ES2225817T3 - Plantas transgenicas con el contenido en polioles alterado. - Google Patents

Plantas transgenicas con el contenido en polioles alterado.

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Hans J. Bohnert
Daniel M. Vernon
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Abstract

SE HAN PRODUCIDO PLANTAS TRANSGENICAS EN LAS QUE SE HA LLEVADO A CABO UNA TECNICA DE INGENIERIA GENETICA PRODUCIR UNOS NIVELES FISIOLOGICAMENTE SIGNIFICATIVOS DE ALCOHOLES DE AZUCAR, POLIOLES, EL CUAL NO LO PRODUCEN DE MANERA NATURAL LAS PLANTAS DE LAS ESPECIES. SE HAN LLEVADO A CABO TECNICAS DE INGENIERIA GENETICA EN LAS PLANTAS TRANSGENICAS PARA EXPRESAR UNA DESHIDROGENASA DE MANITOL-1-P BACTERIANA QUE, EN LA REACCION INVERSA EN LAS CELULAS VEGETALES, PRODUCE MANITOL A PARTIR DE LA FRUCTOSA EN UNA PLANTA QUE DE MANERA NATURAL NO PRODUCE MANITOL. LOS NIVELES DE POLIOLES EN LAS CELULAS VEGETALES SE HAN ASOCIADO A LA REGULACION OSMOTICA Y POR TANTO A LA TOLERANCIA A LA FUERZA DEL AGUA. LAS PLANTAS TRANSGENICAS TIENE UN VALOR SIGNIFICATIVO DESDE EL PUNTO DE VISTA DE LA INVESTIGACION, Y SORPRENDENTEMENTE, PARECEN PRESENTAR UNAS VELOCIDADES DE CRECIMIENTO Y UN VIGOR MAS ELEVADOS ASI COMO UNA MAYOR TOLERANCIA A LOS ESFUERZOS. SE HA SEPARADO OTRO GEN DE ENZIMAS QUE PRODUCE POLIOLES DE UNA PLANTATOLERANTE AL ESFUERZO.

Description

Plantas transgénicas con el contenido en polioles alterado.
Resumen de la revelación
La presente invención se refiere al campo general de la ingeniería genética de plantas superiores y relacionadas, en particular, a la creación de plantas transgénicas que han sido ingeniadas para producir niveles elevados de azúcares polihidroxilados o polioles.
Antecedentes de la invención
Una de las aplicaciones de la biotecnología moderna ha sido permitir la ingeniería genética de plantas superiores. Por el término ingeniería genética, tal como se utiliza aquí, se pretende describir la inserción en el material genético heredable de una planta, uno o más de los genes extraños, normalmente quiméricos que no están presentes de forma nativa en el genoma de la planta o no están presentes en la planta en esa forma. La planta misma transformada y sus descendientes que llevan el gen insertado son referidas como plantas transgénicas, y el gen insertado puede algunas veces ser referido como un transgen. Es importante que el gen extraño insertado sea heredable por la progenie de la planta original por herencia Mendeliana sexual normal, en otras palabras, que la línea germinal de la planta se transforme.
El método primero, y aún el más ampliamente utilizado, de la ingeniería genética de plantas se basa en la capacidad de un patógeno de plantas naturales, Agrobacterium tumefaciens, para insertar una porción de su plásmido DNA, referido a su T-DNA (DNA de transferencia) en una planta huésped. El plásmido Agrobacterium que es responsable de esta capacidad es conocido como el plásmido "Ti", por inducción de tumor, ya que la función nativa del plásmido es inducir en células de plantas infectadas un proceso oncogénico que también produce metabolitos de los que se alimenta la bacteria. Los científicos han aprendido cómo eliminar la capacidad oncogénica, o a "desarmar" el plásmido Ti de Agrobacterium, y entonces insertar en el T-DNA del plásmido Ti desarmado el gen extraño que pretende ser insertado en la planta. Entonces se permite al Agrobacterium que lleva el plásmido Ti alterado que infecte las células de la planta susceptible, y su proceso de transferencia lleva al gen o genes extraños al T-DNA en las células de la planta. Si un marcador de resistencia seleccionable, es decir un transgen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida al que la planta es susceptible, se incorpora en el plásmido Ti, el agente de selección puede utilizarse para la selección de las células de planta transformada. Entonces las células transformadas pueden regenerarse en las plantas totalmente maduras sexualmente.
Las técnicas de transformación de la planta mediada por Agrobacterium han sido aplicadas a un gran número de plantas incluyendo tabaco, tomate, petunia, algodón, zanahoria, soja y nuez. La técnica puede ser limitada en algunas plantas, sin embargo, debido a limitaciones en el rango de huésped de las especies Agrobacterium (notablemente para plantas dicotiledóneas) y la falta de protocolos de regeneración para algunas plantas. Otros logros han capacitado a la ingeniería genética de muchas de las especies de plantas más importantes no susceptibles a la transformación con Agrobacterium. Es posible introducir genes a células de plantas individuales mediante electroporación, comprendiendo choque eléctrico, o mediante interrupción de la pared química utilizando polietilenglicol, y estas técnicas han sido utilizadas para transformar protoplastos de arroz y otros cereales, que no son huéspedes de Agrobacterium. Para especies que pueden estar regeneradas a partir de protoplastos, este logro es práctico. Otra técnica recientemente desarrollada hace uso de microproyectiles recubiertos con DNA, que son físicamente acelerados en células de la planta. Esta técnica de transformación de aceleración de partícula se ha reportado que funciona con cultivos tisulares de tabaco, con suspensiones de cultivos de algodón y maíz, y con tejido meristemático de soja, álamo, y algodón.
En general, mientras las plantas transgénicas son, por supuesto, algo diferentes de las plantas nativas de la especie, generalmente no están radicalmente alteradas. Las plantas transgénicas pueden llevar uno o más, algunas veces muchas, copias de un gen extraño insertado. Los genes insertados pueden expresarse frecuentemente, aunque para los genes que se expresan, el nivel de expresión variará dependiendo de variables tales como número de copias, sitio de inserción (que se cree aleatorio), fuerza de promotores o potenciadores, y carácter de la secuencia codificante. Debido a que el número de copia y el sitio de inserción varían con cada suceso de transformación, normalmente es el caso de que varias familias o líneas de plantas transgénicas se crean independientemente, éstas tendrán características de expresión levemente diferentes. En general, no parecen ser diferencias fundamentales entre las plantas transgénicas creadas mediante cualquiera de estos métodos, es decir, hay variación en las plantas, pero es independiente del método de transformación. En cualquier caso, mientras no todas las plantas han sido ingeniadas genéticamente, las técnicas disponibles actualmente y la gran variedad de plantas a las que han sido aplicadas, sugieren que no hay fronteras biológicas para la ingeniería genética de cualquier especie de planta.
En el estudio de las plantas transgénicas, tabaco y Arabidopsis se usan frecuentemente como sistemas modelo. Esto es debido a que el tabaco es generalmente una de las plantas más fáciles para ingeniar genéticamente por transformación de Agrobacterium, debido a la disponibilidad bien conocida y los marcadores seleccionables convenientes, y los fáciles protocolos de regeneración. En general, los trangenes que han sido expresados bien en el tabaco han demostrado que han sido expresados con características similares en otras especies de plantas. El tabaco también es típico de plantas de cultivo sensibles al estrés en su regulación osmótica y síntesis de azúcar. El tabaco no produce de forma nativa manitol en sus tejidos y se ha reportado que es incapaz de metabolizar manitol.
Debido a que los procedimientos para la ingeniería genética de muchas de las especies de cultivo agrícolamente importantes han sido desarrollados, ha habido algo de menos progreso en la identificación de que genes o características extranjeras pueden ser útiles insertadas en plantas. Los ejemplos mejor conocidos en la tecnología implican genes que confieren resistencias, por ejemplo, resistencias a herbicidas o pesticidas. Tales genes pueden conferir la característica deseada (es decir, resistencia) con un único transgen. Para mejorar algunas de las características más importantes agronómicamente de las plantas relacionadas con el vigor, rendimiento, tolerancia al agua y la sal, estrés por calor, o similares, parece ser inicialmente un objetivo más difícil. Las características que están asociadas con estas cualidades son pobremente comprendidas, y el gen, o más probablemente, los genes, asociados con las varias características están generalmente sin caracterizar. Consecuentemente, existe una necesidad de identificar nuevas clases de características, o genes, que pueden estar insertados en plantas de cultivo para intentar hacerlas crecer mejor. Aún si los genes insertados nuevamente no hacen que la planta funcione mejor en condiciones agrícolas, las plantas transgénicas llevando tales genes son útiles para propósitos de investigación para investigar cómo los cambios en procedimientos internos (por ejemplo, regulación osmótica) afectan al campo de funcionamiento de las plantas.
Todas las plantas, por supuesto, captan energía en forma de luz solar y almacenan la energía en forma química como azúcares. Sin embargo, los azúcares que las plantas fabrican varían en tipo y cantidades relativas de planta a planta. Además, para servir a su función de almacenamiento de energía química, algunos azúcares o otros carbohidratos pueden también servir para regular el balance osmótico de las plantas. La capacidad osmótica de las células de la planta, y los balances osmóticos relativos entre los orgánulos subcelulares, pueden estar fundamentalmente relacionados con la habilidad de las plantas para resistir una variedad de tipos de estrés, tales como estrés de congelación o de sal, además para estrés de sequía o de agua. El frío, por ejemplo, puede ser fatal para los tejidos de las plantas debido a la pérdida de agua antes de que se alcancen temperaturas extremas en las que el hielo se cristalizaría en el interior de los tejidos de las plantas. Esta capacidad de resistir al estrés de agua puede estar fundamentalmente relacionada con el funcionamiento de la planta en condiciones adversas.
El papel de azúcares polialcoholes, o polioles, en el metabolismo de la planta es pobremente entendido, a pesar del hecho de que hasta el 30% de la producción de carbono global anual por plantas superiores puede se por los polioles más que por los azúcares simples. De los polioles, el manitol es el más abundante en la naturaleza. Debido a que se encuentra en aproximadamente setenta familias de plantas, no se produce a niveles detectables en cualquier campo agrícola importante o cultivo de vegetales, a parte del apio (Apiaceae), café (Rubiaceae) y oliva (Oleacea). El manitol se produce bastante comúnmente en algas y hongos.
Otros polioles son comunes en algunas especies de plantas, incluso en algunos casos en los que ningún papel metabólico para los polioles es aparente. Por ejemplo, los polioles ononitol y pinitol se sabe que son producidos en algunas plantas bajo condiciones de estrés de sequedad, sal o baja temperatura. En algunas de estas plantas, el poliol producido parece ser un producto final, es decir, uno que no tiene mas papel metabólico y a partir del que ningún otro metabolito es sintetizado. Esto descubre la posibilidad de que la acumulación de tales polioles tenga un papel regulatorio osmótico.
En plantas, hay dos rutas separadas para la biosíntesis de manitol. Un camino utilizado, por ejemplo en algas marrones, procede de la reducción de la fructosa-6-P a manitol-1-P mediante la manitol-1P deshidrogenasa, con un cofactor NAD, seguido por la defosforilación mediante una fosfatasa manitol-1-P específica (manitol-6-P y manitol-1-P son sinónimos). En el apio, el proceso es diferente, empezando con la manosa-6-P, que es reducida a manitol-1-P por la manosa-6-P reductasa con un cofactor NADP, seguido otra vez por defosforilación.
En E. coli, se conoce un sistema catabólico del manitol. En E. coli, el manitol se toma del medio y se convierte en manitol-1-fosfato (M1P). Entonces el enzima dependiente de NAD, manitol-1fosfato deshidrogenasa, (M1PD) convierte el manitol-1-fosfato en fructosa 6-fosfato en una reacción de equilibrio. El gen que codifica para esta enzima, referida como mt1D, ha sido previamente clonado por otros.
Un método para evaluar el papel de los polioles en la respuesta al estrés de las plantas es examinar la producción de polioles en plantas tolerantes al estrés. Hay un número de plantas tolerantes a la sal, referidas como halófitas, que son relativamente tolerantes a la sequía y al frío, así como a la sal. Desafortunadamente, muchas de nuestras plantas de cultivo importantes son especies sensibles a la sal, referidas como glicofitas. Si los genes y mecanismos utilizados por halófitas para combatir el estrés son identificados, puede ser posible transferir esos genes y/o mecanismos a plantas de cultivo importantes mediante ingeniería genética.
Un sistema único que puede utilizarse para identificar los genes de tolerancia al estrés y los mecanismos es el halófito inducible, Mesembryanthemum crystallinum, la planta comúnmente denominada escarchada. Como un halófito facultativo, la planta escarchada experimenta un conjunto de cambios bioquímicos inducidos por el estrés para convertirse más tolerante al estrés. Uno de esos cambios implica un intercambio de vías metabólicas, es decir, a partir de C_{3} al metabolismo del ácido crasuláceo, como una medida de conservación del agua. Otros de esos cambios fueron anteriormente pobremente caracterizados.
Schaewen et al, EMBO J. 1990, Vol. 9, Pág. 3033-3044 revela la expresión de una invertasa derivada de levaduras en la pared celular de las plantas de tabaco y Arabidopsis. Esto llevó a una acumulación de carbohidrato y a la inhibición de la fotosíntesis influenciando fuertemente el crecimiento y fenotipo de plantas de tabaco transgénicas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una planta transgénica comprendiendo en sus células una característica genética heredable, un gen extraño condicionante para la expresión de un enzima catalizando la producción de un poliol en los tejidos de la planta a partir de sustancias nativamente presentes en la planta en donde el poliol no se produce de forma nativa en los tejidos de la planta y el poliol se acumula en la planta sin impacto adverso en la planta.
En una realización particular de la invención se refiere a una planta comprendiendo en sus células como una característica genética heredable un gen extraño que condiciona para la expresión de un enzima que cataliza la producción de manitol en el tejido de la planta a partir de una sustancia presente de forma nativa en la planta.
En otra realización más la invención proporciona un método para alterar los constituyentes de los azúcares alcohol de especies de cultivo comprendiendo la introducción en el genoma de la planta de cultivo mediante ingeniería genética un gen que expresa un enzima que cataliza la producción en células de la planta de un azúcar alcohol no producido de forma nativa en plantas de las especies de plantas a partir de un azúcar que se produce de forma nativa en plantas de las especies de plantas.
Es objeto de la presente invención describir un nuevo logro para la alteración genética de plantas superiores de modo que las plantas de cultivo útiles pueden hacerse con nuevas características y así puede fomentarse esta búsqueda en la mejora de las plantas de cultivo.
Es otro objeto de la presente invención ingeniar plantas genéticamente que no producen manitol de forma nativa para que produzcan manitol. La producción de manitol en tales plantas es útil para propósitos de búsqueda, y pueden ser útiles agronómicamente debido a la tolerancia al estrés inducida de las plantas modificadas genéticamente.
Es todavía otro objeto de la presente invención producir genéticamente plantas que no producen ononitol de forma nativa para que produzcan ononitol. La producción de ononitol o su metabolito pinitol, puede también aumentar la tolerancia al estrés en plantas glicofitas.
Es todavía otro objeto de la presente invención alterar las plantas para que produzcan nuevos carbohidratos en plantas que están creciendo sin producir efectos negativos sobre la planta.
Es una característica sorprendente de la presente invención que las plantas transgénicas que producen manitol, que son de una especie de planta que no produce de forma nativa manitol y que se ha reportado que metaboliza pobremente el manitol, si no lo puede metabolizar en absoluto, no están afectadas de forma negativa por la presencia de manitol en su tejido, pero realmente parecen haber incrementado en vigor y tolerancia al estrés.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente especificación cuando se tomen en conjunción con los esquemas acompañantes.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 es una ilustración esquemática de la construcción de vectores de expresión de la planta p35SMTLDL y p35SMTLDS.
Fig. 2 es una ilustración esquemática de la construcción del vector de expresión de plantas pRBCSMTLDS.
Fig. 3 es un mapa que ilustra los varios vectores de expresión construidos aquí por los inventores.
Fig. 4 ilustra tres ilustraciones gráficas del resultado de la cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con análisis de detección amperométrica pulsada (HPAE-PAD) de azúcares solubles de tejidos de plantas.
Fig. 5 ilustra otras tres ilustraciones gráficas del análisis HPAE-PAD de tejidos de plantas transgénicas.
Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida a un método para modificar genéticamente plantas para de esta manera producir cambios alterados, fisiológicos o agrónomos en las plantas por alteración de la producción de azúcares polihidroxilados, o polioles, en los tejidos de las plantas. En particular, se ha encontrado que es posible ingeniar genéticamente una planta que no produce de forma nativa un poliol en particular, tal como manitol, para producir cantidades medibles fisiológicamente del poliol como un producto metabólico, a partir de azúcares precursores normalmente presentes en los tejidos de la planta. Sorprendentemente, la producción de manitol por una planta que no la produce de forma nativa no sólo no fracasa en la creación de cualquier efecto adverso en la planta, sino que parece fomentar el crecimiento de la planta resultando en una planta visiblemente más vigorosa y saludable. Este resultado se ha logrado mediante la introducción en el genoma de una planta de un gen extraño que codifica para la expresión de un enzima bacteriano, que es capaz bajo condiciones fisiológicas presentes en el citosol de células de planta, de catalizar la producción de manitol a partir de fructosa.
También se ha encontrado que uno de los mecanismos inductores del estrés en halófitos facultativos también implica la síntesis de polioles. Mediante la identificación y clonación de uno de los genes responsables para tal respuesta al estrés, ahora es posible empezar a transferir directamente características de tolerancia al estrés relacionadas con la producción de poliol en especies glicofitas.
El trabajo que dio origen a la invención descrita aquí empezó como una investigación en la viabilidad de la alteración de constituyentes carbohidrato relativos de tejidos de plantas. Debido a que la tecnología para ingeniería genética se ha vuelto más ampliamente conocida y apreciada, una pregunta consecuente ha sido dirigida hacia que cambios útiles se podrían hacer a las plantas para que pudieran ser fácilmente manipulables, finalmente para propósitos agronómicos mejores. Las alteraciones en la producción de polioles, o alcoholes azúcares, en plantas también tienen una utilidad inmediata en investigación, para demostrar que pueden hacerse las variaciones en osmolitos vegetales, de manera que el balance de los tejidos de las plantas pueda ser mejor entendido.
Uno de los objetivos de la manipulación genética de las plantas es producir plantas que son más resistentes al estrés del ambiente. La adaptabilidad global de las plantas al estrés de agua y sal parece ser dependiente de los ajustes osmóticos que pueden realizarse por las plantas durante épocas de estrés, y la capacidad de las plantas para realizar tales ajustes osmóticos parece ser dependiente de un número de citosolutos compatibles generados en las células de las plantas superiores. Las plantas superiores generan muchos citosolutos compatibles. Incluidos dentro de estos compuestos están varias moléculas de azúcar, incluyendo los oligosacáridos y polioles. Así, una forma posible de probar la capacidad de los ingenieros genéticos de plantas para variar la sensibilidad de estrés de plantas puede ser para alterar la producción de poliol dentro de una planta determinada, y para usar esta planta para investigar qué efectos pueden alcanzarse. No estaba claro antes de los resultados descritos aquí que este objetivo fuera posible. En teoría, si uno introduce en una planta la capacidad de sintetizar un compuesto no nativo a partir de un sustrato abundante, en ausencia de una ruta metabólica para el compuesto, uno puede esperar que los tejidos vegetales acumulen cantidades excesivas del compuesto, para su perjuicio. Por ejemplo, uno puede esperar que la biosíntesis de polioles puede eliminar metabolitos vegetales endógenos de las plantas de tipo salvaje y alterar así las rutas metabólicas de tipo salvaje en detrimento de la planta transgénica. Sorprendentemente, lo que se ha encontrado es que las cantidades relativamente grandes de un poliol como manitol pueden producirse en tejidos vegetales sin dañar a la planta, aún cuando las especies vegetales han sido descritas para metabolizar pobremente el manitol. Además, y aún más sorprendentemente, se ha encontrado que la introducción de un gen sencillo que permite la producción de un poliol simple puede tener un aparente realzamiento del vigor y la productividad en una planta (es decir, acumulación de manitol), y puede claramente resultar en alteraciones bioquímicas significativas de la planta, sin estresar o dañar indebidamente a la planta. De hecho, la planta transgénica en realidad pasa a ser más tolerante al estrés.
Otra ruta para investigar el mismo problema se dirigió hacia la caracterización de los mecanismos de respuesta al estrés de plantas tolerantes al estrés. Esta investigación se dirigió hacia la escarchada, Mesembryanthemum crystallinum, ya que esta planta es un halófito inducible. Mediante estudio de los mecanismos que se inducen en la planta mediante estrés, y contrastando aquellos mecanismos con aquellos de la planta en su estado no inducido, un mejor entendimiento se alcanza de los métodos para infundir a plantas glicofitas con tolerancia a estrés.
Se ha encontrado aquí que una de las respuestas a estrés en la escarchada es la inducción transcripcional de un gen que codifica una nueva metil transferasa. Esta metil transferasa ha sido identificada mediante ensayo funcional como una mio-inositol-O-metil transferasa, y está involucrada en la escarchada en la biosíntesis del poliol D-pinitol cíclico. El pinitol se produce de forma abundante en un número de especies tolerantes a la sal y al estrés, y en la escarchada puede acumular alrededor de 70% de los carbohidratos solubles de la planta. Paul y Cockburn, Jour. Exp. Bot. 40:1093-1098 (1989). Ya que el mio-inositol es un metabolito vegetal ubicuo, la disponibilidad del gen codificante de mio-inositol-O-metil transferasa, referida aquí como Imtl, hace posible la introducción de este gen simple en un gran número de especies vegetales diana para causar la acumulación de ononitol en aquellas plantas, mediante metilación del mio-inositol.
Así, tal como se describe a continuación, dos genes separados se describen que son capaces de inducir nuevas biosíntesis de poliol en plantas transgénicas. Un gen es bacteriano en origen y el otro deriva de una planta tolerante al estrés. Así es evidente que una variedad de técnicas para efectuar la acumulación de poliol en plantas para la tolerancia al estrés en plantas son posibles. Cada uno de los dos genes ejemplificados permiten describir estas técnicas a continuación.
Gen de producción de manitol
El gen de origen bacteriano se usa para demostrar que las plantas transgénicas de tabaco han sido creadas que pueden producir manitol y que pueden tener un aumento de la tolerancia para la sal. Antes del trabajo descrito aquí, se desconoce si las plantas pueden ser alteradas para producir manitol sin consecuencias adversas. De hecho, ya que las especies vegetales investigadas, tabaco, no produce normalmente manitol, la producción de manitol en las células vegetales puede racionalmente esperarse que sea perjudicial para aquellas células. Normalmente uno no espera que el tabaco presente una ruta de degradación para un compuesto, como el manitol, que no se produce normalmente, y se ha descrito que lo metaboliza pobremente, Thompson et al., Physio. Plant., 65, pp. 365-369 (1986). Basándose en esto, una expectación razonable de la producción de manitol puede ser una sobreabundancia de manitol en las células de la planta, llevando a un desequilibrio osmótico y el reventón probable o deformación de las células. De hecho, por razones que son aún oscuras, este no ha sido el caso. De hecho, los sistemas endógenos dentro de la planta del tabaco parecen ser capaces de manejar y reaccionar con manitol, en particular transportándolo sistemáticamente dentro de la planta preferentemente a ciertas porciones de la planta en sí. De esta manera, y sorprendentemente, la producción de un único poliol no presentó nativamente en una especie vegetal no sólo evita dañar a la planta, sino que la planta parece bastante capaz de manejar la existencia del poliol dentro de sus tejidos y de transportar el poliol preferentemente dentro de la planta sin ser necesarias más modificaciones adicionales a la genética de la planta.
Los inventores de la presente invención comienzan así con la meta en mente de alterar las características de producción de poliol de plantas superiores. Para llevarlo a cabo se necesita la producción en células vegetales de un enzima heterólogo o extraño que podrá catalizar la producción de un poliol deseado dentro de las células de los tejidos vegetales. Los enzimas que catalizan la producción de polioles en plantas superiores fueron, antes del trabajo descrito aquí, generalmente pobremente caracterizados. Clones para los genes de estas enzimas de plantas no están aún disponibles. Por lo tanto, la búsqueda de un gen de un enzima adecuado para transformarse en células vegetales se dirigió por primera vez hacia genes para enzimas que han sido caracterizados es sistemas bacterianos. Ya que los enzimas varían en su eficacia sobre un rango de pHs, es apropiado buscar un gen para un enzima que puede operar en el rango de pH de condiciones vegetales citosólicas. El enzima puede utilizar un sustrato que está presente en suficientes cantidades en ambos citosoles de plantas y en los cloroplastos. La concentración del sustrato dentro del citosol, y el cloroplasto, puede ser suficiente como para producir suficientes cantidades del poliol para resultar en cambios bioquímicos en la planta que puede detectarse mediante un ensayo razonablemente conveniente. También es preferible que el enzima use tanto un cofactor fácilmente disponible, o ningún factor, para que los catalizadores puedan proseguir en una planta transgénica que posee un gen transformante sencillo insertado en él. Por lo tanto es preferido que el enzima sea un enzima sencillo, uno sin subunidades adicionales o cofactores necesarios.
La búsqueda de un enzima que reúna las condiciones anteriores se dirigió, y resultó en la identificación de un enzima conocido como manitol-l-P deshidrogenasa (M1PD) que se identificó en E. coli. El gen para este enzima se clonó y estuvo disponible para los investigadores en biología molecular, como se describe por Lee y Saier, J. Bact., 153:2, pág. 685-692 (1983). El gen para el enzima M1PD es referido como mtlD. En E. coli, el enzima está implicado en el catabolismo del manitol, que es una fuente de carbono para las bacterias. El manitol es fosforilado por las bacterias para proporcionar manitol-1-fosfato, que es deshidrogenado entonces por el enzima M1PD para producir fructosa-6-fosfato. El único co-factor para la reacción es NADH. La reacción es reversible, y el enzima es un polipéptido simple que no requiere subunidades adicionales y es por lo tanto activa como una unidad simple. La secuencia codificante para la codificación de genes bacterianos para la expresión de este enzima se presenta como ID. DE SEC. NO.: 1, a continuación, que contiene la secuencia codificante de mtlD. Este enzima bacteriano opera eficientemente a un pH óptimo entre 6,5 y 8,5, que es compatible con condiciones citosólicas de plantas. El sustrato para la biosíntesis de manitol-l-P es fructosa-6-P, que es abundante en el citosol de todas las plantas superiores. Además, el cofactor, NADH, también está presente en plantas superiores. Concordantemente, todas las condiciones necesarias para la síntesis de manitol-l-P a partir de fructosa-6-P mediante la introducción de un gen que codifica este enzima sencillo parecen en teoría estar presentes en los tejidos de tabaco. Hasta que las plantas no fueron creadas, no estuvo claro que estas condiciones fueran suficientes.
En las plantas transgénicas descritas aquí, el manitol se produce claramente en cantidades fisiológicamente significativas. La ruta deducida para la síntesis de manitol es que la fructosa-6-P se crea a partir de fructosa libre mediante un proceso nativo en las células de la planta. La fructosa-6-P es un producto natural indirecto del proceso de producción de azúcar fotosintético. La fructosa-6-P es convertida en manitol-l-P por la enzima M1PD expresada mediante el gen mt1D. El manitol-l-P es desfosforilado entonces mediante una fosfatasa nativa no específica a la planta. Mientras que la conversión de fructosa-6-P a manitol-l-P debe estar en equilibrio termodinámico, la desfosforilación de manitol-l-P está altamente favorecida y así esta ruta de síntesis no sugiere cómo el manitol puede ser metabolizado después de eso.
Las plantas de tabaco transgénico producidas por la inserción del gen mtlD no están afectadas de forma deletérea por la presencia del gen. Por el contrario, las plantas transgénicas parecen al menos tan saludables y vigorosas como los controles no transformados. Además, las plantas transgénicas han demostrado tener un nivel mayor de tolerancia a la sal. En experimentos controlados, las plantas transgénicas que expresan el gen mtlD permanecen vigorosas bajo condiciones deletéreas a las plantas control. Así se demuestra la capacidad de acumular poliol para aumentar la tolerancia al estrés.
Tal como se ha descrito brevemente antes, muchas técnicas para la introducción de rasgos de genes extraños en plantas superiores son ahora ampliamente conocidas, y pueden ser practicadas por aquellos entendidos en el campo. Las secuencias codificadoras para las proteínas introducidas, tales como las de la secuencia codificadora mtlD en ID. DE SEC. NO.: 1 a continuación, puede combinarse con secuencias reguladoras flanqueantes adecuadas, tales como promotores y terminadores, para producir casetes de expresión que pueden transformarse en células de plantas. Se pueden utilizar varias técnicas para introducir tales vectores de expresión de plantas en células de plantas. La primera técnica desarrollada y más ampliamente utilizada está, tal como se ha descrito antes, basada en el mecanismo de infección de Agrobacterium tumefaciens. No obstante, otras técnicas como la electroporación de protoplastos, y la liberación de partículas aceleradas de ácidos nucleicos al interior de células vegetales, ha sido desarrollado y demostrado ser efectivo en la creación de plantas transgénicas. También es conocido y reconocido en la industria que la introducción de un casete de expresión de plantas llevando uno o dos genes en el genoma de una planta resulta en plantas transgénicas que son capaces de transmitir los transgenes insertados a través de herencia Mendeliana normal a su progenie. Mientras que existe alguna variación en las diferentes familias, o líneas, de plantas producidas usando tales técnicas de transformación de plantas, las variaciones son estables dentro de las líneas de plantas o familias, y parecen ser dependientes sobre estas variaciones como número de copias y locus del inserto genético en el genoma de la planta. Tal como se describirá a continuación, los inventores han creado muchas líneas diferentes de plantas independientes incorporando el gen mtlD bajo varios promotores, y todos son efectivos para producir manitol en las plantas transgénicas en cantidades fácilmente medibles. El gen insertado es totalmente heredable por herencia Mendeliana y es efectivo tanto si se presenta en una planta homozigota como heterozigota.
Lo que se propone aquí es que la misma metodología puede aplicarse a otras plantas superiores que no producen de forma nativa manitol. Ninguno de los principales cultivos de campo, como el grano, incluyendo maíz y trigo, y otros cultivos de campo como algodón y soja, y los principales cultivos vegetales, diferentes de apio, producen manitol a niveles detectables o por encima aproximadamente de 5 mili-Molar. Se ha encontrado en este punto que la introducción de un gen único en las plantas de tabaco resulta en niveles relativamente grandes de producción de manitol dentro del citosol de las plantas. Niveles de manitol en exceso de 100 mili-Molar se encuentran fácilmente medibles, y suficientes para causar un visible realce del vigor general y crecimiento de la planta transgénica en la que el atributo de producción de manitol ha sido insertado. Se intenta específicamente, y se vislumbra aquí, que la producción de manitol puede así ser creada en otras especies de plantas ambas como una herramienta de laboratorio para investigar las características del catabolismo y almacenamiento de polioles en estas especies de plantas, y potencialmente como estrategia para inducir el aumento del rendimiento agronómico o agrícola para las plantas transgénicas así producidas.
Como una variante de la presente invención, se pretende también que el gen mtlD se inserte en plantas transgénicas para que preferencialmente produzca manitol en los cloroplastos de las plantas transformadas. La presencia del enzima, y por lo tanto del manitol, es deseable que esté presente en los cloroplastos específicamente en la teoría que los efectos osmóticos protectores del manitol serán más acentuados si están presentes en los cloroplastos. Esto se puede realizar situando la secuencia codificante mtlD en un casete de expresión vegetal incluyendo una secuencia 5' de péptido de tránsito que provoca el paso del péptido expresado preferentemente en los cloroplastos. Uno de tales casete de expresión de péptido de tránsito se describe por Guerineau et al., Nucl. Acids Res. 16:23, p. 11380 (1989). Si se hace posible transferir genes directamente en orgánulos celulares, esto puede también puede ser útil para controlar el lugar de síntesis de manitol.
Gen Imtl
Tal como se ha indicado antes, otra vía de investigación se dirige hacia la identificación de mecanismos en los halófitos tolerantes a la sal, M. crystallinum, escarchada, para identificar genes responsables de su tolerancia a sal inducible. Para investigar la base molecular de esta tolerancia a sal inducible, una genoteca sustraída de cDNA se creó enriquecida de secuencias inducidas por estrés. La librería de cDNA se analizó entonces para identificar aquellos productos transcripcionales que están preferencialmente, o dramáticamente, incrementadas en expresión en la planta siguiendo la inducción por estrés. Esto se realizó mediante comparación de los cDNAs de plantas estresadas y sin estresar. Un número de cDNAs se identificaron que estaban dramáticamente sobrereguladas durante el proceso de respuesta al estrés. Los experimentos de hibridación cruzada últimamente indicaron que se habían identificado tres clones distintos de aquellos cDNAs. Uno de estos clones ha sido identificado como un gen codificante de un enzima, mio-inositol O-metil transferasa, denominado aquí mediante el nombre Imtl. El enzima metil transferasa está involucrado, en la escarchada, en la biosíntesis del poliol pinitol cíclico. Pinitol es un metabolito abundante en la escarchada estresada por sal. Esta inducción transcripcional de la biosíntesis del gen Imtl en la escarchada estresada indica que la producción de los polioles juega un papel crucial durante la adaptación al estrés osmótico mediante este halófito facultativo.
En la escarchada, la ruta de producción de pinitol comienza con la glucosa-6-P que se convierte en mio-inositol-l-P y luego en mio-inositol. En general, el mio-inositol puede convertirse mediante una metil transferasa en tanto secuoyitol o D-ononitol, dependiendo de las especies vegetales, que se convierten entonces en D-pinitol. En la escarchada, es D-ononitol lo que se fabrica. El enzima Imtl se cree que realiza la función metil transferasa para convertir mio-inositol a D-ononitol.
Ha sido determinado el clon de cDNA que contiene la región codificante para el gen Imtl. La secuencia se presenta como ID. DE SEC. NO.: 3 a continuación. El clon de cDNA tiene 1524 pares de bases de longitud e incluye una secuencia leader rica en residuos A y T, y un codón de inicio ATG, seguido por un marco de lectura abierto ininterrumpido de 1095 nucleótidos. El análisis de la secuencia codificante para el gen Imtl predice una proteína hidrofílica de 365 amino ácidos con un peso molecular de alrededor de 40 kD. Una búsqueda de la base de datos genética NBRF revela una similitud con una hidroxindol O-metil-transferasa de la glándula pineal bovina, que fue homóloga en un 55% de la longitud entera de la región codificante de la proteína. El producto proteico predicho del gen Imtl se encontró que estaba aún más relacionado a dos hidroximetil transferasas bifuncionales de plantas, que metilan los monómeros de lignina de ácido cafeico y ácido hidroxiferúlico, teniendo más de 50% de identidad sobre la longitud completa de la región codificante de la proteína.
Todo esto sugiere que el posible rol de esta metil transferasa en la respuesta al estrés por sal en la escarchada es la iniciación de la biosíntesis de pinitol. El pinitol acumula altos niveles en la escarchada al mismo tiempo que el transcrito del gen Imt aparece a altos niveles en el citosol de la planta. Para sustanciar el papel fisiológico hipotetizado del gen Imt en la biosíntesis de pinitol, el gen ha sido introducido en un vector de expresión adecuado y expresado en E. coli. Los lisados bacterianos de la E. coli transformada, se probaron para la actividad mio-isotol hidroximetil transferasa. En este lisado, una proteína de masa molecular de aproximadamente 40 kD se identificó que co-migró en geles de poliacrilamida con un producto traduccional creado por las copias transcritas del clon Imtl creado in vitro. Los extractos de las células de E. coli, ambas células control y células que expresan el gen Imtl, se probaron para la actividad O-metil transferasa dependiente de mio-inositol. Se encontró la actividad esperada en los extractos transformados y la actividad faltaba en los controles. El enzima producido por el gen Imtl se encontró capaz de metilación de mio-inositol para producir ononitol, el intermediario metilado en la biosíntesis de pinitol.
El hecho de que un gen inducible asociado con la tolerancia al estrés en una planta inducible tolerante a sal es responsable de la síntesis de un poliol cíclico apoya en gran manera a la tesis que la acumulación de polioles en células vegetales está asociada con el aumento de estabilidad a la resistencia al estrés. Esta conclusión es apoyada por los datos de los dos tipos independientes. Primero, tal como se apunta en el primer ejemplo descrito antes, un gen bacteriano que codifica una enzima capaz de condicionar la producción de polioles en células vegetales ha proporcionado a la planta el aumento de estabilidad para resistir el estrés por sal. Secundariamente, los genes nativos encontrados en plantas también se asocian con el estrés por sal incluyen genes que codifican enzimas responsables de la síntesis de poliol. Por lo tanto ambas observaciones apoyan la conclusión que de otra manera las plantas intolerantes al estrés pueden convertirse mas tolerantes al estrés mediante la introducción en estas plantas de sistemas génicos que codifican enzimas responsables de la acumulación de poliol en las células de aquellas plantas.
También se cree que los resultados sorprendentemente alcanzados aquí sugieren que otros polioles no-nativos pueden también ser producidas en plantas de cultivo sin dañar las plantas y con un beneficio potencial. Enzimas adecuados pueden encontrarse para producir en células vegetales otros azúcares de alcohol, como ribitol, eritritol, xilitol, arabitol, sorbitol, inositol, metil-inositol, dulcitol, galactitol y heptitol. Además de los azúcares de alcohol identificados antes, el término "poliol" tal como se usa aquí se intenta aplicar a ambos azúcares de polialcohol además de derivados inmediatos de ellos, tales como polioles metilados. Estos otros polioles pueden producirse en plantas superiores mediante un método similar a la producción de manitol descrita aquí, es decir, mediante identificación de enzimas que pueden catalizar la síntesis del poliol deseado a partir de los sustratos disponibles en las células vegetales y mediante la introducción de un gen para el enzima en plantas transgénicas. Las plantas transgénicas así producidas acumularán en sus células uno o más polioles no producidos de forma nativa por plantas de estas especies.
Los siguientes son ejemplos que narran el protocolo preciso usado por los inventores aquí. Se debería entender que estos ejemplos son ilustrativos de la presente invención y no limitantes de la misma.
Ejemplos Ejemplo 1 Gen Bacteriano mt1D Construcción de vectores/plásmidos de expresión en plantas
La construcción del plásmido p35SMTLDL empezó con el plásmido pCD7,5, el cual es descrito en Lee y Saier, J. Bact. 153:2, pp. 685-692 (1983). La digestión de copias de pCD7,5 mediante los enzimas de restricción NSI 1 y Pst I dio lugar a un fragmento de 1,5 kilobases, que contenía toda la región codificante del gen estructural mtlD de E. coli junto con 150 pares de bases de la secuencia leader no traducida. Este fragmento de 1,5 kilobases fue entonces subclonado en la diana Pst I de un vector de expresión derivado de p35SCATNOS, del cual el gen CAT había sido eliminado. El plásmido p35SCATNOS fue descrito por by Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, páginas 5824-5828 (1985) y por Fromm et al., Nature, 319, páginas 791-793 (1986). El subclonado del fragmento en el vector de expresión dio lugar a un plásmido denominado p35SMTLDL. Este procedimiento se ilustra esquemáticamente en la Fig,1.
Este vector fue entonces alterado para eliminar el leader no traducido 5' de 150 pares de bases del gen bacteriano estructural mtlD, mediante subclonación de extremos romos producidos por digestión de p35SMTLDL mediante las enzimas Ava 1 y Pst I en las copias adicionales del plásmido p35SCATNOS, creando un vector de expresión alternativo denominado p35SMTLDS. Los sufijos "L" y "S" representan "largo" o "corto," en referencia a la secuencia leader. Ambos vectores p35SMTLDL y p35SMTLDS incluían las regiones codificantes para el gen mtlD localizado detrás del promotor del gen 35S del gen del virus del mosaico de la coliflor, un promotor que es conocido por ser altamente activo resultando en un alto nivel de expresión de genes foráneos transformados en células vegetales. Los vectores pueden ser comparados por referencia a la Fig. 3.
Un segundo equipo de vectores de expresión contiene el gen mtlD detrás del promotor de la nopalina sintasa de pNOSCATNOS, también descrito en Fromm et al. supra. Las manipulaciones fueron exactamente análogas a las descritas más arriba, creando dos plásmidos denominados pNOSMTLDL y pNOSMTLDS, cada uno de ellos incluía el gen estructural mtlD localizado detrás del promotor de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.
Copias adicionales del plásmido p35SMTLDL fueron digeridas mediante enzimas Ava I y Eco RI, presentando entonces extremos romos. El fragmento de 1600 pares de bases resultante fue entonces aislado mediante electroforesis y ligado a un plásmido llamado pBI131, como se describe por Jefferson et al. En EMBO-Journal 6, páginas 3901-3907 (1987), el cual había sido digerido mediante SmaI, dando lugar a un vector denominado pRBCSMTLDS. Este vector contenía como promotor, al promotor de la subunidad pequeña de la rubisco del tabaco, el cual se ha demostrado previamente que es un promotor ligeramente activado, condicionando la expresión de los genes solamente a tejidos fotosintéticos o otros tejidos vegetales expuestos a radiación lumínica de forma incidental.
Un plásmido adicional pD35SMTLDL, fue creado de una forma similar a p35SMTLDL, a excepción del vector de expresión pJIT117, descrito por Guerineau et al., Nucleic Acids Research 16:23, p. 11380, (1988), que fue digerido mediante los enzimas HindIII y SphI, se le proporcionó extremos romos, fue religado, y posteriormente digerido mediante PstI. Este plásmido contenía el gen estructural mtlD localizado detrás del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, y una secuencia potenciadora no traducida también procedente del virus del mosaico de la coliflor.
El plásmido, pCABMTLDL, fue creado mediante la digestión por separado de un plásmido denominado pKHl11 (Harkins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87, páginas 816-820 (1990)) y el plásmido pUC18 por los enzimas Eco RI y Sma I, aislando el fragmento de 1750 pares de bases que contiene el promotor CAB del producto de digestión pKHl11, y ligando este fragmento con las copias linearizadas de pUC18. El promotor CAB hace referencia al promotor del gen de la proteína de unión a clorofila AB. Este vector fue entonces digerido mediante PstI, y el fragmento que contenía el gen estructural mtlD arriba fue ligado al vector pUC18 digerido mediante PstI. Este vector fue entonces digerido mediante PstI y ligado a un vector digerido por PstI que contenía el terminador de 300 pares de bases de la nopalina sintasa del p35SMTLDL el cual fue aislado por digestión con PstI y Eco RI de aquel plásmido.
Todos los vectores de expresión descritos aquí fueron subclonados en un vector binario desactivado, Binl9, por inserción en plantas tal y como se describe en Bevan Nucleic Acids Research 12, páginas 8711-8721 (1984). El sistema del vector binario separa la función de virulencia del plásmido Ti del ADN-T. Esto fue realizado construyendo fragmentos de digestión Hind III de p35SMTLDL, p35SMTLDS, y pRBCSMTLDS y utilizando fragmentos de digestión Eco RI e HindIII de pNOSMTLDL, pNOSMTLDS, y pCABMTLDL. Para el plásmido pD35SMTLDL, la digestión se produjo mediante Sst I y Xho I. Cada uno de estos casetes de expresión fue subclonado en las correspondientes dianas de restricción del vector binario Bin19 desactivado.
Transformación del tejido de la planta
La planta receptora usada para todos los experimentos de transformación descritos aquí fue el tabaco, Nicotiana tabacum cv SR1.
Para la realización de experimentos de transformación, los vectores de expresión Binl9 fueron cada uno de ellos introducidos de forma separada en cultivos de Agrobacterium tumefaciens no oncogénico (cepa LBA4404) a través de la técnica de apareamiento triparental descrita por Bevin, Nucleic Acids Research 12:8711-8721 (1984). La presencia de construcciones génicas en A. tumefaciens fue confirmada mediante análisis de Southern Blot. El A. tumefaciens no oncogénico fue entonces utilizado para realizar técnicas de transformación/regeneración en tabaco esencialmente como se describe en Horscht et al. Science 227 páginas 1229-1231 (1985).
Haciendo una breve recapitulación del procedimiento, los cultivos de A. tumefaciens fueron incubados durante tres días a 28ºC en placas MSO (medio MSO conteniendo un vial por litro de sales MS, 5 ml/l 200 x vitaminas-20,000 mg/ml mio-inositol, 100 mg/ml ácido nicotínico, 100 mg/ml piridoxina-HCL, 400 mg/ml tiamina-HCL y 400 mg/ml glicina-30 g/L sacarosa, pH 5,8 con KOH, 8 g/L agar). El cultivo de A. tumefaciens se transfiere a 7 mililitros de medio líquido MSO como se ha descrito más arriba, solamente sin agar. Después de la resuspensión bacteriana, fragmentos estériles de tejido foliar joven procedente de plantas de tabaco que fueron cortados en cuadrados de 0,2 a 0,5 centímetros y fueron incubados durante de 10 a 20 minutos en la suspensión bacteriana. Los tejidos foliares fueron entonces transferidos en las placas de agar MSO, y se permitió el co-cultivo con la bacteria durante 48 horas a temperatura ambiente. Siguiendo con el co-cultivo, el tejido foliar fue transferido a un medio inductor de brotes llamado MSS, el cual consiste en el medio MSO y agar más 0,5 mg/L 6-benzil aminopurina, 400 mg/L carbenicilina y 400 mg/L kanamicina, en el cual se permitió el crecimiento de los brotes durante cerca de cuatro semanas. Los brotes de tabaco resultantes fueron cortados del tejido de callo y transferidos a un medio indoctor de la producción de raíces, similar al MSS descrito más arriba excepto 2 g/l sacarosa, 8 g/l glucosa y 200 mg/l carbenicilina y 75 mg/l kanamicina. Se permitió a los brotes enraizar durante 4 semanas. Después del enraizamiento, las plántulas fueron retiradas de las cajas magenta estériles y depositadas en suelo. Las plantas pudieron ser entonces cambiadas a condiciones de invernadero, bajo las cuales se desarrollaron normalmente como plantas de tabaco adultas completamente fértiles por vía sexual. Las plantas transgénicas, tal y como se ha evidenciado a través de su contenido en manitol, fueron autopolinizadas para obtener progenie transgénica y confirmar la segregación mendeliana.
Características bioquímicas de las plantas transgénicas
La presencia y expresión de transgenes en plantas regeneradas (RO) y plantas de la progenie (R1) fue confirmada a través del análisis de presencia de manitol. Plantas no control, no transformadas pero sí regeneradas, evidencian niveles detectables de manitol. Aproximadamente, doscientas líneas de plantas transgénicas separadas conteniendo manitol han sido recuperadas. Los niveles de manitol medidos normalmente excedían 100 mM en las plantas transgénicas. Se detectó que los niveles normales de los azucares comunes, sacarosa, fructosa, y glucosa, se mantenían en las plantas que producían manitol.
Para realizar el análisis, segmentos de material foliar extraídos de plantas jóvenes cultivadas en condiciones
estériles y transformadas mediante las construcciones p35SMTLDL, p35SMTLDS y pRBCSMTLDS. Los segmentos de material foliar, de aproximadamente 3 centímetros de largo, fueron sometidos a extracción de carbohidratos solubles, que fueron posteriormente eluidos por cromatografía de intercambio aniónico de alta-resolución acoplada a detección amperométrica (HPAE-PAD), para analizar el contenido de carbohidratos de los tejidos, utilizando la técnica de Lee, Analyt. Biochem., 189, pp. 151-162-(1990).
Los resultados de la separación por HPAE-PAD de los extractos solubles de carbohidratos en las plantas se ilustra a través de tres separaciones cromatográficas ilustradas en la Figura 4. En la Figura 4, se muestran tres respresentaciones de resultados del análisis por HPAE-PAD de los materiales foliares. Los tres resultados cromatográficos se designan como 12, 14 y 16. La curva 12 ilustra el resultado de la separación mediante HPAE-PAD del extracto soluble de carbohidratos de hoja de planta control regenerada no transformada. En la curva 12, el numeral de referencia 18 se dispone donde la elución característica del manitol debería estar indicada, y el numeral de referencia 20 indica lo mismo para el azúcar simple sacarosa.
La representación del resultado de la separación HPAE-PAD indicado en 14 representa el perfil cromatográfico de un extracto procedente de hoja de una planta regenerada, no transformada, a la que se le había añadido manitol en una cantidad de 0,25 nanomoles, como control positivo. Indicado en 22 se encuentra el pico asociado con el tiempo de retención del manitol, e indicado en 24 se encuentra el pico para la sacarosa.
Ilustrada en la curva 16 se muestra la separación cromatográfica HPAE-PAD para una planta transgénica transformada con el vector de expresión en plantas p35SMTLDL. Indicado en 26, es el pico asociado con la elución característica del manitol, y en 28 está el pico de la sacarosa.
Se puede ver fácilmente en referencia a las curvas ilustradas en la Figura 4 que las plantas transgénicas exhiben un pico para producción de manitol que no se presenta en las muestras no transformadas. Por lo tanto, el carácter transgénico de la planta es claramente indicado por la presencia en las plantas de un producto catalítico de reacción, no presente en los tejidos nativos transformados de tabaco. Perfiles similares fueron encontrados con otras familias de plantas transgénicas. El contenido de manitol estuvo frecuentemente dentro del rango del contenido en sacarosa, y en ocasiones lo excedía.
Una observación anecdótica y sorprendente realizada durante la regeneración de las plantas transgénicas, transformadas con los vectores y los genes descritos aquí, es que las plantas transformadas aparecían generalemente más verdes y más vigorosas que las plantas control similares no transformadas, que habían sido simultáneamente regeneradas. Mientras que debería sospecharse que la producción de manitol provocaría un detrimento de la producción de otros carbohidratos necesarios para el vigor y el crecimiento, se observó de forma sorprendente que en general las plantas transgénicas parecen realmente superar el crecimiento y desarrollarse de forma más rápida y más vigorosa que plantas similares que se habían regenerado a partir de cultivos de tejidos que no habían sido transformados. La razón exacta para este aparente incremento en la tasa de crecimiento y vigor es oscura, pero claramente indica que la producción autóctona de manitol en las células de las plantas no es perjudicial para el crecimiento global de la planta y su salud y puede, de alguna manera todavía por determinar, realmente ser beneficioso para la salud y el vigor de las plantas transgénicas que generan este compuesto en el interior de sus células.
Otro sorprendente resultado producido por las plantas transgénicas en la presente invención es ilustrado por los resultados de la HPAE-PAD ilustrados en la Figura 5. Estos resultados están asociados con una planta transgénica la cual fue transformada con el vector pRBCSMTLDS. Debe ser recordado que, el promotor asociado con este vector de expresión pertenece a la subunidad pequeña de la rubisco, y ha sido previamente demostrado que es ligeramente activado. Por lo tanto, se esperaría que aquel análisis de varias partes del tejido de la planta transgénica la cual contiene este particular vector de expresión debería indicar producción de manitol solamente en las hojas o otros tejidos verdes de la planta. Se espera encontrar solamente cantidades traza de manitol en las porciones de la planta ubicadas en el subsuelo. De hecho, sorprendentemente, este no es el caso. Respecto a la separación cromatográfica por HPAE-PAD ilustrada en la Figura 5, el numeral de referencia 30 indica la característica del análisis de separación HPAE-PAD de los azucares solubles procedentes de material de las raíces de una planta transgénica transformada con este vector de expresión. En esta señal, la posición del pico para manitol se indica en 32, y el pico para sacarosa se indica en 34. Una segunda señal de resultado de HPAE- PAD se indica por el numeral 36, en el cual la posición del manitol se indica en 38, y para la sacarosa se indica en 40. Finalmente, en 42 se ilustra un cromatograma en el cual la localización del manitol se indica en 44, y la posición de la sacarosa se indica en 46.
La gráfica 42 representa, en la Figura 5, el experimento control. La señal fue recogida de material de raíces de una planta regenerada no transformada. Como era de esperar en este control negativo, no hubo indicación de presencia detectable de manitol en este tejido de raíces. La señal 36 representa el resultado obtenido de material foliar de una planta transgénica, la misma planta de la que se obtuvo el extracto de raíz de la señal 30. Como debe ser parecido por esta función, el manitol está presente a niveles significativos en los tejidos de las plantas transgénicas. En base al área bajo la curva que se ilustra en esta figura, se estimó que el manitol constituye el 8% del contenido total en azúcar del material foliar, y fue claramente varias veces inferior al contenido en sacarosa. Lo que es sorprendente es que la gráfica 30 que representa la separación de azucares solubles del material de raíces de la misma planta. En esta curva, aparecería que el manitol representa más del 35% de la cantidad total de azúcares detectables en el material de raíces, y parece ser al menos varias veces superior que la abundancia de sacarosa en el tejido.
Este resultado es inesperado y verdaderamente sorprendente. Dado que el manitol no es presente de forma nativa en los tejidos de la planta del tabaco, no es de esperar que exista un mecanismo de transporte existente en la planta capaz de transportar de una forma eficiente el manitol desde las hojas hasta las raíces. Pero de forma aparente, tal sistema existe, dado que el promotor que produce el incremento del manitol en la planta a través de los azúcares solubles que se encuentran separados en los cromatogramas de la Figura 5 fue transformada con un promotor ligeramente activado. En consecuencia, esto indicaría que el manitol está siendo producido en las hojas, y está siendo transportado a través de un mecanismo todavía no caracterizado desde las hojas hacia la planta para su almacenamiento en las raíces. Claramente la presencia de niveles tan significativos de un protector osmótico en la raíz proporciona el potencial de aliviar el estrés para la planta, a base de hacer a la planta menos sensible a las variaciones de los niveles de humedad en el suelo. Aunque este resultado no puede ser asegurado por medio de la investigación llevada a cabo hasta la fecha, claramente, ésta establece que efectos únicos y sorprendentes del contenido en azúcares solubles de los tejidos de la planta son creados a través del uso de esta tecnología, la cual presenta resultados que son sorprendentes y claramente útiles en la investigación para establecer en mayor detalle los mecanismos de transporte y almacenamiento de azúcares en la planta.
Los tejidos vegetales pueden en un futuro ser también transformados con vectores de expresión en plantas construidos para incluir un péptido de tránsito para el transporte en cloroplasto. Es de esperar que las plantas transgénicas recuperadas expresando tal vector acumularán preferentemente manitol en los cloroplastos. Las pruebas de campo revelarán que la magnitud de este acúmulo confiere una resistencia adicional al estrés hídrico bajo condiciones de campo.
Test de tolerancia de salinidad de las plantas transgénicas
Para testar si los efectos de la introducción del gen Mtl1D en plantas transgénicas realmente resulta en una tolerancia a las condiciones de estrés, un test controlado fue desarrollado comparando la tolerancia al estrés por sal de las plantas de tabaco tanto transgénicas como plantas control. Este test fue realizado utilizando tolerancia a la sal, con una concentración de sal igual a la mitad de la del agua marina.
El crecimiento de ambos tipos de planta de tabaco, control (no transformadas) y transgénicas expresando el gen Mtll, fue evaluado para tolerancia a la salinidad. Tanto las plantas control como las transformadas fueron cultivadas en cultivos hidropónicos en la misma habitación de cultivo. Después de cuatro semanas de cultivos hidropónicos, sin exposición a sal, grupos de los dos tipos de plantas, control y transgénicas, recibieron soluciones de nutrientes que fueron suplementadas con NaCl 250 mM. El resto de plantas recibieron solamente la solución de nutrientes. Todas las plantas fueron fotografiadas a intervalos de 3 a 4 días a lo largo de un mes. Después de un mes de cultivo bajo estas condiciones, a las plantas se les evaluó la altura, peso fresco, y contenido de manitol en la raíz y en las hojas. Los perímetros de crecimiento de un total de 3 transformantes independientes fueron comparados con los controles. Cada grupo experimental (de un total de 3) contenía al menos 4 réplicas de cada uno de los controles en los transformantes.
En ausencia de NaCl, tanto las plantas control como las transgénicas no mostraron diferencias significativas en altura, inicio de la floración, o peso fresco como porcentaje del peso inicial al comienzo del experimento. Sin embargo, para cada grupo experimental expuesto a sal en la solución de nutrientes, las plantas transgénicas productoras de manitol presentaron una masa significativamente superior al final del experimento. Las plantas típicamente transgénicas parecían visiblemente más robustas y menos cloróticas que las plantas control. En muchos casos, las plantas transgénicas productoras de manitol no solamente sobrevivieron al tratamiento con sal, sino que continuaron creciendo y finalmente florecieron. En virtualmente todos los casos, a las plantas control expuestas al tratamiento con sal les fue imposible sobrevivir. Dado que las plantas transgénicas portadoras del carácter de producción de manitol crecieron en la solución de sal, presentaron alturas significativamente superiores a las plantas control. Una comparación una a una entre las plantas con o sin sal indicó que tanto las plantas control como las plantas transgénicas que no habían sido expuestas a la solución de nutrientes con sal crecían más altas, florecían antes, y presentaban un tamaño general superior que las plantas que fueron expuestas a la solución de sal. Sin embargo, una comparación similar de las plantas expuestas a la solución con sal entre las plantas control y las plantas transgénicas reveló que las plantas transgénicas crecían significativamente más altas, florecían más, y presentaban un mayor tamaño general que las plantas control expuestas a la solución de sal.
Capacidad de elaborar otras construcciones
Más abajo se presenta la secuencia nucleotídica completa para el gen mtlD así como la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada. A los ingenieros genéticos de plantas con una habilidad práctica corriente les será posible utilizar esta secuencia para construir genes que expresen mtlD ya sea utilizando hibridación intentando recuperar el gen de E. coli, o construyendo secuencias codificantes utilizando oligonucleótidos. Sin embargo está hecho, una vez la secuencia codificante ha sido obtenida, es posible construir un vector de expresión en plantas adecuado como los que han sido descritos más arriba para transformación en plantas. Ya ha sido visto que tales vectores de expresión en plantas pueden ser construidos para su uso en una gran variedad de plantas de cultivo, diferentes a la especie modelo del tabaco que se ha descrito aquí, y que por tanto el manitol puede ser creado en tejidos de plantas que no producen de forma nativa este poliol.
Expuesta más abajo se encuentra la secuencia de nucleótidos así como la secuencia de aminoácidos para el gen mtlD y del correspondiente enzima M1PD. Aunque se cree que estas secuencias son completamente precisas, dado el nivel de desarrollo de las técnicas de análisis y procesamiento de secuencias pueden estar presentes errores ocasionales en los pares de bases. Tales errores no evitan la utilización de esta secuencia, sin excesiva experimentación, para aquellos con habilidad práctica corriente.
Ejemplo 2 Gen vegetal Imtl Identificación del gen
Este trabajo fue realizado para identificar los cambios inducidos por el ambiente en las características de expresión implicadas en la adaptación de la escarchada al estrés por salinidad. Esto fue realizado mediante la construcción y criba diferencial de una genoteca de ADNc enriquecida con secuencias inductoras de estrés. Primero, el ADNc fue generado a partir de ARN + poli-A que había sido aislado a partir de plantas crecidas en suelo de 7 semanas de edad, las cuales habían sido sometidas a estrés mediante 500 mM de NaCl durante 10 horas. A las 10 horas de exposición a sal, normalmente las escarchadas se empiezan a recuperar normalmente del estado marchito transitorio inducido por el estrés, y empiezan a acumular los ARNm asociados con alteraciones de las características metabólicas esenciales de la planta. Tres ciclos de criba diferencial de aproximadamente 10^{5} placas con la primera cadena marcada de ADNc obtenidos a partir de plantas estresadas y no estresadas dando lugar a 8 insertos los cuales fueron consistentemente más abundantes en los tejidos de las plantas estresadas. Experimentos de hibridación cruzada indicaron que los insertos representaban 3 clones distintos. Uno de estos clones, un inserto de 1,6 kilobases al que nos referimos como Imtl, fue escogido para experimentos posteriores.
Expresión del ARN_{m} de Imtl
La expresión del tránscrito Imtl fue analizada en Northern blots de ARN procedentes de tejidos de raíces y hojas de plantas escarchadas cultivadas hidropónicamente. El ARN total fue aislado de plantas no sometidas a estrés y también de plantas cultivadas a varios tiempos dentro de un intervalo de 6 días en los que las plantas fueron sometidas a estrés mediante 400 mM de NaCl. La sonda de ADNc Imtl se hibridó a un ARNm inducido por salinidad de aproximadamente 1,6 kD tanto en ARN procedente de hojas como en ARN procedente de raíces. El patrón de inducción fue diferente en los tejidos radiculares y los tejidos foliares. En los tejidos foliares no sometidos a estrés, el transcrito Imtl estuvo presente a muy bajos niveles. El transcrito se fue acumulando de forma gradual en las hojas estresadas, siendo detectable al cabo de 6 horas de estrés pero no fue detectable hasta el segundo día, después de aproximadamente 30 horas de estrés. La acumulación del transcrito en las hojas alcanzó un máximo al sexto día de estrés por tratamiento salino. En contraposición, el transcrito Imtl fue de forma transitoria sobreproducido en los tejidos de raíces, elevándose desde niveles no detectables a un máximo nivel de expresión durante el segundo día de estrés.
De forma interesante, el ARN_{m} desapareció completamente de las raíces en el momento de máxima expresión en las hojas. Diluciones de las manchas de ARN de las hojas y de las raíces indicaron que, en los momentos de máxima expresión relativa, el tránscrito fue 25 veces más abundante en las hojas que en las raíces.
Análisis genómico
El transcrito Imtl inducido en hojas y raíces está codificado por un gen nuclear único o, posiblemente, una pequeña familia de genes interrelacionados. ADN genómico nuclear procedente de escarchada fue digerido mediante varios enzimas de restricción y separados mediante un gel de agarosa al 1% y posteriormente sometidos a Southern blot con un número de copias genómicas equivalente al ADN_{c}de la ID. DE SEC. NO.: 3 posterior. Para los Southern blots fueron utilizados como sonda fragmentos de ADN_{c}marcados con P^{32} y las intensidades de la señal fueron cuantificadas mediante un escáner Beta (Betagen, Inc.). Las sondas fueron específicas tanto para la región codificante 5' como para la región 3' terminal no codificante del ADNc. Las sondas se hibridaron con bandas simples de la misma intensidad en cada carril. Las condiciones de lavado de alta astringencia fueron idénticas a las que se utilizaron en los Northern blots. La comparación de las intensidades de las bandas con su número de copias reconstituyentes sugiere que las bandas probablemente representaban a un solo gen.
Análisis de secuencia
Para tener un mayor conocimiento de la función bioquímica y fisiológica de la proteína Imtl, se determinó la secuencia del ADNc. Esta secuencia es presentada como ID. DE SEC. NO.: 3 posterior. La secuencia presenta una longitud de 1524 pares de bases. La secuencia presenta un leader rico en residuos A y T, y un codón de inicio ATG, seguido de una pauta de lectura ininterrumpida de 1095 nucleótidos. El extremo 3' de la región no codificante de 383 nucleótidos incluye dos posibles secuencias de reconocimiento de adenilación corriente arriba de los 31 pares de bases de la cola poli-A.
En la ID. DE SEC. NO.: 4 mostrada más abajo se encuentra la secuencia proteica pronosticada en función de la secuencia nuclear de Imtl. Este polipéptido pronosticado de 365 aminoácidos debe de ser hidrofílico, con una masa molecular de 40 kD.
Expresión de Imtl y E. coli
Para verificar la actividad enzimática de la proteína codificada por el gen Imtl, la región codificante del gen Imtl de ID. DE SEC. NO.: 3 mostrada más abajo se incorporó en un vector de expresión para la expresión en el huésped bacteriano E. coli. El marco de lectura abierto completo de Imtl fue clonado en un vector Bluescript KS+ como una fusión transcripcional en ambas orientaciones detrás de los promotores de la polimerasa T7. Las construcciones se transformaron en células de E. coli cepa BL21 (DE3), las cuales contenían el gen que codifica para la polimerasa T7 bajo el control de un promotor inducible por isopropil-beta-tiogalactósido (IPTG). Una secuencia AAGAG localizada al azar dentro del leader 5' del ADN_{c} fue pronosticada para actuar como sitio de unión a ribosomas en E. coli. El IPTG fue añadido a cultivos a una concentración final de 0,5 mM, 4 horas antes del cultivo. La expresión proteica fue analizada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en geles de acrilamida al 10%. Las muestras fueron preparadas hirviendo durante 2 minutos las alícuotas de cultivos de E. coli transformadas en un volumen igual de tampón de extracción SDS.
La proteína soluble procedente de E. coli transformadas con el constructo de expresión Imtl o con los vectores Bluescript KS+ nativos fueron extraídas de 20-200 ml de cultivos centrifugados a 2500 g durante 10 minutos, y resuspendida en tampón de extracción metil transferasa (MTEB), utilizando 1 ml de tampón MTEB por cada 20 ml de cultivo de E. coli. El tampón MTEB incluye 100 mM de Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA, y beta-mercaptoetanol, a 1 ml por 20 ml de cultivo. Las células fueron sometidas a lisis por sonicación, y los extractos fueron separados por centrifugación a 10000 g durante 20 minutos. La concentración de proteína total fue determinada. Los sobrenadantes fueron utilizados inmediatamente para los ensayos o guardados a -70ºC con glicerol al 5%.
Con la proteína soluble extraída de esta manera, fueron llevados a cabo ensayos de metil transferasa. Alícuotas de 200 microlitros de volumen conteniendo 1 mg de proteína total soluble fueron disueltas en 50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM MgCl_{2}, y 1,0 mM mio-inositol. Estos ensayos fueron preincubados a 30ºC durante 5 minutos, y iniciados por la adición de S-adenosil-l-metionina (SAM) a una concentración final de 0,5 mM. La solución madre de SAM contenía SAM (Sigma) sin marcar y SAM marcado con ^{14}C (ICN Biochemicals) en una relación de 50:1. Los ensayos fueron llevados a cabo a 30ºC durante 30-120 minutos y finalizados mediante la transferencia a hielo y extracción mediante cloroformo. La fase acuosa fue sometida a un procesamiento posterior en un análisis de HPLC.
Para el análisis por HPLC, las muestras fueron preparadas por extracción dos veces con volúmenes de metanol/cloroformo/agua (12:5:3) seguida de la adición de 0,4 ml de agua. Una columna de destilación de HG50WX4 (BioRad) en Amberlite IRA-68(Sigma) en forma-OH fue utilizada para desalar los extractos y eliminar las especies con carga. Las muestras fueron secadas, disueltas en agua desionizada, y filtradas a través de un Acrodisc 13 (Gelman) de nylon. Cantidades iguales de carbohidratos disueltos procedentes de cada ensayo fueron disueltas en una columna de intercambio de ligando de formas de calcio 300 x 7,8 mM HPX 87 C (BioRad) a 85ºC con un flujo de 0,6 ml por minuto utilizando agua desionizada y desgasificada como eluyente. Fue añadido NaOH 0,3 mM a 0,6 ml por minuto posteriormente al paso por la columna, y se obtuvieron gráficas utilizando un detector de pulso amperométrico a 35ºC y un integrador Spectrophysic SP4290. Las fracciones fueron recogidas a intervalos de 7,5 segundos o 0,5 minutos y el centelleo fue contado.
Los resultados del análisis por HPLC indicaron que el gen Imtl codifica por una mio-inositol O-metil transferasa dependiente de SAM. El producto marcado con carbono radioactivo de los ensayos de los extractos de E. coli fue visible en las gráficas de la HPLC como un pico distinto con un tiempo de retención ligeramente por debajo de 11,1 minutos. Este mismo pico no estuvo presente en los ensayos realizados con extractos control. Para establecer que el mio-inositol metilado generado por la proteína Imtl era ononitol, el intermediario metilado en la biosíntesis del pinitol, su tiempo de retención fue comparado con el tiempo de retención de estándares de metil-mio-inositol.
Existen 4 isómeros del mono-metil-mio-inositol: secuoyitol, ononitol, y D-L-bornesitol. Solamente el ononitol y el sequoyitol son posibles precursores del pinitol, y solamente el ononitol ha sido documentado como el precursor del pinitol en las angiospermas. Extractos procedentes de E. coli control fueron analizados en paralelo con tales estándares mediante HPLC. Los tiempos de retención del secuoyitol y el bornesitol fueron 11,5 y 12,2 minutos, respectivamente. Sin embargo, el ononitol mostró un tiempo de retención idéntico al del producto de reacción procedente de las E. coli transformadas.
Estos resultados demuestran que el gen aislado Imtl y la secuencia la cual es presentada más abajo, es responsable de la producción inducida de un acumulo de polioles como parte de la respuesta a estrés en la planta escarchada. Dado que la secuencia codificante completa de la región codificante de proteína de este gen es presentada más abajo, la incorporación de este gen en vectores de clonación y la inserción en plantas transgénicas es ahora posible. Dado que el sustrato sobre el que actúa el enzima, el mio-inositol, es ubicuo en los tejidos de las plantas, otro mecanismo ha sido presentado aquí el cual es capaz de transferir en otras especies de plantas para inducir el acúmulo de polioles no nativos en estas especies de plantas.
Debe de ser también entendido que la presente invención no debe estar limitada a las realizaciones particulares descritas aquí, sino que abarca modificaciones y variaciones bajo el enfoque de las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Tarczynski, Mitchell C.
\hskip4cm
Jensen, Richard G. 
\hskip4cm
Bohnert, Hans J. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Plantas Transgénicas Con Manitol Potenciado
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORREOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Quarles & Brady
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: PO Box 2113, First Wisconsin Plaza
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Madison
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: WI
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 53701-2113
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE DE DISCO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
COMPUTADORA: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, versión #1,25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA ACTUAL DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE INGRESO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Seay, Nicholas J.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 27386
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMEROS DE REFERENCIA/ETIQUETA 9221490026
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (608)251-500Q
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (608) 251-9166
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1153 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPOS DE MOLÉCULA DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5..1153
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /codón de inicio= 5
\hskip6,6cm
/producto= "manitol-1 deshidrogenasa" 
\hskip6,5cm
/evidencia= EXPERIMENTAL 
\hskip6,5cm
/gen= "mt1D" 
\hskip6,5cm
/número= 1 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:1
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 382 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1525 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mesembryanthemum crystallinum 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Imtl
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 47..1141
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:3
5
6
7 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 365 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº:4
8
9

Claims (22)

1. Una planta transgénica que comprenda en sus células un gen foráneo como un rasgo genético heredable que condicione para la expresión de un enzima que catalice la producción de un poliol en los tejidos de la planta a partir de sustancias que se encuentren nativamente en la planta, en donde el poliol no es producido nativamente en los tejidos de la planta y el poliol se acumula en la planta sin que se produzca un impacto adverso para ella.
2. Una planta transgénica tal como se reivindica en la reivindicación 1 en donde el poliol es ribitol, eritritol, xilitol, arabitol, sorbitol, inositol, metil-inositol, dulcitol, galactitol, heptitol o manitol.
3. Una planta transgénica tal como se reivindica en la reivindicación 1 ó 2 en donde el enzima es de origen bacteriano.
4. Una planta transgénica que comprende en sus células un gen foráneo como un rasgo genético heredable que condiciona para la expresión de un enzima que cataliza la producción de manitol en los tejidos de la planta a partir de una sustancia presente de forma nativa en la planta.
5. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 4 de una especie que no produzca de forma nativa manitol en sus células en cantidades por encima de 5 mM, la planta transgénica que contenga en sus células manitol por encima de 100 mM.
6. Una planta transgénica de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5 en donde el gen foráneo se encuentra bajo la forma de una construcción genética que incluya una región codificante de proteína y secuencias reguladoras flanqueantes que sean efectivas para la expresión de la proteína codificada por la región codificante en las células de la planta.
7. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 6 donde el enzima cataliza la producción de manitol-1-P a partir de la fructosa-1-P.
8. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 7 en donde el enzima es una manitol-1-P deshidrogenasa como la manitol-1-P-deshidrogenasa bacteriana.
9. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8 en donde el enzima se encuentra de forma nativa en E. coli.
10. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 9 en donde el enzima es una proteína que tenga la secuencia ID. DE SEC. NO.: 2.
11. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 10 donde el enzima es m1PD.
12. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 11 en donde la planta es una planta dicotiledónea.
13. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 en donde la planta es tabaco.
14. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13 en donde el gen foráneo se encuentra hospedado en el genoma nuclear o en el genoma cloroplástico de la planta.
15. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14 la cual tiene una tolerancia incrementada al estrés por salinidad.
16. Una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15 en donde el gen foráneo fue introducido en un progenitor de la planta a través de transformación de la planta mediante Agrobacterium y traspaso a la planta por herencia mendeliana.
17. La semilla de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, en donde la semilla contiene el gen foráneo que condiciona la expresión del enzima que cataliza la producción del poliol que no se produce de forma nativa en los tejidos de la planta.
18. Un método para alterar los alcohol azúcares constituyentes de especies de plantas de cultivo que comprenda la introducción en el genoma de la planta de cultivo, mediante ingeniaría genética, de un gen que exprese un enzima que catalice la producción en las células de la planta de un azúcar alcohol que no sea producido de forma nativa en esa especie de plantas a partir de un azúcar el cual sí es producido de forma nativa en las plantas de esa especie.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18 donde la ingeniería genética es realizada utilizando un procedimiento de transformación con Agrobacterium.
20. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19 donde el enzima es de origen bacteriano.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, 19 ó 20 donde el alcohol azúcar es manitol.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21 donde el enzima es un enzima bacteriano el cual cataliza de forma reversible la deshidrogenación del manitol.
ES92913309T 1991-05-09 1992-05-08 Plantas transgenicas con el contenido en polioles alterado. Expired - Lifetime ES2225817T3 (es)

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