CN102387701A - 植物谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶基因以及携带该基因的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因植物以及产生生长增强的转基因植物的方法，所述转基因植物表现出提高的生长速率、种子和果实产率和总生物量产率。在一个实施方案中，提供了被工程化为过度表达谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)的转基因植物。

Description

植物谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶基因以及携带该基因的转基因植物

对基于联邦资助的研究或项目而进行的发明的权利的声明

本发明是在政府的支持下，根据由美国能源部授予加利福尼亚大学董事会的合同NO.W-7405-ENG-36以及美国能源部授予Los Alamos NationalSecurity，LLC的合同NO.DE-AC52-06NA25396而进行的。政府对本发明具有某些权利。

相关专利申请

本申请要求2008年8月29日提交的美国临时申请NO.61/190,581的权利要求。

发明背景

随着全世界人口的增加以及可供利用的农场不断受到破坏或以其它方式受损，对更有效和可持续性的农业体系的需求已经成为人种的首要关注点。提高农作物产率、蛋白含量和植物生长速率代表了开发能够更有效地应对所面临的挑战的农业体系的主要目标。

近年来，随着许多发育良好的农作物已经趋于瓶颈，经改善的农作物生产技术的重要性得到提高。许多农业活动都是时间敏感的，并且成本和回收取决于农作物的快速周转以及投入市场的时间。因此，植物快速生长是许多农业商业的经济重要的目标，所述农业商业涉及高价值的农作物，如谷物、蔬菜、浆果和其它水果。

基因工程在开发可持续农业技术中已经并且继续起到重要的作用，但是仍有争议。近年来，已经开发了大量的基因修饰的植物和相关技术，其中许多技术目前已经广泛应用(资料：Genetically Modified Crops in theUnited States，Pew Initiative on Food and Biotechnology，2004年8月，(pewagbiotech.org/resources/factsheets)。所采用的转基因植物品种目前非常巨大，并且继续增加，其中2006年有25000万英亩土地种植有转基因植物。

虽然转基因植物技术的认可度可能逐步增加(特别是在美国、加拿大和澳大利亚)，但是世界上的很多地区在农业中采用基因修饰的植物仍然缓慢(特别是欧洲)。因此，为了致力于可靠并且可持续性的农业的目标，强烈期望开发这样的转基因植物，其不会将毒素和/或可能有害的物质引入到植物和/或环境中。还强烈期望最大程度地降低实现诸如改善灭草剂耐抗性、害虫和疾病耐抗性以及农作物的总产率等目标的成本。因此仍然需要能够实现这些目标的转基因植物。

已经通过对各种植物调节体系的大量研究而致力于植物快速生长的目标，其中许多植物调节体系仍然未被彻底理解。特别是，使得碳代谢和氮代谢的植物调节机制尚未完全阐明。据估计这些调节机制对植物生长和发展具有实质性影响。

在光合有机体中，碳和氮的代谢必须以协调的方式进行调节，以确保植物源和能量的充分利用。目前对碳和氮机制的理解包括作为较大体系的子体系的某些步骤和代谢途径的详细情况。在光合成有机体中，碳代谢以CO₂固定开始，然后通过被称为C-3和C-4代谢的两个主要过程继续进行。在具有C-3代谢的植物中，核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)催化CO₂与二磷酸核酮糖的组合，以产生3-磷酸甘油酸酯，该3-磷酸甘油酸酯为植物利用其来合成含碳化合物的三碳化合物(C-3)。在具有C-4代谢的植物中，CO₂在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化的反应中与磷酸烯醇丙酮酸结合，以形成含有4碳(C-4)的酸。酸被转移至维管束鞘细胞，在那里酸发生脱羧反应，以释放CO₂，然后CO₂在由C-3植物所采用的相同反应中与核酮糖双磷酸酯结合。

许多研究发现各种代谢物对于植物调节氮代谢是重要的。这些化合物包括有机酸-苹果酸酯以及氨基酸-谷氨酸和谷氨酰胺。氮借助于酶-谷氨酰胺合成酶(GS)的作用由光合成有机体分泌，所述谷氨酰胺合成酶催化氨与谷氨酸的组合，以形成谷氨酰胺。GS在通过在ATP依赖反应中催化氨添加至谷氨酸上以形成谷氨酰胺，从而在植物分泌氮时起到重要作用(Miflin和Habash，2002，Journal of Experimental Botany，Vol.53，No.370，第979-987页)。GS还由于光呼吸作用与蛋白和氮输送化合物的分解而重新分泌所释放的氨。GS酶可被分为两种常规类别，一种代表细胞质形式(GS1)，并且另一种代表质体(即叶绿素)形式(GS2)。

以前的报导已经证明，GS1的表达水平增加使得GS活性和植物生长的水平增加，但是报导并不一致。例如，Fuentes等报导，CaMV S35启动子促使紫花苜蓿GS1(细胞质形式)在烟草中过度表达，从而使得叶子组织中的GS表达水平和GS活性增加，在氮贫乏条件下的生长增强，但是却对在最优氮肥条件下的生长没有效果(Fuentes等，2001，J.Exp.Botany52：1071-8)。Temple等报导，过度表达全长紫花苜蓿GS1编码序列的转基因烟草植物含有水平显著升高的GS转录体，以及组装成活性酶的GS多肽，但是却没有报导其对生长的效果(Temple等，1993，Molecular andGeneral Genetics 236：315-325)。Corruzi等已经报导了在CaMV S35启动子的控制下过度表达豌豆细胞溶质GS1转基因的转基因烟草显示出增加的GS活性、增加的细胞溶质GS蛋白和改善的生长特性(美国专利NO.6,107,547)。Unkefer等最近报导，发现在叶子组织中过度表达紫花苜蓿GS1的转基因烟草植物在其叶子部分产生增多的2-羟基-5-氧脯氨酸水平，发现与野生型烟草植物相比，这会使得生长速率显著增加，其中所述转基因烟草植物通过自体受精进行基因分离，然后筛选其增强的叶至根的GS活性，从而使得GS1转基因拷贝数增多(参见美国专利No.6,555,500、6,593,275和6,831,040)。

Unkefer等还记载了采用2-羟基-5-氧脯氨酸(也称为2-氧戊二酸酰胺)来改善植物生长(美国专利No.6,555,500、6.593,275、6,831,040)。特别是，Unkefer等公开了2-羟基-5-氧脯氨酸在叶子组织中的浓度增加(相对于根组织而言)引发一系列事件，其使得植物生长特性增强。Unkefer等记载了这样的方法，通过该方法可以使得2-羟基-5-氧脯氨酸的叶子内浓度增多，以便促使植物生长特性增强，具体而言，这是通过将2-羟基-5-氧脯氨酸的溶液直接施加到植物的叶子部分、并且在叶子组织内优先过度表达谷氨酰胺合成酶而实现的。

已经在动物肝脏和肾脏组织中确认了多种转氨酶和水解酶，已知这些酶在动物内参与2-羟基-5-氧脯氨酸的合成(Cooper和Meister，1977，CRCCritical Reviews in Biochemistry，第281-303页；Meister，1952，J.Biochem.197：304)。在植物中，2-羟基-5-氧脯氨酸的生物化学合成是已知的，但是尚未充分表征。此外，2-羟基-5-氧脯氨酸在植物内的功能及其池大小(组织浓度)是未知的。最后，本领域对于究竟在植物内可能存在何种转氨酶或水解酶并且/或者何种转氨酶或水解酶对催化2-羟基-5-氧脯氨酸的合成具有活性没有具体的指导，并且尚未报导、分离或表征这样的转氨酶。

发明概述

本发明涉及转基因植物以及产生生长增强的转基因植物的方法，所述转基因植物表现出提高的生长速率、种子和果实产率和总生物量产率。在一个实施方案中，提供了被修饰为过度表达谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)的转基因植物。通常，这些植物的生长超过其野生型相应部分约50％。

申请人已经确认酶谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)作为植物内2-羟基-5-氧脯氨酸(2-氧戊二酸酰胺)合成的催化剂。2-氧戊二酸酰胺为强有效的信号代谢物，其调节参与光合机构、碳固定和氮代谢的大量基因的功能。

通过优先增加信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的浓度(即在叶子组织内)，本发明的转基因植物能够在较短的时期内产生较高的总产率，因此可以提供在宽泛的农作物中都具有增加的生产率的农业产业。重要的是，与迄今已经记载的许多植物不同，本发明利用了编码天然植物酶的天然植物基因。本发明的转基因植物的增强的生长特性基本上是通过向植物中引入附加的GPT容量而实现的。因此，本发明的转基因植物不会表达任何毒性物质、生长激素、病毒或细菌基因产物，因此不会产生目前妨碍转基因植物在世界的某些地区应用的问题。

在一个实施方案中，本发明提供包含GPT转基因的转基因植物，其中所述GPT转基因可操作地连接植物启动子。在具体的实施方案中，所述GPT转基因编码具有选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列的多肽，并且具有GPT活性，其中所述序列为：(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及(b)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中的任一者具有至少75％一致性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，GPT转基因引入植物的基因组中。本发明的转基因植物可以为单子叶或双子叶植物。

本发明还提供本发明的转基因植物的任意代次的后代，其中所述后代包含GPT转基因；以及本发明的转基因植物的任意代次的种子，其中所述种子包含GPT转基因。与相似野生型植物或未转化的植物相比，本发明的转基因植物可以显示出一种或多种增强的生长特性，其包括(但不限于)：提高的生长速率、生物量产率、种子产率、花朵或花苞产率、果实或荚果产率、较大的叶子，并且还可以显示出提高的GPT活性水平和/或提高的2-氧戊二酸酰胺水平。在一些实施方案中，本发明的转基因植物显示出提高的氮利用效率。

本发明还提供生产本发明的转基因植物及其种子的方法，包括生产以下植物的方法，其中相对于类似野生型或未转化的植物而言，所述具有增强的生长性能、提高的氮利用效率以及对在盐或盐水条件下的发芽或生长耐受性增加。

附图简要说明

图1.氮同化作用和2-氧戊二酸酰胺生物合成：代谢途径的示意图。

图2示出过度表达GPT的转基因烟草植物与野生型烟草植物的比较结果的照片。从右侧至左侧分别为：野生型植物、紫花苜蓿GS1转基因、拟南芥GPT转基因。参见以下的实施例3。

图3示出过度表达GPT的转基因小汤姆番茄植物与野生型番茄植物的比较结果的照片。(A)野生型植物；(B)拟南芥GPT转基因。参见以下的实施例4。

图4示出野生型烟草植物(上部叶子)与GPT转基因烟草植物(底部叶子)之间的叶子尺寸的比较结果的照片。

发明详述

定义

除非另外限定，否则本文所用的所有技术术语、符号和其它科学术语都旨在具有本发明所属领域内的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或准备引用的目的，在本文中对具有通常理解的含义的术语进行了定义，并且在本文中引入这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的含义具有实质性区别。本文所描述或引用的技术和过程一般容易理解，并且通常由本领域内的技术人员采用常规的方法进行使用，例如，在以下文献中所述的广泛利用的分子克隆方法，所述文献为：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第三版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols inMolecular Biology(Ausbel等，eds.，John Wiley & Sons公司，2001；Transgenic Plants：Methods and Protocols(Leandro Pena，ed.，Humana Press，第一版，2004)；和Agrobacterium Protocols(Wan，ed.，Humana Press，第二版，2006)。除非指定，否则适当时，涉及利用市售可得的试剂盒和试剂的过程通常根据制造商限定的规程和/或参数进行。

术语“核酸”是指单股形式或双股形式的脱氧核苷酸或核糖核酸及其聚合物(“多核苷酸”)。除非具体限定，否则术语“多核苷酸”包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参引核酸类似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指定，否则特定的核算序列还隐含包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列以及所明确指定的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱和/或脱氧肌苷残基置换的序列实现简并密码子置换(Batzer等，1991，Nucleic Res.19：5081；Ohtsuka等，1985 J.Biol.Chem.260：2605-2608；和Cassol等，1992；Rossolini等，1994，MoI.Cell.Probes 8：91-98)。术语核酸可以与基因、基因编码的cDNA和mRNA交换使用。

术语“启动子”是指用于指导可操作连接的核酸的转录的核酸控制序列的阵列。如本文所用，“植物启动子”是在植物中起作用的启动子。启动子包括在转录的开始位点附近的必需的核酸，如在聚合酶II型启动子的情况下，其为TATA元件。启动子还可任选地包括远侧增强子或抑制子元件，其可以与转录的开始位点相距数千个碱基对。“组成型”启动子为在大多数环境和发育条件下激活的启动子。“诱导型”启动子为在环境或发育条件下激活的启动子。术语“可操作连接”是指核酸表达控制序列和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。这些术语用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及氨基酸类似物和以天然存在氨基酸相似的方式起作用的氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸以及之后经修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢结合的α-碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者经修饰的肽骨架。但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但是却以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。

氨基酸在本文中可以以其通常已知的三字母符号或者由IUPAC-IUB生物化学体系命名委员会推荐的单字母符号进行引用。同样，核苷酸可以以其通常接受的单字母编码进行引用。

术语“植物”包括完整的植物、植物器官(例如，叶子、干部、花、根部等)，种子和植物细胞及其后代。在本发明的方法中可以使用的植物的类别通常宽泛地包括可接受转化技术的更高级的植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)以及裸子植物。其包括各种倍性水平(包括多倍性、二倍性、单倍性和半合子)的植物。

术语“GPT多核苷酸”和“GPT核酸”可以在本文中互换使用，并且可以指编码参与催化2-氧戊二酸酰胺的合成的多肽的基因的全长或部分长多核苷酸，其包括既含有被转译(编码)、又含有未转译序列的多核苷酸以及其补体。术语“GPT编码序列”是指基因的被转录并且编码GPT蛋白的那部分。术语“目标序列”是指蛋白的引导该蛋白进入细胞的亚细胞室(如植物细胞中的叶绿体)内的氨基末端部分。GPT多核苷酸还由其在限定的条件下杂化为本文具体公开的GPT多核苷酸或由其得到的PCR产物的能力所定义。

“GPT转基因”是包含GPT多核苷酸的核酸分子，所述GPT多核苷酸对于具有该核酸分子的转基因植物或植物胚芽、器官或种子是外源的，或者对于该GPT多核苷酸的转基因植物的原种植物或植物胚芽、器官或种子是外源的。

本文提供了示例性的本发明的GPT多核苷酸，并且包括用于拟南芥、水稻、大麦、竹子、大豆、葡萄和斑马鱼GPT的GPT编码序列。

部分长度GPT多核苷酸包括编码GPT的N-末端或C-末端的切断物、成熟GPT(没有目标序列)的多核苷酸序列以及编码GPT区域的序列。示例性的编码GPT的N-末端切断物的多核苷酸包括拟南芥-30、-45和-56构造体，其中分别用于SEQ ID NO：2的全长GPT结构的头30、45和56个氨基酸的编码序列被除去。

在采用本发明的GPT多核苷酸产生转化细胞核转基因细胞时，技术人员会认识到，所插入的多核苷酸序列不必是一致的，而是只可以与其衍生的基因的序列是“基本一致的”，如下文所进一步定义的那样。术语“GPT多核苷酸”具体涵盖这种基本一致的变体。相似地，技术人员会认识到，由于密码子简并性，大量的多核苷酸会编码相同的多肽，并且所有这些多肽序列都旨在包括在术语GPT多核苷酸内。此外，该术语具体地包括与本文所公开的GPT多核苷酸序列基本上一致(按照下文所述方式确定)的那些序列，并且这些序列编码作为野生型GPT多肽的突变体或者保留GPT多肽的功能(由GPT多肽中的氨基酸的保守置换而实现)的多肽。因此，术语“GPT多核苷酸”还包括这种基本一致的变体。

术语“保守修饰的变体”既用于氨基酸序列，又用于核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸不将氨基酸序列编码至基本一致的序列的核酸。由于遗传密码的简并性，因此大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸-丙氨酸。由此，在丙氨酸由密码子规定的每个位置处，密码子可以被改变为所述的相应密码子的任意一者，而不改变所编码的多肽。这些核酸变型为“静默变型”，其为保守修饰的变型的一个具体种类。本文中的编码多肽的每一个核酸序列均还描述核酸的每一个可能的静默变型。技术人员将会认识到，核酸中的各密码子(除了通常作为蛋氨酸的唯一密码子的AUG和通常作为色氨酸的唯一密码子的TGG之外)均可以被修饰为产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各静默变型暗含在每一个所述的序列中。

关于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独置换、缺失或添加(其改变、添加或除去编码序列中的单独氨基酸或小比例的氨基酸)为“保守修饰的变体”，其中该变型使得用化学相似的氨基酸置换氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守置换表为本领域内公知的。这些保守修饰的变体还包括并且不排除本发明的多态变体、种间同源体和等位基因。

以下的8组均包含对于另一者为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺酸(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。

诸如多肽结构等大分子结构可以用各种层次的构造进行描述。对于这种构造的一般讨论，参见文献(例如)Alberts等，Molecular Biology of theCell(3rd ed.，1994)和Cantor and Schimmel，Biophysical Chemistry Part I：The Conformation of Biological Macromolecυles(1980)。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常被称为结构域。结构域为多肽中的形成多肽的紧凑单元的部分，并且其长度通常为25至约500个氨基酸。典型的结构域由较少的构造的部分构成，如β-片和α-螺旋的伸长物。“三级结构”是指多肽单体的完全三维的结构。“四级结构”是指由单独的三级单元的非共价缔合。各向异性项也被称为能量项。

术语“分离”是指这样的材料，其基本上不含或者根本不含通常在材料以其本身状态或天然状态存在时伴随的成分。然而，术语“分离”并不是指存在于电泳凝胶或其它分离介质中的成分。分离的成分不含这种分离介质，并且处于即将用于其它应用或已经用于新应用/环境的形式。“分离”的抗体为已经被确认并且与其天然环境的成分分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分为干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选的实施方案中，抗体被纯化为：(1)通过Lowry法测定，占抗体的大于95重量％，并且最优选大于99重量％，(2)通过使用旋杯序列分析仪，达到足以获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)使用考马斯蓝或优选使用银染料在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE使其达到同质性。分离抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分不会存在。然而，通常分离抗体通过至少一个分离步骤进行制备。

参照核酸的一部分使用的术语“异源”是指核酸包括两个或多个本身不以彼此相同的关系存在的子序列。例如，核酸通常以重组方式制备，从而具有两个或多个来源于被布置为形成新功能的核酸的不相关基因的序列，例如编码来自一个来源的蛋白的核酸和编码来自另一个来源的蛋白序列的核酸。相似地，异源蛋白是指蛋白包括两个或多个本身不以彼此相同的关系存在的子序列。

在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致”百分比是指这样的两个序列或子序列，它们相同或者具有特定百分比例的相同氨基酸残基或核苷酸(即在比较窗或通过使用序列比对算法测量的指定区域内进行比较并且匹配以最大化对应关系时，或者通过手工对准并且目视检测时，具有约70％的一致性、优选75％、80％、85％、90％或95％的一致性)。该定义还指测试序列的补体，该补体在测试序列基本上与参照序列一致时基本上具有序列或子序列互配能力。该定义还指测试序列的补体，该补体在测试序列基本上与参照序列一致时基本上具有序列或子序列互配能力。

在参照多肽使用序列一致性百分比时，应认识到，不同来源的残基位置的区域通常在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被置换为具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此，并不改变多肽的功能特性。在序列的区别在于保守置换时，序列一致性百分比可以往上调节，以校正置换的保守性质。

为了序列比较，通常一个序列用作测试序列被比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，如果需要的话，指定子序列坐标轴，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或者可以指定可供选用的其它参数。序列比较算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。

本文所用的“比较窗”包括对多个邻接位置中的任意一者的片段的参照，所述位置选自由20至600组成的组，通常为约50至约200、更通常为约100至约150，其中在将两个序列优化对准之后，可以将序列与具有相同数目的邻接位置的参照序列进行比较。对准比较用序列的方法是本领域内公知的。可以通过以下方法进行比较用序列的优化对准，所述方法例如为Smith & Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部同源算法；Needleman & Wunsch，1970，J.MoI.Bio。48：443的局部同源算法；Pearson& Lipman，1988，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似度检索方法；这些算法的计算机实施(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA in theWisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr。，Madison，Wl)；或者手工对准并且目视观测(参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.1995 supplement))。

适合于确定序列一致性百分比和序列相似度的算法的优选例子为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在文献Altschul等，1977，Nuc.AcidsRes.25：3389-3402和Altschul等，1990，J.MoI.Biol.215：403-410中有所描述。通常与本文所述的默认参数一起使用BLAST和BLAST 2.0，以确定本发明的核酸和蛋白质的序列一致性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。该算法包括：首先通过识别研究序列中长度为W的短字从而确认高分值序列对(HSP)，在其与数据库序列中的相同长度的字串匹配时，其匹配或者符合一些正值的阈分值T。T被称为相邻字串的分值阈(Altschul等，见下文)。这些初始的相邻击中字串用作引动检索以发现含有它们的更长的HSP的种子。将这些击中字串在两个方向上沿各序列延伸，以使得累积匹配分值尽可能增加。对于核苷酸序列而言，使用(例如)参数M(一对匹配残基的奖励分值；总是＞0)和N(残基失配的罚分；总是＜0)计算累积分值。对于氨基酸序列，采用计分矩阵计算累积分值。击中字串在各方向的延伸在以下情况时终止：累积匹配分值由其实现的最大值降低了量X；由于一个或多个负值残基匹配而使得累积分值达到0或以下；或者达到任何一个序列的末端。BLAST参数W、T和X确定匹配的灵敏度和速率。BLASTN程序默认采用的(对于核苷酸而言)字串长度(W)为11，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4并且采用两股同时比对。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序默认采用的字串长度为3，并且预期值(E)为10，以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl。Acad.ScL USA 89：10915(1989))，匹配值(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及采用两股同时比对。

BLAST算法还在两个序列之间进行统计分析(参见，例如，Karlin &Altschul，1993，Proc.Natl Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。One measure ofsimilarity provided由BLAST算法提供的一个相似度的量度为最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸和氨基酸序列随机之间随机实现匹配的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参照核酸比较时，最小和概率低于约0.2，最优选低于约0.01并且最优选低于约0.001，则认为核酸与参照序列相似。

短语“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，探针通常以核酸的复合混合物的形式与其目标子序列杂交，但是与其它核酸并不杂交。严格条件具有序列依赖性，并且在不同情况下而有不同。较长的序列特异性地在较高的温度下杂交。核酸杂交的更深指导参见文献Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic assays”(1993)。通常，高度严格的条件在限定的离子强度pH下被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。低严格性的条件通常被选择为比Tm低约15-30℃。Tm为50％的与目标物互补的探针与目标序列平衡杂交的温度(在限定的离子强度pH和核酸浓度下)，即当目标序列过量存在时，在Tm下，50％的探针被平衡占用)。严格条件为这样的条件下，其中在pH为7.0至8的情况下，盐浓度为低于约0.1M钠离子浓度，通常为约0.01至1M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于较短的探针(例如，10至50个核苷酸)而言为至少约30℃，并且对于较长的探针(例如，大于50个核苷酸)而言为约60℃。还可以添加诸如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。为了选择性或特异性杂交，阳性信号为背景杂交信号的至少2倍，优选为背景杂交信号的10倍。

如果核酸编码的多核苷酸为基本上一致的，则在严格条件下不彼此杂交的核酸仍然是基本上一致的。(例如)当使用由遗传密码许可的最大密码子简并性来产生核酸拷贝时会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格的条件下进行杂交。

可以采用本文公开的GPT多核苷酸序列通过标准的Southern印迹方法在严格条件下确认含有GPT多核苷酸的基因组DNA或cDNA。为了实现该目的，用于上述杂交的合适的严格条件为以下的条件或等价条件，所述条件包括在37℃的40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中进行杂交，并且在至少约50℃、通常约55℃至约60℃下进行一次洗涤，洗涤时间为20分钟。阳性杂交信号为背景信号的至少2倍。普通的技术人员会容易理解，可以采用其它可供选用的杂交和洗涤条件来提供相似严格度的条件。

两个多核苷酸基本上一致的其它指标是通过一对寡核苷酸引物将参照序列扩增，然后可以将其在严格条件下用作探针，以从cDNA或基因组图谱中分离出测试序列，或者以(例如)northern或Southern印迹法识别测试序列。

转基因植物：

本发明提供表现出基本上增强的农学特性的转基因植物，所述农学特性包括较快的生长、较高的成熟植物鲜重和总生物量、以及更充分的开花和更多的果实和种子产率。本发明的转基因植物通过向植物中引入一个或多个可表达的基因构造体而产生，所述基因构造体能够驱使编码谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)的一个或多个多核苷酸的表达。本发明的例子包括产生携带并且表达异源GPT基因的转基因烟草植物(下文的实施例2)。预期所有的植物也含有在相同的代谢途径(即信号代谢物2-羟基-5-氧脯氨酸的生物合成)中起作用的GPT类似物。因此，在实施本发明时，编码GPT类似物或其功能变体的任何植物基因均可以用于产生本发明的转基因植物。

在本发明的稳定转化实施方案中，可表达的基因构造体的一个或多个拷贝被整合到主体植物基因组中，从而为植物提供增强的GPT酶能力，其用于介导2-氧戊二酸酰胺的增强合成，2-氧戊二酸酰胺进而传导代谢基因表达的信号，从而产生增强的植物生长和增强的其它农学特性。2-氧戊二酸酰胺为用作基因表达、代谢和植物生长的非常有效的效应物的代谢物(美国专利6,555,500)，并且在协调碳代谢和氮代谢体系时起到重要的作用(Lancien等，2000，Enzyme Redundancy and the Importance2-Oxoglutarate in Higher plants Ammonium assimilation，Plant Physiol.123：817-824)。还参见图1所示的2-氧戊二酸酰胺途径的示意图。

在本发明的一个方面中，申请人已经分离了编码拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)酶(参见以下的实施例)的核酸分子，并且首次证明了经表达的重组酶是活性，并且能够催化信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的合成(下文的实施例2)。此外，申请人首次证明了拟南芥谷氨酰胺转氨酶基因在异源植物中的过度表达产生提高的CO₂固定速率和增强的生长特性(下文的实施例3)。

如本文所公开(参见下文的实施例3)，包含全长拟南芥GPT编码序列的转基因在转基因烟草植物中的过度表达还产生更快的CO₂固定速率，以及增多的总蛋白、谷氨酰胺和2-氧戊二酸酰胺的水平。这些转基因植物比野生型植物还生长更快(图2)。相似地，在用番茄植物进行的预研究中(参见下文的实施例4)，用拟南芥GPT转基因转化的番茄植物与野生型对照植物相比，显示出显著提高的生长速率，开花率和种子产率(图3和下文的实施例4)。

除了上述的转基因烟草植物，还在番茄、胡椒、大豆、豇豆、紫花苜蓿、香瓜、南瓜、拟南芥和Camilena的两个种系中产生了各种其它种系的转基因植物，其包含GPT并且显示出增强的生长特性(参见2009年8月31日提交的共有的、共同待审的案卷NO.S-112,983，其全文以引用方式并入本文)。通过使用各种GPT转基因采用各种转化方法并且借助于单独转基因植物的有性杂交产生上述的转基因植物，所述方法包括农杆菌介导的愈伤组织转化、蘸花转化、豆荚接种和直接花朵接种以及它们的组合。

本发明还提供产生具有增强的生长特性和其它农学特性的转基因植物的方法。在一个实施方案中，产生具有增强的生长特性和其它农学特性的转基因植物的方法包括：在能够驱使转基因表达的合适启动子的控制下，将包含编码GPT转基因的核酸分子的表达盒引入到植物细胞中，从而产生转化的植物细胞，并且获得表达经编码的GPT的转基因植物。在另一个实施方案中，产生具有增强的生长特性和其它农学特性的转基因植物的方法包括：在能够驱使转基因表达的一个或多个合适启动子(可任选的其它调节元件)的控制下，将包含编码GPT转基因的核酸分子的一个或多个核酸构造体或表达盒引入到植物细胞中，从而产生由此转化的植物细胞，并且获得表达GPR转基因的转基因植物。

可以采用任意数量的GPT多核苷酸来产生本发明的转基因植物。GPT蛋白在各种不同的植物品种之间是高度保守的，并且由本文公开的试验数据可以看出，紧密相关的非植物GPT(例如，斑马鱼GPT)也可以使用。关于GPT，来自不同品种的多种GPT多核苷酸已经显示出具有活性，并且可用作GPT转基因。

在具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自拟南芥的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：30所示的GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：1具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；SEQ ID NO：2所示的编码多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；以及编码在SEQ ID NO：2中的氨基末端切下30至56个氨基酸的多肽的核苷酸序列或者编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在另一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自葡萄的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：31所示的葡萄GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；与SEQID NO：8具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：31所示的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在又一个具体的实施方案中GPT转基因是编码得自水稻的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：32所示的水稻GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；与SEQID NO：10具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：32所示的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自大豆的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33或在序列的N末端具有另外的异亮氨酸的SEQ ID NO：33的大豆GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：12具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33或在序列的N末端具有另外的异亮氨酸的SEQ ID NO：33的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自大麦的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：34的大麦GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；与SEQ IDNO：10具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：34的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自斑马鱼的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：35的斑马鱼GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO：16具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且编码具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：35的多肽的核苷酸序列或编码与其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在又一个具体的实施方案中，GPT转基因是编码得自竹子的GPT的GPT多核苷酸，如SEQ ID NO：36的竹子GPT。GPT转基因可以由以下的序列编码：SEQ ID NO：36的核苷酸序列；或编码其具有至少75％一致性、优选至少80％一致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。

在本发明的实施中，其它适合用作GPT转基因的GPT多核苷酸可以由本领域内的技术人员所认识的各种手段获得，并且测试其在重组表达载体体系(即大肠杆菌(参见实施例20-23)中、在瞬间的植物表达体系(参见实施例19)中或在转基因植物(参见实施例1-18)中指导GPT的表达以及GPT活性的能力。

转基因构造体/表达载体

为了产生本发明的转基因植物，必须将用于所需转基因的基因编码序列引入到核酸构造体(在本文中其还可互换地称为(转基因)表达载体、表达盒、表达构造体或表达可表达基因构造体)中，所述构造体能够在转化的植物细胞中指导转基因序列的表达。可以使用多种本领域内已知的方法(其包括但是不限于电穿孔法、DNA枪轰击法或粒子传递法、微注射法)并且借助于各种基于DNA的载体(如根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌)将携带所关注转基因的这种核酸构造体引入到植物细胞内。一旦将核酸构造体引入到转化的植物细胞内，其可以采用瞬间或稳定方式指导所引入的转基因(即GPT)的表达。稳定表达是优选的，并且可以利用能够指导转基因构造体的染色体整合的植物转化载体来实现。一旦植物细胞成功转化，可以将其培育，以使转基因植物再生。

多种适合于在转化植物内驱使所插入基因的组成型或诱导型表达的表达载体是已知的。此外，各种瞬间表达载体和体系是已知的。在很大程度上，选择合适的表达载体用于基因转化的特定方法中(参见下文)。宽泛地说，用于产生转基因植物的典型植物表达载体包括在启动子的表达调节控制下的所关注基因、用于辅助转化株的选择的选择性标记物和转录终止子序列。

更具体而言，用于产生本发明的转基因植物的核酸构造体的基本元件为：能够在转化植物细胞内知道转基因的功能表达的合适启动子；与启动子可操作地连接的转基因(即GPT编码序列)；与转基因可操作地连接的优选的合适转录终止序列(即胭脂碱合成酶基因终止子)和通常用于控制转基因的表达的其它元件，以及一个或多个适合于选择所需转基因产物的选择性标记物基因(即耐抗生素基因)。

由于根癌土壤杆菌为用于产生转基因植物的主要转化体系，因此存在设计用于土壤杆菌转化的各种载体。为了稳定转化，土壤杆菌体系利用“二元”载体，该载体允许质粒在大肠杆菌和土壤杆菌均能操作，并且通常包含一个或多个选择性标记物，以回收转化的植物(Hellens等，2000，Technical focus：A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends Plant Sci5：446-451)。用于土壤杆菌转化体系中的二元载体通常包含T-DNA的边区、多个克隆位点、用于大肠杆菌和根癌土壤杆菌的复制功能区和选择性标记物以及报道基因。

所谓的“超二元”载体提供更高的转化效率，并且通常包含来自Ti的附加致病基因(Komari等，2006，Methods MoI.Biol.343：15-41)。超二元载体通常用于表现出较低的转化效率的植物，如谷物。这种附加的致病基因包括而不限于virB、virE和virG(Vain等，2004，The effect of additionalvirulence genes on transformation efficiency，transgene integration andexpression in rice plants using the pGreen/pSoup dual binary vector system.Transgenic Res.13：593-603；Srivatanakul等，2000，Additional virulencegenes influence transgen expression：transgen copy number，integration patternand expression，J.Plant Physiol.157，685-690；Park等，2000，Shorter T-DNAor additional virulence genes improve Agrobacteriυm-mediated transformation.Theor.Appl.Genet.101，1015-1020；Jin等，1987，Genes responsible for thesupervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281.J.Bacteriol.169：4417-4425)。

在本文示例的实施方案中(参见下文的实施例)，采用其中将插入的转基因置于组成型CaMV 35S启动子的控制下的表达载体。多种利用CaMV 35S启动子的表达载体是已知的并且/或者是市售可得的。

植物启动子

术语“启动子”用于指示基因转录开始位点(TSS)上游的基因组序列内的区域，但是TSS下游的序列还可以影响转录启动。启动子元件选择转录启动点、转录特异性和速率。根据距TSS的距离，还可以采用“近端启动子“(TSS周围的数百个核苷酸)和“远端启动子”(TSS上游的数千和更多的核苷酸)这样的术语。近端启动子和远端启动子均包括参与细胞阶段、组织阶段、器官阶段、发育阶段的复杂过程和转录的环境因素调节的各种元件的组合。大多数调节TSS选择的启动子位于近端启动子。

在植物中起作用的多种启动子是本领域内已知的。在构造GPT转基因构造体时，选择的启动子可以为组成型的、非特异性的启动子，如花椰菜花叶病毒35S核糖体启动子(CaMV 35S启动子)，其广泛用于转基因在植物内的表达。其它的强效组成型启动子包括而不限于：水稻肌动蛋白1启动子、CaMV 19S启动子、Ti质粒胭脂碱合成酶启动子、醇脱氢酶启动子和蔗糖合成酶启动子。

或者，在一些实施方案中，可能有利的是，基于以下因素选择启动子，所述因素为：旨在由转基因构造体转化的所需植物细胞、转基因的所需表达水平、用于转基因表达的所需组织或亚细胞区室、所针对的发育阶段等。

例如，当需要在光合组织和区室中进行表达时，可以采用核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)基因启动子。当需要在种子内进行表达时，可以采用种子存储蛋白基因启动子。当需要在果实内表达时，可以采用果实特异性启动子，如番茄2A11。其它组织特异性启动子的例子包括编码以下物质的启动子：植物血凝素(Vodkin等，1983，Cell 34：1023-31；Lindstrom等，1990，Developmental Genetics 11：160-167)，玉米醇脱氢酶1(Vogel等，1989，J.Cell.Biochem.(Supp1.0)13：Part D；Dennis等，1984，Nucl.AcidsRes.，12(9：3983-4000)，玉米光捕集复合物(Simpson，1986，Science，233：34-38；Bansal等，1992，Proc.Natl Acad.Sci.USA，89：3654-3658)，玉米热冲击蛋白(Odell等，1985，Nature，313：810-812；Rochester等，1986，EMBO J.，5：451-458)，豌豆小子单元RuBP羧化酶(Poulsen等，1986，MoI.Gen.Genet，205(2：193-200；Cashmore等，1983，Gen.Eng，Plants，Plenum Press，New York，pp 29-38)；Ti质粒甘露碱合成酶和Ti质粒胭脂碱合成酶(Langridge等，1989，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，86：3219-3223)，矮牵牛花查耳酮异构化酶(Van Tunen等，1988，EMBO J.7(5：1257-1263)，大豆甘氨酸富集酶1(Keller等，1989，EMBO J.8(5：1309-1314)，切断的CaMV 35(Odell等，1985，上文)，番茄储藏蛋白(Wenzler等，1989，Plant MoI.Biol.12：41-50)，根细胞(Conkling等，1990，Palnt Physiol.93：1203-1211)，玉米蛋白(Reina等，1990，Nucl.AcidsRes.18(21：6426；Kriz等，1987，MoI.Gen.Genet.207(1)：90-98；Wandeltand Feix，1989，Nuc.Acids Res.17(6：2354；Langridge和Feix，1983，Cell 34：1015-1022；Reina等，1990，Nucl.Acids Res.18(21：6426)，球蛋白-1(Belanger and Kriz，1991，Genetics 129：863-872)，α-微管蛋白(Carpenter等，1992，Plant Cell 4(5：557-571；Uribe等，1998，Plant MoI.Biol.37(6：1069-1078)，cab启动子(Sullivan等，1989，MoI.Gen.Genet.215(3)：431-440)，PEPCase(Hudspeth和Grula，1989，Plant MoI.Biol.12：579-589)，R基因复合物(Chandler等，1989，The Plant Cell 1：1175-1183)，查耳酮合成酶(Franken等，1991，EMBO J.10(9)：2605-2612)和谷氨酰胺合成酶启动子(美国专利NO.5,391,725；Edwards等，1990，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 87：3459-3463；Brears等，1991，Plant J.1(2：235-244)。

除了组成型启动子以外，在转基因植物再生、成熟、开花等时需要调节转基因表达的情况下还可以采用各种诱导型启动子序列。诱导型启动子的例子包括：热冲击基因、保护反应基因(即苯基丙氨酸解氨酶；参见，例如，Bevan等，1989，EMBO J.8(7：899-906)、创伤反应基因(即细胞壁蛋白基因)、化学诱导基因(即硝酸盐还原酶，几丁质酶)和黑暗诱导基因(即天冬酰胺酸合成酶；例如，参见美国专利NO.5,256,558)的启动子。此外，多种植物核基因由光激活，其包括编码主叶绿素a/b结合蛋白(cab)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶rbcS)的小子单元的基因家族(例如，参见Tobin和Silverthome，1985，Annu，Rev.Plant Physiol.36：569-593；Dean等，1989，Annu.Rev.Plant Physiol.40：415-439)。

其它诱导型启动子包括ABA诱导启动子和细胞组织膨胀诱导启动子，生长素结合蛋白启动子(Schwob等，1993，Plant J.4(3)：423-432)，UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston等，1988，Genetics 119(1：185-197)；MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等，1994，Plant J.6(2：141-150)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子基因启动子(Kohler等，1995，PlantMoI.Biol.29(6：1293-1298；Quigley等，1989，J.MoI.Evol，29(5：412-421；Martinez等，1989，J.MoI.Biol.208(4)：551-565)和得自豌豆的光诱导质体谷氨酰胺合成酶基因(美国No.5,391,725；Edwards等，1990，上文)。

关于在植物转基因技术中使用的植物启动子的综述，参见文献Potenza等，2004，In Vitro Cell.Devel.Biol-Plant，40(1)：1-22。关于合成植物启动子工程的综述，参见(例如)文献Venter，M.，2007，Trends Plant ScL，12(3：118-124)。

谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)转基因

本发明首次公开了植物含有在信号代谢物2-羟基-5-氧脯氨酸的合成中直接起作用的谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)。迄今为止，尚未记载具有限定功能的植物转氨酶。申请人已经分离并且测试了得自几种植物和动物品种的GPT多核苷酸编码序列，并且成功地将基因引入到异源转基因主体植物中，所述转基因植物表现出显著增强的生长特性，包括较快的生长、较高的叶子蛋白含量和较快的CO₂固定速率。

预期所有植物品种均含有在相同的代谢途径起作用的GPT，从而参与信号代谢物2-羟基-5氧脯氨酸的生物合成。因此，在本发明的实施中，编码GPT类似于或其功能变体的任何植物基因均可以用于产生本发明的转基因植物。此外，考虑到各种植物GPT基因蛋白结构和来自斑马鱼的突变(并且生物活性)的GPT类似物之间(参见实施例22)的相似性，因此可以在制备用于产生本发明的转基因植物时采用其它的非植物GPT类似物。当与SEQ ID NO：30提供的拟南芥成熟蛋白序列进行单独比较(通过BLAST匹配)时，针对以下的成熟GPT蛋白获得下述的序列一致性和同系性(BLAST“阳性率”，包括类似氨基酸)：

通过强调大多数植物品种之前的GPT蛋白的结构的保守性质，在上述植物品种中观察到的保守性扩大至来自于斑马鱼和衣滴虫的非人类突变GPT。在斑马鱼的情况下，一致程度极高(与SEQ ID NO：30的成熟拟南芥GPT具有83％的氨基酸序列一致性，并且考虑了相似的氨基酸序列具有92％的同系性)。斑马鱼成熟GPT通过在大肠杆菌中进行表达并且证明其生物活性(2-氧戊二酸酰胺的合成)而进行了确认。

为了确认突变GPT类似物是否适合于产生本发明的生长增强的转基因植物，需要最初在大肠杆菌或其它合适的主体中表达其编码序列，并且确定2-氧戊二酸酰胺信号代谢物是否以升高的水平合成(参见实施例19-23)。在证明上述的增加时，然后可以将编码序列同时引入同种的植物主体以及异源的植物主体内，并且评价生长特性。能够特异性地检测2-氧戊二酸酰胺的任何分析方法均可以用于该目的，包括而不限于在下文的实施例2中所述的NMR和HPLC分析方法。此外，可以采用直接测量GPT活性的分析方法。

可以将具有2-氧戊二酸酰胺合成活性的任意植物GPT用于转化植物细胞，以产生本发明的转基因植物。在植物品种中出现高水平的结构同系性，其似乎超出了植物的范围，如各种植物GPT蛋白和突变斑马鱼GPT类似物之间的密切同系性所证明的那样。因此，可以采用各种植物GPT基因在多种医异源的植物品种中产生生长增强的植物。此外，在同种植物中表达的GPT转基因预期也会产生期望的生长增强特性(即水稻谷氨酰胺转氨酶在转基因水稻植物中过度表达)，但是在一致细胞中的调节也可能以在异源细胞中不可操作的某种方式减弱表达。

转录终止子：

在优选的实施方案中，将3’转录终止序列引入到转基因的下游，以引导转录的终止并且允许mRNA转录的正确多腺苷酸化。合适的转录终止子为已知在植物中起作用的那些，其包括而不限于：根癌土壤杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)基因、得自章鱼碱合成酶基因的T7转录、得自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II的3’末端、CaMV 35S终止子、tml终止子和豌豆rbcS E9终止子。此外，可以采用基因本身的转录终止子。在具体的实施方案中，由下文的实施例所述，采用了胭脂碱合成酶转录终止子。

选择性标记物：

通常在转基因表达载体中包括选择性标记物，以提供选转化株的手段。虽然可以利用各种类型的标记物，但是通常采用各种负选择标记物，包括赋予选择剂(其抑制或杀灭未转化的细胞)抗性的那些，如赋予抗生素(如卡那霉素、庆大霉素、anamycin、潮霉素和潮霉素B)抗性的基因，或赋予除草剂(如磺脲、草丁膦、草胺磷和草甘膦)抗性的基因。可筛选的标记物包括：(例如)编码β-葡萄糖苷酸酶的基因(Jefferson，1987，PlantMoI.Biol.Rep 5：387-405)、编码荧光素酶的基因(Ow等，1986，Science 234：856-859)和编码参与产生或控制花青素颜料的蛋白的各种基因(例如，参见美国专利6,573,432)。大肠杆菌葡萄糖苷酸酶(gus、gusA或uidA)已经在植物转化中称为广泛使用的选择标记物，这主要是因为葡萄糖苷酸酶的稳定性、高灵敏度和容易检测(例如，荧光测定法、分光光度法、各种组织化学法)。此外，在大多数高等植物品种中，基本上没有可检测的葡萄糖苷酸酶。

转化方法和体系：

各种用于将本发明的转基因表达载体构造体引入到植物或植物细胞内的方法对本领域的技术人员而言是熟知的，并且可以利用能够转化目标植物或植物细胞的任何方法。

农杆菌介导的转化法可能是在植物转基因技术中利用最普遍的方法，并且用于多种植物的农杆菌介导的转化的规程在以下文献中具有详尽描述(例如，参见Agrobacterium Protocols，Wan，ed.，Humana Press，2nd edition，2006)。根癌农杆菌为革兰阴性土壤细菌，其通过在植物细胞内插入肿瘤诱导DNA(“T-DNA”、“转移DNA”)的小片段而在大量的双子叶植物品种中导致肿瘤(冠瘿病)，该细菌在半随机位置被并入到植物基因组内，并且最终可能变得稳定地并入其中。直接重复地DNA序列(称为界区)限定T-DNA的左端和右端。T-DNA可以与Ti-质粒的其余部分物理分离，从而产生“二元”载体。

农杆菌转化可以用于稳定地转化双子叶植物、单子叶植物及其细胞(Rogers等，1986，Methods Enzymol.，118：627-641；Hemalsteen等，1984，EMBO J.，3：3039-3041；Hoykass-Van Slogteren等，1984，Nature，311：763-764；Grimsley等，1987，Nature 325：167-1679；Boulton等，1989，Plant MoI.Biol.12：31-40；Gould等，1991，Plant Physiol.95：426-434)。各种用于将细胞DNA引入到农杆菌内的方法是已知的，包括电穿孔法、冷冻/融解法和三亲本杂交。将异源DNA置于农杆菌内的最有效的方法是借助于电穿孔法(Wise等，2006，Three Methods for the Introduction ofForeign DNA into Agrobacterium，Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1；Ed.，Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.43-53)。此外，考虑到大量的T-DNA没有整合，农杆菌介导的转化法可以用于通过未引入的转基因构造体分子的转录互补而实现转基因的瞬间表达(Helens等，2005，Plant Methods 1：13)。

大量的农杆菌转化载体和方法已经有所描述(Karimi等，2002，TrendsPlant Sci.7(5：193-5)，并且许多这种载体可以是市售可得的(例如，Invitrogen公司)。此外，大量的“开源”农杆菌转化载体是可得到的(例如，pCambia载体；Cambia，Canberra，Australia)。还参见下文的转基因构造体上的小部分。在实施例进一步描述的具体实施方案中，基于pMON316的载体被用于Horsch等人的叶盘转化体系中(Horsch等，1995，Science 227：1229-1231)，以产生生长增强的烟草植物和番茄植物。

可用于产生本发明的转基因植物的其它常用的方法包括而不限于微弹轰击法或粒子专递转化；通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔而进行的裸DNA的原生质转化法(Paszkowski等，1984，EMBO J.3：2727-2722；Potrykus等，1985，MoI.Gen.Genet.199：169-177；Fromm等，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828；Shimamoto等，1989，Nature，338：274-276)。

粒子传递转化法包括采用粒子传递装置(或“基因枪”)将数百万的包被DNA的金属颗粒注射到靶细胞或组织内，其中的数种装置是市售可得的；一旦进入细胞内部，DNA从颗粒上脱离，并且其一部分稳定地并入一个或多个细胞染色体内(关于其综述，参见Kikkert等，2005，StableTransformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics，in：Methodsin Molecular Biology，vol.286：Transgenic Plant：Methods and Protocols，Ed.L.Pena，Humana Press Inc.，Totowa，NJ)。

电穿孔是利用短的高强度电场可逆地渗入细胞膜的脂质双层内的技术(例如，参见Fisk和Dandekar，2005，Introduction and Expression ofTtransgenes in Plant Protoplasts，in：Methods in Molecular Biology，vol.286：Transgenic Plant：Methods and Protocols，Ed.L.Pena，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.79-90；Fromm等，1987，Electroporation of DNA and RNAinto Plant protoplasts，in Methods in Enzymology，Vol.153，Wu和Grossman，eds.，Academic Press，London，UK1 pp.351-366；Joersbo和Brunstedt，1991，Electroporation：mechanism and transient expression，stabletransformation and biological effects in Plant protoplasts.Physiol.Plant.81，256-264；Bates，1994，Genetic transformation of Plants by protoplastelβctroporation.MoI.Biotech.2：135-14；Dillen等，1998，Electroporation-mediated DNA transfer to Plant protoplasts and intact Planttissues for transient gene expression assays，in Cell Biology，Vol.4，ed.，CeNs，Academic Press，London，UK，pp.92-99)。这种技术通过在细菌膜上产生水性孔而操作，所述孔具有足够大的尺寸，以允许DNA分子(和其它大分子)进入细胞内，其中转基因表达构造体(T-DNA的形式)可以稳定地并入植物基因组DNA内，从而产生转化细胞，该细胞随后能够再生为转基因植物。

更新的转化方法包括所谓的“花序浸渍”法，其提供简便的潜能，而不需要在其它所有通常使用的转化方法情况采用的植物组织培养物(Bent等，2006，Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method，MethodsMoI Biol，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1；Ed.，Wang，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.87-103；Clough and Bent，1998，Floraldip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana，Plant J.16：735-743)。然而，除了拟南芥之外，这些方法尚未在宽泛的不同植物品种之间广泛使用。简而言之，花序浸渍法涉及用适当的根癌土壤杆菌菌株浸渍或喷洒开花植物。然后使由这些T0植物收集的种子在选择性条件下发育，以确认转基因的T1个体。实施例16证明了拟南芥的花序浸渍接种能够产生转基因的拟南芥植物。

其它的转化的方法包括其中采用诸如土壤杆菌载体等载体对发育的种子或植物的秧苗进行转化的方法。例如，可以通过将载体的悬浮液或载体混合物(即土壤杆菌)直接注射到发育的荚果的种子空穴内，从而采用这种载体来转化发育的种子(Wang和Waterhouse，1997，Plant MoI.Biol.Reporter 15：209-215)。可以按照文献Yasseem，2009，Plant MoI.Biol.Reporter 27：20-28所述的方法转化秧苗。可以按照文献Chee等，1989，PlantPysiol.91：1212-1218所述的方法转化发育的种子。还可以采用果实内方法，其中载体被注射到果实或发育的果实内。其它的转化方法包括其中针对花结构进行载体接种的那些方法，如花接种方法。

上述的植物转化方法可以用于将转基因引入到大量的不同植物细胞和组织内，所述植物细胞和组织包括而不限于：完整的植物、组织和器官外植体(包括叶绿体、开花组织和细胞)、原生质体、分裂组织细胞、愈伤组织、未成熟的胚芽和配子细胞(如花粉粒，花粉、精子和卵细胞)、上述物质的任何组织培养细胞、可以由其生成可繁殖的再生植物的任意其它细胞。愈伤组织起源于以下的组织来源，其包括(但是不限于)：未成熟的胚芽、秧苗顶端分生组织、花粉粒等。能够增生为愈伤组织的细胞还能够容纳用于基因转化的细胞。

由转化的植物细胞、组织或器官再生单独的植物的方法是已知的，并且针对大量植物品种进行了描述。

作为一个例子，将转化的植物幼苗(得自转化的细胞或组织)在补充有在转化方案中所用的选择性试剂(即诸如卡那霉素等抗生素)的允许根生长的介质中培养。一旦生根，就将转化的植物幼苗转移至土壤中，并且允许其生长至成熟。在开花后，优选使成熟的植物自体受精(自受精)，并且收获所得的种子，并且将其用于生长出后代。实施例3-6描述了转基因烟草和番茄植物的再生。

通过一代或二代转化株的自体受精或者通过使一代或二代转化株与其它植物(转化或未转化的植物)进行有性杂交，T₀转基因植物可以用于生成后代(例如，T₁、T₂等)。

生长增强的转基因植物选择：

可以采用标准方法对转基因植物进行选择、筛选并且表征。本发明的优选的转基因植物表现出一种或多种表型特征，其表示增强的生长和/或其它有利的农学性能。通常在选择性压力下江转基因植物再生，以在产生转基因植物的后代之前选择转化株。此外，所用的选择压力可以超过T₀代，以便确保存在所需的转基因表达构造体或盒。

可以通过选择或筛选在用于转化的转基因表达构造体中所含的标记基因的基因组成和/或编码的表型特征，从而识别T₀转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过使潜在转化的植物、组织或细胞在含有抑制量的抗生素或除草剂(可以赋予转化基因构造体对其的抗性)生长介质中生长，从而进行选择。此外，可以通过筛选可能存在于转基因表达构造体中的标记基因(如β-葡萄糖苷酸酶)的活性来确认转化的植物细胞、组织和植物。

如所熟知的那样，可以采用各种物理和生物化学方法来识别含有所需基因表达构造体的植物。这些方法的例子包括：用于识别转基因、转基因表达构造体或其元件的Southern印迹分析或各种核酸扩增方法(即PCR)；用于检测并且确定RNA转录产物的Northern印迹、S1核糖核酸酶保护、逆转录酶PCR(RT-PCR)扩增方法；以及用于识别由转基因编码并且表达的蛋白的蛋白凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀、酶联免疫分析等。

在另一种方法中，可以采用基因、蛋白和/或代谢化合物的表达水平(其已知由在目标植物中的转基因表达而调节)来识别转化株。在本发明的一个实施方案中，可以采用信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的水平增加来筛选所需的转化株。

最终，可筛选出本发明的转化植物的增强的生长特性和/或其它有利的农学特性。实际上，为了确认具有具有最快生长速率、最高种子产率等的转化谱系，某些程度的表型筛选通常是有利的，当识别用于随后的自体受精、杂交育种和回交育种的植物时尤其是如此。可以采用各种参数来实现该目的，其包括而不限于：生长速率、总鲜重、干重、种子和果实产率(数量、重量)、种子和/或种子荚产率、种子荚产率(例如数量、重量)、叶子大小、植物大小、增多的开花、开花的时间、总蛋白含量(在种子、果实、植物组织内)、具体的蛋白含量(即GS)、氮含量、游离氨基酸和具体的代谢化合物水平(即2-氧戊二酸酰胺)。通常，将这些表型测量结果与由亲本的相同或类似植物谱系、未转化的相同或类似植物或者相同或类似的野生型植物(即正常或亲本植物)所获得的结果进行比较。优选的是，至少首先是，按照与测量正常或亲本植物中的所选表型特征一致的方式对目标转基因植物中的相同特征进行测量。通常，针对任何特定的表型特征，采用多个植物来确立转基因植物的表型有利性和/或优越性。

优选的是，选择最初的转化株，然后用其通过自体受精(自受精)生成T1代和随后的代，直至转基因表型纯一传代为止(即植物对于转基因而言是纯合的)。这通过以下方法实现：将其自体受精3或4代，在每一代筛选所需的特征，并且将这些个体进行自体受精。

可以将稳定的转基因谱系进行杂交育种和回交育种，以产生具有任何数量的所需特征的品种，包括具有叠加的转基因、转基因的多个拷贝等的那些品种。此外，可以通过用其它的转基因或亲本转基因的附加拷贝对稳定的转基因植物进一步进行基因修饰。本发明还涵盖由单个转化事件产生的转基因植物，所述转化事件包括引入给定转基因的多个拷贝或多种转基因。各种常规的繁育方法对于本领域内的技术人员而言是熟知的(例如，参见Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，AmericanSociety of Agronomy，Madison Wis.(1987))。

实施例

对本发明的各个方面进一步进行描述，并且通过以下的多个实施例进行阐释，这些实施例均无意义限制本发明的范围。

实施例1：拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶(GPT)基因的分离：

为了将直接参与信号代谢物2-氧戊二酸酰胺的合成的植物酶定位，申请人假定突变植物酶可以与已经表征为参与2-氧戊二酸酰胺的合成的人蛋白具有一定程度的结构相关性。人蛋白谷氨酰胺转氨酶K(E.C.2.6.1.64)(在文献中也称为半胱氨酸结合物β-裂解酶、犬尿氨酸转氨酶、谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶以及其它名称)已经显示出参与卤化异源物质的半胱氨酸结合物的处理(Perry等，1995，FEBS Letters 360：277-280)。虽然不具有参与氮代谢的活性，但是人半胱氨酸半胱氨酸结合物β-裂解酶在人体和动物内具有脱毒活性(参考)。然而，该蛋白对于2-氧戊二酸酰胺的合成的潜在参与性受到了关注。

通过采用人半胱氨酸结合物β-裂解酶的蛋白序列，经过对TIGR拟南芥植物蛋白序列数据库的检索确认了一种潜在相关的序列(即由在At1q77670的拟南芥基因位点的部分序列编码的多肽)，它们在匹配的区域之间具有约36％的序列同系性/一致性。

随后采用以下的引物对将该基因的全编码区域由拟南芥cDNA库(Stratagene)进行扩增：

5’-CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3’

5’-GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3’。

这些引物被设计为并入CIa I(ATCGAT)和Kpn I(GGTACC)限制性位点，以有利于随后将其亚克隆至用于产生转基因植物的表达载体内。在以下条件下将Takara ExTaq DNA聚合酶用于高保真PCR：开始在94℃下变性4分钟；进行94℃、30秒的30个循环，在55℃下退火30秒；在72℃下延伸90秒；最后在72℃下延伸7分钟。扩增产物用CIa I和Kpn I限制酶消化，由琼脂糖凝胶电泳分离，并且将其连接入载体pMon316内(Rogers等，1987 Methods in Enzymology 153：253-277)，所述载体含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S组成型启动子和胭脂碱合成酶(NOS)3’终止子。将连接物转化入DH5α细胞内，并且对转化株进行测序，以核实插入物。

分离出1.3kb的cDNA，并且测序，发现其编码长度为440个氨基酸的全长蛋白，包含突变叶绿体信号序列。

实施例2：制备生物活性的拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶：

为了测试由按照上述实施例1所述方法分离的cDNA编码的蛋白是否能够催化2-氧戊二酸酰胺的合成，将cDNA在大肠杆菌内表达，纯化，并且使用标准方法分析其合成2-氧戊二酸酰胺的能力。

2-氧戊二酸酰胺的NMR分析

简言之，将所得的纯化蛋白加入到含有以下成分的反应混合物中：150mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM β巯基乙醇、200mM谷氨酰胺、100mM乙醛酸和200microM吡哆醛5’-磷酸盐。将不加入测试蛋白的反应混合物用作对照物。将测试和对照反应混合物在37℃下孵育20小时，然后通过离心澄清，以除去沉淀的材料。使用精确化学合成的2-氧戊二酸酰胺作为参照，利用¹³C NMR测试上清液中2-氧戊二酸酰胺的存在及其量。反应的产物为2-氧戊二酸酰胺和甘氨酸，而底物(谷氨酰胺和乙醛酸)大量减少。环状的2-氧戊二酸酰胺产生明显的信号，从而允许其容易地与开环的谷氨酰胺前体区分。

2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析

GPT活性的另一种分析方法根据以下文献的更改方法采用HPLC来确定2-氧戊二酸酰胺的产生：Calderon等，1985，J Bacteriol 161(2)：807-809。简言之，更改的提取缓冲液由25mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM EDTA、20μM FAD、10mM半胱氨酸和～1.5％(v/v)巯基乙醇构成。以约1/3的比例(w/v)将得自测试材料(即植物组织)的组织样品加入到提取缓冲液内，在37℃下孵育30分钟并且用200μl的20％TCA终止。在5分钟后，将分析混合物离心，并且采用上清液通过HPLC对2-氧戊二酸酰胺定量，HPLC条件为：采用ION-300 7.8mm ID X 30cm L柱，流动相为0.01Nh2SO4，流速为约0.2ml/min，在40℃下进行。注射体积为约20μl，并且保留时间为约38至39分钟。采用210nm紫外光进行检测。

采用NMR分析的结果：

该试验显示，测试蛋白能够催化2-氧戊二酸酰胺的合成。因此，这些数据表明，分离的cDNA编码直接参与植物内2-氧戊二酸酰胺的合成的谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶。因此，测试蛋白被称为拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶或“GPT”。

拟南芥GPT编码序列的核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO.1。GPT蛋白的转译的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2中。

实施例3：产生过度表达拟南芥GPT的转基因烟草植物：

获得植物表达载体pMON-PJU：

简言之，按照如下方式构造植物表达载体pMon316-PJU。将分离的编码拟南芥GPT的cDNA(实施例1)克隆入pMON316载体的Clal-Kpnl多聚接头位点，其将GPT基因置于组成型花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶(NOS)转录终止子的控制下。引入卡那霉素抗性基因以提供选择性标记物。

农杆菌介导的植物转化：

使用标准电穿孔方法将pMON-PJU和对照载体pMon316(没有插入的DNA)转移至根癌农杆菌菌株pTiTT37ASE内(McCormac等，1998，Molecular Biotechnology 9：155-159)，随后将其涂敷至含有抗生素奇霉素(100微克/ml)和卡那霉素(50微克/ml)的LB板上。通过PCR检测农杆菌的抗生素抗性克隆，以确保它们含有质粒。

采用Horsch等(Horsch等1995，Science 227：1229-1231)的叶盘转化体系、用pMON-PJU转化的农杆菌转化珊西烟(Nicotiana tabacumcv.Xanthi)植物。简言之，将灭菌叶盘接种，并且培养2天，然后将其转移至含有100μg/ml卡那霉素和500μg/ml的凯福隆(clafaran)的选择性MS基质内。确认转化株在选择性基质内形成根的能力。

产生GPT转化烟草植物：

允许灭菌叶片段在Murashige & Skoog(M&S)基质上发育出愈伤组织，由此得到转化株幼苗。然后将这些幼苗转移至允许生根的选择性基质(M&S基质，其中卡那霉素作为选择试剂)上。然后将健康并且已经生根的转化烟草幼苗转移至土壤内，并且允许其生长至成熟，并且在开花后，使植物自体受精，并且收获所得的种子。在生长阶段，已经检测了植物的生长表型，并且测量了许多幼小转基因植物的CO₂固定速率。

产生T1代和T2代GPT转基因植物：

收获的种子形成转基因烟草植物的T₀代，使其在含有卡那霉素(100mg/L)的M&S基质上发芽，以富集转基因。至少四分之一的种子在该基质上不会发芽(预期卡那霉素抑制没有抗性的种子发芽，这是由于基因的正常基因分离而产生的)，并且其余的种子中超过一半被除去，因为已经证实了其对卡那霉素的敏感性(甚至是中度敏感)。

使得存活的植物(T₁代)繁育，然后使这些植物自体受精，以产生T₂代的种子。使得自T₁代的种子在补充有含卡那霉素(10mg/升)的转化株谱系的MS基质上发芽。在14天后，将它们转移到沙土上，并且提供1/4强度的Hoagland营养液(其补充有25mM硝酸钾)。在900微摩尔/立方米/秒的光强度下，使得它们在24℃下生长经过16小时的光照期和8小时的黑暗期。在将它们转移至沙土培养物之后14天进行收获。

GPT转基因植物的表征：

分析收获的转基因植物(GPT转基因以及载体对照转基因)在根和叶子内的谷氨酰胺合成酶活性、完整植物的鲜重、根和叶子内的蛋白含量和CO₂固定速率(Knight等，1988，Plant Physiol.88：333)。还就相同的参数分析了未转化的根癌土壤杆菌植物和野生型根癌土壤杆菌植物，以便确立基线对照。

生长特性结果列于以下的表1中。此外，GPT转基因植物与野生型对照植物的比较照片示于图2中(与GS1转基因烟草植物一起)。在所有评价的参数中，GPT转基因烟草植物显示出增强的生长特性。特别是，与野生型对照植物相比，GPT转基因植物的CO₂固定速率表现出50％的增加，并且在叶子组织内的谷氨酰胺合成酶的活性表现出大于2倍的增加。此外，与野生型对照植物相比，在转氨酶转基因植物中叶至根的GS比例增加了几乎三倍。与野生型对照相比，转基因植物的鲜重和总蛋白量还分别增加了约50％和80％(叶子)。这些数据证明了过量表达拟南芥GPT转基因的烟草植物实现了显著增强的生长和CO₂固定速率。

表1

数据＝三个植物的平均值

野生型-对照植物；未经再生或转化。

PN1谱系通是通过采用没有插入基因的构造体转化后再生而制得的。

再生和转化过程的对照。PN9谱系是通过使用具有拟南芥GPT基因转化后再生而制得的。

实施例4：产生携带拟南芥GPT转基因的转基因番茄植物：

使用实施例3所述的载体和方法产生携带拟南芥GPT转基因的转基因番茄(Lycopersicon esculentum)(小汤姆番茄)植物。产生T₀代转基因番茄植物，并且使其生长成熟。GPT转基因番茄植物的初始生长特性列于表II中。与野生型对照植物相比，转基因植物显示出显著增加的生长速率、开花量和种子产率。此外，转基因植物发育为多个主干，而野生型植物仅发育出一个主干。GPT转基因番茄植物与野生型植物的比较用照片示于图3中。

表II

生长特性	野生型番茄	GPT转基因番茄
			干长度，cm	6.5	18、12、11(主干)
干数	1	3个主干，0个其它干
			花蕾	2	16
花	8	12
			果实	0	3

实施例5：大麦GPT转基因在植物内的活性

在该实施例中，分离出大麦GPT的突变编码序列，并且采用植物内瞬间表达分析法由转基因构造体进行表达。制备生物活性的重组大麦GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如HPLC证实的那样。

确认大麦(Hordeum vulgare)GPT编码序列，并且进行合成。该实施例中所用的大麦GPT编码序列的DNA序列由SEQ ID NO：14表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO：15表示。

将大麦GPT的编码序列插入1305.1cambia载体内，并且使用标准的电穿孔方法将其转移至根癌土壤杆菌菌株LBA404内(McCormac等，1998，Molecular Biotechnology 9：155-159)，随后将其涂敷于含有潮霉素(50微克/ml)的LB板上。选择土壤杆菌的耐抗生素的克隆用于分析。

瞬间烟草叶表达分析包括将转化的土壤杆菌(1.5-2.0OD 650)注射到快速生长的叶子内。在叶子表面上以交叉网格的形式进行皮内注射，以确保显著量的叶子表面接触土壤杆菌。然后允许植物生长3-5天，此时按照针对所有其它组织提取的方法提取组织，并且测量GPT活性。

接种的叶子组织中的GPT活性水平(1217纳摩尔/gFWt/h)为在对照植物叶子组织中测量的水平(407纳摩尔/gFWt/h)的三倍，从而表明大麦属GPT构造物能够指导功能性GPT在转基因植物内的表达。

实施例6：重组水稻GPT基因编码序列的分离和表达以及生物活性的分析

在该实施例中，分离水稻GPT的突变编码序列，并且在大肠杆菌内表达。制备生物活性的重组水稻GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如HPLC证实的那样。

材料和方法：

水稻GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达：

确认水稻(Oryza sativia)GPT编码序列，并且进行合成，插入PET28载体内，并且在大肠杆菌内进行表达。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。使用下述的NMR分析方法分析总共25X 10⁶个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。

在该实施例中所用的水稻GPT编码序列的DNA序列以SEQ IDNO：10表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：11表示。

2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析：

根据以下文献的更改方法采用HPLC来确定2-氧戊二酸酰胺的产生：Calderon等，1985，J Bacteriol 161(2)：807-809。简言之，更改的提取缓冲液由25mM Tris-HCl(pH 8.5)、1mM EDTA、20μM吡哆醛磷酸盐、10mM半胱氨酸和～1.5％(v/v)巯基乙醇构成。以约1/3的比例(w/v)将样品(得自大肠杆菌细胞的裂解物，25X 106细胞)加入到提取缓冲液内，在37℃下孵育30分钟并且用200μl的20％TCA终止。在约5分钟后，将分析混合物离心，并且采用上清液通过HPLC对2-氧戊二酸酰胺定量，HPLC条件为：采用ION-300 7.8mm ID X 30cm L柱，流动相为0.01Nh2SO4，流速为约0.2ml/min，在40℃下进行。注射体积为约20μl，并且保留时间为约38至39分钟。采用210nm紫外光进行检测。

采用NMR分析与精确2-氧戊二酸酰胺进行比较，以确认拟南芥全长序列表达具有2-氧戊二酸酰胺合成活性的GPT。简言之，通过化学合成制得精确2-氧戊二酸酰胺(用NMR证实其结构)以确证上述的HPLC分析，该HPLC分析通过确认分析产物(响应于表达的GPT而合成的分子)与精确2-氧戊二酸酰胺在相同的时间洗脱而实现。此外，当分析产物和精确化合物混合在一起时，它们洗脱为一个单独的峰。此外，HPLC分析的确证还包括监测底物谷氨酰胺的消耗，并且显示出所消耗的谷氨酰胺与所产生的2-氧戊二酸酰胺之间存在1∶1的摩尔化学计量比。分析过程总是包括两个对照试验，一个对照试验不含有添加的酶，并且一个对照试验含有添加的谷氨酰胺。第一个对照表明2-氧戊二酸酰胺的产物依赖于具有所存在的酶，并且第二个对照表明2-氧戊二酸酰胺的产生依赖于底物谷氨酰胺。

结果：

水稻GPT编码序列(SEQ ID NO：10)的表达使得具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性的重组GPT蛋白过度表达。具体而言，在过度表达重组水稻GPT的大肠杆菌内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为1.72纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了86倍。

实施例7：重组大豆GPT基因编码序列的分离和表达以及生物活性分析

在该实施例中，分离大豆GPT的突变编码序列，并且在大肠杆菌内表达。制备生物活性的重组大豆GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如HPLC证实的那样。

材料和方法：

水稻GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达：

确认大豆(Glycine max)GPT编码序列，并且进行合成，插入PET28载体内，并且在大肠杆菌内进行表达。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。使用下述的NMR分析方法分析总共25X 10⁶个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。

在该实施例中所用的大豆GPT编码序列的DNA序列以SEQ ID NO：12表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：13表示。

2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析：

按照上述实施例20所述的方法，采用HPLC确认在GPT过度表达大肠杆菌细胞内2-氧戊二酸酰胺的产生。

结果：

大豆GPT编码序列(SEQ ID NO：12)的表达使得具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性的重组GPT蛋白过度表达。具体而言，在过度表达重组大豆GPT的大肠杆菌内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为31.9纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了几乎1,600倍。

实施例8：斑马鱼GPT基因编码序列的分离和表达以及生物活性的分析

在该实施例中，分离斑马鱼GPT的突变编码序列，并且在大肠杆菌内表达。制备生物活性的重组斑马鱼GPT，并且催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加，如NMR证实的那样。

材料和方法：

斑马鱼GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达：

确认斑马鱼(Danio rerio)GPT编码序列，并且进行合成，插入PET28载体内，并且在大肠杆菌内进行表达。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。使用下述的NMR分析方法分析总共25X 10⁶个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。

在该实施例中所用的斑马鱼GPT编码序列的DNA序列以SEQ ID NO：16表示，并且经编码的GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：17表示。

2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析：

按照上述实施例20所述的方法，采用HPLC确认在GPT过度表达大肠杆菌细胞内2-氧戊二酸酰胺的产生。

结果：

斑马鱼GPT编码序列(SEQ ID NO：16)的表达使得具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性的重组GPT蛋白过度表达。具体而言，在过度表达重组斑马鱼GPT的大肠杆菌内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为28.6纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了超过1,400倍。

实施例9：切断的重组拟南芥GPT GENE编码序列的产生和表达以及生物活性分析

在该实施例中，设计了拟南芥GPT编码序列的两种不同的切断物，并且将其在大肠杆菌内表达，以评价其中突变叶绿体信号肽不存在或被切下的GPT蛋白的活性。对应于全长拟南芥GPT氨基酸序列SEQ ID NO：1的重组切断GPT蛋白被切断，以除去头30个氨基末端的氨基酸残基或头45个氨基末端的氨基酸残基，将其成功表达，并且显示出催化2-氧戊二酸酰胺的合成增加的生物活性，如NMR证实的那样。

材料和方法：

切断拟南芥GPT编码序列和在大肠杆菌内的表达

设计拟南芥GPT编码序列(SEQ ID NO：1)的切断物的DNA编码序列，进行合成，插入到PET28载体内，并且在大肠杆菌内表达。该实施例所用的切断拟南芥GPT编码序列的DNA序列以SEQ ID NO：20(-45AA构造体)表示，并且相应的切断GPT蛋白氨基酸序列以SEQ ID NO：21表示。简言之，用表达载体转化大肠杆菌，并且使转化株在LB肉汤培养基(其被稀释并且生长为OD 0.4)中生长过夜，用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(0.4微摩尔)诱导表达，生长3小时并且进行收获。然后使用实施例20所述的HPLC分析方法分析总共25X 10⁶个细胞的生物活性。分析未转化的野生型大肠杆菌细胞作为对照。另外的对照利用采用空载体转化的大肠杆菌细胞。

切断的-45拟南芥GPT编码序列(SEQ ID NO：20)的表达使得生物活性的重组GPT蛋白(具有2-氧戊二酸酰胺合成催化生物活性)过度表达。具体而言，在过度表达切断的-45拟南芥GPT的大肠杆菌细胞内观察的2-氧戊二酸酰胺活性为16.1纳摩尔，而在对照大肠杆菌细胞内的2-氧戊二酸酰胺活性仅为0.02纳摩尔，并且与对照相比，活性水平增加了超过800倍。作为比较，在相同的大肠杆菌分析方法表达的全长拟南芥基因编码序列产生的2-氧戊二酸酰胺活性为2.8纳摩尔，或者大致低于由切断的重组GPT蛋白观察的活性水平的五分之一。

本说明书所引用的所有公开、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，好像指出各独立的公开或专利申请具体并且独立地以引用的方式并入一样。

本发明无意于通过本文所公开的实施方案来限制其范围，这些实施方案旨在作为本发明的各方面的独立阐释，并且与其功能等价的任何实施放哪均在本发明的范围内。除了本文所述的那些之外，对本发明的模型和方法的各种更改从上述的说明书和教导中对于本领域的技术人员而言是显而易见的，并且同样希望其落在本发明的范围内。可以在不偏离本发明的真正范围和精神的条件下实施这些更改方式或其它实施方案。

序列表：

SEQ ID NO：1拟南芥谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶DNA编码序列：

ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTCTCCCAT

TCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCAC

AGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGT

TCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGG

CCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAA

GATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGC

GGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTG

CACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTT

GCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCA

CTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGA

CTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAG

CTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACG

ATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACT

GTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATT

GCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCA

ACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCT

GAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTA

CAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGA

ACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCG

TCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAG

AGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA

SEQ ID NO：2拟南芥GPT氨基酸序列

MYLDINGVMIKQFSFKASLLPFSSNFRQSSAKIHRPIGATMTTVSTQNESTQKPVQVAKRLEKFKT

TIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFRED

TGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDF

SIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHIS

IASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALK

APESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGV

VAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRK

SEQ ID NO：3葡萄GPT DNA序列

示出具有(3’端)rbcS3C+Vitis的Cambia 1305.1(葡萄)。粗体

是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是用于在大麦属基因中分裂的speI克隆位点。

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG

AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC

CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT

ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA

TAGATCTGAGG(GT

AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT

TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA

ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA

ATGCAGCTCTCTCAATGTACCTGGACATTCCCAGAGTTGCTTAAAAGACCAGCCTTTT

TAAGGAGGAGTATTGATAGTATTTCGAGTAGAAGTAGGTCCAGCTCCAAGTATCCATCTTTCAT

GGCGTCCGCATCAACGGTCTCCGCTCCAAATACGGAGGCTGAGCAGACCCATAACCCCCCTCA

ACCTCTACAGGTTGCAAAGCGCTTGGAGAAATTCAAAACAACAATCTTTACTCAAATGAGCAT

GCTTGCCATCAAACATGGAGCAATAAACCTTGGCCAAGGGTTTCCCAACTTTGATGGTCCTGA

GTTTGTCAAAGAAGCAGCAATTCAAGCCATTAAGGATGGGAAAAACCAATATGCTCGTGGATA

TGGAGTTCCTGATCTCAACTCTGCTGTTGCTGATAGATTCAAGAAGGATACAGGACTCGTGGT

GGACCCCGAGAAGGAAGTTACTGTTACTTCTGGATGTACAGAAGCAATTGCTGCTACTATGCT

AGGCTTGATAAATCCTGGTGATGAGGTGATCCTCTTTGCTCCATTTTATGATTCCTATGAAGCCA

CTCTATCCATGGCTGGTGCCCAAATAAAATCCATCACTTTACGTCCTCCGGATTTTGCTGTGCCC

ATGGATGAGCTCAAGTCTGCAATCTCAAAGAATACCCGTGCAATCCTTATAAACACTCCCCATA

ACCCCACAGGAAAGATGTTCACAAGGGAGGAACTGAATGTGATTGCATCCCTCTGCATTGAG

AATGATGTGTTGGTGTTTACTGATGAAGTTTACGACAAGTTGGCTTTCGAAATGGATCACATTT

CCATGGCTTCTCTTCCTGGGATGTACGAGAGGACCGTGACTATGAATTCCTTAGGGAAAACTTT

CTCCCTGACTGGATGGAAGATTGGTTGGACAGTAGCTCCCCCACACCTGACATGGGGAGTGA

GGCAAGCCCACTCATTCCTCACGTTTGCTACCTGCACCCCAATGCAATGGGCAGCTGCAACAG

CCCTCCGGGCCCCAGACTCTTACTATGAAGAGCTAAAGAGAGATTACAGTGCAAAGAAGGCA

ATCCTGGTGGAGGGATTGAAGGCTGTCGGTTTCAGGGTATACCCATCAAGTGGGACCTATTTT

GTGGTGGTGGATCACACCCCATTTGGGTTGAAAGACGATATTGCGTTTTGTGAGTATCTGATCA

AGGAAGTTGGGGTGGTAGCAATTCCGACAAGCGTTTTCTACTTACACCCAGAAGATGGAAAG

AACCTTGTGAGGTTTACCTTCTGTAAAGACGAGGGAACTCTGAGAGCTGCAGTTGAAAGGAT

GAAGGAGAAACTGAAGCCTAAACAATAGGGGCACGTGA

SEQ ID NO：4葡萄GPT氨基酸序列

MVDLRNRRTSMQLSQCTWTFPELLKRPAFLRRSIDSISSRSRSSSKYPSFMASASTVSAPNTEAEQT

HNPPQPLQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIKDGKNQYA

RGYGVPDLNSAVADRFKKDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAATMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEA

TLSMAGAQIKSITLRPPDFAVPMDELKSAISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNVIASLCIENDVL

VFTDEVYDKLAFEMDHISMASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWTVAPPHLTWGVRQAH

SFLTFATCTPMQWAAATALRAPDSYYEELKRDYSAKKAILVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVVVDHT

PFGLKDDIAFCEYLIKEVGVVAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVERMKEKLKPKQ

SEQ ID NO：5水稻GPT DNA序列

水稻GPT密码子优化用于E.coli表达；未翻译序列以小写字母示出

atgtggATGAACCTGGCAGGCTTTCTGGCAACCCCGGCAACCGCAACCGCAACCCGTCATGAAAT

GCCGCTGAACCCGAGCAGCAGCGCGAGCTTTCTGCTGAGCAGCCTGCGTCGTAGCCTGGTGG

CGAGCCTGCGTAAAGCGAGCCCGGCAGCAGCAGCAGCACTGAGCCCGATGGCAAGCGCAAG

CACCGTGGCAGCAGAAAACGGTGCAGCAAAAGCAGCAGCAGAAAAACAGCAGCAGCAGCC

GGTGCAGGTGGCGAAACGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGATGAGCATGCT

GGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCC

GAACTTTGATGGCCCGGATTTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTAACGCGGGCAAAA

ACCAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGAACTGAACAGCGCGATTGCGGAACGTTTTCTGA

AAGATAGCGGCCTGCAGGTGGATCCGGAAAAAGAAGTGACCGTGACCAGCGGCTGCACCGA

AGCGATTGCGGCGACCATTCTGGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTCTGTTTGCGCC

GTTTTATGATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAACGTGAAAGCGATTACCCT

GCGTCCGCCGGATTTTAGCGTGCCGCTGGAAGAACTGAAAGCGGCCGTGAGCAAAAACACCC

GTGCGATTATGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCGTGAAGAACTGG

AATTTATTGCGACCCTGTGCAAAGAAAACGATGTGCTGCTGTTTGCGGATGAAGTGTATGATA

AACTGGCGTTTGAAGCGGATCATATTAGCATGGCGAGCATTCCGGGCATGTATGAACGTACCGT

GACCATGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTG

CGCCGCCGCATCTGACCTGGGGCGTGCGTCAGGCACATAGCTTTCTGACCTTTGCAACCTGCA

CCCCGATGCAGGCAGCCGCCGCAGCAGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATGAAGAACTGC

GTCGTGATTATGGCGCGAAAAAAGCGCTGCTGGTGAACGGCCTGAAAGATGCGGGCTTTATTG

TGTATCCGAGCAGCGGCACCTATTTTGTGATGGTGGATCATACCCCGTTTGGCTTTGATAACGA

TATTGAATTTTGCGAATATCTGATTCGTGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGCCGAGCGTGTTT

TATCTGAACCCGGAAGATGGCAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGATGAAACC

CTGCGTGCGGCGGTGGAACGTATGAAAACCAAACTGCGTAAAAAAAAGCTTgcggccgcactcgagc

accaccaccaccaccactga

SEQ ID NO：6水稻GPT氨基酸序列

斜体包括用于克隆的氨基末端氨基酸

和来自pet28载体的His标签序列

MNLAGFLATPATATATRHEMPLNPSSSASFLLSSLRRSLVASLRKASPAAAAALSPMASASTVA

AENGAAKAAAEKQQQQPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAA

IQAINAGKNQYARGYGVPELNSAIAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVI

LFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREEL

EFIATLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPP

HLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQAAAAAALRAPDSYYEELRRDYGAKKALLVNGLKDAGFIVYPS

SGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDETLRAAVE

RMKTKLRKK

SEQ ID NO：7大豆GPT DNA序列

局部151D，大豆，用于E coli表达

从起始密码子.载体序列是斜体

GCGAAACGTCTGGAAAAATTTCAGACCACCATTT

TTACCCAGATGAGCCTGCTGGCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGA

ACTTTGATGGCCCGGAATTTGTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGCAAAAAC

CAGTATGCGCGTGGCTATGGCGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTGCGGAACGTTTTAAAAAA

GATACCGGCCTGGTGGTGGATCCGGAAAAAGAAATTACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGC

GATTGCGGCGACCATGATTGGCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTATGTTTGCGCCGTTT

TATGATAGCTATGAAGCGACCCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGT

CCGCCGGATTTTGCGGTGCCGCTGGAAGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCCGTGC

GATTCTGATTAACACCCCGCATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCGTGAAGAACTGAACTG

CATTGCGAGCCTGTGCATTGAAAACGATGTGCTGGTGTTTACCGATGAAGTGTATGATAAACTG

GCGTTTGATATGGAACATATTAGCATGGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGACCC

TGAACAGCCTGGGCAAAACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCG

CCGCATCTGAGCTGGGGCGTGCGTCAGGCGCATGCGTTTCTGACCTTTGCAACCGCACATCCG

TTTCAGTGCGCAGCAGCAGCAGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATGTGGAACTGAAACGT

GATTATATGGCGAAACGTGCGATTCTGATTGAAGGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTT

CCGAGCAGCGGCACCTATTTTGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCTGGAAAACGATGTG

GCGTTTTGCGAATATCTGGTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGACCAGCGTGTTTTAT

CTGAACCCGGAAGAAGGCAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGAAGAAACCAT

TCGTAGCGCGGTGGAACGTATGAAAGCGAAACTGCGTAAAGTCGACTAA

SEQ ID NO：8大豆GPT氨基酸序列

翻译的蛋白产物，载体序列斜体

AKRLEKFQTTIFTQMSLLAIKHGAINLGQGFPNF

DGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYARGYGVPDLNIAIAERFKKDTGLVVDPEKEITVTSGCTEAIAATM

IGLINPGDEVIMFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFAVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPT

GKMFTREELNCIASLCIENDVLVFTDEVYDKLAFDMEHISMASLPGMFERTVTLNSLGKTFSLTG

WKIGWAIAPPHLSWGVRQAHAFLTFATAHPFQCAAAAALRAPDSYYVELKRDYMAKRAILIEGL

KAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGLENDVAFCEYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCK

DEETIRSAVERMKAKLRKVD

SEQ ID NO：9大麦GPT DNA序列

编码序列从除去内含子起始

TAGATCTGAGGAACCGACGA

ATGGCATCCGCCCCCGCCTCCGCCTCCGCGGCC

CTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGACAACGGGGCCGCCAAGCCCACGGAGCAGCGGCCGGTAC

AGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGTTCAAAACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCA

GTGAAGCATGGAGCAATAAACCTTGGACAGGGGTTTCCCAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTC

AAAGATGCTGCTATTGAGGCTATCAAAGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTG

CCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCTGAGAGATTTCTCAAGGACAGTGGATTGCACATCGATCCT

GATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGGGTGCACAGAAGCAATAGCTGCAACGATATTGGGTCTG

ATCAACCCTGGGGATGAAGTCATACTGTTTGCTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACACTGTC

CATGGCTGGTGCGAATGTCAAAGCCATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGA

AGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAATACCAGAGCAATAATGATTAATACACCTCACAACCC

TACCGGGAAAATGTTCACAAGGGAGGAACTTGAGTTCATTGCTGATCTCTGCAAGGAAAATG

ACGTGTTGCTCTTTGCCGATGAGGTCTACGACAAGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAA

TGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTC

CTTGACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGTAAGGC

AGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCCACCTCCACGCCGATGCAATCAGCAGCGGCGGCGGCCC

TGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGAGGAGCTGAAGAGGGACTACGGCGCAAAGAAAGCGCT

GCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCGGGCTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCAT

CATGGTCGACCACACCCCGTTCGGGTTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCG

CGAGGTCGGCGTCGTGGCCATCCCGCCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGACGGGAAGA

ACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGACGACGACACGCTAAGGGCGGCGGTGGACAGGATG

AAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGA

SEQ ID NO：10大麦GPT氨基酸序列

来自起始位点(内含子除去)的翻译的序列

MVDLRNRRTSMASAPASASAALSTAAPADNGAAKPTEQRPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAVK

HGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAIKAGKNQYARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLHIDPDKEV

TVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKAAVSK

NTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIADLCKENDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTV

TMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTPMQSAAAAALRAPDSYFEELKRD

YGAKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVEFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPE

DGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK

SEQ ID NO：11斑马鱼GPTDNA序列

Danio rerio序列设计用于在E coli中表达。粗体斜体核苷酸加入用于克隆或来自pET28b载体。

GTGGCGAAACGTCTGGAAAAATTTAAAACCACCATTTTTACCCAGATGAGCATGCTG

GCGATTAAACATGGCGCGATTAACCTGGGCCAGGGCTTTCCGAACTTTGATGGCCCGGATTTT

GTGAAAGAAGCGGCGATTCAGGCGATTCGTGATGGCAACAACCAGTATGCGCGTGGCTATGG

CGTGCCGGATCTGAACATTGCGATTAGCGAACGTTATAAAAAAGATACCGGCCTGGCGGTGGA

TCCGGAAAAAGAAATTACCGTGACCAGCGGCTGCACCGAAGCGATTGCGGCGACCGTGCTGG

GCCTGATTAACCCGGGCGATGAAGTGATTGTGTTTGCGCCGTTTTATGATAGCTATGAAGCGAC

CCTGAGCATGGCGGGCGCGAAAGTGAAAGGCATTACCCTGCGTCCGCCGGATTTTGCGCTGC

CGATTGAAGAACTGAAAAGCACCATTAGCAAAAACACCCGTGCGATTCTGCTGAACACCCCG

CATAACCCGACCGGCAAAATGTTTACCCCGGAAGAACTGAACACCATTGCGAGCCTGTGCATT

GAAAACGATGTGCTGGTGTTTAGCGATGAAGTGTATGATAAACTGGCGTTTGATATGGAACATA

TTAGCATTGCGAGCCTGCCGGGCATGTTTGAACGTACCGTGACCATGAACAGCCTGGGCAAA

ACCTTTAGCCTGACCGGCTGGAAAATTGGCTGGGCGATTGCGCCGCCGCATCTGACCTGGGGC

GTGCGTCAGGCGCATGCGTTTCTGACCTTTGCAACCAGCAACCCGATGCAGTGGGCAGCAGC

AGTGGCACTGCGTGCACCGGATAGCTATTATACCGAACTGAAACGTGATTATATGGCGAAACGT

AGCATTCTGGTGGAAGGCCTGAAAGCGGTGGGCTTTAAAGTGTTTCCGAGCAGCGGCACCTA

TTTTGTGGTGGTGGATCATACCCCGTTTGGCCATGAAAACGATATTGCGTTTTGCGAATATCTG

GTGAAAGAAGTGGGCGTGGTGGCGATTCCGACCAGCGTGTTTTATCTGAACCCGGAAGAAGG

CAAAAACCTGGTGCGTTTTACCTTTTGCAAAGATGAAGGCACCCTGCGTGCGGCGGTGGATC

GTATGAAAGAAAAACTGCGTAAA

SEQ ID NO：12斑马鱼GPR氨基酸序列

在E.coli中克隆和表达的Danio rerio氨基酸序列(粗体斜体氨基酸是从载体/克隆和C-末端上的His标签加入)

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIRDGNNQYARGYGVP

DLNIAISERYKKDTGLAVDPEKEITVTSGCTEAIAATVLGLINPGDEVIVFAPFYDSYEATLSMAGA

KVKGITLRPPDFALPIEELKSTISKNTRAILLNTPHNPTGKMFTPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVY

DKLAFDMEHISIASLPGMFERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNP

MQWAAAVALRAPDSYYTELKRDYMAKRSILVEGLKAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGHENDIA

FCEYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRK

SEQ ID NO：13拟南芥截短的GPT-30构造体DNA序列

拟南芥GPT具有从目标序列除去的30个氨基酸。

ATGGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCT

ACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCA

AATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGAC

GGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCT

CGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTC

TTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAG

CTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTAT

GAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTC

TCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAAC

ACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCT

CTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATG

GATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGG

GAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTT

GGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCA

GCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGT

GAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCG

GGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGA

GTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAA

GAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGC

GTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA

SEQ ID NO：14拟南芥截短的GPT-30构造体氨基酸序列

MAKIHRPIGATMTTVSTQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPD

FVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLI

NPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGK

MFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKI

GWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEV

GFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEE

TLRGAIERMKQKLKRKV

SEQ ID NO：15：拟南芥截短的GPT-45构造体DNA序列

拟南芥GPT具有从目标序列除去的45个残基

ATGGCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTT

CAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGC

CAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAG

ATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCG

GTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGC

ACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTG

CACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCAC

TTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGAC

TCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGC

TTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGA

TAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACT

GTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATT

GCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCA

ACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCT

GAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTA

CAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGA

ACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCG

TCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAG

AGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA

SEQ ID NO：16：拟南芥截短的GPT-45构造体氨基酸序列

MATQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDG

KNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFY

DSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASL

CIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWG

VRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFV

VADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKL

KRKV

SEQ ID NO：17：番茄Rubisco启动子

番茄RuBisCo rbcS3C启动子序列从KpnI至NcoI

GTTTGAATCCTCCTTAAAGTTTTTCTCTGGAGAAACTGTAGTAATTTTACTTTGTTGTG

TTCCCTTCATCTTTTGAATTAATGGCATTTGTTTTAATACTAATCTGCTTCTGAAACTTGTAATGT

ATGTATATCAGTTTCTTATAATTTATCCAAGTAATATCTTCCATTCTCTATGCAATTGCCTGCATAA

GCTCGACAAAAGAGTACATCAACCCCTCCTCCTCTGGACTACTCTAGCTAAACTTGAATTTCC

CCTTAAGATTATGAAATTGATATATCCTTAACAAACGACTCCTTCTGTTGGAAAATGTAGTACTT

GTCTTTCTTCTTTTGGGTATATATAGTTTTATACACCATACTATGTACAACATCCAAGTAGAGTG

AAATGGATACATGTACAAGACTTATTTGATTGATTGATGACTTGAGTTGCCTTAGGAGTAACAA

ATTCTTAGGTCAATAAATCGTTGATTTGAAATTAATCTCTCTGTCTTAGACAGATAGGAATTATG

ACTTCCAATGGTCCAGAAAGCAAAGTTCGCACTGAGGGTATACTTGGAATTGAGACTTGCACA

GGTCCAGAAACCAAAGTTCCCATCGAGCTCTAAAATCACATCTTTGGAATGAAATTCAATTAG

AGATAAGTTGCTTCATAGCATAGGTAAAATGGAAGATGTGAAGTAACCTGCAATAATCAGTGA

AATGACATTAATACACTAAATACTTCATATGTAATTATCCTTTCCAGGTTAACAATACTCTATAAA

GTAAGAATTATCAGAAATGGGCTCATCAAACTTTTGTACTATGTATTTCATATAAGGAAGTATAA

CTATACATAAGTGTATACACAACTTTATTCCTATTTTGTAAAGGTGGAGAGACTGTTTTCGATGG

ATCTAAAGCAATATGTCTATAAAATGCATTGATATAATAATTATCTGAGAAAATCCAGAATTGGC

GTTGGATTATTTCAGCCAAATAGAAGTTTGTACCATACTTGTTGATTCCTTCTAAGTTAAGGTGA

AGTATCATTCATAAACAGTTTTCCCCAAAGTACTACTCACCAAGTTTCCCTTTGTAGAATTAAC

AGTTCAAATATATGGCGCAGAAATTACTCTATGCCCAAAACCAAACGAGAAAGAAACAAAATA

CAGGGGTTGCAGACTTTATTTTCGTGTTAGGGTGTGTTTTTTCATGTAATTAATCAAAAAATATT

ATGACAAAAACATTTATACATATTTTTACTCAACACTCTGGGTATCAGGGTGGGTTGTGTTCGA

CAATCAATATGGAAAGGAAGTATTTTCCTTATTTTTTTAGTTATATTTTCAGTTATACCAAACAT

ACCTTGTGATATTATTTTTAAAAATGAAAAACTCGTCAGAAAGAAAAAGCAAAAGCAACAAA

AAAATTGCAAGTATTTTTTAAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGT

TTGAGATAAGGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACC

ACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATA

GGAAGCCTTATCACTTATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA

SEQ ID NO：18：竹子GPT DNA序列

ATGGCCTCCGCGGCCGTCTCCACCGTCGCCACCGCCGCCGACGGCGTCGCGAAGCCGACGGA

GAAGCAGCCGGTACAGGTCGCAAAGCGTTTGGAAAAGTTTAAGACAACAATTTTCACACAGA

TGAGCATGCTTGCCATCAAGCATGGAGCAATAAACCTCGGCCAGGGCTTTCCGAATTTTGATG

GCCCTGACTTTGTGAAAGAAGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTATGCAA

GAGGATATGGTGTGCCTGAACTGAACTCGGCTGTTGCTGAAAGGTTCCTGAAGGACAGTGGC

TTGCAAGTCGATCCCGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGGTGCACGGAAGCGATAGCTGC

AACGATATTGGGTCTTATCAACCCTGGCGATGAAGTGATCTTGTTTGCTCCATTCTATGATTCAT

ACGAGGCTACGCTGTCGATGGCTGGTGCCAATGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTT

TGCAGTCCCTCTTGAGGAGCTAAAGGCCACAGTCTCTAAGAACACCAGAGCGATAATGATAA

ACACACCACACAATCCTACTGGGAAAATGTTTTCTAGGGAAGAACTTGAATTCATTGCTACTC

TCTGCAAGAAAAATGATGTGTTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTATGACAAGTTGGCATTTGAGG

CAGATCATATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACTGTGACTATGAACTCTCTG

GGGAAGACATTCTCTCTAACAGGATGGAAGATCGGTTGGGCAATAGCACCACCACACCTGAC

ATGGGGTGTAAGGCAGGCACACTCATTCCTCACATTTGCCACCTGCACACCAATGCAATCGGC

GGCGGCGGCGGCTCTTAGAGCACCAGATAGCTACTATGGGGAGCTGAAGAGGGATTACGGTG

CAAAGAAAGCGATACTAGTCGACGGACTCAAGGCTGCAGGTTTTATTGTTTACCCTTCAAGTG

GAACATACTTTGTCATGGTCGATCACACCCCGTTTGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGA

GTATTTGATCCGCGAAGTCGGTGTTGTCGCCATACCACCAAGCGTATTTTATCTCAACCCTGAG

GATGGGAAGAACTTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAAGGATGATGATACGCTGAGAGCCGCAGT

TGAGAGGATGAAGACAAAGCTCAGGAAAAAATGA

SEQ ID NO：19：竹子GPT氨基酸序列

MASAAVSTVATAADGVAKPTEKQPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPD

FVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPELNSAVAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLI

NPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANVKAITLRPPDFAVPLEELKATVSKNTRAIMINTPHNPTGK

MFSREELEFIATLCKKNDVLLFADEVYDKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWK

IGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTPMQSAAAAALRAPDSYYGELKRDYGAKKAILVDGLKA

AGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIEFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDD

DTLRAAVERMKTKLRKK

SEQ ID NO：20：1305.1+rbcS3C启动子+catI内含子和水稻GPT基因.

Cambia1305.1和(3’端)rbcS3C+水稻GPT。下划线ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是speI克隆位点，其用于在水稻基因中分裂。

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG

AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC

CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT

ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA

TAGATCTGAGG(GT

AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT

TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA

ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA

ATGAATCTGGCCGGCTTTCTCGCCACGCCCGCGACCGCGACCGCGACGCGGCATGAG

ATGCCGTTAAATCCCTCCTCCTCCGCCTCCTTCCTCCTCTCCTCGCTCCGCCGCTCGCTCGTCG

CGTCGCTCCGGAAGGCCTCGCCGGCGGCGGCCGCGGCGCTCTCCCCCATGGCCTCCGCGTCC

ACCGTCGCCGCCGAGAACGGCGCCGCCAAGGCGGCGGCGGAGAAGCAGCAGCAGCAGCCTG

TGCAGGTTGCAAAGCGGTTGGAAAAGTTTAAGACGACCATTTTCACACAGATGAGTATGCTTG

CCATCAAGCATGGAGCAATAAACCTTGGCCAGGGTTTTCCGAATTTCGATGGCCCTGACTTTGT

AAAAGAGGCTGCTATTCAAGCTATCAATGCTGGGAAGAATCAGTACGCAAGAGGATATGGTGT

GCCTGAACTGAACTCAGCTATTGCTGAAAGATTCCTGAAGGACAGCGGACTGCAAGTCGATC

CGGAGAAGGAAGTTACTGTCACATCTGGATGCACAGAAGCTATAGCTGCAACAATTTTAGGTC

TAATTAATCCAGGCGATGAAGTGATATTGTTTGCTCCATTCTATGATTCATATGAGGCTACCCTG

TCAATGGCTGGTGCCAACGTAAAAGCCATTACTCTCCGTCCTCCAGATTTTTCAGTCCCTCTTG

AAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAGAACACCAGAGCTATTATGATAAACACCCCGCACAAT

CCTACTGGGAAAATGTTTACAAGGGAAGAACTTGAGTTTATTGCCACTCTCTGCAAGGAAAAT

GATGTGCTGCTTTTTGCTGATGAGGTCTACGACAAGTTAGCTTTTGAGGCAGATCATATATCAA

TGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGAGGACCGTGACCATGAACTCTCTTGGGAAGACATTCTC

TCTTACAGGATGGAAGATCGGTTGGGCAATCGCACCGCCACACCTGACATGGGGTGTAAGGC

AGGCACACTCATTCCTCACGTTTGCGACCTGCACACCAATGCAAGCAGCTGCAGCTGCAGCT

CTGAGAGCACCAGATAGCTACTATGAGGAACTGAGGAGGGATTATGGAGCTAAGAAGGCATT

GCTAGTCAACGGACTCAAGGATGCAGGTTTCATTGTCTATCCTTCAAGTGGAACATACTTCGTC

ATGGTCGACCACACCCCATTTGGTTTCGACAATGATATTGAGTTCTGCGAGTATTTGATTCGCG

AAGTCGGTGTTGTCGCCATACCACCTAGTGTATTTTATCTCAACCCTGAGGATGGGAAGAACTT

GGTGAGGTTCACCTTTTGCAAGGATGATGAGACGCTGAGAGCCGCGGTTGAGAGGATGAAGA

CAAAGCTCAGGAAAAAATGA

SEQ ID NO：21：载体中大麦属GPT序列

Cambia1305.1和(3’端)rbcS3C+大麦属IDI4。下划线ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是speI克隆位点，其用于在大麦属基因中分裂。

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG

AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC

CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT

ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCA

TAGATCTGAGG(GT

AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT

TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA

ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA

ATGGCATCCGCCCCCGCCTCCGCCTCCGCGGCCCTCTCCACCGCCGCCCCCGCCGAC

AACGGGGCCGCCAAGCCCACGGAGCAGCGGCCGGTACAGGTGGCTAAGCGATTGGAGAAGT

TCAAAACAACAATTTTCACACAGATGAGCATGCTCGCAGTGAAGCATGGAGCAATAAACCTTG

GACAGGGGTTTCCCAATTTTGATGGCCCTGACTTTGTCAAAGATGCTGCTATTGAGGCTATCAA

AGCTGGAAAGAATCAGTATGCAAGAGGATATGGTGTGCCTGAATTGAACTCAGCTGTTGCTGA

GAGATTTCTCAAGGACAGTGGATTGCACATCGATCCTGATAAGGAAGTTACTGTTACATCTGG

GTGCACAGAAGCAATAGCTGCAACGATATTGGGTCTGATCAACCCTGGGGATGAAGTCATACT

GTTTGCTCCATTCTATGATTCTTATGAGGCTACACTGTCCATGGCTGGTGCGAATGTCAAAGCC

ATTACACTCCGCCCTCCGGACTTTGCAGTCCCTCTTGAAGAGCTAAAGGCTGCAGTCTCGAAG

AATACCAGAGCAATAATGATTAATACACCTCACAACCCTACCGGGAAAATGTTCACAAGGGAG

GAACTTGAGTTCATTGCTGATCTCTGCAAGGAAAATGACGTGTTGCTCTTTGCCGATGAGGTC

TACGACAAGCTGGCGTTTGAGGCGGATCACATATCAATGGCTTCTATTCCTGGCATGTATGAGA

GGACCGTCACTATGAACTCCCTGGGGAAGACGTTCTCCTTGACCGGATGGAAGATCGGCTGG

GCGATAGCACCACCGCACCTGACATGGGGCGTAAGGCAGGCACACTCCTTCCTCACATTCGCC

ACCTCCACGCCGATGCAATCAGCAGCGGCGGCGGCCCTGAGAGCACCGGACAGCTACTTTGA

GGAGCTGAAGAGGGACTACGGCGCAAAGAAAGCGCTGCTGGTGGACGGGCTCAAGGCGGCG

GGCTTCATCGTCTACCCTTCGAGCGGAACCTACTTCATCATGGTCGACCACACCCCGTTCGGG

TTCGACAACGACGTCGAGTTCTGCGAGTACTTGATCCGCGAGGTCGGCGTCGTGGCCATCCCG

CCAAGCGTGTTCTACCTGAACCCGGAGGACGGGAAGAACCTGGTGAGGTTCACCTTCTGCAA

GGACGACGACACGCTAAGGGCGGCGGTGGACAGGATGAAGGCCAAGCTCAGGAAGAAATGA

TTGAGGGGCG

SEQ ID NO：22Cambia 1201+拟南芥GPT序列(斜体来自CaMV的35S启动子)

ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCT

TCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACC

ATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATT

AGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGAT

CAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCA

AGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCT

ATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTT

ACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAA

GTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGT

AAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGT

AACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCA

CTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGG

ATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATG

TATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATC

GGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACA

TTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTA

CTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGG

AAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATT

TGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGAT

CCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTG

TAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAA

GTCTGA

SEQ ID NO：23Cambia p1305.1和(3’端)rbcS3C+拟南芥GPT。下划线ATG是起始位点，括号是catI内含子，下划线actagt是speI克隆位点，其用于在拟南芥基因中分裂。

AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTG

AGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTAC

CATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATAT

ATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCATAGATCTGAGG(GT

AAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCT

TTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTA

ACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGA

ATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTC

TCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCAT

GACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAG

AGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAA

TTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCT

ATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAG

CTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACAT

CTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCA

TTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAA

AGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAAC

TAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAG

GGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGA

AGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATG

AAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCT

GGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCG

CCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTC

AAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAG

TCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGG

AATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCC

AACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAA

AGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTC

TGA

SEQ ID NO：24拟南芥GPT编码序列(成熟蛋白，无目标序列)

GTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTT

AAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAA

GAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTTGCTCGTGGATACGGCATTCCT

CAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGA

AAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAA

CCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGG

CTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGC

TTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCG

GGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGC

TTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCT

CTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCG

GATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACAC

TCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCA

CCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAA

GGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGA

TCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGG

GTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGG

TTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCT

TAAGAGAAAAGTCTGA

SEQ ID NO：25拟南芥GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)

VAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLN

SAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKV

KGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYD

KLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPA

QWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAF

CEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV

SEQ ID NO：26葡萄GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGVPDL

NSAVADRFKKDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAATMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAQ

IKSITLRPPDFAVPMDELKSAISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNVIASLCIENDVLVFTDEVYD

KLAFEMDHISMASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWTVAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTP

MQWAAATALRAPDSYYEELKRDYSAKKAILVEGLKAVGFRVYPSSGTYFVVVDHTPFGLKDDIA

FCEYLIKEVGVVAIPTSVFYLHPEDGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVERMKEKLKPKQ

SEQ ID NO：27水稻GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPEL

NSAIAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANV

KAITLRPPDFSVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIATLCKENDVLLFADEVYD

KLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTP

MQAAAAAALRAPDSYYEELRRDYGAKKALLVNGLKDAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDI

EFCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDETLRAAVERMKTKLRKK

SEQ ID NO：28大豆GPT氨基酸序列(-1成熟蛋白，无目标序列)

AKRLEKFQTTIFTQMSLLAIKHGAINLGQGFPNFDGPEFVKEAAIQAIRDGKNQYARGYGVPDLNI

AIAERFKKDTGLVVDPEKEITVTSGCTEAIAATMIGLINPGDEVIMFAPFYDSYEATLSMAGAKVK

GITLRPPDFAVPLEELKSTISKNTRAILINTPHNPTGKMFTREELNCIASLCIENDVLVFTDEVYDKL

AFDMEHISMASLPGMFERTVTLNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLSWGVRQAHAFLTFATAHPFQ

CAAAAALRAPDSYYVELKRDYMAKRAILIEGLKAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGLENDVAFC

EYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEETIRSAVERMKAKLRKVD

SEQ ID NO：29大麦GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAVKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKDAAIEAIKAGKNQYARGYGVPEL

NSAVAERFLKDSGLHIDPDKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANV

KAITLRPPDFAVPLEELKAAVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFTREELEFIADLCKENDVLLFADEVY

DKLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATSTP

MQSAAAAALRAPDSYFEELKRDYGAKKALLVDGLKAAGFIVYPSSGTYFIMVDHTPFGFDNDVE

FCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVDRMKAKLRKK

SEQ ID NO：30斑马鱼GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAIRDGNNQYARGYGVPDL

NIAISERYKKDTGLAVDPEKEITVTSGCTEAIAATVLGLINPGDEVIVFAPFYDSYEATLSMAGAKV

KGITLRPPDFALPIEELKSTISKNTRAILLNTPHNPTGKMFTPEELNTIASLCIENDVLVFSDEVYDK

LAFDMEHISIASLPGMFERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHAFLTFATSNPM

QWAAAVALRAPDSYYTELKRDYMAKRSILVEGLKAVGFKVFPSSGTYFVVVDHTPFGHENDIAFC

EYLVKEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFTFCKDEGTLRAAVDRMKEKLRK

SEQ ID NO：31竹子GPT氨基酸序列(成熟蛋白，无目标序列)

VAKRLEKFKTTIFTQMSMLAIKHGAINLGQGFPNFDGPDFVKEAAIQAINAGKNQYARGYGVPEL

NSAVAERFLKDSGLQVDPEKEVTVTSGCTEAIAATILGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGANV

KAITLRPPDFAVPLEELKATVSKNTRAIMINTPHNPTGKMFSREELEFIATLCKKNDVLLFADEVYD

KLAFEADHISMASIPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSFLTFATCTP

MQSAAAAALRAPDSYYGELKRDYGAKKAILVDGLKAAGFIVYPSSGTYFVMVDHTPFGFDNDIE

FCEYLIREVGVVAIPPSVFYLNPEDGKNLVRFTFCKDDDTLRAAVERMKTKLRKK

Claims (21)

1.一种转基因植物，包含与植物启动子可操作地连接的GPT转基因。

2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述GPT转基因编码具有选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列的多肽，并且具有GPT活性：

(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及(b)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中的任一者具有至少75％一致性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的转基因植物，其中所述GPT转基因引入所述植物的基因组内。

4.根据权利要求3所述的转基因植物，其还被限定为单子叶植物。

5.根据权利要求3所述的转基因植物，其还限定为双子叶植物。

6.根据权利要求3所述的转基因植物的任意代次的后代，其中所述后代包含所述GPT转基因。

7.根据权利要求3所述的转基因植物的任意代次的种子，其中所述种子含有所述GPT转基因。

8.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的生长速率。

9.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的生物量产率。

10.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的种子产率。

11.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的花朵或花蕾产率。

12.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的果实或荚果产率。

13.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出较大的叶子。

14.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的GPT活性。

15.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的GS活性。

16.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的2-氧戊二酸酰胺水平。

17.根据权利要求3所述的转基因植物，当与类似野生型植物或未转化的植物相比时，其显示出提高的氮利用效率。

18.一种产生相对于类似野生型植物或未转化的植物具有增强的生长特性的植物的方法，包括：

(a)将GPT转基因引入所述植物内，并且进行表达；以及

(b)选择这样的植物，该植物相对于不含GPT转基因的相同品种的植物具有增强的生长特性。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述增强的生长特性选自由以下方面组成的组：提高的生物量、较高开花、较早发芽、增加的植物高度、增加的开花量、增加的发芽率、较大的叶子、增加的果实或荚果产率以及增加的种子产率。

20.一种产生相对于类似野生型植物或未转化的植物具有增加的氮利用效率的植物的方法，包括：

(a)将GPT转基因引入所述植物内，并且进行表达；

(b)选择这样的植物，该植物相对于不含GPT转基因的相同品种的植物具有增加的氮利用效率。

21.根据权利要求18、19或20所述的方法，还包括由这样选择的种子使所述植物繁殖，并且由所述植物收获种子。

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