CN105001314A - 一种与植物低氮耐性相关的SiLNT2蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与植物低氮耐性相关的SiLNT2蛋白及其相关生物材料与应用。该蛋白是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本发明通过实验证明，本发明提供的蛋白具有提高植物低氮耐性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。

Description

一种与植物低氮耐性相关的SiLNT2蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及一种与植物低氮耐性相关的SiLNT2蛋白及其相关生物材料与应用，属于生物技术领域。
背景技术
氮是一种在植物生长和发育中需求量最大的矿质营养元素，植物干物质和植株全氮中的含氮量分别为1.5％-2％和16％。元素氮对作物生长起着非常重要的作用，它是植物体内氨基酸的组成部分、是构成蛋白质的成分，也是植物进行光合作用起决定作用的叶绿素的组成部分。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、高盐和养分缺乏等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，将其命名为SiLNT2蛋白。
本发明提供的SiLNT2蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与具有相同功能的蛋白质。
其中，序列表中序列2所示的氨基酸序列由119个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述SiLNT2蛋白相关的生物材料。
本发明提供的与上述SiLNT2蛋白相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码上述SiLNT2蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1所示的核苷酸序列由360个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiLNT2蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiLNT2蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiLNT2蛋白且具有上述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码SiLNT2蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达SiLNT2蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动SiLNT2基因转录的启动子，还可包括终止SiLNT2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述SiLNT2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，SiLNT2蛋白的编码基因(即序列表中序列1的核苷酸)通过含有SiLNT2蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pWMB014:SiLNT2导入农杆菌GV1301中。所述重组载体pWMB014:SiLNT2为用序列表中序列1所示的DNA分子插入pWMB014载体的Sal I位点和BamH I酶切位点之间得到的重组载体pWMB014:SiLNT2，重组载体pWMB014:SiLNT2表达SiLNT2蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了上述SiLNT2蛋白或与上述SiLNT2蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明提供了上述SiLNT2蛋白或与上述SiLNT2蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
本发明还提供了上述SiLNT2蛋白或与上述SiLNT2蛋白相关的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
上述应用中，所述抗逆性为低氮耐性
上述应用中，所述植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述单子叶植物具体可为水稻Kitaake。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括将上述SiLNT2蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物抗逆性高于所述受体植物。
上述方法中，所述SiLNT2蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
上述方法中，所述抗逆性为低氮耐性，所述耐低氮性具体可体现为在低氮胁迫下，与受体植物相比：(1)转基因植物比受体植物的存活率高；(2)转基因植物比受体植物的株高高；(3)转基因植物比受体植物的鲜重高；(4)转基因植物比受体植物的蛋白质含量低；(5)转基因植物比受体植物的总氮量高。
上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻Kitaake。
在本发明的实施例中，所述SiLNT2蛋白的编码基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通过含有SiLNT2基因表达盒的重组载体pWMB014:SiLNT2导入所述受体植物中。所述重组载体pWMB014:SiLNT2为用序列表中序列1所示的DNA分子插入pWMB014载体的Sal I位点和BamH I酶切位点之间得到的重组载体pWMB014:SiLNT2，重组载体pWMB014:SiLNT2表达SiLNT2蛋白。
上述方法中，所述SiLNT2基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SiLNT2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。
所述SiLNT2基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SiLNT2基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
扩增编码上述SiLNT2蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种与植物低氮耐性相关的SiLNT2蛋白及其相关生物材料与应用。通过实验证明：将SiLNT2基因超表达于水稻中，得到的转SiLNT2水稻在低氮胁迫处理下，存活率、鲜重、株高、总氮含量均高于野生型水稻，蛋白质含量低于野生型水稻。说明SiLNT2蛋白具有调控植物抗逆性的功能，尤其是提高植物的低氮耐性，为培育具有抗逆性的转基因植物的研究奠定基础。
附图说明
图1为SiLNT2蛋白在植物细胞内的亚细胞定位。
图2为转SiLNT2水稻和野生型水稻的存活率。其中，Ki为野生型水稻Kitaake，L1，L2，L3均为T3代转SiLNT2水稻。
图3为转SiLNT2水稻和野生型水稻的鲜重。其中，Ki为野生型水稻Kitaake，L1，L2，L3均为T3代转SiLNT2水稻。
图4为转SiLNT2水稻和野生型水稻的株高。其中，Ki为野生型水稻Kitaake，L1，L2，L3均为T3代转SiLNT2水稻。
图5为转SiLNT2水稻和野生型水稻的蛋白含量。其中，Ki为野生型水稻Kitaake，L1，L2，L3均为T3代转SiLNT2水稻。
图6为转SiLNT2水稻和野生型水稻的总氮含量。其中，Ki为野生型水稻Kitaake，L1，L2，L3均为T3代转SiLNT2水稻。
图7为转SiLNT2水稻和野生型水稻的表型。其中，Ki为野生型水稻Kitaake，L1，L2，L3均为T3代转SiLNT2水稻。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷子品种龙谷25在文献“筛选高产优质谷子品种及喷施钙肥对米质影响的研究”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的水稻Kitaake在文献“Transgenic rice is a source of iron foriron-depleted rats.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的pWMB014载体在文献“小麦组织培养再生相关基因克隆及分子特性分析”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的霍格兰营养液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在霍格兰营养液中的浓度为：Ca(NO3)24.023mM，KNO36.03mM，MgSO41.91mM，(NH4)2HPO40.908mM，Fe-EDTA 0.1mM。
下述实施例中的无氮培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在无氮培养基中的浓度为：CaCl24.023mM，KCl 6.03mM，MgSO41.91mM，(Na)2HPO40.908mM，Fe-EDTA 0.1mM。
实施例1、SiLNT2基因的获得
1、植物材料的处理
用纯水将在完全培养基上生长10天的龙谷25谷子小苗进行冲洗，滤纸吸干多余水分后移至无氮培养基中进行低氮处理，处理48小时。
2、RNA提取及cDNA的获得
提取经步骤1低氮处理48小时后的龙谷25的RNA。以获得的RNA为模板，反转录得到cDNA。
3、PCR扩增
以步骤2中获得的cDNA为模板，采用引物F和R，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物两端分别引入限制性内切酶BamH I和Sac I识别位点。引物序列如下(小写的碱基代表酶切位点)：
F：5’-ggatccATGGCCAGGAGCTCGTTCAA-3’(序列3)；
R：5’-gaactcTTAGAACAGCCCGAAGGTGT-3’(序列4)。
对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到大小为360bp的DNA片段。将其与pEasyBlunt载体(购于北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB101-01)连接，得到重组质粒，并将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为360bp的扩增产物，将其命名为SiLNT2基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，SiLNT2基因编码的SiLNT2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
实施例2、SiLNT2蛋白在植物细胞内的亚细胞定位
为了定位SiLNT2蛋白在植物细胞内位置，对SiLNT2蛋白进行了亚细胞定位分析。具体步骤如下：
1、以龙谷25的cDNA为模板，采用引物F和引物R进行PCR扩增，得到SiLNT2基因全长CDS区。引物序列如下：
F:5’-ATGGCCAGGAGCTCGTTCAA-3’；
R:5’-TTAGAACAGCCCGAAGGTGT-3’。
2、将扩增产物与pCAMBIA1302载体连接，得到pCAMBIA1302-35S-GFP-SiLNT2融合表达载体。
3、通过PEG法转化谷子原生质体，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。
结果如图1所示：SiLNT2蛋白主要定位在细胞膜和细胞质中。
实施例3、转SiLNT2水稻的获得及其低氮耐性分析
一、植物过表达载体的构建
1、植物材料的处理
用纯水将在完全培养基上生长10天的龙谷25的谷子小苗进行冲洗，滤纸吸干多余水分后移至无氮培养基中进行低氮处理，处理48小时。
2、RNA提取及cDNA的获得
提取经步骤1低氮处理48小时后的龙谷25的RNA。以获得的RNA为模板，反转录得到cDNA。
3、PCR扩增
以步骤2中获得的cDNA为模板，采用引物F和R，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物两端分别引入限制性内切酶BamH I和Sac I识别位点。引物序列如下(小写的碱基代表酶切位点)：
F：5’-ggatccATGGCCAGGAGCTCGTTCAA-3’；
R：5’-gaactcTTAGAACAGCCCGAAGGTGT-3’。
对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到大小为360bp的DNA片段。
4、重组表达载体的获得
用BamH I和Sac I限制性内切酶对pWMB014载体进行双酶切，回收大小为12.7kb的骨架载体；用BamH I和Sac I限制性内切酶对上述步骤3回收得到的PCR扩增产物进行双酶切，得到大小为360bp的DNA片段；用连接酶连接上述骨架载体和DNA片段，得到重组载体pWMB014:SiLNT2。
对重组载体pWMB014:SiLNT2进行测序验证。结果表明：重组载体pWMB014:SiLNT2为将pWMB014载体的Sal I位点和BamH I酶切位点间的DNA替换为序列表中序列1所示的SiLNT2基因，且保持pWMB014载体的其他序列不变得到的载体。SiLNT2基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
5、重组菌的获得
采用热击法将上述获得的重组载体pWMB014:SiLNT2转化农杆菌GV1301(购于北京博迈德基因技术有限公司，产品目录号为CC3201)，得到重组菌pWMB014:SiLNT2/GV1301；采用热击法将pWMB014载体转化农杆菌GV1301，得到重组菌pWMB014/GV1301。
对上述重组菌pWMB014:SiLNT2/GV1301和pWMB014/GV1301进行菌液PCR鉴定，经鉴定表明重组菌pWMB014:SiLNT2/GV1301含有大小为360bp的SiLNT2基因；重组菌pWMB014/GV1301不含有大小为360bp的DNA片段。
二、转SiLNT2水稻的获得
采用农杆菌花序侵染的方法将上述所得的重组农杆菌GV1301/pWMB014:SiLNT2转化水稻Kitaake，经含除草剂培养基筛选，共筛选出50株T0代转SiLNT2水稻。按同样的方法将重组菌pWMB014/GV1301转化水稻Kitaake，得到转空载体水稻株系。
将筛选出的阳性植株移栽至营养土中在温室进行培养，繁殖出的每代种子都在含有除草剂培养基上进行筛选，直至繁殖得到T3代转SiLNT2水稻株系(L1-L50)，并对得到的T3代的转基因水稻植株进行PCR检测。具体步骤如下：
以T3代转SiLNT2水稻植株的基因组DNA为模板，采用UbiF2和NosR2引物进行PCR扩增。引物序列如下：
UbiF2：5’-TGGCATATGCAGCAGCTATA-3’；
NosR2：5’-GCAACAGGATTCAATCTTAAG-3’。
结果表明：50个不同的T3代转SiLNT2水稻株系均扩增得到了长度约为750bp的片段，而用同样的引物对转空载体水稻植株和野生型水稻Kitaake进行PCR检测，未得到上述扩增片段。选取T3代转SiLNT2水稻L1株系、T3代转SiLNT2水稻L2株系和T3代转SiLNT2水稻L3株系用于下述功能验证试验。
三、转SiLNT2水稻的低氮耐性分析
将在正常的霍格兰营养液中生长三周大的T3代转SiLNT2水稻L1株系、T3代转SiLNT2水稻L2株系、T3代转SiLNT2水稻L3株系和野生型水稻Kitaake分成两组：一组转移到无氮培养基中，PH＝5.5；另一组仍然在霍格兰营养液中继续生长(植物生长环境为相对湿度70％、温度30℃、光照周期16h光照/8h黑暗的温室)，以野生型水稻(Kitaake)作为对照。21天后统计植株的存活率、鲜重、株高、蛋白质含量和总氮量。所有实验技术重复和生物学重复各3次。
1、存活率
无氮处理21天后，每株系取3棵转SiLNT2水稻，以嫩叶仍有绿叶为存活标准，统计存活率。
结果如图2所示：无氮处理后，野生型水稻(Ki)、T3代转SiLNT2水稻L1株系(L1)、T3代转SiLNT2水稻L2株系(L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系(L3)的存活率分别为65％、90％、93％、94％。说明在无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的存活率明显提高。
2、鲜重
无氮处理21天后，取样称鲜重，每株系取5棵转SiLNT2水稻。
结果如图3所示：无氮处理后，和野生型水稻(Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻L1株系(L1)、T3代转SiLNT2水稻L2株系(L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系(L3)的鲜重明显高于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的鲜重明显提高。
3、株高
无氮处理21天后，取样测量株高，每株系取5棵转SiLNT2水稻。
结果如图4所示：无氮处理后，和野生型水稻(Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻L1株系(L1)、T3代转SiLNT2水稻L2株系(L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系(L3)的株高明显高于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的株高明显提高。
4、蛋白质含量
无氮处理21天后，采用Bradford法测定蛋白质含量。具体步骤如下：先配制1mg/ml的牛血清蛋白(BSA)母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液(PBS)配制一组浓度分别为1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml、0.08mg/ml、0.06mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml的BSA溶液。计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。
每组称1g样品，加10mL的PBS研磨，离心，取上清测量。根据标准曲线计算蛋白质含量。
结果如图5所示：无氮处理后，和野生型水稻(Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻L1株系(L1)、T3代转SiLNT2水稻L2株系(L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系(L3)的蛋白质含量明显低于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的蛋白质含量降低，将体内的蛋白质转换成氨基酸的能力比野生型水稻强，可以供给植株在低氮饥饿处理时的能量。
5、总氮量
无氮处理21天后，取样测量。采用快速消煮法测量总氮量，具体步骤如下：每组称取植物样品0.25g(称准至0.0002g)，放入消煮管，加1ml水湿润，加入4ml浓H2SO4摇匀，过夜。分两次各加入2ml H2O2，每次加入后均摇匀，待激烈反应结束后，进行消煮。固体成为溶液，浓硫酸冒白烟，溶液呈褐色时，停止加热，此过程大约十分钟。冷却到不烫手时，加入2ml H2O2，继续消煮5-10分钟，冷却，再加入2ml H2O2消煮，反复进行直到溶液无色或清亮后(大约8-10ml双氧水)再继续加热5-10分钟，以除去剩余的双氧水。冷却，用蒸馏水将消煮液定容到100ml容量瓶。待测。
结果如图6所示：无氮处理后，和野生型水稻(Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻L1株系(L1)、T3代转SiLNT2水稻L2株系(L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系(L3)的总氮含量明显高于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的总氮含量明显提高。
6、表型
无氮处理21天后，观察野生型水稻、T3代转SiLNT2水稻L1株系、T3代转SiLNT2水稻L2株系和T3代转SiLNT2水稻L3株系的表型。
结果如图7所示：无氮处理后，野生型水稻的生长明显受到抑制；和野生型水稻(Ki)相比，T3代转SiLNT2水稻L1株系(L1)、T3代转SiLNT2水稻L2株系(L2)和T3代转SiLNT2水稻L3株系(L3)受抑制的程度明显低于野生型水稻。说明经过无氮源处理后，和野生型水稻相比，转SiLNT2水稻的低氮耐性明显提高。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为低氮耐性。
6.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为低氮耐性。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.扩增编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。
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