CN102405289A - 具有增强的生长特性的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开转基因植物，所述转基因植物表现出显著提高的生长速率、更高的种子和果实/荚果产量、更早并且更多的开花率、更有效的氮利用、对高盐条件增加的耐受性和提高的生物量产量。提供被工程化为既过度表达谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)、又过度表达谷氨酰胺合成酶(GS)的转基因植物。GPT+GS双转基因植物一致地表现出增强的生长特性，其中T0代品系的生物量显示出比野生型植物负体增加50％至300％。由有性杂交和/或自体受精产生的代次通常表现更好，其中一些双转基因植物的生物量比野生型植物的生物量惊人地增加了4倍。

Description

具有增强的生长特性的转基因植物
对基于联邦资助的研究或项目而进行的发明的权利的声明
本发明是在政府的支持下，根据由美国能源部授予加利福尼亚大学董事会的合同NO.W-7405-ENG-36以及美国能源部授予Los Alamos NationalSecurity，LLC的合同NO.DE-AC52-06NA25396而进行的。政府对本发明具有某些权利。
相关申请
本申请要求2008年8月29日提交的美国临时申请NO.61/190,520的权利要求。
发明背景
随着全世界人口的增加以及可供利用的农场不断受到破坏或以其它方式受损，对更有效和可持续性的农业体系的需求已经成为人种的首要关注点。提高农作物产量、蛋白含量和植物生长速率代表了开发能够更有效地应对所面临的挑战的农业体系的主要目标。
近年来，由于许多发育良好的农作物的产量已经趋于瓶颈，因此经改善的农作物生产技术的重要性得到提高。许多农业活动都是时间敏感的，并且成本和回收取决于农作物的快速周转以及投入市场的时间。因此，植物快速生长是许多农业商业的经济重要的目标，所述农业商业涉及高价值的农作物，如谷物、蔬菜、浆果和其它水果。
基因工程在开发可持续农业技术中已经并且继续起到重要的作用，但是仍有争议。近年来，已经开发了大量的基因修饰的植物和相关技术，其中许多技术目前已经广泛应用(资料：Genetically Modified Crops in theUnited States，Pew Initiative on Food and Biotechnology，2004年8月，(pewagbiotech.org/resources/factsheets)。所采用的转基因植物品种目前非常巨大，并且继续增加，其中2006年有25000万英亩土地种植有转基因植物。
虽然转基因植物技术的认可度可能逐步增加(特别是在美国、加拿大和澳大利亚)，但是世界上的很多地区在农业中采用基因修饰的植物仍然缓慢(特别是欧洲)。因此，为了致力于可靠并且可持续性的农业的目标，强烈期望开发这样的转基因植物，其不会将毒素和/或可能有害的物质引入到植物和/或环境中。还强烈期望最大程度地降低实现诸如改善灭草剂耐抗性、害虫和疾病耐抗性以及农作物的总产量等目标的成本。因此仍然需要能够实现这些目标的转基因植物。
已经通过对各种植物调节体系的大量研究而致力于植物快速生长的目标，其中许多植物调节体系仍然未被彻底理解。特别是，使得碳代谢和氮代谢的植物调节机制尚未完全阐明。据估计这些调节机制对植物生长和发展具有实质性影响。
在光合有机体中，碳和氮的代谢必须以协调的方式进行调节，以确保植物源和能量的充分利用。目前对碳和氮机制的理解包括作为较大体系的子体系的某些步骤和代谢途径的详细情况。在光合成有机体中，碳代谢以CO2固定开始，然后通过被称为C-3和C-4代谢的两个主要过程继续进行。在具有C-3代谢的植物中，核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)催化CO2与二磷酸核酮糖的组合，以产生3-磷酸甘油酸酯，该3-磷酸甘油酸酯为植物利用其来合成含碳化合物的三碳化合物(C-3)。在具有C-4代谢的植物中，CO2在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化的反应中与磷酸烯醇丙酮酸结合，以形成含有4碳(C-4)的酸。酸被转移至维管束鞘细胞，在那里酸发生脱羧反应，以释放CO2，然后CO2在由C-3植物所采用的相同反应中与核酮糖双磷酸酯结合。
许多研究发现各种代谢物对于植物调节氮代谢是重要的。这些化合物包括有机酸-苹果酸酯以及氨基酸-谷氨酸和谷氨酰胺。氮借助于酶-谷氨酰胺合成酶(GS)的作用由光合成有机体分泌，所述谷氨酰胺合成酶催化氨与谷氨酸的组合，以形成谷氨酰胺。GS在通过在ATP依赖反应中催化氨添加至谷氨酸上以形成谷氨酰胺，从而在植物分泌氮时起到重要作用(Miflin和Habash，2002，Journal of Experimental Botany，Vol.53，No.370，第979-987页)。GS还由于光呼吸作用与蛋白和氮输送化合物的分解而重新分泌所释放的氨。GS酶可被分为两种常规类别，一种代表细胞质形式(GS1)，并且另一种代表质体(即叶绿素)形式(GS2)。
以前的报导已经证明，GS1的表达水平增加使得GS活性和植物生长的水平增加，但是报导并不一致。例如，Fuentes等报导，CaMV S35启动子促使紫花苜蓿GS1(细胞质形式)在烟草中过度表达，从而使得叶子组织中的GS表达水平和GS活性增加，在氮贫乏条件下的生长增强，但是却对在最优氮肥条件下的生长没有效果(Fuentes等，2001，J.Exp.Botany52：1071-8)。Temple等报导，过度表达全长紫花苜蓿GS1编码序列的转基因烟草植物含有水平显著升高的GS转录体，以及组装成活性酶的GS多肽，但是却没有报导其对生长的效果(Temple等，1993，Molecular andGeneral Genetics 236：315-325)。Corruzi等已经报导了在CaMV S35启动子的控制下过度表达豌豆细胞溶质GS1转基因的转基因烟草显示出增加的GS活性、增加的细胞溶质GS蛋白和改善的生长特性(美国专利NO.6,107,547)。Unkefer等最近报导，发现在叶子组织中过度表达紫花苜蓿GS1的转基因烟草植物在其叶子部分产生增多的2-羟基-5-氧脯氨酸水平，发现与野生型烟草植物相比，这会使得生长速率显著增加，其中所述转基因烟草植物通过自体受精进行基因分离，然后筛选其增强的叶至根的GS活性，从而使得GS1转基因拷贝数增多(参见美国专利No.6,555,500、6,593,275和6,831,040)。
Unkefer等还记载了采用2-羟基-5-氧脯氨酸(也称为2-氧戊二酸酰胺(2-oxoglutaramate))来改善植物生长(美国专利No.6,555,500、6.593,275、6,831,040)。特别是，Unkefer等公开了2-羟基-5-氧脯氨酸在叶子组织中的浓度增加(相对于根组织而言)引发一系列事件，其使得植物生长特性增强。Unkefer等记载了这样的方法，通过该方法可以使得2-羟基-5-氧脯氨酸的叶子内浓度增多，以便促使植物生长特性增强，具体而言，这是通过将2-羟基-5-氧脯氨酸的溶液直接施加到植物的叶子部分、并且在叶子组织内优先过度表达谷氨酰胺合成酶而实现的。
已经在动物肝脏和肾脏组织中确认了多种转氨酶和水解酶，已知这些酶在动物内参与2-羟基-5-氧脯氨酸的合成(Cooper和Meister，1977，CRCCritical Reviews in Biochemistry，第281-303页；Meister，1952，J.Biochem.197：304)。在植物中，2-羟基-5-氧脯氨酸的生物化学合成是已知的，但是尚未充分表征。此外，2-羟基-5-氧脯氨酸在植物内的功能及其池大小(组织浓度)是未知的。最后，本领域对于究竟在植物内可能存在何种转氨酶或水解酶并且/或者何种转氨酶或水解酶对催化2-羟基-5-氧脯氨酸的合成具有活性没有具体的指导，并且尚未报导、分离或表征这样的转氨酶。
发明概述
本发明涉及转基因植物，所述转基因植物表现出显著提高的生长速率、更高的种子和果实/荚果产量、更早并且更多的开花率、更有效的氮利用、对高盐条件增加的耐受性和提高的生物量产量。在一个实施方案中，提供了被工程化为既过度表达谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)、又过度表达谷氨酰胺合成酶(GS)的转基因植物。本发明的GPT+GS双转基因植物一致地表现出增强的生长特性，其中T0代品系的生物量显示出比野生型植物负体增加50％至300％。由有性杂交和/或自体受精产生的代次通常表现更好，其中一些双转基因植物的生物量比野生型植物的生物量惊人地增加了4倍。类似地，花朵和果实或荚果产量也显著地增加，其中T0代品系通常比它们的野生型植物负体显示出50％-70％的增加，并且在一些情况下显示出100％的增加。通过采用各种转化方法、不同的表达载体和启动子以及来自多个品种的异源和同系转基因序列已经成功地产生了表现出上述增强的生长表型特性的转基因植物，如本文提供的大量实施例所示例的那样。因此，本发明提供了有潜力转化几乎所有农业领域的根本突破性技术。
申请人已经确认酶谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)作为植物内2-羟基-5-氧脯氨酸(2-氧戊二酸酰胺)合成的催化剂。2-氧戊二酸酰胺为强有效的信号代谢物，其调节参与光合机构、碳固定和氮代谢的大量基因的功能。本发明提供了编码GPT的分离核酸分子，并且公开了新的发现结果，经编码的酶直接参与2-羟基-5-氧脯氨酸的合成。本发明的该方面在本文中通过编码来自多个品种(包括拟南芥、葡萄、水稻、大豆、大麦、竹子和来自斑马鱼的非植物类似物)的GPT的GPT多核苷酸的公开而得到了例证，所述GPT多核苷酸的大多数已经以重组GPT的方式进行了表达，并且证实了其具有GPT活性。
本发明还提供了同时表达GPT和GS转基因的转基因植物。这两种转基因在这种“双转基因”植物中的表达产生了显著提高的二氧化碳固定速率和极其有效的生长增强效果，因为这些植物表现出非常显著、有时明显提高的生长速率和花朵/果实/荚果/种子产量。本发明还提供给了产生这种生长得到增强的转基因植物的方法。
通过优先增加信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的浓度(即在叶子组织内)，本发明的转基因植物能够在较短的时期内产生较高的总产量，因此可以提供在宽泛的农作物中都具有增加的生产量的农业产业。重要的是，与迄今已经记载的许多植物不同，本发明利用了编码天然植物酶的天然植物基因。本发明的转基因植物的增强的生长特性基本上是通过向植物中引入附加的GPT和GS容量而实现的。因此，本发明的转基因植物不会表达任何毒性物质、生长激素、病毒或细菌基因产物，因此不会产生目前妨碍转基因植物在世界的某些地区应用的问题。
在一个实施方案中，本发明提供包含GPT转基因和GS转基因的转基因植物，其中所述GPT转基因和GS转基因可操作地连接植物启动子。在一个具体的实施方案中，所述GS转基因为GS转基因。在另一个具体的实施方案中，所述GPT转基因编码具有选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列的多肽，并且具有GPT活性：(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及(b)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中的任一者具有至少75％一致性的氨基酸序列。在又一个具体的实施方案中，GS转基因编码具有选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列的多肽：来自残基11的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7，和(b)与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7具有至少75％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，GPT转基因和GS转基因引入植物的基因组中。本发明的转基因植物可以为单子叶或双子叶植物。
本发明还提供本发明的转基因植物的任意代次的后代，其中所述后代包含GPT转基因和GS转基因；以及本发明的转基因植物的任意代次的种子，其中所述种子包含GPT转基因和GS转基因。当与相似野生型植物或未转化的植物相比时，本发明的转基因植物可以显示出一种或多种增强的生长特性，其包括(但不限于)：生长速率、生物量产量、种子产量、花朵或花苞产量、果实或荚果产量、较大的叶子，并且本发明的转基因植物还可以显示出提高的GPT活性水平和/或GS活性，和/或提高的2-氧戊二酸酰胺水平。在一些实施方案中，本发明的转基因植物显示出提高的氮利用效率。
本发明还提供生产本发明的转基因植物及其种子的方法，包括生产以下植物的方法，其中相对于类似野生型或未转化的植物而言，所述具有增强的生长性能、提高的氮利用效率以及对在盐或盐水条件下的发芽或生长耐受性增加。
附图简要说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。在要求并且支付所需的费用之后，专利局会提供具有彩色附图的专利或专利申请的副本。
图1.氮同化作用和2-氧戊二酸酰胺生物合成：代谢途径的示意图。
图2.示出过度表达GS1或GPT的转基因烟草植物与野生型烟草植物的比较用照片。从左侧至右侧分别为：野生型植物、紫花苜蓿GS1转基因、拟南芥GPT转基因。参见以下的实施例3和5。
图3.示出过度表达GS1或GPT的转基因小汤姆番茄植物与野生型番茄植物的比较用照片。从左侧到右侧：野生型植物、紫花苜蓿GS1转基因、拟南芥GPT转基因。参见以下的实施例4和6。
图4.示出野生型烟草植物与GS1或GPT转基因烟草植物之间的叶子尺寸的比较用照片。A：来自GS1转基因烟草(底部叶子)和野生型烟草(顶部叶子)的叶子之间的比较；B：GPT转基因烟草(底部叶子)和野生型烟草(顶部叶子)之间的叶子之间的比较。
图5.示出由GS1和GPT转基因烟草系之间的各种杂交产生的转基因烟草植物与野生型植物和单转基因植物的比较情况的照片。A-C：分别为杂交2、3和7。参见下文的实施例7。
图6.示出野生型与GS1和GPT转基因烟草植物之间的杂交品种之间的叶子大小的比较情况的照片。A：GSXGPT杂交3(底部叶子)与野生型的叶子支架的比较情况(顶部叶子)；B：GSXGPT杂交7(底部叶子)与野生型(顶部叶子)的叶子支架的比较情况。参见下文的实施例7。
图7.转基因胡椒植物(右侧)和野生型对照胡椒植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有较大的胡椒果实产量。参见下文的实施例8。
图8.转基因菜豆植物与野生型对照菜豆植物之间的比较(表达拟南芥GPT和GS转基因的几种转基因系)。左上侧：在各天时的植物高度；右上侧：花蕾数目；左下侧：花朵数目；右下侧：菜豆荚数目。野生型为对照，并且品系2A、4A和5B均为转基因植物系。参见下文的实施例9。
图9.转基因菜豆植物(右侧)和野生型对照菜豆植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系。参加下文的实施例9。
图10.转基因菜豆植物荚果、花朵和花蕾与野生型对照菜豆植物的比较情况(表达葡萄GPT和拟南芥GS转基因的转基因系)。参见下文的实施例10。
图11.转基因菜豆植物(右侧)和野生型对照菜豆植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达葡萄GPT和拟南芥GS转基因的转基因系。参见下文的实施例10。
图12.转基因豇豆系A植物与野生型对照豇豆植物的比较(表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系)，其示出转基因植物比野生型对照植物生长更快、开花和结果更早。(A)到5月21号时的相对高度和最长的叶子的测量值；(B)到6月18号时相对的三倍叶和花蕾；(C)到6月22号时的花朵、花蕾和菜豆荚的相对数目。参见下文的实施例11。
图13.转基因豇豆系A植物(右侧)和野生型对照豇豆植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系。参见下文的实施例11。
图14.转基因豇豆品系G植物与野生型对照豇豆植物之间的比较照片(表达葡萄GPT和拟南芥GS转基因的转基因系)，其示出转基因植物比野生型对照植物生长更快、并且开花和结果更早。(A)植物高度，(B)花朵和豆荚数目，(C)叶蕾和三倍叶数目。参加下文的实施例12。
图15.转基因豇豆品系G植物与野生型对照豇豆植物的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达葡萄GPT和拟南芥GS转基因的转基因系。参加下文的实施例12。
图16.转基因甜瓜植物(右侧)和野生型对照相关植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系。参见下文的实施例14。
图17.转基因南瓜植物(右侧)和野生型对照南瓜植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系。参见下文的实施例15。
图18.转基因拟南芥植物(右侧)和野生型对照拟南芥植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系。参见下文的实施例16。
图19.表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因番茄植物与对照番茄植物的比较。(A)转基因番茄植物的叶子(右侧)与野生型对照叶子(左侧)的照片，其示出在转基因植物具有更大的叶子；(B)转基因番茄植物(右侧)和野生型对照植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。参见下文的实施例17。
图20.转基因亚麻荠植物(右侧)和野生型对照亚麻荠植物(左侧)的照片，其示出转基因植物相对于野生型对照植物具有增强的生长。表达拟南芥GPT和GS转基因的转基因系。参见下文的实施例18。
发明详述
定义
除非另外限定，否则本文所用的所有技术术语、符号和其它科学术语都旨在具有本发明所属领域内的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或准备引用的目的，在本文中对具有通常理解的含义的术语进行了定义，并且在本文中引入这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的含义具有实质性区别。本文所描述或引用的技术和过程一般容易理解，并且通常由本领域内的技术人员采用常规的方法进行使用，例如，在以下文献中所述的广泛利用的分子克隆方法，所述文献为：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第三版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols inMolecular Biology(Ausbel等，eds.，John Wiley & Sons公司，2001；Transgenic Plants：Methods and Protocols(Leandro Pena，ed.，Humana Press，第一版，2004)；和Agrobacterium Protocols(Wan，ed.，Humana Press，第二版，2006)。除非指定，否则适当时，涉及利用市售可得的试剂盒和试剂的过程通常根据制造商限定的规程和/或参数进行。
术语“核酸”是指单股形式或双股形式的脱氧核苷酸或核糖核酸及其聚合物(“多核苷酸”)。除非具体限定，否则术语“多核苷酸”包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参引核酸类似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指定，否则特定的核算序列还隐含包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列以及所明确指定的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱和/或脱氧肌苷残基置换的序列实现简并密码子置换(Batzer等，1991，Nucleic Res.19：5081；Ohtsuka等，1985 J.Biol.Chem.260：2605-2608；和Cassol等，1992；Rossolini等，1994，MoI.Cell.Probes 8：91-98)。术语核酸可以与基因、基因编码的cDNA和mRNA交换使用。
术语“启动子”是指用于指导可操作连接的核酸的转录的核酸控制序列的阵列。如本文所用，“植物启动子”是在植物中起作用的启动子。启动子包括在转录的开始位点附近的必需的核酸，如在聚合酶II型启动子的情况下，其为TATA元件。启动子还可任选地包括远侧增强子或抑制子元件，其可以与转录的开始位点相距数千个碱基对。“组成型”启动子为在大多数环境和发育条件下激活的启动子。“诱导型”启动子为在环境或发育条件下激活的启动子。术语“可操作连接”是指核酸表达控制序列和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。这些术语用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及氨基酸类似物和以天然存在氨基酸相似的方式起作用的氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸以及之后经修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢结合的α-碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者经修饰的肽骨架。但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但是却以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。
氨基酸在本文中可以以其通常已知的三字母符号或者由IUPAC-IUB生物化学体系命名委员会推荐的单字母符号进行引用。同样，核苷酸可以以其通常接受的单字母编码进行引用。
术语“植物”包括完整的植物、植物器官(例如，叶子、干部、花、根部等)，种子和植物细胞及其后代。在本发明的方法中可以使用的植物的类别通常宽泛地包括可接受转化技术的更高级的植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)以及裸子植物。其包括各种倍性水平(包括多倍性、二倍性、单倍性和半合子)的植物。
术语“GPT多核苷酸”和“GPT核酸”可以在本文中互换使用，并且可以指编码参与催化2-氧戊二酸酰胺的合成的多肽的基因的全长或部分长多核苷酸，其包括既含有被转译(编码)、又含有未转译序列的多核苷酸以及其补体。术语“GPT编码序列”是指基因的被转录并且编码GPT蛋白的那部分。术语“目标序列”是指蛋白的引导该蛋白进入细胞的亚细胞室(如植物细胞中的叶绿体)内的氨基末端部分。GPT多核苷酸还由其在限定的条件下杂化为本文具体公开的GPT多核苷酸或由其得到的PCR产物的能力所定义。
“GPT转基因”是包含GPT多核苷酸的核酸分子，所述GPT多核苷酸对于具有该核酸分子的转基因植物或植物胚芽、器官或种子是外源的，或者对于具有该GPT多核苷酸的转基因植物的原种植物或植物胚芽、器官或种子是外源的。
术语“GS多核苷酸”和“GS核酸”在本文中可以互换使用，并且是指编码谷氨酰胺合成酶的基因的全长或部分长的多核苷酸序列，并且包括含有转译(编码)以及未转译的序列的多核苷酸及其补体。术语“GS编码序列”是指被转录并且编码GS蛋白的基因部分。术语“GS1多核苷酸”和“GS1核酸”在本文中可以互换使用，并且是指编码谷氨酰胺合成酶异形体1蛋白的基因的全长或部分长的多核苷酸序列，并且包括含有转译(编码)以及未转译的序列的多核苷酸及其补体。术语“GS1编码序列”是指被转录并且编码GS1蛋白的基因部分。
“GS转基因”是包含GS多核苷酸的核酸分子，所述GS多核苷酸对于具有该核酸分子的转基因植物或植物胚芽、器官或种子是外源的，或者对于具有该GPT多核苷酸的转基因植物的原种植物或植物胚芽、器官或种子是外源的。“GS1转基因”是包含GS1多核苷酸的核酸分子，所述GS1多核苷酸对于具有该核酸分子的转基因植物或植物胚芽、器官或种子是外源的，或者对于具有该GPT多核苷酸的转基因植物的原种植物或植物胚芽、器官或种子是外源的。
本文提供了示例性的本发明的GPT多核苷酸，并且包括拟南芥、水稻、大麦、竹子、大豆、葡萄和斑马鱼GPT的GPT编码序列。
部分长度GPT多核苷酸包括编码GPT的N-末端或C-末端的切断物、成熟GPT(没有目标序列)的多核苷酸序列以及编码GPT区域的序列。示例性的编码GPT的N-末端切断物的多核苷酸包括拟南芥-30、-45和-56构造体，其中分别用于SEQ ID NO：2的全长GPT结构的头30、45和56个氨基酸的编码序列被除去。
在采用本发明的GPT多核苷酸产生转化细胞核转基因细胞时，技术人员会认识到，所插入的多核苷酸序列不必是一致的，而是只可以与其衍生的基因的序列是“基本一致的”，如下文所进一步定义的那样。术语“GPT多核苷酸”具体涵盖这种基本一致的变体。相似地，技术人员会认识到，由于密码子简并性，大量的多核苷酸会编码相同的多肽，并且所有这些多肽序列都旨在包括在术语GPT多核苷酸内。此外，该术语具体地包括与本文所公开的GPT多核苷酸序列基本上一致(按照下文所述方式确定)的那些序列，并且这些序列编码作为野生型GPT多肽的突变体或者保留GPT多肽的功能(由GPT多肽中的氨基酸的保守置换而实现)的多肽。因此，术语“GPT多核苷酸”还包括这种基本一致的变体。
术语“保守修饰的变体”既用于氨基酸序列，又用于核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸不将氨基酸序列编码至基本一致的序列的核酸。由于遗传密码的简并性，因此大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸-丙氨酸。由此，在丙氨酸由密码子规定的每个位置处，密码子可以被改变为所述的相应密码子的任意一者，而不改变所编码的多肽。这些核酸变型为“静默变型”，其为保守修饰的变型的一个具体种类。本文中的编码多肽的每一个核酸序列均还描述核酸的每一个可能的静默变型。技术人员将会认识到，核酸中的各密码子(除了通常作为蛋氨酸的唯一密码子的AUG和通常作为色氨酸的唯一密码子的TGG之外)均可以被修饰为产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各静默变型暗含在每一个所述的序列中。
关于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独置换、缺失或添加(其改变、添加或除去编码序列中的单独氨基酸或小比例的氨基酸)为“保守修饰的变体”，其中该变型使得用化学相似的氨基酸置换氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守置换表为本领域内公知的。这些保守修饰的变体还包括并且不排除本发明的多态变体、种间同源体和等位基因。
以下的8组均包含对于另一者为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺酸(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。
诸如多肽结构等大分子结构可以用各种层次的构造进行描述。对于这种构造的一般讨论，参见文献(例如)Alberts等，Molecular Biology of theCell(3rd ed.，1994)和Cantor and Schimmel，Biophysical Chemistry PartI：The Conformation of Biological Macromolecυles(1980)。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常被称为结构域。结构域为多肽中的形成多肽的紧凑单元的部分，并且其长度通常为25至约500个氨基酸。典型的结构域由较少的构造的部分构成，如β-片和α-螺旋的伸长物。“三级结构”是指多肽单体的完全三维的结构。“四级结构”是指由单独的三级单元的非共价缔合。各向异性项也被称为能量项。
术语“分离”是指这样的材料，其基本上不含或者根本不含通常在材料以其本身状态或天然状态存在时伴随的成分。然而，术语“分离”并不是指存在于电泳凝胶或其它分离介质中的成分。分离的成分不含这种分离介质，并且处于即将用于其它应用或已经用于新应用/环境的形式。“分离”的抗体为已经被确认并且与其天然环境的成分分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分为干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选的实施方案中，抗体被纯化为：(1)通过Lowry法测定，占抗体的大于95重量％，并且最优选大于99重量％，(2)通过使用旋杯序列分析仪，达到足以获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)使用考马斯蓝或优选使用银染料在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE使其达到同质性。分离抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分不会存在。然而，通常分离抗体通过至少一个分离步骤进行制备。
参照核酸的一部分使用的术语“异源”是指核酸包括两个或多个本身不以彼此相同的关系存在的子序列。例如，核酸通常以重组方式制备，从而具有两个或多个来源于被布置为形成新功能的核酸的不相关基因的序列，例如编码来自一个来源的蛋白的核酸和编码来自另一个来源的蛋白序列的核酸。相似地，异源蛋白是指蛋白包括两个或多个本身不以彼此相同的关系存在的子序列。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致”百分比是指这样的两个序列或子序列，它们相同或者具有特定百分比例的相同氨基酸残基或核苷酸(即在比较窗或通过使用序列比对算法测量的指定区域内进行比较并且比对以最大化对应关系时，或者通过手工对准并且目视检测时，具有约70％的一致性、优选75％、80％、85％、90％或95％的一致性)。该定义还指测试序列的补体，该补体在测试序列基本上与参照序列同源时基本上具有序列或子序列互配能力。该定义还指测试序列的补体，该补体在测试序列基本上与参照序列同源时基本上具有序列或子序列互配能力。
在参照多肽使用序列一致性百分比时，应认识到，不同来源的残基位置的区域通常在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被置换为具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此，并不改变多肽的功能特性。在序列的区别在于保守置换时，序列一致性百分比可以往上调节，以校正置换的保守性质。
为了序列比较，通常一个序列用作测试序列被比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，如果需要的话，指定子序列坐标轴，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或者可以指定可供选用的其它参数。序列比较算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。
本文所用的“比较窗”包括对多个邻接位置中的任意一者的片段的参照，所述位置选自由20至600组成的组，通常为约50至约200、更通常为约100至约150，其中在将两个序列优化对准之后，可以将序列与具有相同数目的邻接位置的参照序列进行比较。对准比较用序列的方法是本领域内公知的。可以通过以下方法进行比较用序列的优化对准，所述方法例如为Smith & Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部同源算法；Needleman & Wunsch，1970，J.MoI.Bio。48：443的局部同源算法；Pearson& Lipman，1988，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似度检索方法；这些算法的计算机实施(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA in theWisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr。，Madison，Wl)；或者手工对准并且目视观测(参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.1995 supplement))。
适合于确定序列一致性百分比和序列相似度的算法的优选例子为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在文献Altschul等，1977，Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等，1990，J.MoI.Biol.215：403-410中有所描述。通常与本文所述的默认参数一起使用BLAST和BLAST 2.0，以确定本发明的核酸和蛋白质的序列一致性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。该算法包括：首先通过识别研究序列中长度为W的短字从而确认高分值序列对(HSP)，在其与数据库序列中的相同长度的字串匹配时，其匹配或者符合一些正值的阈分值T。T被称为相邻字串的分值阈(Altschul等，见下文)。这些初始的相邻击中字串用作引动检索以发现含有它们的更长的HSP的种子。将这些击中字串在两个方向上沿各序列延伸，以使得累积匹配分值尽可能增加。对于核苷酸序列而言，使用(例如)参数M(一对匹配残基的奖励分值；总是＞0)和N(残基失配的罚分；总是＜0)计算累积分值。对于氨基酸序列，采用计分矩阵计算累积分值。击中字串在各方向的延伸在以下情况时终止：累积匹配分值由其实现的最大值降低了量X；由于一个或多个负值残基匹配而使得累积分值达到0或以下；或者达到任何一个序列的末端。BLAST参数W、T和X确定匹配的灵敏度和速率。BLASTN程序默认采用的(对于核苷酸而言)字串长度(W)为11，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4并且采用两股同时比对。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序默认采用的字串长度为3，并且预期值(E)为10，以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.ScL USA 89：10915(1989))，匹配值(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及采用两股同时比对。
BLAST算法还在两个序列之间进行统计分析(参见，例如，Karlin &Altschul，1993，Proc.Natl Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一个相似度的量度为最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸和氨基酸序列随机之间随机实现匹配的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参照核酸比较时，最小和概率低于约0.2，最优选低于约0.01并且最优选低于约0.001，则认为核酸与参照序列相似。
短语“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，探针通常以核酸的复合混合物的形式与其目标子序列杂交，但是与其它核酸并不杂交。严格条件具有序列依赖性，并且在不同情况下而有不同。较长的序列特异性地在较高的温度下杂交。核酸杂交的更深指导参见文献Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic assays”(1993)。通常，高度严格的条件在限定的离子强度pH下被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。低严格性的条件通常被选择为比Tm低约15-30℃。Tm为50％的与目标物互补的探针与目标序列平衡杂交的温度(在限定的离子强度pH和核酸浓度下)，即当目标序列过量存在时，在Tm下，50％的探针被平衡占用)。严格条件为这样的条件下，其中在pH为7.0至8的情况下，盐浓度为低于约0.1M钠离子浓度，通常为约0.01至1M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于较短的探针(例如，10至50个核苷酸)而言为至少约30℃，并且对于较长的探针(例如，大于50个核苷酸)而言为约60℃。还可以添加诸如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。为了选择性或特异性杂交，阳性信号为背景杂交信号的至少2倍，优选为背景杂交信号的10倍。
如果核酸编码的多核苷酸为基本上一致的，则在严格条件下不彼此杂交的核酸仍然是基本上一致的。(例如)当使用由遗传密码许可的最大密码子简并性来产生核酸拷贝时会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格的条件下进行杂交。
可以采用本文公开的GPT多核苷酸序列通过标准的Southern印迹方法在严格条件下确认含有GPT多核苷酸的基因组DNA或cDNA。为了实现该目的，用于上述杂交的合适的严格条件为以下的条件或等价条件，所述条件包括在37℃的40％甲酰胺、1M NaCI、1％SDS的缓冲溶液中进行杂交，并且在至少约50℃、通常约55℃至约60℃下进行一次洗涤，洗涤时间为20分钟。阳性杂交信号为背景信号的至少2倍。普通的技术人员会容易理解，可以采用其它可供选用的杂交和洗涤条件来提供相似严格度的条件。
两个多核苷酸基本上同源的其它指标是通过一对寡核苷酸引物将参照序列扩增，然后可以将其在严格条件下用作探针，以从cDNA或基因组图谱中分离出测试序列，或者以(例如)northern或Southern印迹法识别测试序列。
转基因植物：
本发明提供表现出基本上增强的农学特性的转基因植物，所述农学特性包括较快的生长、较高的成熟植物鲜重和总生物量、以及更充分的开花和更大的果实、荚果和种子产量。本发明的转基因植物通过向植物中引入一个或多个可表达的基因构造体而产生，所述基因构造体能够驱使编码谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)的一个或多个多核苷酸的表达。在一个示例性的实施方案中，产生携带GPT或GS1转基因编码序列的单转基因亲本品系(优选进行自体受精直至转基因是纯合的为止)，然后进行杂交，以产生含有两种转基因的后代植物。
在本发明的稳定转化实施方案中，可表达的基因构造体的一个或多个拷贝被整合到主体植物基因组中，从而为植物提供增强的GS和GPT酶能力，其用于介导2-氧戊二酸酰胺的合成增加，2-氧戊二酸酰胺进而传导代谢基因表达的信号，从而产生增强的植物生长和增强的其它农学特性。2-氧戊二酸酰胺为用作基因表达、代谢和植物生长的非常有效的效应物的代谢物(美国专利6,555,500)，并且在协调碳代谢和氮代谢体系时起到重要的作用(Lancien等，2000，Enzyme Redundancy and the Importance2-Oxoglutarate in Higher plants Ammonium Assimilation，Plant Physiol.123：817-824)。还参见图1所示的2-氧戊二酸酰胺途径的示意图。
在本发明的一个方面中，申请人已经分离了编码拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)酶(参见以下的实施例)的核酸分子，并且首次证明了经表达的重组酶是活性，并且能够催化信号代谢物-2-氧戊二酸酰胺的合成(下文的实施例2)。此外，申请人首次证明了拟南芥谷氨酰胺转氨酶基因在异源植物中的过度表达产生提高的CO2固定速率和增强的生长特性(下文的实施例3)。
申请人以前的研究证明，在强效组成型启动子的控制下过度表达紫花苜蓿GS1基因产生在叶子内具有更高水平的GS活性的转基因烟草植物。这些植物的生长优于其野生型相应植物，固定CO2速率更快，含有浓度增加的总蛋白，以及浓度增加的谷氨酰胺和2-氧戊二酸酰胺，并且通过它们的根显示出增加的硝酸盐摄取速率。
如本文所公开(参见下文的实施例3)，包含全长拟南芥GPT编码序列的转基因在转基因烟草植物中的过度表达还产生更快的CO2固定速率，以及增多的总蛋白、谷氨酰胺和2-氧戊二酸酰胺的水平。这些转基因植物比野生型植物还生长更快(图2)。相似地，在用番茄植物进行的预研究中(参见下文的实施例4)，用拟南芥GPT转基因转化的番茄植物与野生型对照植物相比，显示出显著提高的生长速率，开花率和种子产量(图3和下文的实施例4)。
在一个具体的实施方案中(通过下文的实施例3、5和7所示例)，采用农杆菌介导的基因转化方法在选择性压力下产生了携带紫花苜蓿GS基因(包括5’和3’未转译区域)的第一组亲本单转基因烟草植物品系，同时筛选出了生长最快的表型，并且自体受精，直至转基因/表型纯合(参见下文的实施例5)。以相同的方式产生携带拟南芥GPT的全长编码序列的第二组亲本单转基因烟草植物(参见下文的实施例3)。然后将得自各亲本品系的表现出高生长速率的织物进行有性杂交，从而得到后代品系(参加下文的实施例7)。
与单转基因亲本品系以及野生型植物相比，由拟南芥GS1和GPT转基因烟草植物的多重杂交得到的后代的生长速率得到了明显更好、并且颇为出乎意料的提高。图5示出得自单转基因GS1 X GPT杂交的双转基因后代的照片(与野生型和单转基因亲本植物相比)。图6示出双转基因后代和野生型植物的比较用照片。这些双转基因植物的试验观察的生长速率比野生型植物高200％至300％(参见下文的实施例7)。此外，总生物量水平在双转基因植物中显著增加，其中完整植物鲜重通常为野生植物重量的约2至3倍。类似地，双转基因植物的种子产量显示出类似的提高，同时种荚产量通常为野生型平均值的2至3倍，并且总种子产量比野生型植物高300-400％。
除了上述的转基因烟草植物，本文还示例了多个其它品种的包含GPT和GS转基因的转基因植物。如本文所示例，在两个品种的番茄(参见实施例4和17)、胡椒(实施例8)、菜豆(实施例9和10)、豇豆(实施例11和12)、紫花苜蓿(实施例13)、甜瓜(实施例14)、南瓜(实施例15)、拟南芥(实施例16)和亚麻荠(Camilena)中产生了显示出增强的生长特性的转基因植物。如本文示例的那样，通过采用各种转化方法并且借助于单转基因植物的有性杂交产生了本发明的这些转基因植物，所述方法包括农杆菌介导的愈伤组织转化、蘸花转化(floral dip)、种子接种、荚果接种和直接花接种以及它们的组合。如本文所示例的那样，成功地采用不同的GPT和GS转基因产生了本发明的转基因植物。
本发明还提供产生具有增强的生长特性和其它农学特性的转基因植物的方法。在一个实施方案中，产生具有增强的生长特性和其它农学特性的转基因植物的方法包括：在能够驱使转基因表达的合适启动子的控制下，将包含编码GPT转基因的核酸分子的表达盒引入到植物细胞中，从而产生转化的植物细胞，并且获得表达经编码的GPT的转基因植物。在另一个实施方案中，产生具有增强的生长特性和其它农学特性的转基因植物的方法包括：在能够驱使转基因表达的一个或多个合适启动子(可任选的其它调节元件)的控制下，将包含编码GPT转基因和GS转基因的核酸分子的一个或多个核酸构造体或表达盒引入到植物细胞中，从而产生由此转化的植物细胞，并且获得表达GPT转基因和GS转基因的转基因植物。
基于本文所公开的结果，显而易见的是，可以采用任意数量的GPT和GS多核苷酸来产生本发明的转基因植物。GS和GPT蛋白在各种不同的植物品种之间均是高度保守的，并且由本文公开的试验数据可以看出，紧密相关的非植物GPT(例如，斑马鱼GPT)也可以使用。关于GPT，来自不同品种的多种GPT多核苷酸已经显示出具有活性，并且可用作GPT转基因。类似地，可以采用不同的GS多核苷酸，其包括(而不限于)在用可表达的GS1构造体转化的主体细胞内产生GS活性的任何植物GS1编码多核苷酸。
在具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自拟南芥的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：30所示的GPT，并且GS转基因为编码得自紫花苜蓿的GS1(即SEQ ID NO：4)或得自拟南芥的GS1(即SEQ ID NO：7)的GS多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：2所示多肽的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO：2所示多肽具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；以及编码在SEQ ID NO：2中的氨基末端切下30至56个氨基酸的多肽的核苷酸序列或者编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。GS1转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；以及编码SEQ ID NO：4或7所示多肽的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO：4或7所示多肽具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在另一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自葡萄的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：31所示的葡萄GPT，并且GS转基因为GS1多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQID NO：8所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：8具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：31所示的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自水稻的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：32所示的水稻GPT，并且GS转基因为GS1多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQID NO：10所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：10具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQID NO：11和SEQ ID NO：32所示的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自大豆的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33或在序列的N末端具有另外的异亮氨酸的SEQ ID NO：33的大豆GPT，并且GS转基因为GS1多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：12具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：33或在序列的N末端具有另外的异亮氨酸的SEQ ID NO：33的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自大麦的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：34的大麦GPT，并且GS转基因为GS1多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ IDNO：14所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：10具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：34的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自斑马鱼的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：35的斑马鱼GPT，并且GS转基因为GS1多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQID NO：16所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：16具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQID NO：17或SEQ ID NO：35的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自竹子的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：36的竹子GPT，并且GS转基因为GS1多核苷酸。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：36的核苷酸序列；或编码其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。
在本发明的实施中，其它适合用作GPT转基因的GPT多核苷酸可以由本领域内的技术人员所认识的各种手段获得，并且测试其在重组表达载体体系(即大肠杆菌(参见实施例20-23)中、在瞬间的植物表达体系(参见实施例19)中或在转基因植物(参见实施例1-18)中指导GPT的表达以及GPT活性的能力
转基因构造体/表达载体
为了产生本发明的转基因植物，必须将用于所需转基因的基因编码序列引入到核酸构造体(在本文中其还可互换地称为(转基因)表达载体、表达盒、表达构造体或表达可表达基因构造体)中，所述构造体能够在转化的植物细胞中指导转基因序列的表达。可以使用多种本领域内已知的方法(其包括但是不限于电穿孔法、DNA枪轰击法或粒子传递法、微注射法)并且借助于各种基于DNA的载体(如根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌)将携带所关注转基因的这种核酸构造体引入到植物细胞内。一旦将核酸构造体引入到转化的植物细胞内，其可以采用瞬间或稳定方式指导所引入的转基因(即GPT)的表达。稳定表达是优选的，并且可以利用能够指导转基因构造体的染色体整合的植物转化载体来实现。一旦植物细胞成功转化，可以将其培育，以使转基因植物再生。
多种适合于在转化植物内驱使所插入基因的组成型或诱导型表达的表达载体是已知的。此外，各种瞬间表达载体和体系是已知的。在很大程度上，选择合适的表达载体用于基因转化的特定方法中(参见下文)。宽泛地说，用于产生转基因植物的典型植物表达载体包括在启动子的表达调节控制下的所关注基因、用于辅助转化株的选择的选择性标记物和转录终止子序列。
更具体而言，用于产生本发明的转基因植物的核酸构造体的基本元件为：能够在转化植物细胞内知道转基因的功能表达的合适启动子；与启动子可操作地连接的转基因(即GPT编码序列)；与转基因可操作地连接的优选的合适转录终止序列(即胭脂碱合成酶基因终止子)和通常用于控制转基因的表达的其它元件，以及一个或多个适合于选择所需转基因产物的选择性标记物基因(即耐抗生素基因)。
由于根癌土壤杆菌为用于产生转基因植物的主要转化体系，因此存在设计用于土壤杆菌转化的各种载体。为了稳定转化，土壤杆菌体系利用“二元”载体，该载体允许质粒在大肠杆菌和土壤杆菌均能操作，并且通常包含一个或多个选择性标记物，以回收转化的植物(Hellens等，2000，Technical focus：A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends Plant Sci5：446-451)。用于土壤杆菌转化体系中的二元载体通常包含T-DNA的边区、多个克隆位点、用于大肠杆菌和根癌土壤杆菌的复制功能区和选择性标记物以及报道基因。
所谓的“超二元”载体提供更高的转化效率，并且通常包含来自Ti的附加致病基因(Komari等，2006，Methods MoI.Biol.343：15-41)。超二元载体通常用于表现出较低的转化效率的植物，如谷物。这种附加的致病基因包括而不限于virB、virE和virG(Vain等，2004，The effect of additionalvirulence genes on transformation efficiency，transgene integration andexpression in rice plants using the pGreen/pSoup dual binary vector system.Transgenic Res.13：593-603；Srivatanakul等，2000，Additional virulencegenes influence transgen expression：transgen copy number，integration patternand expression，J.Plant Physiol.157，685-690；Park等，2000，ShorterT-DNA or additional virulence genes improve Agrobacteriυm-mediatedtransformation.Theor.Appl.Genet.101，1015-1020；Jin等，1987，Genesresponsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciensA281.J.Bacteriol.169：4417-4425)。
在本文示例的实施方案中(参见下文的实施例)，采用其中将插入的转基因置于组成型CaMV 35S启动子和RuBisCo启动子的控制下的表达载体。多种利用CaMV 35S启动子和RuBisCo启动子的表达载体是已知的，并且/或者是市售可得的并且/或者使用本领域普通技术衍生的。
植物启动子
术语“启动子”用于指示基因转录开始位点(TSS)上游的基因组序列内的区域，但是TSS下游的序列还可以影响转录启动。启动子元件选择转录启动点、转录特异性和速率。根据距TSS的距离，还可以采用“近端启动子“(TSS周围的数百个核苷酸)和“远端启动子”(TSS上游的数千和更多的核苷酸)这样的术语。近端启动子和远端启动子均包括参与细胞阶段、组织阶段、器官阶段、发育阶段的复杂过程和转录的环境因素调节的各种元件的组合。大多数调节TSS选择的启动子位于近端启动子。
在植物中起作用的多种启动子是本领域内已知的。在构造GPT和GS转基因构造体时，选择的启动子可以为组成型的、非特异性的启动子，如花椰菜花叶病毒35S核糖体启动子(CaMV 35S启动子)，其广泛用于转基因在植物内的表达。其它的强效组成型启动子包括而不限于：水稻肌动蛋白1启动子、CaMV 19S启动子、Ti质粒胭脂碱合成酶启动子、醇脱氢酶启动子和蔗糖合成酶启动子。
或者，在一些实施方案中，可能有利的是，基于以下因素选择启动子，所述因素为：旨在由转基因构造体转化的所需植物细胞、转基因的所需表达水平、用于转基因表达的所需组织或亚细胞区室、所针对的发育阶段等。
例如，当需要在光合组织和区室中进行表达时，可以采用核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)基因启动子。在下面的实施例中，制备了包含在番茄RuBisCo启动子控制下的GPT和GS1转基因的可表达核酸载体，并且将其用于产生转基因植物，或者在植物内或大肠杆菌内分析GPT活性。
当需要在种子内进行表达时，可以采用种子存储蛋白基因启动子。当需要在果实内表达时，可以采用果实特异性启动子，如番茄2A11。其它组织特异性启动子的例子包括编码以下物质的启动子：植物血凝素(Vodkin等，1983，Cell 34：1023-31；Lindstrom等，1990，Developmental Genetics11：160-167)，玉米醇脱氢酶1(Vogel等，1989，J.Cell.Biochem.(Suppl.0)13：Part D；Dennis等，1984，Nucl.Acids Res.，12(9：3983-4000)，玉米光捕集复合物(Simpson，1986，Science，233：34-38；Bansal等，1992，Proc.Natl Acad.Sci.USA，89：3654-3658)，玉米热冲击蛋白(Odell等，1985，Nature，313：810-812；Rochester等，1986，EMBO J.，5：451-458)，豌豆小子单元RuBP羧化酶(Poulsen等，1986，MoI.Gen.Genet，205(2：193-200；Cashmore等，1983，Gen.Eng，Plants，Plenum Press，New York，pp29-38)；Ti质粒甘露碱合成酶和Ti质粒胭脂碱合成酶(Langridge等，1989，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，86：3219-3223)，矮牵牛花查耳酮异构化酶(VanTunen等，1988，EMBO J.7(5：1257-1263)，大豆甘氨酸富集酶1(Keller等，1989，EMBO J.8(5：1309-1314)，切断的CaMV 35(Odell等，1985，上文)，番茄储藏蛋白(Wenzler等，1989，Plant MoI.Biol.12：41-50)，根细胞(Conkling等，1990，Palnt Physiol.93：1203-1211)，玉米蛋白(Reina等，1990，Nucl.Acids Res.18(21：6426；Kriz等，1987，MoI.Gen.Genet.207(1)：90-98；Wandelt and Feix，1989，Nuc.Acids Res.17(6：2354；Langridge和Feix，1983，Cell 34：1015-1022；Reina等，1990，Nucl.AcidsRes.18(21：6426)，球蛋白-1(Belanger and Kriz，1991，Genetics 129：863-872)，α-微管蛋白(Carpenter等，1992，Plant Cell 4(5：557-571；Uribe等，1998，Plant MoI.Biol.37(6：1069-1078)，cab启动子(Sullivan等，1989，MoI.Gen.Genet.215(3)：431-440)，PEPCase(Hudspeth和Grula，1989，Plant MoI.Biol.12：579-589)，R基因复合物(Chandler等，1989，The Plant Cell 1：1175-1183)，查耳酮合成酶(Franken等，1991，EMBO J.10(9)：2605-2612)和谷氨酰胺合成酶启动子(美国专利NO.5,391,725；Edwards等，1990，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 87：3459-3463；Brears等，1991，Plant J.1(2：235-244)。
除了组成型启动子以外，在转基因植物再生、成熟、开花等时需要调节转基因表达的情况下还可以采用各种诱导型启动子序列。诱导型启动子的例子包括：热冲击基因、保护反应基因(即苯基丙氨酸解氨酶；参见，例如，Bevan等，1989，EMBO J.8(7：899-906)、创伤反应基因(即细胞壁蛋白基因)、化学诱导基因(即硝酸盐还原酶，几丁质酶)和黑暗诱导基因(即天冬酰胺酸合成酶；例如，参见美国专利NO.5,256,558)的启动子。此外，多种植物核基因由光激活，其包括编码主叶绿素a/b结合蛋白(cab)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rbcS)的小子单元的基因家族(例如，参见Tobin和Silverthome，1985，Annu。Rev.Plant Physiol.36：569-593；Dean等，1989，Annu.Rev.Plant Physiol.40：415-439)。
其它诱导型启动子包括ABA诱导启动子和细胞组织膨胀诱导启动子，生长素结合蛋白启动子(Schwob等，1993，Plant J.4(3)：423-432)，UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston等，1988，Genetics 119(1：185-197)；MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等，1994，Plant J.6(2：141-150)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子基因启动子(Kohler等，1995，PlantMoI.Biol.29(6：1293-1298；Quigley等，1989，J.MoI.Evol。29(5：412-421；Martinez等，1989，J.MoI.Biol.208(4)：551-565)和得自豌豆的光诱导质体谷氨酰胺合成酶基因(美国No.5,391,725；Edwards等，1990，上文)。
关于在植物转基因技术中使用的植物启动子的综述，参见文献Potenza等，2004，In Vitro Cell.Devel.Biol-Plant，40(1)：1-22。关于合成植物启动子工程的综述，参见(例如)文献Venter，M.，2007，Trends Plant ScL，12(3：118-124)。
谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)转基因
本发明首次公开了植物含有在信号代谢物2-羟基-5-氧脯氨酸的合成中直接起作用的谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)。迄今为止，尚未记载具有限定功能的植物转氨酶。申请人已经分离并且测试了得自几种植物和动物品种的GPT多核苷酸编码序列，并且成功地将基因引入到异源转基因主体植物中，所述转基因植物表现出显著增强的生长特性，包括较快的生长、较高的叶子蛋白含量、在叶子组织内增加的谷氨酰胺合成酶活性和较快的CO2固定速率。
在本发明的实施中，GPT转基因用作并入本发明转基因植物内的至少两种转基因中的一种，另一种为谷氨酰胺合成酶基因(参见下文)。
预期所有植物品种均含有在相同的代谢途径起作用的GPT，从而参与信号代谢物2-羟基-5氧脯氨酸的生物合成。因此，在本发明的实施中，编码GPT类似于或其功能变体的任何植物基因均可以用于产生本发明的转基因植物。此外，考虑到各种植物GPT基因蛋白结构和来自斑马鱼的突变(并且生物活性)的GPT类似物之间(参见实施例22)的相似性，因此可以在制备用于产生本发明的转基因植物时采用其它的非植物GPT类似物。
当与SEQ ID NO：30提供的拟南芥成熟蛋白序列进行单独比较(通过BLAST比对)时，针对以下的成熟GPT蛋白获得下述的序列一致性和同系性(BLAST“阳性率”，包括类似氨基酸)：
Figure BPA00001327983800271
通过强调大多数植物品种之前的GPT蛋白的结构的保守性质，在上述植物品种中观察到的保守性扩大至来自于斑马鱼和衣滴虫的非人类突变GPT。在斑马鱼的情况下，同源程度极高(与SEQ ID NO：30的成熟拟南芥GPT具有83％的氨基酸序列一致性，并且考虑了相似的氨基酸序列具有92％的同系性)。斑马鱼成熟GPT通过在大肠杆菌中进行表达并且证明其生物活性(2-氧戊二酸酰胺的合成)而进行了确认。
为了确认突变GPT类似物是否适合于产生本发明的生长增强的转基因植物，需要最初在大肠杆菌或其它合适的主体中表达其编码序列，并且确定2-氧戊二酸酰胺信号代谢物是否以升高的水平合成(参见实施例19-23)。在证明上述的增加时，然后可以将编码序列同时引入同种的植物主体以及异源的植物主体内，并且评价生长特性。能够特异性地检测2-氧戊二酸酰胺的任何分析方法均可以用于该目的，包括而不限于在下文的实施例2中所述的NMR和HPLC分析方法。此外，可以采用直接测量GPT活性的分析方法，如实施例7所述的GPT活性分析方法。
可以将具有2-氧戊二酸酰胺合成活性的任意植物GPT用于转化植物细胞，以产生本发明的转基因植物。在植物品种中出现高水平的结构同系性，其似乎超出了植物的范围，如各种植物GPT蛋白和突变斑马鱼GPT类似物之间的密切同系性所证明的那样。因此，可以采用各种植物GPT基因在多种医异源的植物品种中产生生长增强的植物。此外，在同种植物中表达的GPT转基因预期也会产生期望的生长增强特性(即水稻谷氨酰胺转氨酶在转基因水稻植物中过度表达)，但是在同源细胞中的调节也可能以在异源细胞中不可操作的某种方式减弱表达。
谷氨酰胺合成酶(GS)转基因
在本发明的实施中，谷氨酰胺合成酶(GS)基因用作并入本发明的转基因植物内的至少两种转基因中的一种(GPT为这两种中的另一种)。
谷氨酰胺合成酶在植物以及动物和细菌内起到重要的作用。GS酶催化氨添加到谷氨酸上，以按照ATP依赖反应合成谷氨酰胺。得自于各种物种的GS酶显示出高度保守的氨基酸序列(其被认为对活性位点功能是重要的)，从而表明GS酶起到相似的作用(关于其综述，参见Eisenberg等，Biochimica et Biophysica Acta，1477：122145，2000)。
GS分布于不同的亚细胞位置(叶绿体和细胞质)，并且存在于各种植物组织(包括叶子、根、芽、种子和果实)内。植物GS存在两种主要的异形体：细胞溶质异形体(GS1)和细胞质异形体(GS2)。GS2主要存在于叶子组织内，并且起到同化通过光呼吸或通过硝酸盐还原而产生的氨的作用。GS1主要存在于叶子和根组织内，通常在更高等的植物内以多种不同的异形体形式存在，并且起到同化由所有其它生物过程产生的氨的作用(Coruzzi，1991，Plant Science 74：145-155；McGrath和Coruzzi，1991，Plant J.1(3)：275-280；Lam等，1996，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47：569-593；Stitt，1999，Curr.Op.Plant Biol.2：178-186；Oliveira等，2001，Brazilian J.Med.Biol.Res.34：567-575)。多种GS基因与复杂的启动子指令有关，所述指令能够以器官和组织特异性方式以及环境因素依赖方式表达GS。
植物谷氨酰胺合成酶由8个亚单元构成，并且植物内的天然酶的分子质量为320至380kD，各亚单元的分子质量为38至45kD。已经克隆出几种植物(特别是豆科植物)的GS1基因，并且进行了测序(Tischer等，1986，Mol Gen Genet.203：221-229；Gebhardt等，1986，EMBO J.5：1429-1435；Tingey等，1987，EMBO J.6：1-9；Tingey等，1988，J Biol Chem.263：9651-9657；Bennett等，1989，Plant Mol Biol.12：553-565；Boron andLegocki，1993，Gene 136：95-102；Roche等，1993，Plant Mol Biol.22：971-983；Marsolier等，1995，Plant Mol Biol.27：1-15；Temple等，1995，Mol Plant-Microbe Interact.8：218-227)。发现所有这些GS基因均通过核基因编码(对于其综述，参见Morey等，2002，Plant Physiol.128(1)：182-193)。
叶绿体GS2通过单基因编码，而各种细胞溶质GS1异形体通过多基因类别编码(Tingey等，1987，上文；Sakamoto等，1989，Plant Mol.Biol.13：611-614；Brears等，1991，上文；Li等，1993，Plant Mol.Biol.，23：401-407；Dubois等，1996，Plant Mol.Biol.，31：803-817；Lam等，1996，上文)。GS1多基因类别似乎编码不同的亚单元，该亚单元可组合，从而形成均八聚体或杂八聚体，并且不同的成员显示出独特的表达模式(从而表明基因成员被差异性地调节)，这可能与谷氨酰胺合成酶在整个氮代谢中起到的各种功能作用有关(Gebhardt等，1986，上文；Tingey等，1987，上文；Bennett等，1989，上文；Walker and Coruzzi，1989，上文；Peterman and Goodman，1991，Mol Gen Genet.1991；330：145-154.；Marsolier等，1995，上文；Temple等，1995，上文；Dubois等，1996，上文)。
在一个实施方案中，采用GS1基因编码序列产生GS转基因构造体。在下面的实施例所描述的特定的实施方案中，采用紫花苜蓿或拟南芥GS1基因编码序列产生转基因构造体，该构造体可以用于产生表达GS1转基因的转基因植物。作为一个例子，可以采用该构造体转化农杆菌。然后可以采用转化的农杆菌产生T0转基因植物。实施例5示出了使用该方法产生T0GS1转基因烟草植物。类似地，实施例6和17示出了产生T0GS1转基因番茄植物，实施例8示出了产生T0GS1转基因胡椒植物，实施例9和10示出了产生T0GS1转基因菜豆植物，实施例11和12示出了T0GS1转基因豇豆植物，实施例13示出了产生T0GS1转基因紫花苜蓿植物，实施例14示出了产生T0GS1转基因甜瓜植物，实施例15示出了产生T0GS1转基因南瓜植物，实施例16示出了产生T0GS1转基因拟南芥植物，并且实施例18示出了产生T0GS1转基因亚麻荠植物。
转录终止子：
在优选的实施方案中，将3’转录终止序列引入到转基因的下游，以引导转录的终止并且允许mRNA转录的正确多腺苷酸化。合适的转录终止子为已知在植物中起作用的那些，其包括而不限于：根癌土壤杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)基因、得自章鱼碱合成酶基因的T7转录、得自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II的3’末端、CaMV 35S终止子、tml终止子和豌豆rbcS E9终止子。此外，可以采用基因本身的转录终止子。在具体的实施方案中，由下文的实施例所述，采用了胭脂碱合成酶转录终止子。
选择性标记物：
通常在转基因表达载体中包括选择性标记物，以提供选转化株的手段。虽然可以利用各种类型的标记物，但是通常采用各种负选择标记物，包括赋予选择剂(其抑制或杀灭未转化的细胞)抗性的那些，如赋予抗生素(如卡那霉素、庆大霉素、anamycin、潮霉素和潮霉素B)抗性的基因，或赋予除草剂(如磺脲、草丁膦、草胺磷和草甘膦)抗性的基因。可筛选的标记物包括：(例如)编码β-葡萄糖苷酸酶的基因(Jefferson，1987，PlantMoI.Biol.Rep 5：387-405)、编码荧光素酶的基因(Ow等，1986，Science 234：856-859)和编码参与产生或控制花青素颜料的蛋白的各种基因(例如，参见美国专利6,573,432)。大肠杆菌葡萄糖苷酸酶(gus、gusA或uidA)已经在植物转化中称为广泛使用的选择标记物，这主要是因为葡萄糖苷酸酶的稳定性、高灵敏度和容易检测(例如，荧光测定法、分光光度法、各种组织化学法)。此外，在大多数高等植物品种中，基本上没有可检测的葡萄糖苷酸酶。
转化方法和体系：
各种用于将本发明的转基因表达载体构造体引入到植物或植物细胞内的方法对本领域的技术人员而言是熟知的，并且可以利用能够转化目标植物或植物细胞的任何方法。
农杆菌介导的转化法可能是在植物转基因技术中利用最普遍的方法，并且用于多种植物的农杆菌介导的转化的规程在以下文献中具有详尽描述(例如，参见Agrobacterium Protocols，Wan，ed.，Humana Press，2nd edition，2006)。根癌农杆菌为革兰阴性土壤细菌，其通过在植物细胞内插入肿瘤诱导DNA(“T-DNA”、“转移DNA”)的小片段而在大量的双子叶植物品种中导致肿瘤(冠瘿病)，该细菌在半随机位置被并入到植物基因组内，并且最终可能变得稳定地并入其中。直接重复地DNA序列(称为界区)限定T-DNA的左端和右端。T-DNA可以与Ti-质粒的其余部分物理分离，从而产生“二元”载体。
农杆菌转化可以用于稳定地转化双子叶植物、单子叶植物及其细胞(Rogers等，1986，Methods Enzymol.，118：627-641；Hemalsteen等，1984，EMBO J.，3：3039-3041；Hoykass-Van Slogteren等，1984，Nature，311：763-764；Grimsley等，1987，Nature 325：167-1679；Boulton等，1989，Plant MoI.Biol.12：31-40；Gould等，1991，Plant Physiol.95：426-434)。各种用于将细胞DNA引入到农杆菌内的方法是已知的，包括电穿孔法、冷冻/融解法和三亲本杂交。将异源DNA置于农杆菌内的最有效的方法是借助于电穿孔法(Wise等，2006，Three Methods for the Introduction ofForeign DNA into Agrobacterium，Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1；Ed.，Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.43-53)。此外，考虑到大量的T-DNA没有整合，农杆菌介导的转化法可以用于通过未引入的转基因构造体分子的转录互补而实现转基因的瞬间表达(Helens等，2005，Plant Methods 1：13)。
大量的农杆菌转化载体和方法已经有所描述(Karimi等，2002，TrendsPlant Sci.7(5：193-5)，并且许多这种载体可以是市售可得的(例如，Invitrogen公司)。此外，大量的“开源”农杆菌转化载体是可得到的(例如，pCambia载体；Cambia，Canberra，Australia)。还参见下文的转基因构造体上的小部分。在实施例进一步描述的具体实施方案中，基于pMON316的载体被用于Horsch等人的叶盘转化体系中(Horsch等，1995，Science 227：1229-1231)，以产生生长增强的烟草植物和番茄植物。
可用于产生本发明的转基因植物的其它常用的方法包括而不限于微弹轰击法或粒子专递转化；通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔而进行的裸DNA的原生质转化法(Paszkowski等，1984，EMBO J.3：2727-2722；Potrykus等，1985，MoI.Gen.Genet.199：169-177；Fromm等，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828；Shimamoto等，1989，Nature，338：274-276)。
粒子传递转化法包括采用粒子传递装置(或“基因枪”)将数百万的包被DNA的金属颗粒注射到靶细胞或组织内，其中的数种装置是市售可得的；一旦进入细胞内部，DNA从颗粒上脱离，并且其一部分稳定地并入一个或多个细胞染色体内(关于其综述，参见Kikkert等，2005，StableTransformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics，in：Methodsin Molecular Biology，vol.286：Transgenic Plant：Methods and Protocols，Ed.L.Pena，Humana Press Inc.，Totowa，NJ)。
电穿孔是利用短的高强度电场可逆地渗入细胞膜的脂质双层内的技术(例如，参见Fisk和Dandekar，2005，Introduction and Expression ofTtransgenes in Plant Protoplasts，in：Methods in Molecular Biology，vol.286：Transgenic Plant：Methods and Protocols，Ed.L.Pena，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.79-90；Fromm等，1987，Electroporation of DNA and RNAinto Plant protoplasts，in Methods in Enzymology，Vol.153，Wu和Grossman，eds.，Academic Press，London，UK1 pp.351-366；Joersbo和Brunstedt，1991，Electroporation：mechanism and transient expression，stabletransformation and biological effects in Plant protoplasts.Physiol.Plant.81，256-264；Bates，1994，Genetic transformation of Plants by protoplastelβctroporation.MoI.Biotech.2：135-14；Dillen等，1998，Electroporation-mediated DNA transfer to Plant protoplasts and intact Planttissues for transient gene expression assays，in Cell Biology，Vol.4，ed.，CeNs，Academic Press，London，UK，pp.92-99)。这种技术通过在细菌膜上产生水性孔而操作，所述孔具有足够大的尺寸，以允许DNA分子(和其它大分子)进入细胞内，其中转基因表达构造体(T-DNA的形式)可以稳定地并入植物基因组DNA内，从而产生转化细胞，该细胞随后能够再生为转基因植物。
更新的转化方法包括所谓的“花序浸渍”法，其提供简便的潜能，而不需要在其它所有通常使用的转化方法情况采用的植物组织培养物(Bent等，2006，Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method，MethodsMoI Biol，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1；Ed.，Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.87-103；Clough and Bent，1998，Floraldip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana，Plant J.16：735-743)。然而，除了拟南芥之外，这些方法尚未在宽泛的不同植物品种之间广泛使用。简而言之，花序浸渍法涉及用适当的根癌土壤杆菌菌株浸渍或喷洒开花植物。然后使由这些T0植物收集的种子在选择性条件下发育，以确认转基因的T1个体。实施例16证明了拟南芥的花序浸渍接种能够产生转基因的拟南芥植物。
其它的转化的方法包括其中采用诸如土壤杆菌载体等载体对发育的种子或植物的秧苗进行转化的方法。例如，如实施例8所示例的那样，可以通过将载体的悬浮液或载体混合物(即土壤杆菌)直接注射到发育的荚果(即胡椒荚果、菜豆荚果、豌豆荚果等)的种子空穴内，从而采用这种载体来转化发育的种子。可以按照实施例13针对紫花苜蓿所述的方法转化秧苗。可以按照实施例18针对亚麻荠所述的方法转化发育的种子。还可以采用果实内方法，其中载体被注射到果实或发育的果实内，如实施例14针对甜瓜和实施例15针对南瓜所述的那样。
如实施例9和10针对菜豆、实施例11和12针对豌豆和实施例17针对番茄所述的那样，其它的转化方法包括其中针对花结构进行载体接种的那些方法，如花接种方法。
上述的植物转化方法可以用于将转基因引入到大量的不同植物细胞和组织内，所述植物细胞和组织包括而不限于：完整的植物、组织和器官外植体(包括叶绿体、开花组织和细胞)、原生质体、分裂组织细胞、愈伤组织、未成熟的胚芽和配子细胞(如花粉粒，花粉、精子和卵细胞)、上述物质的任何组织培养细胞、可以由其生成可繁殖的再生植物的任意其它细胞。愈伤组织起源于以下的组织来源，其包括(但是不限于)：未成熟的胚芽、秧苗顶端分生组织、花粉粒等。能够增生为愈伤组织的细胞还能够容纳用于基因转化的细胞。
由转化的植物细胞、组织或器官再生单独的植物的方法是已知的，并且针对大量植物品种进行了描述。
作为一个例子，将转化的植物幼苗(得自转化的细胞或组织)在补充有在转化方案中所用的选择性试剂(即诸如卡那霉素等抗生素)的允许根生长的介质中培养。一旦生根，就将转化的植物幼苗转移至土壤中，并且允许其生长至成熟。在开花后，优选使成熟的植物自体受精(自受精)，并且收获所得的种子，并且将其用于生长出后代。实施例3-6描述了转基因烟草和番茄植物的再生。
通过一代或二代转化株的自体受精或者通过使一代或二代转化株与其它植物(转化或未转化的植物)进行有性杂交，T0转基因植物可用于产生随后的后代(例如，T1、T2等)。例如，如下文的实施例7所述，将过度表达紫花苜蓿GS1基因并且性能超过野生型植物的单独植物与过度表达拟南芥GPT基因并且性能超过野生型植物的单独植物通过使用人工花粉移送进行简单的有性杂交，从而将其杂交。进行正反杂交，使得各植物用作一组杂交中的雄性体，并且各植物用作第二组杂交中的雌性体。在成熟植物生长阶段，通常检测植物的表型、CO2固定速率等(参见下文)。
生长增强的转基因植物选择：
可以采用标准方法对转基因植物进行选择、筛选并且表征。本发明的优选的转基因植物表现出一种或多种表型特征，其表示增强的生长和/或其它有利的农学性能。通常在选择性压力下江转基因植物再生，以在产生转基因植物的后代之前选择转化株。此外，所用的选择压力可以超过T0代，以便确保存在所需的转基因表达构造体或盒。
可以通过选择或筛选在用于转化的转基因表达构造体中所含的标记基因的基因组成和/或编码的表型特征，从而识别T0转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过使潜在转化的植物、组织或细胞在含有抑制量的抗生素或除草剂(可以赋予转化基因构造体对其的抗性)生长介质中生长，从而进行选择。此外，可以通过筛选可能存在于转基因表达构造体中的标记基因(如β-葡萄糖苷酸酶)的活性来确认转化的植物细胞、组织和植物。
如所熟知的那样，可以采用各种物理和生物化学方法来识别含有所需基因表达构造体的植物。这些方法的例子包括：用于识别转基因、转基因表达构造体或其元件的Southern印迹分析或各种核酸扩增方法(即PCR)；用于检测并且确定RNA转录产物的Northern印迹、S1核糖核酸酶保护、逆转录酶PCR(RT-PCR)扩增方法；以及用于识别由转基因编码并且表达的蛋白的蛋白凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀、酶联免疫分析等。
在另一种方法中，可以采用基因、蛋白和/或代谢化合物的表达水平(其已知由在目标植物中的转基因表达而调节)来识别转化株。在本发明的一个实施方案中，可以采用信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的水平增加来筛选所需的转化株，如实施例所示例的那样。类似地，可以分析GPT和/GS活性增加的水平，如实施例所示例的那样。
最终，可筛选出本发明的转化植物的增强的生长特性和/或其它有利的农学特性。实际上，为了确认具有具有最快生长速率、最高种子产量等的转化品系，某些程度的表型筛选通常是有利的，当识别用于随后的自体受精、杂交育种和回交育种的植物时尤其是如此。可以采用各种参数来实现该目的，其包括而不限于：生长速率、总鲜重、干重、种子和果实产量(数量、重量)、种子和/或种荚产量、种荚产量(例如数量、重量)、叶子大小、植物大小、增多的开花、开花的时间、总蛋白含量(在种子、果实、植物组织内)、具体的蛋白含量(即GS)、氮含量、游离氨基酸和具体的代谢化合物水平(即2-氧戊二酸酰胺)。通常，将这些表型测量结果与由亲本的相同或类似植物品系、未转化的相同或类似植物或者相同或类似的野生型植物(即正常或亲本植物)所获得的结果进行比较。优选的是，至少首先是，按照与测量正常或亲本植物中的所选表型特征一致的方式对目标转基因植物中的相同特征进行测量。通常，针对任何特定的表型特征，采用多个植物来确立转基因植物的表型有利性和/或优越性。
优选的是，选择最初的转化株，然后用其通过自体受精(自受精)生成T1代和随后的代，直至转基因表型纯一传代为止(即植物对于转基因而言是纯合的)。这通过以下方法实现：将其自体受精3或4代，在每一代筛选所需的特征，并且将这些个体进行自体受精。如本文示例的那样，与不具有有性繁殖的优点的品系相比，通过至少一个有性传代繁育的转基因植物品系显示出更高的转基因产品活性，同时显示出转基因拷贝数的增加。
可以将稳定的转基因品系进行杂交育种和回交育种，以产生具有任何数量的所需特征的品种，包括具有叠加的转基因、转基因的多个拷贝等的那些品种。此外，可以通过用其它的转基因或亲本转基因的附加拷贝对稳定的转基因植物进一步进行基因修饰。本发明还涵盖由单个转化事件产生的转基因植物，所述转化事件包括引入给定转基因的多个拷贝或多种转基因。各种常规的繁育方法对于本领域内的技术人员而言是熟知的(例如，参见Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，AmericanSociety of Agronomy，Madison Wis.(1987))。
在另一个方面中，本发明提供由增强的氮利用效率表征的转基因植物。氮利用效率可以表示为植物产量/给定量的氮。在本文所提供的实施例中，转基因和对照植物均接受相同量的相同营养液。转基因植物一致地由更高的产量表征，由此以更高的氮利用效率表征。
在另一个方面中，本发明提供对高盐生长条件具有提高的耐受性的转基因植物及其种子。本发明的该方面由实施例24所示例，该实施例描述了转基因烟草种子在极高盐条件(200mM NaCl)下发芽。虽然负体野生型烟草种子平均仅以约10％的比率发芽，但是转基因烟草种子对转基因种子和野生型种子在无盐条件下获得了几乎相同的发芽率，或者为约92％。
实施例
对本发明的各个方面进一步进行描述，并且通过以下的多个实施例进行阐释，这些实施例均无意义限制本发明的范围。
实施例1：拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)基因的分离：
为了将直接参与信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的合成的植物酶定位，申请人假定突变植物酶可以与已经表征为参与2-氧戊二酸酰胺的合成的人蛋白具有一定程度的结构相关性。人蛋白谷氨酰胺转氨酶K(E.C.2.6.1.64)(在文献中也称为半胱氨酸结合物β-裂解酶、犬尿氨酸转氨酶、谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶以及其它名称)已经显示出参与卤化异源物质的半胱氨酸结合物的处理(Perry等，1995，FEBS Letters 360：277-280)。虽然不具有参与氮代谢的活性，但是人半胱氨酸半胱氨酸结合物β-裂解酶在人体和动物内具有脱毒活性。然而，该蛋白对于2-氧戊二酸酰胺的合成的潜在参与性受到了关注。
通过采用人半胱氨酸结合物β-裂解酶的蛋白序列，经过对TIGR拟南芥植物蛋白序列数据库的检索确认了一种潜在相关的序列(即由在At1q77670的拟南芥基因位点的部分序列编码的多肽)，它们在匹配的区域之间具有约36％的序列同系性/一致性。
随后采用以下的引物对将该基因的全编码区域由拟南芥cDNA库(Stratagene)进行扩增：
5’-CCCATCGATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATG-3’
5’-GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3’
这些引物被设计为并入Cla I(ATCGAT)和Kpn I(GGTACC)限制性位点，以有利于随后将其亚克隆至用于产生转基因植物的表达载体内。在以下条件下将Takara ExTaq DNA聚合酶用于高保真PCR：开始在94℃下变性4分钟；进行94℃、30秒的30个循环，在55℃下退火30秒；在72℃下延伸90秒；最后在72℃下延伸7分钟。扩增产物用CIa I和Kpn I限制酶消化，由琼脂糖凝胶电泳分离，并且将其连接入载体pMon316内(Rogers等，1987 Methods in Enzymology 153：253-277)，所述载体含有花椰菜花叶病毒(CaMV，也称为CMV)35S组成型启动子和胭脂碱合成酶(NOS)3’终止子。将连接物转化入DH5α细胞内，并且对转化株进行测序，以核实插入物。
分离出1.3kb的cDNA，并且测序，发现其编码长度为440个氨基酸的全长蛋白，包含突变叶绿体信号序列。
实施例2：制备生物活性的重组拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)：
为了测试由按照上述实施例1所述方法分离的cDNA编码的蛋白是否能够催化2-氧戊二酸酰胺的合成，将cDNA在大肠杆菌内表达，纯化，并且使用标准方法分析其合成2-氧戊二酸酰胺的能力。
2-氧戊二酸酰胺的NMR分析
简言之，将所得的纯化蛋白加入到含有以下成分的反应混合物中：150mM Tris-HCI(pH 8.5)、1mM β巯基乙醇、200mM谷氨酰胺、100mM乙醛酸和200 microM吡哆醛5’-磷酸盐。将不加入测试蛋白的反应混合物用作对照物。将测试和对照反应混合物在37℃下孵育20小时，然后通过离心澄清，以除去沉淀的材料。使用精确化学合成的2-氧戊二酸酰胺作为参照，利用13C NMR测试上清液中2-氧戊二酸酰胺的存在及其量。反应的产物为2-氧戊二酸酰胺和甘氨酸，而底物(谷氨酰胺和乙醛酸)大量减少。环状的2-氧戊二酸酰胺产生明显的信号，从而允许其容易地与开环的谷氨酰胺前体区分。
2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析
GPT活性的另一种分析方法根据以下文献的更改方法采用HPLC来确定2-氧戊二酸酰胺的产生：Calderon等，1985，J Bacteriol 161(2)：807-809。简言之，更改的提取缓冲液由25mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM EDTA、20μM FAD、10mM半胱氨酸和～1.5％(v/v)巯基乙醇构成。以约1/3的比例(w/v)将得自测试材料(即植物组织)的组织样品加入到提取缓冲液内，在37℃下孵育30分钟并且用200μl的20％TCA终止。在5分钟后，将分析混合物离心，并且采用上清液通过HPLC对2-氧戊二酸酰胺定量，HPLC条件为：采用ION-300 7.8mm ID X 30cm L柱，流动相为0.01N h2SO4，流速为约0.2ml/min，在40℃下进行。注射体积为约20μl，并且保留时间为约38至39分钟。采用210nm紫外光进行检测。
采用NMR分析的结果：
该试验显示，测试蛋白能够催化2-氧戊二酸酰胺的合成。因此，这些数据表明，分离的cDNA编码直接参与植物内2-氧戊二酸酰胺的合成的谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶。因此，测试蛋白被称为拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶或“GPT”。
拟南芥GPT编码序列的核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO.1。GPT蛋白的转译的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2中。
实施例3：产生过度表达拟南芥GPT的转基因烟草植物：
获得植物表达载体pMON-PJU：
简言之，按照如下方式构造植物表达载体pMon316-PJU。将分离的编码拟南芥GPT的cDNA(实施例1)克隆入pMON316载体的Clal-Kpnl多聚接头位点，其将GPT基因置于组成型花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶(NOS)转录终止子的控制下。引入卡那霉素抗性基因以提供选择性标记物。
农杆菌介导的植物转化：
使用标准电穿孔方法将pMON-PJU和对照载体pMon316(没有插入的DNA)转移至根癌农杆菌菌株pTiTT37ASE内(McCormac等，1998，Molecular Biotechnology 9：155-159)，随后将其涂敷至含有抗生素奇霉素(100微克/ml)和卡那霉素(50微克/ml)的LB板上。通过PCR检测农杆菌的耐抗生素性克隆，以确保它们含有质粒。
采用Horsch等(Horsch等1995，Science 227：1229-1231)的叶盘转化体系、用pMON-PJU转化的农杆菌转化珊西烟(Nicotiana tabacumcv.Xanthi)植物。简言之，将灭菌叶盘接种，并且培养2天，然后将其转移至含有100μg/ml卡那霉素和500μg/ml的凯福隆(clafaran)的选择性MS培养基内。确认转化株在选择性培养基内形成根的能力。
产生GPT转化烟草植物：
允许灭菌叶片段在Murashige & Skoog(M&S)培养基上发育出愈伤组织，由此得到转化株幼苗。然后将这些幼苗转移至允许生根的选择性培养基(M&S培养基，其中卡那霉素作为选择试剂)上。然后将健康并且已经生根的转化烟草幼苗转移至土壤内，并且允许其生长至成熟，并且在开花后，使植物自体受精，并且收获所得的种子。在生长阶段，已经检测了植物的生长表型，并且测量了许多幼小转基因植物的CO2固定速率。
产生T1代和T2代GPT转基因植物：
收获的种子形成转基因烟草植物的T0代，使其在含有卡那霉素(100mg/L)的M&S培养基上发芽，以富集转基因。至少四分之一的种子在该培养基上不会发芽(预期卡那霉素抑制没有抗性的种子发芽，这是由于基因的正常基因分离而产生的)，并且其余的种子中超过一半被除去，因为已经证实了其对卡那霉素的敏感性(甚至是中度敏感)。
使得存活的植物(T1代)繁育，然后使这些植物自体受精，以产生T2代的种子。使得自T1代的种子在补充有含卡那霉素(10mg/升)的转化株品系的MS培养基上发芽。在14天后，将它们转移到沙土上，并且提供1/4强度的Hoagland营养液(其补充有25mM硝酸钾)。在900微摩尔/立方米/秒的光强度下，使得它们在24℃下生长经过16小时的光照期和8小时的黑暗期。在将它们转移至沙土培养物之后14天进行收获。
GPT转基因植物的表征：
分析收获的转基因植物(GPT转基因以及载体对照转基因)在根和叶子内的谷氨酰胺合成酶活性、完整植物的鲜重、根和叶子内的蛋白含量和CO2固定速率(Knight等，1988，Plant Physiol.88：333)。还就相同的参数分析了未转化的根癌土壤杆菌植物和野生型根癌土壤杆菌植物，以便确立基线对照。
生长特性结果列于以下的表1中。此外，GPT转基因植物与野生型对照植物的比较照片示于图2中(与GS1转基因烟草植物一起，参见实施例5)。在所有评价的参数中，GPT转基因烟草植物显示出增强的生长特性。特别是，与野生型对照植物相比，GPT转基因植物的CO2固定速率表现出50％的增加，并且在叶子组织内的谷氨酰胺合成酶的活性表现出大于2倍的增加。此外，与野生型对照植物相比，在转氨酶转基因植物中叶至根的GS比例增加了几乎三倍。与野生型对照相比，转基因植物的鲜重和总蛋白量还分别增加了约50％和80％(叶子)。这些数据证明了过量表达拟南芥GPT转基因的烟草植物实现了显著增强的生长和CO2固定速率。
表1
Figure BPA00001327983800411
数据＝三个植物的平均值
野生型-对照植物；未经再生或转化。
PN1品系通是通过采用没有插入基因的构造体转化后再生而制得的。
针对再生和转化过程的对照。
PN 9品系是通过使用具有拟南芥GPT基因转化后再生而制得的。
实施例4：产生携带拟南芥GPT转基因的转基因番茄植物：
使用实施例3所述的载体和方法产生携带拟南芥GPT转基因的转基因番茄(Lycopersicon esculentum)(小汤姆番茄)植物。产生T0代转基因番茄植物，并且使其生长成熟。GPT转基因番茄植物的初始生长特性列于表II中。与野生型对照植物相比，转基因植物显示出显著增加的生长速率、开花量和种子产量。此外，转基因植物发育为多个主干，而野生型植物仅发育出一个主干。GPT转基因番茄植物与野生型植物的比较用照片示于图3中(与GS1转基因番茄植物一起，参见实施例6)。
表II
  生长特性   野生型番茄   GPT转基因番茄
  干长度，cm   6.5   18、12、11(主干)
  干数   1   3个主干，0个其它干
  花蕾   2   16
  花   8   12
  果实   0   3
实施例5：产生过度表达紫花苜蓿GS1的转基因烟草植物
产生植物表达载体pGS111：
按照以前所述的方法产生过度表达紫花苜蓿GS1的转基因烟草植物(Temple等，1993，Mol.Gen.Genetics 236：315-325)。简言之，通过将整个编码序列以及紫花苜蓿GS1基因([SEQ ID NO：3])的5’和3’未转译区域的延伸区(DasSarma等，1986，Science，Vol 232，Issue 4755，1242-1244)插入到pMON316内，从而构造植物表达载体pGS111(Rogers等，1987，上文)，其将转基因置于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶(NOS)转录终止子的控制下。引入卡那霉素抗性基因，以提供选择性标记物。
产生GS1转化株：
按照如下文献所述的方法采用三亲本杂交将pGS111转移到根癌农杆菌菌株pTiTT37ASE内，所述文献为Rogers等，1987，上文；Unkefer等、美国专利No.6,555,500。采用Horsch等(Horsch等1995，Science227：1229-1231)的叶盘转化体系、用pGS111转化的农杆菌转化珊西烟(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)植物。在含有100μg/ml卡那霉素的MS培养基上筛选转化株，并且使其再生。使幼苗在相同的培养基(含有卡那霉素，不含激素)上生根并且转移至盆栽土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)上，使其生长至成熟，并且允许其自体受精。由该T0代收获种子，并且通过自体受精并且继续用卡那霉素选择从而产生次生代。采用性能最优者产生T3，以与按照实施例3所述方法确认的性能最优的GPT过度表达品系进行杂交。
图2示出GS1转基因植物与野生型对照植物的比较用照片(与GPT转基因烟草植物一起，参见实施例3)。
实施例6：产生携带紫花苜蓿GS1转基因的转基因番茄植物
使用实施例5所述的载体和基本如以下文献所述的规程产生携带紫花苜蓿GS1转基因的转基因番茄(Lycopersicon esculentum)(小汤姆番茄)植物，所述文献为Sun等，2006.Plant Cell Physiol.46(3)426-31。产生T0代转基因番茄植物，并且使其生长成熟。GPT转基因番茄植物的初始生长特性列于表III中。与野生型对照植物相比，转基因植物显示出显著增加的生长速率、开花量和种子产量。此外，转基因植物发育为多个主干，而野生型植物仅发育出一个主干。GS1转基因番茄植物与野生型植物的比较用照片示于图3中(与GPT转基因番茄植物一起，参见实施例4)。
表III
  生长特性   野生型番茄   GS1转基因番茄
  干高度，cm   6.5   主干分别为16，7，5
  干   1   3个主干，3个中型干，1个最小干
  花蕾   2   2
  花   8   13
  果实   0   4
实施例7：产生携带GS1和GPT转基因的双转基因烟草植物
为了确认在单转基因植物中的GS1和GPT的组合是否能够改善生长特性和其它农学特性可能增加的程度，在单转基因(GS1或GPT)转基因植物的高产品系之间进行了多个有性杂交。所获得的结果是显著的，因为这些杂交稳定地产生了在生长速率、生物量产量和种子产量方面具有出乎意料并且迄今未知的增加的后代植物。
材料和方法：
分别按照实施例3和4的方法产生过度表达GPT或GS1的转基因烟草植物(单转基因)。采用正反交方法将几个生长最快的T2代GPT转基因植物品系与生长最快的T3代GS1转基因品系进行杂交。然后按照实施例3所述的方法在含有卡那霉素的M&S培养基上对后代进行选择，并且检测其生长情况、开花量和种子产量。
GPT和GS活性的组织提取：在以3ml/克组织的比例将新鲜植物组织在含有1mm二乙胺四乙酸、200mM GPT吡哆醛磷酸盐和6mM巯基乙醇的冷100mM Tris-HCl(pH 7.6)中研磨，然后从该组织内提取GPT活性。通过离心将提取物澄清，并且用于分析中。在以3ml/克组织的比例将新鲜植物组织在含有10mM MgCl2和12.5mM巯基乙醇的冷50mM咪唑(pH 7.5)中研磨，然后从该组织内提取GS活性。通过离心将提取物澄清，并且用于分析中。按照文献Calderon和Mora，1985，Journal Bacteriology161：807-809中所述的方法分析GPT活性。按照文献Shapiro和Stadtmann，1970，Methods in Enzymology 17A：910-922的方法分析GS活性。这两种分析均涉及将其与底物和辅因子在适当的pH下孵育。通过HPLC进行检测。
结果：
以两种方式提供结果。首先将具体的生长特性列于表IV.A和IV.B中(生物量、种子产量、生长速率、GS活性、GPT活性、2-氧戊二酸酰胺活性等)。第二，将后代植物及其叶子的照片以与单转基因植物和野生型植物及其叶子相比较的方式示于图5和6中，与亲本单转基因植物和野生型对照植物相比，所述后代植物显示出更大的完整植物、更大的叶子以及更早和/或更丰盛的开花。
参照表IV.A，由上述杂交得到的双转基因后代植物显示出总生物量(鲜重)的显著增加，其中鲜重为45-89克/单独后代植物，而野生型植物的鲜重仅为19-24克/单独野生型植物，这代表其生物量比野生物型植物平均增加了约2至3倍，并且以较高端值计，这代表其生物量比野生型植物出人意料地增加了4倍。通过采用24株单独双转基因后代植物进行评价，单独植物的平均生物量为野生型对照植物的平均生物量的约2.75倍。4个后代品系的鲜重显示出比野生型植物平均高约2.5倍，而两个品系的鲜重显示出比野生型植物高超过3倍。
与单转基因亲本品系相比，双转基因后代植物还显示出远远更多的额外生长增加。与野生型植物的生物量相比，GPT单转基因品系显示出约50％的增加，并且GS1单转基因品系显示出66％的增加，而后代植物平均显示出几乎200％的增加。
类似地，双转基因后代植物比野生物或单转基因亲本品系开花更早，并且更繁茂，而且每株植物产生了远远更多数量的种荚以及总种子数量。再次参照表IV.A，平均而言，双转基因后代产生的种荚数量为野生型植物产生的种荚数量的超过2倍，其中两株高产植物产生的种荚数量为野生型植物产生的种荚数量的超过3倍。基于每株植物重量而言，后代植物的总种子产量为野生型植物产生的种子数量的约2倍至几乎4倍。
Figure BPA00001327983800461
Figure BPA00001327983800471
Figure BPA00001327983800481
表IV.B示出品系XX(品系3进一步自体受精)的生长速率、生物量和产量与表达GS1的单转基因品系和野生型对照烟草的比较情况。在双转基因植物中所有参数均显示出显著增加(品系XX)。特别注意的是，品系XX植物的2-氧戊二酸酰胺活性为对照植物活性的几乎17倍，并且产量和叶子生物量为其三倍。
表IV.B
Figure BPA00001327983800491
NM未测量
实施例8：产生携带GS1和GPT转基因的双转基因胡椒植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的种荚转移法，在CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化Big Jim chili胡椒植物(新墨西哥品种)，并且在RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述胡椒植物。3天后，收获种子，并且用于产生T0植物，筛选转化株。与对照植物相比，所得的双转基因植物显示出更高的荚果产量、更快的生长速率并且更大的生物量产量。
材料和方法：
分别采用农杆菌介导的种荚转移法在以下条件下转化SolanaceaeCapisicum胡椒植物(“Big Jim”品种)：在表达载体pMON(参见实施例3)内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化，以及在表达载体pCambia 1201内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化(番茄核酮糖二磷酸缩化酶rbcS3C启动子：Kyozulka等，1993，Plant Physiol.103：991-1000；SEQ IDNO：22；SEQ ID NO：6的载体构造体)。
对于该实施例以及随后的所有实施例，Cambia 1201或1305.1载体均根据标准克隆方法构造(Sambrook等，1989，上文，Saiki等，1988，Science239：487-491)。为载体提供35S CaMV启动子；将该启动子用来自番茄的RcbS-3C启动子置换，以控制目标基因的表达。Cambia 1201载体含有细菌氯霉素和植物潮霉素抗性选择性标记基因。Cambia 1305.1载体含有细菌氯霉素和植物潮霉素抗性选择性标记基因。
采用标准电穿孔法将转基因表达载体pMON(GPT转基因)和pCambia1201(GS转基因)转移至根癌农杆菌菌株LBA4404培养物内(McCormac等，1998，Molecular Biotechnology 9：155-159)。在含有50μg/ml的链霉素(对于pMON构造体而言)或氯霉素(对于Cambia构造体而言)的培养基上选择转化的农杆菌。使得转化的农杆菌细胞在含有25μg/ml抗生素的LB培养基上生长36小时。在36小时的生长期之后，通过离心收集细胞，并且将由各转化得到的细胞悬浮在不含抗生素的100ml LB肉汤内。
然后采用以下转化规程用所得的农杆菌细胞悬浮液混合物转化胡椒植物，所述转化规程为：将农杆菌直接注射到发育荚果的种子空穴内。简言之，对发育的荚果注射200ml混合物，以便用农杆菌接种未成熟的种子，如文献Wang和Waterhouse，1997，Plant Mol.Biol.Reporter 15：209-215所述的那样。为了诱导农杆菌毒性，并且改善转化效率，在荚果接种之前向农杆菌培养物内加入10μg/ml的乙酰丁香酮(参见文献Sheikholeslam和Weeks，1986，Plant Mol.Biol.8：291-298)。
采用注射针对荚果注射足量的农杆菌载体混合物，并且使其孵育约3天。然后收获种子，并且使其发芽，然后观察植物的表型特征，包括生长和耐抗生素性。携带转基因的植物为绿色的，而转化的植物在叶子末端显示出萎黄病的迹象。使生长旺盛的转化株生长，并且在相同的条件下与野生型胡椒植物比较。
结果：
结果示于图7和表V中。图7示出在相同条件下生长相同时间的GPT+GS双转基因胡椒植物与对照植物的比较用照片。该照片显示出与对照植物相比，转基因品系具有大得多的胡椒产量。
表V提供了转基因品系的生物量产量和GS活性，以及转基因表型与野生型对照植物的比较情况。参见表V，双转基因后代植物显示出的总生物量(鲜重)显示出显著的增加，其鲜重为393-662克/株单独转基因植物，而野生型植物的鲜重为328克/株野生型植物。转基因品系A5产生的总生物量为对照植物的总生物量的超过2倍。此外，转基因品系的胡椒产量与野生型植物得到显著提高，并且其比对照植物高50％(平均而言)。特别是，一种转基因品系产生的胡椒平均而言为对照植物产生的胡椒的2倍。
表V：转基因胡椒生长/生物量和再生
Figure BPA00001327983800511
FWt鲜重；DWt干重
实施例9：产生携带拟南芥GS1和GPT转基因的双转基因菜豆植物：
在该实施例中，采用农杆菌介导的花朵转移法，在表达载体pCambia1201内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ IDNO：1)转化黄斑菜豆植物(Phaseolus vulgaris)，并且在表达载体pCambia1201内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述菜豆植物。
材料和方法：
采用标准电穿孔法将转基因表达载体pCambia 1201-GPT(SEQ ID NO：27的载体构造物)和pCambia 1201-GS(SEQ ID NO：6的载体构造物)转移至根癌农杆菌菌株LBA4404培养物内(McCormac等，1998，MolecularBiotechnology 9：155-159)。在含有50μg/ml的链霉素的培养基上选择转化的农杆菌。使得转化的农杆菌细胞在含有25μg/ml抗生素的LB培养基上生长36小时。在36小时的生长期之后，通过离心收集细胞，并且将由各转化得到的细胞悬浮在不含抗生素的100ml LB肉汤内。
然后采用以下转化规程用所得的农杆菌细胞悬浮液混合物转化菜豆植物，所述转化规程为：将农杆菌直接注射到花结构内。为了诱导农杆菌毒性，并且改善转化效率，在花接种之前向农杆菌培养物内加入10μg/ml的乙酰丁香酮(参见文献Sheikholeslam和Weeks，1986，Plant Mol.Biol.8：291-298)。简言之，一旦花朵开放，用镊子轻轻地打开包封繁殖器官的外部结构，以便允许引入农杆菌混合物，其中所述混合物被加入到花结构中使其足以充满花粉囊。
使植物生长，直至发育出菜豆荚，然后收获种子，并且用于产生转基因植物。然后使转基因植物与对照菜豆植物在相同条件下一起生长，照相，并且进行基因型表征。测量转基因植物和对照植物的生长速率。在该实施例以及所有实施例中，根据文献Shapiro和Stadtmann，1970，Methods inEnzymology 17A：910-922的方法分析谷氨酰胺合成酶(GS)活性，并且根据文献Calderon等，1985，J.Bacteriol.161：807-809中的方法分析谷氨酸苯基丙酮酸转氨酶(GPT)活性。详细情况参见上文的实施例7中的方法。
结果：
结果示于图8、图9和表VI中。
图8示出与对照植物相比，GPT+GS转基因菜豆品系A的生长速率数据，包括在培养的各天时的植物高度、以及花蕾、花朵和菜豆荚的数量。这些数据表明，GPT+GS双转基因菜豆植物的生长性能优于其相应的对照植物。与野生型对照植物相比，转基因植物长的更高，开花更早，并且产生更多的花蕾和花朵，而且发育出菜豆荚，以及产生更多的菜豆荚。
表VI：转基因菜豆品系A
Figure BPA00001327983800531
WT野生型；FWt鲜重；NM未测量
表VI提供了转基因品系的菜豆荚产量、GPT和GS活性以及耐抗生素状况与野生型对照植物的比较情况(几种健壮的对照植物的平均值；没有对生长不好的对照植物进行分析)。参见VI，与对照植物相比，双转基因后代植物的菜豆荚生物量(鲜豆荚重)表现出显著的增加，其中菜豆荚生物量稳定地为超过200克/株单独转基因植物(而野生型植物的豆荚生物量为127克/株野生型植物)，这表明双转基因品系的豆荚产量相对于对照植物增加了超过60％。
最后，图9示出在相同的条件下生长相同时间的GPT+GS双转基因菜豆植物与对照植物的比较用照片，其表明转基因植物具有增强的生长。
实施例10：携带拟南芥GS1和葡萄GPT转基因的双转基因菜豆植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的发育豆荚转移法，在表达载体pCambia 1305.1内的RuBisCo启动子的控制下用葡萄GPT全长编码序列(SEQ ID NO：8)转化黄斑菜豆植物(Phaseolus vulgaris)，并且在表达载体pCambia 1201内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述菜豆植物。
材料和方法：
分别采用标准电穿孔法将转基因表达载体pCambia 1201-GPT(葡萄)(SEQ ID NO：8的载体构造物)和pCambia 1201-GS(SEQ ID NO：6的载体构造物)转移至根癌农杆菌菌株LBA4404培养物内(McCormac等，1998，Molecular Biotechnology 9：155-159)。在含有50μg/ml的氯霉素的培养基上选择转化的农杆菌。使得转化的农杆菌细胞在含有25μg/ml抗生素的LB培养基上生长36小时。在36小时的生长期之后，通过离心收集细胞，并且将由各转化得到的细胞悬浮在不含抗生素的100ml LB肉汤内。
然后采用以下转化规程用所得的农杆菌细胞悬浮液混合物转化菜豆植物，所述转化规程为：将农杆菌直接注射到花结构内。为了诱导农杆菌毒性，并且改善转化效率，在花接种之前向农杆菌培养物内加入10μg/ml的乙酰丁香酮。简言之，一旦花朵开放，用镊子轻轻地打开包封繁殖器官的外部结构，以便允许引入农杆菌混合物，其中所述混合物被加入到花结构中使其足以淹没花粉囊。
使植物生长，直至发育出菜豆荚，然后收获种子，并且用于产生转基因植物。然后使转基因植物与对照菜豆植物在相同条件下一起生长，照相，并且进行基因型表征。测量转基因植物和对照植物的生长速率。
结果：
结果示于图10、图11和表VII中。
图10示出与对照植物相比，GPT+GS转基因菜豆品系G的生长速率数据，具体包括花蕾、花朵和菜豆荚的数量。这些数据表明，GPT+GS双转基因菜豆植物的生长性能优于其相应的对照植物。特别是，转基因植物比野生型对照植物产生明显更多的菜豆荚。
表VII：转基因菜豆品系G：豆荚产量
  植物类型   菜豆荚产量FWt，g   耐抗生素性
  野生型，平均值   157.9   阴性
  G1   200.5   +
  G2   178.3   +
WT野生型；FWt鲜重；NM未测量
表VII提供了转基因品系的菜豆荚产量和耐抗生素状况与野生型对照植物的比较情况(几种健壮的对照植物的平均值；没有对生长不好的对照植物进行分析)。参见VII，与对照植物相比，双转基因后代植物的菜豆荚生物量(鲜豆荚重)表现出显著的增加，其中菜豆荚生物量分别为200.5克/株单独转基因植物(品系G1)和178克/株单独转基因植物(品系G2)(而野生型植物的豆荚生物量为158克/株野生型植物)，这表明双转基因品系的豆荚产量相对于对照植物增加了超过27％。
最后，图11示出在相同的条件下生长相同时间的GPT+GS双转基因菜豆植物与对照植物的比较用照片。与对照植物相比，转基因植物显示出明显增加的大小和生物量，更大的叶子和更成熟的花朵。
实施例11：产生携带拟南芥GS1和GPT转基因的双转基因豇豆植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的花朵转移法，在表达载体pMON内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化普通豇豆植物，并且在表达载体pCambia 1201内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述豇豆植物。材料和方法如上文的实施例9所述。
结果：
结果示于图12、图13和表VI中。图12示出GPT+GS转基因豇豆品系A和野生型对照豇豆在培养期间的不同间隔时的相对生长速率，包括(图12A)高度和最长的叶子测量值、(图12B)三倍叶和花蕾以及(图12C)花朵、花蕾和豆荚。这些数据表明，GPT+GS双转基因豇豆植物的生长性能优于其相应的对照植物。与野生型对照植物相比，转基因植物长长更快并且更高，具有更长的叶子并且开花和长出荚果更早。
表VIII：转基因豇豆品系A
Figure BPA00001327983800551
WT野生型；FWt鲜重；NM未测量
表VIII提供了转基因品系的豆荚产量、GPT和GS活性以及耐抗生素状况与野生型对照植物的比较情况(几种健壮的对照植物的平均值；没有对生长不好的对照植物进行分析)。参见VIII，与对照植物相比，双转基因后代植物的豆荚生物量(鲜豆荚重)表现出显著的增加，其中豆荚的平均生物量比对照植物测量的产量高几乎52％。
最后，图13示出在相同的条件下生长相同时间的GPT+GS双转基因豇豆植物与对照植物的比较用照片，其表明转基因植物相对于野生型对照植物具有增加的生物量和豆荚产量。
实施例12：产生携带拟南芥GS1和葡萄GPT转基因的双转基因豇豆植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的花朵转移法，在表达载体pCambia1350.1(SEQ ID NO：8的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用葡萄GPT全长编码序列(SEQ ID NO：8)转化普通豇豆植物，并且在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述豇豆植物。材料和方法如上文的实施例11所述。
结果：
结果示于图14和图15以及表IX中。
图14示出GPT+GS转基因豇豆品系G和野生型对照豇豆的相对生长速率。这些数据表明，转基因植物一致地更高(图14A)、产生明显明显更多的花、花蕾和豆荚(图14B)，并且发育出三倍叶和叶蕾更快(图14C)。
表IX：转基因豇豆品系G
Figure BPA00001327983800561
WT野生型；FWt鲜重；NM未测量
表IX提供了转基因品系的豆荚产量、GPT和GS活性以及耐抗生素状况与野生型对照植物的比较情况(几种健壮的对照植物的平均值；没有对生长不好的对照植物进行分析)。参见IX，与对照植物相比，双转基因后代植物的豆荚生物量(鲜豆荚重)表现出显著的增加，其中豆荚的平均生物量比对照植物的生物量高70％。
最后，图15示出在相同的条件下生长相同时间的GPT+GS双转基因豇豆植物与对照植物的比较用照片，其表明转基因植物相对于野生型对照植物具有增加的高度、生物量和叶子大小。
实施例13：产生携带拟南芥GS1和GPT转基因的双转基因紫花苜蓿植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的秧苗植物转移法，在表达载体pMON316(参见上文的实施例3)内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化紫花苜蓿植物(Medicago sativa，var Ladak)，并且在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述紫花苜蓿植物。材料和方法如上文的实施例11所述。
秧苗接种：
当紫花苜蓿秧苗的高度仍然低于约1/2英寸时，将它们浸入到已经充满含有两种转基因的农杆菌混合物的纸料内。使秧苗留在纸料内2至3天，取出，然后种到盆栽土内。然后使所得的T0植物和对照植物在生长室内生长头30天，随后在温室内培养，然后在分枝后42天时收获。在此时，只有转基因紫花苜蓿品系显示出花朵，因为野生型植物只显示出不成熟的花蕾。表征植物的开花状况以及总生物量。
结果：
结果示于表X内。该表格表明相对于对照植物，转基因紫花苜蓿植物生长更快、开花更早并且其生物量平均显示出约62％的增加。
表X：转基因紫花苜蓿与对照植物的比较
Figure BPA00001327983800571
实施例14：产生携带拟南芥GS1和GPT转基因的双转基因甜瓜植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的转移法(通过注射到发育的甜瓜内)，在表达载体pMON316(参见上文的实施例3)内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化甜瓜植物(Cucumis melo var common)，并且在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述甜瓜植物。按照实施例8的方法制备土壤杆菌载体和混合物，以进行甜瓜内接种。基本上按照实施例8的方法进行对发育的甜瓜的接种。表征植物相对于在相同的条件下生长的对照甜瓜植物的开花状况和总生物量。
结果示于图16和表XI内。参见表XI，与对照植物相比，转基因植物显示出明显的植物叶子生物量增加，其中生物量平均增加63％。此外，在所有转基因品系内均观察到花朵和花蕾产量具有显著的增加。对照植物没有显示出花朵，并且在死亡时平均只有5个花蕾。与此形成鲜明对比的是，钻基因植物显示出2至5个花朵/株植物，以及21至30个花蕾/株植物，从而表明转基因植物具有明显更高的生长速率和花朵产量。在转基因植物内增加的花朵产量预期会转化为相应高的甜瓜产量。参见图16(转基因甜瓜植物与对照甜瓜植物的比较照片)，转基因甜瓜植物相对于对照植物显示出显著增加的高度、总生物量和开花状况。
表XI：转基因甜瓜与对照植物的比较
Figure BPA00001327983800581
FWt鲜重
实施例15：产生携带拟南芥GS1和GPT转基因的双转基因南瓜植物
在该实施例中，采用农杆菌介导的转移法(通过注射到发育的南瓜内)，在表达载体pMON316(参见上文的实施例3)内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化普通南瓜植物(Cucurbita maxima)，并且在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ IDNO：6)转化上述南瓜植物，该方法基本上如上文的实施例14所述。使转基因南瓜植物和对照南瓜植物在相同的条件下生长，直至对照植物产生花蕾为止，然后表征所有植物的开花状况和总生物量。
结果示于图17和表XII内。参见表XII，与对照植物相比，转基因植物显示出明显的植物叶子生物量增加，其中生物量平均增加67％。此外，与对照植物相比，在五个转基因品系的四个品系中观察到花蕾产量的增加。对照植物在死亡时仅显示出4个花蕾(平均值)。与此形成对比的是，四个转基因品系显示出8至15个花蕾/株植物，从而表明其产量具有2倍至几乎4倍的增加。
表XII：转基因南瓜与对照植物的比较
FWt鲜重；
参见图17(转基因南瓜植物与对照南瓜植物的比较照片)，转基因南瓜植物相对于对照植物显示出显著增加的植株大小、总生物量、叶子大小和数量。
实施例16：产生携带拟南芥GS1和GPT转基因的双转基因拟南芥植物
在该实施例中，采用如下文献所述的农杆菌介导的“蘸花”转移法，在表达载体pMON316(参见上文的实施例3)内的CMV 35S启动子的控制下用切断的拟南芥GPT编码序列(SEQ ID NO：18)转化拟南芥植物(Arabidopsis thaliana)，随后在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQID NO：6)转化上述转基因植物，其中所述文献为Harrison等，2006，PlantMethods 2：19-23；Clough和Bent，1998，Plant J.16：735-743。分别按照实施例3和11的方法制备携带GPT的土壤杆菌载体pMON316和pCambia1201。
用Weigel and Glazebrook 2002的方法通过电穿孔，用pMon 316+拟南芥GTP构造物或用Cambia 1201+拟南芥GS构造物对两种不同的土壤杆菌培养物进行转化。然后在抗生素选择条件下使转化的土壤杆菌生长，通过离心收集，悬浮于具有抗生素的LB肉汤内，并且用于对拟南芥花序的蘸花转移。使蘸花转化的拟南芥植物生长至成熟，并且自体受精，然后收集种子。首先通过常规的选择步骤使得自两个蘸花转化的植物的种子在含有20ug/ml的卡那霉素的培养基上发芽，然后将存活的秧苗转移至含有20ug潮霉素的培养基上。使得通过在两种抗生素上进行的选择过程的植物(3)字体受精，并且收集种子。使得自T1代的种子在含有20ug/ml潮霉素的MS培养基上发芽，使存活的秧苗生长至成熟，自体受精，并且收集种子。然后将该种子种群(T2代)用于随后的生长研究中。
结果示于图18和表XIII中。参见表XIII，其示出得自6株野生型拟南芥植物和6株转基因拟南芥植物的数据(平均值)，转基因植物显示出增加的GPT活性水平以及GS活性水平。GPT活性是对照植物的超过20倍。此外，转基因植物鲜叶平均重量良好地为野生型对照植物鲜叶平均重量的超过4倍。图18示出相同条件下生长的转基因拟南芥幼年植物与野生型对照拟南芥植物的比较照片，并且揭露了转基因植物相对于对照植物的稳定以及非常显著的增加。
表XIII：转基因拟南芥与对照植物的比较
Figure BPA00001327983800601
实施例17：产生携带拟南芥GPT和GS1转基因的转基因番茄植物
在该实施例中，在表达载体pMON316(参见上文的实施例3)内的CMV 35S启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ ID NO：1)转化番茄植物(Solanum lycopersicon，“money Maker”品种)，并且在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述番茄植物。基本上按照实施例4的方法产生单转基因(GPT)转基因番茄植物，使其生长至开花。然后使用农杆菌介导的转移法(通过直接注射到花朵内)将拟南芥GS1转基因引入到单转基因T0植物内，如实施例8所述的那样。在相同的条件下使转基因和对照番茄植物生长，并且表征其生长表型特征。然后，使所得的T0双转基因植物与对照番茄植物一起生长至成熟，照相并且进行表型表征。
结果示于图19和表IXX内。参见表IXX，与对照植物相比，双转基因番茄植物显示出明显的植物叶子生物量增加，其生物量比对照植物平均增加了45％。此外，与对照植物相比，在转基因植物内观察到其番茄果实产量具有高达70％的增加(例如，由品系4C收获51个番茄，与此形成对比的是，从对照平均收获约30个番茄)。在转基因植物内观察到明显更高的GPT活性水平(例如，品系4C的GPT活性为在对照植物中测量的平均GPT活性的约32倍)。转基因植物的GS活性相对于对照植物也较高(品系4C为对照植物的几乎2倍)。
关于生长表型，参见图19，转基因番茄植物显示出比对照植物更大的叶子(图19A)。此外，可以看出，转基因番茄植物明显更大、更高，并且具有更高的总生物量(参见图19B)。
表IXX：转基因番茄植物的生长和繁殖情况
Figure BPA00001327983800611
实施例18：产生携带拟南芥GPT和GS1转基因的转基因亚麻荠植物
在该实施例中，根据文献Chee等，1989，Plant Physiol.91：1212-1218中所述的方法，采用农杆菌介导的萌发种子转移法，在表达载体pCambia1201内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GPT全长编码序列(SEQ IDNO：1)转化亚麻荠植物(Camelina sativa，Var MT 303)，并且在表达载体pCambia 1201(SEQ ID NO：6的载体构造物)内的RuBisCo启动子的控制下用拟南芥GS1编码序列(SEQ ID NO：6)转化上述亚麻荠植物。按照上述施例11的方法制备农杆菌载体和混合物，以用于种子接种。
在相同的条件下使转基因和对照亚麻荠植物生长39天(30天在生长室内，然后转移至温室培养)，并且表征其生物量、生长特性和开花阶段。
结果示于表XX和图20内。参照表XX，可以看出，平均而言，转基因植物的总生物量几乎为对照植物生物量的2倍。转基因植物的冠幅也得到提高。图20示出转基因亚麻荠与对照植物的比较照片。转基因植物明显更大，并且显示出更高级的开花阶段。
表XX：转基因亚麻荠与对照植物的比较
Figure BPA00001327983800621
实施例19：大麦GPT转基因在植物内的活性
在该实施例中，分离出大麦GPT的突变编码序列，并且采用植物内瞬间表达分析法由转基因构造体进行表达。制备生物活性的重组大麦GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如HPLC证实的那样。
确认大麦(Hordeum vulgare)GPT编码序列，并且进行合成。该实施例中所用的大麦GPT编码序列的DNA序列由SEQ ID NO：14表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO：15表示。
将大麦GPT的编码序列插入1305.1 cambia载体内，并且使用标准的电穿孔方法将其转移至根癌土壤杆菌菌株LBA404内(McCormac等，1998，Molecular Biotechnology 9：155-159)，随后将其涂敷于含有潮霉素(50微克/ml)的LB板上。选择土壤杆菌中耐抗生素的克隆用于分析。
瞬间烟草叶表达分析包括将转化的土壤杆菌(1.5-2.0 OD 650)注射到快速生长的烟草叶子内。在叶子表面上以交叉网格的形式进行皮内注射，以确保显著量的叶子表面接触土壤杆菌。然后允许植物生长3-5天，此时按照针对所有其它组织提取的方法提取组织，并且测量GPT活性。
接种的叶子组织中的GPT活性水平(1217纳摩尔/gFWt/h)为在对照植物叶子组织中测量的水平(407纳摩尔/gFWt/h)的三倍，从而表明大麦属GPT构造物能够指导功能性GPT在转基因植物内的表达。
实施例20：重组水稻GPT基因编码序列的分离和表达以及生物活性的分析
在该实施例中，分离水稻GPT的突变编码序列，并且在大肠杆菌内表达。制备生物活性的重组水稻GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如HPLC证实的那样。
材料和方法：
水稻GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达：
确认水稻(Oryza sativia)GPT编码序列，并且进行合成，插入PET28载体内，并且在大肠杆菌内进行表达。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。使用下述的NMR分析方法分析总共25X106个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。
在该实施例中所用的水稻GPT编码序列的DNA序列以SEQ IDNO：10表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：11表示。
2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析：
根据以下文献的更改方法采用HPLC来确定2-氧戊二酸酰胺的产生：Calderon等，1985，J Bacteriol 161(2)：807-809。简言之，更改的提取缓冲液由25mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM EDTA、20μM吡哆醛磷酸盐、10mM半胱氨酸和～1.5％(v/v)巯基乙醇构成。以约1/3的比例(w/v)将样品(得自大肠杆菌细胞的裂解物，25X 106细胞)加入到提取缓冲液内，在37℃下孵育30分钟并且用200μl的20％TCA终止。在约5分钟后，将分析混合物离心，并且采用上清液通过HPLC对2-氧戊二酸酰胺定量，HPLC条件为：采用ION-3007.8mm ID X 30cm L柱，流动相为0.01Nh2SO4，流速为约0.2ml/min，在40℃下进行。注射体积为约20μl，并且保留时间为约38至39分钟。采用210nm紫外光进行检测。
采用NMR分析与精确2-氧戊二酸酰胺进行比较，以确认拟南芥全长序列表达具有2-氧戊二酸酰胺合成活性的GPT。简言之，通过化学合成制得精确2-氧戊二酸酰胺(用NMR证实其结构)以确证上述的HPLC分析，该HPLC分析通过确认分析产物(响应于表达的GPT而合成的分子)与精确2-氧戊二酸酰胺在相同的时间洗脱而实现。此外，当分析产物和精确化合物混合在一起时，它们洗脱为一个单独的峰。此外，HPLC分析的确证还包括监测底物谷氨酰胺的消耗，并且显示出所消耗的谷氨酰胺与所产生的2-氧戊二酸酰胺之间存在1∶1的摩尔化学计量比。分析过程总是包括两个对照试验，一个对照试验不含有添加的酶，并且一个对照试验含有添加的谷氨酰胺。第一个对照表明2-氧戊二酸酰胺的产物依赖于具有所存在的酶，并且第二个对照表明2-氧戊二酸酰胺的产生依赖于底物谷氨酰胺。
结果：
水稻GPT编码序列(SEQ ID NO：10)的表达使得具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性的重组GPT蛋白过度表达。具体而言，在过度表达重组水稻GPT的大肠杆菌内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为1.72纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了86倍。
实施例21：重组大豆GPT基因编码序列的分离和表达以及生物活性分析
在该实施例中，分离大豆GPT的突变编码序列，并且在大肠杆菌内表达。制备生物活性的重组大豆GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如HPLC证实的那样。
材料和方法：
水稻GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达：
确认大豆(Glycine max)GPT编码序列，并且进行合成，插入PET28载体内，并且在大肠杆菌内进行表达。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。使用下述的NMR分析方法分析总共25X 106个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。
在该实施例中所用的大豆GPT编码序列的DNA序列以SEQ ID NO：12表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：13表示。
2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析：
按照上述实施例20所述的方法，采用HPLC确认在GPT过度表达大肠杆菌细胞内2-氧戊二酸酰胺的产生。
结果：
大豆GPT编码序列(SEQ ID NO：12)的表达使得具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性的重组GPT蛋白过度表达。具体而言，在过度表达重组大豆GPT的大肠杆菌内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为31.9纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了几乎1,600倍。
实施例22：斑马鱼GPT基因编码序列的分离和表达以及生物活性的分析
在该实施例中，分离斑马鱼GPT的突变编码序列，并且在大肠杆菌内表达。制备生物活性的重组斑马鱼GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如NMR证实的那样。
材料和方法：
斑马鱼GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达：
确认斑马鱼(Danio rerio)GPT编码序列，并且进行合成，插入PET28载体内，并且在大肠杆菌内进行表达。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。使用下述的NMR分析方法分析总共25X 106个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。
在该实施例中所用的斑马鱼GPT编码序列的DNA序列以SEQ ID NO：16表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：17表示。
2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析：
按照上述实施例20所述的方法，采用HPLC确认在GPT过度表达大肠杆菌细胞内2-氧戊二酸酰胺的产生。
结果：
斑马鱼GPT编码序列(SEQ ID NO：16)的表达使得具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性的重组GPT蛋白过度表达。具体而言，在过度表达重组斑马鱼GPT的大肠杆菌内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为28.6纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了超过1,400倍。
实施例23：切断的重组拟南芥GPT基因编码序列的产生和表达以及生物活性分析
在该实施例中，设计了拟南芥GPT编码序列的两种不同的切断物，并且将其在大肠杆菌内表达，以评价其中突变叶绿体信号肽不存在或被切下的GPT蛋白的活性。对应于全长拟南芥GPT氨基酸序列SEQ ID NO：1的重组切断GPT蛋白被切断，以除去头30个氨基末端的氨基酸残基或头45个氨基末端的氨基酸残基，将其成功表达，并且显示出催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加的生物活性，如NMR证实的那样。
材料和方法：
切断拟南芥GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达
设计拟南芥GPT编码序列(SEQ ID NO：1)的切断物的DNA编码序列，进行合成，插入到PET28载体内，并且在大肠杆菌内表达。该实施例所用的切断拟南芥GPT编码序列的DNA序列以SEQ ID NO：20(-45 AA构造体)表示，并且相应的切断GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：21表示。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。然后使用实施例20所述的HPLC分析方法分析总共25X 106个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。
切断的-45拟南芥GPT编码序列(SEQ ID NO：20)的表达使得生物活性的重组GPT蛋白(具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性)过度表达。具体而言，在过度表达切断的-45拟南芥GPT的大肠杆菌细胞内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为16.1纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了超过800倍。作为比较，在相同的大肠杆菌分析方法表达的全长拟南芥基因编码序列产生的2-氧戊二酸酰胺活性为2.8纳摩尔，或者大致低于由切断的重组GPT蛋白观察的活性水平的五分之一。
实施例24：GPT+GS转基因烟草植物的发芽对高盐浓度的耐受性
在该实施例中，在以种子发芽分析方法测试来自双转基因烟草品系XX-3(表4中的杂交3，参见实施例7)的种子，所述分析方法被设计为评价对高盐浓度的耐受性。
材料和方法：
将得自野生型种群和XX-3种群的烟草种子进行表面灭菌(5％消毒液灭菌5分钟，随后10％乙醇洗涤3分钟)，然后用灭菌蒸馏水淋洗。然后将表面灭菌的种子撒在Murashige和Skoog培养基(10％琼脂糖)上，所述培养基不含有蔗糖，并且含有0或200mM NaCl。允许种子在黑暗条件下发芽2天，随后在24℃、16∶8的光照期内保持6天。在第8天，通过测量已经发芽的得自对照和转基因植物的种子的百分比来确定发芽率。
结果：
结果列于以下的表XXI中。在零盐条件下，转基因品系种子的发芽率与在野生型对照植物种子情况下观察到的发芽率相同。形成鲜明对比的是，在高盐条件下，转基因植物品系种子的发芽率远超过野生型对照种子的发芽率。截止到相同的时间点，有超过81％的转基因植物种子在高盐条件下发芽，而只有约9％的野生型对照植物种子发芽。这些结果表明，转基因种子在高盐条件下能够非常良好地发芽，这是植物在含水量和/或土壤盐度增高的区域生长的重要特征。
表XXI：
转基因烟草植物发芽和耐高盐情况
  植物类型   对照植物(0mM NaCl)   测试植物(200mMNaCl)a
  ％发芽率   ％发芽率
  野生型   92，87，94   9，11，8
  转基因品系XX-3   92，91，94   84，82，78
本说明书所引用的所有公开、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，好像指出各独立的公开或专利申请具体并且独立地以引用的方式并入一样。
本发明无意于通过本文所公开的实施方案来限制其范围，这些实施方案旨在作为本发明的各方面的独立阐释，并且与其功能等价的任何实施放哪均在本发明的范围内。除了本文所述的那些之外，对本发明的模型和方法的各种更改从上述的说明书和教导中对于本领域的技术人员而言是显而易见的，并且同样希望其落在本发明的范围内。可以在不偏离本发明的真正范围和精神的条件下实施这些更改方式或其它实施方案。
序列表：
SEQ ID NO：1拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶DNA编码序列：
ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTCTCCCAT
TCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCAC
AGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGT
TCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGG
CCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAA
GATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGC
GGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTG
CACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTT
GCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCA
CTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGA
CTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAG
CTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACG
ATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACT
GTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATT
GCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCA
ACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCT
GAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTA
CAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGA
ACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCG
TCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAG
AGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA
SEQ ID NO：2拟南芥GPT氨基酸序列
MYLDINGVMIKQFSFKASLLPFSSNFRQSSAKIHRPIGATMTTVSTQNESTQKPVQVAKRLEKFKT
TIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFRED
TGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDF
SIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHIS
IASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALK
APESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGV
VAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV
SEQ ID NO：3具有5’和3’未翻译序列(用小写字母表示)的紫花苜蓿GS1 DNA编码序列(大写字母)
atttccgttttcgttttcatttgattcattgaatcaaatcgaatcgaatctttaggattcaatacagattccttagatttt
actaagtttgaaaccaaaaccaaaacATGTCTCTCCTTTCAGATCTTATCAACCTTGACCT
CTCCGAAACCACCGAGAAAATCATCGCCGAATACATATGGATTGGTGGATCT
GGTTTGGACTTGAGGAGCAAAGCAAGGACTCTACCAGGACCAGTTACTGAC
CCTTCACAGCTTCCCAAGTGGAACTATGATGGTTCCAGCACAGGTCAAGCTC
CTGGAGAAGATAGTGAAGTTATTATCTACCCACAAGCCATTTTCAAGGACCC
ATTTAGAAGGGGTAACAATATCTTGGTTATGTGTGATGCATACACTCCAGCTG
GAGAGCCCATTCCCACCAACAAGAGACATGCAGCTGCCAAGATTTTCAGCC
ATCCTGATGTTGTTGCTGAAGTACCATGGTATGGTATTGAGCAAGAATACACC
TTGTTGCAGAAAGACATCAATTGGCCTCTTGGTTGGCCAGTTGGTGGTTTTC
CTGGACCTCAGGGACCATACTATTGTGGAGCTGGTGCTGACAAGGCATTTGG
CCGTGACATTGTTGACTCACATTACAAAGCCTGTCTTTATGCCGGCATCAACA
TCAGTGGAATCAATGGTGAAGTGATGCCTGGTCAATGGGAATTCCAAGTTGG
TCCCTCAGTTGGTATCTCTGCTGGTGATGAGATATGGGTTGCTCGTTACATTT
TGGAGAGGATCACTGAGGTTGCTGGTGTGGTGCTTTCCTTTGACCCAAAACC
AATTAAGGGTGATTGGAATGGTGCTGGTGCTCACACAAATTACAGCACCAAG
TCTATGAGAGAAGATGGTGGCTATGAAGTCATCTTGAAAGCAATTGAGAAGC
TTGGGAAGAAGCACAAGGAGCACATTGCTGCTTATGGAGAAGGCAACGAGC
GTAGATTGACAGGGCGACATGAGACAGCTGACATTAACACCTTCTTATGGGG
TGTTGCAAACCGTGGTGCGTCGATTAGAGTTGGAAGGGACACAGAGAAAGC
AGGGAAAGGTTATTTCGAGGATAGGAGGCCATCATCTAACATGGATCCATAT
GTTGTTACTTCCATGATTGCAGACACCACCATTCTCTGGAAACCATAAgccacc
acacacacatgcattgaagtatttgaaagtcattgttgattccgcattagaatttggtcattgttttttctaggatttgg
atttgtgttattgttatggttcacactttgtttgtttgaatttgaggccttgttataggtttcatatttctttctcttgttcta
agtaaatgtcagaataataatgtaat
SEQ ID NO：4紫花苜蓿GS1氨基酸序列
MSLLSDLINLDLSETTEKIIAEYIWIGGSGLDLRSKARTLPGPVTDPSQLPKWNYDGSSTGQAPGE
DSEVIIYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDAYTPAGEPIPTNKRHAAAKIFSHPDVVAEVPWYGIEQEYT
LLQKDINWPLGWPVGGFPGPQGPYYCGAGADKAFGRDIVDSHYKACLYAGINISGINGEVMPGQ
WEFQVGPSVGISAGDEIWVARYILERITEVAGVVLSFDPKPIKGDWNGAGAHTNYSTKSMREDGG
YEVILKAIEKLGKKHKEHIAAYGEGNERRLTGRHETADINTFLWGVANRGASIRVGRDTEKAGKG
YFEDRRPSSNMDPYVVTSMIADTTILWKP
SEQ ID NO：5具有5’和3’未翻译序列(由小写字母表示)以及从ClaI至SmaI/SspI和从SspI/SmaI至SalI/XhoI(小写字母，下划线)的载体序列的紫花苜蓿GS1 DNA编码序列(大写字母)
atcgatgaattcgagctcggtacccatttccgttttcgttttcatttgattcattgaatcaaatcgaatcgaatctttag
gattcaatacagattccttagattttactaagtttgaaaccaaaaccaaaacATGTCTCTCCTTTCAGAT
CTTATCAACCTTGACCTCTCCGAAACCACCGAGAAAATCATCGCCGAATACA
TATGGATTGGTGGATCTGGTTTGGACTTGAGGAGCAAAGCAAGGACTCTACC
AGGACCAGTTACTGACCCTTCACAGCTTCCCAAGTGGAACTATGATGGTTCC
AGCACAGGTCAAGCTCCTGGAGAAGATAGTGAAGTTATTATCTACCCACAAG
CCATTTTCAAGGACCCATTTAGAAGGGGTAACAATATCTTGGTTATGTGTGAT
GCATACACTCCAGCTGGAGAGCCCATTCCCACCAACAAGAGACATGCAGCT
GCCAAGATTTTCAGCCATCCTGATGTTGTTGCTGAAGTACCATGGTATGGTAT
TGAGCAAGAATACACCTTGTTGCAGAAAGACATCAATTGGCCTCTTGGTTGG
CCAGTTGGTGGTTTTCCTGGACCTCAGGGACCATACTATTGTGGAGCTGGTG
CTGACAAGGCATTTGGCCGTGACATTGTTGACTCACATTACAAAGCCTGTCT
TTATGCCGGCATCAACATCAGTGGAATCAATGGTGAAGTGATGCCTGGTCAA
TGGGAATTCCAAGTTGGTCCCTCAGTTGGTATCTCTGCTGGTGATGAGATATG
GGTTGCTCGTTACATTTTGGAGAGGATCACTGAGGTTGCTGGTGTGGTGCTT
TCCTTTGACCCAAAACCAATTAAGGGTGATTGGAATGGTGCTGGTGCTCACA
CAAATTACAGCACCAAGTCTATGAGAGAAGATGGTGGCTATGAAGTCATCTT
GAAAGCAATTGAGAAGCTTGGGAAGAAGCACAAGGAGCACATTGCTGCTTA
TGGAGAAGGCAACGAGCGTAGATTGACAGGGCGACATGAGACAGCTGACAT
TAACACCTTCTTATGGGGTGTTGCAAACCGTGGTGCGTCGATTAGAGTTGGA
AGGGACACAGAGAAAGCAGGGAAAGGTTATTTCGAGGATAGGAGGCCATCA
TCTAACATGGATCCATATGTTGTTACTTCCATGATTGCAGACACCACCATTCT
CTGGAAACCATAAgccaccacacacacatgcattgaagtatttgaaagtcattgttgattccgcattagaa
tttggtcattgttttttctaggatttggatttgtgttattgttatggttcacactttgtttgtttgaatttgaggccttgtta
taggtttcatatttctttctcttgttctaagtaaatgtcagaataataatgtaatggggatcctctagagtcgag
SEQ ID NO：6拟南芥GS1编码序列
Cambia 1201载体+rbcS3C+拟南芥GS1粗体ATG是起始位点
AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG
AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC
CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT
ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA
Figure BPA00001327983800711
TCTCTGCTCTCAGAT
CTCGTTAACCTCAACCTCACCGATGCCACCGGGAAAATCATCGCCGAATACATATGGATCGGTG
GATCTGGAATGGATATCAGAAGCAAAGCCAGGACACTACCAGGACCAGTGACTGATCCATCA
AAGCTTCCCAAGTGGAACTACGACGGATCCAGCACCGGTCAGGCTGCTGGAGAAGACAGTG
AAGTCATTCTATACCCTCAGGCAATATTCAAGGATCCCTTCAGGAAAGGCAACAACATCCTGG
TGATGTGTGATGCTTACACACCAGCTGGTGATCCTATTCCAACCAACAAGAGGCACAACGCTG
CTAAGATCTTCAGCCACCCCGACGTTGCCAAGGAGGAGCCTTGGTATGGGATTGAGCAAGAAT
ACACTTTGATGCAAAAGGATGTGAACTGGCCAATTGGTTGGCCTGTTGGTGGCTACCCTGGCC
CTCAGGGACCTTACTACTGTGGTGTGGGAGCTGACAAAGCCATTGGTCGTGACATTGTGGATG
CTCACTACAAGGCCTGTCTTTACGCCGGTATTGGTATTTCTGGTATCAATGGAGAAGTCATGCC
AGGCCAGTGGGAGTTCCAAGTCGGCCCTGTTGAGGGTATTAGTTCTGGTGATCAAGTCTGGGT
TGCTCGATACCTTCTCGAGAGGATCACTGAGATCTCTGGTGTAATTGTCAGCTTCGACCCGAA
ACCAGTCCCGGGTGACTGGAATGGAGCTGGAGCTCACTGCAACTACAGCACTAAGACAATGA
GAAACGATGGAGGATTAGAAGTGATCAAGAAAGCGATAGGGAAGCTTCAGCTGAAACACAA
AGAACACATTGCTGCTTACGGTGAAGGAAACGAGCGTCGTCTCACTGGAAAGCACGAAACCG
CAGACATCAACACATTCTCTTGGGGAGTCGCGAACCGTGGAGCGTCAGTGAGAGTGGGACGT
GACACAGAGAAGGAAGGTAAAGGGTACTTCGAAGACAGAAGGCCAGCTTCTAACATGGATCC
TTACGTTGTCACCTCCATGATCGCTGAGACGACCATACTCGGTTGA
SEQ ID NO：7拟南芥GS1氨基酸序列
斜体是在N-末端的载体序列
Figure BPA00001327983800721
MSLLSDLVNLNLTDATGKIIAEYIWIGGSGMDIRSKARTLPGPVTDPSKLPKWNYD
GSSTGQAAGEDSEVILYPQAIFKDPFRKGNNILVMCDAYTPAGDPIPTNKRHNAAKIFSHPDVAKE
EPWYGIEQEYTLMQKDVNWPIGWPVGGYPGPQGPYYCGVGADKAIGRDIVDAHYKACLYAGIG
ISGINGEVMPGQWEFQVGPVEGISSGDQVWVARYLLERITEISGVIVSFDPKPVPGDWNGAGAHC
NYSTKTMRNDGGLEVIKKAIGKLQLKHKEHIAAYGEGNERRLTGKHETADINTFSWGVANRGAS
VRVGRDTEKEGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIAETTILG
SEQ ID NO：8葡萄GPTDNA序列示出具有(3’端)rbcS3C+Vitis的Cambia 1305.1(葡萄)。粗体ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是用于在大麦属基因中分裂的speI克隆位点。
AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG
AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC
CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT
ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA
Figure BPA00001327983800722
TAGATCTGAGG(GT
AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT
TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA
ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA
ATGCAGCTCTCTCAATGTACCTGGACATTCCCAGAGTTGCTTAAAAGACCAGCCTTTT
TAAGGAGGAGTATTGATAGTATTTCGAGTAGAAGTAGGTCCAGCTCCAAGTATCCATCTTTCAT
GGCGTCCGCATCAACGGTCTCCGCTCCAAATACGGAGGCTGAGCAGACCCATAACCCCCCTCA
ACCTCTACAGGTTGCAAAGCGCTTGGAGAAATTCAAAACAACAATCTTTACTCAAATGAGCAT
GCTTGCCATCAAACATGGAGCAATAAACCTTGGCCAAGGGTTTCCCAACTTTGATGGTCCTGA
GTTTGTCAAAGAAGCAGCAATTCAAGCCATTAAGGATGGGAAAAACCAATATGCTCGTGGATA
TGGAGTTCCTGATCTCAACTCTGCTGTTGCTGATAGATTCAAGAAGGATACAGGACTCGTGGT
GGACCCCGAGAAGGAAGTTACTGTTACTTCTGGATGTACAGAAGCAATTGCTGCTACTATGCT
AGGCTTGATAAATCCTGGTGATGAGGTGATCCTCTTTGCTCCATTTTATGATTCCTATGAAGCCA
CTCTATCCATGGCTGGTGCCCAAATAAAATCCATCACTTTACGTCCTCCGGATTTTGCTGTGCCC
ATGGATGAGCTCAAGTCTGCAATCTCAAAGAATACCCGTGCAATCCTTATAAACACTCCCCATA
ACCCCACAGGAAAGATGTTCACAAGGGAGGAACTGAATGTGATTGCATCCCTCTGCATTGAG
AATGATGTGTTGGTGTTTACTGATGAAGTTTACGACAAGTTGGCTTTCGAAATGGATCACATTT
CCATGGCTTCTCTTCCTGGGATGTACGAGAGGACCGTGACTATGAATTCCTTAGGGAAAACTTT
CTCCCTGACTGGATGGAAGATTGGTTGGACAGTAGCTCCCCCACACCTGACATGGGGAGTGA
GGCAAGCCCACTCATTCCTCACGTTTGCTACCTGCACCCCAATGCAATGGGCAGCTGCAACAG
CCCTCCGGGCCCCAGACTCTTACTATGAAGAGCTAAAGAGAGATTACAGTGCAAAGAAGGCA
ATCCTGGTGGAGGGATTGAAGGCTGTCGGTTTCAGGGTATACCCATCAAGTGGGACCTATTTT
GTGGTGGTGGATCACACCCCATTTGGGTTGAAAGACGATATTGCGTTTTGTGAGTATCTGATCA
AGGAAGTTGGGGTGGTAGCAATTCCGACAAGCGTTTTCTACTTACACCCAGAAGATGGAAAG
AACCTTGTGAGGTTTACCTTCTGTAAAGACGAGGGAACTCTGAGAGCTGCAGTTGAAAGGAT
GAAGGAGAAACTGAAGCCTAAACAATAGGGGCACGTGA
SEQ ID NO：9葡萄GPT氨基酸序列
MVDLRNRRTSMQLSQCTWTFPELLKRPAFLRRSIDSISSRSRSSSKYPSFMASASTVSAPNTEAEQT
HNPPQPLQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIKDGKNQYA
RGYGVPDLNSAVADRFKKDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAATMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEA
TLSMAGAQIKSITLRPPDFAVPMDELKSAISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNVIASLCIENDVL
VFTDEVYDKLAFEMDHISMASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWTVAPPHLTWGVRQAH
SFLTFATCTPMQWAAATALRAPDSYYEELKRDYSAKKAILVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVVVDHT
PFGLKDDIAFCEYLIKEVGVVAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVERMKEKLKPKQ
SEQ ID NO：10水稻GPT DNA序列
水稻GPT密码子优化用于E.coli表达；未翻译序列以小写字母示出
atgtggATGAACCTGGCAGGCTTTCTGGCAACCCCGGCAACCGCAACCGCAACCCGTCATGAAAT
GCCGCTGAACCCGAGCAGCAGCGCGAGCTTTCTGCTGAGCAGCCTGCGTCGTAGCCTGGTGG
CGAGCCTGCGTAAAGCGAGCCCGGCAGCAGCAGCAGCACTGAGCCCGATGGCAAGCGCAAG
CACCGTGGCAGCAGAAAACGGTGCAGCAAAAGCAGCAGCAGAAAAACAGCAGCAGCAGCC
GGTGCAGGTGGCGAAACGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGATGAGCATGCT
GGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCC
GAACTTTGATGGCCCGGATTTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTAACGCGGGCAAAA
ACCAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGAACTGAACAGCGCGATTGCGGAACGTTTTCTGA
AAGATAGCGGCCTGCAGGTGGATCCGGAAAAAGAAGTGACCGTGACCAGCGGCTGCACCGA
AGCGATTGCGGCGACCATTCTGGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTCTGTTTGCGCC
GTTTTATGATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAACGTGAAAGCGATTACCCT
GCGTCCGCCGGATTTTAGCGTGCCGCTGGAAGAACTGAAAGCGGCCGTGAGCAAAAACACCC
GTGCGATTATGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCGTGAAGAACTGG
AATTTATTGCGACCCTGTGCAAAGAAAACGATGTGCTGCTGTTTGCGGATGAAGTGTATGATA
AACTGGCGTTTGAAGCGGATCATATTAGCATGGCGAGCATTCCGGGCATGTATGAACGTACCGT
GACCATGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTG
CGCCGCCGCATCTGACCTGGGGCGTGCGTCAGGCACATAGCTTTCTGACCTTTGCAACCTGCA
CCCCGATGCAGGCAGCCGCCGCAGCAGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATGAAGAACTGC
GTCGTGATTATGGCGCGAAAAAAGCGCTGCTGGTGAACGGCCTGAAAGATGCGGGCTTTATTG
TGTATCCGAGCAGCGGCACCTATTTTGTGATGGTGGATCATACCCCGTTTGGCTTTGATAACGA
TATTGAATTTTGCGAATATCTGATTCGTGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGCCGAGCGTGTTT
TATCTGAACCCGGAAGATGGCAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGATGAAACC
CTGCGTGCGGCGGTGGAACGTATGAAAACCAAACTGCGTAAAAAAAAGCTTgcggccgcactcgagc
accaccaccaccaccactga
SEQ ID NO：11水稻GPT氨基酸序列
斜体包括用于克隆的氨基末端氨基酸MW和来自pet28载体的His标签序列
MNLAGFLATPATATATRHEMPLNPSSSASFLLSSLRRSLVASLRKASPAAAAALSPMASASTVA
AENGAAKAAAEKQQQQPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAA
IQAINAGKNQYARGYGVPELNSAIAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVI
LFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREEL
EFIATLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPP
HLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQAAAAAALRAPDSYYEELRRDYGAKKALLVNGLKDAGFIVYPS
SGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDETLRAAVE
RMKTKLRKK
SEQ ID NO：12大豆GP TDNA序列
局部151D，大豆，用于E coli表达
从起始密码子.载体序列是斜体
Figure BPA00001327983800743
Figure BPA00001327983800744
Figure BPA00001327983800745
GCGAAACGTCTGGAAAAATTTCAGACCACCATTT
TTACCCAGATGAGCCTGCTGGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGA
ACTTTGATGGCCCGGAATTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGCAAAAAC
CAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTGCGGAACGTTTTAAAAAA
GATACCGGCCTGGTGGTGGATCCGGAAAAAGAAATTACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGC
GATTGCGGCGACCATGATTGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTATGTTTGCGCCGTTT
TATGATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGT
CCGCCGGATTTTGCGGTGCCGCTGGAAGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCCGTGC
GATTCTGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCGTGAAGAACTGAACTG
CATTGCGAGCCTGTGCATTGAAAACGATGTGCTGGTGTTTACCGATGAAGTGTATGATAAACTG
GCGTTTGATATGGAACATATTAGCATGGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGACCC
TGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCG
CCGCATCTGAGCTGGGGCGTGCGTCAGGCGCATGCGTTTCTGACCTTTGCAACCGCACATCCG
TTTCAGTGCGCAGCAGCAGCAGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATGTGGAACTGAAACGT
GATTATATGGCGAAACGTGCGATTCTGATTGAAGGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTT
CCGAGCAGCGGCACCTATTTTGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCTGGAAAACGATGTG
GCGTTTTGCGAATATCTGGTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGACCAGCGTGTTTTAT
CTGAACCCGGAAGAAGGCAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGAAGAAACCAT
TCGTAGCGCGGTGGAACGTATGAAAGCGAAACTGCGTAAAGTCGACTAA
SEQ ID NO：13大豆GPT氨基酸序列
翻译的蛋白产物，载体序列斜体
Figure BPA00001327983800746
AKRLEKFQTTIFTQMSLLAIKHGAINLGQGFPNF
DGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYARGYGVPDLNIAIAERFKKDTGLVVDPEKEITVTSGCTEAIAATM
IGLINPGDEVIMFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFAVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPT
GKMFTREELNCIASLCIENDVLVFTDEVYDKLAFDMEHISMASLPGMFERTVTLNSLGKTFSLTG
WKIGWAIAPPHLSWGVRQAHAFLTFATAHPFQCAAAAALRAPDSYYVELKRDYMAKRAILIEGL
KAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGLENDVAFCEYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCK
DEETIRSAVERMKAKLRKVD
SEQ ID NO：14大麦GPTDNA序列
编码序列从除去内含子起始
Figure BPA00001327983800751
TAGATCTGAGGAACCGACGA
Figure BPA00001327983800752
ATGGCATCCGCCCCCGCCTCCGCCTCCGCGGCC
CTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGACAACGGGGCCGCCAAGCCCACGGAGCAGCGGCCGGTAC
AGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGTTCAAAACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCA
GTGAAGCATGGAGCAATAAACCTTGGACAGGGGTTTCCCAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTC
AAAGATGCTGCTATTGAGGCTATCAAAGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTG
CCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCTGAGAGATTTCTCAAGGACAGTGGATTGCACATCGATCCT
GATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGGGTGCACAGAAGCAATAGCTGCAACGATATTGGGTCTG
ATCAACCCTGGGGATGAAGTCATACTGTTTGCTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACACTGTC
CATGGCTGGTGCGAATGTCAAAGCCATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGA
AGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAATACCAGAGCAATAATGATTAATACACCTCACAACCC
TACCGGGAAAATGTTCACAAGGGAGGAACTTGAGTTCATTGCTGATCTCTGCAAGGAAAATG
ACGTGTTGCTCTTTGCCGATGAGGTCTACGACAAGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAA
TGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTC
CTTGACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGTAAGGC
AGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCCACCTCCACGCCGATGCAATCAGCAGCGGCGGCGGCCC
TGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGAGGAGCTGAAGAGGGACTACGGCGCAAAGAAAGCGCT
GCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCGGGCTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCAT
CATGGTCGACCACACCCCGTTCGGGTTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCG
CGAGGTCGGCGTCGTGGCCATCCCGCCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGACGGGAAGA
ACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGACGACGACACGCTAAGGGCGGCGGTGGACAGGATG
AAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGA
SEQ ID NO：15大麦GPT氨基酸序列
来自起始位点(内含子除去)的翻译的序列
MVDLRNRRTSMASAPASASAALSTAAPADNGAAKPTEQRPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAVK
HGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAIKAGKNQYARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLHIDPDKEV
TVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKAAVSK
NTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIADLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTV
TMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTPMQSAAAAALRAPDSYFEELKRD
YGAKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVEFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPE
DGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK
SEQ ID NO：16斑马鱼GPTDNA序列
Danio rerio序列设计用于在E coli中表达。粗体，斜体核苷酸加入用于克隆或来自pET28b载体。
Figure BPA00001327983800761
TGGCGAAACGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGATGAGCATGCTG
GCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGAACTTTGATGGCCCGGATTTT
GTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGCAACAACCAGTATGCGCGTGGCTATGG
CGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTAGCGAACGTTATAAAAAAGATACCGGCCTGGCGGTGGA
TCCGGAAAAAGAAATTACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCGTGCTGG
GCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTGTGTTTGCGCCGTTTTATGATAGCTATGAAGCGAC
CCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGTCCGCCGGATTTTGCGCTGC
CGATTGAAGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCCGTGCGATTCTGCTGAACACCCCG
CATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCCGGAAGAACTGAACACCATTGCGAGCCTGTGCATT
GAAAACGATGTGCTGGTGTTTAGCGATGAAGTGTATGATAAACTGGCGTTTGATATGGAACATA
TTAGCATTGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGACCATGAACAGCCTGGGCAAA
ACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCGCCGCATCTGACCTGGGGC
GTGCGTCAGGCGCATGCGTTTCTGACCTTTGCAACCAGCAACCCGATGCAGTGGGCAGCAGC
AGTGGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATACCGAACTGAAACGTGATTATATGGCGAAACGT
AGCATTCTGGTGGAAGGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTTCCGAGCAGCGGCACCTA
TTTTGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCATGAAAACGATATTGCGTTTTGCGAATATCTG
GTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGACCAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGAAGG
CAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGAAGGCACCCTGCGTGCGGCGGTGGATC
GTATGAAAGAAAAACTGCGTAAA
Figure BPA00001327983800763
SEQ ID NO：17斑马鱼GPR氨基酸序列
在E.coli中克隆和表达的Danio rerio氨基酸序列(粗体，斜体氨基酸是从载体/克隆和C-末端上的His标签加入)
Figure BPA00001327983800764
VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIRDGNNQYARGYGVP
DLNIAISERYKKDTGLAVDPEKEITVTSGCTEAIAATVLGLINPGDEVIVFAPFYDSYEATLSMAGA
KVKGITLRPPDFALPIEELKSTISKNTRAILLNTPHNPTGKMFTPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVY
DKLAFDMEHISIASLPGMFERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNP
MQWAAAVALRAPDSYYTELKRDYMAKRSILVEGLKAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGHENDIA
FCEYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRK
Figure BPA00001327983800765
Figure BPA00001327983800766
SEQ ID NO：18拟南芥截短的GPT-30构造体DNA序列
拟南芥GPT具有从目标序列除去的30个氨基酸。
ATGGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCT
ACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCA
AATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGAC
GGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCT
CGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTC
TTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAG
CTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTAT
GAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTC
TCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAAC
ACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCT
CTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATG
GATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGG
GAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTT
GGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCA
GCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGT
GAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCG
GGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGA
GTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAA
GAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGC
GTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA
SEQ ID NO：19拟南芥截短的GPT-30构造体氨基酸序列
MAKIHRPIGATMTTVSTQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPD
FVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLI
NPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGK
MFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKI
GWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEV
GFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEE
TLRGAIERMKQKLKRKV
SEQ ID NO：20：拟南芥截短的GPT-45构造体DNA序列
拟南芥GPT具有从目标序列除去的45个残基
ATGGCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTT
CAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGC
CAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAG
ATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCG
GTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGC
ACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTG
CACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCAC
TTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGAC
TCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGC
TTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGA
TAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACT
GTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATT
GCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCA
ACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCT
GAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTA
CAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGA
ACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCG
TCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAG
AGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA
SEQ ID NO：21：拟南芥截短的GPT-45构造体氨基酸序列
MATQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDG
KNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFY
DSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASL
CIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWG
VRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFV
VADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKL
KRKV
SEQ ID NO：22：番茄Rubisco启动子
番茄RuBisCo rbcS3C启动子序列从KpnI至NcoI
Figure BPA00001327983800781
GTTTGAATCCTCCTTAAAGTTTTTCTCTGGAGAAACTGTAGTAATTTTACTTTGTTGTG
TTCCCTTCATCTTTTGAATTAATGGCATTTGTTTTAATACTAATCTGCTTCTGAAACTTGTAATGT
ATGTATATCAGTTTCTTATAATTTATCCAAGTAATATCTTCCATTCTCTATGCAATTGCCTGCATAA
GCTCGACAAAAGAGTACATCAACCCCTCCTCCTCTGGACTACTCTAGCTAAACTTGAATTTCC
CCTTAAGATTATGAAATTGATATATCCTTAACAAACGACTCCTTCTGTTGGAAAATGTAGTACTT
GTCTTTCTTCTTTTGGGTATATATAGTTTATATACACCATACTATGTACAACATCCAAGTAGAGTG
AAATGGATACATGTACAAGACTTATTTGATTGATTGATGACTTGAGTTGCCTTAGGAGTAACAA
ATTCTTAGGTCAATAAATCGTTGATTTGAAATTAATCTCTCTGTCTTAGACAGATAGGAATTATG
ACTTCCAATGGTCCAGAAAGCAAAGTTCGCACTGAGGGTATACTTGGAATTGAGACTTGCACA
GGTCCAGAAACCAAAGTTCCCATCGAGCTCTAAAATCACATCTTTGGAATGAAATTCAATTAG
AGATAAGTTGCTTCATAGCATAGGTAAAATGGAAGATGTGAAGTAACCTGCAATAATCAGTGA
AATGACATTAATACACTAAATACTTCATATGTAATTATCCTTTCCAGGTTAACAATACTCTATAAA
GTAAGAATTATCAGAAATGGGCTCATCAAACTTTTGTACTATGTATTTCATATAAGGAAGTATAA
CTATACATAAGTGTATACACAACTTTATTCCTATTTTGTAAAGGTGGAGAGACTGTTTTCGATGG
ATCTAAAGCAATATGTCTATAAAATGCATTGATATAATAATTATCTGAGAAAATCCAGAATTGGC
GTTGGATTATTTCAGCCAAATAGAAGTTTGTACCATACTTGTTGATTCCTTCTAAGTTAAGGTGA
AGTATCATTCATAAACAGTTTTCCCCAAAGTACTACTCACCAAGTTTCCCTTTGTAGAATTAAC
AGTTCAAATATATGGCGCAGAAATTACTCTATGCCCAAAACCAAACGAGAAAGAAACAAAATA
CAGGGGTTGCAGACTTTATTTTCGTGTTAGGGTGTGTTTTTTCATGTAATTAATCAAAAAATATT
ATGACAAAAACATTTATACATATTTTTACTCAACACTCTGGGTATCAGGGTGGGTTGTGTTCGA
CAATCAATATGGAAAGGAAGTATTTTCCTTATTTTTTTAGTTAATATTTTCAGTTATACCAAACAT
ACCTTGTGATATTATTTTTAAAAATGAAAAACTCGTCAGAAAGAAAAAGCAAAAGCAACAAA
AAAATTGCAAGTATTTTTTAAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGT
TTGAGATAAGGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACC
ACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATA
GGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA
Figure BPA00001327983800791
Figure BPA00001327983800792
SEQ ID NO：23：竹子GPTDNA序列
ATGGCCTCCGCGGCCGTCTCCACCGTCGCCACCGCCGCCGACGGCGTCGCGAAGCCGACGGA
GAAGCAGCCGGTACAGGTCGCAAAGCGTTTGGAAAAGTTTAAGACAACAATTTTCACACAGA
TGAGCATGCTTGCCATCAAGCATGGAGCAATAAACCTCGGCCAGGGCTTTCCGAATTTTGATG
GCCCTGACTTTGTGAAAGAAGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTATGCAA
GAGGATATGGTGTGCCTGAACTGAACTCGGCTGTTGCTGAAAGGTTCCTGAAGGACAGTGGC
TTGCAAGTCGATCCCGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGGTGCACGGAAGCGATAGCTGC
AACGATATTGGGTCTTATCAACCCTGGCGATGAAGTGATCTTGTTTGCTCCATTCTATGATTCAT
ACGAGGCTACGCTGTCGATGGCTGGTGCCAATGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTT
TGCAGTCCCTCTTGAGGAGCTAAAGGCCACAGTCTCTAAGAACACCAGAGCGATAATGATAA
ACACACCACACAATCCTACTGGGAAAATGTTTTCTAGGGAAGAACTTGAATTCATTGCTACTC
TCTGCAAGAAAAATGATGTGTTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTATGACAAGTTGGCATTTGAGG
CAGATCATATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACTGTGACTATGAACTCTCTG
GGGAAGACATTCTCTCTAACAGGATGGAAGATCGGTTGGGCAATAGCACCACCACACCTGAC
ATGGGGTGTAAGGCAGGCACACTCATTCCTCACATTTGCCACCTGCACACCAATGCAATCGGC
GGCGGCGGCGGCTCTTAGAGCACCAGATAGCTACTATGGGGAGCTGAAGAGGGATTACGGTG
CAAAGAAAGCGATACTAGTCGACGGACTCAAGGCTGCAGGTTTTATTGTTTACCCTTCAAGTG
GAACATACTTTGTCATGGTCGATCACACCCCGTTTGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGA
GTATTTGATCCGCGAAGTCGGTGTTGTCGCCATACCACCAAGCGTATTTTATCTCAACCCTGAG
GATGGGAAGAACTTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGATGATGATACGCTGAGAGCCGCAGT
TGAGAGGATGAAGACAAAGCTCAGGAAAAAATGA
SEQ ID NO：24：竹子GPT氨基酸序列
MASAAVSTVATAADGVAKPTEKQPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPD
FVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLI
NPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKATVSKNTRAIMINTPHNPTGK
MFSREELEFIATLCKKNDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWK
IGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQSAAAAALRAPDSYYGELKRDYGAKKAILVDGLKA
AGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDD
DTLRAAVERMKTKLRKK
SEQ ID NO：25：1305.1+rbcS3C启动子+catI内含子和水稻GPT基因.Cambia1305.1和(3’端)rbcS3C+水稻GPT。下划线ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是speI克隆位点，其用于在水稻基因中分裂。
AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG
AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC
CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT
ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCATAGATCTGAGG(GT
AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT
TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA
ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA
Figure BPA00001327983800802
ATGAATCTGGCCGGCTTTCTCGCCACGCCCGCGACCGCGACCGCGACGCGGCATGAG
ATGCCGTTAAATCCCTCCTCCTCCGCCTCCTTCCTCCTCTCCTCGCTCCGCCGCTCGCTCGTCG
CGTCGCTCCGGAAGGCCTCGCCGGCGGCGGCCGCGGCGCTCTCCCCCATGGCCTCCGCGTCC
ACCGTCGCCGCCGAGAACGGCGCCGCCAAGGCGGCGGCGGAGAAGCAGCAGCAGCAGCCTG
TGCAGGTTGCAAAGCGGTTGGAAAAGTTTAAGACGACCATTTTCACACAGATGAGTATGCTTG
CCATCAAGCATGGAGCAATAAACCTTGGCCAGGGTTTTCCGAATTTCGATGGCCCTGACTTTGT
AAAAGAGGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTACGCAAGAGGATATGGTGT
GCCTGAACTGAACTCAGCTATTGCTGAAAGATTCCTGAAGGACAGCGGACTGCAAGTCGATC
CGGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGATGCACAGAAGCTATAGCTGCAACAATTTTAGGTC
TAATTAATCCAGGCGATGAAGTGATATTGTTTGCTCCATTCTATGATTCATATGAGGCTACCCTG
TCAATGGCTGGTGCCAACGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTTTTCAGTCCCTCTTG
AAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAACACCAGAGCTATTATGATAAACACCCCGCACAAT
CCTACTGGGAAAATGTTTACAAGGGAAGAACTTGAGTTTATTGCCACTCTCTGCAAGGAAAAT
GATGTGCTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTACGACAAGTTAGCTTTTGAGGCAGATCATATATCAA
TGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACCGTGACCATGAACTCTCTTGGGAAGACATTCTC
TCTTACAGGATGGAAGATCGGTTGGGCAATCGCACCGCCACACCTGACATGGGGTGTAAGGC
AGGCACACTCATTCCTCACGTTTGCGACCTGCACACCAATGCAAGCAGCTGCAGCTGCAGCT
CTGAGAGCACCAGATAGCTACTATGAGGAACTGAGGAGGGATTATGGAGCTAAGAAGGCATT
GCTAGTCAACGGACTCAAGGATGCAGGTTTCATTGTCTATCCTTCAAGTGGAACATACTTCGTC
ATGGTCGACCACACCCCATTTGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGAGTATTTGATTCGCG
AAGTCGGTGTTGTCGCCATACCACCTAGTGTATTTTATCTCAACCCTGAGGATGGGAAGAACTT
GGTGAGGTTCACCTTTTGCAAGGATGATGAGACGCTGAGAGCCGCGGTTGAGAGGATGAAGA
CAAAGCTCAGGAAAAAATGA
SEQ ID NO：26：载体中大麦属GPT序列
Cambia1305.1和(3’端)rbcS3C+大麦属IDI4。下划线ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是speI克隆位点，其用于在大麦属基因中分裂。
AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG
AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC
CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT
ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA
Figure BPA00001327983800811
TAGATCTGAGG(GT
AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT
TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA
ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA
Figure BPA00001327983800812
ATGGCATCCGCCCCCGCCTCCGCCTCCGCGGCCCTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGAC
AACGGGGCCGCCAAGCCCACGGAGCAGCGGCCGGTACAGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGT
TCAAAACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCAGTGAAGCATGGAGCAATAAACCTTG
GACAGGGGTTTCCCAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTCAAAGATGCTGCTATTGAGGCTATCAA
AGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTGCCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCTGA
GAGATTTCTCAAGGACAGTGGATTGCACATCGATCCTGATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGG
GTGCACAGAAGCAATAGCTGCAACGATATTGGGTCTGATCAACCCTGGGGATGAAGTCATACT
GTTTGCTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACACTGTCCATGGCTGGTGCGAATGTCAAAGCC
ATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGAAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAG
AATACCAGAGCAATAATGATTAATACACCTCACAACCCTACCGGGAAAATGTTCACAAGGGAG
GAACTTGAGTTCATTGCTGATCTCTGCAAGGAAAATGACGTGTTGCTCTTTGCCGATGAGGTC
TACGACAAGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGA
GGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTCCTTGACCGGATGGAAGATCGGCTGG
GCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGTAAGGCAGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCC
ACCTCCACGCCGATGCAATCAGCAGCGGCGGCGGCCCTGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGA
GGAGCTGAAGAGGGACTACGGCGCAAAGAAAGCGCTGCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCG
GGCTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCATCATGGTCGACCACACCCCGTTCGGG
TTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCGCGAGGTCGGCGTCGTGGCCATCCCG
CCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGACGGGAAGAACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAA
GGACGACGACACGCTAAGGGCGGCGGTGGACAGGATGAAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGA
TTGAGGGGCG
Figure BPA00001327983800813
SEQ ID NO：27 Cambia 1201+拟南芥GPT序列(斜体来自CaMV的35S启动子)
Figure BPA00001327983800815
ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCT
TCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACC
ATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATT
AGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGAT
CAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCA
AGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCT
ATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTT
ACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAA
GTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGT
AAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGT
AACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCA
CTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGG
ATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATG
TATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATC
GGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACA
TTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTA
CTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGG
AAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATT
TGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGAT
CCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTG
TAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAA
GTCTGA
SEQ ID NO：28 Cambia p1305.1和(3’端)rbcS3C+拟南芥GPT。下划线ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是speI克隆位点，其用于在拟南芥基因中分裂。
AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG
AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC
CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT
ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA
Figure BPA00001327983800821
TAGATCTGAGG(GT
AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT
TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA
ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA
Figure BPA00001327983800822
ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTC
TCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCAT
GACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAG
AGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAA
TTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCT
ATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAG
CTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACAT
CTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCA
TTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAA
AGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAAC
TAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAG
GGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGA
AGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATG
AAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCT
GGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCG
CCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTC
AAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAG
TCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGG
AATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCC
AACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAA
AGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTC
TGA
SEQ ID NO：29拟南芥GPT编码序列(成熟蛋白，无目标序列)
GTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTT
AAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAA
GAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCT
CAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGA
AAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAA
CCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGG
CTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGC
TTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCG
GGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGC
TTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCT
CTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCG
GATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACAC
TCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCA
CCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAA
GGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGA
TCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGG
GTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGG
TTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCT
TAAGAGAAAAGTCTGA
SEQ ID NO：30拟南芥GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)
VAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLN
SAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKV
KGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYD
KLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPA
QWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAF
CEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV
SEQ ID NO：31葡萄GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)
VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGVPDL
NSAVADRFKKDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAATMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAQ
IKSITLRPPDFAVPMDELKSAISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNVIASLCIENDVLVFTDEVYD
KLAFEMDHISMASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWTVAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTP
MQWAAATALRAPDSYYEELKRDYSAKKAILVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVVVDHTPFGLKDDIA
FCEYLIKEVGVVAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVERMKEKLKPKQ
SEQ ID NO：32水稻GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)
VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPEL
NSAIAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANV
KAITLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIATLCKENDVLLFADEVYD
KLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTP
MQAAAAAALRAPDSYYEELRRDYGAKKALLVNGLKDAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDI
EFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDETLRAAVERMKTKLRKK
SEQ ID NO：33大豆GPT氨基酸序列(-1成熟蛋白，无目标序列)
AKRLEKFQTTIFTQMSLLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYARGYGVPDLNI
AIAERFKKDTGLVVDPEKEITVTSGCTEAIAATMIGLINPGDEVIMFAPFYDSYEATLSMAGAKVK
GITLRPPDFAVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNCIASLCIENDVLVFTDEVYDKL
AFDMEHISMASLPGMFERTVTLNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLSWGVRQAHAFLTFATAHPFQ
CAAAAALRAPDSYYVELKRDYMAKRAILIEGLKAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGLENDVAFC
EYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEETIRSAVERMKAKLRKVD
SEQ ID NO：34大麦GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)
VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAIKAGKNQYARGYGVPEL
NSAVAERFLKDSGLHIDPDKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANV
KAITLRPPDFAVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIADLCKENDVLLFADEVY
DKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTP
MQSAAAAALRAPDSYFEELKRDYGAKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVE
FCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK
SEQ ID NO：35斑马鱼GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)
VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIRDGNNQYARGYGVPDL
NIAISERYKKDTGLAVDPEKEITVTSGCTEAIAATVLGLINPGDEVIVFAPFYDSYEATLSMAGAKV
KGITLRPPDFALPIEELKSTISKNTRAILLNTPHNPTGKMFTPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVYDK
LAFDMEHISIASLPGMFERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNPM
QWAAAVALRAPDSYYTELKRDYMAKRSILVEGLKAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGHENDIAFC
EYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRK
SEQ ID NO：36竹子GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)
VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPEL
NSAVAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANV
KAITLRPPDFAVPLEELKATVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFSREELEFIATLCKKNDVLLFADEVYD
KLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTP
MQSAAAAALRAPDSYYGELKRDYGAKKAILVDGLKAAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIE
FCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVERMKTKLRKK

Claims (28)

1.一种转基因植物，包含GPT转基因和GS转基因，其中所述GPT转基因和所述GS转基因与植物启动子可操作地连接。
2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述GS转基因为GS1转基因。
3.根据权利要求1或2所述的转基因植物，其中所述GPT转基因编码具有选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列的多肽，并且具有GPT活性：(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及(b)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中的任一者具有至少75％一致性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的转基因，其中所述GS转基因编码具有选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列的多肽：得自残基11的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7，以及(b)与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7具有至少75％一致性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4所述的转基因植物，其中所述GPT和GS转基因引入所述植物的基因组内。
6.根据权利要求5所述的转基因植物，其还被限定为单子叶植物。
7.根据权利要求5所述的转基因植物，其还限定为双子叶植物。
8.根据权利要求5所述的转基因植物的任意代次的后代，其中所述后代包含GPT转基因和所述GS转基因。
9.根据权利要求5所述的转基因植物的任意代次的种子，其中所述种子含有GPT转基因和所述GS转基因。
10.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的生长速率。
11.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的生物量产量。
12.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的种子产量。
13.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的花朵或花蕾产量。
14.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的果实或荚果产量。
15.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出更大的叶子。
16.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的GPT活性。
17.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的GS活性。
18.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的2-氧戊二酸酰胺水平。
19.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的氮利用效率。
20.根据权利要求5所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出对盐或盐水条件提高的耐受性。
21.一种产生相对于类似野生型植物或未转化的植物具有增强的生长特性的植物的方法，包括：
(a)将GPT转基因引入所述植物内；
(b)将GS转基因引入所述植物或所述植物的后代内；
(c)在所述植物或所述植物的后代内表达所述GPT转基因和所述GS转基因；以及
(d)选择这样的植物，该植物相对于不含GPT转基因或GS转基因的相同品种的植物具有增强的生长特性。
22.一种产生相对于类似野生型植物或未转化的植物具有增强的生长性能的植物的方法，包括：
(a)将GS转基因引入所述植物内；
(b)将GPT转基因引入所述植物或所述植物的后代内；
(c)在所述植物或所述植物的后代内表达所述GS转基因和所述GPT转基因；以及
(d)选择这样的植物，该植物相对于不含GS转基因或GPT转基因的相同品种的植物具有增强的生长特性。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述增强的生长特性选自由以下方面组成的组：提高的生物量、较高开花、较早发芽、增加的植物高度、增加的开花量、增加的发芽率、较大的叶子、增加的果实或荚果产量、以及增加的种子产量。
24.一种产生相对于类似野生型植物或未转化的植物具有增强的氮利用效率的植物的方法，包括：
(a)将GPT转基因引入所述植物内；
(b)将GS转基因引入所述植物或所述植物的后代内；
(c)在所述植物或所述植物的后代内表达所述GPT转基因和所述GS转基因；以及
(d)选择这样的植物，该植物相对于不含GPT转基因或GS转基因的相同品种的植物具有增强的氮利用效率。
25.一种产生相对于类似野生型植物或未转化的植物具有增强的氮利用效率的植物的方法，包括：
(a)将GS转基因引入所述植物内；
(b)将GPT转基因引入所述植物或所述植物的后代内；
(c)在所述植物或所述植物的后代内表达所述GS转基因和所述GPT转基因；以及
(d)选择这样的植物，该植物相对于不含GS转基因或GPT转基因的相同品种的植物具有增强的氮利用效率。
26.一种产生相对于类似的野生型植物或未转化的植物对在盐或盐水条件下的发芽或生长具有增强的耐受性的植物种子的方法，包括：
(a)将GPT转基因引入所述植物内；
(b)将GS转基因引入所述植物或所述植物的后代内；
(c)在所述植物或所述植物的后代内表达所述GPT转基因和所述GS转基因；
(d)选择这样的植物，该植物相对于不含GPT转基因或GS转基因的相同品种的植物具有增强的生长特性，以及
(e)由所述的植物收获种子，并且选择在高盐条件下显示出增强的发芽率的种子。
27.一种产生相对于类似的野生型植物或未转化的植物对在盐或盐水条件下的发芽或生长具有增强的耐受性的植物种子的方法，包括：
(a)将GS转基因引入所述植物内；
(b)将GPT转基因引入所述植物或所述植物的后代内；
(c)在所述植物或所述植物的后代内表达所述GS转基因和所述GPT转基因；
(d)选择这样的植物，该植物相对于不含GS转基因或GPT转基因的相同品种的植物具有增强的生长特性，以及
(e)由所述的植物收获种子，并且选择在高盐条件下显示出增强的发芽率的种子。
28.根据权利要求26或27所述的方法，还包括由这样选择的种子使所述植物繁殖，并且由所述植物收获种子。
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