MX2011002110A - Plantas transgenicas con caracteristicas mejoradas de crecimiento. - Google Patents

Abstract

Se describen plantas transgénicas que exhiben índices dramáticamente aumentados de crecimiento, semillas mayores y rendimientos de fruto/vainas mayores, con florecimiento más temprano y más productivo, utilización del nitrógeno más eficiente, tolerancia aumentada a altas condiciones de sal, y rendimientos de la biomasa aumentados. Se proporcionan plantas transgénicas diseñadas para sobre-expresar tanto la transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT), como la sintetasa de glutamina (GS). Las plantas transgénicas dobles GPT+GS exhiben consistentemente, características aumentadas de crecimiento, con líneas de generación T0 que muestran un aumento en la biomasa sobre sus contrapartes de tipo natural de entre 50% y 300%. Las generaciones que son el resultado de cruces sexuales y/o la venta generalmente funcionan mejor, con algunas de las plantas transgénicas dobles logrando un aumento sorprendente de la biomasa de cuatro veces sobre las plantas de tipo natural.

Description

PLANTAS TRANSGÉ NICAS CON CARACTERÍSTICAS MEJORADAS DE CRECIMIENTO Declaración con Respecto a los Derechos a las Invenciones Hechas Bajo la Investigación o Desarrollo Patrocinados Federalmente La presente invención se hizo con el apoyo gubernamental bajo el Contrato No. W-7405-ENG-36, otorgado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos de América a los Regentes de la Universidad de California, y el contrato No. DE-AC52-06NA25396, otorgado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos de América a Los Alamos National Security, LLC. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad sobre la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana No. 61/190,520 presentada en Agosto 29, 2008.

Antecedentes de la Invención Conforme aumenta la población humana a nivel mundial, y las siembras disponibles continúan siendo destruidas o comprometidas de otra manera, la necesidad de sistemas agrícolas más efectivos y sustentables es de un interés supremo para los seres humanos. La mejora de rendimientos de las cosechas, el contenido de proteínas, y los índices de crecimiento de las plantas representan objetivos mayores en el desarrollo de los sistemas agrícolas que pueden responder de una manera más efectiva a los retos presentados.

En años recientes, la importancia de las tecnologías de producción de cosechas mejoradas solamente ha aumentado conforme los rendimientos han tendido a llegar a la cima para muchas de las cosechas bien desarrolladas. Muchas actividades agrícolas son sensibles al tiempo, siendo dependientes los costos y rendimientos de la rotación rápida de las cosechas o del tiempo para el mercado. Por lo tanto, el crecimiento rápido de las plantas es una meta importante económicamente para muchos negocios agrícolas que comprenden cosechas de alto valor tales como granos, vegetales, bayas y otros frutos.

La ingeniería genética ha y continúa jugando todavía un rol crecientemente importante el cual todavía es controversial en el desarrollo de las tecnologías agrícolas sustentables. Un número grande de plantas modificadas genéticamente y las tecnologías relacionadas han sido desarrolladas en los años recientes, y muchas de las cuales tienen un uso difundido en la actualidad (Registro de Hechos: Cosechas Modificadas Genéticamente en los Estados Unidos de América, Iniciativa de Pew sobre Alimentos y Biotecnología, Agosto 2004, (pewagbtotech.org/recursos/reportes de hechos). La adopción de las variedades de plantas transgénicas ahora es muy substancial y se encuentra a la alza, con aproximadamente 250 millones de acres plantados con plantas transgénicas en el año 2006.

Aunque la aceptación de las tecnologías de plantas transgénicas puede estar creciendo gradualmente, particularmente en los Estados Unidos de América, Canadá y Australia, muchas regiones del Mundo todavía están lentas para adoptar las plantas modificadas genéticamente en la agricultura, notablemente Europa. Por lo tanto, de acuerdo con la persecución de objetivos de agricultura responsable y sustentable, existe un interés fuerte en el desarrollo de plantas diseñadas genéticamente que no introduzcan toxinas u otras substancias potencialmente problemáticas en las plantas y/o el medio ambiente. También existe un interés fuerte en minimizar los costos para lograr los objetivos tales como la mejora de la tolerancia a los herbicidas, resistencia a los animales dañinos y las enfermedades, y rendimientos generales de las cosechas. Por consiguiente, existe una necesidad de plantas transgénicas que puedan cumplir con estos objetivos.

La meta del crecimiento rápido de las plantas ha sido perseguida a través de numerosos estudios de diferentes sistemas regulatorios de plantas, muchos de los cuales permanecen sin entenderse completamente. En particular, los mecanismos regulatorios de la planta que coordinan el metabolismo del carbono y nitrógeno no se ha aclarado completamente. Estos mecanismos regulatorios se presume que tienen un impacto fundamental en el crecimiento y desarrollo de la planta.

El metabolismo de los organismos del carbono y el nitrógeno en organismos fotosintéticos debe ser regulado de una manera coordinada para asegurar el uso eficiente de los recursos de las plantas y la energía. El entendimiento actual del metabolismo del carbono y nitrógeno incluye detalles de ciertos pasos y trayectorias metabólicas los cuales son subsistemas de sistemas más grandes. En los organismos fotosintéticos, el metabolismo del carbono comienza con la fijación del CO2, el cual procede por medio de dos procesos principales, denominados el metabolismo C-3 y C-4. En las plantas con metabolismo C-3, la carboxilasa de bisfosfato de enzima de ribulosa (RuBisCo) cataliza la combinación de C02 con el bisfosfato de ribulosa para producir el 3-fosfoglicerato, un compuesto de tres carbonos (C-3) que utiliza la planta para sintetizar los compuestos que contienen carbono. En las plantas con metabolismo C-4, el C02 es combinado con piruvato de fosfoenol para formar ácidos que contienen cuatro carbonos (C-4), en una reacción catalizada por la carboxilasa de piruvato de fosfoenol de enzima. Los ácidos son transferidos para atar las células del forro, en donde son descarboxilatadas para liberar el C02, las cuales entonces son combinadas con el bisfosfato de ribulosa en la misma reacción empleada por las plantas C-3.

Muchos estudios han descubierto que varios metabolitos son importantes en la regulación del metabolismo del nitrógeno de la planta. Estos compuestos incluyen, el malato de ácido orgánico y el glutamato y glutamina de aminoácidos. El nitrógeno es asimilado por los organismos fotosintéticos por medio de la acción de la sintetasa de glutamina en la enzima (GS) la cual cataliza la combinación de amoníaco con glutamato para formar la glutamina. La GS juega un rol clave en la asimilación del nitrógeno en las plantas catalizando la adición del amoníaco a glutamato para formar glutamina en una reacción dependiente del ATP (Miflin y Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53, No. 370, páginas 979 a 987). La GS también vuelve a asimilar el amoníaco liberado como resultado de la fosfo-respiración y la descomposición de proteínas y los compuestos de transporte de nitrógeno. Las enzimas GS pueden ser divididas en dos clases generales, una que representa la forma citoplásmica (GS1) y la otra que representa la forma plastídica (por ejemplo, cloroplástica) (GS2).

El trabajo anterior ha demostrado que los niveles aumentados de expresión de GS1 dan como resultado niveles aumentados de actividad de la GS y crecimiento de la planta, aunque los reportes son inconsistentes. Por ejemplo, Fuentes y asociados, reportaron que el promotor S35 de CaMV operado con la sobre-expresión del GS1 de Alfalfa (forma citoplásmica) en el tabaco dio como resultado niveles aumentados en la expresión de GS y actividad de GS en el tejido de la hoja, un crecimiento aumentado bajo la inanición de nitrógeno, pero sin efecto en el crecimiento bajo las condiciones óptimas de fertilización del nitrógeno (Fuentes y asociados, 2001, J. Exp. Botany 52: páginas 1071 a 1081). Temple y asociados, reportaron que las plantas transgénicas de tabaco que sobre-expresan la secuencia de codificación GS1 de Alfalfa de longitud completa contenían niveles elevados grandemente del transcrito GS, y el polipéptido GS el cual se ensamblaba en la enzima activa, pero no reportaba efectos fenotípicos en el crecimiento (Temple y asociados, 1993, Molecular and General Genetics 236: páginas 315 a 325). Corruzi y asociados, han reportado que el tabaco transgénico que sobre-expresa un transgén de chícharo citosólico GS1 bajo el control del promotor S35 de CaMV muestra una actividad aumentada de GS, una proteína citosólica GS aumentada, y características del crecimiento mejorado (Patente Norteamericana No. 6,107,547). Unkefer y asociados, han reportado más recientemente que las plantas transgénicas de tabaco que sobre-expresan el GS1 de Alfalfa en los tejidos del follaje, los cuales habían sido seleccionados por la actividad GS de hoja a raíz aumentada siguiendo la segregación genética, auto-fertilizándose para lograr un número de copias del transgén GS1 aumentado, se encontró que producían niveles aumentados de 2-hidroxi-5-oxoprolina en sus porciones del follaje, el cual se encontró que conducía a índices de crecimiento aumentados marcadamente sobre las plantas de tabaco de tipo natural (ver, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,555,500; 6,593,275; y 6,831,040).

Unkefer y asociados, han descrito además el uso de la 2-hidroxi-5-oxoprolina (también conocida como 2-oxoglutaramato) para mejorar el crecimiento de la planta (Patentes Norteamericanas Nos. 6,555,500; 6,593,275; 6,831,040). En particular, Unkefer y asociados, describen que las concentraciones aumentadas de 2-hidroxi-5-oxoprolina en los tejidos del follaje (relativos con los tejidos de la raíz) detona una cascada de eventos que resultan en características aumentadas del crecimiento de la planta. Unkefer y asociados, describen métodos por medio de los cuales la concentración en el follaje de 2-hidroxi-5-oxoprolina puede ser aumentada con el objeto de detonar características aumentadas del crecimiento de la planta, específicamente, aplicando una solución de 2-hidroxi-5-oxoprolina directamente a las porciones del follaje de la planta y sobre-expresando preferentemente la sintetasa de glutamina en los tejidos de las hojas.

Un número de enzimas de transaminasa e hidroliasa se sabe que están involucradas en la síntesis de la 2-hidroxi-5-oxoprolina en animales han sido identificados en los tejidos del hígado y el riñon de los animales (Cooper y Meister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, páginas 281 a 303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: página 304). En las plantas, la síntesis bioquímica de la 2-hidroxi-5-oxoprolina ha sido conocida pero ha sido caracterizada de manera deficiente. Además, es desconocida la función de la 2-hidroxi-5-oxoprolina en las plantas y el significado de su tamaño del conjunto (concentración de tejidos). Finalmente, la técnica no proporciona una guía específica con respecto a precisamente lo que las transaminasas o hidroliasas pueden existir y/o ser activas para catalizar la síntesis de la 2-hidroxi-5-oxoprolina en las plantas, y ninguna de dichas transaminasas de las plantas ha sido reportada, aislada o caracterizada.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a plantas transgénicas que exhiben índices de crecimiento aumentados dramáticamente, mayores rendimientos de semillas y brotes de flores, florecimiento más temprano y más productivo, la utilización más eficiente del nitrógeno, la tolerancia aumentada a las condiciones de alta sal, y rendimientos de la biomasa aumentados. En una modalidad, se proporcionan las plantas transgénicas diseñadas para sobre-expresar tanto la transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT) como la sintetasa de glutamina (GS). Las plantas dobles transgénicas GPT + GS de la invención exhiben consistentemente características aumentadas de crecimiento, con líneas de generación T0 que muestran un aumento en la biomasa sobre las contrapartes de tipo natural de entre el 50% y el 300%. Las generaciones que resultan de los cruces sexuales y/o auto-fertilizado típicamente funcionan todavía mejor, con algunas de las plantas transgénicas dobles logrando un aumento asombroso de la biomasa de cuatro veces sobre las plantas de tipo natural. De un modo similar, las flores y los frutos o los rendimientos de los brotes también son tremendamente mejorados con las líneas de generación TO que muestran generalmente del 50% al 70% de aumento sobre sus contrapartes de tipo natural, y en algunos casos muestran un aumento del 100%. Las plantas transgénicas que exhiben dichas características fenotípicas de crecimiento mejorado han sido generadas de manera exitosa en un espectro de especies de plantas individuales, utilizando varias metodologías de transformación, diferentes vectores de expresión y promotores, y secuencias del transgén heterólogas y homologas de una variedad de especies, como lo ejemplifican los numerosos ejemplos de trabajo aquí proporcionados. Por lo tanto, la presente invención proporciona una tecnología de resultados fundamentales que tiene el potencial de transformar virtualmente todas las áreas de la agricultura.

Los solicitantes han identificado la enzima de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT) como un catalizador de la síntesis de 2-hidroxi-5-oxoprolina (2-oxoglutaramato) en las plantas. El 2-oxoglutaramato es un metabolito de señal poderoso el cual regula la función de un número grande de genes involucrados en el aparato de la fotosíntesis, la fijación del carbono y el metabolismo del nitrógeno. La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican el GPT, y describe el descubrimiento novedoso de que la enzima codificada está directamente involucrada en la síntesis de la 2-hidroxi-5-oxoprolina. Este aspecto de la presente invención se ejemplifica aquí por la descripción de los polinucleótidos GPT que codifican los GPTs de varias especies, incluyendo la Arabidopsis, Uva, Arroz, Frijol de Soya, Cebada, Bambú y un homólogo del Pez Cebra que no es de planta, la mayor parte de las cuales han sido expresadas como GPTs recombinantes y confirmado como que tiene actividad de GPT.

La presente invención proporciona además plantas transgénicas las cuales expresan tanto un transgén GPT como un transgén GS. La expresión de estos dos transgenes en dichas plantas de "transgenes dobles" da como resultado una cantidad substancialmente aumentada de la fijación de dióxido de carbono y un efecto extremadamente potente de aumento del crecimiento, ya que estas plantas exhiben rendimientos e índices de crecimiento tremendamente aumentados algunas veces y de manera significativa de las flores/frutos/brotes/semillas. Se proporcionan los métodos para la generación de dichas plantas transgénicas con crecimiento mejorado.

Aumentando preferencialmente la concentración del metabolito de señal del 2-oxoglutaramato (por ejemplo, en los tejidos del follaje), las plantas transgénicas de la presente invención tienen la capacidad de producir rendimientos generales más altos en períodos de tiempo más cortos, y por lo tanto pueden proporcionar a las industrias agrícolas una productividad mejorada en un amplio rango de cosechas. Lo que es más importante, a diferencia de muchas plantas transgénicas descritas hasta la fecha, la presente invención utiliza los genes naturales de la planta que codifican una enzima de la planta natural. Las características mejoradas de crecimiento de las plantas transgénicas de la presente invención son logradas esencialmente introduciendo la capacidad GPT y GS adicional en la planta. Por lo tanto, las plantas transgénicas de la presente invención no expresan substancias tóxicas algunas, hormonas de crecimiento, productos de genes virales o bacteriales, y por lo tanto están libres de muchas de las preocupaciones que hasta la fecha han impedido la adopción de las plantas transgénicas en ciertas partes del Mundo.

En una modalidad, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende un transgén GPT y un transgén GS, en donde dicho transgén GPT y dicho transgén GS son enlazados de manera operativa al promotor de la planta. En una modalidad específica, el transgén GS es un transgén GS1. En otra modalidad específica, el transgén GPT codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de (a) SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, y (b) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 y tiene actividad GPT. Todavía en otra modalidad específica, el transgén GS codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente del residuo 11 de (a) la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 7, y (b) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, los transgenes GPT y GS están incorporados en el genoma de la planta. La planta transgénica de la presente invención puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea.

La presente invención también proporciona la descendencia de cualquier generación de las plantas transgénicas de la invención, en donde dicha descendencia comprende un transgén GPT y un transgén GS, así como una semilla de cualquier generación de las plantas transgénicas de la invención, en donde dicha semilla comprende dicho transgén GPT y dicho transgén GS. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden mostrar una o más características del crecimiento mejorado cuando son comparadas con plantas análogas de tipo natural o sin transformar, incluyendo sin limitación, un índice de crecimiento aumentado, rendimiento de la biomasa, rendimiento de la semilla, rendimiento de la flor o brotes de la flor, rendimientos de los frutos o vainas, hojas más grandes, y también pueden mostrar niveles aumentados de actividad GPT y/o GS, y/o niveles aumentados del 2-oxoglutaramato. En algunas modalidades, las plantas transgénicas de la presente invención muestran un uso de eficiencia aumentada del nitrógeno o una tolerancia aumentada a la sal o condiciones salinas.

Los métodos para producir las plantas transgénicas de la presente invención y las semillas de las mismas también se proporcionan, incluyendo métodos para producir una planta que tiene propiedades de crecimiento mejoradas, una eficiencia de uso aumentada del nitrógeno y tolerancia aumentada a la germinación o crecimiento en condiciones de sal o salinas, en relación con las plantas no transformadas o de tipo natural análogas.

Breve Descripción de los Dibujos La patente o el archivo de la solicitud contienen por lo menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con el dibujo a color serán proporcionadas por la Oficina a solicitud y mediante el pago de los gastos necesarios.

Figura 1. Asimilación de nitrógeno y la biosíntesis de 2-oxoglutaramato: esquemática de la trayectoria metabólica.

Figura 2. Fotografía que muestra la comparación de las plantas de tabaco transgénicas que sobre-expresan ya sea el GS1 o GPT, comparadas con la planta de tabaco de tipo natural. De izquierda a derecha, planta de tipo natural, transgén GS1 de Alfalfa, transgén GPT de Arabidopsis. Ver los Ejemplos 3 y 5, mencionados en este documento.

Figura 3. Fotografía que muestra la comparación de las plantas de tomate Micro-Tom transgénicas que sobre-expresan ya sea el GS1 o GPT, comparada con la planta de tomate de tipo natural. De izquierda a derecha: planta de tipo natural, transgén GS1 de Alfalfa, transgén GPT de Arabidopsis. Ver los Ejemplos 4 y 6, que se mencionan a continuación.

Figura 4. Fotografías que muestran comparaciones de los tamaños de las hojas entre las plantas de tabaco transgénicas GS1 o GPT de tipo natural. A: Comparación entre las hojas del tabaco transgénico GS1 (hoja del fondo) y las de tipo natural (hoja superior). B: Comparación entre las hojas del tabaco transgénico de GPT (hoja del fondo) y la de tipo natural (hoja superior).

Figura 5. Fotografías que muestran comparaciones de las plantas de tabaco transgénicas generadas de diferentes cruces entre las líneas de tabaco transgénicas GS1 y GPT con plantas de tipo natural y de un solo gen. De la A a la C: Los cruces 2, 3 y 7, respectivamente. Ver Ejemplo 7.

Figura 6. Fotografías que muestran comparaciones de los tamaños de las hojas entre las plantas de tabaco de tipo natural y los cruces entre los genes GS1 y GPT de tabaco transgénico. A: Comparación entre las hojas del Cruce 3 GSXGPT (hoja del fondo) y la de tipo natural (hoja superior). B: Comparación entre las hojas del Cruce 7 GSXGPT (hoja del fondo) y la de tipo natural (hoja superior). Ver Ejemplo 7.

Figura 7. Fotografía de la planta del pimentero transgénico (derecha) y la planta del pimentero de control de tipo natural (izquierda), que muestra el rendimiento de frutos de pimientos más grandes en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. Ver Ejemplo 8.

Figura 8. Plantas de frijoles transgénicas comparadas con las plantas de frijoles de control de tipo natural (varias líneas transgénicas que expresan los transgenes GPT y GS de Arabidopsis). Izquierda superior: altura de la planta en varios días; Derecha superior: número de brotes de flores; Izquierda inferior: número de flores; Derecha inferior: número de brotes de frijoles. Las plantas de tipo natural son el control, y las líneas 2A, 4A y 5B son todas líneas de plantas transgénicas. Ver Ejemplo 9.

Figura 9. Fotografía de la planta de frijol transgénica (derecha) y la planta de frijol de control de tipo natural (izquierda), muestra el crecimiento aumentado de la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. La línea transgénica que expresa los transgenes GPT y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 9.

Figura 10. Brotes de las plantas de frijol transgénicas, flores y vainas comparadas con las plantas de frijol de control de tipo natural (las líneas transgénicas expresan los transgenes GPT de uva y GS de Arabidopsis). Ver Ejemplo 10.

Figura 11. Fotografía de una planta de frijol transgénico (derecha) y la planta de frijol de control de tipo natural (izquierda), que muestra el crecimiento aumentado en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. Las líneas transgénicas que expresan los transgenes GPT de Uva y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 10.

Figura 12. Plantas de guisante pinto (cowpea) de la Línea A comparadas con las plantas de guisante pinto (cowpea) de control de tipo natural (la línea transgénica que expresa los transgenes GPT de Arabidopsis y GS), mostrando que las plantas transgénicas crecen más rápido y sacan vainas más rápido que las plantas de control de tipo natural. (A) Altura relativa y las mediciones de hojas más largas al 21 de Mayo, (B) Hojas de trifolato en relación con los brotes de las flores a Junio 18, (C) Números relativos de flores, brotes de las flores y vainas de guisante pinto (cowpea) al 22 de Junio. Ver Ejemplo 11.

Figura 13. Fotografía de la planta de la Línea A de guisante pinto (cowpea) transgénica (derecha) y la planta de guisante pinto (cowpea) de control de tipo natural (izquierda), que muestra el crecimiento aumentado en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. La línea transgénica que expresa los transgenes GPT y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 11.

Figura 14. Plantas transgénicas de guisante pinto (cowpea) de la Línea G comparadas con las plantas de guisante pinto (cowpea) de control de tipo natural (la línea transgénica que expresa los transgenes GPT de Uva y GS de Arabidopsis), muestran que las plantas transgénicas crecen más rápido y florecen y establecen los brotes más rápido que las plantas de control de tipo natural. (A) alturas de las plantas, (B) números de flores y brotes de guisante pinto (cowpea), (C) vainas de hojas y números de trifolato. Ver Ejemplo 12.

Figura 15. Fotografía de la planta de guisante pinto (cowpea) transgénica de la Línea G (derecha) y la planta de guisante pinto (cowpea) de control de tipo natural (izquierda), que muestra un crecimiento aumentado en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. La línea transgénica que expresa los transgenes GPT de Uva y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 12.

Figura 16. Fotografía de la planta de melón (Cantalupo) transgénica (derecha) y la planta de melón (Cantalupo) de tipo natural de control (izquierda), que muestra el crecimiento aumentado en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. La línea transgénica que expresa los transgenes GPT y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 14.

Figura 17. Fotografía de plantas de Calabaza transgénicas (derecha) y plantas de Calabaza de control de tipo natural (izquierda), que muestran el crecimiento aumentado en las plantas transgénicas en relación con las plantas de control de tipo natural. Las líneas transgénicas que expresan los transgenes GPT y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 15.

Figura 18. Fotografía de las plantas de Arabidopsis transgénicas (derecha) y las plantas de Arabidopsis de control de tipo natural (izquierda), que muestran el crecimiento aumentado en las plantas transgénicas en relación con las plantas de control de tipo natural. Las líneas transgénicas expresan los transgenes GPT y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 16.

Figura 19. Plantas transgénicas de tomate que expresan los transgenes GPT y GS de Arabidopsis comparados con las plantas de tomate de control. (A) Fotografía de las hojas de las plantas de tomate transgénicas (derecha) contra hojas de control de tipo natural (izquierda) que muestran hojas más grandes en la planta transgénica. (B) Fotografía de las plantas de tomate transgénicas (derecha) y las plantas de control de tipo natural (izquierda), que muestran el crecimiento aumentado en las plantas transgénicas en relación con las plantas de control de tipo natural. Ver Ejemplo 17.

Figura 20. Fotografía de la planta de mostaza (Camelina) (Hierba del Mediterráneo) (derecha) y la planta de mostaza (camelina) de control de tipo natural (izquierda), mostrando el crecimiento aumentado en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural. La línea transgénica que expresa los transgenes GPT y GS de Arabidopsis. Ver Ejemplo 18.

Descripción Detallada de la Invención DEFINICIONES A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, observaciones y otra terminología científica aquí utilizada pretende tener los significados generalmente entendidos para aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. En algunos casos, los términos con significados entendidos comúnmente se definen en la presente descripción por razones de claridad y/o por razones de referencia fácil, y la inclusión de dichas definiciones en esta descripción no necesariamente será interpretada que representa una diferencia substancial sobre lo que es generalmente entendido en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos a los que se hace referencia en esta descripción son generalmente bien entendidos y generalmente empleados utilizando metodología convencional para los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular utilizadas ampliamente descritas en el libro de Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 3a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology) (Ausbel y asociados, eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001; "Plantas Transgénicas: Métodos y Protocolos" (Transgenic Plants: Methods and Protocols) (Leandro Pena, ed., Humana Press, 1a edición, 2004); y, "Protocolos de Agrobacterium" (Agrobacterium Protocols) (Wan, ed., Humana Press, 2a edición, 2006). Según sea apropiado, los procedimientos que comprenden el uso de los equipos y reactivos que se consiguen comercialmente generalmente son llevados a cabo de acuerdo con los protocolos definidos por el fabricante y/o los parámetros a menos que se indique lo contrario.

El término "ácido nucleico" se refiere a desoxi-ribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ("polinucleótidos") ya sea en forma de un solo hilo o de hilo doble. A menos que se límite específicamente, el término "polinucleótido" comprende los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de los nucleótidos naturales los cuales tienen propiedades de enlace similares a las de los ácidos nucleicos de referencia y son metabolizados de una manera similar a los nucleótidos que ocurren de manera natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también comprende implícitamente las variantes modificadas de manera conservadora de las mismas (por ejemplo, substituciones degeneradas del codón) y secuencias complementarias así como las secuencias explícitamente indicadas. Específicamente, las substituciones degeneradas del codón pueden ser logradas generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más de los codones seleccionados (o todos) son substituidos por residuos de base mezclados y/o desoxi-inosina (Batzer y asociados, 1991, Nucleic Acid Res. 19: página 5081; Ohtsuka y asociados, 1985 J. Biol. Chem. 260: páginas 2605 a 2608; y Cassol y asociados, 1992; Rossolini y asociados, 1994, Mol. Cell. Probes 8: páginas 91 a 98). El término ácido nucleico es utilizado de manera intercambiable con gen, cADN, y mARN codificado por un gen.

El término "promotor" se refiere a una adaptación de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico enlazado de manera operable. Como se usa en la presente descripción, un "promotor de planta" es un promotor que funciona en las plantas. Los promotores incluyen las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso del promotor de polimerasa de tipo II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente el mejorador o elementos represivos distantes, los cuales pueden estar localizados a tanto como a miles de pares básicos del sitio de inicio de transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de medios ambientes y condiciones de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo la regulación ambiental o de desarrollo. El término "enlazado de manera operable" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia de control de expresión del ácido nucleico (tal como un promotor, o adaptación de sitios de enlace del factor de transcripción) y una secunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos es un aminoácido artificial de imitación química de un aminoácido correspondiente que ocurre de manera natural, así como a los polímeros de aminoácidos que ocurren de manera natural y polímeros de aminoácidos que ocurren de manera no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y que ocurren de manera natural, así como análogos de aminoácidos e imitaciones de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que ocurren de manera natural. Los aminoácidos que ocurren de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados después, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la estructura química básica de los aminoácidos que ocurren de manera natural, es decir, un a carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfonio de metil metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras péptidas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que los aminoácidos que ocurren de manera natural. Las imitaciones de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido que ocurre de manera natural.

A los aminoácidos no podemos referir en la presente descripción ya sea por los tres símbolos de letras generalmente conocidos, o por símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. A los nucleótidos, de un modo similar nos podemos referir por sus códigos de una sola letra aceptados generalmente.

El término "planta" incluye plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, etc.), semillas y células de planta y la descendencia de las mismas. La clase de plantas que pueden ser utilizadas en el método de la presente invención generalmente es tan amplia como la clase de plantas mayores sensibles a las técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y monocotiledóneas), así como gimnospermas. Incluyen plantas de una variedad de niveles de ploidia, incluyendo poliploide, diploide, haploide y hemizigos.

Los términos "polinucleótido GPT" y "ácido nucleico GPT" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción, y se refieren a una secuencia de polinucleótidos de longitud parcial o longitud completa de un gen el cual codifica un polipéptido involucrado en la catalización de la síntesis de 2-oxoglutaramato, e incluye polinucleótidos que contienen secuencias (de codificación) tanto traducidas como sin traducir, así como los complementos de las mismas. El término "secuencia de codificación GPT" se refiere a la parte del gen la cual es transcrita y codifica una proteína GPT. El término "secuencia de envío al objetivo" se refiere a la parte terminal de aminoácidos de una proteína que dirige la proteína dentro del compartimento subcelular de una célula, tal como un cloroplasto en una célula de plantas. Los polinucleótidos GPT son definidos adicionalmente por su capacidad para hibridar bajo condiciones definidas, a los polinucleótidos GPT descritos específicamente en este documento, o a productos PCR derivados de los mismos.

Un "transgén GPT" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido GPT el cual es exógeno a la planta transgénica, o el embrión, órgano o semilla de la planta, dándole albergue a la molécula de ácido nucleico, o la cual es exógena a una planta ancestral, o embrión de la planta, órgano o semilla de la misma, de una planta transgénica que le da albergue al polinucleótido GPT.

Los términos "polinucleótido GS" y "ácido nucleico GS" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción, y se refieren a una secuencia de polinucleótidos de longitud completa o longitud parcial de un gen el cual codifica una proteina de sintetasa de glutamina, e incluye polinucleótidos que contienen tanto secuencias (de codificación) traducidas como sin traducir, así como el complemento de las mismas. El término "secuencia de codificación GS" se refiere a la parte del gen la cual es transcrita y codifica una proteína GS. Los términos "polinucleótido GS1" y "ácido nucleico GS1" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción, y se refieren a una secuencia de polinucleótidos de longitud total o de longitud parcial de un gen el cual codifica una proteína de isoforma 1 de sintetasa de glutamina, e incluye polinucleótidos que contienen secuencias tanto traducidas (de codificación) como sin traducir, así como a los complementos de las mismas. El término "secuencia de codificación GS1" se refiere a la parte del gen que es transcrita y codifica una proteína GS1.

Un "transgén GS" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido GS el cual es exógeno a la planta transgénica, o embrión, órgano o semilla de la planta, que da albergue a la molécula de ácido nucleico, o la cual es exógena a una planta ancestral, o embrión, órgano, o semilla de la planta, de una planta transgénica que le da albergue al polinucleótido GPT. Un "transgén GS1" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido GS1 el cual es exógeno a la planta transgénica, o al embrión, órgano o semilla de la planta, que le da albergue a la molécula de ácido nucleico, la cual es exógena a una planta antepasada, o embrión, órgano o semilla de la planta, de una planta transgénica que le da albergue al polinucleótido GPT.

Los polinucleótidos GPT de ejemplo de la presente invención se presentan en este documento, e incluyen secuencias de codificación GPT para Arabidopsis, Arroz, Cebada, Bambú, Frijol de Soya, Uva, y GPT de Pez Cebra.

Los polinucleótidos GPT de longitud parcial incluyen secuencias de polinucleótidos que codifican truncaciones de la terminal N- o C- del GPT, GPT maduro (sin secuencia de envío al objetivo) así como las secuencias que codifican los dominios de GPT. Los polinucieótidos GPT de ejemplo que codifican las truncaciones de la terminal N- del GPT incluyen construcciones de Arabidopsis -30, -45 y -56, en las cuales se eliminan las secuencias de codificación para los primeros 30, 45, y 56 aminoácidos, respectivamente, de la estructura GPT de longitud completa de la SEQ ID NO: 2.

Al momento de emplear los polinucieótidos GPT de la invención en la generación de células transformadas y plantas transgénicas, un experto en la técnica reconocerá que la secuencia de polinucieótidos insertada no necesita ser idéntica, sino que puede ser solamente "substancialmente idéntica" a una secuencia del gen de la cual fue derivada, como se definirá adicionalmente más adelante. El término "polinucleótido GPT" comprende específicamente dichas variantes substancialmente idénticas. De un modo similar, un experto en la técnica reconocerá que debido a la degeneración del codón, un número de secuencias de polinucieótidos codificarán el mismo polipéptido, y significa que todas dichas secuencias de polinucieótidos están incluidas en el término polinucleótido GPT. Además, el término incluye específicamente aquellas secuencias substancialmente idénticas (determinadas como se describirá más adelante) con una secuencia de polinucieótidos GPT aquí descrita y que codifica los polipéptidos que son ya sea mutantes de los polipéptidos GPT de tipo natural o retienen la función del polipéptido GPT (por ejemplo, resultando de substituciones conservadoras de aminoácidos en un polipéptido GPT). Por lo tanto, el término "polinucleótido GPT" también incluye dichas variantes substancialmente idénticas.

El término "variantes modificadas conservadoramente" aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las secuencias de ácido nucleico. Con respecto a secuencias particulares de ácido nucleico, las variantes modificadas de manera conservadoras se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias idénticas o esencialmente idénticas de aminoácidos, en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un número grande de ácidos nucleicos idénticos funcionalmente codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido de alanina. Por lo tanto, en cada posición en donde es especificada una alanina por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente descripción que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para la metionina, y TGG, el cual es generalmente el único codón para el triptofano) pueden ser modificados para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En lo que se refiere a las secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las substituciones, eliminaciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservadoramente" en donde la alteración da como resultado la substitución de un aminoácido con un aminoácido similar químicamente. Las tablas de substitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas conservadoramente son además de y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y alelos de la presente invención.

Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son substituciones conservadoras entre ellas: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Usina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V): 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Las estructuras moleculares tales como las estructuras de polipéptidos pueden ser descritas en términos de diferentes niveles de organización. Para una explicación general de esta organización, consultar, por ejemplo, el libro de Alberts y asociados, en "Biología Molecular de las Células" (Molecular Biology of the Cell) (3a ed., 1994) y el libro de Cantor y Schimmel, en "Química Biofísica Parte I: La Conformación de las Macromoléculas Biológicas" (Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules) (1980). La "estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido particular. La "estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales, ordenadas localmente, dentro de un polipéptido. Estas estructuras son generalmente conocidas como dominios. Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido y son generalmente de una longitud de 25 hasta aproximadamente 500 aminoácidos. Los dominios típicos están formados de secciones de organización menor tales como estiramientos de ß-hoja y a-hélices. Una "estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero de polipéptido. Una "estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los términos anisotrópicos también son conocidos como términos de energía.

El término "aislado" se refiere al material el cual está substancialmente o esencialmente libre de componentes los cuales acompañan normalmente el material como es descubierto en su condición natural o nativa. Sin embargo, el término "aislado" no pretende referirse a los componentes presentes en un gel electroforético u otro medio de separación. Un componente aislado está libre de dichos medios de separación y en una forma lista para utilizarse en otra aplicación o ya en uso en la nueva aplicación/entorno. Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con el diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solubles proteináceos o no proteináceos. En las modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de un 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y más preferentemente más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la terminal N- o secuencia interna de aminoácidos mediante el uso de un elaborador de secuencias de taza de hilado, o (3) a la homogeneidad por medio del SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no de reducción utilizando el azul Coomassie o, preferentemente, la tinción de plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo en el sitio dentro de las células recombinantes ya que por lo menos no estará presente un componente del ambiente natural del anticuerpo. Sin embargo, generalmente, los anticuerpos aislados serán preparados por al menos un paso de purificación.

El término "heterólogo" cuando es utilizado haciendo referencia a las porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no son encontradas en la misma relación entre ellas en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico generalmente es producido de manera recombinante, de manera que tiene dos o más secuencias de genes no relacionados acomodadas para hacer un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de una fuente y un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos de otra fuente. De un modo similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no son encontradas en la misma relación entre ellas en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son el mismo (por ejemplo, de aproximadamente 70% de identidad, preferentemente de 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% identidad sobre una región especificada, cuando es comparada y alineada para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada como medida utilizando algoritmos de comparación de una secuencia, o mediante la alineación manual y la inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, la cual tiene una secuencia substancial o complementariedad de subsecuencia cuando la secuencia de prueba tiene una identidad substancial con una secuencia de referencia. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, la cual tiene una secuencia substancial o complementariedad de subsecuencia cuando la secuencia de prueba tiene una identidad substancial con la secuencia de referencia.

Cuando el porcentaje de identidad de la secuencia es utilizado en la referencia a los polipéptidos, se reconoce que las posiciones del residuo que no son idénticas con frecuencia difieren por substituciones conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos son substituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales del polipéptido. En donde difieren las secuencias en substituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de la secuencia puede ser ajustado hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la substitución.

Para comparación en una secuencia, una secuencia generalmente actúa como una secuencia de referencia, con la cual son comparadas las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia son ingresadas en una computadora, y son designadas coordenadas de subsecuencia, de ser necesario, y un programa de algoritmo de secuencia con sus parámetros los cuales son designados. Los parámetros por omisión (default) del programa pueden ser utilizados, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basada en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en la presente descripción, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo consistente de 20 a 600, generalmente de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, y más generalmente de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 150 en la cual una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que dos secuencias son alineadas de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de las secuencias para comparación puede ser conducida, por ejemplo, por medio del algoritmo de homología local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: página 482, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: página 443, por medio de la búsqueda de un método de similitud de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: página 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante la alineación manual y la inspección visual (ver, por ejemplo, "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology) (Ausubel y asociados, eds., 1995 suplemento).

Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y la similitud de la secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales los describen Altschul y asociados, 1977, Nuc. Acids Res. 25: páginas 3389 a 3402 y Altschul y asociados, 1990, J. Mol. Biol. 215: páginas 403 a 410, respectivamente. Los BLAST y BLAST 2.0 son utilizados, generalmente con parámetros por omisión (default) aquí descritos, para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología. Este algoritmo comprende identificar primero pares de secuencias de calificación alta (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de solicitud, los cuales ya sea que coinciden o satisfacen alguna calificación T del umbral valuado de manera positiva cuando es alineado con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Nos referimos a T como el umbral de calificación de la palabra vecindad (Altschul y asociados, mencionado anteriormente). Estos éxitos de palabras iniciales de la vecindad actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSPs más largos que las contienen. Los éxitos de las palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como la calificación de alineación acumulativa que puede ser aumentada. Las calificaciones acumulativas son calculadas utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (calificación de premio para un par de residuos que se acoplan; siempre > 0) y N (calificación de penalidad para residuos de mal acoplamiento; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de calificación para calcular la calificación acumulativa. La extensión de los éxitos de la palabra en cada dirección se han interrumpido cuando: la calificación de alineación acumulativa falla por la cantidad X de su valor máximo logrado; la calificación acumulativa va a cero o más abajo, debido a la acumulación de una o dos alineaciones de residuos de calificación negativa; o se ha alcanzado el fin de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como (defaults) una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambos hilos. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como (defaults) una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (consultar Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: página 10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambos hilos.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: páginas 5873 a 5787). Una medida de la similitud proporcionada para el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría una coincidencia entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos por oportunidad. Por ejemplo, un ácido nucleico es considerado similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.2, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01, y aún más preferentemente menor de aproximadamente 0.001.

La frase "condiciones severas de hibridación" se refiere a condiciones bajo las cuales una muestra se hibridará a su subsecuencia objetivo, generalmente en una mezcla de complejo de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente en temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en el libro de Tijssen, "Técnicas en Bioquímica e Hibridación de Biología Molecular con Muestras de Ácido Nucleico" (Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes), "Revisión general de principios de hibridación y la estrategia de ensayos de ácido nucleico" (Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays) (1993). Generalmente, las condiciones altamente severas son seleccionadas para que sean aproximadamente de 5°C a 10°C inferiores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica en una fuerza definida iónica de pH. Las condiciones de baja severidad generalmente son seleccionadas para que sean aproximadamente de 15°C a 30"C inferiores al Tm. Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica definida, pH, y la concentración nucleica) en el cual el 50% de la complementaridad de las muestras para el objetivo hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (conforme las secuencias objetivo están presentes en exceso, en Tm, 50% de las muestras son ocupadas en equilibrio). Las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente un ión de sodio 1.0 M, generalmente de aproximadamente en una concentración de 0.01 a 1.0 M del ión de sodio (u otras sales) en un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30°C para las muestras cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos de aproximadamente 60°C para las muestras largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones severas también pueden ser logradas con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es por lo menos un fondo de dos veces, preferentemente una hibridación de un fondo de 10 veces.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre ellos bajo condiciones severas todavía son substancialmente idénticos si los polipéptidos que los codifican son substancialmente idénticos. Por ejemplo, esto ocurre, cuando una copia del ácido nucleico es creada utilizando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético. En dichos casos, los ácidos nucleicos generalmente hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente severas.

El ADN o cADN genómico que comprende los polinucleótidos GPT puede ser identificado en el Southern blots estándar bajo condiciones severas utilizando las secuencias del polinucleótido GPT aquí descritas. Para este propósito, las condiciones de severidad adecuadas para dichas hibridaciones son aquellas las cuales incluyen una hibridación en un regulador de formamida al 40%, NaCI 1 M, SDS al 1% a una temperatura de 37°C, y por lo menos un lavado en 0.2 X SSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50°C, generalmente entre 55°C hasta aproximadamente 60°C, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Una hibridación positiva es un fondo de por lo menos dos veces. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones de hibridación y lavado alternativas para producir condiciones de una severidad similar.

Una indicación adicional de que dos polinucleótidos son substancialmente idénticos es si la secuencia de referencia, amplificada por un par de cebadores de oligonucleótidos, puede entonces ser utilizada como una muestra bajo condiciones de hibridación severas para aislar la secuencia de prueba de un cADN o librería genómica, o para identificar la secuencia de prueba en, por ejemplo, un Northern o Southern blot.

PLANTAS TRANSGÉNICAS: La presente invención proporciona plantas transgénicas novedosas que exhiben características agronómicas substancialmente mejoradas, incluyendo el crecimiento más rápido, el peso fresco de la planta madura mayor y biomasa total, florecimiento más temprano y más abundante, y mayores frutos, vainas y rendimientos de las semillas. Las plantas transgénicas de la presente invención son generadas introduciendo en una planta una o más construcciones genéticas que se pueden expresar con capacidad para conducir la expresión de uno o más polinucleótidos que codifican la sintetasa de glutamina (GS) y la transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT). En una modalidad de ejemplo, las líneas paternas de un solo transgén portadoras de ya sea secuencias que codifican el transgén GPT o GS1, preferentemente auto-fertilizadas hasta los homozigos para el transgén, y luego son cruzadas para generar las plantas de descendencia que contienen ambos transgenes.

En modalidades de transformación estable de la presente invención, una o más copias de la construcción genética que se puede expresar llega a quedar integrada en el genoma de la planta huésped, proporcionando de esta manera una capacidad mejorada de la enzima GS y GPT dentro de la planta, la cual sirve para ser el portador de la síntesis aumentada del 2-oxoglutaramato, el cual a la vez señala la expresión del gen metabólico, dando como resultado un crecimiento aumentado de la planta y la mejora de otras características agronómicas. El 2-oxoglutaramato es un metabolito el cual es un efectuador extremadamente potente de la expresión del gen, metabolismo y crecimiento de la planta (Patente Norteamericana No. 6,555,500), y el cual puede jugar un rol de pivote en la coordinación de los sistemas de metabolismo del carbono y nitrógeno (Lancien y asociados, 2000, "Redundancia de la Enzima y la Importancia del 2-Oxoglutarato en la Asimilación de Amoníaco de las Plantas Más Altas" (Enzyme Redundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants Ammonium Assimilation), Plant Physiol. 123: páginas 817 a 824). Ver, también, la figura esquemática de la trayectoria del 2-oxoglutaramato mostrado en la figura 1.

En un aspecto de la presente invención, los solicitantes han aislado una molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina de Arabidopsis (GPT) (ver Ejemplo 1), y ha demostrado por primera vez que la enzima recombinante expresada es activa y tiene capacidad de catalizar la síntesis del metabolito de señal, 2-oxoglutaramato (Ejemplo 2). Además, los solicitantes han demostrado por primera vez que la sobre-expresión del gen de transaminasa de glutamina de Arabidopsis en una planta heteróloga transformada da como resultado índices de fijación de CO2 mejorados y características de crecimiento aumentado (Ejemplo 3).

El trabajo anterior de los solicitantes demostró que la sobre-expresión del gen GS1 de Alfalfa bajo el control de un promotor constitutivo fuerte da como resultado plantas de tabaco transgénico con niveles más altos de actividad del GS en las hojas. Estas plantas crecen más que sus contrapartes de tipo natural, fijan más rápido el C02, contienen concentraciones aumentadas de la proteína total, así como concentraciones aumentadas de glutamina y 2-oxoglutaramato, y muestran índices aumentados de asimilación del nitrato a través de sus raíces.

Como aquí se describe (ver Ejemplo 3), la sobre-expresión de un transgén que comprende una secuencia de codificación GPT de Arabidopsis de longitud completa en las plantas transgénicas de tabaco también da como resultado una fijación más rápida del C02, y niveles aumentados de proteína total, glutamina y 2-oxoglutaramato. Estas plantas transgénicas también crecen más rápido que las plantas de tipo natural (figura 2). De un modo similar, en estudios preliminares conducidos con plantas de tomate (ver Ejemplo 4), las plantas de tomate transformadas con el transgén GPT de Arabidopsis mostraron una mejora importante en el índice de crecimiento, florecimiento, y rendimiento de la semilla en relación con las plantas de control de tipo natural (figura 3 y Ejemplo 4).

En una modalidad particular, ejemplificada en esta descripción a modo de los Ejemplos 3, 5 y 7, un primer conjunto de líneas de plantas de tabaco de un solo transgén paterno portadores del gen GS1 de Alfalfa, incluyendo las regiones sin traducir 5' y 3', fueron generadas utilizando la transformación del gen portada por la Agrobacterium , bajo presión selectiva, junto con la selección del fenotipo más rápido de crecimiento, e igualando la homozigosidad del transgén/fenotipo (ver Ejemplo 5). Un segundo conjunto de líneas de plantas de tabaco de un solo transgén paterno portadores de la secuencia de codificación de longitud completa del GPT de Arabidopsis fueron generadas de la misma manera (Ejemplo 3). Las plantas de funcionamiento de índices de crecimiento alto para cada una de las líneas paternas entonces fueron cruzadas sexualmente para producir las líneas de descendencia (Ejemplo 7).

La progenie resultante de los cruces múltiples de las plantas de tabaco transgénicas GS1 y GPT de Arabidopsis produjeron aumentos bastante sorprendentes y mucho mejores en los índices de crecimiento sobre las líneas paternas de un solo transgén así como las plantas de tipo natural. La figura 5 muestra fotografías de la descendencia del doble transgén de los cruces de plantas GS1 X GPT de un solo transgén, en relación con las plantas paternas de un solo transgén y las de tipo natural. La figura 6 muestra fotografías que comparan los tamaños de las hojas de la descendencia del doble transgén y las plantas de tipo natural. Experimentalmente los índices de crecimiento observados en estas plantas transgénicas dobles son en un rango entre 200% y 300% sobre las plantas de tipo natural (Ejemplo 7). Además, los niveles totales de biomasa aumentaron substancialmente en las plantas de doble transgén, con pesos totales de la planta fresca que se encuentran entre una y tres veces los pesos de las plantas de tipo natural. De un modo similar, los rendimientos de las semillas mostraron aumentos similares en las plantas de doble transgén, con una producción de vainas de semillas generalmente de dos a tres veces en promedio de las de tipo natural, y rendimientos generales de la semilla que exceden de los rendimientos de las plantas de tipo natural en un 300% a 400%.

Además de las plantas transgénicas de tabaco a las que se hizo referencia anteriormente, varias otras especies de plantas transgénicas que comprenden los transgenes GPT y GS son específicamente ejemplificadas en esta descripción. Tal y como se ejemplifican en esta descripción, las plantas transgénicas que muestran características mejoradas de crecimiento han sido generadas en dos especies de Tomate (ver Ejemplos 4 y 17), Pimentero (Ejemplo 8), Frijoles (Ejemplos 9 y 10), Guisante Pinto (cowpea) (Ejemplos 11 y 12), Alfalfa (Ejemplo 13), Melón (cantalupo) (Ejemplo 14), Calabaza (Ejemplo 15), Arabidopsis (Ejemplo 16) y Mostaza (camilena) (Ejemplo 18). Estas plantas transgénicas de la presente invención fueron generadas utilizando una variedad de metodologías de transformación, incluyendo los callos portados por la Agrobacterium, la inmersión floral, inoculación de la semilla, inoculación de la vaina, y la inoculación directa de la flor, así combinaciones de los mismos, y por medio de cruces sexuales de plantas de un solo transgén, como aquí se ejemplifica. Los diferentes transgenes GPT y GS fueron empleados exitosamente para generar las plantas transgénicas de la presente invención, de acuerdo con la ejemplif icación de esta descripción.

La invención también proporciona métodos para generar una planta transgénica que tiene un crecimiento mejorado y otras características agronómicas. En una modalidad, un método para generar una planta transgénica que tiene crecimiento mejorado y otras características agronómicas comprende introducir dentro de la célula de la planta un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un transgén GPT, bajo el control de un promotor adecuado con capacidad para conducir la expresión del transgén, como para producir una célula de planta transformada, y obteniendo una planta transgénica la cual expresa el GPT codificado. En otra modalidad, un método para generar una planta transgénica que tiene características de crecimiento mejorado y otras características agronómicas comprende introducir dentro de la célula de la planta una o más construcciones o cassette de expresión de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un transgén GPT y un transgén GS, bajo el control de uno o más promotores adecuados (y opcionalmente, otros elementos regulatorios) con capacidad de conducir la expresión de los transgenes, como para producir una célula de planta transformada por el mismo, y obtener una planta transgénica la cual expresa los transgenes GPT y GS.

Basados en los resultados aquí descritos, es claro que cualquier número de polinucleótidos de GPT y GS pueden ser utilizados para generar las plantas transgénicas de la presente invención. Ambas las proteínas GS1 y GPT son altamente conservadas entre varias especies de plantas, y es evidente por los datos experimentales aquí descritos que los GPTs que no son de plantas relacionados cercanamente pueden ser utilizados también (por ejemplo, Danio rerio GPT). Con respecto al GPT, numerosos polinucleótidos de GPT derivados de diferentes especies han mostrado ser activos y útiles como transgenes GPT. De un modo similar, se pueden utilizar diferentes polinucleótidos GS, incluyendo sin limitación cualquier GS1 que codifica el polinucleótido que genera la actividad GS en una célula huésped transformada con una construcción GS1 que se puede expresar.

En una modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de Arabidopsis, tal como el GPT de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 30, y el transgén GS es un polinucleótido GS que codifica un derivado GS1 de Alfalfa (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) o un derivado GS1 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 7). El transgén GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 1, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GPT; y una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 truncada en su terminal amino por entre 30 a 56 residuos de aminoácidos, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene actividad GPT. El transgén GS1 puede ser codificado por el polinucleótido de las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 6 o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 6, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; y una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 4 ó' 7, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GS.

En otra modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de la Uva, tal como los GPTs de la Uva de las SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 31, y el transgén GS es un polinucleótido GS1. El transgén GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8; una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 8, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 31, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GPT.

Todavía en otra modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de Arroz, tal como los GPTs de Arroz de las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 32, y el transgén GS es un polinucleótido GS1. El transgén GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10; una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 10; y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GPT.

Todavía en otra modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado de Frijol de Soya, tal como los GPTs de Frijol de Soya de las SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 33 con una Isoleucina adicional en la terminal-N de la secuencia, y el transgén GS es un polinucleótido GS1. El transgén GPT puede ser codificado con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12; una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 12, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; una secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido de las SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 33 con una Isoleucina adicional en la terminal-N de la secuencia, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GPT.

Todavía en otra modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido GPT que codifica el GPT derivado de Cebada, tal como los GPTs de Cebada de las SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 34, y el transgén GS es un polinucleótido GS1. El transgén GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 14; una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 10, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; una secuencia de nucleotidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 34, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GPT.

Todavía en otra modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido GPT que codifica un GPT derivado del Pez Cebra, tal como los GPTs del Pez Cebra de las SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 35, y el transgén GS es un polinucleótido GS1. El transgén GPT puede ser codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16; una secuencia de nucleotidos que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 16. y que codifica un polipéptido que tiene una actividad GPT; una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 35, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de la secuencia la cual tiene una actividad GPT.

Todavía en otra modalidad específica, el transgén GPT es un polinucleótido que codifica un GPT derivado de Bambú, tal como el GPT de Bambú de la SEQ ID NO: 36, y el transgén GS es un polinucleótido GS1. El transgén GPT puede ser codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 36, o un polipéptido que tiene por lo menos 75% y más preferentemente por lo menos 80% de identidad de secuencia la cual tiene una actividad GPT.

Otros polinucleótidos GPT adecuados para utilizarse como transgenes GPT en la práctica de la presente invención pueden ser obtenidos por diferentes medios, como lo podrá apreciar un experto en la técnica, probados por su capacidad para dirigir la expresión de un GPT con una actividad GPT en un sistema de expresión recombinante (por ejemplo, E. coli (ver Ejemplos del 20 al 23), en un sistema de expresión en la planta transitorio (ver Ejemplo 19), o en una planta transgénica (ver Ejemplos del 1 al 18).

CONSTRUCCIONES DE TRANSGÉN/VECTORES DE EXPRESIÓN Con el objeto de generar plantas transgénicas de la presente invención, la secuencia de codificación del gen para el transgén deseado debe de ser incorporada en una construcción de ácido nucleico (a la que también nos referimos de manera intercambiable en la presente descripción como un vector de expresión (transgén), cassette de expresión, una construcción de expresión o una construcción genética que se puede expresar) la cual puede dirigir la expresión de la secuencia del transgén en las células de la planta transformadas. Dichas construcciones de ácido nucleico portadoras del transgén de interés pueden ser introducidas en las células de la planta o células utilizando un número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a electroporación, bombardeo de ADN o métodos biolísticos, microinyección, y por medio del uso de varios vectores basados en ADN tales como los vectores Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. Una vez introducido dentro de la célula de la planta transformada, la construcción de ácido nucleico puede dirigir la expresión del transgén incorporado (es decir, GPT), ya sea de un modo transitorio o estable. La expresión estable es la preferida, y es lograda utilizando los vectores de transformación de la planta los cuales pueden dirigir la integración de los cromosomas de la construcción del transgén. Una vez que la célula de la planta ha sido transformada exitosamente, puede ser cultivada para regenerar una planta transgénica.

Son conocidos un número grande de vectores de expresión adecuados para conducir la expresión constitutiva o inducida de los genes insertados en las plantas transformadas. Además, son conocidos varios vectores de expresión transitoria y sistemas. En un grado más extenso, los vectores de expresión apropiados son seleccionados para utilizarse en un método particular de transformación del gen (ver, lo anterior). Hablando generalmente, un vector de expresión de la planta típico para generar plantas transgénicas comprenderá el transgén de interés bajo el control regulatorio de expresión de un promotor, un marcador que se puede seleccionar para ayudar en la selección de los transformantes, y una secuencia terminadora de transcripción.

Más específicamente, los elementos básicos de una construcción de ácido nucleico para utilizarse para generar las plantas transgénicas de la presente invención son: un promotor adecuado con capacidad para dirigir la expresión funcional del transgén en una célula de planta transformada, el transgén(s) (por ejemplo, secuencia de codificación GPT) enlazado de manera operable al promotor, preferentemente una secuencia de terminación de transcripción adecuada (por ejemplo, un terminador del gen de enzima sintética de nopalina) enlazado de manera operable al transgén, y generalmente otros elementos útiles para controlar la expresión del transgén, así como uno o más genes marcadores que se pueden seleccionar adecuados para seleccionar la producción transgénica deseada (por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos).

Debido a que la Agrobacterium tumefaciens es un sistema de transformación primario utilizado para generar plantas transgénicas, existen numerosos vectores diseñados para la transformación del Agrobacterium. Para la transformación estable, los sistemas de Agrobacterium utilizan vectores "binarios" que permiten la manipulación del plásmido en ambos E. coli y Agrobacterium, y generalmente contienen uno o más marcadores que se pueden seleccionar para recuperar las plantas transformadas (Hellens y asociados, 2000, "Enfoque técnico: Una guía para los vectores binarios Ti de Agrobacterium" (Technical focus: A guide to Agrobacterium binary 77 vectors). Trends Plant Sci 5: páginas 446 a 451). Los vectores binarios para utilizarse con los sistemas de transformación de Agrobacterium generalmente comprenden los límites del T-ADN, sitios de clonación múltiple, funciones de duplicación para Escherichia coli y A. tumefaciens, y un marcador que se puede seleccionar y genes reportadores.

Los vectores denominados "súper-binario" proporcionan eficiencias más altas de transformación, y generalmente comprenden genes de virulencia adicional de un Ti (Komari y asociados, 2006, Methods Mol. Biol. 343: páginas 15 a 41). Los vectores súper binarios generalmente son utilizados en plantas las cuales exhiben eficiencias inferiores de transformación, tales como los cereales. Dichos genes de virulencia adicional incluyen sin limitación virB, virE, y virG (Vain y asociados, 2004. El efecto de los genes de virulencia adicional en la eficiencia de transformación, integración y expresión del transgén en las plantas de arroz utilizando el sistema de vector binario doble pGreen/pSoup. Transgenic Res. 13: páginas 593 a 603; Srivatanakul y asociados, 2000. Los genes de virulencia adicional influyen en la expresión del transgén: el número de copias del transgén, patrón de integración y expresión. J. Plant Physiol. 157, páginas 685 a 690; Park y asociados, 2000. El T-ADN más corto o los genes de virulencia adicional mejoran la transformación portada por Agrobacterium. Theor. Appl. Genet 101, páginas 1015 a 1020; Jin y asociados, 1987. Genes responsables del fenotipo de supervirulencia del Agrobacterium A281. J. Bacterol. 169: páginas 4417 a 4425).

En las modalidades aquí ejemplificadas (ver los Ejemplos anteriores), son empleados los vectores de expresión que colocan el transgén insertado bajo el control del promotor 35S de CaMV y el promotor RuBisCo. Un número de vectores de expresión que utiliza el promotor 35S de CaMV y RuBisCo son conocidos y/o se consiguen comercialmente y/o se pueden derivar utilizando las técnicas conocidas en el arte.

PROMOTORES DE PLANTAS El término "promotor" es utilizado para designar una región en la secuencia del genoma arriba del sitio de inicio de transcripción del gen (TSS), aunque las secuencias inferiores del TSS también pueden efectuar la iniciación de la transcripción. Los elementos promotores seleccionan el punto de iniciación a la transcripción, la especificidad y cantidad de transcripción. Dependiendo de la distancia del TSS, también son utilizados los términos de "promotor próximo" (varios cientos de nucleótidos alrededor del TSS) y "promotor distante" (miles y más nucleótidos arriba del TSS). Ambos promotores próximos y distantes incluyen conjuntos de varios elementos que participan en el proceso complejo de la etapa de desarrollo de célula-, tejido-, órgano-, y los factores ambientales de la regulación específica de transcripción. La mayor parte de los elementos promotores que regulan la selección de TSS se localizan en el promotor próximo.

Se conoce un número grande de promotores los cuales son funcionales en las plantas. Para construir las construcciones del transgén GPT y GS, el promotor seleccionado puede ser constitutivo, los promotores no específicos tales como el Virus de Mosaico de la Coliflor del promotor 35S del ribosoma (promotor 35S de CalvlV), el cual es ampliamente empleado para la expresión de los transgenes en las plantas. Los ejemplos de otros promotores constitutivos fuertes incluyen sin limitación, el promotor 1 de actina de arroz, el promotor 19S de CaMV, el promotor de sintasa de nopalina plásmido Ti, el promotor de deshidrogenasa de alcohol y el promotor de sintasa de sacarosa.

Alternativamente, en algunas modalidades, puede ser deseable seleccionar un promotor basado en las células de planta que se desea transformar por la construcción del transgén, el nivel de expresión deseado del transgén, el tejido deseado o compartimento subcelular para la expresión del transgén, la etapa de desarrollo que se tiene por objetivo, y similares.

Por ejemplo, cuando la expresión en los tejidos fotosintéticos y compartimentos es deseada, puede ser empleado un promotor para el gen de carboxilasa del bisfosfato de ribulosa (RuBisCo). En los Ejemplos siguientes, las construcciones de ácido nucleico que se pueden expresar que comprenden los transgenes GPT y GS1 bajo el control de un promotor RuBisCo de tomate fueron preparados y utilizados en la generación de plantas transgénicas o para probar la actividad GPT en la planta o en E coli.

Cuando la expresión en las semillas es deseada, se pueden emplear promotores de diferentes genes de proteína de almacenamiento de semillas. Para la expresión en las frutas, se puede utilizar un promotor específico de la fruta tal como el promotor de tomate 2A11. Los ejemplos de otros promotores específicos de tejidos incluyen los promotores que codifican la lectina (Vodkin y asociados, 1983, Cell 34: páginas 1023 a 1031; Lindstrom y asociados, 1990, Developmental Genetics 11: páginas 160 a 167), la deshidrogenase de alcohol de maíz 1 (Vogel y asociados, 1989, J. Cell. Biochem. (Suppl. 0) 13: Parte D; Dennis y asociados, 1984, Nucí. Acids Res., 12(9): páginas 3983 a 4000), el complejo de recolección de maíz ligero (Simpson, 1986, Science, 233: páginas 34 a 38; Bansal y asociados, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89: páginas 3654 a 3658), proteínas de choque de calor de maíz (Odell y asociados, 1985, Nature, 313: páginas 810 a 812; Rochester y asociados, 1986, EMBO J., 5: páginas 451 a 458), carboxilasa RuBP de subunidad de chícharo pequeño (Poulsen y asociados, 1986, Mol. Gen. Genet., 205(2): páginas 193 a 200; Cashmore y asociados, 1983, Gen. Eng. Plants, Plenum Press, New York, páginas 29 a 38), sintasa de manopina plásmida Ti y sintasa de nopalina plásmida Ti (Langridge y asociados, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 86: páginas 3219 a 3223), isomerasa de chalcona de petunia (Van Tunen y asociados, 1988, EMBO J. 7(5): páginas 1257 a 1263), proteína 1 rica en glicina de frijol (Keller y asociados, 1989, EMBO J. 8(5): páginas 1309 a 1314), 35S de CaMV truncado (Odell y asociados, 1985, mencionado anteriormente), patatina de papa (Wenzler y asociados, 1989, Plant Mol. Biol. 12: páginas 41 a 50), células de la raíz (Conkling y asociados, 1990, Plant Physiol. 93: páginas 1203 a 1211), maíz zein (Reina y asociados, 1990, Nucí. Acids Res. 18(21): página 6426; Kriz y asociados, 1987, Mol. Gen. Genet. 207(1): páginas 90 a 98; Wandelt y Feix, 1989, Nuc. Acids Res. 17(6): página 2354; Langridge y Feix, 1983, Cell 34: páginas 1015 a 1022; Reina y asociados, 1990, Nucí. Acids Res. 18(21): página 6426), globulina-1 (Belanger y Kriz, 1991, Genetics 129: página 863 a 872), a-tubulina (Carpenter y asociados, 1992. Plant Cell 4(5): páginas 557 a 571; Uribe y asociados, 1998, Plant Mol. Biol. 37(6): páginas 1069 a 1078), clorofila a/b (cab) (Sullivan, y asociados, 1989, Mol. Gen. Genet. 215(3): páginas 431 a 440), PEPCase (Hudspeth y Gruía, 1989, Plant Mol. Biol. 12: páginas 579 a 589), complejo de gen R (Chandler y asociados, 1989, The Plant Cell 1: páginas 1175 a 1183), sintasa de chalcona (Franken y asociados, 1991, EMBO J. 10(9): páginas 2605 a 2612) y promotores de sintetasa de glutamina (Patente Norteamericana No. 5,391,725; Edwards y asociados, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87: páginas 3459 a 3463; Brears y asociados, 1991, Plant J. 1 (2): páginas 235 a 244).

Además de los promotores constitutivos, varias secuencias promotoras que se pueden inducir pueden ser empleadas en los casos en donde se desea regular la expresión del transgén conforme se regenera, madura, florece, etc., la planta transgénica. Los ejemplos de dichos promotores que se pueden inducir incluyen promotores de genes de choque de calor, genes que responden a la protección (por ejemplo, fenilalanina de amonia Masa; ver, por ejemplo, Bevan y asociados, 1989, EMBO J. 8(7): páginas 899 a 906), genes que responden a las lesiones (por ejemplo, genes de proteína de pared celular), genes que se inducen químicamente (por ejemplo, reductasa de nitrato, quitinasa) y genes que inducen la oscuridad (por ejemplo, sintetasa de asparagina; ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,256,558). También, son activados por la luz un número de genes nucleares de la planta, incluyendo familias de genes que codifican las proteínas de enlace de clorofila a/b principales (cab) así como la subunidad pequeña de la carboxilasa de ribulosa-1 ,5-bisfosfato (rbcS) (ver, por ejemplo, Tobin y Silverthorne, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: páginas 569 a 593; Dean y asociados, 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: páginas 415 a 439).

Otros promotores que se pueden inducir incluyen los promotores ABA- y ampulosos que se pueden inducir, el promotor del gen de proteína de enlace de auxina (Schwob y asociados, 1993, Plant J. 4(3): páginas 423 a 432), el gen promotor de glicosil-transferasa flavanoide de glucosa UDP (Ralston y asociados, 1988, Genetics 119(1): páginas 185 a 197); el promotor del inhibidor de proteinasa MPI (Cordero y asociados, 1994, Plant J. 6(2): páginas 141 a 150), el promotor del gen de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (Kohier y asociados, 1995, Plant Mol. Biol. 29(6): páginas 1293 a 1298; Quigley y asociados, 1989, J. Mol. Evol. 29(5): páginas 412 a 421; Martínez y asociados, 1989, J. Mol. Biol. 208(4): páginas 551 a 565) y el gen plástido de sintetasa de glutamina que se puede inducir proveniente del guisante pinto (cowpea) (Patente Norteamericana No. 5,391,725; Edwards y asociados, 1990, mencionada anteriormente).

Para una revisión de los promotores de plantas utilizados en la tecnología de plantas transgénicas, consultar la publicación de Potenza y asociados, 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol - Plant, 40(1): páginas 1 a 22. Para una revisión del diseño del promotor de la planta sintética, ver, por ejemplo, Venter, M., 2007, Trends Plant Sci. 12(3): páginas 118 a 124.

TRANSGÉN DE TRANSAMINASA DE FE N I LP I RU VATO DE GLUTAMINA (GP"P La presente invención describe por primera vez que las plantas que contienen una enzima de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT) la cual es directamente funcional en la síntesis del metabolito de señal 2-hidroxi-5-oxoprolina. Hasta ahora, no se habían descrito transaminasas de plantas con una función definida. Los solicitantes han aislado y probado el polinucleótido GPT que codifica las secuencias derivadas de varias plantas y especies de animales, y han incorporado exitosamente el gen dentro de las plantas huésped transgénicas heterólogas las cuales exhiben características marcadamente mejoradas de crecimiento, incluyendo el crecimiento más rápido, un contenido de proteína más alto del follaje, una actividad de sintetasa de glutamina aumentada en el tejido del follaje, e índices de fijación de C02 más rápidos.

En la práctica de la presente invención, el gen GPT funciona como uno de por lo menos dos transgenes incorporados dentro de las plantas transgénicas de la invención, siendo el otro el gen de sintetasa de glutamina (ver lo mencionado anteriormente).

Se espera que todas las especies de plantas que contienen un GPT que funciona de la misma trayectoria metabólica, comprendiendo la biosíntesis del metabolito de señal 2-hidroxi-5-oxoprolina. Por lo tanto, en la práctica de la presente invención, cualquier gen de planta que codifica un homólogo GPT o variantes funcionales del mismo puede ser útil en la generación de las plantas transgénicas de la presente invención. Además, debido a la similitud estructural entre las diferentes estructuras de proteínas GPT de la planta y el homólogo GPT putativo (y biológicamente activo) de Danio rerio (Pez Cebra) (ver Ejemplo 22), los homólogos GPT que no son de plantas pueden ser utilizados para preparar los transgenes GPT para utilizarse en la generación de plantas transgénicas de la presente invención.

Cuando son comparados individualmente (mediante la alineación BLAST) la secuencia de proteína madura de Arabidopsis proporcionada en la SEQ ID NO: 30, las siguientes identidades y homologías de la secuencia (BLAST "positivas", incluyendo aminoácidos similares) fueron obtenidas para las secuencias de proteínas GPT maduras siguientes: [SEQ ID] o FIG. NO. Origen % DE IDENTIDAD % POSITIVO [31] Uva 84 93 [32] Arroz 83 91 [33] Frijol de soya 83 93 [34] Cebada 82 91 [35] Pez cebra 83 92 [36] Bambú 81 90 FIG.2 Maíz 79 90 FIG.2 Aceite de risino 84 93 FIG.2 Álamo 85 93 Subcalificando la naturaleza conservada de la estructura de la proteína GPT en la mayor parte de las especies de las plantas, la conservación vista dentro de las especies de las plantas anteriores se extiende a los GPTs putativos no humanos del Pez Cebra y las Chlamydomonas. En el caso del Pez Cebra, la extensión de la identidad es muy alta (83% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el GPT de Arabidopsis maduro de la SEQ ID NO: 30, y 92% homólogo tomando en cuenta los residuos de aminoácido similares). El GPT maduro del Pez Cebra fue confirmado expresándolo en E. coli y demostrando actividad biológica (síntesis de 2-oxoglutaramato).

Con el objeto de determinar si los homólogos GPT putativos serían adecuados para generar las plantas transgénicas con crecimiento mejorado de la presente invención, se necesita expresar inicialmente la secuencia de codificación del mismo en E. coli u otro huésped adecuado y determinar si el metabolismo de señal de 2-oxoglutaramato es sintetizado en niveles aumentados (ver los Ejemplos del 19 al 23). En donde dicho aumento es demostrado, la secuencia de codificación entonces puede ser introducida en ambos huéspedes de plantas homólogas y huéspedes de plantas heterólogas, y evaluar las características de crecimiento. Cualquier ensayo que tenga la capacidad de detectar el 2-oxoglutaramato con especificidad puede ser utilizado para este propósito, incluyendo pero sin limitación los ensayos RMN y HPLC descritos en el Ejemplo 2. Además, se pueden emplear ensayos los cuales miden directamente la actividad de GPT, tales como el ensayo de actividad GPT descrito en el Ejemplo 7.

Cualquier GPT de planta con actividad de síntesis del 2-oxoglutaramato puede ser utilizada para transformar las células de las plantas con el objeto de generar plantas transgénicas de la invención. Parece ser un alto nivel de homología estructural entre las especies de plantas, la cual parece extenderse más allá de las plantas, como es evidenciado por la homología cercana entre diferentes plantas de la proteína GPT y el homólogo GPT putativo del Pez Cebra. Por lo tanto, varios genes GPT de plantas pueden ser utilizados para generar las plantas transgénicas mejoradas en el crecimiento en una variedad de especies heterólogas de plantas. Además, los transgenes GPT expresados en una planta homologa se esperaría que resultaran también en las características deseadas de crecimiento mejorado (por ejemplo, la transaminasa de glutamina de arroz sobre-expresada en las plantas de arroz transgénicas), aunque es posible que la regulación dentro de las células homologas puedan atenuar la expresión de los transgenes en algún modo que pueda no ser operable en una célula heteróloga.

TRANSGÉN DE SINTETASA DE GLUTAMINA (GS): En la práctica de la presente invención, el gen de sintetasa de glutamina (GS) funciona como uno de por lo menos dos transgenes incorporados en las plantas transgénicas de la invención (siendo el otro de los dos el GPT).

La sintetasa de glutamina juega un rol clave en el metabolismo del nitrógeno en las plantas, así como en animales y bacterias. La enzima GS cataliza la adición de amonio a glutamato para sintetizar la glutamina en una reacción dependiente del ATP. Las enzimas GS de las especies clasificadas muestran residuos de aminoácidos altamente conservados considerados importantes para la función del sitio activa, indicando que las enzimas GS funcionan de una manera similar (para revisión, consultar Eisenberg y asociados, Biochimica et Biophysica Acta, 1477: páginas 122 a 145, 2000).

El GS es distribuido en diferentes ubicaciones subcelulares (cloroplasto y citoplasma) y se encuentra en varios tejidos de las plantas, incluyendo las raíces, las hojas, los retoños, las semillas y los frutos. Existen dos isoformas principales de plantas GS: la isoforma cistólica (GS1) y la isoforma plastídica (cloroplástica) (GS2). El GS2 se encuentra principalmente en el tejido de las hojas y funciona en la asimilación del amoníaco producido por la foto-respiración o mediante la reducción de nitrato. El GS1 es principalmente encontrado en los tejidos de la hoja y la raíz, generalmente existen un número de isoformas diferentes en las plantas más altas, y funciona para asimilar el amoníaco producido por todos los otros procesos fisiológicos (Coruzzi, 1991, Plant Science 74: páginas 145 a 155; McGrath y Coruzzi, 1991, Plant J. 1(3): páginas 275 a 280; Lam y asociados, 1996, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: páginas 569 a 593; Stitt, 1999, Curr. Op. Plant Biol. 2: páginas 178 a 186; Oliveira y asociados, 2001, Brazilian J. Med. Biol. Res. 34: páginas 567 a 575). Múltiples genes GS están asociados con un repertorio de promotor complejo el cual hace posible la expresión del GS de una manera específica en un órgano o tejido, así como de una manera dependiente de un factor ambiental.

La sintetasa de glutamina de las plantas consiste de ocho subunidades, y la enzima natural en las plantas tiene una masa molecular en un rango de 320 a 380 kD, teniendo cada subunidad una masa molecular de entre 38 y 45 kD. Los genes GS1 de diferentes plantas, especialmente las legumbres, han sido clonados y se han elaborado sus secuencias (Tischer y asociados, 1986, Mol Gen Genet 203: páginas 221 a 229; Gebhardt y asociados, 1986, EMBO J. 5: páginas 1429 a 1435; Tingey y asociados, 1987, EMBO J. 6: páginas 1 a 9; Tingey y asociados, 1988, J Biol Chem. 263: páginas 9651 a 9657; Bennett y asociados, 1989, Plant Mol Biol. 12: páginas 553 a 565; Boron y Legocki, 1993, Gene 136: páginas 95 a 102; Roche y asociados, 1993, Plant Mol Biol. 22: páginas 971 a 983; Marsolier y asociados, 1995, Plant Mol Biol. 27: páginas 1 a 15; Temple y asociados, 1995, Mol Plant-Microbe Interact. 8: páginas 218 a 227). Se ha encontrado que todas son codificadas por genes nucleares (para revisión, consultar, Morey y asociados, 2002, Plant Physiol. 128(1): páginas 182 a 193).

El GS2 cloroplástico parece ser codificado por un solo gen, mientras que varias isoformas GS1 cistoloicas son codificadas dentro de las familias de los genes múltiples (Tingey y asociados, 1987, mencionado anteriormente; Sakamoto y asociados, 1989, Plant Mol. Biol. 13: páginas 611 a 614; Brears y asociados, 1991, mencionado anteriormente; Li y asociados, 1993, Plant Mol. Biol., 23: páginas 401 a 407; Dubois y asociados. 1996, Plant Mol. Biol., 31: páginas 803 a 817; Lam y asociados, 1996, mencionado anteriormente). Las familias del GS1 de genes múltiples parecen codificar diferentes subunidades las cuales se pueden combinar para formar homo- o hetero-octámeros, y los diferentes miembros muestran un patrón de expresión único sugiriendo que los miembros del gen son regulados de manera diferencial, los cuales se pueden relacionar con los diferentes roles funcionales de la sintetasa de glutamina que juega un rol en el metabolismo general del nitrógeno (Gebhardt y asociados, 1986, mencionado anteriormente; Tingey y asociados, 1987, mencionado anteriormente; Bennett y asociados, 1989, mencionado anteriormente; Walker y Coruzzi, 1989, mencionado anteriormente; Peterman y Goodman, 1991. Mol Gen Genet. 1991; 330: páginas 145 a 154; Marsolier y asociados, 1995, mencionado anteriormente; Temple y asociados, 1995, mencionado anteriormente; Dubois y asociados, 1996, mencionado anteriormente).

En una modalidad, se emplea la secuencia de codificación del gen GS1 para generar las construcciones del transgén GS. En modalidades particulares, descritas adicionalmente en los Ejemplos, la secuencia que codifica el gen GS1 de Alfalfa o Arabidopsis es utilizada para generar una construcción de transgenes que puede ser utilizada para generar una planta transgénica que expresa el transgén GS1. Como un ejemplo, dicha construcción puede ser utilizada para transformar la Agrobacteria. La Agrobacteria transformada entonces es utilizada para generar las plantas transgénicas T0. El Ejemplo 5 demuestra la generación de las plantas de tabaco transgénicas GS1 de T0 utilizando este método. De un modo similar, los Ejemplos 6 y 17 demuestran la generación de plantas de tomate transgénico GS1 de T0, el Ejemplo 8 demuestra la generación de plantas de pimenteros transgénicas GS1 de T0, los Ejemplos 9 y 10 demuestran la generación de plantas de frijol transgénicas GS1 de T0, los Ejemplos 11 y 12 demuestran la generación de plantas transgénicas de Guisante Pinto (cowpea) GS1 de T0, el Ejemplo 13 demuestra la generación de plantas de alfalfa transgénicas GS1 de T0> el Ejemplo 14 demuestra la generación de plantas de melón (cantalupo) transgénicas GS1 de T0, el Ejemplo 15 demuestra la generación de plantas de Calabaza transgénicas GS1 de T0, el Ejemplo 16 demuestra la generación de plantas transgénicas de Arabidopsis GS1 de T0, y el Ejemplo 18 demuestra la generación de plantas de Melón (cantalupo) transgénicas GS1 de T0.

TERMINADORES DE TRANSCRIPCIÓN: En las modalidades preferidas, una secuencia de terminación de transcripción 3' es incorporada debajo del transgén con el objeto de dirigir la terminación de la transcripción y permitir la poliadenilación correcta del transcrito de mARN. Los terminadores adecuados de transcripción son aquellos los cuales es conocido que funcionan en las plantas, incluyendo sin limitación, los genes de la sintasa de nopalina (NOS) y la sintasa de octapina (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, el transcrito T7 del gen de sintasa de octapina, el extremo 3' del inhibidor de proteasa de los genes I o II de la papa o tomate, el terminador 35S de CaMV, el terminador tml y el terminador E9 de rbcS de guisante pinto (cowpea). Además, se puede utilizar un terminador de transcripción natural del gen. En modalidades específicas, descritas a modo de Ejemplos, mencionadas anteriormente, es empleada la transcripción de sintasa de nopalina.

MARCADORES QUE SE PUEDEN SELECCIONAR: Los marcadores que se pueden seleccionar generalmente están incluidos en los vectores de expresión del transgén con el objeto de proporcionar medios para seleccionar los transformantes. Aunque diferentes tipos de marcadores están disponibles, varios marcadores de selección negativa son utilizados típicamente, incluyendo aquellos los cuales confieren resistencia a un agente de selección que inhibe o extermina las células sin transformar, tales como genes que imparten resistencia a un antibiótico (tal como canamicina, gentamicina, anamicina, higromicina e higromicina B) o resistencia a un herbicida (tal como sulfonilurea, gulfosinato, fosfinotricina y glifosato). Los marcadores que se pueden seleccionar incluyen, por ejemplo, genes que codifican la ß-glucuronidasa (Jefferson. 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5. páginas 387 a 405), genes que codifican la luciferasa (Ow y asociados, 1986, Science 234: páginas 856 a 859) y varios genes que codifican proteínas comprendidas en la producción o control de los pigmentos de antocianina (Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,573,432). El gen de glucoronidasa de E. coli (gus, gusA o uidA) se ha convertido en un marcador de selección ampliamente utilizado en las plantas transgénicas, en gran parte debido a la estabilidad de la enzima de glucoronidasa, la alta sensibilidad y facilidad de detección (por ejemplo, por métodos fluorométricos, espectrofotométricos, y varios métodos histoquímicos). Además, existe esencialmente glucuronidasa que no se puede detectar en la mayor parte de las especies más altas de las plantas.

METODOLOGÍAS Y SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN: Varios métodos para introducir las construcciones vector de expresión del transgén de la invención en una planta o célula de la planta son bien conocidos para los expertos en la técnica, y se puede utilizar cualquiera que tenga la capacidad de transformar la planta objetivo o la célula de la planta.

La transformación portada por Agrobacterium es tal vez el método más común utilizado en las plantas transgénicas, y los protocolos para la transformación portada por Agrobacterium de un número grande de plantas que son extensivamente descritas en la literatura (ver, por ejemplo, "Protocolos de Agrobacterium" (Agrobacterium Protocols), Wan, ed., Humana Press, 2a edición, 2006). "Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram negativa de la tierra que ocasiona tumores" (Agrobacterium tumefaciens is a Gram negative soil bacteria that causes tumors) (enfermedad de la Vesícula) en muchas especies de dicotiledones, por medio de la inserción de un segmento pequeño del ADN inductor del tumor ("T-ADN", ADN de transferencia) en la célula de la planta, la cual es incorporada a una ubicación semi-aleatoria dentro del genoma de la planta, y la cual eventualmente puede convertirse establemente incorporada ahí. Directamente, las secuencias de ADN repetidas, denominadas límites de T-ADN, definen los extremos izquierdo y derecho del T-ADN. El T-ADN puede ser separado físicamente del resto del plásmido-Ti, creando un sistema de "vector binario".

La transformación del Agrobacterium puede ser utilizada para transformar los dicotiledóneos, monocotiledóneos, y células de los mismos de manera estable (Rogers y asociados, 1986, Methods Enzymol, 118: páginas 627 a 641; Hernalsteen y asociados, 1984, EMBO J., 3: páginas 3039 a 3041; Hoykass-Van Slogteren y asociados, 1984, Nature. 311: páginas 763 a 764; Grimsley y asociados, 1987, Nature 325: páginas 1670 a 1679; Boulton y asociados, 1989, Plant Mol. Biol 12: páginas 31 a 40; Gould y asociados, 1991, Plant Physiol. 95: páginas 426 a 434). Varios métodos para introducir el ADN en la Agrobacteria son conocidos, incluyendo la electroporación , los métodos de congelación/deshielo, y el acoplamiento tripaternal. El método más eficiente para colocar el ADN extraño dentro del Agrobacterium es por medio de electroporación (Wise y asociados, 2006, "Tres Métodos para la Introducción del ADN Extraño Dentro del Agrobacterium" (Three Methods for the Introduction of Foreign DNA into Agrobacterium), "Métodos en Biología Molecular" (Methods in Molecular Biology), volumen 343: "Protocolo de Agrobacterium" (Agrobacterium Protocols), 2/e, volumen 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 43 a 53). Además, debido al porcentaje grande de T-ADNs no se integran, la transformación portada por el Agrobacterium puede ser utilizada para obtener la expresión transitoria de un transgén por medio de la competencia de transcripción de las moléculas de la construcción del transgén no incorporadas (Helens y asociados, 2005, Plant Methods 1: página 13).

Un número grande de vectores de transformación de Agrobacterium y métodos han. sido descritos (Karimi y asociados, 2002, Trends Plant Sci. 7(5): páginas 193 a 195), y muchos de dichos vectores pueden ser obtenidos comercialmente (por ejemplo, Invitrogen). Además, un número creciente de vectores de transformación de Agrobacterium "fuente abierta" están disponibles (por ejemplo, los vectores pCambia; Cambia, Canberra, Australia). También ver, la subsección en CONSTRUCCIONES DEL TRANSGÉN, mencionada anteriormente. En una modalidad específica descrita adicionalmente en los Ejemplos, un vector basado en pMON316 fue utilizado en el sistema de transformación del disco de la hoja de Horsch y asociados. (Horsch y asociados, 1995, Science 227: páginas 1229 a 1231) para generar el crecimiento mejorado del tabaco transgénico y las plantas de tomate.

Otros métodos de transformación utilizados generalmente que pueden ser empleados en la generación de plantas transgénicas de la presente invención, e incluyen sin limitación, bombardeo de microproyectiles, o los métodos de transformación biolística, la transformación del protoplasto del ADN natural por medio del calcio, polietilénglicol (PEG) o electroporación (Paszkowski y asociados, 1984, EMBO J. 3: páginas 2727 a 2722; Potrykus y asociados, 1985, Mol. Gen.

Genet 199: páginas 169 a 177; Fromm y asociados, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 82: páginas 5824 a 5828; Shimamoto y asociados, 1989, Nature, 338: páginas 274 a 276.

La transformación biolística comprende inyectar millones de partículas de metal recubiertas con ADN en las células o tejidos objetivo utilizando un aparato biolístico (o "pistola genética"), varios tipos de los cuales están disponibles comercialmente; una vez dentro de la célula, el ADN eluye las partículas y una porción puede ser incorporada de manera estable en uno o más de los cromosomas de las células (para revisión, consultar las publicaciones de Kikkert y asociados, 2005, "Transformación Estable de Células de Plantas mediante el Bombardeo de Partículas/Biolística, en Métodos de Biología Molecular" (Stable Transformation of Plant Cells by Partióle Bombardment/Biotistics, in: Methods in Molecular Biology), volumen 286: "Plantas Transgénicas: Métodos y Protocolos" {Transgenic Plants: Methods and Protocols), Ed. L. Peña, Humana Press Inc., Totowa, NJ).

La electroporación es una técnica que utiliza campos eléctricos de alta intensidad cortos, para permeabilizar de manera reversible las bicapas de lípidos de las membranas celulares (ver, por ejemplo, Fisk y Dandekar, 2005, "Introducción y Expresión de los Transgenes en Protoplastos de Plantas, en: Métodos en Biología Molecular" (Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology), volumen 286: "Plantas Transgénicas: Métodos y Protocolos" {Transgenic Plants: Methods and Protocols), Ed. L. Peña, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 79 a 90; Fromm y asociados, 1987, "Electroporacion de ADN y ARN dentro de los protoplastos de plantas, en Métodos de Enzimología" (Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology), Volumen 153, Wu y Grossman, eds., Academic Press, London, RU, páginas 351 a 366; Joersbo y Brunstedt, 1991, "Electroporacion: mecanismo y expresión transitoria de transformación estable y efectos biológicos en los protoplastos de las plantas" (Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in plant protoplasts). Physiol. Plant. 81, páginas 256 a 264; Bates, 1994, "Transformación genética de las plantas mediante electroporacion del protoplasto" {Genetic transformation of plants by protoplast electroporation). Mol. Biotech. 2: páginas 135 a 145; Dillen y asociados, 1998, "Transferencia de ADN portada por electroporacion a protoplastos de plantas y tejidos de plantas intactos para ensayos de expresión transitoria del gen" (Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression assays), en Cell Biology, Vol. 4, ed., Cells, Academic Press, London, RU, páginas 92 a 99). La técnica opera mediante la creación de poros acuosos en la membrana de la bacteria, los cuales son lo suficientemente grandes de tamaño para permitir que las moléculas de ADN (y otras macromoléculas) entren en la célula, en donde la construcción de expresión del transgén (en la forma de T-ADN) puede ser incorporada de manera estable dentro del ADN genómico de la planta, conduciendo a la generación de células transformadas que pueden ser posteriormente regeneradas en plantas transgénicas.

Los métodos de transformación más nuevos incluyen los denominados métodos de "inmersión floral", el cual ofrece la promesa de la simplicidad, sin requerir un cultivo de tejido de planta, como es el caso con todos las otras metodologías de transformación utilizadas generalmente (Bent y asociados, 2006, "Método de Transformación de Inmersión Floral de Arabidopsis thaliana" (Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method), Methods Mol Biol, vol. 343: "Protocolos de Agrobacterium" (Agrobacterium Protocols), 2/e, volumen 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 87 a 103; Clough y Bent. 1998, "Inmersión floral: un método simplificado para la transformación portada por Agrobacterium de Arabidopsis thaliana" (Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana), Plant J. 16: páginas 735 a 743). Sin embargo, con la excepción de la Arabidopsis, estos métodos no han sido utilizados ampliamente en un espectro amplio de diferentes especies de plantas. Brevemente, la transformación de inmersión floral es realizada sumergiendo o rociando las plantas florecientes con una cepa apropiada de Agrobacterium tumefaciens. Las semillas recolectadas de estas plantas T0 entonces son germinadas bajo selección para identificar el ?? transgénico individual. El Ejemplo 16 demuestra la inoculación de la inmersión floral de Arabidopsis para generar las plantas transgénicas de Arabidopsis.

Otros métodos de transformación incluyen aquellos en los cuales las semillas en desarrollo o semilleros de las plantas son transformados utilizando vectores tales como vectores de Agrobacterium. Por ejemplo, como se ejemplifica en el Ejemplo 8, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar las semillas en desarrollo inyectando una suspensión o mezcla del vector (por ejemplo, Agrobacteria) directamente dentro de la cavidad de la semilla de las vainas en desarrollo (por ejemplo, vainas de pimentero, vainas de frijol, vainas de guisante pinto, y similares). Los semilleros pueden ser transformados como se describen para la Alfalfa en el Ejemplo 13. Las semillas en germinación pueden ser transformadas como se describió para la mostaza (camelina) en el Ejemplo 18. Los métodos intra-frutas, en los cuales el vector es inyectado dentro de la fruta o frutas en desarrollo, pueden ser utilizados como lo describen para los melones (cantalupos) en el Ejemplo 14 y las calabazas en el Ejemplo 15.

Todavía otros métodos de transformación incluyen aquellos en los cuales la estructura de la flor se utiliza como objetivo para la inoculación del vector, tales como los métodos de inoculación de flores descritos para los frijoles en los Ejemplos 9 y 10, el guisante pinto (coivpea) en los Ejemplos 11 y 12 y los tomates en el Ejemplo 17.

Las metodologías anteriores de transformación de plantas pueden ser utilizadas para introducir los transgenes dentro de un número de diferentes células y tejidos de las plantas, incluyendo sin limitación las plantas completas, tejidos y órganos explantas incluyendo cloroplastos, tejidos que están floreciendo y células, protoplastos, células de los tallos, callos, embriones inmaduros y células gaméticas como microesporas, polen, esperma y células de huevos, células de cultivo de tejidos de cualquiera de los anteriores, se pueden generar otras células de las cuales una planta transgénica fértil regenerada. Los callos son iniciados de las fuentes del tejido incluyendo, pero sin limitarse a, embriones inmaduros, tallos apicales de los semilleros, microesporas y similares. Las células con capacidad para proliferar como callos también son células receptoras para la transformación genética.

Los métodos para regenerar las plantas individuales de las células de plantas transformadas, tejidos u órganos son conocidos y se describen para numerosas especies de plantas.

Como una ilustración, las plantitas transformadas (derivadas de las células transformadas o tejidos) son cultivadas en un medio de crecimiento permisivo de la raíz suplementado con el agente selectivo utilizado en la estrategia de transformación (por ejemplo, antibióticos tales como canamicina). Una vez que son enraizadas las plantitas transformadas son transferidas entonces a la tierra y se permite que crezcan hasta que maduren. Al momento de florecer, las plantas maduras preferentemente son auto-fertilizadas, y las semillas resultantes recolectadas y utilizadas para cultivar generaciones subsecuentes. Los Ejemplos del 3 al 6 describen la regeneración del tabaco transgénico y las plantas de tomate.

Las plantas transgénicas T0 pueden ser utilizadas para generar generaciones posteriores (por ejemplo, ?,, T2, etc.) auto-fertilizando los transformantes primarios y secundarios, o mediante el cruce sexual de los transformantes primarios y secundarios con otras plantas (transformadas o sin transformar). Por ejemplo, tal y como se describe en el Ejemplo 7, las plantas individuales que sobre-expresan el gen GS1 de Alfalfa y que funcionan como plantas de tipo natural fueron cruzadas con plantas individuales que sobre-expresan el gen GPT de Arabidopsis GPT y sobrefuncionan en las plantas de tipo natural, mediante un cruce sexual simple utilizando la transferencia de polen manual. Los cruces recíprocos se hacen de modo que cada planta sirva como el macho en un conjunto de cruces y cada planta sea servida como la hembra en un segundo conjunto de cruces. Durante la etapa de crecimiento de la planta madura, las plantas son generalmente examinadas por el fenotipo de crecimiento, el índice de fijación de C02, etc., (ver la siguiente subsección).

SELECCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS CON CRECIMIENTO MEJORADO: Las plantas transgénicas pueden ser seleccionadas y caracterizadas utilizando metodologías estándar. Las plantas transgénicas preferidas de la presente invención exhiben una o más características fenotípicas indicadoras de propiedades de crecimiento mejorado y/u otras propiedades agronómicas deseables. Las plantas transgénicas son generalmente regeneradas bajo la presión selectiva con el objeto de seleccionar los transformantes antes de crear las generaciones de plantas transgénicas posteriores. Además, la presión selectiva utilizada puede ser empleada más allá de las generaciones de T0 con el objeto de asegurar la presencia de la construcción o cassette de expresión del transgén deseado.

Las células de plantas transformadas T0, callos, tejidos o plantas pueden ser identificadas y aisladas seleccionando la composición genética de y/o las características fenotípicas codificadas por los genes marcadores contenidos en la construcción de expresión del transgén utilizada para la transformación. Por ejemplo, la selección se puede dirigir cultivando plantas transformadas potencialmente, tejidos o células en un medio de crecimiento que contiene una cantidad represiva de antibiótico o herbicida a la cual la construcción genética de transformación puede impartir resistencia. Además, las células de plantas transformadas, tejidos y plantas pueden ser identificadas, seleccionando la actividad de los genes marcadores (tales como ß-glucuronidasa) el cual puede estar presente en la construcción de expresión del transgén.

Varios métodos físicos y bioquímicos pueden ser empleados para identificar las plantas que contienen la construcción de expresión del transgén deseada, como es bien conocido. Los ejemplos de dichos métodos incluyen el análisis Southern blot o diferentes métodos de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) para identificar el transgén, la construcción de expresión del transgén o elementos del mismo; Northern blotting, la protección RNase S1, amplificación de transcriptasa inversa PCR (RT-PCR) para detectar y determinar los productos de transcripción del ARN; y electroforesis de gel de la proteína, Western blotting, la inmunoprecipitación, el inmunoensayo de enzimas, y similares para identificar la proteína codificada y expresada por el transgén.

En otro método, los niveles de expresión de los genes, proteínas y/o compuestos metabólicos que son conocidos para ser modulados por la expresión del transgén en la planta objetivo pueden ser utilizados para identificar los transformantes. En una modalidad de la presente invención, los niveles aumentados del metabolito de señal de 2- oxoglutaramato pueden ser utilizados para seleccionar los transformantes deseables, como se han mostrado en los Ejemplos. De un modo similar, los niveles aumentados de actividad de GPT y/o GS pueden ser probados, como se muestra en los Ejemplos.

Finalmente, las plantas transformadas de la presente invención pueden ser seleccionadas por su crecimiento mejorado y/u otras características agronómicas deseables. Indudablemente, algún grado de selección fenotípica es generalmente deseable con el objeto de identificar las líneas transformadas con los índices de crecimiento más rápido, los rendimientos de semilla más altos, etc., particularmente cuando se identifican plantas para el auto-fertilizado subsecuente, la reproducción cruzada, y el otro cruce. Los diferentes parámetros pueden ser utilizados para este propósito, incluyendo sin limitación, índices de crecimiento, pesos frescos totales, pesos secos, rendimientos de semillas y frutos (número, peso), semillas y/o tamaños de las vainas de semillas, rendimiento de las vainas de semilla (por ejemplo, número, peso), tamaño de las hojas, tamaño de las plantas, florecimiento mejorado, tiempo para florecimiento, contenido general de proteína (en las semillas, frutos, y tejidos de las plantas), contenido específico de proteína (por ejemplo, GS), contenido de nitrógeno, aminoácidos libres, y niveles de compuestos metabólicos específicos (por ejemplo, 2- oxoglutaramato). Generalmente, estas mediciones fenotípicas son comparadas con aquellas obtenidas de una línea paterna idéntica o análoga de la planta, una planta análoga o idéntica sin transformar, o una planta de tipo natural idéntica o análoga (por ejemplo, una planta normal o paterna). Preferentemente, y por lo menos inicialmente, la medición de las características fenotípicas seleccionadas en la planta transgénica objetivo se hace paralela con la medición de las mismas características en una planta normal o paterna. Generalmente, se utilizan plantas múltiples para establecer el deseo fenotípico y/o superioridad de la planta transgénica con respecto a cualquier característica fenotípica particular.

Preferentemente, los transformantes iniciales son seleccionados y luego utilizados para generar el Ti y las generaciones posteriores mediante la auto-fertilización, hasta que se hace realidad la proliferación del fenotipo del transgén (por ejemplo, la planta es homozigo para el transgén). En la práctica, esto se analiza mediante la auto-fertilización de 3 ó 4 generaciones, seleccionando en cada generación las características deseadas y auto-fertilizando aquellas individuales. Como se ejemplifica en esta descripción, las líneas de plantas transgénicas propagandas a través de por lo menos una generación sexual (Tabaco, Arabidopsis, Tomate) demostraron actividades más altas del producto del transgén comparadas con las líneas que no tenían el beneficio de la reproducción sexual y el aumento concomitante en el número de copias del transgén.

Las líneas transgénicas estables pueden ser cruzadas y volverse a cruzar para crear variedades con cualquier número de características deseadas, incluyendo aquellas con transgenes apilados, copias múltiples de un transgén, etc. Adicionalmente, las plantas transgénicas estables pueden ser modificadas genéticamente de manera adicional, transformando dichas plantas con transgenes adicionales o copias adicionales del transgén paterno. También están contempladas las plantas transgénicas creadas por eventos de transformación solos los cuales introducen copias múltiples de un transgén determinado o transgenes múltiples. Varios métodos comunes de reproducción son bien conocidos para los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, "Métodos de Reproducción para el Desarrollo de los Cultivos" (Breeding Methods for Cultivar Development), Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)).

En otro aspecto, la presente invención proporciona plantas transgénicas caracterizadas por la eficiencia en el uso del nitrógeno aumentada. La eficiencia del uso del nitrógeno puede ser expresada como el rendimiento de la planta por una cantidad determinada de nitrógeno. En los Ejemplos aquí proporcionados, el transgén y las plantas de control todas recibieron las mismas soluciones de nutriente en las mismas cantidades. Las plantas transgénicas fueron caracterizadas consistentemente por rendimientos más altos, y por lo tanto tienen eficiencias de uso de nitrógeno más altas.

Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona plantas transgénicas y semillas de las mismas con una tolerancia aumentada a condiciones de crecimiento de alta sal. Este aspecto de la invención es ejemplificado en el Ejemplo 24, el cual describe la germinación de las semillas de la planta de tabaco transgénicas en condiciones de muy alta sal (200 mM de NaCI). Aunque las semillas de tabaco de tipo natural de contraparte germinaron en una cantidad solamente de aproximadamente el 10%, en promedio, las semillas de tabaco transgénico lograron casi la misma cantidad de germinación obtenida bajo condiciones que no son de sal tanto para las semillas transgénicas como las de tipo natural, o de aproximadamente 92%.

EJEMPLOS Varios aspectos de la presente invención se describen adicionalmente y se ilustran a modo de varios de los ejemplos siguientes, y ninguno de los cuales intenta limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1: AISLAMIENTO DEL GEN DE TRANS AMINAS A DE FENILPIRU ATO DE GLUTAMINA ARABIDOPSIS (GPT): En un intento para localizar una enzima de planta que está directamente involucrada en la síntesis del metabolito de señal 2-oxoglutaramato, los solicitantes hipotetizaron que la enzima de la planta putativa podría portar algún grado de relación estructural con una proteína humana que había sido caracterizada como que estaba involucrada en la síntesis del 2-oxoglutaramato. La proteína humana, la transaminasa de glutamina K (E.C. 2.6.1.64) (a la que también nos referimos en la literatura como ß-liasa conjugada con cisteína, aminotransferasa de quineurenina, transaminasa de fenilpiruvato de glutamina, y otros nombres), han mostrado estar involucradas en el procesamiento de los conjugados de cisteína de los xenobióticos halogenados (Perry y asociados, 1995, FEBS Letters 360: páginas 277 a 280). En vez de tener una actividad involucrada en el metabolismo del nitrógeno, no obstante, la ß-liasa conjugada de cisteína humana tiene una actividad de desintoxicación en los humanos, y en los animales. Sin embargo, el involucramiento potencial de esta proteína en la síntesis de 2-oxoglutaramato fue de interés.

Usando la secuencia de la proteína de la ß-liasa conjugada de cisteína humana, una búsqueda contra la base de datos de la planta TIGR de Arabidopsis de secuencias de proteínas identificaron una secuencia potencialmente relacionada, un polipéptido codificado por una secuencia parcial en el lugar del gen de Arabidopsis en At1q77670, que comparte aproximadamente el 36% de homología/identidad de la secuencia en las regiones alineadas.

La región de codificación completa del gen entonces fue amplificada de una librería de cADN de Arabidopsis (Stratagene) con el siguiente par de cebadores: 5'-CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTG ATG-3' 5'-G ATGGTACCTCAG ACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3' Estos cebadores fueron diseñados para incorporar los sitios de restricción Cía I (ATCGAT) y Kpn I (GGTACC) para facilitar la subclonación subsecuente en vectores de expresión para generar plantas transgénicas. La enzima de polimerasa de ADN de Takara ExTaq fue utilizada para un PCR de alta fidelidad utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94CC durante 4 minutos, 30 ciclos a 94°C de 30 segundos, el recocido a una temperatura de 55°C durante 30 segundo, la extensión a una temperatura de 72°C durante 90 segundos, con una extensión final en una temperatura de 72°C durante 7 minutos. El producto de amplificación fue digerido con las enzimas de restricción Cía I y Kpn 1, aisladas de una electrof oresis de gel de agarosa y ligadas en el vector pMon316 (Rogers, y asociados, 987 Methods in Enzymology 153: páginas 253 a 277) el cual contiene el virus de mosaico de coliflor (CaMV, también CMV), el promotor constitutivo 35S y el terminador 3' de la sintasa de nopalina (NOS). La ligación se transformó en células DH5a y se elaboraron secuencias de los transformantes para verificar el inserto.

Un cADN de 1.3 kb fue aislado y se elaboraron las secuencias, y se encontró que codificaba una proteína de longitud completa de 440 aminoácidos de longitud, incluyendo una secuencia de señal putativa de cloroplasto.

EJEMPLO 2: PRODUCCIÓN DE LA TRANS AMINAS A DE FENILPIRUVATO DE GLUTAMINA (GPT) DE ARABIDOPSIS RECOMBINANTE BIOLÓGICAMENTE ACTIVA: Para probar si la proteína codificada por el cADN aislado como se describió en el Ejemplo 1, mencionado anteriormente, tiene la capacidad de catalizar la síntesis del 2-oxoglutaramato, el cADN fue expresado en E. coli, purificado, y ensayado por su capacidad para sintetizar el 2-oxoglutaramato utilizando un método estándar.

Ensayo RMN para el 2-oxoqlutaramato: Brevemente, la proteína purificada resultante fue agregada a una mezcla de reacción que contenía 150 mM de Tris-HCI, pH 8.5, 1 mM de beta mercaptoetanol, 200 mM de glutamina, 100 mM de glioxilato y 200 microM de piridoxal 5'-fosfato. La mezcla de reacción sin agregar la proteína de prueba fue utilizada como un control. Las mezclas de reacción de prueba y control fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante 20 horas, y luego clarificadas mediante centrifugación para eliminar el material precipitado. Los sobrenadantes fueron probados por la presencia y la cantidad del 2-oxoglutaramato utilizando el ensayo 13C RMN con 2-oxoglutaramato auténtico sintetizado químicamente como referencia. Los productos de la reacción son 2-oxoglutaramato y glicina, mientras que los substratos (glutamina y glioxilato) disminuyen en abundancia. El 2-oxoglutaramato cíclico origina una señal distintiva que permite que sea distinguido fácilmente del precursor de glutamina de cadena abierta.

Ensayo HPLC para el 2-oxoglutaramato: Un ensayo alternativo para la actividad de GPT utiliza el HPLC para determinar la producción del 2-oxoglutaramato, siguiendo la modificación de Calderón y asociados, 1985, J Bacteriol 161(2): páginas 807 a 809. Brevemente, un regulador de extracción modificada consistente de 25 mM de Tris-HCI, pH 8.5, 1 mM de EDTA, 20 µ? de FAD, 10 mM de Cisteína, y -1.5% (v/v) de Mercaptoetanol. Las muestras de tejido del material de prueba (por ejemplo, tejidos de la planta) se agregan al regulador de extracción en una proporción de aproximadamente 1/3 (p/v), son incubadas por 30 minutos a una temperatura de 37°C, y se detiene la incubación con 200 µ? de TCA al 20%. Después de aproximadamente 5 minutos, la mezcla de ensayo es centrifugada y el sobrenadante utilizado para cuantificar el 2-oxoglutaramato mediante HPLC, utilizando una columna ION-300 de 7.8 mm de diámetro interior por 30 cm de largo, con una fase móvil en h2S04 0.01 N, un rango de flujo de aproximadamente 0.2 ml/min, a una temperatura de 40°C. El volumen de inyección es de aproximadamente 20 µ?, y el tiempo de retención entre aproximadamente 38 y 39 minutos. La detección es lograda con una luz UV en 210 nm.

Resultados Utilizando el Ensayo RMN: Este experimento reveló que la proteína de prueba puede catalizar la síntesis de 2-oxoglutaramato. Por lo tanto, estos datos indican que el cADN aislado codifica una transaminasa de fenilpiruvato de glutamina que está directamente involucrada en la síntesis del 2-oxoglutaramato en las plantas. Por consiguiente, la proteína de prueba fue designada como transaminasa de fenilpiruvato de glutamina de Arabidopsis, o "GPT".

La secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación del GPT de Arabidopsis se muestra en la Tabla de Secuencias, SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos traducida de la proteína GPT se muestra en la SEQ ID NO: 2.

EJEMPLO 3: CREACIÓN DE PLANTAS DE TABACO TRANSGÉNICAS QUE SOBRE-EXPRESAN EL GPT DE ARABIDOPSIS: Generación del Vector de Expresión de la Planta pMON-PJU: Brevemente, el vector de expresión de la planta pMon316- PJU fue construido de la manera siguiente. El cADN aislado que codifica el GPT de Arabidopsis (Ejemplo 1) fue clonado en el sitio del polienlazador Clal-Kpnl del vector pMON316, el cual coloca el gen GPT bajo el control del promotor 35S del virus de mosaico de coliflor constitutivo (CaMV) y el terminador de transcripción de sintasa de nopalina (NOS). Un gen de resistencia a la canamicina fue incluido para producir un marcador que se puede seleccionar.

Transformaciones de la Planta Portadas por Agrobacterium: pMON-PJU y un vector de control pMon316 (sin ADN insertado) fueron transferidos a la cepa pTiTT37ASE de Agrobacterium tumefaciens usando un método de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9: páginas 155 a 159), seguido por la colocación en placas LB que contienen la espectinomicina como antibiótico (100 micro gm/ml) y canamicina (50 micro gm/ml). Las colonias resistentes a los antibióticos de Agrobacterium fueron examinadas mediante PCR para asegurar que contenían el plásmido.

Las plantas de Nicotiana tabacum contra Xanthi fueron transformadas con la Agrobacteria transformada pMON-PJU utilizando un sistema de transformación de disco de hoja de Horsch y asociados. (Horsch y asociados, 1995, Science 227: páginas 1229 a 1231). Brevemente, los discos de hoja estéril fueron inoculados y cultivados durante 2 días, y luego transferidos a medios MS selectivos que contienen 100 µg/ml de canamicina y 500 µg/ml de clafaran. Los transformantes fueron confirmados por su capacidad para formar raíces en los medios selectivos.

Generación de Plantas de Tabaco Transqénico GPT: Se permitió que desarrollaran callos los segmentos de hoja estéril en los medios de Murashige & Skoog (M&S) de los cuales se presentaron plantitas transformantes. Estas plantitas fueron entonces transferidas al medio de selección que permite que se formen raíces (medio M&S con canamicina como el agente de selección). Las plantitas de tabaco transformadas saludables, y ahora sembradas, fueron entonces transferidas a la tierra y se permitió que crecieran hasta la madurez y al momento de florecer las plantas fueron auto-fertilizadas y luego las semillas resultantes fueron recolectadas. Durante la etapa de crecimiento las plantas habían sido examinadas por el fenotipo de crecimiento y el índice de fijación de CO2 fue medido para muchas de las plantas transgénicas jóvenes.

Producción de la Generación T1 y T2 de Plantas Transgénicas GPT: Las semillas recolectadas de la generación T0 de las plantas transgénicas de tabaco fueron germinadas en medios M&S con contenido de canamicina (100 mg/L) para enriquecer el transgén. Por lo menos una cuarta parte de las semillas no germinó en este medio (se esperaba que la canamicina inhibiera la germinación de las semillas sin resistencia que habían sido producidas como resultado de la segregación genética normal del gen) y más de la mitad de las semillas restantes fueron removidas debido a la sensibilidad demostrada (todavía suave) a ta canamicina.

Las plantas sobrevivientes (generación ??) fueron desarrollándose y estas plantas entonces se auto-fertilizaron para producir semillas para la generación T2. Las semillas de la generación ?? fueron germinadas en medios S suplementados para las líneas transformantes con canamicina (10 mg/litro). Después de 14 días fueron transferidas a la arena y se les proporcionó una solución de nutrientes de un cuarto de potencia de Hoagland suplementada con 25 mM de nitrato de potasio. Se permitió que crecieran a una temperatura de 24°C con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad con una intensidad de la luz de 900 micromoles por metro cuadrado por segundo. Fueron recolectadas 14 días después de ser transferidas al cultivo en la arena.

Caracterización de las Plantas Transaénicas GPT: Las plantas transgénicas recolectadas (ambos transgenes GPT y transgenes de control del vector) fueron analizadas por la actividad de sintetasa de glutamina en la raíz y las hojas, el peso fresco de la planta completa, la proteína total en la raíz y las hojas, y el índice de fijación de C02 (Knight y asociados, 1988, Plant Physiol. 88: página 333). Las plantas de A. tumefaciens de tipo natural no transformadas fueron también analizadas por los mismos parámetros con el objeto de establecer un control de línea de base.

Los resultados de las características de crecimiento se encuentran tabulados a continuación en la Tabla I. Adicionalmente, una fotografía de la planta transgénica GPT comparada con una planta de control de tipo natural se muestra en la figura 2 (junto con una planta de tabaco transgénica GS1, ver Ejemplo 5). En todos los parámetros evaluados, las plantas de tabaco transgénicas GPT mostraron características de crecimiento aumentadas. En particular, las plantas transgénicas GPT exhibieron más del 50% de aumento en el índice de fijación de C02, y un aumento mayor de dos veces en la actividad de la sintetasa de glutamina en el tejido de las hojas, en relación con las plantas de control de tipo natural. Además, la proporción de GS de hoja a raíz aumentó por casi tres veces en las plantas transgénicas de transaminasa en relación con el control de tipo natural. El peso fresco y la cantidad de proteína total también aumentaron en las plantas transgénicas, en aproximadamente 50% y 80% (hoja), respectivamente, en relación con el control de tipo natural. Estos datos demuestran que las plantas de tabaco que sobre-expresan el transgén GPT de Arabidopsis logran un crecimiento aumentado significativamente e índices aumentados de fijación de C02- Tabla I Datos = promedio de tres plantas De Tipo Natural - Plantas de control; no regeneradas o transformadas.

Líneas PN1 fueron producidas mediante la regeneración después de la transformación utilizando una construcción sin gen insertado. Un control contra los procesos de regeneración y transformación.

Líneas PN9 fueron producidas mediante la regeneración después de la transformación utilizando una construcción con el gen GPT de Arabidopsis.

EJEMPLO 4: GENERACIÓN DE PLANTAS DE TOMATE TRANSGÉNICAS PORTADORAS DEL TRANSGÉN GPT DE ARABIDOPSIS Las plantas transgénicas Lycopersicon esculentum (Tomate Micro-Tom) portadoras del transgén GPT de Arabidopsis fueron generadas utilizando los vectores y métodos descritos en el Ejemplo 3. Las plantas de tomate transgénicas T0 fueron generadas y cultivadas hasta la madurez. Los datos iniciales de características de crecimiento de las plantas de tomate transgénicas GPT se presentan en la Tabla II. Las plantas transgénicas mostraron una mejora importante en el rango de flujo, florecimiento, y rendimiento de la semilla en relación con las plantas de control de tipo natural. Además, las plantas transgénicas desarrollaron múltiples tallos principales, mientras que las plantas de tipo natural desarrollaron un solo tallo principal. Una fotografía de una planta de tomate transgénica GPT comparada con una planta de tipo natural se presenta en la figura 3 (junto con las plantas de tomate transgénicas GS1, ver Ejemplo 6).

TABLA II EJEMPLO 5: GENERACIÓN DE PLANTAS DE TABACO TRANSGENICAS QUE SOBRE-EXPRESAN EL GS1 DE ALFALFA: Generación del Vector de Expresión de la Planta pGS111: Las plantas de tabaco transgénicas que sobre-expresan el gen GS1 de Alfalfa fueron generadas como se describió anteriormente (Temple y asociados, 1993, Mol. Gen. Genetics 236: páginas 315 a 325). Brevemente, el vector de expresión de la planta pGS111 fue construido insertando la secuencia de codificación completa junto con las regiones extensas para las regiones sin traducir 5' y 3' del gen GS1 de Alfalfa [SEQ ID NO: 3] (DasSarma y asociados, 1986. Science, Vol. 232, Emisión 4755, páginas 1242 a 1244) en pMON316 (Rogers y asociados, 1987, mencionado anteriormente), colocando el transgén bajo el control del promotor 35S del virus de mosaico de coliflor constitutivo (CaMV) y el terminador de transcripción de la sintasa de nopalina (NOS). Se incluyó un gen de resistencia a la canamicina para producir un marcador que se puede seleccionar.

Generación de Transformantes GS1: El pGS111 fue transferido a la cepa pTiTT37ASE de Agrobacterium tumefaciens utilizando un acoplamiento tripaternal como lo describieron (Rogers y asociados, 1987, mencionado anteriormente; Unkefer y asociados, Patente Norteamericana No. 6,555,500). Las plantas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi fueron transformadas con el pGS111 transformado de Agrobacteria utilizando el sistema de transformación de disco de la hoja de Horsch y asociados, (Horsch y asociados, 1995, Science 227: páginas 1229 a 1231). Los transformantes fueron seleccionados y regenerados en el medio MS con un contenido de 100 µg/ml de canamicina. Los brotes fueron enraizados en el mismo medio (con canamicina, hormonas ausentes) y transferidos a tierra en macetas: perlita:vermiculita (3:1:1), cultivados hasta la madurez, y se permitió que se auto-fertilizaran. Las semillas fueron recolectadas de esta generación T0, y las generaciones subsecuentes producidas mediante la auto-fertilización y la selección continua con canamicina. Los mejores realizadores de crecimiento fueron utilizados para producir una generación T3 para el cruce con las líneas que sobre-expresan el GPT que funcionan mejor identificadas como se describieron en el Ejemplo 3. Una fotografía de la planta transgénica GS1 comparada con la planta de control de tipo natural se muestra en la figura 2 (junto con la planta de tabaco transgénica GPT, ver Ejemplo 3).

EJEMPLO 6: GENERACIÓN DE PLANTAS DE TOMATE TRANSGÉ NICAS PORTADORAS DEL TRANSGÉN GS1 DE ALFALFA: Las plantas transgénicas de Lycopersicon esculentum (Tomate Micro-Tom) portadoras del transgén GS1 de Alfalfa fueron generadas utilizando el vector descrito en el Ejemplo 5 y un protocolo de transformación esencialmente como lo describieron (Sun y asociados, 2006. Plant Cell Physiol 46(3) páginas 426 a 431). Las plantas de tomate transgénicas T0 fueron generadas y cultivadas hasta la madurez. Los datos característicos de crecimiento inicial de las plantas de tomate transgénicas GPT se presentan en la Tabla III. Las plantas transgénicas mostraron una mejora importante del índice de crecimiento, florecimiento, y rendimiento de la semilla en relación con las plantas de control de tipo natural. Además, las plantas transgénicas desarrollaron múltiples tallos principales, mientras que las plantas de tipo natural desarrollaron un solo tallo principal. Una fotografía de una planta de tomate transgénica GS1 comparada con la planta de tipo natural se presenta en la figura 3 (junto con la planta de tomate transgénica GPT, ver Ejemplo 4).

TABLA III EJEMPLO 7: GENERACIÓN DE PLANTAS DE TABACO TRANSGÉ NICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT: En un esfuerzo para determinar si la combinación de los transgenes GS1 y GPT en una sola planta transgénica podría mejorar el grado hasta el cual crecen y se pueden mejorar otras características agronómicas, fue desarrollado un número de cruces sexuales entre las líneas de alta producción de plantas transgénicas de un solo transgén (GS1 o GPT). Los resultados obtenidos son dramáticos, debido a que estos cruces repetidamente generaron plantas de descendencia que tienen aumentos en los índices de crecimiento sorprendentes y hasta ahora desconocidos, de rendimiento de biomasa, y producción de la semilla.

Materiales v Métodos: Las plantas de tabaco transgénicas de un solo transgén, que sobre-expresan el GPT o GS1 fueron generadas como se describió en los Ejemplos 3 y 4, respectivamente. Varias de las líneas de plantas transgénicas GPT de generación T2 de crecimiento más rápido fueron cruzadas con las líneas de plantas transgénicas GS1 de generación T3 de crecimiento más rápido utilizando los cruces recíprocos. La descendencia entonces fue seleccionada en canamicina con un contenido de medio M&S como se describió en el Ejemplo 3, y fueron examinados su crecimiento, florecimiento y rendimiento de las semillas.

Las extracciones de tejidos para las actividades de los transgenes GPT y GS: la actividad del GPT fue extractada de los tejidos de la planta frescos después de molerlos en 100 mM de Tris-HCI frío, pH 7.6, con un contenido de 1 mm de ácido etilendiamintetra-acético, 200 mM de fosfato de piridoxal y 6 mM de mercaptoetanol en una proporción de 3 mi por gramo de tejido. El extracto fue clarificado mediante centrifugación y utilizado en el ensayo. La actividad de GS fue extractada del tejido fresco de la planta después de molerla en 50 mM de imidazol frío, pH 7.5, con un contenido de 10 mM de MgCI2, y 12.5 mM de mercaptoetanol en una proporción de 3 mi por gramo de tejido. El extracto fue clarificado mediante centrifugación y utilizado en el ensayo. La actividad de GPT fue probada como lo describieron Calderón y Mora, 1985, Journal Bacteriology 161: páginas 807 a 809. La actividad de GS fue medida como lo describieron Shapiro y Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: páginas 910 a 922. Ambos ensayos comprenden una incubación con substratos y un cofactor en el pH apropiado. La detección fue mediante HPLC. Resultados: Los resultados se presentan de dos maneras. Primero, las características de crecimiento específicas son tabuladas en la Tablas IV. A y IV. B (biomasa, rendimientos de la semilla, índice de crecimiento, actividad de GS, actividad de GPT, actividad de 2-oxoglutaramato, etc.). Segundo, las fotografías de las plantas de descendencia y sus hojas se muestran en comparación con las plantas de un solo transgén y de tipo natural y las hojas son presentadas en la figura 5 y la figura 6, las cuales muestran plantas completas mucho más grandes, hojas más grandes, y más rápidas y/o florecimiento más abundante en comparación con las plantas de un solo transgén paterno y las plantas de control de tipo natural.

Haciendo referencia a la Tabla IV. A, las plantas de descendencia de doble transgén que forman estos cruces mostraron aumentos tremendos en la biomasa total (peso fresco), con pesos frescos en un rango de 45 a 89 gramos por planta de descendencia individual, comparados con un rango de solamente 19 a 24 gramos por planta de tipo natural individual, representado un promedio, de aproximadamente dos a tres veces un aumento sobre las plantas de tipo natural, y representando en el extremo alto, un aumento sorprendente de cuatro veces en la biomasa sobre las plantas de tipo natural. Tomando las 24 plantas de descendencia de transgén doble individuales evaluadas, el promedio individual de la biomasa de la planta fue de aproximadamente 2.75 veces que las plantas de control de tipo natural promedio. Cuatro de las líneas de descendencia mostraron aproximadamente un promedio de 2.5 veces mayor por pesos frescos de las plantas, mientras que dos líneas mostraron más de tres veces los pesos frescos en comparación con las plantas de tipo natural.

En comparación con las líneas paternas de un solo transgén, las plantas de descendencia de doble transgén también mostraron bastante más que un mejoramiento del crecimiento aditivo. Mientras que las líneas de un solo transgén GPT mostraron tanto como aproximadamente un aumento del 50% sobre la biomasa de las plantas de tipo natural, y las líneas de un solo transgén GS1 tanto como un 66% de aumento, las plantas de descendencia promediaron casi el 200% de aumento sobre las plantas de tipo natural.

De un modo similar, las plantas de descendencia de doble transgén florecieron más pronto y más prolíficamente después que cualquiera de las plantas de tipo natural o las líneas paternas de un solo transgén, y produjeron un número bastante más grande de vainas de la semilla así como un número total de semillas por planta. Haciendo referencia nuevamente a la Tabla IV. A, en promedio, la descendencia de doble transgén produjo casi dos veces el número de vainas de semillas producidas por las plantas de tipo natural, con dos de las plantas productoras altas generando más de tres veces el número de vainas de semillas comparadas con las de tipo natural. El rendimiento total de las semillas en las plantas de descendencia, medido en una base de peso por planta, se encontraron en un rango de aproximadamente el doble hasta casi el cuádruple del número producido en las plantas de tipo natural.

TABLA IV. A La Tabla IV. B muestra un índice de crecimiento, biomasa y rendimiento, y las características bioquímicas de la Línea XX (Línea 3 auto-fertilizada adicional) comparada con la línea de un solo transgén que expresa el gen GS1 y una planta de tabaco de control de tipo natural. Todos los parámetros han aumentado de manera importante en las plantas transgénicas dobles (Línea XX). De manera notable, la actividad del 2- oxoglutaramato fue casi de 17 veces más alta, y el rendimiento de la semilla y la biomasa del follaje fué tres veces más alta, en las plantas de la Línea XX contra las plantas de control.

TABLA IV. B NM No Medido EJEMPLO 8: GENERACIÓN DE PLANTAS DE PIMENTERO TRANSGÉ NICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT: En este ejemplo, las plantas de chile pimiento Big Jim (variedad de Nuevo México) fueron transformadas con la secuencia de codificación de longitud completa GPT de Arabidopsis de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV, y la secuencia de codificación de GS1 de Arabidopsis de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo, utilizando la transferencia portada por Agrobacterium a las vainas de la semilla. Después de 3 días, las semillas fueron recolectadas y utilizadas para generar plantas T0 y seleccionadas para los transformantes. Las plantas transgénicas dobles resultantes mostraron producciones de vainas más altas, índices de crecimiento más rápido, y mayores rendimientos de la biomasa en comparación con las plantas de control.

Materiales v Métodos: Las plantas de Pimentero Solanaceae Capisicum (variedad "Big Jim") fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis de longitud completa que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión pMON (ver Ejemplo 3), y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201 (promotor de rubisco de tomate rbcS3C: Kyozulka y asociados, 1993, Plant Physiol. 103: páginas 991 a 1000; SEQ ID NO: 22; construcción del vector de la SEQ ID NO: 6), utilizando una transferencia portada por Agrobacterium para las vainas de las semillas.

Por este y todos los ejemplos posteriores, los vectores Cambia 1201 ó 1305.1 fueron construidos de acuerdo con métodos de clonación estándar (Sambrook y asociados, 1989, mencionado anteriormente, Saiki y asociados, 1988, Science 239: páginas 487 a 491). El vector es suministrado con un promotor 35S de CaMV; este promotor fue reemplazado por el promotor RcbS-3C de tomate para controlar la expresión del gen objetivo. Los vectores Cambia 1201 contienen cloramfenicol bacterial y genes marcadores que se pueden seleccionar de resistencia de la planta a la higromicina. Los vectores Cambia 1305.1 contienen cloramfenicol bacterial y genes marcadores que se pueden seleccionar de resistencia a la higromicina.

Los vectores de expresión del pMON (transgén GPT) y pCambia 1201 (transgén GS) fueron transferidos a cepas de LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens separadas de cultivos utilizando métodos de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9: páginas 155 a 159). La Agrobacterium transformada fue seleccionada en medios que contienen 50 µ9/??? de cualquiera de estreptamicina para las construcciones pMON y cloramfenicol para las construcciones Cambia. Las células de Agrobacterium transformadas se cultivaron en medios de cultivo LB con un contenido de 25 µg/ml de antibiótico durante 36 horas. Al final de las 36 horas, se recolectaron las células del período de crecimiento mediante centrifugación y las células de cada transformación se volvieron a suspender en 100 mi de caldo LB sin antibiótico.

Las plantas de pimentero fueron transformadas entonces con una mezcla de las suspensiones de células de Agrobacterium resultantes utilizando un protocolo de transformación en el cual la Agrobacterium es inyectada directamente dentro de la cavidad de las semillas de las vainas que se desarrollan. Brevemente, las vainas que se desarrollan fueron inyectadas con una mezcla de 200 mi con el objeto de inocular las semillas inmaduras con la Agrobacteria esencialmente como lo describen (Wang y Waterhouse, 1997, Plant Mol. Biol. Repórter 15: páginas 209 a 215). Con el objeto de inducir la virulencia de la Agrobacteria y mejorar las eficiencias de transformación, se agregaron 10 µg/ml de acetojeringonona a los cultivos de Agrobacteria antes de las inoculaciones de las vainas (ver, Sheikholeslam y Weeks, 1986, Plant Mol. Biol. 8: páginas 291 a 298).

Utilizando una jeringa, se inyectaron las vainas con una cantidad liberal de la mezcla del vector de Agrobacterium, y se dejaron incubar durante aproximadamente 3 días. Entonces las semillas fueron recolectadas y germinadas, y las plantas en desarrollo observadas por sus características fenotípicas incluyendo el crecimiento y la resistencia al antibiótico. Las plantas portadoras de los transgenes eran verdes, mientras que las plantas no transformadas mostraron signos de clorosis en las puntas de las hojas. Los transformantes de crecimiento vigoroso se cultivaron y fueron comparados con las plantas del pimentero de tipo natural cultivadas bajo condiciones idénticas. Resultados: Los resultados se presentan en la figura 7 y la Tabla V. La figura 7 muestra una fotografía de un pimentero transgénico doble GPT + GS comparado con una planta de control cultivada por el mismo tiempo bajo condiciones idénticas. Esta fotografía muestra un rendimiento tremendo del pimentero en la linea transgénica comparado con la planta de control.

La Tabla V representa el rendimiento de la biomasa y la actividad del GS, así como la genotipificación del transgén, en las líneas transgénicas comparadas con el control de tipo natural. Haciendo referencia a la Tabla V, las plantas de descendencia de transgén doble mostraron aumentos tremendos en la biomasa total (peso fresco), con pesos frescos en un rango de 393 a 662 gramos por planta transgénica individual, comparadas con un promedio de 328 gramos por planta de tipo natural. La línea transgénica A5 produjo más del doble de la biomasa total de los controles. Además, las producciones de pimenteros en las líneas transgénicas fueron mejoradas de manera importante sobre las plantas de tipo natural, y fueron 50% mayores que las plantas de control (en promedio). De manera notable, una de las líneas del transgén produjeron dos veces tantos chiles pimientos como el promedio de las plantas de control.

TABLA V: C REC I MIENTO/BIOM AS A Y REPRODUCCIÓN DE LOS PIMIENTOS TRANSGÉ ICOS Peso Fresco del Producción de Actividad GS Ensayo de Tipo de Planta Follaje, Biomasa, pimenteros, g Umoles/min/g de Presencia del g Peso Seco Peso Fresco Transgén Tipo natural, promedio 328.2 83.7 1.09 Negativo Linea A2 457.3 184.2 1.57 GPT - Si Línea A5 661.7 148.1 1.8 GPT - Si Línea B1 493.4 141.0 1.3 GPT - Si Línea B4 393.1 136.0 1.6 GPT - Si Línea C1 509.4 152.9 1.55 GPT - Si FWt Peso Fresco; DWt Peso Seco.

EJEMPLO 9: GENERACIÓN DE PLANTAS DE FRIJOL TRANSGÉ NICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas de frijol de cera amarilla {Phaseolus vulgaris) fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis de longitud completa codificando la secuencia de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión pCambia 1201, y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201, utilizando la transferencia portada por Agrobacterium en las flores.

Materiales v Métodos: Los vectores de expresión del transgén pCambia 1201-GPT (vector construido de la SEQ IDO: 27) y pCambia 1201-GS (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6) fueron transferidos a cepas de Agrobacterium tumefaciens separadas en cultivos LBA4404 utilizando un método de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9: páginas 155 a 159). La Agrobacterium transformada fue seleccionada en los medios que contienen 50 µ?/?t?? de cloramfenicol. Las células transformadas de Agrobacterium fueron cultivadas en un medio de cultivo LB con un contenido de 25 µ?/??? de antibiótico durante 36 horas. Al final del período de crecimiento de 36 horas, las células fueron recolectadas mediante centrifugación y las células de cada transformación se volvieron a suspender en 100 mi de un caldo LB sin antibiótico.

Las plantas de frijoles entonces fueron transformadas con una mezcla de suspensiones de células de Agrobacterium resultantes utilizando un protocolo de transformación en el cual la Agrobacteria es inyectada directamente dentro de la estructura de la flor (Yasseem, 2009, Plant Mol. Biol. Repórter 27: páginas 20 a 28). Con el objeto de inducir la virulencia de la Agrobacteria y mejorar las eficiencias de transformación, se agregaron 10 µg/m\ de acetojeringonona a los cultivos de Agrobacteria antes de la inoculación a las flores. Brevemente, una vez que florecieron las flores, la estructura externa que encapsula los órganos reproductivos fue abierta ligeramente con unas pinzas con el objeto de permitir la introducción de la mezcla de Agrobacteria, la cual fue agregada a la estructura de la flor en cantidades suficientes para inundar las anteras.

Las plantas fueron cultivadas hasta que las vainas de frijol se desarrollaron, y las semillas fueron recolectadas y utilizadas para generar plantas transgénicas. Las plantas transgénicas entonces fueron cultivadas junto con las plantas de frijol de control bajo condiciones idénticas, fotografiadas y caracterizadas fenotípicamente. Los índices de crecimiento fueron medidos tanto para las plantas transgénicas como las de control. En este y todos los ejemplos, la actividad de la sintetasa de glutamina (GS) fue ensayada de acuerdo con los métodos que se presentan en Shapiro y Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: páginas 910 a 922; y, la actividad de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT) fue ensayada de acuerdo con los métodos de Calderón y asociados, 1985, J. Bacteriol. 161: páginas 807 a 809. Ver los detalles en el Ejemplo 7, Métodos, mencionados anteriormente.

Resultados: Los resultados se presentaron en la figura 8, la figura 9 y la Tabla VI.

La figura 8 muestra los datos de índice de crecimiento de la línea A de frijol transgénico GPT + GS en relación con las plantas de control, incluyendo las alturas de las plantas en diferentes días en cultivo, así como los números de brotes de las flores, flores, y vainas de frijol. Estos datos muestran que las plantas de frijol transgénico doble GPT + GS crecieron más que sus plantas de control de contraparte. Las plantas transgénicas crecieron más altas, florecieron antes y produjeron más brotes de las flores y flores, y desarrollaron vainas de los frijoles y produjeron más vainas de frijol que las plantas de control de tipo natural.

TABLA VI: FRIJOLES TRANSGÉNICOS LÍNEA A WT Tipo Natural; FWt Peso Fresco; NM No Medido La Tabla VI presenta el rendimiento de la vaina de frijol, la actividad GPT y GS, así como la condición de resistencia al antibiótico, en las líneas transgénicas comparadas con el control de tipo natural (promedio de varias plantas de control robustas; las plantas de control que no crecieron bien fueron excluidas del análisis). Haciendo referencia a la Tabla VI, las plantas de descendencia de doble transgén mostraron aumentos substanciales en la biomasa de la vaina de frijol (peso de la vaina fresca) en comparación con las plantas de control, con rendimientos de la biomasa de la vaina de frijol consistentemente arriba de 200 gramos por planta transgénica individual, comparadas con un promedio de 127 gramos por planta de tipo natural, representando más del 60% de aumento en el rendimiento de las vainas en las líneas de transgén doble en relación con las plantas de control.

Finalmente, la figura T muestra una fotografía de las plantas de frijol transgénicas dobles GPT + GS comparadas con una planta de control cultivada en el mismo tiempo y bajo condiciones idénticas, mostrando un crecimiento aumentado en la planta transgénica.

EJEMPLO 10: GENERACIÓN DE PLANTAS DE FRIJOL TRANSGÉNICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 DE ARABIDOPSIS Y GPT DE UVA: En este ejemplo, las plantas de frijol de cera amarilla (Phaseolus vulgaris) fueron transformadas con el GPT de Uva de longitud completa que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 8 bajo el control del promotor RuBisCo con el vector de expresión pCambia 1305.1, y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201, utilizando la transferencia portada por Agrobacterium dentro de las vainas en desarrollo.

Materiales v Métodos: Los vectores de expresión del transgén pCambia 12G1-GPT (uva) (construcción del vector de la SEQ ID NO: 8) y pCambia 1201-GS (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6) fueron transferidas a cultivos de cepas de LBA4404 separadas de Agrobacterium tumefaciens utilizando un método de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9: páginas 155 a 159). Las Agrobacterium transformadas fueron seleccionadas en los medios con un contenido de 50 g/ml de cloramfenicol . Las células de Agrobacterium transformadas fueron cultivadas en un medio de cultivo LB grande con un contenido de 25 µg/ml de antibiótico durante 36 horas. Al final del período de crecimiento de 36 horas, las células fueron recolectadas mediante centrifugación y las células de cada transformación se volvieron a suspender en 100 mi de caldo LB sin antibiótico.

Las plantas de frijol entonces fueron transformadas con una mezcla de las suspensiones de células de Agrobacterium utilizando un protocolo de transformación en el cual la Agrobacteria es inyectada directamente dentro de la estructura de la flor. Con el objeto de inducir la virulencia de la Agrobacteria y mejorar las eficiencias de transformación, se agregaron 10 g ml de acetojeringonona a los cultivos de Agrobacterias antes de la inoculación a la flor. Brevemente, una vez que florecieron las flores, la estructura exterior que encapsula los órganos reproductivos fue ligeramente abierta con pinzas con el objeto de permitir la introducción de la mezcla de Agrobacterias, la cual fue agregada a la estructura de la flor en cantidades suficientes como para inundar las anteras.

Las plantas fueron cultivadas hasta que las vainas de fríjol se desarrollaron, y las semillas fueron recolectadas y utilizadas para generar plantas transgénicas. Las plantas transgénicas entonces fueron cultivadas junto con las plantas de frijol de control bajo condiciones idénticas, fotografiadas y caracterizadas fenotípicamente. Los índices de crecimiento fueron medidos tanto para las plantas transgénicas como para las de control.

Resultados: Los resultados se presentan en la figura 10, figura 11 y la Tabla VII.

La figura 10 muestra los datos del índice de crecimiento de la línea G de frijol transgénico GPT + GS en relación con las plantas de control, incluyendo específicamente los números de brotes de flores, flores, y vainas de frijol. Estos datos muestran que las plantas de frijol transgénicas dobles GPT+GS crecen más que su contraparte de las plantas de control. De manera notable, las plantas transgénicas produjeron substancialmente más vainas de frijol que las plantas de control de tipo natural.

TABLA VII: PLANTAS TRANSGÉNICAS LÍNEA G: RENDIMIENTOS DE LAS VAINAS WT Tipo Natural; FWt Peso Fresco; NM No Medido La Tabla VII presenta que el rendimiento de la vaina de frijol y la condición de resistencia al antibiótico en las líneas transgénicas comparadas con el control de tipo natural (promedio de varias plantas de control robustas; las plantas de control que no crecieron bien fueron excluidas del análisis). Haciendo referencia a la Tabla VII, las plantas de descendencia de transgén doble mostraron aumentos substanciales en la biomasa de la vaina de frijol (peso de la vaina fresca) en comparación con las plantas de control, con rendimientos de la biomasa de la vaina de frijol de 200.5 gramos (línea G1) y 178 gramos (Línea G2) por planta transgénica individual, comparadas con un promedio de 158 gramos por planta individual de tipo natural, representando aproximadamente un aumento del 27% en el rendimiento de las vainas en las líneas del transgén doble en relación con las plantas de control.

Finalmente, la figura 11 muestra una fotografía de una planta de frijol transgénica doble GPT + GS comparada con una planta de control cultivada por el mismo tiempo bajo condiciones idénticas. La planta transgénica muestra aumentos substancialmente en el tamaño y la biomasa, hojas más grandes y un florecimiento más maduro comparado con las plantas de control .

EJEMPLO 11: GENERACIÓN DE PLANTAS DE GUISANTE PINTO (COWPEA) TRANSGÉNICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT DE ARABI DOPSIS: En este aspecto, las plantas de Guisante Pinto (cowpea) fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis de longitud completa que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de C V dentro del vector de expresión pMON, y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201, utilizando la transferencia portada por Agrobacterium en las flores. Los materiales y métodos fueron ¡guales que en el Ejemplo 9, anterior.

Resultados: Los resultados se presentan en las figuras 12 y 13, y la Tabla VI. La figura 12 muestra los índices de crecimiento relativos para los Guisantes Pintos (cowpea) de la línea A transgénicos GPT + GS y el control de tipo natural de Guisantes Pintos (cowpea) en diferentes intervalos durante el cultivo, incluyendo (figura 12A) altura y mediciones de hojas más largas, (figura 12B) hojas de trifolato y brotes de flores, y (figura 12C) flores, brotes de flores y vainas de guisantes. Estos datos muestran que las plantas de Guisantes Pintos (cowpea) transgénicas dobles GPT + GS crecen más que su contraparte de las plantas de control. Las plantas transgénicas crecieron más rápido y más altas, y tuvieron hojas más largas, y establecieron flores y brotes más rápidos que las plantas de control de tipo natural.

TABLA VIII: GUISANTE PINTO (COWPEA) TRANSGÉNICO LÍNEA A WT Tipo Natural; FWt Peso Fresco; NM No Medido La Tabla VIII presenta un rendimiento de la vaina del guisante pinto (cowpea), actividad de GPT y GS, así como condiciones de resistencia a los antibióticos, en las líneas transgénicas comparadas con el control de tipo natural (promedio de varias plantas de control robustas; las plantas de control que no crecieron bien fueron excluidas del análisis). Haciendo referencia a la Tabla VIII, las plantas de descendencia del transgén doble mostraron aumentos substanciales en la biomasa de la vaina de los guisantes (peso de la vaina fresca) en comparación con las plantas de control, con rendimientos de la biomasa promedio de la vaina del guisante de la planta transgénica cercana al 52% mayor que los rendimientos medidos en las plantas de control.

Finalmente, la figura 13 muestra una fotografía de una planta de frijol transgénica doble GPT + GS comparada con la planta de control cultivada por el mismo tiempo bajo condiciones idénticas, mostrando una biomasa aumentada y un rendimiento de los brotes en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural.

EJEMPLO 12: GENERACIÓN DE PLANTAS DE GUISANTES PINTOS (COWPEA) TRANSGÉNICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 DE ARABIDOPSIS Y GPT DE UVA: En este ejemplo, las plantas comunes de Guisantes Pintos {cowpea) fueron transformadas con el GPT de Uva de longitud completa que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 8 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1305.1 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 8), y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6), utilizando la transferencia portada por Agrobacterium dentro de las flores. Los materiales y métodos fueron iguales que en el Ejemplo 11, mencionado anteriormente.

Resultados: Los resultados se presentan en las figuras 14 y 15, y la Tabla IX.

La figura 14 muestra los índices de crecimiento relativos para la línea G de Guisante Pinto (cowpea) transgénico GPT+GS y el Guisante Pinto (cowpea) de control de tipo natural. Estos datos muestran que las plantas transgénicas son consistentemente más altas (figura 14A), producen substancialmente más flores, brotes de flores y vainas de guisantes (figura 14B), y desarrollan trifolatos y brotes de hojas más rápido (figura 14C).

TABLA IX: GUISANTE PINTO (COWPEA) TRANSGENICO LÍNEA G WT Tipo Natural; FWt Peso Fresco; NM No Medido La Tabla IX representa el rendimiento de vainas de guisantes, la actividad de GPT y GS, así como la condición de resistencia a los antibióticos, en las líneas transgénicas comparadas con el control de tipo natural (promedio de varias plantas de control robustas; las plantas de control que no crecieron bien fueron excluidas del análisis). Haciendo referencia a la Tabla IX, las plantas de descendencia de transgén doble mostraron aumentos substanciales en la biomasa de la vaina del guisante (peso fresco de la vaina) en comparación con las plantas de control, con rendimientos promedio de la biomasa de la vaina del guisante 70% mayores en las plantas transgénicas comparadas con las plantas de control.

Finalmente, la figura 15 muestra una fotografía de la planta de guisantes transgénica doble GPT+GS comparada con la planta de control cultivada por el mismo tiempo y bajo condiciones idénticas, mostrando una altura aumentada, un tamaño de la biomasa y la hoja en la planta transgénica en relación con la planta de control de tipo natural.

EJEMPLO 13: GENERACIÓN DE PLANTAS DE ALFALFA TRANSGÉ NICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas de Alfalfa (Medicago sativa, var Ladak) fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis de longitud completa que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión pMON316 (ver el Ejemplo 3, mencionado anteriormente), y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6), utilizando la transferencia portada por Agrobacterium dentro de las plantas del semillero. Los vectores de Agrobacterium y las mezclas fueron preparadas para las inoculaciones del semillero tal y como se describieron en el Ejemplo 11, mencionado anteriormente.

Inoculaciones del Semillero: Cuando los semilleros de Alfalfa todavía tenían una altura menor de aproximadamente 1/2 pulgada (1.27 cm2), fueron enjuagados en toallas de papel que habían sido mojadas con la mezcla de Agrobacteria con un contenido de ambas construcciones del transgén. Los semilleros se dejaron en las toallas de papel durante un período de dos a tres días, se removieron y luego se plantaron en la tierra de macetas. Los resultantes TO y las plantas de control fueron entonces cultivadas por los primeros 30 días en una cámara de crecimiento, y posteriormente cultivadas en un invernadero, y luego recolectadas 42 días después del brote. En este punto, solamente la línea de Alfalfa transgénica mostró flores, ya que las plantas de tipo natural solamente mostraron brotes de flores inmaduras. Las plantas fueron caracterizadas con respecto a la condición de florecimiento y la biomasa total.

Resultados: Los resultados se presentan en la Tabla X. Los datos muestran que las plantas de Alfalfa transgénicas crecieron más rápido, florecieron más rápido, y produjeron en promedio un aumento aproximado de la biomasa del 62% en relación con las plantas de control.

TABLA X: ALFALFA TRANSGÉNICA CONTRA CONTROL EJEMPLO 14: GENERACIÓN DE PLANTAS DE MELÓN (CANTALUPO) TRANSGÉ NICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas de Melón (cantalupo) (Cucumis meló var common) fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis de longitud completa que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión pMON316 (ver Ejemplo 3, mencionado anteriormente), y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 201 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6), utilizando la transferencia portada por Agrobacterium por medio de una inyección dentro de los melones en desarrollo. Los vectores de Agrobacterium y las mezclas fueron preparadas para las inoculaciones dentro del melón como se describe en el Ejemplo 8, mencionado anteriormente. Las inoculaciones dentro de los melones en desarrollo se llevaron a cabo esencialmente como se describieron en el Ejemplo 8. Las plantas fueron caracterizadas de acuerdo a la condición de florecimiento, y la biomasa total en relación con las plantas de melón de control cultivadas bajo condiciones idénticas.

Los resultados se presentan en la figura 16 y la Tabla XI. Haciendo referencia a la Tabla XI, las plantas transgénicas mostraron aumentos substanciales en la biomasa del follaje de la planta en comparación con las plantas de control, con un aumento promedio en la biomasa del 63%. Además, se observó un aumento tremendo en los rendimientos de la flor y los brotes de flor en todas las cinco líneas transgénicas. Las plantas de control no mostraron flores y solamente 5 brotes al momento del sacrificio, en promedio. En contraste completo, las plantas transgénicas mostraron entre 2 y 5 flores por planta, y entre 21 y 30 brotes de flores, por planta, indicando un índice de crecimiento substancialmente más alto y un rendimiento de las flores. El rendimiento aumentado de las flores se esperaría que se tradujera en rendimientos del melón más altos de manera correspondiente en las plantas transgénicas. Haciendo referencia a la figura 16 (una fotografía que compara las plantas de Melón (cantalupo) transgénicas) con las plantas de Melón (cantalupo) de control), las plantas de Melón (cantalupo) transgénicas muestran una altura dramáticamente aumentada, una biomasa general y condición de florecimiento aumentado en relación con las plantas de control.

TABLA XI: MELÓN {CANTALUPO) TRANSGÉNICO CONTRA CONTROL FWt Peso Fresco EJEMPLO 15: GENERACIÓN DE PLANTAS DE CALABAZA TRANSGÉNICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas comunes de Calabazas (Cucúrbita máxima) fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis de longitud completa codificando la secuencia de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión p ON316 (ver Ejemplo 3, mencionado anteriormente), y el GS1 de Arabidopsis que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6), utilizando la transferencia portada por Agrobacterium por medio de inyección dentro de las calabazas en desarrollo, esencialmente como se describieron en el Ejemplo 14, mencionado anteriormente. Las plantas de Calabaza transgénicas y de control fueron cultivadas bajo condiciones idénticas hasta la emergencia de los brotes de flores en las plantas de control, y luego todas las plantas fueron caracterizadas con respecto a la condición de florecimiento y la biomasa total.

Los resultados se presentan en la figura 17 y la Tabla XII.

Haciendo referencia a la Tabla XII, las plantas transgénicas mostraron aumentos substanciales en la biomasa del follaje de la planta en comparación con las plantas de control, con un aumento del rendimiento de la biomasa promedio del 67% sobre las plantas de control. Además, un aumento en los rendimientos de los capullos de la flor fue observado en cuatro de las cinco líneas transgénicas en comparación con el control. Las plantas de control mostraron solamente 4 brotes durante el sacrificio (promedio). En contraste, las cuatro líneas de plantas transgénicas mostraron entre 8 y 15 brotes de flores por planta, representando un aumento del rendimiento de dos a casi cuatro veces.

TABLA XII: CALABAZA TRANSGÉNICA CONTRA CONTROL FWt Peso Fresco; Haciendo referencia a la figura 17 (una fotografía que compara las plantas de calabaza transgénicas con las plantas de control), las plantas de calabaza transgénicas muestran un tamaño de la planta aumentado substancialmente, la biomasa general y los tamaños de las hojas y los números relativos a las plantas de control.

EJEMPLO 16: GENERACIÓN DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS TRANSGÉNICAS DOBLES PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GS1 Y GPT DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas de Arabidopsis thaliana fueron transformadas con el GPT de Arabidopsis truncado que codifica la secuencia de la SEQ ID NO: 18 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión pMON316 (ver Ejemplo 3, mencionado anteriormente), y plantas transgénicas posteriormente transformadas con el GS1 de Arabidopsis que codifica la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6), utilizando la transferencia de "inmersión floral" portada por Agrobacterium como lo describen (Harrison y asociados, 2006, Plant Methods 2: páginas 19 a 23; Clough y Bent, 1998, Plant J. 16: páginas 735 a 743). Los vectores pMON316 de Agrobacterium portadores del GPT y el pCambia 1201 portadores del GS1 fueron preparados como se describió en los Ejemplos 3 y 11, respectivamente.

La transformación de dos cultivos diferentes de Agrobacterium ya sea con una construcción GPT de pMon 316 + Arabidopsis o con una construcción GS de Cambia 1201 + Arabidopsis se hicieron mediante electroporación utilizando el método de Weigel y Glazebrook 2002. La Agrobacterium transformada entonces se cultivó bajo la selección de antibióticos, fue recolectada mediante centrifugación y se volvió a suspender en caldo de LB con antibiótico y fue utilizada en la inmersión floral de la inflorescencia de Arabidopsis. Las plantas florales sumergidas en Arabidopsis fueron tomadas hasta la madurez y luego auto-fertilizadas y las semillas fueron recolectadas. Las semillas de las plantas sumergidas dos veces primero germinadas en un medio con un contenido de 20 ug/ml de canamicina y siguiendo los procedimientos de selección regular los semilleros sobrevivientes fueron transferidos a los medios que contienen 20 ug de higromicina. Las plantas (3) sobrevivientes del proceso de selección en ambos antibióticos fueron auto-fertilizadas y las semillas recolectadas. Las semillas de la generación T1 fueron germinadas en medio MS con un contenido de 20 ug/ml de higromicina y los semilleros sobrevivientes fueron llevados hasta la madurez, auto-fertilizados y las semillas recolectadas. Esta población de semillas de la generación T2 entonces fue utilizada para estudios posteriores de crecimiento.

Los resultados se presentan en la figura 18 y la Tabla XIII.

Haciendo referencia a la Tabla XIII, la cual muestra los datos de 6 plantas de tipo natural y 6 de Arabidopsis transgénicas (promediado), las plantas transgénicas mostraron niveles aumentados tanto de actividad GPT como de GS. La actividad GPT fue más alta por más de veinte veces que las plantas de control. Además, el peso promedio del follaje fresco de las plantas transgénicas fue bastante arriba de cuatro veces del promedio de plantas de control de tipo natural. Una fotografía de plantas de Arabidopsis del transgén joven en comparación con las plantas de Arabidopsis de control de tipo natural crecieron bajo condiciones idénticas y se muestra en la figura 18, y revela un aumento consistente y muy significativo en las plantas transgénicas en relación con las plantas de control.

TABLA XIII: ARABIDOPSIS TRANSGÉNICA CONTRA CONTROL EJEMPLO 17: GENERACIÓN DE PLANTAS DE TOMATE TRANSGÉNICAS PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GPT Y GS1 DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas de tomate (Solanum lycopersicon , variedad "Hacedor de dinero") fueron transformadas con la secuencia de codificación del GPT de Arabidopsis de longitud completa de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor 35S de CMV dentro del vector de expresión pMON316 (ver, Ejemplo 3, mencionado anteriormente), y la secuencia de codificación GS1 de Arabidopsis de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201 (construcción del vector de la SEQ ID NO: 6). Las plantas de tomate transgénicas (GPT) de un solo transgén fueron generadas y cultivadas hasta el florecimiento esencialmente como se describió en el Ejemplo 4. El transgén GS1 de Arabidopsis entonces fue introducido en las plantas TO de un solo transgén utilizando la transferencia portada por Agrobacterium por medio de inyección directamente en las flores (como se describió en el Ejemplo 8). Las plantas de tomate transgénicas y de control fueron cultivadas bajo condiciones idénticas y caracterizadas con respecto a las características del fenotipo de crecimiento. Las plantas transgénicas dobles TO resultantes entonces fueron cultivadas hasta la madurez, fotografiadas junto con las plantas de tomate de control, y caracterizadas de manera fenotípica.

Los resultados se presentan en la figura 19 y en la Tabla IXX. Haciendo referencia a la Tabla IXX, las plantas de tomate de doble transgén mostraron aumentos substanciales en la biomasa del follaje de la planta en comparación con las plantas de control, con un aumento en el rendimiento de la biomasa promedio del 45% sobre el control. Además, se observó un aumento de tanto como el 70% en la producción del fruto de tomate en las líneas transgénicas comparadas con las plantas de control (por ejemplo, 51 tomates recolectados de la Línea 4C, contra y un promedio de aproximadamente 30 tomates de las plantas de control). Un nivel mucho más alto de actividad GPT fue observado en las plantas transgénicas (por ejemplo, mostrando la línea 4C aproximadamente una actividad de GPT de 32 veces más alta en comparación con la actividad GPT promedio medida en las plantas de control). La actividad GS fue también más alta en las plantas transgénicas en relación con las plantas de control (casi el doble en la Línea 4C).

Con respecto al fenotipo de crecimiento, y haciendo referencia a la figura 19, las plantas transgénicas de tomate mostraron substancialmente hojas más grandes comparadas con las plantas de control (figura 19A). Además, se puede observar que las plantas transgénicas de tomate fueron substancialmente más grandes, más altas y de una biomasa general mayor (ver figura 19B).

TABLA IXX: CRECIMIENTO Y REPRODUCCIÓN DE TOMATE TRANSGÉNICO Tomates Peso Fresco Totales Actividad GPT Actividad GS Ensayo de Tipo de Planta Follaje Recolectados nmoles/h/Peso umoles/mi n Presencia del Biomasa, g Hasta el Fresco, g (Peso fresco, g Transgén Sacrifcio Tipo natural, 891 30.2 287 14.27 Negativo promedio Línea 6C 1288 43 9181 18.3 .+ Línea 4C 1146 51 1718 26.4 .+ EJEMPLO 18: GENERACIÓN DE PLANTAS DE MOSTAZA (CAMELINA) TRANSGÉ NICAS PORTADORAS DE LOS TRANSGENES GPT Y GS1 DE ARABIDOPSIS: En este ejemplo, las plantas de Mostaza (camelina) (Camelina sativa, Var MT 303) fueron transformadas con la secuencia de codificación GPT de Arabidopsis de longitud completa de la SEQ ID NO: 1 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201, y la secuencia de codificación GS1 de Arabidopsis de la SEQ ID NO: 6 bajo el control del promotor RuBisCo dentro del vector de expresión pCambia 1201, utilizando la transferencia portada por Agrobacterium en las semillas en germinación de acuerdo con el método descrito por Chee y asociados, 989, Plant Physiol. 91: páginas 1212 a 1218. Los vectores de Agrobacterium y las mezclas fueron preparadas para las inoculaciones de las semillas tal y como se describió en el Ejemplo 11, mencionado anteriormente.

Las plantas de Mostaza (camelina) transgénicas y de control se cultivaron bajo condiciones idénticas (30 días en una cámara de crecimiento y luego fueron movidas a un cultivo en un invernadero) durante 39 días, y fueron caracterizadas con respecto a la biomasa, características de crecimiento y etapa de florecimiento.

Los resultados se presentan en la Tabla XX y la figura 20. Haciendo referencia a la Tabla XX, se puede observar que la biomasa de las plantas transgénicas fue, en promedio, casi el doble que la biomasa de la planta de control. El diámetro del toldo también fue significativamente mejorado en las plantas transgénicas. La figura 20 muestra una fotografía de la Mostaza (camelina) transgénica comparada con el control. La planta transgénica es notablemente más grande y muestra una condición de florecimiento más avanzada.

TABLA XX: MOSTAZA (CAMELINA) TRANSGÉNICA CONTRA CONTROL EJEMPLO 19: ACTIVIDAD DEL TRANSGÉN GPT DE CEBADA EN LA PLANTA En este ejemplo, la secuencia de codificación putativa del GPT de Cebada fue aislada y expresada a partir de una construcción de un transgén utilizando un ensayo de expresión transitorio en la planta. El GPT de Cebada recombinante biológicamente activo fue producido, y catalizó la síntesis aumentada del 2-oxoglutaramato, como lo confirma el HPLC.

La secuencia de codificación del GPT de Cebada (Hordeum vulgare) fue determinada y sintetizada. La secuencia de ADN de la secuencia de codificación del GPT de Cebada fue utilizada en este ejemplo y se proporciona en la SEQ ID NO: 14, y la secuencia de aminoácidos de la proteína GPT codificada es presentada en la SEQ ID NO: 15.

La secuencia de codificación del GPT de Cebada fue insertada en un vector Cambia 1305.1, y transferida a la cepa LBA404 de Agrobacterium tumefaciens utilizando un método de electroporación estándar (McCormac y asociados, 1998, Molecular Biotechnology 9: páginas 155 a 159), seguido por la colocación en placas LB con un contenido de higromicina (50 micro gm/ml). Las colonias resistentes al antibiótico de Agrobacterium fueron seleccionadas para el análisis.

El ensayo de expresión transitoria de la hoja de tabaco consistió en inyectar una suspensión de la Agrobacterium transformada (1.5-2.0 DE 650) en las hojas de tabaco que crecen rápidamente. Las inyecciones intradérmicas se hicieron en una rejilla a lo ancho de la superficie de la hoja para asegurar que una cantidad importante de la superficie de la hoja sería expuesta a la Agrobacterium. La planta entonces se permitió crecer durante 3 a 5 días cuando el tejido fue extraído como se describió para otras extracciones de tejidos y fue medida la actividad de GPT.

La actividad del GPT en tejidos de la hoja inoculada (1217 nanomoles/gPeso Fresco/h) fue de tres veces el nivel medido en el tejido de la hoja de la planta de control (407 nanomoles/g Peso Fresco/h), indicando que la construcción del GPT de Hordeum puede dirigir la expresión del GPT funcional en una planta transgénica.

EJEMPLO 20: AISLAMIENTO Y EXPRESIÓN DE LA SECUENCIA DE CODIFICACIÓN DEL GEN GPT RECOMBINANTE DE ARROZ Y ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA: En este ejemplo, la secuencia de codificación putativa para el GPT de arroz fue aislada y expresada en E. coli. El GPT de arroz recombinante biológicamente activo fue producido, y catalizando la síntesis aumentada del 2-oxoglutaramato, confirmado por el HPLC.

Materiales y Métodos: Secuencia de codificación GPT de arroz y expresión en E. coli: La secuencia de codificación GPT de arroz (Oryza sativia) fue determinada y sintetizada insertada dentro del vector PET28, y expresada en E. coli. Brevemente, las células de E. coli fueron transformadas con el vector de expresión y los transformantes cultivados durante la noche en caldo LB diluidos y cultivados hasta la expresión OD 0.4, inducida con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), cultivadas durante 3 horas y recolectadas. Un total de 25 X 106 células fueron entonces probadas por su actividad biológica utilizando el ensayo RMN, siguiente. Las células de E. coli de tipo natural sin transformar fueron probadas como control. Un control adicional utilizó células de E. coli transformadas con un vector vacio.

La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GPT de arroz utilizada en este ejemplo se proporciona en la SEQ ID NO: 10, y la secuencia de aminoácidos de la proteína GPT codificada es presentada en la SEQ ID NO: 11.

Ensayo HPLC para el 2-oxoqlutaramato: La HPLC fue utilizada para determinar la producción del 2-oxoglutaramato en la sobre-expresión del GPT en las células de E. coli, después de una modificación del artículo de Calderón y asociados, 1985, J Bacteriol 161(2): páginas 807 a 809. Brevemente, se utilizó un regulador de extracción modificado consistente de 25 mM de Tris-HCI, pH 8.5, 1 mM de EDTA, 20 µ? de Piridoxal fosfato, 10 mM de Cisteína, y -1.5% (v/v) de Mercaptoetanol. Las muestras (Usado de células de E. coli, 25 X 106 células) fueron agregadas al regulador de extracción en una proporción de aproximadamente 1/3 (p/v), incubadas durante 30 minutos a una temperatura de 37°C, y detenidas con 200 µ? de TCA al 20%. Después de aproximadamente 5 minutos, la mezcla del ensayo es centrifugada y el sobrenadante utilizado para cuantificar por HPLC el 2-oxoglutaramato, utilizando una columna L ION-300 de 7.8 mm de diámetro interior X 30 cm, con una fase móvil en h2S04 0.01 N, un rango de flujo de aproximadamente 0.2 ml/min, a una temperatura de 40°C. El volumen de inyección es de aproximadamente 20 µ?, y el tiempo de retención entre aproximadamente 38 y 39 minutos. La detección es lograda con 210 nm de luz UV.

La comparación del análisis RMN con el 2-oxoglutaramato auténtico fue utilizada para establecer que la secuencia de longitud completa de Arabidopsis expresa un GPT con actividad de síntesis del 2-oxoglutaramato. Brevemente, el 2-oxoglutaramato auténtico (estructura confirmada con RMN) hecho por síntesis química para validar el ensayo HPLC anterior, confirmando que el producto del ensayo (molécula sintetizada en respuesta al GPT expresado) y el 2-oxoglutaramato auténtico eluye en el mismo tiempo de retención. Además, cuando se mezclan juntos, el producto del ensayo y el compuesto auténtico se eluyen como un solo pico. Además, la validación del ensayo HPLC también incluyó el monitoreo de la desaparición de la glutamina del substrato mostrando que existía una estequiometría molar de 1:1 entre la glutamina consumida para el 2-oxoglutaramato producido. El procedimiento de ensayo siempre incluyó dos controles, uno sin enzima agregada y el otro con la glutamina agregada. El primero muestra que la producción del 2-oxoglutaramato dependía de tener la enzima presente, y el segundo muestra que la producción del 2-oxoglutaramato dependía de la glutamina en el substrato.

Resultados: La expresión de la secuencia de codificación GPT de arroz de la SEQ ID NO: 10 dio como resultado la sobre-expresión de la proteína GPT recombinante que tiene una bioactividad de catalización de síntesis de 2-oxoglutaramato. Específicamente, se observaron 1.72 nanomoles de actividad del 2-oxoglutaramato en las células de E. coli sobre-expresando el GPT de arroz recombinante, comparado con solamente 0.02 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato en las células E. coli de control, un aumento del nivel de actividad de 86 veces sobre el control.

EJEMPLO 21: AISLAMIENTO Y EXPRESIÓN DE LA SECUENCIA DE CODIFICACIÓN DEL GEN GPT DE FRIJOL DE SOYA Y ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, la secuencia de codificación putativa del GPT de frijol de soya fue aislada y expresada en E. coli. El GPT de frijol de soya recombinante biológicamente activo fue producido, y se catalizó la síntesis aumentada del 2-oxoglutaramato, como lo confirma el HPLC.

Materiales v Métodos: Secuencia de codificación GPT de frijol de soya v expresión en E. coli: La secuencia de codificación GPT de frijol de soya (Glicina max) fue determinada y sintetizada, injertada dentro del vector PET28, y expresada en E. coli. Brevemente, las células de E. coli fueron transformadas con el vector de expresión y los transformantes cultivados durante la noche en un caldo de LB diluido y cultivado hasta la expresión de OD 0.4, inducida con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), cultivada durante 3 horas y recolectada. Un total de 25 X 10 células fueron probadas entonces por su actividad biológica utilizando el ensayo RMN, anterior. Las células de E. coli de tipo natural sin transformar fueron ensayadas como control. Un control adicional utilizó las células de E. coli transformadas con un vector vacío.

La secuencia de ADN de la secuencia de codificación GPT de frijol de soya utilizada en este ejemplo se proporciona en la SEQ ID NO: 12, y la secuencia de aminoácidos de la proteína GPT codificada se presenta en la SEQ ID NO: 13.

Ensayo HPLC para el 2-oxoglutaramato: La HPLC fue utilizada para determinar la producción de 2-oxoglutaramato en las células de E. coli que sobre-expresan el GPT como se describió en el Ejemplo 20, mencionado anteriormente.

Resultados: La expresión de la secuencia de codificación del GPT de frijol de soya de la SEQ ID NO: 12 dio como resultado la sobre-expresión de la proteína GPT recombinante que tiene bioactividad de catalización de síntesis del 2-oxoglutaramato. Específicamente, la actividad de 31.9 nanomoles del 2-oxoglutaramato fue observada en las células de E. coli, que sobre-expresan el GPT de frijol de soya recombinante, comparado con solamente 0.02 nanomoles de actividad del 2-oxoglutaramato en las células E. coli de control, un aumento en el nivel de actividad cercano a las 1,600 veces sobre el control. EJEMPLO 22: AISLAMIENTO Y EXPRESIÓN DE LA SECUENCIA DE CODIFICACIÓN DEL GEN GPT EN EL PEZ CEBRA Y ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, la secuencia de codificación putativa del GPT del Pez Cebra fue aislada y expresada en E. coli. Se produjo el GPT de Pez Cebra recombinante biológicamente activo, y se catalizó la síntesis aumentada del 2-oxoglutaramato, como lo confirma el análisis RMN.

Materiales y Métodos: Secuencia de codificación del GPT del Pez Cebra v expresión en E. coli: La secuencia de codificación del GPT del Pez Cebra (Danio rerio) fue determinada y sintetizada, insertada en el vector PET28, y expresada en E. coli. Brevemente, las células de E. coli fueron transformadas con el vector de expresión y los transformantes cultivados durante la noche en un caldo de LB diluido y cultivado hasta la expresión de OD 0.4, inducida con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), cultivado durante 3 horas y recolectado. Un total de 25 X 106 células fueron entonces ensayadas por su actividad biológica utilizando el ensayo RMN, que se muestra más adelante. Las células de E. coli de tipo natural sin transformar fueron ensayadas como control. Un control adicional utilizó células de E. coli transformadas con un vector vacío.

La secuencia del ADN de la secuencia de codificación del GPT del Pez Cebra utilizada en este ejemplo es proporcionada en la SEQ ID NO: 16, y la secuencia de aminoácidos de la proteína GPT codificada es presentada en la SEQ ID NO: 17. Ensayo HPLC para el 2-oxoqlutaramato: La HPLC fue utilizada para determinar la producción del 2-oxoglutaramato en las células de E. coli que sobre-expresan el GPT, como se describe en el Ejemplo 20, mencionado anteriormente.

Resultados: La expresión de la secuencia de codificación del GPT de Pez Cebra de la SEQ ID NO: 16 dio como resultado la sobre-expresión de la proteína GPT recombinante que tiene bioactividad de catalización de síntesis del 2-oxoglutaramato. Específicamente, se observaron 28.6 nanomoles de actividad del 2-oxoglutaramato en las células de E. coli sobre-expresando el GPT de Pez Cebra recombinante, comparado con solamente 0.02 nanomoles de actividad del 2-oxoglutaramato en las células de control, y un aumento en el nivel de actividad mayor de 1,400 veces superior al control.

EJEMPLO 23: GENERACIÓN Y EXPRESIÓN DE LAS SECUENCIAS DE CODIFICACIÓN DEL GEN GPT TRUNCADAS DE ARABIDOPSIS Y ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA En este ejemplo, se diseñaron dos truncaciones diferentes de la secuencia de codificación de GPT de Arabidopsis y se expresaron en E. coli, con el objeto de evaluar la actividad de las proteínas GPT en las cuales el péptido de señal de cloroplasto putativo está ausente o truncado. Las proteínas GPT truncadas recombinantes correspondientes a la secuencia de aminoácidos del GPT de Arabidopsis de longitud completa de la SEQ ID NO: 1, truncadas para eliminar ya sea los primeros 30 residuos de aminoácidos de la terminal amino, o los primeros 45 residuos de aminoácidos de la terminal amino, fueron sucesivamente expresados y mostraron actividad biológica en la catalización de la síntesis aumentada del 2-oxoglutaramato, confirmado mediante RMN.

Materiales y Métodos: Secuencia de codificación del GPT de Arabidopsis truncada v expresión en E. coli: La secuencia de codificación de ADN de una truncación de la secuencia de codificación del GPT de Arabidopsis thaliana de la SEQ ID NO: 1 fue diseñada, sintetizada, insertada en un vector PET28, y expresada en E. coli. La secuencia de ADN de la secuencia de codificación del GPT de Arabidopsis truncado utilizado en este ejemplo se proporciona en la SEQ ID NO: 20 (construcción -45 AA), y la secuencia de aminoácidos de la proteína GPT truncada correspondiente se proporciona en la SEQ ID NO: 21. Brevemente, las células de E. coli fueron transformadas con el vector de expresión y los transformantes cultivados durante la noche en un caldo de LB diluido y cultivado hasta la expresión de OD 0.4, inducida con isopropil-B-D-tiogalactosida (0.4 micromolar), cultivadas durante 3 horas y recolectadas. Un total de 25 X 106 células fueron entonces ensayadas por su actividad biológica utilizando la HPLC como se describió en el Ejemplo 20. Las células de E. coli de tipo natural no transformadas fueron probadas como control. Un control adicional utilizó células de E. coli transformadas con un vector vacío.

La expresión de la secuencia de codificación -45 del GPT de Arabidopsis de la SEQ ID NO: 20 dio como resultado la sobre-expresión de la proteína GPT recombinante biológicamente activa (bioactividad de catalización-síntesis de 2-oxoglutaramato). Específicamente, se observaron 16.1 nanomoles de actividad del 2-oxoglutaramato en las células de E. coli que sobre-expresan el -45 del GPT truncado, comparados con solamente 0.02 nanomoles de actividad del 2-oxoglutaramato en las células de E. coli de control, un aumento en el nivel de actividad mayor de 800 veces sobre el control. Para comparación, La secuencia de codificación del gen de Arabidopsis de longitud completa expresada en el mismo ensayo de E. coli generó 2.8 nanomoles de actividad de 2-oxoglutaramato, o simplemente menos de una quinta parte de la actividad observada de la proteína GPT recombinante truncada. EJEMPLO 24: GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE TABACO TRANSGÉNICO GPT + GS QUE TOLERA ALTAS CONCENTRACIONES DE SAL En este ejemplo, las semillas de las líneas XX-3 de tabaco de doble transgén (Cruce 3 en la Tabla 4, ver Ejemplo 7) fueron probadas en un ensayo de germinación de semillas diseñado para evaluar la tolerancia a las concentraciones de alta sal. Materiales v Métodos: Las semillas de tabaco de las poblaciones XX-3 y de tipo natural fueron esterilizadas en la superficie (solución de blanqueador al 5% durante 5 minutos seguido por un lavado de etanol al 10% durante 3 minutos) y fueron enjuagadas con agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas en la superficie entonces fueron dispersadas en un medio Murashige y Skoog (agarosa al 10%) sin sacarosa y conteniendo ya sea 0 ó 200 mM de NaCI. Se permitió que las semillas germinaran en la oscuridad durante 2 días seguido por 6 días bajo un fotoperíodo de 16:8 a una temperatura de 24°C. En el día ocho, la cantidad de germinación fue determinada midiendo el porcentaje de semillas de las plantas de control y transgénicas que habían germinado.

Resultados: Los resultados son tabulados en la Tabla XXI siguiente. La cantidad de germinación de la línea de semillas de las plantas transgénicas bajo condiciones de cero sal fue la misma a la observada con las semillas de la planta de control de tipo natural. En completo contraste, el índice de germinación de las semillas de la línea de plantas transgénicas bajo condiciones de muy alta sal excedieron bastante la cantidad observada en las semillas de control de tipo natural. Mientras tanto, más del 81% de las semillas de las plantas transgénicas habían germinado bajo condiciones de alta sal, y solamente aproximadamente el 9% de las semillas de las plantas de control de tipo natural habían germinado para el mismo punto de tiempo. Estos datos indican que las semillas transgénicas tienen la capacidad de germinar muy bien bajo concentraciones altas de sal, una característica importante para el crecimiento de las plantas en áreas de salinidad de la tierra y/o de creciente salinidad en el agua.

TABLA XXI: PLANTAS DE TABACO TRANSGÉNICAS QUE GERMINAN Y TOLERAN LA ALTA SAL Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en esta descripción están incorporadas como referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual fueran específicamente e individualmente indicadas para ser incorporadas como referencia.

La presente invención no deberá ser limitada en su alcance por las modalidades aquí descritas, las cuales pretenden ilustraciones solas de los aspectos individuales de la administración, y cualquiera de los cuales son funcionalmente equivalentes y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán por la descripción y enseñanzas anteriores, que se le pueden hacer varias modificaciones a los modelos y métodos de la invención, además de los aquí descritos, y que pretenden de un modo similar encontrarse dentro del alcance de la presente invención. Dichas modificaciones u otras modalidades pueden ser practicadas sin salirse del alcance y espíritu reales de la presente invención.

TABLA DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:1 Secuencia de codificación de ADN transaminasa de fenilpiruvato de glutamina de Arabidopsis: ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTC TTCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTAT CGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGT CCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAG CATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTC GACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAA ACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGC GGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTAC ATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGG TGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTA TGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCC CTTTGGMGAGCTTAMGCTGCGGTAÁCTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGA ACACTCCGGACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACC ATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACG ATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTA TGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATG GAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAG CACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTG CAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATG TGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCC CATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGA ACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCC CAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTG CGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAG AAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEQ ID NO:2 Secuencia de aminoácido GPT de Arabidopsis YLDINGVMIKQFSFKASLLPFSSNFRQSSAKIHRPIGAT TTVSTQNESTQKPVQV AKRLEKF TTIFTQMSILAVKHGAIIMLGQGFPNFOGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYAR YGIPQL SAIAARFREDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFY DSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTRE ELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFE DHISIASLPGMYERTVT NSLGKTFSLTG WKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVK KETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADHTPFG ENDVAFCEYLIEEVGWAIPTSVF YLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV SEQ ID N0:3 Secuencia de codificación de ADN de GS1 de alfalfa (cuadro superior) con secuencias 5' y 3' sin traducir (indicados en el cuadro inferior). atttccgttttcgttttcatttgattcattgaatcaaatcgaatcgaatctttaggáttcaatacag attccttagattttactaagtttgaaaccaaaáccaaaacATGTCTCTCCTTTCAGAT CTTATCAACCTTGACCTCTCCGAAACCACCGAGAAAATCATCGCCG AATACATATGGATTGGTGGATCTGGTTTGGACTTGAGGAGCAAAGC AAGGACTCTACCAGGACCAGTTACTGACCCTTCACAGCTTCCCAAG TGGAACTATGATGGTTCCAGCACAGGTCAAGCTCCTGGAGAAGAT AGTGAAGTTATTATCTACCCACAAGCCATTTTCAAGGACCCATTTA GAAGGGGTAACAATATCTTGGTTATGTGTGATGCATACACTCCAGC TGGAGAGCCCATTCCCACCAACAAGAGACATGCAGCTGCCAAGAT TTTCAGCCATCCTGATGTTGTTGCTGAAGTACCATGGTATGGTATT GAGCAAGAATACACCTTGTTGCAGAAAGACATCAATTGGCCTCTTG GTTGGCCAGTTGGTGGTTTTCCTGGACCTCAGGGACCATACTATTG TGGAGCTGGTGCTGACAAGGCATTTGGCCGTGACATTGTTGACTC ACATTACAAAGCCTGTCTTTATGCCGGCATCAACATCAGTGGAÁTC AATGGTGAAGTGATGCCTGGTCAATGGGAATTCCAAGTTGGTCCCT CAGTTGGTATCTCTGCTGGTGATGAGATATGGGTTGCTCGTTACAT TTTGGAGAGGATCACTGAGGTTGCTGGTGTGGTGCTTTCCTTTGAC CCAAAACCAATTAAGGGTGATTGGAATGGTGCTGGTGCTCACACAA ATTACAGCACCAAGTCTATGAGAGAAGATGGTGGCTATGAAGTCAT CTTGAAAGCAATTGAGAAGCTTGGGAAGAAGCACAAGGAGCACAT TGCTGCTTATGGAGAAGGCAACGAGCGTAGATTGACAGGGCGACA TGAGACAGCTGACATTAACACCTTCTTATGGGGTGTTGCAAACCGT GGTGCGTCGATTAGAGTTGGAAGGGACACAGAGAAAGCAGGGAAA GGTTATTTCGAGGATAGGAGGCCATCATCTAACATGGATCCATATG TTGTTACTTCCATGATTGCAGACACCACCATTCTCTGGAAACCATA Agccaccacacacacatgcattgaagtatttgaaagtcattgttgattccgcattagaatttgg tcattgttttttctaggatttggatttgtgttattgttatggttcacactttgtttgtttgaatttgaggc cttgttataggtttcatatttctttctcttgttctaagtaaatgteagaataataatgtaat SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácido de GS1 de alfalfa MSLLSDLINLDLSETTEKHAEYIWIGGSGLDLRSKARTLPGPVTDPSQLPKWNYDGS STGQAPGEDSEVIIYPQAIFKDPFRRGNNILV CDAYTPAGEPIPTNKRHAAAKIFSH PDWAEVPWYGIEQEYTLLQKDINWPLGWPVGGFPGPQGPYYCGAGADKAFGRDI VDSHYKACLYAGINISGINGEV PGQWEFQVGPSVGISAGDEIWVARYILERITEVA GWLSFDPKPIKGDWNGAGAHTNYSTKS REDGGYEVILKAIEKLGKKHKEHIAAYG EGNERRLtGRHETADINTFLVVGVANRGASIRVGRDTEKAGKGYFEDRRPSSNMDP YVVTSMIADTTIL KP SEQ ID NO:5 Secuencia de codificación de ADN de GS1 alfalfa (cuadro superior) con secuencias 5' y 3' sin traducir (indicadas en el cuadro inferior) secuencias del vector de Clal a Smal/Sspl y Sspl/Smal a Sall/Xhol (cuadro inferior, subrayado). atcqatgaattcqaqctcqqtacccatttccqttttcqttttcatttaattcattaaatcaaatCQa atcgaatctttaggattcaatacagattccttagattttactaagtttgaaaccaaaaccaaaa cATGTCTCTCCTTTCAGATCTTATCAACCTTGACCTCTCCGAAACCA CCGAGAAAATCATCGCCGAATACATATGGATTGGTGGATCTGGTTT GGACTTGAGGAGCAAAGCAAGGACTCTACCAGGACCAGTTACTGA CCCTTC ACAGCTTCCCAAGTGGAACTATGATGGTTCCAGCACAGGT CAAGCTCCTGGAGAAGATAGTGAAGTTATTATCTACCCACAAGCCA TTTTCAAGGACCCATTTAGAAGGGGTAACAATATCTTGGTTATGTG TGATGCATACACTCCAGCTGGAGAGCCCATTCCCACCAACAAGAG ACATGCAGCTGCCAAGATTTTCAGCCATCCTGATGTTGTTGCTGAA GTACCATGGTATGGTATTGAGCAAGAATACACCTTGTTGCAGAAAG ACATCAATTGGCCTCTTGGTTGGCCAGTTGGTGGTTTTCCTGGACC TCAGGGACCATACTATTGTGGAGCTGGTGCTGACAAGGCATTTGG CCGTGACATTGTTGACTCACATTACAAAGCCTGTCTTTATGCCGGC ATCAACATCAGTGGAATCAATGGTGAAGTGATGCCTGGTCAATGGG AATTCCAAGTTGGTCCCTCAGTTGGTATCTCTGCTGGTGATGAGAT ATGGGTTGCTCGTTACATTTTGGAGAGGATCACTGAGGTTGCTGGT GTGGTGCTTTCCTTTGACCCAAAACCAATTAAGGGTGATTGGAATG GTGCTGGTGCTCACACAAATTACAGCACCAAGTCTATGAGAGAAGA TGGTGGCTATGAAGTCATCTTGAAAGCAATTGAGAAGCTTGGGAAG AAGCACAAGGAGCACATTGCTGCTTATGGAGAAGGCAACGAGCGT AGATTGACAGGGCGACATGAGACAGCTGACATTAAC ACCTTCTTAT GGGGTGTTGCAAACCGTGGTGCGTCGATTAGAGTTGGAAGGGACA CAGAGAAAGCAGGGAAAGGTTATTTCGAGGATAGGAGGCCATCAT CTAACATGGATCCATATGTTGTTACTTCCATGATTGCAGACACCAC CATTCTCTGGAAACCATAAgccaccacacacacatgcattgaagtatttgaaagtc attgttgattccgcattagaatttggtcattgttttttctaggatttggatttgtgttattgttatggttc acactttgtttgtttgaatttgaggccttgttataggtttcatatttctttctcttgttctaagtaaatg tcaqaataataatqtaatq qqatcctctagaqtcqag SEQ ID NO:6 Secuencia de codificación de GS1 de Arabidopsis vector Cambia 1201 + rbcS3C+GS1 de arabidopsis, ATG en negritas es el sitio de inicio.

AAAA GAAAAAAAA CATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGG ACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCAC AAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCG TTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTA ACCAATTATTTCAGCACCATGTCTCTGCTCTCAGATCTCGTTAACCTCAACCTCA CCGATGCCACCGGGAAAATCATCGCCGAATACATATGGATCGGTGGATCTGGA ATGGATATCAGAAGCAAAGCCAGGACACTACCAGGACCAGTGACTGATCCATCA AAGCTTCCCAAGTGGAACTACGAGGGATCCAGCACCGGTCAGGCTGCTGGAGA AGACAGTGAAGTCATTCTATACCCTCAGGCAATATTCAAGGATCCCTTCAGGAAA GGCAACAACATCCTGGTGATGTGTGATGCTTACAGACCAGCTGGTGATCCTATT CCAACCAACAAGAGGCACAACGCTGCTAAGATCTTCAGCCACCCCGACG1FTGC CMGGAGGAGCCTTGGTATGGGATTGAGCAAGAATACACTTTGATGCAAAAGGA TGTGAACTGGCCAATTGGTTGGCCTGTTGGTGGCTACCCTGGCCCTCAGGGAC CTTACTACTGTGGTGTGGGAGCTGACAAAGCCATTGGTCGTGACATTGTGGATG CTCACTACAAGGCCTGTCTTTACGCCGGTATTGGTATTTCTGGTATCAATGGAGA AGTCATGCCAGGCCAGTGGGAGTTCCAAGTCGGCCCTGTTGAGGGTATTAGTT CTGGTGATCAAGTCTGGGTTGCTCGATACCTTCTCGAGAGGATCACTGAGATCT CTGGTGTAATTGTCAGCTTCGACCCGAAACCAGTCCCGGGTGACTGGAATGGA GCTGGAGCTCACTGCAACTACAGCACTAAGACAATGAGAAACGATGGAGGATTA GAAGTGATCAAGAAAGCGATAGGGAAGCTTCAGCTGAAACACAAAGAACACATT GCTGCTTACGGTGAAGGAAACGAGCGTCGTCTCACTGGAAAGCACGAAACCGC AGAGATCAACACATTCTCTTGGGGAGTCGCGAACGGTGGAGCGTCAGTGAGAG TGGGACGTGACACAGAGAAGGAAGGTAAAGGGTACTTCGAAGACAGAAGGCCA GCTTCTAACATGGATCCTTACGTTGTCACCTCGATGATCGCTGAGACGACCATA CTCGGTTGA SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácido GS1 de Arabidop secuencias del Vector en la terminal-N en cursivas M DLRAfífírSMSLLSDLVNLNLTDATGKIIAEYI lGGSGMDIRSKARTLPGPVTDPS KLPKWNYDGSSTGQAAGEOSEVILYPQAIFKDPFRKGNNILV CDAYTPAGDPIPTN KRHNAAKIFSHPDVAKEEPWYGIEQEYTL QKDVNWPIGWPVGGYPGPQGPYYC GVGADKAIGRDIVDAHYKACLYAGIGISGINGEVMPGQWEFQVGPVEGISSGDQVW ARYLLERltEISGVIVSFDPKPVPGDWNGAGAHCNYSTKT RNDGGLEVIKKAiGK LQLKHKEHIAAYGEGNERRLTGKHETADINTFSWGVANRGASVRVGRDTEKEGKG YFEDRRPASNMDPYWTS IAETTILG SEQ ID NO:8 Secuencia de ADN GPT de Uva que Muestra el Vector Cambia 1305.1 con (el extremo 3') de rbcS3C + Vitis (Uva). El ATG en negritas es el sitio de inicio, los paréntesis son el intrón catl y el actagt en el sitio de clonación spel para d ivi d i r e l ge n d e horde u m .

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGG ACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCAC AAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCG TTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTA ACCAATTATTTCAGCACC ROGTAGATCTGAGG(GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT TCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCT TTA CTGATCTATTTTTTMTTGATTGGTTATGGTGTA TA7TACATAGCTTTAA CTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)A ACCGACGAACL GTATGCAGCTCTCTCAATGTACCTGGACATTCCCAGAGTTGC TTAÁAAGAGCAGCGTTTTTAÁGGAGGAGTATTGATAGTATTTCGAGTAGAAGTAG GTCCAGGTCCAAGTATCCATCTTTCATGGCGTCCGCATCAACGGTCTCCGCTCC AAATACGGAGGCTGAGCAGACCCATAACCCCCCTCAACCTCTACAGGTTGCAAA GCGCTTGGAGAAATTCAAAACAACAATCTTTACTCAAATGAGCATGCTTGCCATC AAACATGGAGCAATAAACCTTGGCCAAGGGTTTCCCAACTTTGATGGTCCTGAG TTTGTCAAAGAAGCAGCAATTCAAGCCATTAAGGATGGGAAAAACCAATATGCTC GTGGATATGGAGTTCCTGATCTCAACTCTGCTGTTGCTGATAGATTCAAGAAGG ATACAGGACTCGTGGTGGACCCCGAGAAGGAAGTTACTGTTACTTCTGGATGTA CAGAAGCAATTGCTGCTACTATGCTAGGCTTGATAAATCCTGGTGATGAGGTGA TCCTCTTTGCTCCATTTTATGATTCCTATGAAGCCACTCTATCCATGGCTGGTGC CCAAATAAAATCCATCACTTTACGTCCTCCGGATTTTGCTGTGCCCATGGATGAG CTCAAGTCTGCAATCTCAAAGAATACCCGTGCAATGCTTATAAACAGTCCCCATA ACCCCACAGGAAAGATGTTCACAAGGGAGGAACTGAATGTGATTGCATCCCTCT GCATTGAGAATGATGTGTTGGTGIRTTACTGATGAAGTTTACGACAAGTTGGCTTT CGAAATGGATCACATTTCCATGGCTTCTCTTCCTGGGATGTACGAGAGGACCGT GACTATGAATTCCTTAGGGAAAACTTTCTCCCTGACTGGATGGAAGATTGGTTG GACAGTAGCTCCCCCACACCTGACATGGGGAGTGAGGCAAGCCCACTCATTCC TCACGTTTGCTACCTGCACCCCAATGCAATGGGCAGCTGCAACAGCCCTCCGG GCCCCAGACTCTTACTATGAAGAGCTAAAGAGAGATTACAGTGCAAAGAAGGCA ATCCTGGTGGAGGGATTGAAGGCTGTCGGTTTCAGGGTATACCCATCAAGTGG GACCTATTTTGTGGTGGTGGATCACACCCCATTTGGGTTGAAAGACGATATTGC GTTTTGTGAGTATCTGATCAAGGAAGTTGGGGTGGTAGCAATTCCGACAAGCGT TTTCTACTTACACCCAGAAGATGGAAAGAACCTTGTGAGGTTTACCTTCTGTAAA GACGAGGGAACTCTGAGAGCTGCAGTTGAAAGGATGAAGGAGAAACTGAAGCC TAAACAATAGGGGCACGTGA S E Q I D N O : 9 secu e n ci a d e a m i n o á cid o d e G PT d e U va VDLRNRRTS QLSQGTWTFPELLKRPAFLRRSIDSISS SRSSSKYPSFMASAST VSAPNTEAEQTHNPPQPLQVAKRLEKF TTIFTQ SMLAIKHGAfNLGQGFPNFDGP EFVKEAAIQAIKDG NQYARGYGVPDLNSAVADRF KDTGLWDPEKEVTVTSGCT EAfAAT LGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLS AGAQIKS!TLRPPDFAVP DELKSAI SKNTRAILfNTPHNPTGKMFTREELNVIASLCIENDVLVFTDEVYDKLAFEMDHIS AS LPG YERTVTMNSLGKTFSLTGWKiGVVTVAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQW AAATALRAPDSYYEELKRDYSAKKA1LVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVWDHTPFGLK DDIAFCEYLIKEVG VAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVERMKEKLKP KQ SEQ ID NO: 10 secuencia de ADN GPT de Arroz codón GPT de Arroz optimizado para la expresión en E. coli; las secuencias sin traducir se muestran en el cuadro inferior atgtggATGMCCTGGCAGGCTTTCTGGGAACCCCGGCAACGGCAACCGeAAGGC GTCATGAAATGCCGCTGAACCGGAGCAGCAGCGCGAGCTTTCTGCTGÁGCAGC CTGCGTCGTAGCCTGGTGGCGAGCCTGCGTAAAGCGAGCCCGGCAGCAGCAG CAGCACTGAGCCCGATGGCAAGCGCAAGCACCGTGGCAGCAGAAAACGGTGC AGCAAAAGCAGCAGCAGAAAAACAGCAGCAGCAGCCGGTGCAGGTGGCGAAA CGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGATGAGCATGCTGGCGATTA AACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCC GAACTTTGATGGCCCGGATTTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTAACGC GGGCAAAAACCAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGAACTGAACAGCGCGA TTGCGGAACGTTTTCTGAAAGATAGCGGCCTGCAGGTGGATCCGGAAAAAGAA GTGACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCATTCTGGGCCT GATTMCCCGGGGGATGAAGTGATTCTGTTTGCGCCGTTTTATGATAGCTATGA AGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAAGGTGAAAGCGATTAGCCTGCGTGGG CGGGATTTTAGCGTGCCGCTGGÁAGÁACTGAAAGCGGCCGTGAGCAAAAACAC CCGTGCGATTATGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCG TGAAGAACTGGAATTTATTGCGACCCTGTGCAAAGAAAACGATGTGCTGCTGTT TGCGGATGAAGTGTATGATAAACTGGCGTTTGAAGCGGATCATATTAGCATGGC GAGCATTCCGGGCATGTATGAACGTACCGTGACCATGAACAGCCTGGGCAAAA CCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCGCCGCATCTG ACCTGGGGCGTGCGTCAGGCACATAGCTTTCTGACCTTTGCAACCTGCACCCC GATGCAGGCAGCCGCCGCAGCAGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATGAAG AACTGCGTCGTGATTATGGCGCGAAAAAAGCGCTGCTGGTGAACGGCCTGAAA GATGCGGGCTTTATTGTGTATCCGAGCAGCGGCACCTATTTTGTGATGGTGGAT CATACCCCGTTTGGCTTTGATAACGATATTGAATTTTGCGAATATCTGATTCGTG AAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGCCGAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGAT GGCAAAAACCTGGTGCGtTTTACCTTTTGCAAAGATGATGAAACCCTGCGTGCG GCGGTGGAACGTATGAAAACCAAACTGCGTAAAAAAAAGGTTgcggccgcactcgagc accaccaccaccaccactga SEQ ID NO: 11 secuencia de aminoácido GPT de Arroz Incluye aminoácidos MW de la terminal amino para la clonación y las secuencias de etiqueta His del vector pet28 en cursivas.

WW^NLAGFLATPATATATRHEMPLNPSSSASFLLSSLRRSLVASLRKASPAAAAAL SPMASASWAAENG KAAAEKQQQQPVQVAKRLEKFKTTIFTQMS LAIKHGAINL GQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPELNSAIAERFLKDSGLQVDPE KEVTVTSGCTEAlAATILGtlNPGDEVILFAPFYDSYEATLS AGANVKAITLRPPDFS VPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIATLCKENDVLLFADEVYDKL AFEAOHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFL TFATCTPMQAAAAAALRAPDSYYEELRRDYGAKKALLVNGLKDAGFIVYPSSGTYF VMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDETLR AAVERM KTKLRKKKLAAAÍEHHHHHH SEQ ID NO: 12 secuencia de ADN de GPT de Frijol de Soya TOPO 151D CON FRIJOL DE SOYA para la expresión en E.coli A partir del codón de inicio. Las secuencias del vector están en cursivas.

ATGCATCATCACCATCACCATGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTC GATTCTACGGAAAACCTGTATTTTCAGGGAATTGATCCCTTCACCGCGAAACGT CTGGAAA TTTCAGACCACCATTTTTACCCAGATGAGCCTGCTGGCGÁTTAAAC ATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGAACTTTGATGGCCCGGAATTT GTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGCAAAAACCAGTATGCGCG TGGCTATGGCGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTGCGGAACGTTTTAAAAAAGA TACCGGCCTGGTGGTGGATCCGGAAAAAGAAATTACCGTGACCAGCGGCTGCA CCGAAGCGATTGCGGCGACCATGATTGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTG ATTATGTTTGCGCCGTTTTATGATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGC GCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGTCCGCCGGATTTTGCGGTGCCGCTGGA AGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCCGTGCGATTCTGATTAACACCCC GCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCGTGAAGAACTGAACTGCATTGCGAG CCTGTGCATTGAAAACGATGTGCTGGTGTTTACCGATGAAGTGTATGATAAACT GGCGTTTGATATGGAACATATTAGCATGGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACG TACCGTGACCCTGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAAT TGGCTGGGCGATTGCGCCGCCGCATCTGAGCTGGGGCGTGCGTCAGGCGCAT GCGTTTCTGACCTTTGCAACCGCACATCCGTTTCAGTGCGCAGCAGCAGCAGCA CTGCGTGCACCGGATAGCTATTATGTGGAACTGAAACGTGATTATATGGCGAAA CGTGCGATTCTGATTGAAGGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTTCCGAGC AGCGGCACCTATTTTGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCTGGAAAACGAT GTGGCGTTTTGCGAATATCTGGTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGAC CAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGAAGGCAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTT TTGCAAAGATGAAGAAACCATTCGTAGCGCGGTGGAACGTATGAAAGCGAAACT GCGTAAAGTCGACTAA SEQ ID NO: 13 secuencia de aminoácido de GPT de Frijol de Soya producto de la proteína traducido, secuencias del vector en cursivas MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTmRLEKFQTriFJQMSL^ GAl NLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYARGYGVPDLNIAIAERFKKDTGLWDP EKEITVTSGCTEAIAATMIGLINPGDEVIMFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDF AVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNCIASLCIENDVLVFTDEVYDKL AFDMEHISMASLPG FERTVTLNSLGKTFSLTGVVKIGWAIAPPHLSWGVRQAHAFL TFATAHPFQCAAA LRAPDSYYVELKRDYMAKRAILIEGLkAVGFKVFPSSGTYFV WDHTPFGLENDVAFCEYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEETIRS AVERM KAKL RKVD SEQ ID NO:14 secuencia de ADN de GPT de Cebada la secuencia de Codificación desde el inicio con el intrón removido rGGTAGATCTGAGGAACCGACGAACr GTATGGCATCCGCCCCCGCCTCCGC CTCCGCGGCCCTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGACAACGGGGCCGCCAAGCCC ACGGAGCAGCGGCCGGTACAGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGTTCAAAACAAC AATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCAGTGAAGCATGGAGCAATAAACCTTGG ACAGGGGTTTCCCAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTCAAAGATGCTGCTATTGA GGCTATCAAAGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTGCCTGAATT GAACTCAGCTGTTGCTGAGAGATTTCTCAAGGACAGTGGATTGCACATCGATCC TGATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGGGTGCACAGAAGCAATAGCTGCAACGAT ATTGGGTCTGATCAACCCTGGGGATGAAGTCATACTGTTTGCTCCATTCTATGAT TeTTATGAGGCTACACTGTGCATGGCTGGTGCGAATGTCAAAGCCATTACACTC CGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGAAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAA GAATACCAGAGCAATAATGATTAATACACCTCACAACCCTACCGGGAAAATGTTC ACAAGGGAGGAACTTGAGTTCATTGCTGATCTCTGCAAGGAAAATGACGTGTTG CTCTTTGCCGATGAGGTCTACGACAAGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCA ATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGG AAGACGTTCTCCTTGACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATAGCACCACCGCA CCTGACATGGGGCGTAAGGCAGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCCACCTCCA CGCCGATGCAATCAGCAGCGGCGGCGGCCCTGAGAGCACCGGACAGCTACTT TGAGGAGCTGAAGAGGGACTACGGCGCAAAGAAAGCGCTGCTGGTGGACGGG CTCAAGGCGGCGGGCTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCATCATG GTCGACCACACCCCGTTCGGGTTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTT GATCCGCGAGGTCGGCGTCGTGGCCATCCCGCCAAGCGTGTTCTACCTGAACC CGGAGGACGGGAAGAACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGACGACGACACG CTAAGGGCGGCGGTGGACAGGATGAAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGA SEQ ID NO: 15 secuencia de aminoácido de GPT de Cebada secuencia Traducida desde el sitio del inicio (intrón removido) MVDLRNRRTS ASAPASASAALSTAAPADNGAAKPTEQRPVQVAKRLEKFKTTÍFT Q S LAVKHGAfNLGQGFPNFDGPDFVKDAAÍEAIKAGKNQYARGYGVPELNSAVA E RFLKDSGL H l DPDKE VTVTSGCTEAI AATl LG Ll NPGDEVI LFAPF YDSYEATLS AG ANVKAITLRPPDFAVPLEELKAAVS NTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIADLGKE NDVLLFADEWDKLAFÉADMIS ASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWklGWAIAPP HLTWGVRQAHSFLTFATSTP QSAAAAALRAPDSYFEELKRDYGAKKALLVDGLKA AGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVEFCEYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLV 5 RFTFCKDDDTLRAAVDR KÁKLRKK SEQ ID NO: 16 secuencia de ADN de GPT de Pez Cebra secuencia Danio rerio designada para la expresión en E.Coli. Los nucleótidos en negritas y cursivas, agregados para la clonación o desde el vector pET28b. 0 ArGTCCGTGGGGAAÁCGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGATGA GCATGCTGGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGAAC TTTGATGGCCCGGATTTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGC AACAACCAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTAG CGAACGTTATAAAAAAGATACCGGCCTGGCGGTGGATCCGGAAAAAGAAATTAC CGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCGTGCTGGGCCTGATT AACCCGGGCGATGAAGTGATTGTGTTTGCGCCGTTTTATGATAGCTATGAAGCG ACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGTCCGCCGG ATTTTGCGCTGCCGATTGAAGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCCGTG CGATTCTGCTGAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCCGGAAG ü AACTGAACACCATTGCGAGCCTGTGCATTGAAAACGATGTGCTGGTGTTTAGCG ATG GTGTATGATAMGTGGCGTTTGATATGGAACATATTAGCATTGCGAGCCT GCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGACCATGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTA GCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCGCCGCATCTGACCTGG GGCGTGCGTCAGGCGCATGCGTTTCTGACCTTTGCAACCAGCAACCCGATGCA GTGGGCAGCAGCAGTGGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATACCGAACTGA AACGTGATTATATGGCGAAACGTAGCATTCTGGTGGAAGGCCTGAAAGCGGTG GGCTTTAAAGTGTTTCCGAGCAGCGGCACCTATTTTGTGGTGGTGGATCATACC CCGTTTGGCCATGAA CGATATTGCGTTTTGCGAATATCTGGTGAAAGAAGTG ,n GGCGTGGTGGCGATTCCGACCAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGAAGGCAA AAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGAAGGCACCCTGCGTGCGGCGGT GGATCGTATGAAAGAAAAACTGCGTAAAGTCGACA GCTTGCGGCCGC4C7"CG AGCACCACCACCACCACCACTGA SEQ ID NO: 17 secuencia de aminoácido de GPR de Pez Cebra La secuencia de aminoácidos del Danio rerio clonadas y 5 expresadas en E.coli (los aminoácidos en negritas y cursivas son agregados del vector/ la clonación y la etiqueta His en la terminal-C) AfSVAKRLEKFKTTIFTQ S LAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAiQAIRDGNNQ YARGYGVPDLNiAiSERYKKDTGLAVDPE ElTVTSGCTEAlAATVLGLINPGDEVIVF APFYDSYEATLSMAGA VKGITLRPPDFALPIEELKSTÍSKNTRAILLNTPHNPTGKMF TPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFD EHISIASLPGMFERTVTMNSLGKTFSL 5 TGWK1GWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNP QWAAAVALRAPDSYYTELKRDY AKRS i LVEGLKAVG FKVFPSSGTYF VWDHTPFGH EN DI AFCEYLVKEVG WAI PT SVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRKVD LAAALEWWHHHH- SEQ ID NO: 18 secuencia de ADN de construcción -30 GPT truncado de Arabidopsis El GPT de Arabidopsis con 30 aminoácidos removidos a partir de la secuencia de envío al 10 objetivo.

ATGGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAG AACGAGTCTACTCAAAAACCCGTGCAGGTGGGGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAG ACTAGTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATT TAGGCCMGGCTTTCCC TTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGA TCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCA GCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGA TCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGC TATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTAT 1 ü GATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTT TACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTA ACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGT TCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGC TTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGA TGGATCACATTTC TATAGCtTCTCTTCGCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGA AAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCAT CTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACA CCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAA ?n GAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAG GAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGAT CACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAG AAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAG GGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGC GTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEQ ID NO: 19 secuencia de aminoácido de construcción GPT-30 truncada de Arabidopsis MAKIHRPIGATMTTVSTQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTTFTQMS!LAVKHGAFNTGQG FPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLWDPEKEVT VTSGCTEALAAA LGLÍNPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGA VKGITLRPPDFSIPLE ELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGK FTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYD LAFE DHISIASLPGMYERTVT NSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATS TPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADH TPFG ENDVAFCEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIER MKQKLKRKV S EQ I D N O : 20 : secu en ci a d e ADN d e con stru cció n d e G PT -45 tru ncad a de Arabidopsis ATGGCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTA GAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATG GAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAA AGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATA CGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGG TCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCC ATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTG CACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAA AGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGC TGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGAC CGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGA AAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATG GATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGA ATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTG CGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCG CCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAG TCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTA AGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTG TGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTA TCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAAT CCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACG TTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA S E Q I D N O : 21 secue n cia d e a m i noácido de co nstrucció n de G P T -45 tru n cada de Arabidopsis MATQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQ SILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFV EA AIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAIAAA L GLINPGDEVÍLFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKMVT KTRAIL NTPHNPTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISFASLPG YER TVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKA PESYF ELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADHTPFGMENDVAFCE YL I EE VG WA! PTSVFYLN PEEGKNLVRFAFGKD EETLRG AL ERM KQKLKRKV SEQ ID NO:22 Promotor Rubisco de Tomate secuencia del promotor rbcS3C de RuBisCo de TOMATE de Kpnl a Ncol GGr¾CCGTTTGMTCCTCCTTA GTTTTTCTCTGGAGAAACTGTAGTAATTTTAC TTrGTTGTGTTCCCTTCATCTTrrG TTMTGGCATTTGTTTTAATACTAATC TTGTGAAACTTGTAATGTATGTATATCAGTTTCTTATAATTTATCCAAGTAATATCT TCCATTCTCTATGCAATTGCCTGCATAAGCTCGACAAAAGAGTACATCAACCCCT CCTCCTCTGGAGTACTCTAGCTAAACTTGAATTTCCCCTTAAGATTATGAAATTG ATATATCCTT CA CGACTCCTTCTGTTGGAAAATGTAGTACTTGTCTrTCTTC TTTGGGTATATATAGTTTATATACACCATACTATGTAGAACATCCAAGTAGAGTG AAATGGATACATGTACAAGACTTATTTGA GATTGATGACTTGAGTTGCCTTAG GAGTAACAAATTCTTAGGTCAATAAATCGTTGATTTGAAATTAATCTCTCTGTCTT AGACAGATAGGAATTATGACTTCCAATGGTCCAGAAAGCAAAGTTCGCACTGAG GGTATACTTGGAATTGAGACTTGCACAGGTCCAGAAACCAAAGTTCCCATCGAG CTCTAAAATCACATCTTTGGAATGAAATTCAATTAGAGATAAGTTGCTTCATAGCA TAGGTAAAATGGAAGATGTGAAGTAACCTGCAATAATCAGTGAAATGACATTAAT ACACTAAATACTTCATATGTAATTATCCTTTCCAGGTTAACAATACTCTATAAAGT AAGAATTATCAGAAATGGGCTCATCAAACTTTTGTACTATGTATTTCATATAAGGA AGTATMCTATACATAAGTGTATACACAACTTTATTCCTATTTTGTAAAGGTGGAG AGACTGTTTTCGATGGATCTAAAGCAATATGTCTATAAAATGCATTGATATAATAA TTATCTGAGAAAATCCAGAATTGGCGTTGGATTATTTCAGCCAAATAGAAGTTTG TACCATAGTTGTrGATTCCTrCT GTTAAGGTG GTATCATTCATA CAGTTT TCCCCAAAGTACTACTCÁCCAAGTTTCCCTTTGTAGAATTAACAGTTCAAATATAT GGCGCAGAAATTACTCTATGCCCAAAACCAAACGAGAAAGAAACAAAATACAGG GGITTGCAGACTTT-ATTTTCGTGTTAGGGTGTGTTTirTTCATGTAATTAATCAAAAA ATATTATGACAAAAACATTTATACATATTTTTACTCAACACTCTGGGTATCAGGGT GGGTTGTGTTCGACAATCAATATGGAAAGGAAGTATTTTCCTTAI I I I I I IAGTTA ATATTTTCAGTTATACCAAACATACCTTGTGATATTATTTTTAAAAATGAAAAACTC GTCAGAAAGAAAAAGCAAAAGCMCAAAAAAATTGCAAGTATTTTTTAAAAAAGA AAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTGA GGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAA TGGTTAGCATTCCTGTMGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGG AAGCCTTATCAC ATATATAGAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATT TCAGCACGA TGG SEQ ID NO:23 secuencia de ADN de GPT de Bambú ATGGCCTCCGCGGCCGTCTCCACCGTCGCCACCGCCGCCGACGGCGTCGCGA AGCCGACGGAGAAGCAGCCGGTACAGGTCGCAAAGCGTTTGGAAAAGTTTAAG ACMCAATTTTCACACÁGATGAGCATGCTTGCCATCAAGCATGGAGCAATAAAC CTCGGCCAGGGCTTTCCGAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTGAAAGAAGCTGCT ATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTGCCT GAACTGAACTCGGCTGTTGCTGAAAGGTTCCTGAAGGACAGTGGCTTGCAAGTC GATCCCGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGGTGCACGGAAGCGATAGCTGC AACGATATTGGGTCTTATCAACCCTGGCGATGAAGTGATCTTGTTTGCTCCATTC TATGATTCATACGAGGCTACGCTGTCGATGGCTGGTGCCAATGTAAAAGCCATT ACTCTCCGTCCTCCAGATTTTGCAGTCCCTCTTGAGGAGCTAAAGGCCACAGTC TCTAAGAACACCAGAGCGATAATGATAAACACACCACACAATCCTACTGGGAAA ATGTTTTCTAGGGAAGAACTTGAATTCATTGCTACTCTCTGCAAGAAAAATGATG TGTTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTATGACAAGTTGGCATTTGAGGCAGATCATAT ATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACTGTGACTATGAACTCTCTG GGGAAGACATTCTCTCTAACAGGATGGAAGATCGGTTGGGCAATAGCACCACCA CACCTGACATGGGGTGTAAGGCAGGCACACTCATTCCTCACATTTGGCACCTGC ACACCAATGCAATCGGGGGCGGCGGCGGCTGTTAGAGCACCAGATAGCTACTA TGGGGAGCTGAAGAGGGATTACGGTGCAAAGAAAGCGATACTAGTCGACGGAC TCAAGGCTGCAGGTTTTATTGTTTACCCTTCAAGTGGAACATACTTTGTCATGGT CGATCACACCCCGTTTGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGAGTATTTGATC CGCGAAGTCGGTGTTGTCGCCATACCACCAAGCGTATTTTATCTCAACCCTGAG GATGGGAAGAACTTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGATGATGATACGCTGAGA GCCGCAGTTGAGAGGATGAAGACAAAGCTCAGGAAAAAATGA SEQ ID NO: 24 secuencia de aminoácido de GPT de Bambú AS VSTVAT DGVA PTE QPVQVAKRLE FKtTIFTQMS LAÍKHGAiNLGQG FPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLQVDPEKEV TVTSGCTEAlAATILGLiNPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPL EELKATVS NTRAIMJNTPHNPTGK FSREELEFIATLGKKNDVLLFADEVYDKLAFE ADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGW IGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFA TCTP QSAAAAALRAPDSYYGELKRDYGAKKAILVDGLKAAGFIVYPSSGTYFVMV DHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGWAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVE R KTKLRKK SEQ ID NO: 25 promotor 1305.1 +rbcS3C + intrón catl con el gen de GPT de arroz.

El vector Cambia1305.1 con (el extremo 3') rbcS3C + GPT de arroz. El ATG subrayado es el sitio de inicio, y el paréntesis en el intrón catl y el actagt es el sitio de clonación spel utilizado para dividir el gen del arroz.

AAAAAAGAAAAAAAAMCATATCTTGTTTGTCAGTATGGGMGTTTGAGATAAGG ACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCAC AAAATCCMTGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTT GCTAACTCTTTTTGTCCG TTAGATAGGMGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCT T CCTCTTAGTA ACCAATTATTTCAGCACC47GGTAGATCTGAGG( GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT TCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCT TTAAACTGATCTA I I I I ITAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAA CTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)A ACCGACGA4CLAGTATGAATCTGGCCGGCTTTCTCGCCACGCCCGCGACCGCG ACCGCGACGCGGCATGAGATGCCGTTAAATCCCTCCTCCTCCGCCTCCTTCCTC CTCTCCTCGCTCCGCCGCTCGCTCGTCGCGTCGCTCCGGAAGGCCTCGCCGG CGGCGGCCGCGGCGCTCTCCCCCATGGCCTCCGCGTCCACCGTCGCCGCCGA GAACGGCGCCGCCAAGGCGGCGGCGGAGAAGCAGCAGCAGCAGCCTGTGCA GGTTGCAAAGCGGTTGGAAAAGTTTAAGACGACCATTTTCACACAGATGAGTAT GCTTGCGATCAAGGATGGAGCAATAAACCTTGGCCAGGGTTTTGGGAATTTCGA TGGCCCTGACTTTGTAAAAGAGGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAA TCAGTACGCAAGAGGATATGGTGTGCCTGAACTGAACTCAGCTATTGCTGAAAG ATTCCTGAAGGACAGCGGACTGCAAGTCGATCCGGAGAAGGAAGTTACTGTCA CATCTGGATGCACAGAAGCTATAGCTGCAACAATTTTAGGTCTAATTAATCCAGG CGATGAAGTGATATTGTTTGCTCCATTCTATGATTCATATGAGGCTACCCTGTCA ATGGCTGGTGCCAACGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTTTTCAGTC CCTCTTGAAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAACACCAGAGCTATTATGATA AACACCCCGCACAATCCTACTGGGAAAATGTTTACAAGGGAAGAACTTGAGTTT ATTGCCACTCTCTGCAAGGAAAATGATGTGCTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTAC GACAAGTTAGCTTTTGAGGCAGATCATATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGT ATGAGAGGACCGTGACCATGAACTCTCTTGGGAAGACATTCTCTCTTACAGGAT GGAAGATCGGTTGGGCAATCGCACCGCCACACCTGACATGGGGTGTAAGGCAG GCACACTCATTCCTCACGTTTGCGACCTGCACACCAATGCAAGCAGCTGCAGCT GGAGGTCTGAGAGCACCAGATAGGTACTATGAGGAACTGAGGAGGGATTATGG AGCTAAGAAGGCATTGCTAGTCAACGGACTCAAGGATGCAGGTTTCATTGTCTA TCCTTC GTGG CATACTTCGTCATGGTCGACCACACCCCATTTGGTTTCGA CAATGATATTGAGTTCTGCGAGTATTTGATTCGCGAAGTCGGTGTTGTCGCCATA CCACCTAGTGTATTTTATCTCAACCCTGAGGATGGGAAGAACTTGGTGAGGTTC ACCTTTTGCAAGGATGATGAGACGCTGAGAGCCGCGGTTGAGAGGATGAAGAC AAAGCTCAGGAAAAAATGA SEQ ID NO: 26 SECUENCIA GPT DE HORDEUM EN EL VECTOR. El vector Cambia 1305.1 con (un extremo 3') de los rbcS3C + /7or<_/eum ID14. ATG subrayado es el sitio de inicio, los paréntesis son el intrón catl y el actagt subrayado en el sitio de clonación spel utilizado para dividir el gen de hordeum.

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGG ACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCAC AAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCG TTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTA ACCAATTATTTCAGCACCAT¡GGTAGATCTGAGG(GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT TCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATT I I I I I GAGCTTTGATCTTTCT TTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAA CTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)A ACCGACGAAC7^GTATGGCATCCGCCCCCGCCTCCGCCTCCGCGGCCCTCTCC ACCGCCGCCCCCGCCGACAACGGGGCCGCCAAGCCCACGGAGCAGCGGCCG GTACAGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGTTCAAAACAACAATTTTCACACAGATG AGCATGCTCGCAGTGAAGCATGGAGCAATAAACCTTGGACAGGGGTTTCCCAAT TTTGATGGCCCTGACTTTGTCAAAGATGCTGCTATTGAGGCTATCAAAGCTGGA AAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTGCCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCT GAGAGATTTCTCAAGGACAGTGGATTGCACATCGATCCTGATAAGGAAGTTACT GTTACATCTGGGTGGACAGAAGCAATAGCTGCAACGATATTGGGTCTGATCAAC CCTGGGGATGAAGTCATACTGTTTGGTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACAC TGTCCATGGCTGGTGCGAATGTCAAAGCCATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTG CAGTCCCTCTTGAAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAATACCAGAGCAATAA TGATTAATACACCTCACAACCCTACCGGGAAÁATGTTCACAAGGGAGGAACTTG AGTTCATTGCTGATCTCTGCAAGGAAAATGACGTGTTGGTCTTTGCCGATGAGG TCTACGACAAGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAATGGCTTCTATTCCTG GCATGTATGAGAGGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTCCTTGA CCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGT AAGGCAGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCCACCTCCACGCCGATGCAATCAGC AGCGGCGGCGGCCCTGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGAGGAGCTGAAGAGG GACTACGGCGCAAAGAAAGCGCTGCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCGGGCT TCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCATCATGGTCGACCACACCCCGT TCGGGTTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCGCGAGGTCGGC GTCGTGGCCATCCCGCCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGACGGGAAGAA CCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGACGACGACACGCTAAGGGCGGCGGTG GACAGGATGAAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGATTGAGGGGCGCACGTGrGA S EQ I D N O : 27 E l ve cto r Ca m b i a 1 20 1 + l a secu e n ci a G PT de A ra bidopsis ( p ro m oto r 35 S d e C a M V e n c u rsi va s ) CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGG CGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTC AACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCT CAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACC TCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAA GGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCA TTGCGA TAAAGGAAAGGCCATCGTTGA AGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCA TCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTG ATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACC CTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTTGA CCATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTC TCTTCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCT ATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCC GTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATG AGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATT TCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAA AAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGC GCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGT TACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCT GGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCT CTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCA TCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTA TGAACACTCCGGACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAA ACGATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCT GTGTTCTCGGATGAAGTAT ACGAT GCTTGGGTTTGAMTGGATCAGATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTAT GTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGA TGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACA AGCACACTGTTACCTCACATTCGCCACATCAACAGCAGCACAATGGGCAGCCGT TGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAA TGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTT CCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGA GAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGAT CCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTT TGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGC AGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA SEQ ID NO 28: El vector Cambia p1305.1 con (el extremo 3' de) rbcS3C + GPT de Arabidopsis. El ATG subrayado es el sitio de inicio, el paréntesis son el intrón catl y el actagt subrayado en el sitio de clonación spel utilizado para dividir el gen de Arabidopsis.

AAAAAAGAAMAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGG ACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCAC AA TCCAATGGTTACCATTCGTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTGCG TTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTA ACC TTATTTCAGCACCAJGGTAGATCTGAGG(GTAMTTTCTAGTTTTTCTCCT TCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCT TTAAACTGATCTA I I I I I I AATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAA CTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)A ACCGACGAAC AGTATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTA GCTTCAAAGCCTCTCTTCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAA AATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTC TACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTAT TTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAA GGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTA TTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACT CTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGA AAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGG GTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTAT GAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCA CCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACT CGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAG GGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTT CTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCT TCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTT TCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTT GGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCAC AATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGA AAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCG GATTTACAGTGTTCCCATGGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTG CATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGG GGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAA TTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGA GAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA S EQ I D N O : 29 Secu enci a de cod ifi ca ció n d e G PT d e A ra bidopsis ( p roteí n a m ad u ra , s i n s ec u e n ci a de e n v í o a l o bjetivo ) GTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAÁTGAGCATAT TGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACG GTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCGAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCA GTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCÁGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTT TCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCT GGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGAT GAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGG CTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTT GGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACAC TCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTG CATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAA GCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAA AGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAG ATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACA CTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGC TCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAA AAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCG AGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGAT GTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACG AGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCT GTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTT AAGAGAAAAGTCTGA SEQ ID NO: 30 Secuencia de aminoácidos de GPT de Arabidopsis (proteína madura, sin secuencia de envío objetivo) VAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGK QYAR GYGIPQLNSAI RFREDTGLVVDPE EVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAP FYDSYEATLS AGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAIL NTPHNPTGK FT REELETIASLCIENDVIVFSDEVYDKLAFE TGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAAL APESYFKEL RDYN VKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFWADHTPFGMENDVÁFCEYLIEEVGWAIPTS VFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV SEQ ID NO: 31 Secuencia de aminoácidos GPT de Uva (proteína madura, sin secuencia de envío al objetivo) VAKRLEKF TTIFTQ S LAIKHGAiNLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAI DGKNQYAR GYGVPDLNSAyADRFKKDTGLWDPEKEVTVTSGCTEAlAAT LGLÍNPGDEVÍLFA PFYDSYEATLSMAGAQIKSITLRPPDFAVP DEL SAISKNTRAiLINTPHNPTGK FT REELNVIASLCIENDVLVFTDEVYDKLAFEMDHISMASLPGMYERTVTMNSLGKTFS LTGW IGWTVAPPHLTWGVRQAHSFLTFATGTP QWAAATALRAPDSYYEELKRD YSAK AILVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVWDHTPFGLKDDIAFCEYLlkEVGWAIPT SVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVER KEKLKPKQ SEQ ID NO: 32 Secuencia de aminoácido GPT de arroz (proteína madura, sin secuencia de envío al objetivo) VAKRLEKFKTTIFTQ S LAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGK QYAR GYGVPELNSAIAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPF YDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAI INTPHNPTGKMFT RÉELEFiATLCKENDVLLFADE DKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSL TGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQAAAAAALRAPDSYYEELRRDY GAKKALLVNGLKDAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGWAIPPS VF YL N PEDGKNL VRFTFCKDDETLR AAVERM KTKL RKK SEQ ID NO: 33 Secuencia de aminoácido GPT de Frijol de soya (-1 proteína madura, sin secuencia de envío al objetivo).

AKRLEKFQTTIFTQMSLLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFV EAAIQAIRDGKNQYARG YGVPDLNIAIAERFK DTGLWDPEKEITVTSGCTEAIAATMIGLINPGDEVI FAPFY DSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFAVPLEELKST!SKNTRAILINTPHNPTGKMFTRE ELNCIASLGIENDVLVFTDEVYDKLAFDMEHISMASLPG FERTVTLNSLGKTFSLTG WKIGVVAIAPPHLSWGVRQAHAFLTFATAHPFQCAAAAALRAPDSYYVELKRDYMAK RAILIEGLKAVGFKVFPSSGTYFVWDHTPFGLENDVAFCEYLVKEVGWAIPTSVFY LNPEEGKNLVRFTFCKDEETIRSAVERMKAKLRKVD SEQ ID NO: 34 Secuencia de aminoácido GPT de cebada (proteína madura, sin secuencia de envío al objetivo).

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAiKAGKNQYA RGYGVPELNSAVAERFLKDSGLHIDPDKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAP FYDSYEATLS AGANVKAITLRPPDFAVPLEELKAÁVSKNTRAIMINTPHNPTGKIvlFT REELEFIADLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHiSMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSL TGWKIG AtAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTPMQSAAAAALRAPDSYFEELKRDYG AKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFiMVDHTPFGFDNDVEFCEYUREVGWAIPPSV FYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK SEQ ID NO: 35 Secuencia de aminoácido GPT de Pez Cebra (proteína madura, sin secuencia de envío al objetivo).

VAKRLEKFKTTIFTQ SMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFV EAAIQAiRDGNNQYA RGYGVPDLNIAISERYKKDTGLAVDPEKEITVTSGCTEAIAATVLGLINPGDEVIVFAP FYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFAL IEELKSTISKNTRAILLNTPHNPTGKMFTP EELNTIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFDMEHISIASLPG FERTVTMNSLGKTFSLT GWKIG AIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNPMQWAAAVALRAPDSYYTELKRDY AKRSILVEGLKAVGFKVFPSSGTYFVWDHTPFGHENDIAFCEYLVKEVGVVAIPTSV FYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDR KEKLRK SEQ ID NO: 36 Secuencia de aminoácido GPT de Bambú (proteína madura, sin secuencia de envío al objetivo).

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYAR GYGVPELNSAVAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAP FYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKATVSKNTRAIIvUNTPHNPTG FS REELEFÍATLCKKNDVLLFADEVYDKLAFEADHIS ASIPG YERTVTMNSLGKTFSL TGWKIGWAiAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQSAAAAALRAPDSYYGELKRDY GAKKAILVDGLKAAGFfVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGVVAIPPS VFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVERMKTKLRKK

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica la cual comprende un transgén GPT y un transgén GS, en donde dicho transgén GPT y dicho transgén GS son enlazados de manera operable a un promotor de la planta.

2. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el transgén GS es un transgén GS1.

3. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el transgén GPT codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de (a) SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, y (b) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 y tiene actividad GPT.

4. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque el transgén GS codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente del residuo 11 de (a) las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 7, y (b) una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7.

5. La planta transgénica tal y como se describe en las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque los transgenes GPT y GS son incorporados en el genoma de la planta.

6. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque se define además como una planta monocotiledónea.

7. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque se define además como una planta dicotiledónea.

8. Una descendencia de cualquier generación de la planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque dicha descendencia comprende dicho transgén GPT y dicho transgén GS.

9. Una semilla de cualquier generación de la planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque dicha semilla comprende dicho transgén GPT y dicho transgén GS.

10. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra un índice de crecimiento aumentado cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

11. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra un rendimiento aumentado de la biomasa cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

12. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra un rendimiento aumentado de la semilla cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

13. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra un rendimiento aumentado de flores o brotes de flores cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

14. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra un rendimiento de vainas o frutos aumentado cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

15. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra hojas más grandes cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

16. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra una actividad GPT aumentada cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

17. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra una actividad GS aumentada cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

18. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra niveles aumentados de 2-oxoglutaramato cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

19. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra una eficiencia aumentada en el uso del nitrógeno cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

20. La planta transgénica tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque muestra una tolerancia aumentada a la sal o condiciones salinas cuando es comparada con una planta análoga de tipo natural o sin transformar.

21. Un método para producir una planta que tiene propiedades de crecimiento mejoradas en relación con una planta análoga de tipo natural o sin transformar, el cual comprende: (a) introducir un transgén GPT dentro de la planta; (b) introducir un transgén GS dentro de la planta o una descendencia de la planta; (c) expresar el transgén GPT y el transgén GS en la planta o la descendencia de la planta; y, (d) seleccionar una planta que tiene una característica de crecimiento aumentada en relación con una planta de la misma especie que no comprende un transgén GPT o un transgén GS.

22. Un método para producir una planta que tiene propiedades de crecimiento aumentadas en relación con una planta análoga de tipo natural o sin transformar, el cual comprende: (a) introducir un transgén GS dentro de la planta; (b) introducir un transgén GPT dentro de la planta o una descendencia de la planta; (c) expresar el transgén GS y el transgén GPT en la planta o la descendencia de la planta; y, (d) seleccionar una planta que tiene una característica de crecimiento aumentada en relación con una planta de la misma especie que no comprende un transgén GS o un transgén GPT.

23. El método tal y como se describe en la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque la característica de crecimiento aumentado es seleccionada del grupo consistente de biomasa aumentada, florecimiento más temprano, formación de brotes más temprano, altura de la planta aumentada, florecimiento aumentado, presentación de brotes aumentada, hojas más grandes, producción de frutos o vainas aumentados y rendimiento de la semilla aumentado.

24. Un método de producción de una planta que tiene una eficiencia aumentada del uso del nitrógeno en relación con una planta análoga de tipo natural o sin transformar, el cual comprende: (a) introducir un transgén GPT dentro de la planta; (b) introducir un transgén GS dentro de la planta o una descendencia de la planta; (c) expresar el transgén GPT y el transgén GS en la planta o la descendencia de la planta; y, (d) seleccionar una planta que tiene una eficiencia aumentada del uso del nitrógeno en relación con una planta de la misma especie que no comprende un transgén GPT o un transgén GS.

25. Un método de producción de una planta que tiene una eficiencia aumentada del uso del nitrógeno en relación con una planta análoga de tipo natural o sin transformar, el cual comprende: (a) introducir un transgén GS dentro de la planta; (b) introducir un transgén GPT dentro de la planta o una descendencia de la planta; (c) expresar el transgén GS y el transgén GPT en la planta o la descendencia de la planta; y, (d) seleccionar una planta que tiene una eficiencia aumentada del uso del nitrógeno en relación con una planta de la misma especie que no comprende el transgén GS o el transgén GPT.

26. Un método de producción de una semilla de planta que tiene una tolerancia aumentada a la germinación o crecimiento en condiciones de sal o salinas en relación con una planta análoga de tipo natural o sin transformar, el cual comprende: (a) introducir un transgén GPT dentro de la planta; (b) introducir un transgén GS dentro de la planta o una descendencia de la planta; (c) expresar el transgén GPT y el transgén GS en la planta o la descendencia de la planta; (d) seleccionar una planta que tiene una característica de crecimiento aumentada en relación con una planta de la misma especie que no comprende un transgén GPT o un transgén GS; y, (e) recolectar las semillas de dicha planta y seleccionar las semillas que demuestran una germinación aumentada en condiciones de alta sal.

27. Un método de producción de una semilla de una planta que tiene tolerancia aumentada a la germinación en condiciones salinas o de sal en relación con una planta análoga de tipo natural o sin transformar, el cual comprende: (a) introducir un transgén GS dentro de la planta; (b) introducir un transgén GPT dentro de la planta o una descendencia de la planta; (c) expresar el transgén GS y el transgén GPT en la planta o la descendencia de la planta; (d) seleccionar una planta que tiene una característica de crecimiento aumentada en relación con una planta de la misma especie que no comprende un transgén GS o un transgén GPT; y, (e) recolectar las semillas de dicha planta y seleccionar una semilla que demuestra una germinación aumentada en condiciones de alta sal.

28. El método tal y como se describe en la reivindicación 26 ó 27, el cual comprende además propagar una planta de las semillas seleccionada de esta manera y recolectar las semillas de la misma.