられる。このよう
な成分を望み通りにDNAを含めて、植物のDNAを形質転換
する最適な性能を得る。例えば、特定の組み換えDNA構
造のプロモーターとコーディング配列の間に、メイズAd
h I S第１イントロンを配置する。本イントロンは、DNA
構造に含まれる時には、メイズ細胞の蛋白産生を増加す
ることが判明している。
（J.Gallisら、Genes and Debelop.,１,1183（198
3））。しかし、選択可能なマーカーが満足に遂行する
のに十分な発現は、イントロンがなくても得られること
が多い。（T.Kleinら、Plant Physiol.,91,440（198
9）。適する代りのイントロンの１例は、Zea maysのshr
unken−１第１イントロンである。この様な他の成分
は、DNA構造の残り部分と適合しなければならない。
III.DNA伝達過程 組み換えDNAは、再生可能なメイズ細胞培養に導入す
ることができ、粒子砲撃処理を経てカルス培養に導入さ
れることが望ましい。適する粒子砲撃装置の一般的記述
がSanfordら（1987）に提供されており、その内容は参
考文献によって、この中に組み込まれている。再生でき
ないメイズの懸濁培養細胞の砲撃法において、装置の使
用に関するプロトコールはKleinら（198a,1988b及び198
9）に記述されているが、カルス培養もしくは再生可能
なメイズ細胞の砲撃法について発表されているプロトコ
ールは皆無である。
微小投射物砲撃処理は、バイオリスティック処理とも
言われるが、その場合、生物学的に不活性な物質の非常
に小さな粒子が、カルスへの組み換えDNAの輸送に介在
している。不活性な粒子がDNAでコーティングされて、
適当な速度まで加速されると、１個以上の粒子が、その
粒子からDNAが放出されてその細胞内で発現した１個以
上の細胞に進入することができる。レシピーエント細胞
の一部は導入されたDNAをしっかり保持しているので、
これを発現する。
微小投射物と呼ばれる粒子は一般に、タングステンも
しくは金などの高密度の物質である。それらを関連DNA
でコーティングする。次に、適当なエネルギー源から微
小投射物まで、起動力を輸送するのに役立つ大型投射物
の表面に、この微小投射物を置く。大型投射物及び微小
投射物を適当な速度に加速した後、それらを、大型投射
物がその前方進路を継続することは妨げるが、DNAでコ
ーティングした微小投射物が継続することは許し、レシ
ピーエントカルス細胞を砲撃できる遮蔽装置と接触させ
る。このような適切な装置は、火薬などの起動力を用い
ることができるか、電気による衝撃波が発射される（P.
Christouら、Plant Physiol.,87,671（1988））火薬が
起動力である装置の方が現在好まれており、Sanfordら
（1987）に記述されていて、さらに詳しく説明されてい
るが、その内容は参考文献により、この中に組み込まれ
ている。
火薬装置の使用に関するプロトコールは、Kleinら（1
988a,b）に提供されており、２つの重要な段階を含む。
第１に、指定された順序で、タングステン微小投射物を
DNA、塩化カルシウム、スペルミジンを水溶液中で混合
する。種々の成分の濃度は教えられた通り、まちまちで
ある。望ましい手順は、記述されている最適DNA濃度を
倍増すること以外は、Kleinら（1988b）の手順を正確に
必要とする。第２に、DNAでコーティングした微小投射
物、大型投射物及びレシピーエント細胞を装置の所定の
位置に置き、大型投射物に起動力を与える。変化するこ
ともあるこの段階の一部には、円筒部の端からレシピー
エント細胞までの距離ならびにサンプルチェンバー内の
真空度が含まれる。レシピーエント組織は停止プレート
・トレーから２−15cm下に置くが、5cmが望ましい。
この中で、遺伝子変換植物の再生に有用なカルス培養
は、一般にトランスファー期間のおおよそ中ほどなの
で、したがって、新しい培地へのトランスファーに伴う
“ラグ”相を過ぎていなければならないが、新しい培地
への継代培養をしない期間の延長に伴う“定常”相に達
する前でなければならない。この組織は約30〜80mgの切
片の形で使用するが、40〜60mgが望ましい。この凝集塊
をペトリ皿もしくは他の表面に置き、本質的に下記の条
項を確認する方法で配置する。（ｉ）皿の中心の空間
に、金属−DNA粒子の一番濃い濃度を置き、そこに配置
した組織は攻撃中に障害を受けると考えられる。（ii）
組織に到達する粒子の数は、爆発の中心から組織までの
距離の増加とともに減少するので、皿の中心から離れた
組織は砲撃されにくいと考えられる。メッシュスクリー
ンは金属製が望ましく、組織の跳ね返しや排出を防止す
るために皿の上に置く。砲撃用組織を提示する代替方法
は、組織を濾紙上に薄い層にして広げる方法である。DN
Aでコーディングした金属粒子で、この組織を１回以上
砲撃する。
IV.選択過程 組み換えDNAでカルスを砲撃し、そのDNAが幾つかの細
胞を貫通するとすぐに、組み換えDNAを含有し、しかも
依然として十分な再生能力を保持している細胞を同定及
び選別することが必要である。これを遂行するのに有用
なことが判明している２つの一般的アプローチがある。
第一の方法は、形質転換したカルスもしくはそれから再
生した植物は、もしあれば、レポーター遺伝子発現の検
定法あるいは組み換えDNAの表現型効果の評価を含める
ことができる種々の標準法で、組み換えDNAの存在をス
クリーニングできる。代わりに、そして望ましくは、選
択可能なマーカー遺伝子が組み換えDNAと一緒に、ある
いは組み換えDNAの一部として伝達される時、選択可能
なマーカー遺伝子の発現を検出する選択的薬剤を使用し
て、形質転換されているカルスの細胞を同定できる。
形質転換細胞の生育及び蓄積は可能であるが、同時に
非形質転換細胞の生育は阻害する様に選択条件を選ばな
ければならないので、仮想上の形質転換細胞の選択は、
形質転換処理が成功する重大な部分である。集団の中の
個々の細胞の生命力は、隣接する細胞の生命力に左右さ
れることが多いという事実のため、この事態は複雑であ
る。また、選択条件はあまり厳密ではないので、カルス
細胞の植物再生能力及び結果として生じる植物の繁殖力
は除外される。故に、細胞の生育能力及び形態に及ぼす
選択剤の影響を評価しなければならない。特定の選択的
薬剤に関する生育阻止曲線を実験的に作製し、事前に組
織を形質転換しておくことで、これを遂行できる。これ
は生育を阻止する濃度範囲を確立することになる。選択
可能なマーカー遺伝子を使用していた時には、カルスの
凝集塊は、非選択培地上の砲撃から回収するか、あるい
は、この方が好ましいが、選択剤を含有する培地に直接
トランスファーすることができる。
選別手順は有毒な薬剤に暴露することを含み、薬剤濃
度の連続的変化及び選択の複数の過程を用いることがあ
る。特定の濃度及び周期の長さは、特定の薬剤に対して
各々変える必要があると思われる。現在好まれている選
択手順には、比較的低濃度の有毒薬剤で最初の選択過程
を用いてから、より高濃度で後の選択過程を用いること
が必要である。このようにすると、選択的薬剤は、ゆっ
くりとより長時間にわたってその毒性効果を発揮するこ
とができる。薬剤の濃度は最初、生育阻止曲線から求め
た時に、約５〜40％レベルの生育阻止を生じる濃度が好
ましい。その影響は、形質転換細胞は優先的に生育及び
分裂することができるが、非形質転換細胞を阻止するも
のであるが、非形質転換細胞の生育が妨害される程度の
ものではない。個々の形質転換細胞数個が、十分な回数
分裂するとすぐ、より高濃度の有毒な薬剤に組織を移
し、実質的に全ての非形質転換細胞を殺す。より高濃度
への変化は、その薬剤に非形質転換細胞が順応する可能
性も減少させる。約30〜100％の生育阻止範囲内で、よ
り高濃度が望ましい。最初の選択周期の長さは、約１〜
４週間で、約２週間が望ましい。あとの選択周期は約１
〜12週間で、約２〜10週間が望ましい。仮想上のメイズ
形質転換細胞は一般に、非増殖細胞という環境の中で、
組織の増殖セクター領域として同定される。選択手順全
期間の様々な時に、カルスも非選択培地で培養する。
カルスのセクターが仮想上の形質転換細胞であると同
定されるとすぐ、表現型及び／或いは遺伝子型分析法
で、形質転換を確認できる。選択剤を使用する場合に
は、表現型分析法の１例は、様々な濃度のコントロール
と比較した時の、最新の形質転換細胞重量の増加を測定
することである。用いられる他の分析法では、組み換え
DNAの機能に左右される。例えばDNAが酵素もしくは蛋白
をコード化している場合、特定の酵素もしくは蛋白に特
異的な酵素的あるいは免疫学的検定法が用いられる。適
切なバイオアッセイもしくは化学的検定法を用いて、他
の遺伝子産物を検定してもよい。その他の、このような
技法は、本技術では周知であるので、ここでは繰り返さ
ない。従来の手順、即ちサザンブロット法もしくはポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）などにより、遺伝子の存在も
確認できる。
V.植物の再生及び種子の生産 形質転換されたことが明らかな細胞株は次に、植物に
再生されなければならず、しかも結果として生じる植物
の繁殖能力を測定しなければならない。遺伝子型及び／
或いは表現型分析法により、試験が陽性の形質転換株
を、組織分化及び植物再生を促進する培地上に置く。本
技術で周知の標準的な手順に従って、再生が行われる。
この手順には普通、カルスの増殖を中断し、体胚の発生
もしくは他の組織の分化を促進するオーキシン濃度を低
下させることが必要である。再生手順の１例は、Green
ら（1982）に記述されている。栽培室あるいはグリーン
ルームで、植物は成熟するまで栽培され、Neuffer（198
2）が記述している様に、適切な有性交配が行われる。
再生は本発明に重要であるが、従来の方法でも行われ
る。選択可能なマーカーが細胞に形質転換されている場
合、再生植物が形質転換されていることをさらに確認す
るために、選択剤が再生培地に組み込まれる。再生技法
は周知であり、しかも本発明には重大ではないため、再
生を完遂し、結実能力がある植物を生産する、どのよう
な技法を用いてもよい。
VI.R1子孫の分析 形質転換カルスから再生した植物をR0世代もしくはR0
植物という。R0世代植物の種々の有性交配で作られた種
子をRI子孫もしくはR1世代という。R1種子が発芽する
時、結果として生じる植物もR1世代と言われる。
１回の完全な性周期を通して、組み換えDNAの申し分
ない伝達及び継承を確認するため、R1世代を分析して、
形質転換DNAの存在を確認しなければならない。植物及
び植物の一部がカルスの代りに使用されることを考慮し
て、上述の、砲撃したカルスが形質転換されている証拠
を分析するための、いずれかの方法で分析してもよい。
組み換えDNAは、異なる形質転換株に対して異なる型
の遺伝パターンを示すことがある。例えば、組み換えDN
Aはメンデルの遺伝の法則に従って子孫に受け継がれ
る。この型の遺伝率は、雄と雌の両生殖細胞によるDNA
の伝達を含み、しかもメイズの核DNA内への安定した集
合もしくは組み込を伴う。遺伝パターンの別の型は物質
の遺伝で、雌の生殖細胞を通して組み換えDNAが主に、
あるいは排他的に伝達される。種々の有性交配の子孫の
分析で、特定の形質転換細胞の遺伝パターンが確認され
る。
VII.他のメイズ変種における組み換えDNAの確立 次に、導入された組み換えDNAを望み通りの株もしく
は変種に組み込むために、従来のメイズ品種改良プログ
ラムに、繁殖力のあるトランスジェニック植物を使用す
る。コーンの集中改良に関する方法及び参考文献は、Ha
llauerら（1988）により示されており、文献によってこ
の中に組み込まれている。変換処理（戻り交配）は、従
来の品種改良プログラムに用いられるアプローチの中に
はいっている。簡単に言えば、最初の結実能力がある遺
伝子変換植物をエリート同系交配株に交配して交換が行
われる。一部の植物は組み換えDNAを有しているが、一
部の植物はそうでない様に、本交配による子孫は分かれ
る。そのDNAを有する植物を次に、エリート同系交配の
株に再び交配すると、結果としてもう一度分かれる子孫
を生じる。もとのエリート同系交配が、組み換えDNAを
含有する株に変換されるまで、この戻り交配処理を繰り
返し行うが、それにもかかわらず親にもともと見られた
全ての重要な特性を持っている。一般に、この方法には
約６−８世代が必要である。遺伝子的に誘導されたエリ
ート株に変換される各々のエリート株に対して、別個の
戻り交配プログラムが一般に使用される。
一般に、組み換えDNAが異なる多くの交雑種組合せに
組み込まれれば、この中で生産される系質変換コーンの
商業上の価値は最大になる。成熟度、農家は一般に成
熟、耐性、あるいはその他の農業経営上の特色の違いに
基づいた数種の交雑種を栽培する。また成熟、病気、害
虫抵抗性などの特色が異なるため、一地域に適合した交
雑種は一般に、他の地域に適合しないので、農家は自分
の地理的位置に基づいて交雑種を選択しなければならな
い。ゆえに、望ましい異種DNAを含有する多くの交雑種
組合せが生産できる様に、組み換えDNAを多量の親株に
組み込むことが必要である。
コーンの品種改良、ならびに１つの株もしくは変種か
ら別の株に遺伝子をトランスファーするために必要な技
法及び技術は、本技術に熟練した者には周知である。し
たがって、これらの品種改良手順によって、他の株もし
くは変種に組み換えDNAを導入することが遂行できる。
VIII.トランスジェニック植物の使用 この中で生産されるトランスジェニック植物は、種々
の商業上もしくは調査研究の目的に有用であることが期
待される。栽培者に有益な特色（例えば、害虫抵抗性、
除草剤耐性あるいは収量増加など、農業経営上の特
色）、植物から収穫される穀粒の消費者に有益な特色
（例えば、ヒトの食料や動物の飼料中の栄養含有量の改
善）、あるいは食物加工業者に有益な特色（例えば、加
工処理特色の改善）を持つ、伝統的な農業に使用するた
めトランスジェニック植物が創られる。このように使用
する場合、植物は一般に、その穀粒をヒトあるいは動物
の食料に使用するために栽培される。しかし、茎、穀
皮、生長部分などを含める植物の他の部分にも、動物の
サイレージの一部あるいは鑑賞用などの有用性もある。
しばしば、コーン及び他の穀類の化学成分（例えば、オ
イルやスターチ）は、食料あるいは工業用使用のために
抽出されるので、そのような成分のレベルを高めるか修
飾した遺伝子変換植物を創ることもある。
トランスジェニック植物は、蛋白または他の分子の市
販用製造に使用されることもあるが、その場合、関連分
子は植物の一部、種子などから抽出もしくは精製され
る。そのような分子を製造するために、植物の細胞及び
組織を培養しても、イン・ビトロで生育させても、ある
いは醗酵させてもよい。
トランスジェニック植物は、商業上の品種改良プログ
ラムに使用されることもあり、言い換えれば、関連した
穀物種植物に交配あるいは改良されることもある。組み
換えDNAによりコードされた改良は、例えばコーン細胞
から他の種に、原形質体の融合などによって、トランス
ファーされることもある。
トランスジェニック植物には、後に定型的な突然変異
及び選択によって創造できるような有益な変異種を同定
するために、挿入的遺伝子誘発による新しい変異種植物
を創ることを含め、研究調査もしくは改良に、多くの用
途がある。１例は、遺伝子学的変化を起こすために使用
される転移因子コード化している組み換えDNA配列の導
入であろう。本発明の方法は、特許登録株あるいは変種
の同定に使用できる、独特な“シグナル配列”あるいは
他のマーカー配列を有する植物の創造にも使用される。
以下の非制限例は、本発明の実例となるものである。
それらは、組み換えDNAをしっかり発現し、そのDNAを子
孫に伝達する本発明の、結実能力があるZea 明記mays植
物の調整に使用される一般的手順をよく説明するもので
ある。別の方法で名刺されていなければ、全成分及びパ
ーセンテージは重量である。現れている特異的形質転換
事象の確立は、形質転換手順を受けた物質量の関数であ
る。それゆえ、この中で記述された手順で生じる個々の
状況が、形質転換産物を生産しない時には、その手順を
繰り返すことが必要である。
実施例Ｉカルス株AB11に由来する結実能力があるトラン
スジェニック植物Zea mays I.植物再生能を保持するメイズ細胞培養の開始及び維持 同系交配株B73植物の花粉（アイオワ州大学）と、同
系交配株A188植物（ミネソタ大学穀類改良協会）の受粉
によって作られた、交雑種未成熟胚から、砕けやすい、
胚形成メイズカルス培養を開始した。胚の長さが1.5〜
2.0mmに達した時に、雌穂を収穫した。各雌穂を50％v/v
市販漂白剤（2.63％v/v次亜塩素酸ナトリウム）で、室
温で20分間表面滅菌した。次に、この雌穂を滅菌、蒸留
及び脱イオンした水で洗浄した。未成熟胚を無菌的に分
離して、栄養開始／維持培地に、培地に曝した根／新芽
軸と一緒に置いた。開始／維持培地（以下“Ｆ培地”と
言う）は、２％（w/v）スクロース、1.5mg/の2,4−ジ
クロロフェノキシ酢酸（2,4−Ｄ）、6mMプロリン、及び
0.25％Gelrite（サンジエゴ、Kelco社）を含むN6基本培
地（Chu,1975）で構成されていた。オートクレーブ滅菌
に先立って、pHを5.9に調整した。他に記述がない限
り、全ての組織培養操作は、無菌条件で行った。未成熟
胚を26℃、暗がりでインキュベートした。砕けやすい堅
さ及び明確に限定された体胚の存在について、未成熟胚
の胚盤からの細胞増殖を評価した。未成熟胚のプレート
培養開始後10〜14日に、この形態を有する組織を新たな
培地にトランスファーした。次にこの組織を、14〜21日
毎のルーチンベースで継代培養した。約1gの大きさに達
した組織の切片から70〜80mgの組織を採取し、新たな培
地にトランスファーした。正しい形態が維持されている
ことを確認するため、継代培養を常に注意深く視覚的に
モニタリングした。体胚が存在したので、適切な条件下
で培養で植物が生じていることが保証された。本実施例
に使用された、AB11と名付けられた細胞培養は、このよ
うな培養で、砲撃法の約１年前に開始されていた。
II.プラスミド プラスミド、pHYG I 1は、標準的な組み換えDNA技法
を使用して、ベクターpBS＋（カリフォルニア州サンジ
エゴ、Stratgene社）に組立てた、3.2kbの環状プラスミ
ドであった。メイズAdh I S第１イントロン（Callis
ら、1987）を含有する、553bp Bc1−BamH Iフラグメン
トを、CaNY 35Sプロモーターと、実施例Ｖに従って組
立てられた、PCHN1−１のヒグロマイシンコーティング
配列との間に挿入した。図１に、pHYG I 1の地図を示
す。pHYG I 1のサンプルを、ブタペスト条約の規定に従
って、1990年３月16日に合衆国メリーランド州リークビ
リーのAmerican type Culture Collectionに供託し、受
入れ番号40774番が割り当てられた。
pB II 221は、CaMV 35Sプロモーターによって５′末
端で、またnosポリアデニレーション配列によって３′
末端で、側面を防御された大腸菌β−グルクロニダーゼ
・コーディング配列を含有している。本プラスミドは、
35SプロモーターとpB II 221のコーディング配列の間に
メイズAdH I S第１イントロンを挿入して組み立てた（J
effersonら、1987）。図２にpB II 221の地図を示す。
微小投射物攻撃法によって、胚形成カルス培養AB11に
プラスミドを導入した。
III.DNA伝達経過 微小投射物攻撃法の７〜12日前に、胚形成メイズカル
ス株AB11を継代培養した。砲撃法のために、下記のよう
にAB11を調製した。凝集塊もしくはカルス５個、各湿重
量約50mgを、60x15mmの滅菌ペトリプレート（ファルコ
ン1007）の中央に、十字型に配置した。砲撃処理を通し
て、閉じた容器に、湿ったペーパータオルと一緒にプレ
ートを保存した。
下記のこと以外は、Kleinら（1988b）の記述に正確に
従って、Ｍ−10タングステン粒子（Biolistics社）にプ
ラスミドをコーティングした。（ｉ）推奨された量の２
倍のDNAを使用した。（ii）粒子上へのDNA沈殿を０℃で
行った。（iii）砲撃処理を通して、DNAをコーティング
したタングステン粒子が入っている試験管を、氷上で保
存した。
全ての試験管には、1mg/mlのプラスミドDNA合計５μ
ｌと一緒に、水中50mg/mlのＭ−10タングステン25μ
ｌ、2.5MのCaCl225μｌ及び100mMのアスペルミジンが入
っていた。両プラスミドを使用した時には、各々2.5μ
ｌずつであった。１本の試験管にはプラスミドpB II 22
1のみが、もう１本の試験管にはT.E.バッファー（下記
表２参照）が入っていた。
全ての試験管を、氷上で10分間インキュベートした。
室温で５秒間、Eppendorf遠心機で遠心分離してこの粒
子をペレット化し、上澄25μｌを捨てた。砲撃処理を通
して、試験管を氷上に保存した。５回以下の砲撃には各
調製品を使用した。
大型投射物及び停止プレートは、Biolistic社（ニュ
ーヨーク州イサカ）から入手した。供給者の記述通り
に、それらを滅菌した。微小投射物攻撃装置は、Biolis
tic社に入手した。
円筒部に最も近いスロットの中に停止プレートを入
れ、微小投射物攻撃装置の停止プレート・トレーの底か
ら5cm下に、サンプル・プレート・トレーを置いた。上
述の通りに調製したカルス組織のプレートを、サンプル
・プレート・トレーの中心に置き、ペトリ皿のフタを外
した。砲撃の間ずっと組織を保持するために、3X3mmの
網目で、直流電気をかけた鉄でできている、7X7cm2の堅
い金網を開いている皿の上に置いた。Biolistic社の記
述通りに、タングステン/DNA調製品を音波破砕し、各砲
撃毎に、大型投射物の最上部に2.5μｌの懸濁液をピペ
ット操作した。製造会社の記述通りに本装置を操作し
た。表２に実施した砲撃法をまとめる。
pB II 221を含むカルス砲撃のプレート２枚を、Ｆ培
地用プレート（ヒグロマイシンを含有しない）にトラン
スファＳーし、26℃、暗がりでカルスを培養した。７日
後、このカルスを、GUS検定バッファー（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド1m
g/ml（Research Organic社）、100mMリン酸ナトリウムp
H7.0、各5mMのフェリシアンカリウム及びフェロシアン
カリウム、10mM EDTA及び0.065％トリトンＸ−100を含
有する、35x10mmのペトリ皿（Palcom 1008）にトランス
ファーした。37℃で３日間インキュベートし、その後、
青色の細胞数を数えると、２つのプレートで見られる一
過性のGUS−発現細胞は、合計313及び335で、砲撃され
た他のプレートと共に、DNA伝達過程も起きていたこと
が示唆される。GUS検定法は破壊的であるため、GUS検定
に使用した組織のプレートは、カウント後、廃棄した。
培地を45℃まで冷却しておいた時に、水に溶解した10
0mg/mlの濾過滅菌ヒグロマイシンＢの適当量を加え、プ
レートを注ぐ前にヒグロマイシンＢ（Calbiochem社）を
培地に組み込んだ。
全てのサンプルを砲撃した後、ただちにpHYG I 1/pB
II 221で処理したプレートのサンプル全部のカルスとT.
E.プレートの２つを、15mg/のヒグロマイシンＢを含
有するＦ培地にトランスファーした（プレート当たり10
ピースのカルス）。これをラウンド１選択プレートと言
う。T.E.処理プレートのカルスを、ヒグロマイシンを含
まないＦ培地にトランスファーした。この組織を２〜３
週間毎に非選択培地に継代培養したので、これを非選択
コントロールカルスと言う。
選択の14日後、選択培地上にも非選択培地上にも、実
質的に同一の組織が現れた。７つのpHYG I 1/pB II 221
プレートのカルス全部と、T.E.処理プレートのカルス１
個を、ラウンド１選択プレートから、60mg/のヒグロ
マイシンを含有するラウンド２選択プレートにトランス
ファーした。ラウンド２選択プレートは各々、プレート
当たり30mgピースのカルスを10個含んでおり、プレート
の総数が膨張する結果となった。
ラウンド２選択プレート上で21日後、60mg/のヒグ
ロマイシンを含有するラウンド３選択プレートに全ての
物質をトランスファーした。砲撃から75日後、何組かの
ラウンド３選択プレートの、成育可能なカルスのセクタ
ーをチェックした。そのセクターの１つは、壊死組織と
いう環境から、pHYG I 1/pB II 221処理プレート上で、
増殖していた。このセクターは、PH3と呼ばれ、ヒグロ
マイシンを含まないＦ培地にこれをトランスファーし
た。
ヒグロマイシンを含まないＦ培地上で19日後、60mg/
のヒグロマイシンを含有するＦ培地にPH3をトランス
ファーした。60mg/のヒグロマイシンが存在する中
で、多回の継代培養を通して生育を持続することができ
た。
PH3カルスがヒグロマイシン耐性遺伝子を獲得してい
ることを示すために、実施例Ｖに従って、PH3カルス及
びコントロールのカルスからゲノムDNAを分離し、サザ
ンプロット法で分析した。分離したDNA（10μｇ）をBam
H I（NEB）で消化し、TAE（40mMトリス酢酸、pH7.6、1m
M EDTA）バッファー中、15Vで16時間、0.8％w/vアガロ
ス・ゲルで電気泳動にかけた。Nytran膜（Schleicher a
nd Schuell）にこのDNAをトランスファーした。製造業
者の勧告に従って、トランスファー、交雑化及び洗浄条
件を実施した。
供給者の指示に従って、Oligo Labelling Kit（Pharm
acia）で標識する任意のプライマーにより、α−92P−d
ctP（ICN Radiochemicals社）で、32P標識プローブを調
製した。使用した鋳型DNAは、pHYG I 1の1055bpのBamH
Iフラグメントで、HPTコーディング配列全体を含んでい
る。
スクリーンを強化しながら、Ｘ−OMATICカセットのコ
ダックＸ−OMAT ARフイルムに膜を暴露した。予測した
1.05kbの位置に、PH3カルスのバンドが確認され、HPTコ
ーディングカルスの存在を示した。コントロールのカル
スには、バンドが確認されなかった。ヒグロマイシン遺
伝子が高分子量DNAに組み込まれていることを証明する
ために、PH3カルス及びコントロールカルスの非消化DNA
を、上述のように、電気泳動にかけ、ブロットして交雑
化した。非切断DNAと同じ移動度で、非消化PH3 DNAだけ
が、プローブに対して交雑化を示した。コントロールの
カルスのDNAでは、交雑化が認められなかった。この結
果は無傷のpHYG I 1あるいは小さな非染色体プラスミド
のように、PH3カルスにはHPTコーディング配列が存在し
ないことを証明するものである。この結果は、高分子量
DNAへのヒグロマイシン遺伝子の組み込みと一致する。
VI.植物再生及び種子の生産 60mg/のヒグロマイシンを含有するプレートから、
塩酸チアミン0.5mg/。2,4−D0.75mg/、スクロース5
0g/、アスパラギン150mg/、Gelrite2.5g/（サンジ
ェゴ、Kelco社）を補足したRM5基本塩（Murashigeら、1
962）でできているRMS培地に、PH3カルスの一部をトラ
ンスファーした。
RM5培地で14日後、RH3の大部分及び非選択コントロー
ルカルスをR5培地（2,4−Ｄを除く以外はRM5培地）にト
ランスファーした。このプレートを、26℃、暗がりで７
日間培養し、26℃で14時間照射し、10時間は暗い光管理
様式に移した。この点で、R5培地100mlが入っている１
クォートの缶詰製造ジャー（Ball）に、形成された苗木
をトランスファーした。植物を、固形に移植して成熟す
るまで栽培する前に、ジャーからバーミキュライトに７
〜８日間トランスファーした。PH3から合計45本の植物
ができ、コントロールカルスから合計10本の植物ができ
た。
同系交配のZea mays MBS501（Mike Brayton Seeds）F
R4326（Illinois Foundation Research）及び特許登録
同系交配株LM1112を用いて、標準技法により、成熟した
PH3植物のコントロールされた受粉が行われた。受粉後4
5日に種子を収穫し、１〜２日間乾燥させた。
VII.R1子孫の分析 R1植物にHPT及びGUS遺伝子配列が存在することを、PC
R分析法で試験した。HPT遺伝子の発現は、HPT活性の酵
素検定法で測定した。表３に、データをまとめる。これ
らのデータは、両親を通して、組み換えDNAが伝達及び
発現されることを証明するもので、メンデルの遺伝と一
致する。もとのカルスでは、HPTコーディング配列が高
分子量DNAに統合されるというサザンプロット法の証拠
を、遺伝データと組み合わせると、外来DNA配列は染色
体に統合されることが示唆される。R1子孫にGUS遺伝子
が存在することは、非選択遺伝子の同時形質転換及び遺
伝を証明するものである。
HPT酵素検定法は、下記の方法に基づいている。S.K.D
attaら、Bio/Technology,８,736（1990）,M.Stabell
ら、Anal.Bioshem.,185,319（1990）,E.Cabones−Basto
s,Gene,77,169（1989）。
根のサンプル（0.2g）を７〜10日齢の苗木から切り取
り、液体窒素（N2）で急速に凍結する。使い捨ての乳棒
と試験管を使用し、アルミナ及び400μｌのEB（50mMト
リス−塩酸、10％v/vグリセロール、0.1mM PMSF、pH7.
0）で30〜60秒間サンプルをすりつぶし、次にEppendorf
微量遠心機で10分間遠心分離した。Certricon 30フィル
ター・ユニットに上澄を移し、Beckman GRP遠心機の定
角ローターで、5000rpm、４℃で30分間遠心分離するこ
とにより、脱塩した。各フィルター・ユニットの洗浄
に、1mlのEBを使用し、さらに5000rpmで60分間、回転さ
せた。保持物質を回収し、−70℃で保存した。遺伝子変
換したカルス組織及びそのコントロールのサンプル（0.
2g）を上述のようにすりつぶし、その上澄を陽性及び陰
性のコントロールとして使用した。
Bradford,Anal.Bioshem.,72,248（1976）の方法を用
いて、BioRadキットで蛋白を定量した。根抽出物の蛋白
濃度は0.2〜２μg/μｌの範囲であった。
20mMトリス−マレイン酸、13mM MgCl2、NH4Cl、0.5mM
DDT、50μM ATP、0.61μg/μｌヒグロマイシンＢ、25
μg/μｌウシ血清アルブミン、ならびに12μCi/μｌγ3
2P−ATPを含有する反応混合液に根抽出物（４μｇ総蛋
白）を加えた。反応量は32μｌであった。反応混合液を
37℃で30分間インキュベートした。
反応混合液１μｌを、ポリエチレンイミン・セルロー
ス薄層クロマトグラフィー・プレート（Sigma Chem社）
にスポットした。50mMホルム酸pH5.4で展開し、風乾
し、Kodak XAR−５フイルムに暴露した。反応生成物リ
ン酸ヒグロマイシンは、この条件下では溶媒前面付近に
移動する。
PCR検定を実施するために、植物組織からサンプル0.1
gを採取し、液体窒素で凍結した。次に、0.1Mトリス−
塩酸200μｌ、0.1M NaCl、20mM EDTA、１％Sarkosyl、p
H8.5の中、４℃で、120グリットのカーボランダムでサ
ンプルをすりつぶした。フェノール／クロロホルム抽出
物ならびにエタノール及びイソプロパノール沈殿の後、
T.E.にサンプルを懸濁し、ポリメラーゼ連鎖反応で分析
した。（K.B.Mullis,合衆国特許第4,683,202号）。
50mM KCL、10mMトリス−塩酸pH8.4、3mM MgCl2、100
μg/mlゼラチン、0.25μM/ml、各々0.25Mの適切なプラ
イマー、各々0.2mΜのデオキシヌクレオチド・トリホス
フェート（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）、2.5単位のTag DNA
ポリメラーゼ（Cetus）、ならびに10μｌのDNA調製品の
中、容量100μｌでPCRを実施した。混合液に鉱油をの
せ、94℃まで３分間加熱し、１分間55℃、１分間72℃、
１分間94℃の35周期に増幅した。次に、この混合液を50
℃で２分間、さらに72℃で５分間インキュベートした。
PCR生成物10μｌを、アガロースゲル中で電気泳動にか
け、エチジウムブロマイドで染色して見えるようにし
た。
HPT遺伝子の存在の分析に、35Sプロモーターに相補的
なPCHプライマー１つ、ならびにHPTコーディング配列に
相補的なPCHプライマー１つを用いた。それゆえ、適切
な大きさのPCR生成物を作るために、HPT鋳型DNAは隣接
する35Sプロモーター領域、Adh1イントロン、及び５′
蛋白コーディング配列領域を含んでいなければならな
い。
GUS遺伝子の存在の分析に、GUS蛋白コーディング領域
内の配列に相補的なPCHプライマーを用いた。鋳型DNA
が、２つのプライマーの間に無傷のコーディング領域を
含んでいれば、797bpのPCR生成物が予測される。
実施例II.種子貯蔵蛋白をコード化している組み換えDNA
を含むカルス株AB63S由来の、結実能力があるトランス
ジェニック植物 10kDのゼイン貯蔵蛋白は、メイズ仁の胚乳に生産さ
れ、“種子貯蔵蛋白”と言われる蛋白の種類の代表的な
物の１つである。この蛋白は極めて高い濃度のメチニオ
ン（22.5％）を含有しており、ZpS10/（22）遺伝子によ
ってコード化されている（M.S.Bennerら、Tfeor.Appl.G
enet.,78,761（1989）；この中で、z10と言われる遺伝
子）。それゆえ、z10遺伝子の発現増加は、コーンのメ
チオニン含有量の増加に使用できる。キメラz10遺伝子
を含む、結実能力があるトランスジェニックコーンは、
実施例Ｉの手順により、幾つかの小さな修飾で達成でき
る。実施例IIも、実施例Ｉに使用されたものとは異なる
カルス株を使用して、組み換えDNAの導入を証明するも
のである。
I.組織培養株 本実施例に使用された、AB63Sと名付けられた胚形成
メイズカルス株は、実施例Ｉに記述されている開始及び
維持手順により、エリートの同系交配株A188とB73の間
の交配によって生じた未成熟胚から作られた。カルス株
は、砲撃の役７ヵ月前に開始されていた。砲撃の11週間
前に、この組織を1.9mmのスクリーンを強制的に通し
て、ふるい分け、N6維持培地上でプレート培養した。生
育１〜２週間後に、結果として生じた植物から、砕けや
すい、胚形成カルスを選択し、新たな培地にトランスフ
ァーし、再びふるい分ける前に、1.5〜３週間成育させ
た。この周期のふるい分け及び砕けやすいカルスの回収
は、組織に砲撃する前に、合計３回実施た。
実施例Ｉに記述されているプラスミドpHYG I 1及びpB
II 221を本実施例で使用した。加えて、プラスミドpZ2
7Z10は、DNA/タングステン調製に含まれていた。標準的
な組み換えDNA技法による3.2kbの環状プラスミドベクタ
ーpUC118を用いて組立てた（J.Vieiraら、Methods Enzy
mol.,153,3（1987）。pZ27Z10は、メイズ10kDゼイン遺
伝子（Kiriharaら、Gene,７,359（1988）本資料ではz10
と言われる）のコーディング配列及び３′非コーディン
グ配列のすぐ隣に位置する、メイズの27kDゼイン遺伝子
（D.E.Geraghty,ph,D.Thesis,ミネソタ大学（198
7）、）の５′転写調節領域を含む。z27調節遺伝子と、
z10コーディング及び３′配列の組合わせは、本資料で
はキメラz27−z10遺伝子と言われる。35Sプロモーター
に隣接するCaMYゲノム領域のポリＡシグナルは、pZ27Z1
0のz10遺伝子配列の３′の位置をしめる。図７は、本プ
ラスミドの地図を表す。
プラスミドpZ27Z10のサンプルのサンプルを、ブダペ
スト条約の規定に従って、メリーランド州リークビリー
のAmerican Type Culture Collectionに、受入れ番号AT
CC 40938で供託した。
III.DNA伝達過程 微小投射物砲撃法の３週間前に、メイズ胚形成カルス
株AB63Sの組織を継代培養した。1.9mmスクリーンを通し
てふるい分け、その組織を砲撃用に調製した。ふるい分
けた組織を、滅菌した、フィルター当たり約500mgの薄
いローンの、5.5cmのWhatman No.1フィルターディスク
上でプレート培養した。合計６ディスクの組織を調製し
た。微小投射物砲撃法に先立って、組織を含有するフィ
ルターディスクを空のペトリプレートにトランスファー
した。プレートにふたをしないで、層流フードの中に20
分間放置して、組織を少し乾燥した。組織がそれ以上乾
燥するのを防ぐため、砲撃に使用するまでプレートを多
湿の中で保存した。
砲撃に使用したDNAはプラスミドpHYG I 1、pZ27Z10、
及びpB II 221の1:1:1（重量で）で構成されていた。実
施例Ｉに記述されている通りに、タングステン粒子上に
DNAを沈澱させた。
BiolistiTMPDS1000（DuPont）装置を使用したこと、
ならびに組織の上にスクリーンをのせなかったこと以外
は、実施例Ｉに記述されている通りに、砲撃した。カル
ス組織を含む６個のフィルターディスクを下記のように
処理した。フィルター２個は、DNA/タングステン調製品
（潜在的な陽性処理 2X）で各２回砲撃し、フィルター
３個は、DNA/タングステン調製品（潜在的な陽性処理
1X）で各１回砲撃し、フィルター１個は、DNA/タングス
テン砲撃に使用したタングステンと同一重量を用いたタ
ングステン／水懸濁液で１回砲撃した（陰性の処理）。
IV.形質転換カルスの選択 砲撃後、2X DNA処理のカルス組織を含むフィルター
ディスクを、ラウンド１選択プレート、15mg/のヒグ
ロマイシンを含有するＦ培地、にトランスファーした。
1X DNA処理の２個のフィルターならびに陰性のコント
ロール処理のフィルターも、ラウンド１選択プレートに
トランスファーした。非選択コントロールカルスとして
使用するために、1X DNA処理の３番目のフィルター
を、ヒグロマイシンを含有しないＦ培地にトランスファ
ーした。この非選択コントロールカルスは潜在的に陽性
であるため、比較の目的で、選択の初めの２ラウンドの
間、維持されるだけである。その後、ヒグロマイシンを
含まないＦ培地に維持された非砲撃AB63Sカルスをヒグ
ロマイシン選択コントロールカルスとして用いた。
５日後、小さな凝集塊（約25mg）のカルスを、フィル
ターディスクから新たなラウンド１選択培地にトランス
ファーした。プレート培養密度に、プレート当たりカル
ス凝集塊10個であった。この時までに、カルスは重量で
約２倍に増加していた。同じ方法で、ヒグロマイシンを
含まないＦ培地に、非選択コントロールカルスをトラン
スファーした。砲撃後15日に、ラウンド１選択培地から
ラウンド２選択培地（60μg/のヒグロマイシンを含有す
るＦ培地）に全組織をトランスファーした。今回のトラ
ンスファーでは、プレート培養密度は、プレート当たり
カルス凝集塊14個であった。前回のトランスファーから
14日間で、カルスは容積で約３倍に増加していた。23日
後、ラウンド２選択培地から、60μg/のヒグロマイシン
を含有するラウンド３選択培地に全組織をトランスファ
ーした。
砲撃後59日に、壊死カルス凝集塊で囲まれた中に、行
きているセクターが５つ認められた。前回のトランスフ
ァーからの連続的なプレート上に互いに隣接して出現し
たため、このセクター５個は、ラウンド２選択に由来す
るただ１つのカルス凝集塊から誘導されたものと考えら
れた。このセクターは、2X DNA処理から生じ、カルス
株Metlと呼ばれた。
ヒグロマイシン60μg/mlを含有するＦ培地及びヒグロ
マイシンを含まないＦ培地に、カルス株Metlをトランス
ファーした。22日間インキュベートした後、２種の培地
上の組織の成育及び外観に、見た目による違いは認めら
れなかった。このカルス株Met1は急速に成長し、培地中
にヒグロマイシンが存在することによって阻止されない
ようであった。Metlカルスは、かなり砕けやすく、どち
らの培地でも胚形成性であって、ヒグロマイシンを含ま
ないＦ培地で成育したコントロールAB63Sカルスと視覚
的に区別することはできなかった。
V.形質転換カルスの確認 Met1カルス及びコントロールAB63Sカルスを使って、
阻止検査を実施した。阻止検査を開始する前に、ヒグロ
マイシンを含まないＦ培地でMetlカルスを21日間成育さ
せた。Met1カルス及びコントロールAB63Sカルスを、
０、15、60、100及び200mg/のヒグロマイシンを含有
するＦ培地のプレートにトランスファーした。各濃度の
ヒグロマイシンにつき、各カルス株のプレートを３個調
製した。各プレートには、１個約50mgのカルスピース
が、５〜６個含まれていた（プレート当たりの総カルス
は約300mg）。
28日間インキュベートした後、各プレート上のカルス
重量を測定した。各ヒグロマイシン濃度で得られた平均
重量を、0mg/ヒグロマイシンで得られたカルスの平均
重量で割り、成育阻止率を求めた。その結果は、15、60
及び100mg/のヒグロマイシン濃度で、Met1カルスの成
育は完全に阻止されたことを示した。200mg/のヒグロ
マイシンを含有する培地上で、Met1カルスの成育は約20
％阻止された。対照的に、AB63Sカルスの成育は、全て
のヒグロマイシン濃度で阻止され、200mg/ヒグロマイ
シンでは、AB63Sカルスは、成育が約90％阻止された。
この結果から、カルス株Met1は、増殖培地中に存在する
ヒグロマイシンに耐性を示すことが確認された。
Met1カルスDNAにヒグロマイシン耐性遺伝子が存在す
ることを確認するために、またカルスがキメラz27−z10
遺伝子も獲得したかどうかを決定するために、サザンブ
ロット検定法を実施した。HPTコーディング配列の検出
には、Met1カルス及びコントロールカルスから分離した
DNAサンプルを、制限酵素BamH I,Hind II 1及びBstE II
で消化した。消化したDNAサンプルを、0.8％アガロース
ゲルで電気泳動にかけ、実施例Ｉに記述されているよう
に、Nytran膜にブロットした。ブロット前のエチジウム
ブロマイド染色ゲルの視覚的検査では、BamH I消化は完
全のようであるが、Hind II 1もBstE IIも、かなりの程
度までDNAを開裂しなかったことを示した。ビオチン標
識した、HPTコーディング配列の1.05kb BamH Iフラグメ
ントでブロットを精査した。交雑化、洗浄及び検出に用
いた条件は、本実験に使用したBRL PhotogeneTMキット
の示唆通りであった。
交雑化の後で、BamH I消化したMet1 DNAを含有する
レーンに、約2.7、4.5及び6.5kbの大きさのほか、予測
した1.05kbの大きさの、標準バンドを確認した。この結
果から、HPTコーディング配列がカルス株MetlのDNAに存
在することが示された。この他の2.7、4.5及び6.5kbの
バンドは、制限酵素消化が不完全であるか、あるいはHP
T配列の配列し直した複数のコピーが存在することを示
した。Hind II 1及びBstE II消化の場合には、両レーン
で非消化DNAの位置に、交雑化シグナルを見ることがで
きた。この結果は、HPTコーディング配列は、Met1ゲノ
ムの高分子量DNAに集積されることを示した。コントロ
ールカルスのDNA消化物を含有するどのレーンにも、非
交雑化シグナルは認められなかった。
キメラz27−z10遺伝子の検出には、Met1カルス及びコ
ントロールカルスから分離したDNAサンプルを用いて、
サザンブロット検定法を実施した。DNAサンプルを、制
限酵素BamH I及びEcoR Iで消化した。BamH I消化は、本
形質転換に使用した、pZ27Z10構造のz10コーディング配
列及び３非コーディング配列を含有する2.76kbフラグメ
ントを遊離させる。7.26kb pZ27Z10プラスミドには、Ec
oR I部位がただ１個ある。Photogene kit（BRL）に記述
されている条件を用いて、z10コーディング配列全体を
含有するビオチン標識プローブで、作製したブロットを
交雑化した。
BamH I消化の場合には、Met1及びコントロールカルス
の両DNAを含有するレーンの9kb及び約15kbに、内因性z1
0配列が交雑化シグナルを示した。Metlサンプルの約3.5
kbに、補足的なバンドが認められたが、コントロールDN
Aサンプルでは認められなかった。予測されたMet1 DNA
の2.76kbサイズに、強度の交雑化信号は認められなかっ
た。Met1 DNAのBamH I消化に2.76kbの標識バンドが存
在しなかったことは、DNAの不完全消化、もしくは導入
したDNAの再配列を示した。
EcoR I消化の場合、Mer1及びコントロールの両カルス
DNAの、約12kb及び16kbに、内因性z10配列の交雑化シグ
ナルを示した。Met1サンプルの約14kbに、補足的なバン
ドが認められたが、コントロールDNAサンプルでは認め
られなかった。この結果は、コントロールカルスDNAの
サンプルには存在しない、Met1カルスのDNAに新たなz10
配列が存在することを示した。
以上の結果を、Met1及びコントロールカルスDNAをBam
H I、Nco I及びNsi Iで消化した、２回目のサザンプロ
ット検定法で確認した。Met1及びコントロールカルスの
非消化DNAのサンプルも含めた。32P標識したz10コーデ
ィング配列プローブで、フィルターを精査した。消化物
の全てに、陰性のコントロールカルスDNAサンプルには
存在しない新たなz10交雑化シグナルが、Met1カルスDNA
には認められた。以上の結果から、Met1カルスに新たな
z10コーディング配列が存在することが確認された。非
消化DNAを含有するレーンの、Met1及びコントロールカ
ルスの非消化DNAの位置に、交雑化シグナルが認められ
た。これらの結果は、Met1カルスの染色体DNAに導入さ
れたz10配列が集積されることを示した。
VI.植物再生及びトランスジェニック種子の生産 実施例Ｉに記述されているように、Met1株及びコント
ロールAB63S株のカルスをRM5培地にのせた。26℃、暗が
りで14日間インキュベートした後、実施例Ｉに記述され
ているように、カルスをR5培地にトランスファーした。
26℃、暗がりで７日間インキュベートし、次に実施例Ｉ
に記述されている条件の明るい所に移した。明るい所で
14日後、RS培地100mlが入ったMagenta box（Sigma Chem
ical社）に苗木をトランスファーした。本培地で７〜14
日後、苗木をバーミキュライトに７日間、次に土壌に移
したところ、成熟するまで成育した。Met1カルスから、
合計49本の植物（Metl−１〜mMet1−49と呼ばれる）が
再生し、コントロールAB63Sカルスから合計25本の植物
が再生した。
Met1カルスから再生した植物が、導入されたDNAを保
持していたことを確認するために、葉の組織から調製し
たDNAのサンプルに、PCR分析を実施した。この目的のた
めに、６種のオリゴデオキシリボヌクレオチド１組を使
用した。これらのオリゴヌクレオチドの配列、配向及び
ず８に示したキメラz27−z10遺伝子構造内の相対的位置
を下記の表４にまとめた。
オリゴヌクレオチド（またはプライマー）の１組を、
１つのz27オリゴヌクレオチド（z275′またはz27mid）
と１つのz10オリゴヌクレオチド（z10midまたはz10
3′）からなる１対のオリゴヌクレオチドを用いて、内
因性のトウモロコシz227またはz10遺伝子からではな
く、キメラz27−z10遺伝子だけからフラグメントの増幅
が起こるようにデザインした。これらz27−z10−特異オ
リゴヌクレオチド対を用いたPCR反応中に期待する大き
さの増幅フラグメントが現れることは、特別のカルスま
たは植物DNA試料中にキメラz27−z10遺伝子が存在する
ことを示す特徴である。
z27オリゴヌクレオチド（z275′またはz273′を有す
るz27mid）の一対あるいはz10オリゴヌクレオチド（z10
midを有するz105′またはz103′）の一対を用いると、
対照AB635カルスDNA、Met1カルスDNAまたはpz27z10プラ
スミドDNAについて実施されたPCR反応において使用する
とき、それぞれz27調節配列またはz10コーディング配列
を表すフラグメントの増幅が起こる。これらの反応は特
定のカルスまたは植物DNA試料からの内因性トウモロコ
シ遺伝子配列の増幅に関する陽性対照として役立つ。
葉のDNAは以下に述べるように、二つのMet1 RO植物
（Met1−１及びMet1−２と命名）と一つの対照AB63S RO
植物から調製した。PCR反応はこれらのDNA試料につい
て、HPTコーディング配列、キメラz27−z10遺伝子、z27
調節配列およびz10コーディング配列に特異的なオリゴ
ヌクレオチド対を用いて実施した。PCR反応生成物のゲ
ル解析から、期待した大きさの増幅生成物がMet1−1DNA
及びMet1−2DNAを用いたすべての反応について得られ
た。対照AB63S DNAはHPTコーディング配列とキメラz27
−z10遺伝子に関して陰性であったが、内因性z27調節配
列とz10コーディング配列に関しては陽性であった。こ
れらの結果から、験べたMet1 RO植物は導入されたHPT
DNAとキメラz27−z10DNAを保持していることが実証され
た。
特徴的なz27−z10 PCR反応生成物がz27調節配列とz10
コーディング配列の両者を含んでいることの確実な証拠
として、PCR反応生成物についてサウザーンブロット分
析を行った。同じ試料を負荷した二つのアガロースゲル
からサウザーンブロットフィルターを調製した。その試
料には、上に述べたz27調節配列、z10コーディング配
列、およびキメラz27−z10遺伝子配列の増幅によって得
られたPCR反応生成物が含まれている。一つのブロット
をz10コーディング配列プローブとハイブリダイズし、
他のブロットそz27調節配列プローブとバイブリダイズ
させた。その結果、z10コーディング配列プローブはz10
コーディング配列PCR反応およびキメラz27−z10遺伝子P
CR反応からの増幅フラグメントとハイブリッドを形成し
たのに対して、z27調節配列PCR反応からの増幅フラグメ
ントとはハイブリッドを形成しなかった。同じように、
z27プローブはz27調節配列PCR反応およびキメラz27−z1
0遺伝子PCR反応からの増幅フラグメントとハイブリッド
を形成したのに対して、z10コーディング配列PCR反応か
らの増幅フラグメントとはハイブリッドを形成しなかっ
た。これらの結果から、PCR反応において増幅されたフ
ラグメントは期待した遺伝子配列を含むこと、そしてキ
メラz27−z10遺伝子に対する特徴的なPCR増幅生成物はz
27調節配列とz10コーディング配列の両方を含むことが
示された。
トウモロコシの近交系A100、B73、A654およびH99につ
いて成熟Met1 RO植物の授粉調節を行なった。さらに、
いくつかの自家−および同胞受粉を実施した。Met1 RO
植物を雄花粉ドナーと雌花粉レシピエントの両方に用い
て全部で130の授粉を行なった。授粉後45日に成熟した
種子を収穫してのち１〜２週間乾燥させた。
VII.R1子孫の分析 HPT配列とキメラz27−z10遺伝子の存在をR1子孫の３
つの組についてR1植物組織からのDNAのPCR分析によって
評価した。
分析したR1子孫の最初の組は、RO植物Met1−７からの
４個の未成熟ふさ−種子から成っている。これらのふさ
−種子はMet1−７のふさから成長した絹の開放授粉を通
じて得られた。授粉後約18日目に、そのふさ−種子を植
物から除去し、表面を殺菌消毒した。各種子から内乳を
切り出し、ドライアイス上で凍結、DNA分離に使用する
まで−70℃で貯蔵した。
各種子からの胚をR5培地に移し発芽させた。10日後芽
生えをvernmiculateに７日間継代し、ついで土壌に移し
て発育熟成させた。HPTコーディング配列、キメラz27−
z10遺伝子およびトウモロコシAdh−１遺伝子に特異的な
オリゴヌクレオチドの組を用いてそれぞれの内乳から分
離したDNAについてPCR分析を実施した。４個の内乳DNA
試料のうちの三つは、上記遺伝子配列のすべてに対して
陽性であることがわかった。第４番目のDNA試料はHPTコ
ーディング配列とキメラz27−z10遺伝子配列に対して陰
性であったが、内因性Adh−１配列に対して陽性であっ
た。これら野結果からHPT配列とキメラz27−z10遺伝子
のいずれもMet1−７のR1子孫にトランスミットされてい
たことがわかった。同様の分析をA654XMet1−１の交雑
から得た24個の種子について実施した。授粉後24日に種
子を穂から除去し、表面を殺菌消毒した。内乳と胚を分
離し、上に述べたと同じように処理した。内乳DNA試料
のPCR分析によって、24個の子孫のうち９個がHPT配列と
キメラz27−z10遺伝子の両方を受け取っていることがわ
かった。残りの15個の子孫は導入した遺伝子配列のいず
れも保持していなかった。分析したR1子孫の３番目の組
はRO植物Met1−６の自家授粉から由来する28個の２週齢
芽生えの葉組織から調整した。
葉DNA試料の分析からR1子孫の24個がHPT配列とキメラ
z27−z10遺伝子の両方を保持していることがわかった。
残り４個のR1子孫（progeny）は導入した遺伝子のいず
れも保持していなかった。上記分析結果を表５に要約
し、これによりMet1植物のR1子孫のかなりの部分が導入
DNAに遺伝されていることが実証された。
遠縁交雑群からのz27z10/HPT−植物に対するz27z10＋
/HPT＋植物の比は単一遺伝子座の1:1分離比と矛盾しな
い。さらに、自家授粉群からのz27z10/MPT植物に対する
z27z10＋/HPT＋植物の比は単一遺伝子座の3:1分離比と
矛盾しない。データはまた導入HPTとz27−z10配列が結
合していることを示している。
例III 殺虫性蛋白質をコードする組み換えDNAを含むカルス系A
B12からの稔性トランスジェニック植物 種々のバチルスthuringiensis遺伝子によってコード
される蛋白質は多くの殺虫上の応用において有用なこと
が示されている。特定のヘテロBt遺伝子によるトランス
ジェニックトウモロコシ植物の産生は、特定の病害虫に
対するその植物の抵抗性を増強するだろう。組換えBt遺
伝子を含む稔性トランスジェニック植物は、以下に示す
ように、例１に従い、それにいくつかのわずかの変更を
ほどこして作られる。
同時に、例１のカルス系であるAB11をイニシエート
し、他のカルス系も作製する。AB12は同じ両親型遺伝子
型（A188XB73）をもつ植物の分離交雑から作製する。こ
の例はAB11とAB63Sに加えて第３のカルス系から稔性ト
ランスジェニック植物が再生することを示し、さらに稔
性トランスジェニック植物の産生が単一カルス系だけに
特異な性質によるのではないことを示している。
例１に記述したプラスミドpHYG I 1を用いたが、同時
に、ネオマイシンフォスホトランスフェラーゼ（NPT I
I）遺伝子とフレーム融合した殺虫剤性のバチルスthuri
ngiensisエンドトキシン（BT）遺伝子を含むプラスミド
であるpMS533も用いた。融合遺伝子からの５′位置にCa
MVとノーパリンシンターゼプロモーターからのDNAのセ
グメントが位置している。融合遺伝子からの３′位置に
は、ノーパリンシンターゼ遺伝子のpolyA領域とトマト
プロテアーゼ阻害剤Ｉ遺伝子から由来するDNAのフラグ
メントがある。
カルスに対しては例Ｉに述べた方法で行うが、プラス
ミドpHYG IIとpMS533を含むタングステン/DNA調製物中
に用いたDNAだけが異なる。一つのチューブはわずかに
５μlTE（10mM Tris−Hcl pH8.0、1m MEDTA）を含むだ
けである。
つぎの打込みが行われた:11×pHYG II/pMS533（陽性
処置能あり）と3XTE調製物（対照処置）。
打込み後、pHYG II/pMS533処理からのカルスを、プレ
ートあたり10個のピースとして15mg/のハイグロマイ
シンを含むＦ培地であるラウンド１セクションプレート
（選択平板）上に置いた。同様のことをTE調製物（セレ
クト対照カルス）を打込んだプレートのうちの２個につ
いて行った。TE調製物を打込んだカルスの一つのプレー
トをハイグロマイシンのないＦ培地上に置いた；このカ
ルスを対照組織（非セレクト対照カルス）のソースとし
て実験期間中保持した。
18日後、カルスをラウンド１セレクションプレートか
ら、60mg/ハイグロマイシンをプレートあたり10個の3
0mgピースとして含むラウンド２セレクションプレート
に移した。ラウンド２セレクションプレート上で21日間
選別した後、カルスは完全に阻害されていた。カルスの
全部を、ラウンド２セレクションプレートからハイグロ
マイシン60mg/を含むラウンド３セレクションプレー
トに移した。
ラウンド３セレクションプレート上で42日間経過後、
周囲の壊疸組織から６つのセクターが繁殖しているのが
観察され、これらの全てがpHYG I 1/pMS533処置済試料
からのものであった。カルス系はＦ培地に移された。
24日後、CB2で表される１つのカルス系が相当に成長
した。各カルス系の一部が（ｉ）ハイグロマイシン15mg
/を含むＦ培地若しくは（ii）ハイグロマイシン60mg/
を含むＦ培地に移された。対照カルスをハイグロマイ
シン15mg/を含むＦ培地に移した。
６つのカルス系のうち１つ、CB2、だけが60mg/のハ
イグロマイシン存在下の別培養基で成長を続けることが
できた。DNAをこのカルスの一部から離し、Bt遺伝子の
存在をサザンブロット（Southern blot）分析で確認し
た。
DNAはBamH IとXho Iを組合わせた制限酵素で消化され
た。BamH IはBtコーディング配列の５′エンドで切り、
Xho Iはコーディング領域の３′エンドで切る。A32Pと
表示されたプローブはpMS533の1.8kb BamH I/Xho I制限
フラグメントから作製された。予想された1.8kbのバン
ドが、交配と放射能写真撮影の後に確認された。非形質
転換カルスからとったDNAにはバンドが全く存在しなか
った。
植物がCB2から再生され、上述のごとくR1世代を生産
すべく制御受粉が行われた。R1植物はPCR分析でHPT及び
Bt遺伝子配列の存在を、また、例Ｉに記載のごとく酵素
アッセイでHPT遺伝子表現を確かめられた。
例Ｉに記載の方法でPCR分析がR1苗木の根組織から分
離されたDNAについて行われた。各DNA標本がPCRに適当
であることをテストするため、ネイティブメイズ10Kdゼ
イン遺伝子に特有のプライマーを用いたPCR分析を行っ
た。Bt遺伝子のPCR分析に用いたプライマーは、35Sプロ
モーターに相応するものとBtコーディング配列に相応す
るものである。HPT PCR分析に用いたプライマーは、例
Ｉに記載のものと同じである。この分析の結果は表６に
示されるとおりである。結果は雄雌の両親からの導入HP
T及びBt遺伝の伝達を示しており、観察された頻度はメ
ンデルの遺伝法則と合致している。結果はHPT及びBt遺
伝子の染色体DNAへの挿入と一致している。また、HPT及
びBt遺伝子のリンクした状態での遺伝が確認され、二つ
の遺伝子が同一の染色体に近接して挿入されていること
を示す。
例IV 二つの完全な性サイクルを通じて組換えDNAを伝達する
カルス系統AB12からの稔性トランスジェニック植物 I.植物系統と組織培養 カルス系統AB12を用い、それは例IIIに記述してあ
る。
II.プラスミド 例Ｉで述べたプラスミドpD II 221とpHYG I 1を用い
た。
III.DNA カルスの打込みは、タングステン/DNA調製物中に用い
たDNAが異なることを除いて例Ｉと同じように行った。
すべてのチューブは、水中25μl 50mg/ml M−10タング
ステン、25μl 2.5M CaCl2および10μl 100mMスペルミ
ジンとともに全部で５μｌ 1mg/mlの全プラスミドを含
有している。１個のチューブをプラスミドは含まず５μ
ｌ TE緩衝液を含む。
以下の打込みを行った:2XPB II 221調製物（一過性の
発現用）;7XpHYG II調製物（陽性処置能あり）；および
3XTE調製物（陰性対照処置）。
すべての打込みを実施したのち、PB II 221処理から
のカルスをプレートごとに５個の50mgピースとしてのＦ
培地に移した。２日後、カルスを例Ｉにおけると同じよ
うにGUS緩衝液中に置いた。一時的に発現したカルスの
数をかぞえたところ686および845個のGUS陽性細胞が見
出され、このことは粒子放出プロセスが他の打込みプレ
ート中でも起こっていることを示唆している。
IV.トランスフォームカルスのセレクション打込みのの
ち、pHYG II処理からのカルスをラウンド１セレクショ
ンプレート、すなわちプレートあたり10個の25mgピース
として15mg/ハイグロマイシンを含むＦ培地に置い
た。同じことをTE調製物で打込みをしたプレートのうち
の二つについて行った（セレクト対照カルス）。TE調製
物で打込みしたカルスの一つのプレートをハイグロマイ
シンのないＦ培地上に置いた；このカルスは対照組織の
ソースとして実験期間中保持した（非セレクト対照カル
ス）。
13日後、ラウンド１セレクションプレート上のカルス
は非セレクト対照カルスと区別できなかった。すべての
カルスをラウンド１セレクションプレートから60mg/
ハイグロマイシンを含むラウンド２セレクションプレー
トに移した。プレートの数の約５倍の増加が起こった。
ラウンド２セレクションプレート上のカルスは23日後に
実質的に重量が増加したが、この時点で壊死のように見
えた。全部のカルスをラウンド２セレクションプレート
から60mg/ハイグロマイシンを含むラウンド３セレク
ションプレートに移した。
打込み後58日目に、３個の生きたセクターが周囲の死
んだ組織から増殖するのが観察された。３系統すべてと
もpHYG II処理からのものであり、24C、56Aおよび55Aと
名づけられた。
維持培地上15日ののち、各系統の成長が観察された。
系統24Cはよく成長したが55Aと56Aの成長はより遅かっ
た。三つの系統すべてを60mg/のハイグロマイシンを
含むＦ培地に移した。維持培地からの非セレクト対照カ
ルスもまた60mg/ハイグロマイシンを含むＦ培地にプ
レートした。
60mg/ハイグロマイシン上19日ののち、系統24Cの成
長は完全に阻害されたようにみえたのに対して、対照は
24Cの体重増加の約80％を示した。系統56Aは完全に壊死
的であり、55A系統は壊死に極めて近かった。系統24Cと
55Aを、対照組織と同じように60mg/ハイグロマイシン
を含むＦ培地に再び移した。60mg/ハイグロマイシン
上に23日置いたのち、24C系統は再び完全に阻害されな
くなったようにみえた。55A系統は、陰性対照カルスを6
0mg/ハイグロマイシンを含むＦ培地に２回目に暴露し
たときの陰性対照カルスのように完全に死滅した。
V.トランスフォームカルスの確認 24C系統から得たBamH I−切断DNAからサザーンブロッ
トを調製し、例Ｉに述べたHPTプローブでプローブし
た。図６に示すように、24C系統に関して観察されたバ
ンドが期待の大きさ1.05kbに観測され、このことは24C
系統がHPTコーディング配列を含むことを示している。
対照組織からのDNAではバンドは観測されなかった。カ
ルス系統24Cの名前をPH2と変えた。
ハイグロマイシン遺伝子が高分子量DNA中に組み込ま
れたことを実証するために、PH2カルスと対照カルスか
ら分離したDNAを（ｉ）制限酵素なし、（ii）前に述べ
たようにBamH I、または（iii）HPTコーディング配列内
で１回だけプラスミドpHYG I 1を切断するPst Iで処理
した。試料をブロットし、前に述べたようにHPTコーデ
ィング配列でプローブした。
切断しないPH2DNAだけが非切断DNAの位置のプローブ
へのハイブリッド形成を示し、このことはハイグロマイ
シン遺伝子が高分子量DNA中に組み込まれたことを実証
している。BamH Iで切断したPH2DNAついての1.05kbの期
待バンドが、前に示したように観測された。Pst Iで切
断したPH2DNAについては、切断されない無傷のpHYG I 1
プラスミド上にハイグロマイシン遺伝子が存在する場合
には、5.9kbのバンドがみられるはずである。もしも遺
伝子がゲノムDNA中に取り込まれれば、種々の大きさの
２個あるいはそれ以上のバンド（宿主DNA内でのPst Iの
作用点に依存する）が期待されるであろう。分子量が約
6.0と3.0kbの２つのバンドが観測された。これらのデー
タは高分子量DNA内へのハイグロマイシン遺伝子の組み
込みと矛盾しない。上記いずれの処理によっても、対照
カルスからのDNAについてはハイブリッド形成は観測さ
れなかった。
これらの結果は、HPTコーディング配列は無傷のpHYG
I 1または小さな非クロモソームプラスミドとしてPH2カ
ルス中に存在していないことを実証している。これらは
また高分子量DNA中へのハイグロマイシン遺伝子の組み
込みとも矛盾しない。さらにサザーンブロット分析によ
ってHPTコーディング配列は35Sプロモーター配列とも近
接していることが証明された。
VI.植物の再生と種子の産生 PH2系統を非セレクト対照カルスとともに、例Ｉにお
けるように植物を再生させるためにRM5培地に移した。R
5培地上25日ののち、その小植物をR5羽位置に移し20日
間生長させた。この時点で小植物を１週間vermiculite
に移し、ついで土壌に移してそこで性的に成熟するまで
成長させた。ついで近交系統B73を用いて調節授粉を行
った。
VII.R1子孫の分析 A.花粉ドナーとしてのPH2 B73XPH2.6交雑からの10個のR1子孫植物を根伸張と黄
化葉のアッセイの両方を用いてHPT発現についてアッセ
イした。１個の陽性植物が確認された。陽性植物中のHP
T遺伝子の存在は例Ｉに述べたようにHPTプローブをもち
いてサザーンプロット分析により確認した。
根伸張のバイオアッセイを行うため、市販の漂白剤を
水で1:1に薄めたものと0.1％アルコネクス中で20分間12
5mlのエルレンマイヤーフラスコ中で殺菌し、殺菌水中
で３回すすいだ。種子を50mg/mlカプタンを浮む殺菌水
中で150rpmで攪拌しながら一晩中吸水させた。
吸水後、溶液をフラスコから移しH2Oで飽和した発芽
紙３枚を含むフローボックス（Flow Laboratories）へ
種子を移した。４枚目の水飽和発芽紙を種子の上部に置
いた。種子を４日間発芽させた。
種子が発芽してのち、主要根の先端約1cmをそれぞれ
芽生えから切り取り、MS塩、20g/ショ糖、50mg/ハ
イグロマイシン、0.25％ゲルライトを含む培地上にプレ
ートし、26℃で４日間暗所でインキュベートした。
根を根毛と根枝が豊富に存在するか否かについて評価
した。根が根毛と根枝をもっているときトランスジェニ
ック（ハイグロマイシン受容性）と分類し、根枝が少な
い場合トランスフォームなし（ハイグロマイシン感受
性）とした。
根の先端を切り取ったのち、１つのPH2穂と１つの対
照穂の芽生えを湿ったvermiculateに移し、ついで暗所
で５日間成育させた。この時点で、黄化葉バイオアッセ
イを行うため1mmの切片を子葉鞘の先端から切り取り、
表面を10秒間殺菌し、MS基礎塩類、20g/ショ糖、ゼロ
（対照）または100mg/ハイグロマイシンのいずれかを
有する2.5g/ゲルライト上にプレートして暗所で26℃1
8時間インキュベートした。それぞれのプレートはそれ
ぞれの苗条（shoot）の２重の切片を含んでいる。つい
でプレートを明14時間、暗10時間の方式で26℃48時間イ
ンキュベートし、葉組織中の緑色の百分率に関して０
（すべて褐色）から６（すべて緑色）までのスケールで
等級づけた。苗条がゼロ段階のときそれらはトランスフ
ォームしない（感受性）と分類し、３またはそれ以上の
ときトランスフォーム（ハイグロマイシン抵抗性）と分
類された。
B.花粉レシピエントとしてのPH2 PH2.23XB73交雑と名づけられたPH2植物からの80R1子
孫植物を根伸長によるHPT発現をアッセイし、26個が陽
性とされた。HPT遺伝子の発現を26個すべてについてフ
ローボックス中、ハイグロマイシン−含有培地への芽生
えの直接暴露によってさらに確認した。抵抗性植物の二
つをPCRで分析し、HPT配列の存在を確認した。
VIII.R2子孫の分析 PH2を花粉両親として有するトランスジェニックR1植
物を成熟するまで成育させてFR4326植物を受粉するのに
用いた。
この交雑からのR2種子を発芽させてPCRによってHPT配
列の存在に関してテストした。HPT遺伝子の発現を例Ｉ
で述べたHPT酵素アッセイで決定した。
テストした19個の子孫のうち３個がHPT遺伝子配列を
有しており、HPT酵素活性も発現した。残りのものはHPT
配列も含まず酵素活性も示さなかった。この結果は花粉
の伝達と遺伝子工学によるDNAが２世代を通じて発現す
ることを実証しており、遺伝子が安定なことを示してい
る。
例Ｖ 例IIIで述べた砕け易い、胚発生トウモロコシカルス
培養AB12を用いた。
標準の組換えDNA法を用いて、3.2kb環状プラスミドで
あるベクターPBS＋（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）
中にプラスミドpC II N1−１とpLUC−１を組み立てた。
pCHN−１はAqrobacterium tumefaciens（Chilton and B
arnes 1983）のノパリンシンターゼ（nos）ポリアデニ
ル化配列が３′末端で付着している大腸菌（Gritz et a
l.1983）からのハイグロマイシンＢフォスホトランスフ
ェラーゼ（HPT）コード配列を含む。発現はHPTコーディ
ング配列から上流に位置するカリフラワーモザイクウィ
ルス（CaMV）35Sプロモーター（Guilley et al.1982）
によって推進される。プラスミドpB II 221とpHYG I 1
もまたこの例で用いられた。
PLUC−１はホタルのルフェラーゼコーディング配列
（Dewet et al.1987）を含んでおり、この配列は５′末
端にCaMV35Sプロモーターが付着していて、３′末端に
はnosポリアデニル化配列が付着している。このプラス
は主として陰性対照DNAとして用いられる。プラスミド
は微小投射物砲撃によってAB12のなかに導入した。例Ｉ
で述べたのと同じ方式で26個のプレートを調製した。１
個のチューブはプラスミドpB II 221だけを含む;2個の
チューブはpHYG I 1とpB II 221両方のプラスミドを含
む；そして１個のチューブはプラスミドpLUC−１だけを
含む。実施した打込みを表７に要約してある。
pB II 221で打込みしたカルスの２個のプレートを一
時的GUS発現に関してアッセイした。青色の細胞数を数
えたところ、２個のプレート中に291個と479個の一時的
GUS発現細胞があり、このことはDNA放出プロセスが他の
打込みプレートについても起きていたことを示唆する。
すべての試料に打込みを行った直後に、pHYG II/pB I
I 221、pCHN1−1/pB II 221で処理したすべてのプレー
トおよびpLUC−１で処理したプレートのうちの３個から
のカルスをプレートごとに15mg/ハイグロマイシンＢ
を含むＦ培地（プレートあたり５ピース）であるラウン
ド１セレクションプレートに移した。pLUC−１で処理し
た第４番目のプレートからのカルスをハイグロマイシン
のないＦ培地に移した。この組織を非セレクト対照カル
スとした。
２週間のセレクションののち、組織はセレクティブと
非セレクティブ両方の培地上で本質的に同じように見え
た。pHYG I 1/pB II 221およびpHN1−1/pB II 221処理
のそれぞれからの８個のプレートと、セレクティブ培地
上の対照カルスの２個のプレートからのすべてのカルス
を、ラウンド１セレクションプレートから60mg/ハイ
グロマイシンを含むラウンド２セレクションプレートに
移した。ラウンド２セレクションプレートはそれぞれプ
レートあたりカルスの30mgピースを10個含んでおり、こ
の結果プレートの総数の増大が起こる。
セレクティブ培地上の残りの組織、すなわちそれぞれ
pHYG I 1/pB II 221とpCHN1−1/pB II 221で処理した組
織の２個のプレートと対照KSルスの１個を、37℃でGUS
アッセイ緩衝液中に置き、打込み後２週間で青い細胞の
クラスターが観測されるかどうかを調べた。アッセイ緩
衝液中６日の後、この組織のGUS発現に関して計数し
た。結果を表８に要約した。
ラウンド２選択平板（セレクションプレート）上での
21日後、その物質のすべての生存部分を、60mg/のハ
イグロマイシンを含むラウンド３選択平板に転移した。
明らかに死亡した細胞のみを含むラウンド２選択平板は
保存した。ラウンド２及び３の選択平板は定期的にその
生存増殖セクターを観察した。
ラウンド３選択平板上での35日後、ラウンド２および
３選択平板セットの両方のカルスの生存セクターを検査
した。このような２つのセクターについて、pHYG I 1/p
B II 221で処理したプレート上の死亡組織のバックグラ
ウンドからの増殖を観察した。
3AAと名づけた第１セクターは、プレートのラウンド
３グループから得た。両系列を次にハイグロマイシンを
含まないＦ培地に転移した。ハイグロマイシンを含まな
いＦ培地上での19日後、3AA系列は殆ど成長しなかった
が、一方のpH1系列は急速に成長した。両系列共に再
び、Ｆ培地に９日間転移した。3AA及びpH1系列を、次に
15mg/のハイグロマイシンを含むＦ培地に14日間転移
した。この時点で、3AA系列は、質も非常に劣り、生長
もおそかった。しかし、pH1系列は、15mg/を含むＦ培
地上で急速に成長した；この系列はつぎにハイグロマイ
シンを含まないＦ培地に継代培養を行った。
Ｆ培地での10日後、pH1系列の阻害試験を開始した。
ハイグロマイシンＢの１、10、30、100及び250mg/を
含むＦ培地上に、pH1のカルスを転移した。それぞれの
濃度のカルスプレートを５個ずつ作り、各プレートが、
約50mgのカルス片10個を含むようにした。ハイグロマイ
シンの各濃度毎に非選択の対照組織のプレートを１個作
った。
pH1系列は、ハイグロマイシンの０、10、30、100及び
250mg/濃度で９継代培養にわたり成長を維持する能力
のあることが見出された。補足のセクターを、色々な時
間点で、ラウンド２及び３選択平板から回収した。これ
らは何れも、多数ラウンド、すなわち２または３回の継
代培養において、ハイグロマイシンの存在下で成功する
ことが出来なかった。
pH1カルスがハイグロマイシン抵抗遺伝子を取込んだ
ことを示すために、pH1からDNAを分離して作り、非選択
対照カルスは、2gのカルスを液体窒素中で凍結し、それ
を6mlの抽出緩衝液（7M尿素、250mM塩化ナトリウム、50
mMトリス塩酸pH0.0、20mM EDTA pH0.0、１％カルコシ
ン）を含む30mlオークリッジ管に移して微粉末にした。
これに7mlのフェノール：クロロホルム1:1を添加し、そ
の管を振とうし、37℃で15分間培養した。試料を４℃で
10分間、8Kで遠心分離した。上澄みは、ミラクロス（カ
ルバイオケム475855）を通じてピペットで、1mlの4.4M
酢酸アンモニウム、pH5.2を含む使い捨ての15ml管（ア
メリカンサイエンティフィック製品C3920−15A）に採取
した。イソプロパノール6mlを添加し、管を振とうし、
試料を−20℃で15分間培養した。DNAは、ベックマンTJ
−６遠心分離機により、４℃、５分間、最大速度でペレ
ット状になった。上澄みを捨て、ペレットを500μｌのT
E−10（10mMのトリス−塩酸pH8.0、10mM EDTA pH8.0）
で15分間、室温で溶解した。試料を1.5mlのエッペンド
ルフ管に移し、100μｌの4.4M酢酸アンモニウム、pH5.2
及び700μｌのイソプロパノールを添加した。これを−2
0℃で15分培養し、DNAがエッペンドルフのマイクロ遠心
分離（12,000回転）に５分間かけてペレット化した。ペ
レットを70％エタノールで洗い、乾燥し、TE−１（10mM
トリス−塩酸pH8.0、1mM EDTA）中に再懸濁した。
分離したDNA10μｌをRAmH I（NER）で消化し、例しに
記載のように、HPTプローブを用いて分析した。図３に
示すように、pH Iカルスのバンドが、期待した1.05kbの
位置に認められ、HPTコーディング配列の存在を示した
が。対照カルスにはバンドは認められなかった。
ハイグロマイシン遺伝子が高分子量DNA中に取込まれ
ていることを明らかにするため、pH Iカルスを対照カル
スから分離したDNAをｉ）制限酵素で処理しない、ii）
前記のようにBamH Iで処理する、またはiii）HPTコーデ
ィング配列内のプラスミドpHYG I 1のみを切断するPst
Iで処理した。試料をブロットし、前述のようにHPTコー
ディング配列によって立証した。
不消化のpH I DNAだけは、非切断DNAの位置で、プロ
ーブにハイブリッド形成し、ハイグロマイシン遺伝子が
高分子重量DNA中に取込まれていると明示した。BamH I
で消化されたpH I DNAの期待した1.05kbバンドが以前示
したように認められた。若しも、ハイグロマイシン遺伝
子が無傷のpHYG I 1プラスミドに存在したならば、Pst
Iにより消化されたpH I DNAの5.9kbバンドの出現が期待
されよう。若しも遺伝子が高分子量DNAに取込まれたな
らば、２つまたはそれ以上の可変の大きさのバンド（大
きさは、宿主DNA内の付着［フランキンダ］Pst Iの位置
に依存する）の出現が期待される筈である。分子量の大
きさが、約12、5.1及び4.9kbの３種類のバンドが観察さ
れた。この結果は、ハイグロマイシン遺伝子が高分子量
DNAに取込まれたことを明示している。4.9kbバンドの強
度は、他の２つのバンドのおよそ２倍程大きく、部分的
な消化か、または、HPT遺伝子の双頭反復の可能性を示
唆している。上記のどの処理法によっても、対照カルス
からのDNAについてハイブリッド形成は観察されなかっ
た。
これらの結果は、HPTコーディング配列は、無傷のpHY
G I 1または小さな非−染色体プラスミドのように、pH
Iカルス中には存在しないことを示すものである。それ
らは、高分子重量DNA内へ取込まれたハイグロマイシン
遺伝子によって成り立っている。さらに、サザンブロッ
ト分析によって、HPTコーディング配列は、35Sフロモー
ター配列に隣接していることが明らかにされた。
RMS培地への阻害試験に用いられたハイグロマイシン
のすべての濃度からpH Iカルスを転移し、植物が例しに
記載のように再生された。65の植物がpH Iから生成し、
30の植物が対照のカルスから生成した。
導入したDNAがRO組織に保持されたことを明示するた
め、無作為に選んだ３つのpH IのRO植物から得たBamH I
消化の葉のDNAについて、先に述べたようなサザンブロ
ット法を適用した。ブロットは、例ＩのようにHPTプロ
ーブで調べた。図４に示すように、３つの植物全体に1.
05kbバンドが認められ、HPTコーディング配列の存在を
示した。対照の植物から得たDNAについては、どんなバ
ンドも見られなかった。
成熟したpH I植物の調節授粉を、同系繁殖体Zea may
s系のA188、B73及びOh43により、標準法で行った。授粉
後45日目に種を採り、さらに１〜２週間乾燥した。
R I子孫中のハイグロマイシン抵抗特性の存在は根伸
長バイオアッセイ、黄化葉バイオアッセイ及びサザンブ
ロッティング法で評価した。再生したpH Iと対照植物か
ら得たそれぞれ２つの穂を分析用に選んだ。結果を図５
及び表９に示す。
HPT遺伝子の存在は、pH Iの母方の親から得た２つのR
2子孫中で確認した。
植物pH I 3−１（表９）は、OH43花粉によって授粉を
行った。この交雑から得られた９つの種を発芽させ、子
孫の植物の４枚の葉からDNAが作られ、HPTコーディング
配列プローブを用いサザンブロッティング法によって分
析を行った。試験した４植物の中の２つが、高いコピー
数でHPT配列を含んでいた。HPT遺伝子は２植物中に存在
していたが、その発現は、黄化葉分析では認められなか
った。
植物pH I 10.8（表９）は、B73を授粉するために用い
られ、また自家授粉であった。異系支配からの子孫の50
について、根と葉の両方の分析でHPT発現の試験を行っ
た。発現は何れも認められなかった。子孫の８つからの
DNAについて行ったサザンブロット法でも同様に、HPT遺
伝子は検出されなかった。自家授粉の子孫には、９つの
子孫の葉の分析でも、あるいはこれらの植物の４つから
得たDNAのサザンブロット法からも、遺伝子存在の証拠
は得られなかった。
組換えDNAは、形質転換植物（RO及びR Iの両方共）が
雌として用いられた場合だけ子孫に引き継がれることが
示された。これは、pH Iの組換えDNAの母系相続を示唆
するものである。
ここに引用したすべての発表内容、特許文書は、ここ
の文献に含まれている。本発明には、色々な特別なまた
好ましい具体例と技術に関して記載した。然しながら、
本発明の精神と範囲内にありながら、おおくの変化と修
飾がなされることを理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６３６，０８９ (32)優先日 平成２年12月28日(1990．12．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ウォルターズ、デビッド・エー アメリカ合衆国 55437 ミネソタ、ブ ルーミントン、ケル・ロード 11424 (72)発明者 キリハラ、ジュリー・エー アメリカ合衆国 55425 ミネソタ、ブ ルーミントン、シックスティーンス・ア ベニュ・サウス 9745 (56)参考文献 欧州公開292435（ＥＰ，Ａ２) Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，［７］１，（1986）, Ｐ．43−50 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，91 （1989）Ｐ．440−444 Ｇｅｎｅ，71［２］（1988）Ｐ．359 −370

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プロモーターと当該プロモーターの制御下
    にZea mays種子貯蔵蛋白質をエンコードする組換え遺
    伝子とを含むDNA構造体であって染色体に組込まれる組
    換えDNA構造体を有し、前記組換え遺伝子が発現し受け
    継がれる、繁殖力のあるトランスジェニックZea mays
    植物において、 前記トランスジェニックZea mays植物の種子中のアミ
    ノ酸濃度が、前記DNA構造体が存在しないことにおいて
    のみ前記トランスジェニックZea mays植物の種子と相
    違するZea mays植物の種子中のアミノ酸濃度以上に実
    質的に増大するように、前記組換え遺伝子が前記種子貯
    蔵蛋白質として発現し、 前記DNA構造体が、カルス培養の微小投射物砲撃法で、
    前記植物、または前記植物の祖先に導入されるトランス
    ジェニックZea mays植物。
  2. 【請求項２】前記組換え遺伝子が10kDのトウモロコシ種
    子蛋白質をエンコードし、全核メチオニン濃度が、前記
    組換え遺伝子が存在しない場合における対応するZea m
    ays植物中の全核メチオニン濃度以上に実質的に増大す
    るように、前記組換え遺伝子が発現する、請求項１の植
    物。
  3. 【請求項３】Bt−エンドトキシン蛋白質をエンコードす
    る組換え遺伝子を含むDNA構造体であって染色体に組込
    まれる組換えDNA構造体を有し、前記組換え遺伝子が発
    現し受け継がれる、繁殖力のあるトランスジェニックZe
    a mays植物において、 前記DNA構造体が、カルス培養の微小投射物砲撃法で、
    前記植物、または前記植物の祖先に導入されたトランス
    ジェニックZea mays植物。
  4. 【請求項４】ハイグロマイシンに抵抗性または耐性を与
    える蛋白質をエンコードする組換え遺伝子を含むDNA構
    造体であって染色体に組込まれる組換えDNA構造体を有
    し、前記組換え遺伝子が発現し受け継がれる、繁殖力の
    あるトランスジェニックZea mays植物において、 前記DNA構造体が、カルス培養の微小投射物砲撃法で、
    前記植物、または前記植物の祖先に導入されたトランス
    ジェニックZea mays植物。
  5. 【請求項５】前記組換え遺伝子を受け継いだ請求項１〜
    請求項４の植物により生産された種子。
  6. 【請求項６】請求項１〜請求項４の植物から誘導された
    RI及び後世代。
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Families Citing this family (410)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU638438B2 (en) 1989-02-24 1993-07-01 Monsanto Technology Llc Synthetic plant genes and method for preparation
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6025545A (en) * 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) * 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
JP3209744B2 (ja) * 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US6946587B1 (en) * 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DE4013099A1 (de) * 1990-04-25 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
US6395966B1 (en) * 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6403865B1 (en) * 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
DK0558676T3 (da) * 1990-11-23 2000-09-25 Aventis Cropscience Nv Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter
CA2114788C (en) * 1991-08-09 2004-12-21 Saverio C. Falco Synthetic storage proteins with defined structure containing programmable levels of essential amino acids for improvement of the nutritional value of plants
UA48104C2 (uk) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
GB9125330D0 (en) * 1991-11-28 1992-01-29 Commw Scient Ind Res Org Novel dna clones and uses thereof
WO1994020628A2 (en) * 1993-03-02 1994-09-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Improved feedcrops enriched in sulfur amino acids and methods for improvement
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6326527B1 (en) * 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US6281411B1 (en) 1993-08-25 2001-08-28 Dekalb Genetics Corporation Transgenic monocots plants with increased glycine-betaine content
GB9318207D0 (en) * 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
PT731632E (pt) * 1993-12-09 2002-03-28 Texas A & M Univ Sys Transformacao de especies de musa com agrobacterium tumefaciens
CN1035304C (zh) * 1994-04-07 1997-07-02 丁群星 转化植物的方法及装置
US6015942A (en) * 1994-12-30 2000-01-18 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Transgenic plants exhibiting heterologous virus resistance
US6337431B1 (en) 1994-12-30 2002-01-08 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Transgenic plants expressing DNA constructs containing a plurality of genes to impart virus resistance
CN1208437A (zh) * 1996-06-21 1999-02-17 孟山都公司 农杆菌介导转化法生产稳定转化的可育小麦的方法及其相关组分
US6093695A (en) 1996-09-26 2000-07-25 Monsanto Company Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP
US6800726B1 (en) 1996-11-01 2004-10-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Proteins with increased levels of essential amino acids
IT1290858B1 (it) * 1996-12-19 1998-12-14 Mini Ricerca Scient Tecnolog Isolamento e caratterizzazione di un gene codificante per una glutenina a basso peso molecolare
US6573438B1 (en) * 1997-03-14 2003-06-03 Syngenta Participations Ag Inbred Maize line 2044BT
US6040497A (en) * 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
BR9808475A (pt) 1997-04-03 2000-05-23 Dekalb Genetics Corp Linhagens de milho resistentes à glifosato.
GB9708542D0 (en) * 1997-04-25 1997-06-18 Nickerson Biocem Ltd Resistance marker
AU8148398A (en) * 1997-07-15 1999-02-10 Dow Agrosciences Llc Nucleotide sequences of genes encoding sink proteins and uses thereof for improving the nutritional quality of feeds
WO1999016890A2 (en) 1997-09-30 1999-04-08 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
CZ300208B6 (cs) 1997-10-31 2009-03-18 Syngenta Participations Ag Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a zpusob prípravy takové rostliny
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US7053282B1 (en) * 1998-02-09 2006-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6121521A (en) * 1998-04-01 2000-09-19 Novartis Ag Chimeric insecticidal protein and DNA coding therefor
US5973227A (en) * 1998-05-06 1999-10-26 University Of Saskatchewan Flax transformation
US7897843B2 (en) 1999-03-23 2011-03-01 Mendel Biotechnology, Inc. Transcriptional regulation of plant biomass and abiotic stress tolerance
US20050086718A1 (en) 1999-03-23 2005-04-21 Mendel Biotechnology, Inc. Plant transcriptional regulators of abiotic stress
US6489542B1 (en) 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
US20040029167A1 (en) * 1999-03-22 2004-02-12 Bernard Fritig Inducible COMT_II promoter, chimeric gene containing same and plants transformed therewith
CA2267014A1 (en) * 1999-03-26 2000-09-26 Brenda Rojas Monocot transformation using acrobacterium
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6180858B1 (en) * 1999-05-28 2001-01-30 Holden's Foundation Seeds Llc Inbred corn line LH172BT810
US6232532B1 (en) * 1999-05-28 2001-05-15 Holden's Foundation Seeds Llc Inbred corn line LH185Bt810
US6175064B1 (en) * 1999-05-28 2001-01-16 Holden's Foundation Seeds Llc Inbred corn line LH200BT810
US6172285B1 (en) * 1999-05-28 2001-01-09 Holden's Foundation Seeds Llc Inbred corn line LH198Bt810
GB9923306D0 (en) 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
WO2001033944A1 (en) 1999-11-10 2001-05-17 University Of Washington Compositions and methods for modulation of plant cell division
EP1950306A1 (en) 1999-11-17 2008-07-30 Mendel Biotechnology, Inc. Environmental stress tolerance genes
BR0015634A (pt) 1999-11-17 2002-12-31 Mendel Biotechnology Inc Planta, polinucleotìdeo, vetor, célula, composição, polipeptìdeo, métodos para produzir uma planta e para identificar um fator que é modulado por, ou interage com, um polipeptìdeo codificado por um polinucleotìdeo, uma molécula que module a atividade ou a expressão de um polinucleotìdeo ou polipeptìdeo de interesse e uma sequência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotìdeos e sistema integrado, meio computadorizado ou legìvel em computador
EP1240515A4 (en) * 1999-12-14 2004-07-14 Strategic Diagnostics Inc METHOD FOR PROCESSING AND TESTING POWDER SAMPLES USING IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TEST STRIPS
WO2001049852A1 (en) * 2000-01-05 2001-07-12 The Regents Of The University Of California Transgenic maize comprising recombinant pbf genes
US6750379B2 (en) 2000-03-09 2004-06-15 Dekalb Genetics Corporation Homologous recombination-mediated transgene alterations in plants
US6580019B1 (en) 2000-03-09 2003-06-17 Dekalb Genetics Corporation Non-reciprocal recombination-mediated transgene deletion in transgenic plants
WO2002006500A2 (en) * 2000-07-18 2002-01-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of transforming plants and identifying parental origin of a chromosome in those plants
WO2002015675A1 (en) 2000-08-22 2002-02-28 Mendel Biotechnology, Inc. Genes for modifying plant traits iv
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
US20050160488A1 (en) * 2000-11-07 2005-07-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Grain quality through altered expression of seed proteins
US7741533B2 (en) * 2000-11-07 2010-06-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Grain quality through altered expression of seed proteins
US7354776B2 (en) 2000-12-14 2008-04-08 Strategic Diagnostics Inc. Method of processing and testing powdered samples using immunochromatographic strip tests
US7326549B2 (en) 2001-03-19 2008-02-05 Cargill, Incorporated Myo-inositol oxygenases
MXPA03010967A (es) * 2001-05-30 2004-10-28 Chromos Molecular Systems Inc Cromosomas artificiales de plantas, usos de los mismos y metodos para preparar cromosomas artificiales de plantas.
WO2002099067A2 (en) * 2001-06-05 2002-12-12 Oishi Karen K Gene expression and production of tgf-b proteins including bioactive mullerian inhibiting substance from plants
DK1438417T3 (da) * 2001-10-26 2014-08-04 Danisco Us Inc Phytase-enzymer, nukleinsyresekvenser, der koder for fytase-enzymer ogvektorer og værtsceller, der inkorporerer disse
WO2003038035A2 (en) * 2001-10-26 2003-05-08 Genencor International, Inc. T. reesei phytase enzymes, polynucleides encoding the enzymes, vectors and host cells thereof, and methods of using
US6838601B2 (en) * 2001-12-04 2005-01-04 Holden's Foundation Seeds, Llc Inbred corn line LH289
US20090158452A1 (en) * 2001-12-04 2009-06-18 Johnson Richard G Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US6835878B2 (en) * 2001-12-04 2004-12-28 Holden's Foundation Seeds, Llc Inbred corn line LH322
BR0307155A (pt) 2002-01-08 2007-06-19 Michael R Raab plantas transgênicas expressando proteìnas modificadas por civps ou inteìnas e método relativo
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
EP1970442B1 (en) 2002-05-03 2017-01-18 Monsanto Technology LLC Transgenic high tryptophan plants
US20040003432A1 (en) * 2002-05-06 2004-01-01 Pharmacia Corporation Production of hexosamines and uses thereof
BR0311324A (pt) 2002-05-22 2005-06-28 Monsanto Technology Llc Dessaturases de ácidos graxos de fungos
GB0212885D0 (en) * 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
US7364901B2 (en) * 2002-07-15 2008-04-29 University Of Kentucky Research Foundation Recombinant Stokesia epoxygenase gene
US6770598B1 (en) 2003-05-06 2004-08-03 Lta Resources Management Protein transport enhancer for transgenic plants
EP2272962B1 (en) 2002-09-18 2017-01-18 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
US6920521B2 (en) * 2002-10-10 2005-07-19 International Business Machines Corporation Method and system of managing virtualized physical memory in a data processing system
WO2004053055A2 (en) * 2002-12-04 2004-06-24 Monsanto Technology Llc Transgenic maize with enhanced phenotype
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
US7045007B2 (en) 2002-12-31 2006-05-16 Engelhard Corporation Effect pigment
AU2003300448A1 (en) 2002-12-31 2004-07-29 Engelhard Corp Improved effect pigment
US7460252B2 (en) * 2003-01-13 2008-12-02 Axiohm Transaction Solutions, Inc. Graphical printing system and method using text triggers
WO2004087878A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Monsanto Technology, Llc Novel plant promoters for use in early seed development
EP1921152A1 (en) 2003-05-05 2008-05-14 Monsanto Technology, LLC Transgenic plants with glycine-betaine specific promoter
US7560611B2 (en) 2003-08-05 2009-07-14 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
EP1656449B1 (en) 2003-08-21 2009-05-06 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from primula
ES2609428T3 (es) 2003-08-25 2017-04-20 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de tubulina para su uso en plantas
ATE480628T1 (de) 2003-10-02 2010-09-15 Monsanto Technology Llc Stapeln von merkmalen zur verbesserung von nutzpflanzen in transgenen pflanzen
ATE516295T1 (de) 2004-01-20 2011-07-15 Monsanto Technology Llc Chimäre promotoren zur verwendung in pflanzen
AR047598A1 (es) 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
US7683237B2 (en) * 2004-02-10 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Maize seed with synergistically enhanced lysine content
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
WO2005087007A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Monsanto Technology Llc Herbicidal compositions containing n-phosphonomethyl glycine and an auxin herbicide
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
AR048685A1 (es) 2004-04-09 2006-05-17 Monsanto Technology Llc Metodos para el control de infestaciones de insectos en plantas.
BRPI0509944A (pt) 2004-04-16 2007-09-25 Monsanto Technology Llc expressão de dessaturases de ácido graxo em milho
US10105437B2 (en) 2004-04-28 2018-10-23 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
CA2564521C (en) 2004-04-28 2017-04-11 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
WO2005112597A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Agrivida, Inc. Transgenic plants expressing intein modified proteins and associated processes for bio-pharmaceutical production
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
CN101128588A (zh) 2004-08-11 2008-02-20 孟山都技术有限公司 转基因玉米种子中增强的玉米醇溶蛋白减少
WO2006023869A2 (en) 2004-08-24 2006-03-02 Monsanto Technology Llc Adenylate translocator protein gene non-coding regulatory elements for use in plants
AU2005285014A1 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Monsanto Technology Llc Promoter molecules for use in plants
CA2584960A1 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Charles L. Niblett Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants
WO2006073727A2 (en) 2004-12-21 2006-07-13 Monsanto Technology, Llc Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression
SI1827078T1 (sl) 2004-12-21 2014-05-30 Monsanto Technology Llc Transgene rastline z izboljšanimi agronomskimi lastnostmi
EP2562259B1 (en) 2004-12-21 2016-07-06 Monsanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US8314290B2 (en) 2004-12-21 2012-11-20 Monsanto Technology Llc Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP1850656A4 (en) 2005-01-12 2010-04-07 Monsanto Technology Llc GENES AND ITS USES FOR THE PLANT PROCESSING OF PLANTS
US8519225B2 (en) 2006-02-10 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
CA2598307C (en) 2005-02-26 2014-12-30 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
ATE552343T1 (de) * 2005-04-19 2012-04-15 Basf Plant Science Gmbh Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen
EP1874937A2 (en) 2005-04-20 2008-01-09 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1882037A2 (en) 2005-05-10 2008-01-30 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
WO2006138005A2 (en) 2005-05-10 2006-12-28 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
AR053269A1 (es) * 2005-05-16 2007-04-25 Monsanto Technology Llc Plantas y semillas de maiz con mejoramiento de asparagina y proteina
EP2261361A3 (en) 2005-05-25 2011-04-20 Pioneer Hi-Bred International Inc. Methods for improving crop plant architecture and yield
US9121028B2 (en) * 2005-09-09 2015-09-01 Monsanto Technology Llc Selective gene expression in plants
JP5530632B2 (ja) 2005-09-16 2014-06-25 デブジェン エヌブイ ＲＮＡｉを使用した害虫の抑制方法
CA2622660C (en) 2005-09-16 2017-11-07 Devgen Nv Transgenic plant-based methods for plant pests using rnai
EP2431473B1 (en) 2005-09-16 2016-11-09 Monsanto Technology LLC Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
CA2624255C (en) * 2005-10-03 2015-02-10 Monsanto Technology Llc Transgenic plant seed with increased lysine
AU2006302969B2 (en) 2005-10-13 2011-09-22 Monsanto Technology, Llc Methods for producing hybrid seed
EP1962577A4 (en) 2005-12-21 2009-12-16 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
BRPI0707413A2 (pt) 2006-02-09 2011-05-03 Pioneer Hi Bred Int genes para aprimoramento da eficiência de utilização do nitrogênio em culturas
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
AU2007214547B2 (en) 2006-02-13 2012-09-20 Monsanto Technology Llc Selecting and stabilizing dsRNA constructs
WO2007098042A2 (en) 2006-02-17 2007-08-30 Monsanto Technology Llc Chimeric regulatory sequences comprising introns from dicotyledons for plant gene expression
CA2653231C (en) 2006-05-12 2016-04-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants
CA2653248C (en) 2006-05-25 2017-09-26 Monsanto Technology Llc A method to identify disease resistant quantitative trait loci in soybean and compositions thereof
US7855326B2 (en) 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
WO2008021413A1 (en) 2006-08-15 2008-02-21 Monsanto Technology Llc Compositions and methods of plant breeding using high density marker information
US20110252501A1 (en) 2006-08-17 2011-10-13 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CL2007002532A1 (es) * 2006-08-31 2008-01-11 Monsanto Technology Llc Soc Organizada Bajo Las Leyes Del Estado De Delaware Procedimiento para identificar genes que confieren rasgos mejorados de una población de plantas.
AU2007290367B2 (en) 2006-08-31 2013-10-31 Monsanto Technology, Llc Phased small RNAs
EP3378953A1 (en) 2006-10-12 2018-09-26 Monsanto Technology LLC Plant micrornas and methods of use thereof
CN101522023B (zh) 2006-10-16 2014-03-12 孟山都技术公司 改善植物健康的方法和组合物
US7939721B2 (en) 2006-10-25 2011-05-10 Monsanto Technology Llc Cropping systems for managing weeds
WO2008095033A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Verenium Corporation Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US20080220498A1 (en) 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
EP2074219B1 (en) 2007-02-16 2013-11-20 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
CN101646769A (zh) 2007-02-20 2010-02-10 孟山都技术公司 无脊椎动物微rna
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
AR066218A1 (es) 2007-04-19 2009-08-05 Monsanto Technology Llc Plantas de maiz y semillas con contenido incrementado de asparagina y proteina
WO2008134571A1 (en) 2007-04-27 2008-11-06 University Of California Plant co2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
DK2147104T3 (en) * 2007-05-21 2015-12-14 Danisco Us Inc USING A ASPARAGINPROTEASE- (NSP24) SIGNAL SEQUENCE FOR heterologous protein EXPRESSION
EP3567113A1 (en) 2007-06-06 2019-11-13 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant enhancement
AR066922A1 (es) 2007-06-08 2009-09-23 Monsanto Technology Llc Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido
US8491670B2 (en) * 2007-06-21 2013-07-23 Suntava, Llc Anthocyanin pigment/dye compositions and method of providing composition through extraction from corn
EP2175714A4 (en) 2007-07-10 2011-01-26 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
AR071243A1 (es) 2007-08-29 2010-06-09 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para usar plantas haploides en el mapeo genetico de caracteristicas, como resistencia a enfermedades
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
BRPI0909285B1 (pt) * 2008-03-31 2020-01-28 Ceres Inc ácido nucleico, construção de vetor, método de condução de transcrição, método de expressão de uma região de codificação exógena em uma planta, método de alteração da expressão de um gene em uma planta, método de produção de uma planta transgênica
EP2262896B1 (en) 2008-04-07 2014-01-22 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
HUE052318T2 (hu) 2008-04-18 2021-04-28 Danisco Us Inc Bittiauxella sp. fitáz változatok
WO2009134339A2 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant enhancement
BRPI0913657A2 (pt) 2008-07-01 2020-08-04 Monsanto Technology Llc constructos de dna recombinante e métodos para a modulação da expressão de um gene-alvo
EP3023499A1 (en) 2008-07-16 2016-05-25 Monsanto Technology LLC Methods and vectors for producing transgenic plants
BRPI0920107A2 (pt) 2008-10-30 2015-08-18 Pioneer Hi Bred Int Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão recombinante, célula hospedeira, planta tansgênica, semente transgênica, método para modular gs em uma planta, método para reduzir atividade de polipeptídeo da enzima gs em uma célula de planta.
US20110258735A1 (en) 2008-12-22 2011-10-20 Marie Coffin Genes and uses for plant enhancement
US8507754B2 (en) 2009-01-31 2013-08-13 University Of North Texas Engineering lipids in vegetative tissues of plants
US20120277117A1 (en) 2009-02-27 2012-11-01 Adel Zayed Hydroponic apparatus and methods of use
MX2011010845A (es) 2009-04-14 2011-11-02 Pioneer Hi Bred Int La modulacion de acc sintasa mejora el rendimiento de las plantas en condiciones de bajo contenido de nitrogeno.
KR20140014374A (ko) 2009-04-20 2014-02-06 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물에서의 다중 바이러스 저항성
WO2011003901A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
IN2012DN00531A (ja) 2009-07-24 2015-08-21 Pioneer Hi Bred Int
WO2011019652A2 (en) 2009-08-10 2011-02-17 Monsanto Technology Llc Low volatility auxin herbicide formulations
EP2467395A1 (en) 2009-08-20 2012-06-27 Pioneer Hi-Bred International Inc. Functional expression of shuffled yeast nitrate transporter (ynti) in maize to improve nitrate uptake under low nitrate environment
EP2467472A2 (en) 2009-08-20 2012-06-27 Pioneer Hi-Bred International Inc. Functional expression of yeast nitrate transporter (ynt1) in maize to improve nitrate uptake
CN101812476B (zh) * 2009-09-23 2011-12-21 西南大学 一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法
EP2483404A1 (en) 2009-10-02 2012-08-08 Pioneer Hi-Bred International Inc. Down-regulation of acc synthase for improved plant performance
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
WO2011050271A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US10407742B2 (en) 2009-11-06 2019-09-10 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
US9464333B2 (en) 2009-11-06 2016-10-11 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
US8420387B2 (en) 2009-11-06 2013-04-16 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
WO2011058555A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. A method of editing dna in a cell and constructs capable of same
WO2011067712A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for embryo-specific expression in plants
ES2658990T3 (es) 2009-12-23 2018-03-13 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD
UY33140A (es) 2009-12-23 2011-07-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
AR079882A1 (es) 2009-12-23 2012-02-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
AR079883A1 (es) 2009-12-23 2012-02-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
UY33141A (es) 2009-12-23 2011-07-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
WO2011082107A1 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Direct and continuous root alone or root/shoot production from transgenic events derived from green regenerative tissues and its applications
MX2012007855A (es) 2010-01-06 2013-06-05 Du Pont Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo.
EP2524045B1 (en) 2010-01-14 2015-12-02 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
US9695432B2 (en) 2010-01-22 2017-07-04 Dow Agrosciences Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
AR080128A1 (es) 2010-02-04 2012-03-14 Bayer Cropscience Ag Un metodo para incrementar la fijacion fotosintetica del carbono usando la proteina de fusion multi-subunidad de glicolato deshidrogenasa
ES2809679T3 (es) 2010-03-08 2021-03-05 Monsanto Technology Llc Moléculas polinucleotídicas para la regulación génica en plantas
AR081302A1 (es) 2010-06-24 2012-08-01 Brookhaven Science Ass Llc Acumulacion de acidos grasos omega-7 ( -7) en semillas de plantas
BR112012033112A2 (pt) 2010-06-24 2015-09-08 Dow Agrosciences Llc redução do teor de ácidos graxos saturados de sementes de planta.
US10443068B2 (en) 2010-06-25 2019-10-15 Agrivida, Inc. Plants with engineered endogenous genes
US9598700B2 (en) 2010-06-25 2017-03-21 Agrivida, Inc. Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
US8785612B2 (en) 2010-08-30 2014-07-22 Agrigenetics, Inc. Sugarcane bacilliform viral (SCBV) enhancer and its use in plant functional genomics
UY33853A (es) 2010-12-30 2012-07-31 Dow Agrosciences Llc ?moléculas de ácido nucleico que se dirigen a la subunidad h de la atpasa vacuolar y confieren resistencia a plagas de coleópteros?.
WO2012092544A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
BRPI1107332A2 (pt) 2010-12-30 2018-10-30 Dow Agrosciences Llc polinucleotídeo, vetor de transformação, moléculas de ácido nucleico, célula, bem como métodos para controle de praga coleóptera, para aperfeiçoamento do rendimento de cultura de milho, e para produção de célula e planta resistentes à praga coleóptera
US20130052682A1 (en) * 2011-02-14 2013-02-28 Xyleco, Inc. Processing biomass
EP2683799B1 (en) 2011-03-07 2016-11-02 Agrivida, Inc. Consolidated pretreatment and hydrolysis of plant biomass expressing cell wall degrading enzymes
US9677084B2 (en) 2011-04-29 2017-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper I-class homeobox gene for improved plant performance
US9920327B2 (en) 2011-06-02 2018-03-20 The Regents Of The University Of California Plants with elevated levels of glucan
WO2012168124A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
CA2840646C (en) 2011-07-01 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression
RU2014106125A (ru) * 2011-07-20 2015-08-27 Каиима Био Агритех Лтд. Растения кукурузы с частично или полностью умноженным геномом и их применения
CN103981149A (zh) 2011-08-22 2014-08-13 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
CA2848680C (en) 2011-09-13 2020-05-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3296402B1 (en) 2011-09-13 2020-04-15 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP2755466A4 (en) 2011-09-13 2015-04-15 Monsanto Technology Llc METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING WEEDS
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
BR112014005979A8 (pt) 2011-09-13 2017-09-12 Monsanto Technology Llc Métodos e composições quimicas agricolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene ppg oxidase em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene ppg oxidase e mistura herbicida
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
UY39627A (es) 2011-10-26 2022-03-31 Monsanto Technology Llc Sales de herbicidas de ácido carboxílico
BR112014010537A2 (pt) 2011-10-31 2017-05-02 Pioneer Hi Bred Int método para modular a sensibilidade ao etileno, planta transgênica, proteína isolada, sequência de polinucleotídeos isolada, polipeptídeo com atividade regulatória de etileno, método para aumentar o rendimento em uma planta, método para melhorar um parâmetro agronômico de uma planta, método de seleção assistida por marcador de uma planta
WO2013097940A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Genoplante-Valor Plants having a modulated content in seed proteins and method for production thereof
CN108192901A (zh) 2012-02-01 2018-06-22 陶氏益农公司 人造叶绿体转运肽
CA2863664C (en) 2012-02-02 2022-07-05 Dow Agrosciences Llc Plant transactivation interaction motifs and uses thereof
CN102533819A (zh) * 2012-02-20 2012-07-04 西南大学 提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性以及利用其培育抗病植物的方法
US9173359B1 (en) * 2012-02-21 2015-11-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1DG3
CA2865977A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
MX2014011038A (es) 2012-03-13 2015-06-02 Pioneer Hi Bred Int Reduccion genetica de la fertilidad masculina en plantas.
MX2014011600A (es) 2012-03-26 2015-02-04 Pronutria Inc Proteínas nutritivas, fragmentos y métodos.
AU2013205557B2 (en) 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
CN104395474A (zh) 2012-04-20 2015-03-04 富优基尼以色列股份有限公司 青铜蝽防治剂
US20150082490A1 (en) 2012-04-23 2015-03-19 Futuragene Israel Ltd. Glycaspis Brimblecombei Control Agents
CN104471067B (zh) 2012-05-07 2020-08-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的转基因靶向整合的方法和组合物
US10240162B2 (en) 2012-05-24 2019-03-26 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for silencing gene expression
WO2013184622A2 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Monsanto Technology Llc Aqueous concentrated herbicidal compositions containing glyphosate salts and dicamba salts
AU2013278070B2 (en) 2012-06-22 2019-07-11 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for mediating plant stomatal development in response to carbon dioxide and applications for engineering drought tolerance in plants
EP2864486B1 (en) 2012-06-26 2018-09-26 Monsanto Technology LLC Methods and composition for enhanced forage quality
EP2893006B1 (en) 2012-09-07 2018-08-22 Dow AgroSciences LLC Fad3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
CN104736699B (zh) 2012-09-14 2020-04-14 拜尔作物科学有限合伙公司 Hppd变体及使用方法
BR112015007123A2 (pt) 2012-10-03 2017-08-08 Futuragene Israel Ltd molécula de ácido ribonucléico de filamento duplo (dsrna) isolada, vetor, célula hospedeira, tecido vegetal, ácido nucléico isolado, e, métodos para produzir uma planta resistente a uma praga e para inibir uma infestação de praga
EP2908620A4 (en) 2012-10-18 2016-07-27 Monsanto Technology Llc METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING PHYTOPARASITES
CN105473720A (zh) 2012-11-20 2016-04-06 先锋国际良种公司 用于高效摄取和利用尿素以提高作物产量的工程改造植物
US20150307894A1 (en) 2012-11-28 2015-10-29 Monsanto Technology Llc Transgenic Plants With Enhanced Traits
US10253325B2 (en) 2012-12-19 2019-04-09 Boston Medical Center Corporation Methods for elevating fat/oil content in plants
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
CN105358695B (zh) 2013-01-01 2019-07-12 A.B.种子有限公司 将dsRNA引入植物种子以调节基因表达的方法
WO2014110274A2 (en) * 2013-01-09 2014-07-17 Regents Of The University Of California A California Corporation Generation of haploid plants
WO2014113493A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
BR112015017830A2 (pt) 2013-01-29 2017-11-21 Bayer Cropscience Lp processos e meios para aumentar a tolerância ao estresse e a biomassa em plantas
US9288958B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH19V8
US9288959B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1W4K
US9282705B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH17SB
US9282703B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH24WZ
US9282706B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1W82
US9220223B2 (en) * 2013-02-07 2015-12-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1K6Y
US9290776B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH25W1
US9282704B1 (en) * 2013-02-07 2016-03-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1V7G
US8916744B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-23 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH24DV
US8829271B1 (en) * 2013-02-13 2014-09-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1M8A
US8912390B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-16 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1MCM
US8829270B1 (en) * 2013-02-13 2014-09-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1CJK
US8907159B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-09 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH24DM
US8907160B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-09 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1V5T
US8912389B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-16 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1KPK
US8901370B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-02 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1W1F
US8907158B1 (en) * 2013-02-13 2014-12-09 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1T61
US8912391B1 (en) * 2013-02-19 2014-12-16 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1KD2
US9220213B1 (en) * 2013-02-19 2015-12-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PHW5T
US8907161B1 (en) * 2013-02-19 2014-12-09 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1C2K
US9043973B1 (en) * 2013-02-19 2015-06-02 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1MDJ
US9029632B1 (en) * 2013-02-19 2015-05-12 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1M19
US9204605B1 (en) * 2013-02-19 2015-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1C2Y
US9029633B1 (en) * 2013-02-19 2015-05-12 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH12KH
US9029631B1 (en) * 2013-02-19 2015-05-12 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1M17
US8921650B1 (en) * 2013-02-19 2014-12-30 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PH1JNY
US9220212B1 (en) * 2013-02-19 2015-12-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1CSV
US9210859B1 (en) * 2013-02-19 2015-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize inbred PH1D7W
US9043972B1 (en) * 2013-02-19 2015-06-02 Pioneer Hi Bred International Inc Maize inbred PHVBS
US9029634B1 (en) * 2013-02-19 2015-05-12 Pioneer Hi Bred International Inc. Maize inbred PH1D3V
CA3123572A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Monsanto Technology Llc Glyphosate composition for dicamba tank mixtures with improved volatility
WO2014164014A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants
US9018452B2 (en) * 2013-03-13 2015-04-28 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Hybrid melon variety 34-765 RZ
US8987561B2 (en) * 2013-03-13 2015-03-24 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Hybrid melon variety 34-757 RZ
US9000270B2 (en) * 2013-03-13 2015-04-07 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Hybrid melon variety 34-780 RZ
US10612019B2 (en) 2013-03-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20160010101A1 (en) 2013-03-13 2016-01-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over- expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize
WO2014164116A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of bacterial major facilitator superfamily (sfm) gene in maize to improve agronomic traits and grain yield
US10609930B2 (en) 2013-03-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20160024513A1 (en) 2013-03-14 2016-01-28 Pioneer Hi-Bred International Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20160017350A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
CA3177649A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 Basf Se Methods and means for modulating flowering time in monocot plants
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
BR112016000555B1 (pt) 2013-07-19 2022-12-27 Monsanto Technology Llc Método para controlar uma infestação da espécie de leptinotarsa em uma planta, composição inseticida e construção de dna recombinante
RU2016116914A (ru) 2013-10-04 2017-11-13 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Регуляторные элементы гена металлотионеин-подобного белка из zea mays и их применение
US20160237447A1 (en) 2013-10-07 2016-08-18 Monsanto Technology Llc Transgenic Plants With Enhanced Traits
BR102014025574A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e usos dos mesmos
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
RU2694950C2 (ru) 2013-11-04 2019-07-18 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы для борьбы с членистоногими паразитами и заражениями вредителями
BR102014027442B1 (pt) 2013-11-04 2022-09-27 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico recombinante, uso de uma planta de milho, parte de planta de milho ou célula de planta de milho compreendendo a mesma e método para produzir uma célula vegetal transgênica compreendendo um dna de interesse
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
UY35812A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?loci de maíz óptimos?.
TW201525136A (zh) 2013-11-26 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
US10676745B2 (en) 2013-12-20 2020-06-09 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
TW201527313A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
TW201527312A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（一）
TW201527314A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）
TW201527316A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（五）
BR112016016337A2 (pt) 2014-01-15 2017-10-03 Monsanto Technology Llc Composição e métodos para controlar crescimento, desenvolvimento ou a capacidade de reprodução de uma planta, e para sensibilizar uma planta para um herbicida inibidor de epsps
BR102015000943A2 (pt) 2014-01-17 2016-06-07 Dow Agrosciences Llc expressão aumentada de proteína em planta
EP3971283A1 (en) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for site directed genomic modification
TW201538518A (zh) 2014-02-28 2015-10-16 Dow Agrosciences Llc 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現
MX2016011745A (es) 2014-03-11 2017-09-01 Bayer Cropscience Lp Variantes de hppd y metodos de uso.
MX366975B (es) 2014-03-12 2019-08-01 Univ Sydney Produccion de arn en plantas superiores.
US11091770B2 (en) 2014-04-01 2021-08-17 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
US11584937B2 (en) 2014-04-28 2023-02-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for controlling plant growth and development
CA2947756A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Dow Agrosciences Llc Dre4 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
WO2015193653A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas Oxidative resistance chimeric genes and proteins, and transgenic plants including the same
CN106795515B (zh) 2014-06-23 2021-06-08 孟山都技术公司 用于经由rna干扰调控基因表达的组合物和方法
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US10378012B2 (en) 2014-07-29 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
WO2016050512A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Bayer Cropscience Nv Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
AU2015346281B2 (en) 2014-11-12 2021-12-02 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
EP3037432B1 (en) 2014-12-22 2020-06-17 Dow AgroSciences LLC Nucampholin nucleic acid molecules to control coleopteran insect pests
CN108064288B (zh) 2015-01-22 2021-11-26 孟山都技术公司 用于控制叶甲属的组合物和方法
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
CN107529762A (zh) 2015-04-13 2018-01-02 弗劳恩霍夫应用研究促进协会 新型黄曲霉毒素和真菌感染控制方法
MX2017012936A (es) 2015-04-15 2018-02-01 Dow Agrosciences Llc Promotor de plantas para la expresion transgenica.
CN107624136A (zh) 2015-04-15 2018-01-23 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
EP3302053B1 (en) 2015-06-02 2021-03-17 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
WO2016207219A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Carbon-neutral and carbon-positive photorespiration bypass routes supporting higher photosynthetic rate and yield
JP6728340B2 (ja) * 2015-09-02 2020-07-22 ユニヴァーシティ オブ ワシントン 超広帯域ダイレクトサンプリングトランシーバのためのシステム及び方法
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
US11732269B2 (en) 2015-10-02 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Recombinant maize B chromosome sequence and uses thereof
CN108473997B (zh) 2015-10-22 2022-04-12 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
WO2017078935A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
US20190098858A1 (en) 2016-03-18 2019-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing clonal, non-reduced, non-recombined gametes
EP3228187A1 (en) 2016-04-06 2017-10-11 Kws Saat Se Novel means and methods for cereal pathogen resistance
WO2017184500A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Bloomsburg University of Pennsylvania Compositions and methods of delivering molecules to plants
WO2017184727A1 (en) 2016-04-21 2017-10-26 Bayer Cropscience Lp Tal-effector mediated herbicide tolerance
CA3021682A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Cargill Incorporated Engineered nucleases to generate deletion mutants in plants
US11732268B2 (en) 2016-06-28 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for use in genome modification in plants
CN117604022A (zh) 2016-08-17 2024-02-27 孟山都技术公司 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物
CN115885615A (zh) 2016-08-22 2023-04-04 拜欧卢米克有限公司 种子处理系统、装置和方法
IL247752A0 (en) 2016-09-11 2016-11-30 Yeda Res & Dev Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis
WO2018060881A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Insect toxin delivery mediated by a densovirus coat protein
CA3038972A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Dow Agrosciences Llc Binary insecticidal cry toxins
CA3038520A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
WO2018067264A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
US11180770B2 (en) 2017-03-07 2021-11-23 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
US11371056B2 (en) 2017-03-07 2022-06-28 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
US11708565B2 (en) 2017-03-07 2023-07-25 BASF Agricultural Solutions Seesi US LLC HPPD variants and methods of use
US11046969B2 (en) 2017-05-24 2021-06-29 Epiplanta Biotech Ltd. Transgenic plant and the method for producing the same
GB201708665D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing extractability of solids from coffee beans
GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
WO2018220582A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Tropic Biosciences UK Limited Methods of selecting cells comprising genome editing events
WO2019038594A2 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Biolumic Limited TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY
CN111263810A (zh) 2017-08-22 2020-06-09 纳匹基因公司 使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰
CN111527212B (zh) 2017-08-31 2024-04-09 科迪华农业科技有限责任公司 使用来自叶绿素结合Ab基因的调控元件表达转基因的组合物和方法
WO2019053725A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Futuragene Israel Ltd. TISSUE-SPECIFIC EXPRESSION CONTROL OF DELLA POLYPEPTIDES
EP3684929A1 (en) 2017-09-19 2020-07-29 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing gene expression in eukaryotic cells
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
WO2019084148A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Monsanto Technology Llc TARGETED RNA GUIDED ENDONUCLEASE ENDONUCLEASE ACTIVITY IN EUKARYOTES
EP3732295A1 (en) 2017-12-27 2020-11-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of dicot plants
EP3752618A4 (en) 2018-02-15 2021-11-03 Monsanto Technology LLC COMPOSITIONS AND METHODS OF IMPROVING THE HARVEST YIELD THROUGH TRAIT STACKING
UY38100A (es) 2018-02-15 2019-10-01 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para mejorar rendimientos de cultivos a través del apilamiento de rasgos
GB201807192D0 (en) 2018-05-01 2018-06-13 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for reducing caffeine content in coffee beans
CA3102975A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Methods of regenerating and transforming cannabis
US11827892B2 (en) 2018-06-07 2023-11-28 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Nucleic acid constructs and methods of using same
CN113166776A (zh) 2019-01-04 2021-07-23 嘉吉公司 用于在植物中产生突变的工程化核酸酶
WO2020181101A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
GB201903520D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing genes in eukaryotic cells
GB201903519D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Introducing silencing activity to dysfunctional rna molecules and modifying their specificity against a gene of interest
GB201903521D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd No title
EP4166671A1 (en) 2019-05-29 2023-04-19 Altria Client Services LLC Compositions and methods for producing tobacco plants and products having reduced or eliminated suckers
JP2022553642A (ja) 2019-10-10 2022-12-26 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー タバコにおける淡黄色遺伝子座およびその応用
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
US11326176B2 (en) 2019-11-22 2022-05-10 Mozza Foods, Inc. Recombinant micelle and method of in vivo assembly
AU2021338707A1 (en) 2020-09-10 2023-04-06 Monsanto Technology Llc Increasing gene editing and site-directed integration events utilizing meiotic and germline promoters
JP2024505756A (ja) 2021-02-03 2024-02-07 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 植物毛状突起における毛状突起密度の増加および代謝物の輸送の改善の方法
GB202103256D0 (en) 2021-03-09 2021-04-21 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for silencing genes
EP4351621A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Morehouse School of Medicine Hevamine-related plant composition and methods
CA3223344A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Tropic Biosciences UK Limited Delay or prevention of browning in banana fruit
GB202109586D0 (en) 2021-07-02 2021-08-18 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for editing banana genes
CN113516097B (zh) * 2021-07-29 2022-08-09 东北大学秦皇岛分校 一种基于改进EfficentNet-V2的植物叶片疾病识别方法
GB202112866D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to fusarium wilt in a banana
WO2023150637A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nickase fusion proteins
WO2023156906A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 Futuragene Israel Ltd A bacillus thuringiensis pesticidal protein (bt pp) combination useful for plant protection
WO2023199198A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 John Innes Centre Compositions and methods for increasing genome editing efficiency
CN115152623A (zh) * 2022-05-05 2022-10-11 吉林大学 一种含潮霉素抗性基因的转基因玉米的三环筛选方法
WO2023230433A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco field
WO2024031038A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco
WO2024155597A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Inscripta, Inc. Methods and compositions of co-expression of t7rna polymerase and inhibitory rna aptamers
GB202305021D0 (en) 2023-04-04 2023-05-17 Tropic Biosciences Uk Ltd Methods for generating breaks in a genome

Family Cites Families (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4370160A (en) * 1978-06-27 1983-01-25 Dow Corning Corporation Process for preparing silicone microparticles
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) * 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4727028A (en) * 1981-06-22 1988-02-23 Eli Lilly And Company Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US4536475A (en) 1982-10-05 1985-08-20 Phytogen Plant vector
US4583320A (en) * 1982-10-12 1986-04-22 Plant Genetics, Inc. Delivery system for meristematic tissue
US4559302A (en) * 1982-11-01 1985-12-17 Eli Lilly And Company DNA for directing transcription and expression of structural genes
US5094945A (en) * 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US4535060A (en) * 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5352605A (en) * 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5034322A (en) * 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
NL8300698A (nl) * 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4559301A (en) * 1983-03-03 1985-12-17 Eli Lilly And Company Process for preparing macrocin derivatives
US6943282B1 (en) * 1983-09-26 2005-09-13 Mycogen Plant Science, Inc. Insect resistant plants
AU567155B2 (en) * 1983-04-15 1987-11-12 Damon Biotech Inc. Capsules for releasing core material at constant rate
GB8324800D0 (en) * 1983-09-15 1983-10-19 Pasteur Institut Antigens
BR8404834A (pt) 1983-09-26 1985-08-13 Agrigenetics Res Ass Metodo para modificar geneticamente uma celula vegetal
US5567600A (en) * 1983-09-26 1996-10-22 Mycogen Plant Sciences, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
EP0160692A1 (en) * 1983-11-03 1985-11-13 DE WET, Johannes Martenis Jacob Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
AU586620B2 (en) * 1984-01-13 1989-07-20 Plant Genetics, Inc. Artificial seed coats for botanic see analogs
US4761373A (en) * 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
DE3587718T2 (de) * 1984-03-06 1994-08-04 Mgi Pharma Inc Herbizide Resistenz in Pflanzen.
EP0160390A3 (en) * 1984-04-16 1987-04-08 Sandoz Ltd. Embryogenic callus and cell suspension of inbred corn
US4520113A (en) * 1984-04-23 1985-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions
GB2159173B (en) * 1984-05-11 1988-10-12 Ciba Geigy Ag Transformation of hereditary material of plants
US4581847A (en) 1984-09-04 1986-04-15 Molecular Genetics Research And Development Tryptophan overproducer mutants of cereal crops
US4642411A (en) * 1984-09-04 1987-02-10 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Tryptophan overproducer mutants of cereal crops
US4666844A (en) * 1984-09-07 1987-05-19 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating cereals
US4665030A (en) * 1984-09-07 1987-05-12 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
US4743548A (en) * 1984-09-25 1988-05-10 Calgene, Inc. Plant cell microinjection technique
US5145777A (en) * 1984-10-01 1992-09-08 The General Hospital Corporation Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
JPS61134343A (ja) * 1984-12-05 1986-06-21 Nippon Peroxide Co Ltd アクリル酸あるいはアクリル酸エステルの光塩素化方法
ATE93542T1 (de) 1984-12-28 1993-09-15 Plant Genetic Systems Nv Rekombinante dna, die in pflanzliche zellen eingebracht werden kann.
US5254799A (en) * 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
DE3505620A1 (de) * 1985-02-19 1986-08-21 Maschinenfabrik Alfred Schmermund Gmbh & Co, 5820 Gevelsberg Seitenfaltungspacker fuer zigarettenweichpackungen
US5240841A (en) 1985-03-21 1993-08-31 Duke University E. coli resistance to Qβ virus infection
US5580716A (en) * 1985-03-21 1996-12-03 Stephen A. Johnston Parasite-derived resistance
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61265086A (ja) * 1985-05-21 1986-11-22 Mitsui Toatsu Chem Inc プロトプラストの培養法
US4935340A (en) * 1985-06-07 1990-06-19 Eli Lilly And Company Method of isolating antibiotic biosynthetic genes
US4885357A (en) * 1985-06-12 1989-12-05 Lubrizol Genetics Inc. Modified zein proteins containing lysine
US4886878A (en) * 1985-06-12 1989-12-12 Lubrizol Genetics, Inc. Modified zein genes containing lysine
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
AU590597B2 (en) * 1985-08-07 1989-11-09 Monsanto Technology Llc Glyphosate-resistant plants
US4940835A (en) * 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
ES2018274T5 (es) * 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
DE8610680U1 (de) * 1986-04-18 1986-06-05 Acciaierie Weissenfels S.p.A., Fusine Valromana, Tarvisio Verschluß für öffenbare und verschließbare Seitenbügel von Gleitschutzketten von Fahrzeugreifen
US4944954A (en) * 1986-04-23 1990-07-31 Epe Incorporated Vegetable oil extraction process
US5188958A (en) * 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5565347A (en) * 1986-06-10 1996-10-15 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression with plant species
US5134074A (en) * 1986-06-20 1992-07-28 Dekalb Plant Genetics Embryogenic callus and cell suspensions of corn inbred B73
US5187073A (en) * 1986-06-30 1993-02-16 The University Of Toledo Process for transforming gramineae and the products thereof
US5177010A (en) * 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
EP0257472A3 (en) * 1986-08-14 1989-10-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Transgenic monocotyledonous plants, seeds thereof and process for the preparation of the plants
US4806483A (en) * 1986-08-18 1989-02-21 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5003045A (en) 1986-08-29 1991-03-26 Lubrizol Genetics, Inc. Modified 7S legume seed storage proteins
US5215912A (en) * 1986-08-29 1993-06-01 Lubrizol Genetics, Inc. Monocot seed storage proteins in dicots
IL84064A0 (en) * 1986-10-01 1988-03-31 Plant Cell Res Inst Method and medium for controlled regeneration of cucumis sp.plants in vitro from explant tissue
EP0267159A3 (de) * 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
US5268463A (en) * 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
ZA878674B (en) 1986-11-20 1988-08-31 Monsanto Co Insect-resistant tomato plants
US5004863B2 (en) * 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5015580A (en) * 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
IL84459A (en) * 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
JPS63192383A (ja) 1986-12-08 1988-08-09 サンジェン・テクノロジーズ・コーポレイション トウモロコシにおけるフリー・プール・リジン含有量の増加方法
EP0275069A3 (en) * 1987-01-13 1990-04-25 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Pollen-mediated gene transformation in plants
US5049500A (en) * 1987-01-13 1991-09-17 E. I. Du Pont De Nemours Pollen-mediated gene transformation in plants
CH670655A5 (ja) * 1987-01-29 1989-06-30 Inst Botan Im N G Kholodnogo A
US4753035A (en) * 1987-02-04 1988-06-28 Dow Corning Corporation Crosslinked silicone coatings for botanical seeds
US5001060A (en) * 1987-02-06 1991-03-19 Lubrizol Enterprises, Inc. Plant anaerobic regulatory element
US5290924A (en) * 1987-02-06 1994-03-01 Last David I Recombinant promoter for gene expression in monocotyledonous plants
JPH0822224B2 (ja) * 1987-02-09 1996-03-06 三井石油化学工業株式会社 植物の組織培養方法
US5196342A (en) * 1987-04-16 1993-03-23 Prutech R&D Partnership Ii Bacillus thuringiensis P-2 toxin gene
TR27832A (tr) * 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
NZ224470A (en) * 1987-05-05 1991-06-25 Sandoz Ltd Method of transforming plant cell material; plant cell material and plants
US5371003A (en) * 1987-05-05 1994-12-06 Sandoz Ltd. Electrotransformation process
DE3716309A1 (de) 1987-05-15 1988-11-24 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin
EP0292435B1 (en) * 1987-05-20 1995-07-26 Ciba-Geigy Ag Zea mays plants and transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US4971908A (en) * 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
NL8701450A (nl) * 1987-06-22 1989-01-16 Solvay Werkwijze voor het transformeren van cellen.
ATE143694T1 (de) * 1987-10-20 1996-10-15 Plant Genetic Systems Nv Verfahren zur herstellung eines biologisch- aktiven peptides durch expression von modifizierten speicherproteingenen in transgenetischen pflanzen
EP0675960A1 (en) * 1987-11-02 1995-10-11 Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College Plants genetically enhanced for disease resistance
DE3738847A1 (de) 1987-11-16 1989-05-24 Telefonbau & Normalzeit Gmbh Glasfaser-uebertragungssystem
US5580761A (en) 1988-02-16 1996-12-03 Greatbatch Gen-Aid Ltd. Method of conferring resistance to immunodeficiency viral infection
ATE119569T1 (de) * 1988-02-29 1995-03-15 Du Pont Vorrichtung für das liefern von substanzen in zellen und gewebe auf eine nichtletale weise.
FI890917A (fi) 1988-03-02 1989-09-03 Eidgenoess Tech Hochschule Foerfarande foer framstaellning av transgena vaexter.
EP0332581B1 (de) 1988-03-08 1996-12-11 Ciba-Geigy Ag Regeneration von fertilen Gramineen-Pflanzen aus der Unterfamilie Pooideae ausgehend von Protoplasten
GB8806643D0 (en) * 1988-03-21 1988-04-20 Ici Plc Genetic manipulation
NZ228320A (en) * 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
US5250515A (en) * 1988-04-11 1993-10-05 Monsanto Company Method for improving the efficacy of insect toxins
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
US5013658A (en) * 1988-05-13 1991-05-07 Dna Plant Technology Corporation Transposon tagging of genes in transformed plants
AU3756889A (en) * 1988-06-01 1990-01-05 The Texas A & M University System Method for transforming plants via the shoot apex
NL8801444A (nl) * 1988-06-06 1990-01-02 Solvay Werkwijze voor het genetisch transformeren van cellen van een multicellulair eukaryotisch organisme.
US5258300A (en) * 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
DE58909876D1 (de) * 1988-06-20 2000-09-14 Novartis Ag Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen Proteinase-Inhibitoren
CA1341467C (en) 1988-07-29 2004-12-07 John C. Rogers Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
WO1990001869A1 (en) * 1988-08-19 1990-03-08 Regents Of The University Of Minnesota High lysine corn
EP0359617A3 (en) * 1988-09-02 1990-04-04 Plant Genetic Systems, N.V. Stress-tolerant plants
ATE120801T1 (de) * 1988-09-06 1995-04-15 Plant Genetic Systems Nv Pflanzen, die mit einer lepidopteralen dns- sequenz aus bazillus thuringiensis transformiert werden.
NZ230375A (en) 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
EP0360750A3 (en) * 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Novel herbicide tolerant plants
US5693507A (en) * 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5589615A (en) 1988-10-14 1996-12-31 Plant Genetic Systems N.V. Process for the production of transgenic plants with increased nutritional value via the expression of modified 2S storage albumins
DE3843627A1 (de) * 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
AU638438B2 (en) * 1989-02-24 1993-07-01 Monsanto Technology Llc Synthetic plant genes and method for preparation
US5082767A (en) 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
WO1990010691A1 (en) * 1989-03-10 1990-09-20 Grace-Sierra Horticultural Products Company Tissue culturing
US5110732A (en) * 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
EP0400246A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5097093A (en) 1989-08-30 1992-03-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred corn line PHJ33
US5641876A (en) * 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) * 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US6025545A (en) 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US6946587B1 (en) * 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
EP0442174A1 (en) * 1990-02-13 1991-08-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5593963A (en) 1990-09-21 1997-01-14 Mogen International Expression of phytase in plants
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5187267A (en) * 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US6022846A (en) * 1990-09-21 2000-02-08 Mogen International And Gist-Brocades N.V. Expression of phytase in plants
AU643563B2 (en) 1990-11-01 1993-11-18 Sapporo Breweries Limited Method for preparing transformed plant
EP0485970A3 (en) 1990-11-13 1992-07-01 Yeda Research And Development Company Limited Transgenic plants overproducing threonine and lysine
DK0558676T3 (da) 1990-11-23 2000-09-25 Aventis Cropscience Nv Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5436389A (en) 1991-02-21 1995-07-25 Dekalb Genetics Corp. Hybrid genetic complement and corn plant DK570
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
ES2225817T3 (es) 1991-05-09 2005-03-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Plantas transgenicas con el contenido en polioles alterado.
CA2114788C (en) 1991-08-09 2004-12-21 Saverio C. Falco Synthetic storage proteins with defined structure containing programmable levels of essential amino acids for improvement of the nutritional value of plants
WO1993004178A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 University Of Florida A novel method for the production of transgenic plants
UA48104C2 (uk) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5422254A (en) 1992-02-14 1995-06-06 Oy Alko Ab Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase
US5773691A (en) * 1992-03-19 1998-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
AU667301B2 (en) 1992-03-24 1996-03-21 Japan Tobacco Inc. Process for reducing seed storage proteins and process for transforming plants
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5743477A (en) 1992-08-27 1998-04-28 Dowelanco Insecticidal proteins and method for plant protection
US5545545A (en) * 1993-04-27 1996-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｇｅｎｅ，７１［２］（１９８８）Ｐ．３５９−３７０
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，［７］１，（１９８６），Ｐ．４３−５０
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１（１９８９）Ｐ．４４０−４４４

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