CN106565833B

CN106565833B - 抗旱相关蛋白与其编码基因以及二者在调控植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN106565833B
Application number: CN201510650010.4A
Authority: CN
Inventors: 秦峰; 张彬; 丁双成
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2035-10-09
Also published as: CN106565833A

Abstract

本发明公开了抗旱相关蛋白与其编码基因以及二者在调控植物抗旱性中的应用。本发明所提供的抗旱相关蛋白，为如下A1)‑A5)中任一蛋白质：A1)氨基酸序列为序列5的蛋白质；A2)氨基酸序列为序列3的蛋白质；A3)在序列5的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A4)在序列3的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A2)衍生的蛋白质；A5)在A1)或A2)或A3)或A4)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质。实验证明，本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因可以提高植物的抗旱性，可用于培育抗旱性植物。

Description

抗旱相关蛋白与其编码基因以及二者在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中抗旱相关蛋白与其编码基因以及二者在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

植物生活环境变幻莫测，经常遭遇各种不利的非生物胁迫，尤其是在干旱等灾害天气越来越频繁和水资源越来越缺乏的大环境下，农作物抵抗水分胁迫的特性越来越受到重视。因此在拟南芥模式作物中研究植物的抗旱机制，最终获得抵御环境胁迫能力的优良农艺性状作物品种，在生产上具有重要的应用价值。

由于耐旱性性状本身具有复杂性，人们利用常规的方法不能有效地直接由性状指示到功能基因，目前通过功能基因组的研究发现并鉴定出许多基因参与胁迫响应，尤其是参与ABA信号传导的组分得到鉴定，如ABA受体蛋白，蛋白磷酸酶，蛋白激酶，泛素E3连接酶以及各种转录因子，为加深人们理解耐旱性机制提供重要的分子机制。在水分胁迫条件下，植物细胞中内源ABA水平迅速增加，一方面大量诱导胁迫相关基因的表达，激活下游转录因子，表达响应胁迫信号分子组分，以及胚胎发生丰富蛋白来维持细胞水分以及保护细胞内大分子，从而提高植物对胁迫的耐受性。另一方面ABA从合成部位运输到气孔保卫细胞，调控保卫细胞膨压减少，诱导气孔关闭，减少叶片蒸腾失水，维持植物在胁迫条件下正常的生理活动。目前关于ABA信号调控气孔运动的分子机制已有一定的阐述，其中活性氧ROS作为气孔中ABA信号响应的内源信号分子，整合保卫细胞中ABA的信号响应。ABA诱导产生的ROS，进而促进细胞质中Ca²⁺浓度增加，随后激活阴离子通道，阴离子外流诱导质膜去极化，激活外向K⁺通道，抑制内向K⁺通道，保卫细胞中持续的阴离子和K⁺离子外流最终导致细胞内膨压降低，气孔关闭。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗旱性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于野生型哥伦比亚生态型拟南芥的蛋白质，其名称为抗旱相关蛋白M。

本发明所提供的抗旱相关蛋白M，为如下A1)或A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列为序列5的蛋白质；

A2)在序列5的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使所述抗旱相关蛋白便于纯化，可在所述抗旱相关蛋白M的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK

Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的抗旱相关蛋白M可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的抗旱相关蛋白M的编码基因可通过将序列表中序列4的第153-1028位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，序列4由1262个核苷酸组成，序列4的第153-1028位编码序列5所示的蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述抗旱相关蛋白M相关的生物材料。

本发明所提供的与所述抗旱相关蛋白M相关的生物材料，为下述C1)至C20)中的任一种：

C1)编码所述抗旱相关蛋白M的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；

C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；

C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；

C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C9)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

C10)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

C11)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C12)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C13)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织；

C14)含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；

C15)含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；

C16)含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；

C17)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官；

C18)含有C2)所述表达盒的转基因植物器官；

C19)含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；

C20)含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，C1)所述核酸分子可为如下a1)-a5)中任一所示的基因：

a1)核苷酸序列是序列表中序列4的第153-1028位的cDNA分子或DNA分子；

a2)核苷酸序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；

a3)在序列4的第153-1028位的5′或3′端添加上述抗旱相关蛋白M中A4)所述标签的编码序列得到的cDNA分子或DNA分子；

a4)与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗旱相关蛋白M的cDNA分子或基因组DNA分子；

a5)在严格条件下与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗旱相关蛋白M的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述抗旱相关蛋白M的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述抗旱相关蛋白M的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述抗旱相关蛋白M且具有所述抗旱相关蛋白M的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列5所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，C2)所述的含有编码所述抗旱相关蛋白M的核酸分子的表达盒(所述抗旱相关蛋白M基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述抗旱相关蛋白M的DNA，该DNA不但可包括启动所述抗旱相关蛋白M基因转录的启动子，还可包括终止所述抗旱相关蛋白M基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述抗旱相关蛋白M基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的一个实施方式中，所述抗旱相关蛋白M的编码基因通过含有所述抗旱相关蛋白M的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中。所述重组载体为用序列4的第153-1028位所示的DNA分子替换pGKX的Bam HI和Xho I识别序列间的DNA片段得到的重组载体pGKX-CHYR1^T178D，pGKX-CHYR1^T178D表达序列5所示的抗旱相关蛋白M。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述抗旱相关蛋白M、或所述与所述抗旱相关蛋白M相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1或H2的应用：

H1、抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用；所述抗旱相关蛋白为如下B1)或B2)或B3)的蛋白质：

B1)氨基酸序列为序列3的蛋白质；

B2)在序列3的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

H2、与所述抗旱相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；

与所述抗旱相关蛋白相关的生物材料，为下述D1)至D20)中的任一种：

D1)编码所述抗旱相关蛋白的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体；

D4)含有D2)所述表达盒的重组载体；

D5)含有D1)所述核酸分子的重组微生物；

D6)含有D2)所述表达盒的重组微生物；

D7)含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D8)含有D4)所述重组载体的重组微生物；

D9)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

D10)含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D11)含有D3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

D12)含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

D13)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织；

D14)含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D15)含有D3)所述重组载体的转基因植物组织；

D16)含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；

D17)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官；

D18)含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；

D19)含有D3)所述重组载体的转基因植物器官；

D20)含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。

其中，所述抗旱相关蛋白的氨基酸序列如序列3所示，序列3由291个氨基酸组成，所述抗旱相关蛋白与所述抗旱相关蛋白M的关系是：所述抗旱相关蛋白M为将序列3的第178位的苏氨酸突变为天冬氨酸得到的蛋白质，在本发明的实施例中，所述抗旱相关蛋白的名称为CHYR1，所述抗旱相关蛋白M的名称为CHYR1^T178D。

为了使所述抗旱相关蛋白便于纯化，可在所述抗旱相关蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

上述B2)中的抗旱相关蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述B2)中的抗旱相关蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2的第153-1028位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，序列2由1262个核苷酸组成，序列2的第153-1028位编码序列3所示的抗旱相关蛋白。

上述应用中，D1)所述核酸分子可为如下b1)-b5)中任一所示的基因：

b1)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2的第153-1028位的cDNA分子或DNA分子；

b3)在序列2的第153-1028位的5′或3′端添加上述抗旱相关蛋白M中A4)所述标签的编码序列得到的cDNA分子或DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且所述抗旱相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗旱相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述抗旱相关蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述抗旱相关蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述抗旱相关蛋白且具有所述抗旱相关蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，D2)所述的含有编码所述抗旱相关蛋白的核酸分子的表达盒(所述抗旱相关蛋白基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述抗旱相关蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动所述抗旱相关蛋白基因转录的启动子，还可包括终止所述抗旱相关蛋白基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述抗旱相关蛋白基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的一个实施方式中，所述抗旱相关蛋白的编码基因通过含有所述抗旱相关蛋白的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中。所述重组载体为用序列2的第153-1028位所示的DNA分子替换pGKX的Bam HI和Xho I识别序列间的DNA片段得到的重组载体pGKX-CHYR1，pGKX-CHYR1表达序列3所示的抗旱相关蛋白。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1或M2或M3的方法：

M1、一种培育抗旱性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述抗旱相关蛋白M的编码基因或所述抗旱相关蛋白的编码基因得到抗旱性高于所述受体植物的抗旱性转基因植物；

M2、一种培育抗旱性植物的方法，包括对目的植物的基因组进行基因组编辑(genome editing)，将目的植物基因组中对应于所述抗旱相关蛋白中的第178位的苏氨酸的密码子突变为天冬氨酸的密码子，得到抗旱性高于所述目的植物的抗旱性植物；

M3、一种培育抗旱性植物的方法，包括对所述目的植物的基因组进行基因组编辑，将所述目的植物基因组中与所述抗旱相关蛋白的编码基因具有70％或70％以上同一性的基因中的对应于所述抗旱相关蛋白中的第178位的苏氨酸或丝氨酸的密码子突变为天冬氨酸的密码子，得到抗旱性高于所述目的植物的抗旱性植物。

其中，所述基因组编辑是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。所述DNA修复系统可通过两种途径修复DNA双链断裂(double-strand break,DSB),即非同源末端连接(Nonhomologous end joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)。

这里使用的术语“同一性(identity)”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的蛋白质的核苷酸序列具有70％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个蛋白质序列之间的完全相同的氨基酸个数占该蛋白质所有氨基酸总数的百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述70％或70％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述方法中，所述抗旱相关蛋白M的编码基因可为所述a1)-a5)中任一所示的基因；所述抗旱相关蛋白的编码基因可为所述b1)-b5)中任一所示的基因。

在本发明的实施例中，所述抗旱相关蛋白M的编码基因通过含有所述抗旱相关蛋白M基因表达盒的所述抗旱相关蛋白M基因重组表达载体导入目的植物中。所述抗旱相关蛋白的编码基因通过含有所述抗旱相关蛋白基因表达盒的所述抗旱相关蛋白基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述抗旱相关蛋白M基因和所述抗旱相关蛋白基因均可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述抗旱相关蛋白M基因或所述抗旱相关蛋白基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述抗旱相关蛋白M基因重组表达载体和所述抗旱相关蛋白基因重组表达载体均可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,AcademyPress,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述抗旱相关蛋白M基因或所述抗旱相关蛋白基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。通过上述培育抗旱性植物的方法得到的抗旱性植物可理解为通过所述基因组编辑对所述受体植物进行遗传改良得到的种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述基因组编辑具体可为CRISPR/Cas技术。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述抗旱相关蛋白M、所述与所述抗旱相关蛋白M相关的生物材料、所述抗旱相关蛋白或所述与所述抗旱相关蛋白相关的生物材料的下述X1-X3中的任一应用：

X1、在培育抗旱性植物中的应用；

X2、在调控植物气孔开放和/或关闭中的应用；

X3、在调控植物蒸腾速率中的应用。

上述应用中，所述植物气孔开放和/或关闭可为ABA诱导的气孔关闭、黑暗诱导的气孔关闭或光诱导的气孔开放。

本发明中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

实验证明，本发明的抗旱相关蛋白M及其编码基因可以提高植物的抗旱性。当向受体植物中导入抗旱相关蛋白M的编码基因时，得到的转基因植物的抗旱性增强：经干旱处理后，三个转基因植物株系及转空载体对照植物的存活率分别为88±8％、98±8％、85±7％、52±8％，这三个转基因植物株系的存活率均极显著高于转空载体对照植物的存活率；四个转基因植物株系叶片经ABA处理后产生的ROS明显多于转空载体对照植物叶片经ABA处理后产生的ROS；ABA促进气孔关闭实验中，在不同的ABA处理时间下四个转基因植物株系的气孔开度均极显著小于转空载体对照植物的气孔开度；在ABA抑制光诱导的气孔开放和ABA诱导的气孔关闭的实验中，ABA处理后四个转基因植物株系与转空载体对照植物的气孔开度均极显著减小；两个转基因植物株系的叶片蒸腾速率在24h内均低于转空载体对照植物的叶片蒸腾速率。

实验证明，本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因可以提高植物的抗旱性。当向受体植物中导入抗旱相关蛋白的编码基因时，得到的转基因植物的抗旱性增强：经干旱处理后，两个转基因植物株系及转空载体对照植物的存活率分别为86±15％、93±17％、30±17％，两个转基因植物株系的存活率均极显著高于转空载体对照植物的存活率；两个转基因植物株系叶片经ABA处理后产生的ROS明显多于转空载体对照植物叶片经ABA处理后产生的ROS；ABA促进气孔关闭实验中，在不同的ABA处理时间下两个转基因植物株系的气孔开度均极显著小于转空载体对照植物的气孔开度；在ABA抑制光诱导的气孔开放的实验中，ABA处理后两个转基因植物株系与转空载体对照植物的气孔开度均极显著减小；两个转基因植物株系的叶片蒸腾速率在24h内均低于转空载体对照植物的叶片蒸腾速率。

当将野生型植物的抗旱相关蛋白基因敲除时，得到的突变体植物的抗旱性减弱：经干旱处理后，两个突变体植物及野生型植物的存活率分别为22±11％、18±13％、81±16％，两个突变体植物的存活率均极显著低于野生型植物的存活率；两个突变体植物的叶片经ABA处理后产生的ROS明显少于野生型植物叶片经ABA处理后产生的ROS；ABA促进气孔关闭实验中，在ABA处理2小时和2.5小时时，两个突变体植物的气孔开度均极显著大于野生型植物的气孔开度；在ABA抑制光诱导的气孔开放的实验中，ABA处理后两个突变体植物与野生型植物的气孔开度均极显著增大；两个突变体植物的叶片蒸腾速率在24h内均高于野生型植物的叶片蒸腾速率。

实验证明，本发明的抗旱相关蛋白M及其编码基因以及抗旱相关蛋白及其编码基因均可以提高植物的抗旱性，可用于培育抗旱性转基因植物。

附图说明

图1为转基因拟南芥中CHYR1基因的相对表达量。其中，VC表示T₂代VC，OE35和OE42分别表示T₂代OE35和T₂代OE42。

图2为转CHYR1基因拟南芥的干旱耐受性的检测结果。其中，WT/VC表示col或者T₂代VC，OE35和OE42分别表示T₂代OE35和T₂代OE42。

图3为ABA诱导ROS产生实验的结果。其中，WT/VC表示col或者T₂代VC，OE35和OE42分别表示T₂代OE35和T₂代OE42。

图4为ABA促进不同植株气孔关闭实验结果。其中，，WT/VC表示col或者T₂代VC，OE35和OE42分别表示T₂代OE35和T₂代OE42。

图5为ABA抑制光诱导的气孔开放实验结果。其中，WT/VC表示col或者T₂代VC，OE35和OE42分别表示T₂代OE35和T₂代OE42。

图6为不同植株的叶片蒸腾速率。其中，WT/VC表示col或者T₂代VC。

图7为转CHYR1^T178A基因拟南芥和转CHYR1^T178D基因拟南芥的抗旱性检测结果。其中，A为转基因拟南芥的干旱耐受性的检测结果；B为ABA诱导ROS产生实验的结果；C为转基因拟南芥中外源基因的相对表达量；D为ABA促进不同植株气孔关闭实验结果；E为部分植株在ABA处理前后气孔开度的变化趋势。其中，WT/VC表示col或者T₂代VC，VC表示T₂代VC，OE表示T₂代两个OE株系气孔开度均值，chyr1表示chyr1-1和chyr1-2气孔开度平均值，T178A表示四个转基因株系A5、A32、A9和A34气孔开度均值，T178D表示四个转基因株系D30、D42、D21和D10气孔开度均值。

图8为逆境胁迫诱导下CHYR1基因的相对表达量。

图9为CHYR1基因启动子在表皮和气孔中启动目的基因的表达。A-l表示从萌发至开花CHYR1基因启动子的作用部位，m表示没有经过ABA处理的叶片气孔，n表示经过100μMABA处理的叶片气孔。

图10为ABA的合成以及ABA的信号传导对CHYR1基因表达模式影响的实验结果。

图11为CHYR1的亚细胞定位的检测结果。

图12为荧光检测CHYR1的组织定位情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的载体pGKX(Qin F,Sakuma Y,Tran LS,Maruyama K,Kidokoro S,et al.(2008)Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3ligases and negatively regulate plant drought stress-responsive geneexpression.Plant Cell 20:1693-1707.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pBI 121(Qin F,Kakimoto M,Sakuma Y,Maruyama K,Osakabe Y,et al.(2007)Regulation and functional analysis of ZmDREB2A inresponse to drought and heat stresses in Zea mays L.Plant J 50:54-69.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

载体pGKX与载体pBI 121均为植物表达载体，均为35S启动子驱动表达，在利用载体pGKX与利用载体pBI 121在对受体植物进行转基因实验时，受体植物中插入的外源T-DNA序列相同。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101菌株(Jing Y,Zhang D,Wang X,Tang W,WangW,et al.(2013)Arabidopsis chromatin remodeling factor PICKLE interacts withtranscription factor HY5to regulate hypocotyl cell elongation.Plant Cell 25:242-256.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株为将载体pSoup(Roger P，HellensEA,Nicola RL,Samantha B,Philip MM(2000)pGreen:a versatile and flexible binaryTi vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant PhysiolVolume42:819-832)导入根癌农杆菌GV3101中得到的重组菌，公众可从申请人处获得根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pSoup上有质粒在农杆菌中复制所需要的一系列元件，借助于pSoup的存在可以帮助没有农杆菌复制元件的小载体如pGXK等在农杆菌中复制，在利用根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株与利用根癌农杆菌GV3101菌株在对受体植物进行转基因实验时，二者的转化方法与以及整合在植物基因组中的方式都是一样的。

下述实施例中的野生型哥伦比亚生态型拟南芥(名称为col)(Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K(1994)A novel cis-acting element in an Arabidopsisgene is involved in responsiveness to drought,low-temperature,or high-saltstress.Plant Cell6:251-264)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的chyr1-1(SALK_045606)、chyr1-2(SALK_117324)、abi2-1(CS23)、abi4-2(SALK_080095)、necd3-2(GABI-Kat 129B08)、aba2-1(CS156)、snrk2.2(GABI-Kat807G04)、snrk2.6(SALK_008068)和snrk2.3(SALK_096546)均为拟南芥信息资源中心(The Arabidopsis Information Resource)产品。

下述实施例中的OS Buffer(气孔开度缓冲液)由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：10mM KCl，100mM CaCl₂，10mM MES，用KOH调pH至6.1。

实施例1、转CHYR1基因拟南芥的构建

本实施例提供了来源于野生型哥伦比亚生态型拟南芥(名称为col)的抗旱相关蛋白基因，该基因名称为CHYR1基因，其CHYR1基因的基因组DNA序列如序列表中序列1所示，序列1由2275个核苷酸组成，其中序列1的第230-325位、第414-540位、第601-685位、第719-803位、第882-958位、第1003-1107位、第1149-1234位、第1318-1401位、第1494-1580位、第1651-1730位和第1773-1873位分别为CHYR1基因的11个内含子的序列。CHYR1基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由1262个核苷酸组成，其中序列2的第153-1028位为编码序列表中序列3所示的抗旱相关蛋白(即CHYR1)，序列3由291个氨基酸残基组成。

1、重组载体和重组农杆菌的构建

将载体pGKX的Bam HI和Xho I识别序列间的片段替换为序列2的第153-1028位所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pGKX-CHYR1。pGKX-CHYR1与pGKX的差别仅在于：pGKX-CHYR1为将pGKX的Bam HI和Xho I识别序列间的DNA替换为序列2的第153-1028位所示的DNA分子。pGKX-CHYR1中35S启动子启动表达序列3所示的融合蛋白质。

将pGKX-CHYR1导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中，得到含有pGKX-CHYR1重组菌，将其命名为重组农杆菌X；将载体pBI 121导入根癌农杆菌GV3101菌株中，得到含有pGKX重组菌，将其命名为重组农杆菌VC。

2、转基因拟南芥的构建

取步骤1的重组农杆菌X接种于含有50mg/L卡那霉素和5mg/L四环素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600为0.8，25℃、5000转/分钟离心2分钟，除去上清液，用重悬溶液(重悬溶液的溶剂为水，溶质为蔗糖和silwet77，蔗糖和si lwet77的浓度分别为50g/L、0.02％(体积百分含量))重悬菌体，获得侵染液。用移液器将侵染液点在col的花蕾及生长点，用薄膜覆盖，保湿2天后，置于正常条件下生长，收获T₁代转CHYR1基因拟南芥种子。

将T₁代转CHYR1基因拟南芥种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选并将抗性苗种植收种，获得T₂代种子；将T₂代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选，挑选卡那霉素抗性分离比符合3:1的卡那霉素抗性苗种植，得到T₂代转CHYR1基因拟南芥，收获其种子，得到T₂代转CHYR1基因拟南芥种子。

按照上述方法，将重组农杆菌X替换为步骤1的重组农杆菌VC，其他步骤均不变，得到T₂代转空载体拟南芥种子。

将60粒T₂代转CHYR1基因拟南芥种子消毒种于含有卡那霉素的MS培养基筛选，3周后统计抗Kan与不抗Kan的比值，符合3:1为单拷贝家系。对单拷贝家系的植株用特异引物F1和R1进行半定量PCR分析整株中CHYR1基因在mRNA水平上的表达水平，以18S rRNA为内参，内参的引物为FC1和RC1。各引物序列如下：

F1：5’-ATGGATCCATGGATATGGGTTTCCATGAAA-3’；

R1：5’-ATCTCGAGTTAACCGGTTGAACCAACAA-3’；

FC1：5’-AAACGGCTACCACATCCAAG-3’；

RC1：5’-CCTCCAATGGAATCCTCGTTA-3’。

挑选CHYR1基因高表达的2个T₂代转CHYR1基因拟南芥(将其分别命名为T₂代OE35和T₂代OE42)利用上述引物F1和R1、FC1和RC1进行qRT-PCR，对整株中CHYR1基因在mRNA水平上的表达水平进行进一步的准确定量(图1)以T₂代转空载体拟南芥(将其命名为T₂代VC)为对照。结果显示，T₂代OE35和T₂代OE42中CHYR1基因的表达量分别为T₂代转空载体拟南芥的10.7倍和23.8倍。

实施例2、CHYR1可以提高拟南芥的抗旱性

利用转CHYR1基因拟南芥及CHYR1基因缺失的拟南芥突变体检测CHYR1基因对拟南芥抗旱性的影响。本实施例用到的转CHYR1基因拟南芥为实施例1的T₂代OE35和T₂代OE42，并将T₂代VC作为对照；本实施例用到的CHYR1基因缺失的拟南芥突变体为CHYR1基因表达缺失的两个T-DNA插入突变体，其名称分别为chyr1-1和chyr1-2，chyr1-1和chyr1-2的遗传背景为野生型哥伦比亚生态型拟南芥(名称为col)，将col作为对照。

1、干旱耐受性实验

将蛭石和营养土按1:1比例充分混匀，分别称取250g装入底部平整的黑色育苗盘的每个小盘内(12cm×12cm，共6个)，放入大托盘里注水，通过底部吸水使土壤完全湿润。然后将MS培养基上正常生长10天左右的T₂代OE35、T₂代OE42和T₂代VC幼苗均分别按每小盘16株移苗，每一个大托盘内设实验组(即T₂代OE35、T₂代OE42)和对照组(即T₂代VC)，所移栽的幼苗要大小一致，保鲜膜覆盖生长2天后揭膜，正常光照不断水继续培养生长两周，在抽薹前开始停水进行干旱处理。停水前需用吸水毛巾均匀除去花盆外沿的游离水分，干旱过程中每天调换大托盘的方向以减少位置对每一个小盘内苗生长的影响，其他培养条件(如温度、光照)同正常培养下的条件。干旱处理约7～9天植株开始萎蔫，干旱处理15天开始浇水进行复水。复水三天(图2)后，统计存活率(将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长和收种的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于40株，取平均值进行统计分析。

按照上述方法，将T₂代OE35、T₂代OE42和T₂代VC分别替换为chyr1-1、chyr1-2和col，其他步骤均不变，分别得到chyr1-1、chyr1-2和col经干旱处理后的存活率(图2)。

结果显示，T₂代OE35、T₂代OE42和T₂代VC的存活率分别为86±15％、93±17％、30±17％，利用t-test进行显著性检验，T₂代OE35和T₂代OE42的存活率均极显著高于T₂代VC的存活率，表明，CHYR1基因可以提高拟南芥的抗旱性(即干旱耐受性)。chyr1-1、chyr1-2和col经干旱处理后的存活率分别为22±11％、18±13％、81±16％，利用t-test进行显著性检验，chyr1-1和chyr1-2经干旱处理后的存活率均极显著低于col经干旱处理后的存活率，表明，CHYR1基因的缺失可以降低拟南芥的抗旱性(即干旱耐受性)。

2、ABA诱导ROS产生实验

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

剪取生长3～4周的T₂代OE35莲座叶经过100mM ABA浸泡处理3h之后，再浸泡于DAB浓度为100μg/ml的DAB染色液中于黑暗室温染色12h，将染色后的叶片用3:1:1的乙醇/醋酸/甘油固定后，体式微镜下拍照观察T₂代OE35叶片中ABA诱导的ROS。剪取生长3～4周的T₂代OE35莲座叶浸泡于DAB浓度为100μg/ml的DAB染色液中于黑暗室温染色12h，将染色后的叶片用3:1:1的乙醇/醋酸/甘油固定后，体式微镜下拍照观察未经ABA处理的T₂代OE35叶片中的ROS。

按照上述方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代OE42、T₂代VC、chyr1-1、chyr1-2和col，观察T₂代OE42、T₂代VC、col、chyr1-1、chyr1-2和col叶片中ABA诱导的ROS。

结果(图3)显示，T₂代VC与col叶片中ABA诱导的ROS基本一致，T₂代OE35和T₂代OE42叶片经ABA处理后产生的ROS明显多于T₂代VC叶片经ABA处理后产生的ROS，而chyr1-1和chyr1-2叶片经ABA处理后产生的ROS明显少于col叶片经ABA处理后产生的ROS。

3、气孔对ABA的响应实验

气孔对ABA的响应分为ABA促进气孔关闭和ABA抑制光诱导的气孔开放两个部分，光照均为培养箱光照条件，强度均为80μmol m^-2s^-1，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

ABA促进气孔关闭实验的具体操作步骤如下：剪取生长3周的T₂代OE35莲座叶，放在OS Buffer(气孔开度缓冲液)中，使叶片下表皮接触OS Buffer，温室条件下黑暗处理0.5h后，转入培养箱光照条件2.5h，再向OS Buffer中加入ABA，使ABA的浓度为5mM，室温光照下分别继续培养1h、2h和2.5h后，用透明胶带撕下黑暗处理后、光照处理后以及不同ABA处理不同时间的叶片下表皮，轻轻刮去下表皮上的叶肉细胞，压片，尼康正置显微镜40×倍下观察并拍照。最后用统计软件Image J测量气孔的横径(即气孔开度)(图4)。每个样品每个处理至少测量100个气孔，且至少来自5株以上的植株叶片。

按照上述方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代OE42、T₂代VC、col、chyr1-1、chyr1-2和col。与同等处理下T₂代VC和col的气孔开度比较，得到ABA促进T₂代OE35和T₂代OE42的气孔关闭，、抑制chyr1-1、chyr1-2的气孔关闭(图4)。T₂代OE株系气孔开度均值，、T₂代VC和col的气孔开度均值，chyr1-1和chyr1-2气孔开度均值显示了在ABA处理前后气孔开度的变化趋势如图7中E所示。

ABA促进气孔关闭实验结果显示，T₂代VC和col的结果基本一致，在不同的ABA处理时间下T₂代OE35和T₂代OE42的气孔开度均极显著小于T₂代VC的气孔开度，在ABA处理1小时时，chyr1-1、chyr1-2和col的气孔开度基本无差异，在ABA处理2小时和2.5小时时，chyr1-1和chyr1-2的气孔开度均极显著大于col的气孔开度。

ABA抑制光诱导的气孔开放的具体操作步骤如下：剪取生长3周的T₂代OE35莲座叶，放在OS Buffer中，使叶片下表皮接触OS Buffer，温室条件下黑暗处理0.5h后，向OSBuffer中加入ABA，使ABA的浓度为5mM，室温光照下继续培养2.5h后，用透明胶带撕下黑暗处理以及光照条件下不同ABA处理不同时间的叶片下表皮，轻轻刮去下表皮上的叶肉细胞，压片，尼康正置显微镜40×倍下观察并拍照。最后用统计软件Image J测量气孔的横径(即气孔开度)(图5)。每个样品每个处理至少测量100个气孔，且至少来自5株以上的植株叶片。

按照上述方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代OE42、T₂代VC、chyr1-1、chyr1-2和col。与同等处理下T₂代VC和col的气孔开度比较得到ABA抑制光诱导的T₂代OE42、T₂代VC、chyr1-1和chyr1-2气孔开放实验的气孔开度(图5)。

结果显示，T₂代VC和col的结果基本一致，在ABA处理后，T₂代OE35和T₂代OE42的气孔开度均极显著减小，chyr1-1、chyr1-2和col的气孔开度均极显著增大。

以上结果表明，CHYR1基因可以使拟南芥的气孔更快地响应ABA诱导的气孔关闭。

4、叶片蒸腾失水实验

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

首先将T₂代OE35种子直接播种于土里(蛭石:营养土＝1:1)，待生长3～5天后移苗，移苗要求32穴空育苗盘每穴移苗1棵，短光照生长7～9周。注意植株所生长的所有过程(包括萌发)都在短日照条件下(8h光照/16h黑暗)以获得更多的拟南芥莲座叶，另外环境湿度保持在60％左右。其次是测量单位时间内叶片丢失的水分。测量前，用保鲜膜将除地上部分以外都严密包上，并在外面缠上多层透明胶带，以防止叶片以外的水分丢失。测量时T₂代OE35植株未抽薹。每一个测量天平放2～3棵植株，每隔5min自动读数，连续24个小时。测量天平的光照周期与植株在培养时期的光照周期严格一致。再次是计算叶片面积。将每个天平上的植株叶片全部剪下来(不要叶柄)，仔细摆在白纸上，扫描，计算叶片总面积。最后数据整理。叶片蒸腾速率(气孔导度)(mmol·m^-2·s^-1)＝Δm×10³÷(18×总叶面积×Δt)，m为质量，t为时间，Δm为Δt内的质量变化量。第一个时间点的叶片蒸腾速率来自1h内12点的均值，以此类推。最后利用Excel得到T₂代OE35在相邻的两个黑夜一个白天共24h内整株叶片蒸腾速率的曲线图(图6)。

按照上述方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代OE42、T₂代VC、chyr1-1、chyr1-2和col，分别得到T₂代OE42、T₂代VC、chyr1-1、chyr1-2和col在相邻的两个黑夜一个白天共24h内(即一个光照周期)整株叶片蒸腾速率的曲线图(图6)。

结果显示，T₂代VC和col的结果基本一致，T₂代OE35和T₂代OE42的叶片蒸腾速率在24h内均低于T₂代VC的叶片蒸腾速率，chyr1-1和chyr1-2的叶片蒸腾速率在24h内均高于col的叶片蒸腾速率。

本实施例的结果表明，转CHYR1基因拟南芥的抗旱性增强，叶片经ABA处理后产生的ROS明显增多，气孔可以更快地响应ABA诱导的气孔关闭，并且叶片蒸腾速率降低。在CHYR1基因缺失的拟南芥突变体中，则有相反的结果：抗旱性降低，叶片经ABA处理后产生的ROS明显减少，气孔不能快速响应ABA诱导的气孔关闭，并且叶片蒸腾速率升高。表明，CHYR1基因可以提高拟南芥的抗旱性。

实施例3、CHYR1^T178D可以提高拟南芥的抗旱性

将把序列3的第178位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质命名为CHYR1^T178A，编码该蛋白质的DNA分子为将序列2第153-1028位中的第684-686位的核苷酸(即act)突变为gct得到的DNA分子，将该DNA分子命名为CHYR1^T178A基因；将把序列3的第178位的苏氨酸突变为天冬氨酸得到的蛋白质命名为CHYR1^T178D，CHYR1^T178D的序列如序列5所示，编码该蛋白质的DNA分子为将序列2第153-1028位中的第684-686位的核苷酸(即act)突变为gat得到的DNA分子，将该DNA分子命名为CHYR1^T178D基因，CHYR1^T178D基因的序列如序列4所示。

一、转基因植株的构建

将载体pGKX的Bam HI和Xho I识别序列间的片段替换为CHYR1^T178A基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pGKX-CHYR1^T178A，pGKX-CHYR1^T178A表达将序列3的第178位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质。将pGKX-CHYR1^T178A导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中，得到含有pGKX-CHYR1^T178A重组菌，将其命名为重组农杆菌pGKX-CHYR1^T178A。

将载体pGKX的Bam HI和Xho I识别序列间的片段替换为CHYR1^T178D基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pGKX-CHYR1^T178D，pGKX-CHYR1^T178D表达将序列3的第178位的苏氨酸突变为天冬氨酸得到的蛋白质。将pGKX-CHYR1^T178D导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中，得到含有pGKX-CHYR1^T178D重组菌，将其命名为重组农杆菌pGKX-CHYR1^T178D。

按照实施例1步骤2的转基因拟南芥的构建方法，将重组农杆菌X分别替换为重组农杆菌pGKX-CHYR1^T178A和pGKX-CHYR1^T178D，其他步骤均不变，分别得到T₂代转CHYR1^T178A基因拟南芥种子和T₂代转CHYR1^T178D基因拟南芥种子。

将60粒T₂代转CHYR1^T178A基因和CHYR1^T178D基因拟南芥种子消毒种于含有卡那霉素的MS培养基筛选，3周后统计抗Kan与不抗Kan的比值，符合3:1为单拷贝家系。按照实施例1中qRT-PCR的方法检测单拷贝家系的植株中CHYR1^T178A基因和CHYR1^T178D基因在mRNA水平上的表达水平，结果如图7中C所示，A5、A32、A9和A34中CHYR1^T178A基因有高表达，D30、D42、D21和D10中CHYR1^T178D基因有高表达。

二、转CHYR1^T178A基因拟南芥和转CHYR1^T178D基因拟南芥的抗旱性检测

1、干旱耐受性实验

按照实施例2步骤1的方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代VC、A5、A32、A9、D30、D42和D21，其他步骤均不变，分别得到T₂代VC、A5、A32、A9、D30、D42和D21经干旱处理后的存活率(图7中A)。

结果显示，T₂代VC、A5、A32、A9、D30、D42和D21经干旱处理后的存活率分别为52±8％、13±11％、12±15％、28±11％、88±8％、98±8％和85±7％，利用t-test进行显著性检验，A5、A32和A9的存活率均极显著低于T₂代VC的存活率，D30、D42和D21的存活率均极显著高于T₂代VC的存活率。表明，CHYR1^T178D基因可以提高拟南芥的抗旱性(即干旱耐受性)，而CHYR1^T178A基因不可以提高拟南芥的抗旱性。

2、ABA诱导ROS产生实验

按照实施例2步骤2的方法，将T₂代OE35分别替换为T₃代VC、A5、A32、A9、A34、D30、D42、D21和D10，其他步骤均不变，观察T₂代VC、A5、A32、A9、A34、D30、D42、D21和D10叶片中ABA诱导的ROS(图7中B)。

结果显示，D30、D42、D21和D10叶片经ABA处理后产生的ROS明显多于T₂代VC叶片经ABA处理后产生的ROS，而A5、A32、A9和A34叶片经ABA处理后产生的ROS明显少于T₂代VC叶片经ABA处理后产生的ROS。

3、气孔对ABA的响应实验

按照实施例2步骤3中的ABA促进气孔关闭实验方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代VC、A5、A32、A9、A34、D30、D42、D21和D10，其他步骤均不变，得到ABA促进T₂代VC、A5、A32、A9、A34、D30、D42、D21和D10气孔关闭实验的气孔开度(图7中C)。CHYR1^T178A和CHYR1^T178D四个转基因株系的气孔开度均值显示了在ABA处理前后气孔开度的变化趋势如图7中E所示。

结果显示，在不同的ABA处理时间下D30、D42、D21和D10的气孔开度均极显著小于T₂代VC的气孔开度，在ABA处理1小时时，A5、A32、A9和A34的气孔开度与T₂代VC的气孔开度基本无差异，在ABA处理2小时和2.5小时时，A5、A32、A9和A34的气孔开度均极显著大于col的气孔开度。

按照实施例2步骤3中的ABA抑制光诱导的气孔开放的实验方法，将T₂代OE35分别替换为T₂代VC、A5、A32、A9、A34、D30、D42、D21和D10，其他步骤均不变，得到ABA抑制光诱导的T₂代VC、A5、A32、A9、A34、D30、D42、D21和D10气孔开放实验的气孔开度(图5)。

结果显示，在ABA处理后，D30、D42、D21和D10的气孔开度均极显著减小，A5、A32、A9和A34的气孔开度均极显著增大。

以上结果表明，CHYR1^T178D基因可以使拟南芥的气孔更快地响应ABA诱导的气孔关闭，而CHYR1^T178A基因没有该功能。

4、叶片蒸腾失水实验

按照实施例2步骤3的方法，将T₂代OE35分别替换为A5、A32、D30和D42，分别得到A5、A32、D30和D42在相邻的两个黑夜一个白天共24h内(即一个光照周期)整株叶片蒸腾速率的曲线图(图6)。

结果显示，D30和D42的叶片蒸腾速率在24h内均低于col的叶片蒸腾速率，A5和A32的叶片蒸腾速率在24h内均高于col的叶片蒸腾速率。

本实施例的结果表明，转CHYR1^T178D基因拟南芥的抗旱性增强，叶片经ABA处理后产生的ROS明显增多，气孔可以更快地响应ABA诱导的气孔关闭，并且叶片蒸腾速率降低；而在转CHYR1^T178A基因拟南芥中，则有相反的结果：抗旱性降低，叶片经ABA处理后产生的ROS明显减少，气孔不能快速响应ABA诱导的气孔关闭，并且叶片蒸腾速率升高。表明，CHYR1^T178D基因可以提高拟南芥的抗旱性，而CHYR1^T178A基因没有该功能。

实施例4、CHYR1基因的表达模式

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1、逆境胁迫诱导下CHYR1基因的表达模式

将在MS培养基上生长3周的col植株分别经过100μM ABA、干旱、4℃低温以及250mMNaCl进行处理，处理时间分别为0分钟(未处理对照)、10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、5小时、10小时和24小时。col经不同处理后按照实施例1中qRT-PCR的方法检测整株中CHYR1基因的表达量。其中100μM ABA和250mM NaCl处理方法为相应浓度的溶液浸泡拟南芥幼苗；干旱处理是指在常温、台面上将拟南芥幼苗放在滤纸上进行干旱处理；4℃低温处理是指将在MS培养基上生长3周的野生型拟南芥放入4℃的培养箱中进行低温处理。

结果如图8所示，CHYR1基因在ABA、干旱、低温和盐等逆境胁迫的诱导下均有上调表达，CHYR1基因受干旱和ABA处理后上调表达更加强烈。

2、CHYR1基因在组织器官水平上的表达模式

扩增CHYR1的起始密码子ATG上游的1.5kb的DNA序列(如序列表中序列4)作为推测的启动子区，将其命名CHYR1基因启动子。将pGK-GUS载体(Qin F,Sakuma Y,Tran LS,Maruyama K,Kidokoro S,et al.(2008)Arabidopsis DREB2A-interacting proteinsfunction as RING E3ligases and negatively regulate plant drought stress-responsive gene expression.Plant Cell 20:1693-1707.)的HindIII和EcoRI识别序列间的片段替换为序列4所示的DNA分子(即CHYR1基因启动子)，得到重组载体，将该重组载体命名为重组载体V，重组载体V中由CHYR1基因启动子启动表达GUS报告基因。将重组载体V导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中，得到含有重组载体V重组菌，将其命名为重组农杆菌V。按照实施例1步骤2的转基因拟南芥的构建方法，将重组农杆菌X替换为重组农杆菌V，其他步骤均不变，得到转重组载体V拟南芥。鉴定转重组载体V拟南芥，得到阳性转重组载体V拟南芥。

将阳性转重组载体V拟南芥萌发中的种子、生长3周的拟南芥幼苗、叶片以及花序进行GUS染色，显微镜下观察组织染色情况，并拍照记录，如图9所示，CHYR1基因启动子可以启动GUS报告基因在表皮和气孔中表达，表明，在野生型拟南芥中，CHYR1基因在表皮和气孔中表达。图9中n图为ABA处理的植株，其他均为正常生长的植株。

3、ABA的合成以及ABA的信号传导对CHYR1基因表达模式的影响

为了研究CHYR1基因受ABA和干旱的诱导表达是否依赖ABA的合成以及ABA的信号传导。将ABA突变体在MS培养基上生长3周，经过100μM ABA或者干旱处理不同时间后，按照实施例1中qRT-PCR的方法检测整株中CHYR1基因表达(其中ABA和干旱处理方法同步骤1，干旱处理时间为0分钟、20分钟、30分钟和40分钟，ABA处理的时间为0小时、2小时和3小时)。实验中用到的ABA突变体有：nced3-2、aba2-1、abi1-1、abi2-1、abi3-8、abi4-2、abi5、snrk2.2、snrk2.3、snrk2.6、2.2/2.3、2.2/2.6和2.2/2.3/2.6。其中，abi1-1、abi2-1的遗传背景为Ler生态型拟南芥,aba2-1、nced3-2、abi3-8、abi4-2、abi5的遗传背景为Col生态型拟南芥，将Ler和Col生态型拟南芥同时作为对照。

结果如图10所示，表明CHYR1基因的表达依赖ABA合成，也依赖于ABA信号传导以及SnRK2s(即SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6)的活性。

4、CHYR1的亚细胞定位

将载体pGK-CsGFP(Qin F,Sakuma Y,Tran LS,Maruyama K,Kidokoro S,et al.(2008)Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3l igases andnegatively regulate plant drought stress-responsive gene expression.PlantCell 20:1693-1707.)的BamHI和XhoI识别序列间的片段替换为序列2的第153-1025位所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为重组载体G，重组载体G表示序列3所示CHYR1与GFP的融合蛋白。

将重组载体G导入col的原生质体中，得到重组细胞G。在共聚焦显微镜下观察重组细胞G，观察CHYR1与GFP的融合蛋白在拟南芥原生质体细胞中的定位，发现CHYR1与GFP的融合蛋白在拟南芥原生质体的细胞质和细胞核中均有表达。

将重组载体G与表达内质网(ER)Marker蛋白HDEL融合mCherry荧光蛋白的pBI221载体(Chen PY,Wang CK,Soong SC and To KY(2003)Complete sequence of the binaryvector pBI121and its application in cloning T-DNA insertion from transgenicplants.Mol.Breed.11:287-293.)导入col的原生质体中，在共聚焦显微镜下观察CHYR1与GFP的融合蛋白与HDEL-mCherry在拟南芥原生质体细胞中的定位，发现CHYR1-GFP与HDEL-mCherry在ER上有共定位(图11)。用DREB2A-GFP作为荧光定位于细胞核的对照，DREB2A是转录因子，定位细胞核。

5、CHYR1的组织定位

将步骤4的重组载体G导入根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中，得到含有重组载体G重组菌，将其命名为重组农杆菌G。按照实施例1步骤2的转基因拟南芥的构建方法，将重组农杆菌X替换为重组农杆菌G，其他步骤均不变，得到转重组载体G拟南芥。鉴定转重组载体G拟南芥，得到阳性转重组载体G拟南芥。

观察阳性转重组载体G拟南芥(图12)，发现CHYR1主要在侧根和侧根生长点、根尖、叶脉以及气孔保卫细胞中有较强的表达。

按照步骤1的方法，将阳性转重组载体G拟南芥经过100μM ABA处理2小时后，观察CHYR1的定位情况(图12)，结果发现CHYR1仍定位在气孔保卫细胞中。

Claims

1.蛋白质，为序列表中序列5所示的蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述C1）至C8）中的任一种：

C1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体；

C4）含有C2）所述表达盒的重组载体；

C5）含有C1）所述核酸分子的重组微生物；

C6）含有C2）所述表达盒的重组微生物；

C7）含有C3）所述重组载体的重组微生物；

C8）含有C4）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：C1）所述核酸分子为如下a1）或a2）：

a1）核苷酸序列是序列表中序列4的第153-1028位的cDNA分子或DNA分子；

a2）核苷酸序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物抗旱性中的应用；所述植物为拟南芥。

5.下述H1或H2的应用：

H1、抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用；所述抗旱相关蛋白为序列表中序列3所示的蛋白质；

H2、与H1中所述抗旱相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；

与H1中所述抗旱相关蛋白相关的生物材料，为下述D1）至D8）中的任一种：

D1）编码所述抗旱相关蛋白的核酸分子；

D2）含有D1）所述核酸分子的表达盒；

D3）含有D1）所述核酸分子的重组载体；

D4）含有D2）所述表达盒的重组载体；

D5）含有D1）所述核酸分子的重组微生物；

D6）含有D2）所述表达盒的重组微生物；

D7）含有D3）所述重组载体的重组微生物；

D8）含有D4）所述重组载体的重组微生物；

所述植物为拟南芥。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：D1）所述核酸分子为如下b1）或b2）：

b1）核苷酸序列是序列表中序列2的第153-1028位的cDNA分子或DNA分子；

b2）核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子。

7.下述M1或M2的方法：

M1、一种培育抗旱性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因或权利要求5所述应用中所述抗旱相关蛋白的编码基因得到抗旱性高于所述受体植物的抗旱性转基因植物；

M2、一种培育抗旱性植物的方法，包括对目的植物的基因组进行基因组编辑，将目的植物基因组中对应于权利要求5所述应用中所述抗旱相关蛋白中的第178位的苏氨酸的密码子突变为天冬氨酸的密码子，得到抗旱性高于所述目的植物的抗旱性植物；

所述植物为拟南芥。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因为权利要求3的a1）或a2）所示的基因；权利要求5所述应用中所述抗旱相关蛋白的编码基因为权利要求6的b1）或b2）所示的基因。

9.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述生物材料、权利要求5所述应用中所述抗旱相关蛋白或权利要求5或6所述应用中所述生物材料的下述X1- X3中的任一应用：

X1、在培育抗旱性植物中的应用；

X2、在调控植物气孔开放和/或关闭中的应用；

X3、在调控植物蒸腾速率中的应用；

所述植物为拟南芥。