KR100845279B1

KR100845279B1 - 중금속이나 염 축적성, 또는 중금속, 염 또는 건조에 대한내성을 변화시키는 유전자 및 이들을 이용하여 제조한형질전환체

Info

Publication number: KR100845279B1
Application number: KR1020060118652A
Authority: KR
Inventors: 이영숙; 송원용; 김도영; 심동환; 전병욱
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2008-07-09
Also published as: JP4648352B2; US7692060B2; KR20080048368A; JP2008131929A; US20080127366A1

Abstract

본 발명은 중금속이나 염에 대한 내성 및 축적성을 변화시킬 수 있는 유전자 또는 염이나 건조 저항성을 변화시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이로부터 제조되는 형질전환체에 관한 것이다. 상기 중금속 내성이나 축적성을 변화시킬 수 있는 유전자는 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 단백질을 암호화하는 서열을 가진다. 상기 중금속 축적성이나 중금속, 염 또는 건조에 대한 내성을 변화시키는 유전자는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열을 가진다. 또한, 상기 건조 저항성을 변화시키는 유전자는 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프(Geranylgeranylation motif))을 가진 단백질을 암호화하는 서열로 이루어진 군에서 선택된다.

중금속, 형질전환, 재조합 벡터, 증산작용, 환경정화, 환경복원, 안전한 작물

Description

중금속이나 염 축적성, 또는 중금속, 염 또는 건조에 대한 내성을 변화시키는 유전자 및 이들을 이용하여 제조한 형질전환체{GENES THAT ALTER CAPACITY TO ACCUMULATE HEAVY METALS AND SALTS OR RESISTANCE TO HEAVY METALS, SALTS OR DROUGHT, AND TRANSFORMANTS EXPRESSING THE GENES}

도 1은 20개의 막 관통 도메인의 세포막에서의 배치를 보여주는 TaTM20의 구조(A), 3차원 도메인들이 서로 상호작용하여 모여 있는 형상을 도시한 도면(B), 및 상기 TaTM20에서 반복되는 서로 유사한 생체막 관통 도메인 서열(검은 막대기)과 프로테인 카이네이즈 씨 포스포릴레이션(protein kinase c phosphorylation) 모티프와의 상동성을 보여주는 도면(C)이고,

도 2는 TaTM20 단백질이 식물의 세포막에 존재한다는 것을 보여 주는 사진으로, GFP(녹색형광 단백질)-TaTM20 융합 단백질이 식물의 세포막에 발현됨을 녹색형광을 통해 알아냈고(A), GFP 항체를 사용해서 웨스턴 블롯(Western blot)으로 이 GFP-TaTM20 융합 단백질의 위치가 세포막임을 재확인(B)한 것이고,

도 3은 식물 원형질체에서 발현된 GFP-AtPDR8 융합 단백질이 세포막에 위치함을 녹색형광을 통해 나타낸 사진(A)과 이 융합 단백질의 위치를 GFP 항체를 사용해서 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인(B)한 것이고,

도 4는 애기장대 식물에서 AtPDR8 유전자의 발현위치를 GUS 표지유전자를 통해 분석한 것으로 AtPDR8 유전자의 프로모터(Promoter)와 GUS를 융합시킨 유전자는 뿌리와 줄기에 모두 발현되고 특히, 외피 세포 (Epidermal cell)에서 강하게 발현함을 보여준 것이고,

도 5는 효모에 TaTM20을 과발현시키면 카드뮴 내성이 향상된다는 것을 보여주는 사진이고,

도 6은 완전한 크기의 TaTM20만이 카드뮴 저항성에 관여한다는 것을 증명한 것으로, N-말단과 C-말단을 제거한 단백질이 발현된 효모는 카드뮴 내성이 야생종과 차이 없음을 나타내고(A), (A)에서 보여준 유전자 조각들이 효모에서 실제로 발현됨(B)을 보여주는 것이고,

도 7은 카드뮴을 처리하면 밀의 잎과 뿌리에서 TaTM20의 발현이 증가한다는 것을 RT-PCR (A)과 realtime-PCR (B)로 분석한 결과이고,

도 8은 TaTM20 형질전환 애기장대들이 카드뮴에 대한 내성이 향상 됐다는 것을 보여주는 도면으로, 형질전환체에서 TaTM20 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 것이고(A), TaTM20 유전자를 발현하는 형질전환체들을 카드뮴을 포함하는 배지에서 성장 시켰을 때, 야생종에 비해 카드뮴 내성이 향상됨을 보여주는 사진(B)과 생체 중량과 뿌리길이를 측정한 도표(C, D)이고,

도 9는 애기장대에 카드뮴, 납 또는 구리를 처리하였을 때 AtPDR8 유전자의 발현이 증가됨을 노던 블롯(A)과 RT-PCR(B)로 확인한 것이고,

도 10은 AtPDR8 과발현 애기장대 형질전환체가 카드뮴과 납에 대한 내성이 향상되었음을 보여주는 도면으로, AtPDR8 과발현 형질전환 애기장대에서 AtPDR8 유전자의 발현을 RT-PCR 로 확인(A)하고, 이들을 카드뮴 및 납이 함유된 배지에서 재배하였을 때의 생장(B), 생체 중량(C), 뿌리 길이(D)를 보여준 도표이고,

도 11은 AtPDR8 발현이 감소된 형질전환 애기장대는 카드뮴에 매우 민감하다는 것을 보여주는 도면으로, AtPDR8-RNAi로 형질전환된 식물체들의 AtPDR8 유전자 발현 정도를 RT-PCR로 확인하고(A), 이들 형질 전환 식물체를 카드뮴이 함유된 배지에서 배양하였을 때의 생장(B), 엽록소 함량(C), 생체중량(D)을 보여주며, 그리고 이들의 카드뮴에 대한 민감성을 야생종과 AtPDR8이 완전히 결핍된 식물체와 비교(E)한 것이고,

도 12는 TaTM20이 과발현된 효모에서 글루타티온(Glutathione) 합성 저해제인 BSO를 처리하여 세포 내 글루타티온(Glutathione)이 감소된 조건에서도 TaTM20에 의해 증가한 카드뮴 내성이 유지된다는 것을 보여주는 것이고,

도 13은 AtPDR8의 과발현 식물 (PDR8-1), 야생종 (wt), 저발현 식물체 (8i-2)를 글루타티온 합성 저해제인 BSO와 카드뮴을 처리한 조건에서 배양하였을 때 AtPDR8에 의해 변화한 카드뮴 내성이 유지된다는 것을 생장(A, B, C)과 생체 중량과 뿌리길이(D)를 측정하여 보여주는 결과이고,

도 14는 TaTM20 형질전환 효모는 카드뮴을 적게 흡수하고, 배출을 잘 한다는 것을 보여주는 도면으로, 효모 내 카드뮴 함량을 카드뮴 동위원소 및 원자흡광광도계(Atomic Absorption Spectrometry)를 사용하여, 야생종과 TaTM20 형질전환 효모의 카드뮴 흡수(A, C) 및 배출(B) 정도를 측정한 결과(C)를 보여주고,

도 15는 AtPDR8은 식물체 내 카드뮴 함량을 감소시킨다는 도면으로, 과발현 식물 (PDR8-1), 야생종 (wt), 저발현 식물체 (8i-2) 내의 카드뮴 함량을 원자흡광광도계 (A) 및 카드뮴 동위원소 (B)를 사용하여 측정한 결과를 보여주는 도표이고,

도 16은 AtPDR8이 식물 세포로부터 카드뮴의 배출을 향상시킨다는 도면으로, 과발현 식물 (PDR8-1), 야생종 (wt), 저발현 식물체 (8i-2)로부터 분리한 원형질체(Protoplast)들을 카드뮴 동위원소를 포함한 배지에 두었을 때 세포 내 카드뮴 함량의 변화를 측정한 결과를 보여주는 것이고(A, B),

도 17은 AtPDR8이 식물의 염저항성과 건조저항성을 향상시킨다는 것을 보인 도면으로, 과발현 식물 (PDR8-1), 야생종 (wt), 저발현 (8i-2), 결핍 돌연변이 (P8 ko-1) 식물을 배양했을 때 식물체 내의 염의 함량을 보여주는 결과(A)와 과량의 염이 함유된 배지에서의 과발현 식물의 생장행태(B) 및 뿌리길이(C) 그리고 건조 스트레스 조건(D, E, F)에서 배양하였을 때의 식물의 생장형태 (D, F) 및 생체중량 (E)을 보여주는 결과이고,

도 18은 애기장대에서 Rop2 유전자가 잎의 공변세포에서 강하게 발현된다는 것을 보여주는 사진으로 RT-PCR과 Rop2 promoter::GUS를 통해 분석한 결과이고,

도 19는 돌연변이 Rop2 유전자로 형질전환 되거나 Rop2 유전자가 발현되지 않는 애기장대 식물들의 빛에 의한 기공 열림 운동을 비교한 도면으로, 활성형 Rop2(CA-Rop2)를 발현하는 식물은 야생종(wt)에 비해 기공 열림이 느리고 조금 열리며, 비활성형 Rop2(DN-Rop2)를 발현하는 식물은 더 빨리 더 많이 열리며(A), Rop2를 발현하지 않는 식물은 기공을 더 빨리 더 많이 여는 것을(B) 보여주는 결과이고,

도 20은 돌연변이 Rop2 유전자로 형질전환된 애기장대 식물들의 ABA에 의한 기공 닫힘 운동을 비교한 도면으로, 활성형 Rop2(CA-Rop2)를 발현하는 식물은 야생종(wt)에 비해 기공 닫힘이 느리고 조금 닫히며, 비활성형 Rop2(DN-Rop2)를 발현하는 식물은 더 빨리 더 많이 닫히는 것을 보여주는 도면이고,

도 21은 AtPDR7이 염 스트레스 저항성에 관여한다는 것을 보인 도면으로 AtPDR7 결핍 돌연변이 식물을 과량의 염이 함유된 조건에서 배양하였을 때 야생종에 비해 덜 자란다는 것을 보여주는 결과이다.

[발명이 속하는 기술 분야]

본 발명은 중금속이나 염 내성 또는 축적성을 변화시킬 수 있는 유전자, 및 이들 유전자를 이용하여 제조된 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 중금속이나 염에 대한 내성이나 축적성을 변화시키는 유전자 및 이들 유전자와 염이나 건조 저항성을 향상시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환체 및 중금속, 염, 건조에 대한 내성이 우수하거나 중금속을 효과적으로 제거 또는 축적할 수 있는 형질전환 식물과 중금속 흡수가 감소된 형질전환 식물, 상기 식물들을 이용한 환경정화방법 및 안전한 작물 개발에 관한 것이다.

[종래기술]

중금속은 주된 환경오염 인자로 반응성 산소종(reactive Oxidation Species)의 생성, DNA 손상 및 세포내 여러 단백질과 효소의 비활성화를 야기한다.

과거 수십 년 간 산업화가 진행됨에 따라 중금속에 의한 환경오염이 급격히 증가하였다. 1990년 초에는, 연평균 방출량이 카드뮴 22,000톤, 구리 954,000 톤, 납 796,000톤, 아연 1,372,000톤에 이르렀다(Alloway BJ & Ayres DC(1993) Principles of environmental pollution. Chapman and Hall, London). 또한 중금속에 오염된 토양은 식물의 정상적인 성장을 저해하고, 곡물의 오염을 야기하여 인간의 건강을 위협하고 있는 실정이다.

전 세계적으로 중금속을 토양으로부터 제거하기 위한 연구들이 진행되었다. 일반적인 방법은 물리적 또는 화학적인 방법으로, 오염된 부위를 직접 제거 또는 묻어버리거나, 알칼리 용액을 이용하여 고정하거나 여과하는 방법들이 이에 속한다(Salt DE, Blaylock M, Kumar NPBA, Viatcheslav D, Ensley BD, et al.(1995). Phytoremediation : a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Bio-Technology 13,468-74; Raskin I, Smith RD, Salt DE.(1997) Phytoremediation of metals: using plants to remove pollutants from the environment. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 221-6). 그러나 이러한 방법들은 비용이 많이 들고, 막대한 에너지가 소요된다는 문제점이 있다.

반면에 식물환경 정화기술(Phytoremediation)은 식물을 이용한 환경정화법으로 중금속을 제거하는데 매우 효율적이며 경제적이고 환경친화적인 방법으로, 식물추출(phytoextraction), 뿌리여과(rhizofiltration) 및 식물안정화(phytostabilization)의 세 가지 방법을 포함한다. 식물추출(phytoextraction)은 중금속을 축적할 수 있는 능력을 갖고 있는 식물을 이용하여 토양으로부터 중금속을 제거하는 방법이고, 뿌리여과(rhizofiltration)는 식물의 뿌리를 이용하여 오염된 수질로부터 오염 물질을 제거하는 방법이며, 식물안정화(phytostabilization)는 식물을 이용하여 토양에 있는 독성 물질을 비활성화 시키는 방법이다(Salt DE et al., Biotechnology 13(5):468-474, 1995).

식물환경정화기술의 일례로써 라레아 트리덴타타(Larrea tridentata) 식물을 사용하여 구리, 니켈 및 카드뮴을 정화하는 방법(미국 특허 제 5,927,005호), 배추과(Brassicaceae family)의 식물을 이용한 방법(Baker et al., New Phytol. 127:61-68, 1994) 등이 보고되었다.

또 다른 방법으로 중금속에 저항성을 갖게 할 수 있는 유전자를 식물체에 도입하여 형질전환된 식물을 이용한 식물환경정화기술이 가능할 것으로 예측되고 있다. 중금속에 저항성을 향상시키는 식물 유전자로는 AtATM3 (ABC transporters of mitochondria), CAX2 (Calcium exchanger 2), 사이토크롬 P450 2E1, NtCBP4 (Nicotiana tabacum calmodulin-binding protein), GSHII (glutathione synthetase), AtPcr1 (plant cadmium resistance), AtPDR12 (pleiotropic drug resistance) 또는 MRT 폴리펩타이드 (metal-regulated transporter polypeptide)가 알려져 있다. AtATM3는 ABC-type 수송체로서 과발현 형질전환 식물이 카드뮴과 납에 대한 저항성이 향상되며, 식물체 내 카드뮴 함량을 증가시키는 것으로 보고되었으며(Kim et al., Plant Physiol. 140:922-932, 2006), CAX2는 카드뮴, 망간과 같은 중금속을 식물체 내에 축적하며(Hirschi KD et al., Plant Physiol. 124:125-134, 2000), 사이토크롬 P450 2E1은 트리클로로에틸렌 (TCE)등의 유기물질을 식물 내에 받아들여 분해하는 것으로 보고되어 있다(Doty SL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6287-6291, 2000). NtCBP4는 형질전환 식물체에서 니켈에 대하여 저항성을 나타내고(Arazi T et al., Plant J. 20:171-182, 1999), GSHII는 카드뮴을 식물체 내에 축적하며(Liang Zhu Y et al., Plant Physiol. 119:73-80, 1999), AtPcr1 과발현 식물은 체내 카드뮴 함량을 감소시키는 기작으로 카드뮴에 대한 저 항성을 나타내고(Song et al., Plant Physiol. 135:1027-1039, 2004, 한국 특허출원 제10-2003-0058299호, 미국 특허 출원 10/907,694), AtPDR12 형질전환 식물은 식물로 들어온 납의 양을 감소시킴으로써 납 저항성을 향상시키며(Lee et al., Plant Physiol. 138:827-836, 2005), MRT 폴리펩타이드는 철, 카드뮴, 망간 및 아연과 같은 중금속을 토양으로부터 제거하는 것으로 (미국 특허 제5,846,821호) 알려져 있다.

최근에는 식물의 중금속에 대한 내성 및 축적성을 효과적으로 증가시키기 위해서 식물 유전자뿐만 아니라 효모 및 박테리아로부터 중금속에 대한 내성이나 축적성에 기여하는 유전자를 식물체로 도입하여 식물의 중금속에 대한 내성 및 축적성을 변화시키는 방법이 보고되었다. 그 예로 merB (organomercurial lyase)는 유기 수은 물질을 분해하며(Bizily SP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6808-6813, 1999), 박테리아의 P-type 펌프인 ZntA 유전자를 식물에 과발현 시켜서 카드뮴과 납에 대한 내성이 증가하고 흡수량이 감소한 식물(Lee et al., Plant Physiol. 133:589-596, 2003)을 제조하는 방법 (한국 특허 제0515520호)과 효모의 ABC-type 수송체인 Ycf1 (yeast cadmium factor1) 유전자를 식물에 발현시켜서 카드뮴과 납에 대한 내성과 축적성이 증가한 식물(Song et al., Nat Biotechnol. 21:914-919, 2003)을 제조하는 방법(국제특허 PCT/KR02/01934), 그리고 효모의 MRP-type ABC 수송체를 식물에 발현시켜 형질전환 식물을 제조하는 방법이 보고되었다(한국 특허 제0480843호).

그러나 위에 열거한 중금속 저항성을 나타내는 유전자로 형질전환시킨 식물체는 중금속으로 오염된 토양에서의 성장이 야생종에 비해 개선되었지만, 중금속의 지상부 축적성은 크게 개선되지 못했다. 환경정화용 식물은 오염물질에 대해 내성을 가질 뿐만 아니라 이 오염물질을 지상부로 이동시켜 오염물질을 축적할 수 있는 특성을 가지는 것이 더 이상적이다. 식물의 지하부보다는 지상부를 수확하여 처리하는 것이 훨씬 더 안전하고 경제적이기 때문이다. 지금까지 알려진 중금속 저항성을 나타내는 유전자로 형질 전환된 식물체는 중금속으로 오염된 토양에서의 성장이 야생종에 비해 약간 개선된 경우가 있지만, 효과적으로 중금속을 지하부에서 지상부로 이동시켜 축적하는 식물은 아직 개발되고 있지 못하다.

식물은 물을 흡수할 때 환경에 존재하는 다양한 오염물질을 함께 흡수한다. 그러므로 식물이 물을 더 많이 흡수하여 증산을 하도록 할 수 있다면, 오염된 토양에서 오염물질을 더 빨리 더 많이 식물체내로 축적시킬 수 있다. 이러한 식물들은 야생종에 비해 좀 더 빠른 시간 내에 환경의 오염도를 낮출 수 있어서, 환경정화에 소요되는 시간과 경제적인 비용을 줄일 수 있다.

또한 전 세계적으로 물 부족이 큰 문제가 되고 있으며 사막화가 진행되고 있는 지역도 많다. 이는 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있다. 그러므로 물을 적게 사용하고, 건조한 환경이나 염 농도가 높은 환경에서도 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 절실히 필요하다. 특히 건조한 지역에서 경제적으로 환경정화를 하고자 하는 경우에는, 오염 물질에 대한 내성이 향상되었을 뿐만 아니라, 건조 저항성도 향상된 식물이 이상적이다. 반면 증산작용을 낮출 수 있는 식물들은 건조한 조건에서의 생존에 유리하므로, 환경이 매우 건조한 지역에서의 환경정화나 농업 생산성에 기여할 수 있다.

환경정화용 식물의 경우와는 반대로 작물의 경우에는 오염물질의 흡수를 최 소화시키는 기술의 개발이 필요하다. 작물이 중금속이나 다른 오염물질을 흡수하면 그것을 소비하는 사람과 가축의 건강을 해치기 때문이다. 세포에서 중금속을 제거하는 유전자들을 작물에 발현시킴으로써 중금속 오염으로부터 보다 안전한 작물을 개발할 수 있다. 또한 세포에 중금속을 축적시키는 유전자의 발현을 인위적으로 감소시키거나, 이 유전자를 변형시켜 반대작용을 하도록 만들어 발현시키면, 이 러한 형질전환 식물은 야생종에 비해 중금속 축적이 감소할 것이므로, 이 기술을 안전한 작물의 개발에 이용할 수 있다.

중금속 저항성, 염 저항성, 건조저항성 등을 변화시키는 유전자들은 또한 환경 복원(Rehabilitaton)에도 이용될 수 있다. 환경복원은 인위적으로나 자연적으로 파괴된 자연을 다시 회복시키고 생태계를 다시 구축하여 본래의 상태로 돌리는 것이다. 그러므로 이는 환경을 쾌적하게 할 뿐만 아니라 자연자원을 보존하고 인간이 다른 생물종과 함께 살아갈 수 있는 터전을 마련하는 것이다. 복원 방법으로는 오염물질 제거, 내성식물의 식재, 멸종된 동물들의 재도입이 있다. 이러한 환경복원의 실제 사례로는 쓰레기 매립지로 사용되던 지역에 자생식물과 약용식물을 식재하여 서식식물 종 수를 증가시키고 주민생태교육장과 휴식공간으로 바꾼 대구 수목원이 있다. 생활오수 유입으로 수질이 오염되어 생태계가 훼손된 저수지를 복원하여 자연생태공원으로 바꾼 광주 운천 저수지 사례도 여기에 속한다. 쓰레기 매입지에서는 카드뮴이 침출수로 나오는 경우가 많고, 폐광산 지역은 건조한 경우가 많다. 그러므로 중금속과 건조에 대한 내성이 높은 유전자들은 쓰레기 매립지나 폐광산의 환경복원에 유용하게 사용될 수 있다. 간척지는 염분의 농도가 높으므로 염 저항성 유전자는 간척지의 환경복원에 이용될 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 중금속에 대하여 내성을 가지거나, 중금속 축적성을 변화시키는 유전자, 및 염이나 건조 저항성을 가지거나 염 축적성을 변화시키는 유전자를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 중금속에 대하여 내성이나 축적성을 변화시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 중금속에 대한 내성이나 축적성이 변화된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 중금속에 대한 내성이나 축적성이 변화된 형질전환체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 중금속 오염지를 환경친화적인 공간으로 조성할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 중금속 함량이 감소된 안전한 작물을 개발하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 염이나 건조에 대한 저항성을 향상시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 염이나 건조에 대한 저항성이 향상된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 염이나 건조에 대한 저항성이 향상된 형질전환체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 염 농도가 높은 지역이나 건조한 지역을 환경친화적인 공간으로 조성할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 중금속 내성과 축적성을 가지는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 식물에서 발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열 또는 이 서열과 상동성을 가지는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열, GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열, 및 이들 서열과 상동성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 각각 형질전환된 식물세포를 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 식물에서 발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있고, 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열 또는 이 서열과 상동성을 가지는 서열을 포함하는 발현 카세트를 제조하고, (b) 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, (c) 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 것을 포함하는 중금속 내성 식물의 제조방법을 제공한다.

상기 발현 카세트는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열, GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열, 및 이들 서열과 상동성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 언급하는 "생체막 통과 단백질"은 지질 이중층으로 구성된 생체막을 관통하여 위치하는 단백질을 의미한다. 상기 생체막 통과 단백질은 유사한 생체막 통과 도메인이 4개씩 5번 반복되는 구조를 가진 단백질로, 특히 중금속과 염의 흡수 및 배출에 관여한다. 상기 중금속은 비소, 안티몬, 납, 수은, 카드뮴, 크롬, 주석, 아연, 바륨, 비스무트, 니켈, 코발트, 망간, 철, 구리, 바나듐 등을 포함한다.

본 발명에서 언급하는 "ABC 수송체(ATP-binding cassette transporters)"는 ATP를 분해하여 나온 에너지를 사용하여 물질을 운반하는 수송체로서 세포내로 영양분을 흡수하거나, 독성 물질을 세포 밖으로 운반하는 역할을 하는 단백질을 말한다.

본 발명에서 언급하는 "상동성(homology)"은 핵산(DNA) 또는 단백질 간의 서열 유사성(similarity)을 의미한다.

본 발명에서 언급되는 "발현억제방법 (RNAi)"는 상동성을 가지는 염기서열을 머리핀 구조로 만들어 과발현시켜 해당 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. RNAi는 세포 내에서 바이러스의 방어기작으로 바이러스의 dsRNA를 분해하기 위한 기작이 작동한다. 그 과정은 다음과 같다. 1) Dicer라는 효소가 dsRNA를 잘라내어 21-23 염기 길이의 small-interfering RNA(siRNA)를 생성한다. 2)　Dicer는 잘려진 siRNA가 RNA-induced silencing complex(RISC)와 결합할 수 있도록 도와준다. 3) siRNA가 결합된 RISC는 siRNA의 안티센스 메신저 RNA(mRNA)를 인식하여 잘라낸다. 따라서 siRNA와 안티센스인 mRNA가 분해되는 것이다. 이러한 원리를 이용하여 특정 유전자， 이 발명의 경우에는 특히 AtPDR8의 일부 서열을 이용하여, 그것이 dsRNA를 생성할 수 있도록 디자인한 construct를 형질전환시켜서, AtPDR8의 발현만 감소된 RNAi 형질전환식물을 만들 수 있다. 즉, RNAi는 siRNA가 mRNA의 특이적인 서열을 인식하고 결합하여 mRNA를 분해하는 기작을 이용한 gene silencing 기술이다. 이 때 siRNA는 그 siRNA와 유사한 서열을 가진 다른 유전자들의 mRNA (이 경우에는 AtPDR8과 상동성을 지닌 다른 유전자들이 해당한다) 에도 결합하여 분해시킨다.

본 발명에서 언급하는 "중금속 저항성 단백질"은 중금속의 존재 하에서 생명체의 성장이 억제되지 않도록 매개하는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 언급하는 "염, 건조 저항성 단백질"은 높은 농도의 염이나 건조한 조건하에서 생명체의 성장이 억제되지 않도록 매개하는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 언급되는 "형질전환 식물"은 유전공학적으로 조작된 것으로 외래 DNA 서열을 포함하며, 식물세포, 식물조직 또는 식물체에서 발현가능 하도록 제 작되어 외래 DNA 서열을 발현한다.

본 발명에 따른 중금속 내성과 축적성을 가지는 유전자는 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

상기 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 1의 TaTM20 단백질의 암호화 서열인 것이 바람직하다. 또한 상기 상동성을 가지는 서열은 서열번호: 1의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 내지 95% 또는 90% 내지 99%의 상동성을 가지는 서열이다.

본 발명은 또한 상기 유전자 또는 이 유전자 서열과 상동성을 가지는 서열이 식물에서 발현가능 한 조절인자에 연결된 유전자에 연결된 발현 카세트를 제공한다.

상기 발현 카세트는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 유전자, GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열, 및 이들 서열과 상동성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중금속, 염 및 건조 저항성 및 축적성을 변화시키는 유전자, 또는 염 저항성이나 건조 저항성을 가지는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 3의 AtPDR8 단백질의 암호화 서열인 것이 바람직하다. 또한, 상기 상동성을 가지는 서열은 서열번호: 3의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 내지 95% 또는 95% 내지 99%의 상동성을 가지는 서열이다.

또한 상기 발현 카세트는 식물의 기공 운동을 조절하는 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질(Rop2 단백질)을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 Rop2 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호: 5의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 내지 99%의 상동성을 가진 서열로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 발현 카세트는 프로모터; TaTM20 단백질을 암호화하는 유전자, TaTM20과 AtPDR8 단백질을 암호화하는 유전자 및 TaTM20, AtPDR8, 및 Rop2 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 및 이와 상동성을 가지는 서열을 가지는 유전자; 및 전사종결자를 포함한다. 상기 프로모터로는 식물발현용 프로모터로 CMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, CMV 19S 프로모터, 아그로박테리움 튜메팩시엔스 Ti 플라스미드(Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)의 nos(nopaline synthase) 프로모터, ocs(octopine synthase) 프로모터 및 mas(mannopine synthase) 프로모터 및 공지된 프로모터가 있다.

또한 본 발명의 발현 카세트는 TaTM20, AtPDR8, 또는 Rop2 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 확인하거나 형질전환체를 선별할 수 있는 마커를 더 포함할 수 있다. 표지 유전자로는 카나마이신, 히그로마이신, 젠타마니신 및 블레오마이신 등의 항생제에 대하여 내성을 나타내는 유전자나 GUS(β-glucuronidase), CAT 　(chloramphenicol acetyltransferase), 루시퍼레이즈(luciferase) 또는 GFP(green fluorescent protein) 등을 암호화하는 유전자가 있다. 상기 마커는 발현 카세트와 함께 식물에 전달되어, 특정한 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 형질전환체의 선별을 가능케 한다.

또한, 본 발명은 상기의 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 재조합 벡터는 pGA1535/TaTM20과 pCAMBIA1302/AtPDR8이다. pGA1535/TaTM20는 pGA1535에 35S 프로모터, TaTM20 유전자 및 노팔린 합성효소 전사종결자를 포함하며, pCAMBIA1302/AtPDR8은 35S 프로모터, AtPDR8 유전자 및 노팔린 합성효소 전사종결자를 포함한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 중금속을 전달하는 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열, 상기 생체막 통과 단백질과 ABC 수송체를 암호화하는 서열 및 상기 생체막 통과 단백질, ABC 수송체 및 식물의 기공 운동을 조절하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 전사 및 번역 조절인자에 연결되어 있으며, 상기 인자들에 의해 조절되도록 고안되어 있다.

본 발명의 형질전환체는 식물이며, 바람직하게는 식물, 식물세포 및 식물조직으로, 식물조직은 식물 종자를 포함한다. 상기 식물로는 초본(herbaceous plant) 및 목본식물로, 화훼작물(flowering plants), 원예작물(garden plants), 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채(Brassica campestris, B. napus), 갓(Brassica juncea), 담배(Nicotiana tabacum), 자작나무(Betula platyphylla), 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무(Betula schmidtii)가 대표적이다. 상기 식물은 체세포 배아형성법(somatic embryogenesis), 세포조직 배양법(tissue culture) 및 세포주 배양법(cell line culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 무성번식되는 식물일 수 있다.

형질전환체는 공지된 기술로 제조할 수 있으며, 아그로박테리움 튜메팩신스-매개 DNA 전이(Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transfer)가 대표적이다. 더욱 바람직하게는 전기충격(electroporation), 미세 입자 주입 방법(micro-particle injection) 또는 유전자 총(gene gun)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 제조된 재조합 아그로박테리움을 침지방법으로 식물에 도입하는 것이다.

상기 발현 카세트는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열, 또는 이 서열과 상동성을 가지는 서열을 포함하는 유전자, 및 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열과 이들 서열과 상동성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중금속, 염 및 건조 저항성 및 축적성을 변화시키는 유전자, 또는 염이나 건조 저항성을 가지 는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 형질전환 식물에서 TaTM20 단백질(서열번호: 2) 또는 이들 단백질과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 내지 95%, 가장 바람직하게는 95% 내지 99%의 상동성을 가지는 단백질을 과발현 시키면 중금속에 대한 내성이 증가하고 축적성이 변화된 형질전환체를 얻을 수 있고, AtPDR8 단백질(서열번호: 4) 또는 이들 단백질과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 내지 95%, 가장 바람직하게는 95% 내지 99%의 상동성을 가지는 단백질을 과발현 시키면 중금속 및 염, 건조스트레스에 대한 내성이 증가하고 축적성이 변화된 형질전환체를 얻을 수 있다.

또한 상기 형질전환 식물에서 Rop2 단백질(서열번호: 6) 또는 이들 단백질과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 내지 99%의 상동성을 가진 서열을 RNAi 방법을 써서 저발현시키거나 불활성화 시켜서 발현시키면 정상 조건에서는 식물의 기공이 잘 열려서 증산작용이 활발하게 진행되고 이 증산작용에 의하여 중금속이 지상부로 이동하도록 하는 형질전환체를 얻을 수 있으며, 건조 조건에서는 기공을 빨리 닫음으로써 건조 저항성이 향상된 식물을 얻을 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 형질전환 식물은 중금속을 지하부에서 지상부로 효과적으로 이동시켜 축적할 수 있다. 본 발명에 따른 형질전환 식물은 식물의 기공운동을 조절하는 유전자를 변형시켜 도입하거나 발현 수준을 변화시킴으로써 물과 함께 중금속등 오염물질을 증산의 힘을 통해 지상부로 이동시킬 수 있고 건조 저항성도 향상시킬 수 있다.

상기 TaTM20과 AtPDR8 단백질을 암호화하는 유전자들을 식물 원형질체에 도 입하면 식물의 세포막에서 발현된다. 도 1은 20개 막관통 도메인을 포함하는 TaTM20의 구조를 보인 도면(A)이며 3차원 도메인들이 서로 상호작용하여 모여 있는 형상을 도시(B)한 것이며, TaTM20과 프로테인 카이네이즈 씨 포스포릴레이션(protein kinase c phosphorylation) 모티프와의 상동성을 도시한 도면((C)이다.

따라서, ABC 수송체와 생체막 통과 단백질 유전자로 형질전환된 형질전환체는 중금속으로 오염된 환경에서도 원활히 성장할 수 있어, 중금속의 흡수량이 낮고, 인체에 해롭지 않은 안전한 작물을 제조할 수 있다. 반대로 RNAi등의 저발현 기술을 이용하는 경우, 중금속의 흡수를 높여 토양, 대기, 수질 등으로부터 식물을 이용한 중금속 추출 식물의 제조가 가능하다. 황사나 자연재해 등에 의해 중금속이 원격지로부터 유입되는 경우도 있으므로, 이러한 형질의 작물이 필요하다.

이하 본 발명의 실시 예를 기재한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 식물 재배 조건

야생종과 형질전환된 애기장대, 및 밀(Triticum aestivum L. cv. Atlas 66) 종자를 에탄올과 락스를 이용하여 표면 살균하여 4ㅀC 암 상태에서 2일간 보관한 후, 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 치상하였다. 배지는 수평 또는 수직으로 2-3주간 배양하였다.

실시 예 2: 밀의 뿌리 cDNA 라이브러리에서 카드뮴 저항성 유전자 동정

카드뮴 저항성 유전자를 밀 뿌리 cDNA 라이브러리에서 동정하고자, ycf1-null 효모에 리튬 아세테이트(lithium acetate) 방법을 사용하여 삽입한 후, 기능적 상보성(functional complementation)을 보았다. 60 μM의 염화카드뮴(CdCl₂)이 함유된 배지에서 자라난 세포군체를 선발하여, 플라스미드(plasmid)를 동정하였고, 이의 염기서열을 판독한 후 (서열번호: 1), 이를 다시 ycf1-null 효모에 삽입하여 카드뮴 내성을 재확인하였다. 야생종 효모 (wt) 및 ycf1-null 효모에 빈 벡터 (EV)를 넣은 것과 ycf1-null 효모에 TaTM20 유전자를 포함하는 벡터를 넣고 배지에 배양했을 때, 빈 벡터만을 넣어준 야생종 및 ycf1-null 효모보다 TM20을 넣어준 효모가 카드뮴을 함유하는 배지에서 성장이 우수했다 (도 5). 이는 TM20가 효모에서 카드뮴 내성을 향상시킨다는 것을 보여준다.

실시 예 3: N-말단과 C-말단이 제거된 TaTM20 construct의 제작 및 효모에서 카드뮴 내성 시험

모든 N-말단과 C-말단이 제거된 TaTM20 cDNA는 PCR 생산물의 제한효소 절단을 통하여 생성되었다. ycf1-null 효모에 각각의 유전자를 리튬아세테이트 방법을 통하여 삽입하였으며, 유라실(uracil)이 결핍된 최소배지에서 선발하였다. 카드뮴 저항성 상보실험을 위하여, 각각의 유전자를 가지고 있는 효모를 1/2 SG 배지에 30uM 염화카드뮴을 첨가하여 섭씨 30도에서 3일간 배양하여 관찰하였다. 그 결과, N-말단 및 C-말단이 조금씩 제거된 유전자로 형질전환된 효모의 카드뮴 내성이 빈 벡터만을 넣어준 것과 비슷해진다는 것을 알 수 있었다 (도 6A). 이는 TaTM20에 의 해 나타나는 효모의 카드뮴 저항성은 TM20의 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 막관통 도메인이 존재해야 한다는 것을 의미한다.

실시 예 4 : 형질전환 애기장대의 제조

TaTM20 유전자를 HindIII 제한효소를 사용하여 pYES2:TaTM20 유전자로부터 식물 발현 벡터로 재조합하였다. 유리된 HindIII 조각은 40 염기쌍의 5'쪽의 번역되지 않은 부분과 완전한 2670 염기쌍의 TaTM20 유전자, 109 염기쌍의 3'쪽 번역되지 않은 부분, 그리고 번역 종료 코돈을 포함하고 있다.

pGA1535가 형질전환 애기장대의 제조를 위한 식물 발현 벡터로 사용되었으며, 이것은 CaMV35S 프로모터(promoter)와 다수의 클로닝 장소와 노파린 합성 종결자(nopaline synthetase terminator)를 가지고 있다. 화아침지법(Floral dipping, Clough and Bent, 1988)을 사용하여 pGA1535:TaTM20 유전자를 가지고 있는 아그로박테리움(LBA4404)을 사용하여 애기장대를 형질전환 하였다. 형질전환된 종자는 30 ug/L의 카나마이신 항생제가 포함된 1/2 MS 배지에서 선발되었으며, 생존한 식물들로부터 종자를 채취하였다. 3세대의 동질 접합 종자들이 표현형 분석을 위하여 사용되었다.

AtPDR8 유전자를 애기장대로부터 만든 cDNA를 주형으로 하여 AtPDR8F-SB (5'-TCCCCCGGGGGCGCGGATCCGCGATGGATTACAATCCAAATCTTCC-3') 프라이머와 AtPDR8R -PX (5'-GACACGTGCTCCGCTCGAGCGGTTATCTGGTCTGGAAGTTGAG-3') 프라이머를 사용하여. PCR로 증폭한 후, T-vector 에 넣고, 제한 효소를 사용하여 pCambia1302 바이너리(binary) 벡터에 재조합 하였다. pCambia1302 벡터는 형질전환 애기장대의 제조 를 위한 식물 발현 벡터로 사용되었으며, 이것은 CaMV35S 프로모터(promoter)와 다수의 클로닝 장소와 노파린 합성 종결자(nopaline synthetase terminator)를 가지고 있다.

TaTM20과 동일한 방법으로 pCambia1302:AtPDR8을 가지는 아그로 박테리움(GV3101)을 사용하여 애기장대에 형질전환 하였으며, 형질전환된 종자는 30 ug/L의 하이그로 마이신(hygromycin)을 함유한 1/2 MS 배지에서 선발하여 생존한 식물로부터 종자를 받았다.

실시 예 5 : 카드뮴 내성 검정

야생종과 TaTM20 과발현 애기장대(TM20-1, TM20-2)가 40 또는 60 μM 염화카드뮴이 포함된 1/2 MS배지에서 3주간 배양된 후, 수확하여, 무게와 뿌리 길이를 측정하였다. TaTM20을 과발현하는 식물이 40 또는 60 μM 염화카드뮴이 포함된 1/2 MS배지에서 야생종에 비해 성장이 우수했으며 (도 8A, B), 낮은 농도의 염화카드뮴 (15, 25 μM)이 포함된 배지에서도 TaTM20을 과발현하는 식물의 생체량과 뿌리 길이가 야생종보다 우수하다는 것을 알 수 있었다 (도 8C, D). 이는 TM20가 식물에서 카드뮴 내성을 향상시킨다는 것을 보여준다.

야생종과 AtPDR8 형질전환 애기장대 (과발현 및 발현억제 식물)를 30-50 μM 염화카드뮴이 포함된 1/2 MS 배지에 심고, 2-3주간 세워서 배양한 후, 수확하여 식물의 생체량과 뿌리 길이를 측정하였다. 야생종과 AtPDR8을 과발현 하는 식물 (PDR8-1, -2, -3)을 40 μM 염화카드뮴 및 0.4 mM 질산화 납을 함유하는 배지에서 함께 배양한 결과, AtPDR8 과발현 식물의 생체량과 뿌리 길이가 야생종에 비해 우 수하다는 것을 알 수 있었다 (도 10). 또한 AtPDR8 발현을 억제 식물 (RNAi; 8i-1, -2, -3)과 AtPDR8 결핍 돌연변이 개체 (knock-out; ko-1 and ko-2)를 야생종과 함께 염화카드뮴 및 질산화 납을 함유하는 배지에서 배양한 결과, AtPDR8 발현억제 식물과 AtPDR8 결핍 돌연변이는 카드뮴과 납에 대해 민감했으며 (도 11A, B, E), 식물의 클로로필 함량과 생체량이 크게 감소한다는 것을 알 수 있었다 (도 11C, D). 이는 AtPDR8이 식물에서 카드뮴과 납에 대한 내성을 향상시킨다는 것을 보여준다.

실시 예 6 : 카드뮴 내성 기작 검정

TaTM20과 AtPDR8의 카드뮴 내성 기작이 글루타티온과 관련 있는지를 알아 보기위해서 글루타티온 합성 저해제인 BSO(buthionine sulfoximine)을 사용하여 카드뮴 내성을 조사하였다. TaTM20의 경우, 카드뮴이나 BSO가 들지 않은 배지와 BSO 만을 가지는 배지에서는 빈 벡터만 넣어준 효모와 성장이 비슷하고, 카드뮴을 함유하는 배지에서 TaTM20 형질전환 효모의 카드뮴 저항성이 크게 증가한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 카드뮴과 BSO를 함께 포함하는 배지에 배양했을 때 TaTM20에 의해 나타나는 카드뮴 저항성이 전혀 사라지지 않고 유지된다는 것을 알 수 있었다 (도 12). 이는 기존에 많이 알려진 글루타티온을 매개로하는 카드뮴 저항성 기작과는 다른 기작으로 TaTM20이 효모의 카드뮴 저항성에 기여한다는 것을 의미한다.

AtPDR8의 경우에는 형질전환 식물이 1/2MS나 BSO만을 가지는 1/2MS에서는 야생종과 성장이 비슷하지만 (도 13A) 카드뮴을 포함한 배지에서는 과발현 식물의 성장은 우수하고, 발현억제 식물은 민감한 표현형을 나타낸다 (도 13B). BSO와 함께 카드뮴을 처리한 배지에서 AtPDR8 형질전환 식물과 야생종간의 성장 차이가 사라지지 않고 오히려 더 커진다는 것을 알 수 있다 (도 13C, D) 이 결과는 AtPDR8에 의해 나타나는 카드뮴 저항성이 글루타티온을 매개로 하지 않는 새로운 기작을 통해서 나타날 가능성이 있음을 의미한다.

실시 예 7 : 카드뮴 함량 측정

TaTM20 형질전환 효모의 카드뮴 함량을 측정하기 위해서 효모를 유라실이 빠진 합성 갈락토오스 배지 (SG-ura; synthetic galactose-uracil) 에서 배양한 다음, 10 μM의 염화카드뮴과 1 μM의 방사성 염화카드뮴을 처리하고 각 시간별로 세포를 수확해서 감마선 측정기(gamma-ray counter)로 카드뮴 양을 측정하였다. ycf-null 효모에 빈 벡터만을 넣어 준 것(167V)에 비해서 TaTM20을 넣어준 효모(167TM)의 세포 내 카드뮴 양이 낮았으며(도 14A), 카드뮴 배출정도를 측정한 결과, TaTM20을 넣어준 효모가 보다 빨리 카드뮴을 세포 밖으로 배출한다는 것을 알 수 있었다 (도 14B). 또한 형질전환 효모 세포 내의 카드뮴 함량을 원자흡광광도계 (Atomic Absorption Spectroscopy; AAS)를 사용하여 분석하기 위해서 효모를 20 μM 염화카드뮴이 첨가된 SG-Ura 배지에서 키운 후, 얼음물로 씻은 다음, 11 N 질산으로 세포를 녹이고 카드뮴 함량을 측정하였다. 그 결과, TaTM20으로 형질전환된 효모의 카드뮴 함량이 빈 벡터만을 넣어준 것에 비해 낮다는 것을 알았다. 이 결과들은 TaTM20이 세포 내로 들어온 카드뮴을 세포 밖으로 퍼내어 효모의 카드뮴 저항성을 증가시킨다는 것을 의미한다.

AtPDR8 형질전환 식물체 내 카드뮴 함량을 측정하기 위해서 1/2 MS 에서 2주 간 세워서 배양한 다음, 100 μM의 염화카드뮴을 뿌리에 처리하고, 10시간 동안 배양하였다. 지상부와 뿌리를 각각 분리하여 수확한 후, 찬물에 세척하고 건조하였다. 건조된 식물체는 위와 동일한 방법으로 AAS를 이용하여 카드뮴 함량을 측정하였다. AtPDR8을 과발현하는 식물 (PDR8-1)의 지상부 (shoot)와 뿌리 (root)는 야생종보다 적은 양의 카드뮴을 함유하였으며, AtPDR8 발현을 억제하는 식물 (8i-2)의 지상부와 뿌리는 많은 양의 카드뮴이 축적되어 있다는 것을 알았다(도 15A). 또한, 카드뮴 동위원소를 사용하여 식물체 내 카드뮴 함량을 분석하기 위해서 1/2 MS 에서 10일간 세워서 배양한 식물의 뿌리를 방사성 염화카드뮴이 함유된 배지에 10시간 동안 배양하고 씻어준 다음, 지상부와 뿌리를 분리하여 감마선 측정기로 체내 카드뮴 함량을 분석하였다. 이 결과에서도 야생종에 비해서 AtPDR8 과발현 식물에는 지상부와 뿌리의 카드뮴 함량이 더 낮아지고, AtPDR8 발현 억제 식물의 지상부와 뿌리에는 카드뮴이 더 많이 축적된다는 것을 알 수 있었다.

AtPDR8의 카드뮴 수송능력을 측정하기 위해서 AtPDR8 형질전환 식물의 원형질체에 카드뮴 동위원소를 흡수시켜 세포 내 카드뮴 함량을 측정하였다. 원형질체와 함께 카드뮴 동위원소를 배양하고 각 시간대 별로 원형질체를 수확해서 세포 내 카드뮴 함량을 측정한 결과, 야생종 식물 (wt)에서 얻은 원형질체에 비해서 과발현 식물 (PDR8-1)에서 얻은 원형질체에는 적은 양의 카드뮴이, 그리고 발현억제 식물(8i-2)에서 얻은 원형질체에는 많은 양의 카드뮴이 축적된다는 것을 알 수 있었다 (도 16A). 또한 카드뮴 배출 능력을 알아보기 위해서 원형질체와 카드뮴 동위원소를 함께 배양한 뒤 세포 밖의 카드뮴을 씻어준 후, 각 시간별로 세포 내에 남아 있는 카드뮴을 측정한 결과에서 야생종에 비해 과발현 세포는 카드뮴을 더 빨리, 발현억제 세포는 더 느리게 카드뮴을 배출한다는 것을 알 수 있다 (도 16B). 이 결과들은 AtPDR8은 세포 내로 들어온 카드뮴을 세포 밖으로 퍼내어 식물의 카드뮴 저항성을 증가시킨다는 것을 의미한다.

따라서 AtPDR8을 과발현 시킨 형질전환식물은 카드뮴 및 납을 식물체 밖으로 배출하는 내성기작을 가지고 있어 체내 중금속 함량을 크게 감소시킨 안전한 작물을 만드는 데 이용할 수 있다. 반대로 AtPDR8이나 그와 유사한 유전자의 발현을 감소시킨 형질전환식물은 카드뮴 및 납을 식물체 밖으로 배출하는 작용이 감소되어 체내 중금속 함량을 증가시킨 환경정화용 식물을 만드는 데 이용할 수 있을 것이다.

실시 예 8: 엽록소 함량 측정

카드뮴, 납 등의 중금속에 의한 식물의 독성 현상중의 하나는 잎의 황화 현상이다. 따라서 이런 중금속에 대한 식물의 내성 정도는 엽록소 함량 분석을 통해 알 수 있다. 식물의 엽록소 함량을 측정하기 위하여, 잎을 수득하여 95% 에탄올로 20분간 80℃에서 추출하였다. 추출물은 664 nm와 648 nm에서 흡광도를 측정하여 엽록소 A 및 엽록소 B의 함량을 계산하였다 (Oh SA, Park JH, Lee GI, Paek KH, Park SK, Nam HG (1997) Identification of three genetic loci controlling leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Plant J. 12, 527-35). AtPDR8 발현억제 형질전환식물들 (8i-1,8i-2.8i-3)과 야생형식물을 50 ㅅM 염화카드뮴이 첨가된 배지에서 3주 동안 키운 후 엽록소 함량을 측정한 결과 AtPDR8 발현억제 형질전환식물들의 엽록소 함량이 야생형보다 낮은 것을 알 수 있었다 (도 11C). 이는 AtPDR8 발현이 식물의 카드뮴 저항성에 기여함을 확인해 주는 결과이다.

실시 예 9: 염 및 건조 내성 및 함량 검정

AtPDR8 형질전환 식물의 염 및 건조 스트레스에 대한 내성을 시험하기 위해서 과발현 식물, 야생종 및 발현억제 식물을 배양하여 식물체 내 염 함량을 측정한 결과, 야생종에 비해 과발현 식물은 염을 더 적은 양, 그리고 발현억제 식물은 더 많은 양의 염을 함유한다는 것을 알 수 있었다 (도 17A). 또한, 야생종 및 과발현 식물을 100 mM 염화나트륨을 함유한 1/2 MS 배지에서 3주간 배양한 결과, 뿌리 길이와 잎의 색깔로 보아, 과발현 식물이 야생종에 비해 염 내성이 증가했다는 것을 알 수 있었다 (도 17B,C). 그리고 AtPDR8 형질전환 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 시험하기 위해서 흙에서 4주간 배양한 식물에 계속 물을 주거나 (+) 주지 않고 (-) 2주간 배양하거나 (도 17D), 흙에서 3주간 배양한 식물에 10일간 물을 주지 않은 후, 다시 물을 주고 4일 동안 배양한 식물의 성장을 관찰한 결과 (도 17F), AtPDR8 과발현 식물은 생체량이 야생종보다 높았고, 반면에 발현억제 및 돌연변이 식물의 생체량은 낮았다 (도 17E). 이러한 실험 결과로 AtPDR8 유전자를 높은 수준으로 발현하는 식물은 그렇지 못한 식물에 비해, 염을 체내에 덜 축적하여, 염 저항성과 건조 저항성이 높다는 것을 알 수 있었다.

또한, AtPDR8과 매우 유사한 염기서열을 가지는 AtPDR7이 염 스트레스에 대한 내성에 관여하는지 알아보기 위해서, AtPDR7 결핍 돌연변이 식물 (PDR7 k0-1, -2)의 종자를 1/2MS 및 200 mM 염화나트륨을 함유한 1/2 MS 배지에 심어서 3주간 배양한 결과, 염을 처리하지 않은 조건(1/2 MS)에서는 야생종과 성장 차이가 없었으나, 과량의 염을 처리한 조건에서는 AtPDR7 유전자가 결핍된 돌연변이 식물이 야생종에 비해 매우 민감한 표현형을 나타낸다는 것을 알 수 있었다 (도 21). AtPDR7은 상기 AtPDR8과 염기서열이 80% 정도의 수준으로 동일한 유전자로서 이들 유전자가 각각 결핍된 돌연변이 식물이 염에 대해서 공통적으로 민감한 표현형을 나타내므로, 만약 이러한 정도의 상동성을 가진 유전자들을 식물에 높은 수준으로 발현시키면, 야생종보다 염에 대한 내성이 증가한 식물을 개발할 수 있을 것으로 예상된다.

실시 예 10: GFP::TaTM20 및 GFP::AtPDR8의 애기장대 원형질체로의 도입

TM/GFP-F 프라이머 (5'-AAGAAGCTTATGGAGTGTGGTGGC-GTCTCC G-3')와 TM/GFP-R 프라이머 (5'-TAGAAGCTTAGAACTACACTACAGAGCTG CT-3')를 사용하여, pYES2:TaTM20으로부터 PCR 증폭시킨 cDNA를 이용하여, GFP:TaTM20 융합 유전자를 제조하였다. 증폭된 유전자가 326-GFP 벡터의 HindIII 장소로 삽입된 GFP::TaTM20은 CaMV35S 프로모터 조절 하에 발현된다. 또한 AtPDR8의 경우에는 T-vector에 들어있는 AtPDR8 유전자를 제한효소로 잘라서 326GFP-3G 벡터에 옮겨서 GFP::AtPDR8 을 제조하였다. 플라스미드는 애기장대 원형질체 내로 PEG 매개 형질전환법을 통하여 도입되었다 (Jin et al., 2001). GFP 융합 단백질의 발현은 원형질체에 형질전환 후 16-24 시간 후에 형광현미경으로 관찰하였다. 또한 발현한 단백질의 발현위치를 확인하기 위해 형질전환 시킨 애기장대 원형질체에서 세포질, 세포막 단백질을 각각 분리하여 GFP 항체로 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과를 도 2와 도 3에 도시하였다. 도 2는 식물 원형질체에서 발현된 GFP (녹색형광 단백질)-TaTM20 융합 단백질의 발현위치를 나타낸 사진으로 (A) GFP-TaTM20 단백질이 원형질체의 세포막 (plasma membrane)에 위치한다는 것으로 보여주고 있으며, 발현 위치를 웨스턴 블롯 (Western blot)으로 확인한 경우에도 GFP-TaTM20 단백질이 세포질이 아니라 막 부분에 존재한다는 것을 확인하였다 (B). 도 3은 식물 원형질체에서 발현된 GFP-AtPDR8 융합 단백질의 발현위치를 나타낸 사진 (A)과 발현 국지성을 웨스턴 블롯으로 확인 (B)한 것이다. 이 결과에서 GFP-AtPDR8 단백질은 원형질체의 세포막에 위치한다는 것으로 알 수 있다.

실시 예 11 : RNA 동정

식물의 total RNA는 20일 재배한 밀 또는 2-3주 재배한 애기장대로부터 트리졸 (Trizol)을 사용하여 추출하였다. 식물을 1/2 MS에 2-3주간 배양한 다음, 액체질소를 사용하여 고르게 분쇄한 후, 트리졸을 사용하여 total RNA를 분리하고 이를 노던 블롯, RT-PCR 등에 사용하였다.

실시 예 12: RT-PCR

5 ㅅg의 RNA를 사용하여 cDNA를 Powerscript RT(reverse transcription)-kit (BD Bioscience Clontech)와 oligo dT 프라이머를 사용하여 합성하였다. 2 μl의 cDNA로부터 PCR반응을 수행하였으며, 각각 TaTM20, AtPDR8, AtRop2에 특이적인 프라이머를 사용하였다. 대조구로 밀에서는 G3PDH (glycerolaldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를, 애기장대에서는 베타튜블린(-tubulin)과 액틴(actin)을 사용하였다.

TaTM20 유전자의 중금속에 의한 발현변화를 알기 위해서 밀의 뿌리에 카드뮴을 처리한 다음 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 하여 TaTM20 RTF 프라이머 (5'-AAGGGTTGCTCCTCTTCGCGATCTTG-3')와 TaTM20 RTR 프라이머 (5'-GTACATGCCAG CACCGTATGGATTG-3')를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 카드뮴에 의해서 지상부 (CdS)와, 뿌리 (CdR)에서 TaTM20 유전자의 발현이 증가한다는 것을 보여주고 있다 (도 7A). 뿐만 아니라, real time-PCR을 수행해서 카드뮴에 의해 TaTM20의 발현이 증가됨을 확인하였다 (도 7B).대조구로 TaG3PDHF (5'-CAACGCTAGCTGCACCACTAACT-3') 프라이머와 TaG3PDHR 프라이머 (5'-ACTCCTCCTTGATAGCAGCCTT-3')를 사용하여 G3PDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현을 확인한 결과, 이 유전자는 카드뮴에 의해 변화가 없다는 것을 알 수 있다.

AtPDR8 유전자의 발현 변화를 알기 위해서 애기장대의 뿌리에 카드뮴, 납 및 구리를 처리한 다음, cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 AtPDR8-RTF (5'-CTCTTGATTGGTACAGTCTTCTG-3') 프라이머와 AtPDR8 RTR (5'-CCATAATGGTCCT CAATGTATTGC-3') 프라이머로 PCR을 수행한 결과, 뿌리에서 카드뮴과 납 그리고 구리에 의해서 AtPDR8 유전자의 발현이 크게 증가한다는 것을 알 수 있다 (도 9B). 대조구로 사용한 tubulin 유전자의 발현 (Tub-F (5'-GCTGACGTTTTCTGTATTCC-3'), Tub-R (5'-AGGCTCTGTATTGCTGTG AT-3') 프라이머로 PCR을 수행한 결과, tubulin의 발현은 중금속에 의해 변하지 않는다는 것을 알 수 있다.

공변세포에서의 Rop2 유전자의 발현을 알기 위해서 공변세포와 체세포로부터 각각 cDNA을 얻어서 이를 주형으로 Rop2-forward 프라이머 (5'- CCGATCTTGCGGCAGAGATGGCGTCAAGG-3')와 Rop2-reverse 프라이머 ( 5'-CTTATCACA AGAACGCGCAACGGTTCTTATTC-3)를 사용하여 PCR을 수행하여 공변세포에서 Rop2 유전자의 발현이 높다는 것을 확인하였다(도 18). 대조구로서 actin2 유전자의 발현은 공변세포와 체세포에서 큰 차이가 없다는 것을 알 수 있다 (Actin2-forward, 5' - GGCCGATGGTGAGGATATTCAGCCACTTG-3', Actin2-reverse, 5'-TCGATGGACCTGACTCATCG TACTCACTC-3').

실시 예 13 : 노던 블롯팅

30 ug의 RNA를 포름알데히드 젤에서 전기영동한 후, 나일론 멤브레인으로 옮긴 후, ³²P-dCTP로 표시된 암호서열에 특이적인 PCR 산물을 이용하여 결합하였다. 멤브레인을 씻어준 다음 필름에 노출하여 유전자의 발현정도를 관찰하였다. AtPDR8 유전자에 특이적인 염기조각을 얻기 위해서 PDR8NF 프라이머(5'-AGCCTTGCTTTGTTTCACAG-3')와 PDR8NR 프라이머 (5'-CCCTACTCATTCTCCCCATTG-3',)를 사용하여 PCR로 증폭한 다음, ³²P로 표지하여 AtPDR8 유전자의 발현을 노던 블롯으로 확인한 결과, AtPDR8의 발현이 지상부와 뿌리에서 카드뮴과 납, 구리에 의해 증가한다는 것을 알 수 있다 (도 9A).

실시 예 14: 웨스턴 블롯팅

형질전환 효모와 애기장대로 부터 단백질을 분리하기 위해서 추출 buffer (50 mM Hepes-KOH pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.7 ug/mL pepstain A, 5 ug/mL aprotinin, 20 ug/mL leupeptin, 0.5 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride)를 넣어 잘 섞은 후, 12000 rpm 에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 얻은 뒤 다시 100,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 세포의 막부분과 액상 부분을 분리하였다. 10~50 ug 정도의 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 (nitrocellulose) 막에 전이시킨 다음, 막을 7.5%의 무지방 우유를 포함하는 1x TBST (0.1% Tween 20 in 1x TBS) 용액에 1시간 동안 담구었다. 1x TBST 용액으로 5분 동안 2회 반복하여 씻은 후, 각각의 단백질에 특이한 항체와 3시간 동안 상온에서 반응 시켰다. 그 후 1x TBST 용액으로 15분 동안 세 번 반복하여 씻은 다음, sheep anti-mouse IgG conjugated horshradish peroxidase와 1시간 동안 반응하고, 1x TBST 용액으로 10분씩 3번 씻어주었다. ECL (Amersham pharmacia Biotech) 용액을 사용하여 단백질의 발현 신호를 x-ray 필름으로 감지하였다.

GFP-TaTM20 및 GFP-AtPDR8 단백질을 원형질체에 도입한 다음, 단백질을 분리하고 GFP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 단백질이 세포질 (cytosol, S 또는 C)에 위치하지 않고, 막 부위(membrane, M)에 존재한다는 것을 알 수 있다 (도 2B, 도 3B).

실시 예 15: RNAi 형질전환식물의 제조

AtPDR8의 발현을 억제하는 RNAi(RNA interference) 식물을 만들기 위해서 P8RI-XK 프라이머 (5'-CCGCTCGAGCGGGATGCCTTGCTTTGTTTCACAG- 3')와 P8RI-BXa 프라이머 (5'-GGGGTACCCCCCCTACTCATTCTCCCCATTG-3'.)로 PCR을 한 다음, XhoI-KpnI과 BamHI-XbaI 제한효소를 사용하여 pHannibal 벡터에 삽입한 후, Not I 제한 효소를 사용하여 바이너리 벡터인 pART27 벡터에 클로닝하여 제조하였다. pART27-PDR8i 벡터는 아그로박테리움을 이용하여 애기장대에 형질전환 하여 AtPDR8 RNAi 형질전환 식물을 제조하였다.

실시 예 16: 프로모터-거스 융합 단백질을 이용한 유전자의 발현 조직 결정

MS 배지에서 2주간 배양한 식물을 0.5 mM K₄Fe(CN)₆, 0.5 mM K₃Fe(CN)₆, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 500 mg/ml X-Gluc.를 함유한 100 mM phoaphate buffer에서 24시간 동안 배양하고, 100% 에탄올에 넣어 클로로필을 제거한 다음, 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 AtPDR8 프로모터-GUS는 잎과 뿌리에서 모두 발현이 되고 (도 4A-D), Rop2 프로모터-GUS는 식물의 공변세포에 많이 발현된다는 것을 알 수 있었다(도 18). 또한 잎과 뿌리에서의 발현을 보다 자세히 관찰하기 위해서 염색한 조직을 마이크로톰(Microtome)으로 절단하여 현미경으로 관찰한 결과,AtPDR8 프로모터-GUS 유전자의 발현이 특히 외피 세포 (Epidermal cell)에서 강하게 발현된다는 것을 알 수 있었다(도 4E-G).

실시 예 17: 뿌리로부터 물과 다른 물질들을 지상부로 옮기는 증산 작용의 indicator인 기공 운동의 측정

식물의 잎의 표피층을 벗겨서 슬라이드 글라스 위에 놓고 현미경으로 관찰하면서 기공의 열린 정도를 측정하고, 최대치의 반에 이르기까지에 걸리는 시간 (t1/2)을 계산하였다. 비활성화 된 Rop2 유전자(DN-Rop2)를 발현시킨 식물의 경우, 기공이 야생종에 비해 많이 열리고 빨리 열린 것(t1/2 값이 작음)이 관찰되었고, 항상 활성화된 형태의 Rop2 유전자(CA-Rop2)를 발현시킨 식물의 경우, 기공이 느리게 열리고 (t1/2 값이 큼), 덜 열린 것이 관찰되었다(도 19A). 또한 이 유전자의 발현을 없앤 경우에도 (Rop2-KO) 기공을 야생종보다 더 많이, 더 빨리 여는 것을 관찰할 수 있었다(도 19B). 그러므로 이 유전자나 그와 유사한 유전자들을 코딩하는 단백질의 양이나 활성을 저하시키면, 야생종보다 기공을 더 빨리, 더 많이 열어서 증산작용이 증가한 식물을 만들 수 있다. 오염물질은 주로 증산작용 시에 식물의 지상부로 올라오게 되므로, 이 방법을 써서 중금속을 지상부로 많이 올려서 축적하는 식물을 개발할 수 있다. 즉, 기공을 더 크게 열어서 증산 작용이 활발하도록 제조된 형질전환 식물을 오염지에 심어서, 뿌리에서 지상부로 다양한 오염물질의 이동을 촉진시킬 수 있으며, 이는 식물을 이용한 환경정화에 도움이 될 것이다.

실시 예 18: 가뭄에 대한 내성의 indicator인 ABA에 의한 기공 닫힘 운동의 측정

식물의 잎에 ABA를 처리한 후, 식물의 잎의 표피층을 벗겨서 슬라이드 글라스 위에 놓고 현미경으로 관찰하면서 기공의 닫힌 정도를 측정하였다. 비활성화 된 Rop2 유전자(DN-Rop2)를 발현시킨 식물의 경우, 기공이 야생종에 비해 많이 닫히고 빨리 닫힌 것이 관찰되었고, 항상 활성화된 형태의 Rop2 유전자(CA-Rop2)를 발현시킨 식물의 경우, 기공이 느리게 닫히고, 덜 닫히는 것이 관찰되었다(도 20). 그러므로 이 유전자나 그와 유사한 유전자들을 코딩하는 단백질의 양이나 활성을 저하시키면, 야생종보다 기공을 더 빨리, 더 많이 닫히는 가뭄에 내성을 갖는 식물을 만들 수 있다.

상기에서 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 중금속 내성을 가진 유전자로 제조된 형질전환체는 중금속으로 오염된 환경에서 성장할 수 있어, 오염지에 환경친화적인 공원을 조성함으로써 환경복원에 이용될 수 있고, 오염지의 토양유실에 의한 이차오염을 방지할 수 있고, 중금속을 야생종에 비해 덜 흡수하는 안전한 작물을 개발하는 데 이용될 수 있다. 또한 상기 중금속 내성 유전자와 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자가 도입된 형질전환 식물은 중금속에 대한 내성이 우수할 뿐만 아니라, 여러 오염물질들을 지상부에 끌어 올릴 수 있을 것으로 예상되어, 환경정화에 기여할 수 있는 신품종 개발에 이용될 수 있다. 본 발명에서 제시한 AtPDR8 유전자는 중금속 뿐만 아니라 염과 건조 저항성도 증가시키므로, 폐광산 지역과 다른 중금속 오염지역의 정화와 복원에 이용할 수 있다. TaTM20과 AtPDR8 유전자는 식물체내 중금속 함량을 감소시키므로 중금속 흡수가 감소된 안전한 작물의 개발에 이용할 수 있다. AtPDR8이나 이와 상동성이 높은 유전자를 과발현시키거나 Rop2를 억제시키면 염이나 건조 저항성이 향상될 것으로 예상되어, 간척지, 또는 건조 지역의 농업과 환경에 기여할 수 있는 신품종 개발에 이용될 수 있다.

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Claims

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식물에서 발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있는, 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열번호: 1의 서열로 이루어지고, 중금속 내성과 축적성을 변화시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제7항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열번호: 3의 서열로 이루어지는 중금속, 염 또는 건조 저항성과 축적성을 변화시키는 유전자; 상기 서열번호: 3의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열로 이루어지는 유전자; 및 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열번호: 5의 서열로 이루어지는 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 추가로 포함하는 것인 재조합 벡터.
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제8항에 있어서,

상기 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 3과 90% 내지 95%의 상동성을 가지는 서열을 가지는 유전자인 재조합 벡터.
제8항에 있어서,

상기 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 3과 95% 내지 99%의 상동성을 가지는 서열을 가지는 유전자인 재조합 벡터.
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발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있는, 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열번호: 1의 서열로 이루어지고, 중금속 내성과 축적성을 변화시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제18항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열번호: 3의 서열로 이루어지는 중금속, 염 또는 건조 저항성과 축적성을 변화시키는 유전자; 상기 서열번호: 3의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열로 이루어지는 유전자; 및 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열번호: 5의 서열로 이루어지는 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 추가로 포함하는 것인 형질전환체.
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제18항에 있어서,

상기 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 3과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 가지는 유전자인 형질전환체.
제18항에 있어서,

상기 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 3과 90% 내지 95%의 상동성을 가지는 서열을 가지는 유전자인 형질전환체.
제18항에 있어서,

상기 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호: 3과 95% 내지 99%의 상동성을 가지는 서열을 가지는 유전자인 형질전환체.
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제18항에 있어서,

상기 형질전환체는 식물인 것인 형질전환체.
제30항에 있어서,

상기 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러, 및 박달나무로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 형질전환체.
식물에서 발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있는, 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열번호: 1의 서열로 이루어지고, 중금속 내성과 축적성을 변화시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 일부.
제32항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열번호: 3의 서열로 이루어지는 중금속, 염 또는 건조 저항성과 축적성을 변화시키는 유전자; 상기 서열번호: 3의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열로 이루어지는 유전자; 및 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열번호: 5의 서열로 이루어지는 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 추가로 포함하는 것인 식물의 일부.
제32항에 있어서,

상기 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러, 및 박달나무로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 식물의 일부.
식물에서 발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있는 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열번호: 1의 서열로 이루어지고, 중금속 내성과 축적성을 변화시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포.
제35항에 있어서,

상기 재조합 벡터는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열번호: 3의 서열로 이루어지는 중금속, 염 또는 건조 저항성과 축적성을 변화시키는 유전자; 상기 서열번호: 3의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열로 이루어지는 유전자; 및 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열번호: 5의 서열로 이루어지는 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 추가로 포함하는 것인 식물세포.
제35항에 있어서,

상기 식물은 양파, 당근, 오이, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 브로콜리, 담배, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 애기장대, 유채, 갓, 담배, 자작나무, 포플러, 잡종 포플러 및 박달나무로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 식물세포.
(a) 식물에서 발현 가능한 전사 및 번역 조절인자에 의하여 조절되도록 연결되어 있는, 유사한 4개의 생체막 통과 도메인이 5번 반복된 생체막 통과 단백질을 암호화하는 서열번호: 1의 서열로 이루어지고, 중금속 내성과 축적성을 변화시키는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제조하고,

(b) 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고,

(c) 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 것을 포함하는 중금속 내성 또는 축적성이 향상된 환경정화용 식물, 또는 중금속 흡수가 저하된 안전한 식물의 제조방법.
제38항에 있어서,

상기 발현 카세트는 6개의 생체막 통과 도메인과 ATP 결합 도메인이 2번 반복되는 ABC 수송체 단백질을 암호화하는 서열번호: 3의 서열로 이루어지는 중금속, 염 또는 건조 저항성과 축적성을 변화시키는 유전자; 상기 서열번호: 3의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열로 이루어지는 유전자; 및 GTP 결합 도메인과 세포질에서 세포막으로 위치를 옮겨갈 수 있는 CaaL 도메인(제라닐제라닐레이션 모티프)을 가진 단백질을 암호화하는 서열번호: 5의 서열로 이루어지는 염 또는 건조 저항성을 가지는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 추가로 포함하는 것인 식물의 제조방법.