JP6435060B2 - 植物体の耐塩性向上方法 - Google Patents

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Description

本発明は、植物体の耐塩性を向上させる方法に関する。
本願は、日本国に、２０１６年６月１７日に出願された特願２０１６−１２１２３５号、２０１６年１２月１３日に出願された特願２０１６−２４１４６９号、２０１７年４月２５日に出願された特願２０１７−０８６６５４号、及び２０１７年５月１９日に出願された特願２０１７−１００２８６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年、世界各国における人口増加による食糧生産量の増大により、大量の農業用水が必要とされ、水不足が深刻な問題となっている。地球上に最も多く存在する水資源は海水であり、海水を農業用水として利用できれば、この問題を解決できる。ただし、植物の多くは、高塩濃度下では、浸透圧による吸水阻害とナトリウムイオンによる細胞内酵素の阻害により、育成することができない。本来耐塩性の低い植物について、海水の塩濃度程度にまで耐塩性を高めることができれば、海水を用いて栽培可能となることが期待できる。
植物の耐塩性を高める方法としては、遺伝子組換え技術を用いて、塩耐性機構に関与する遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、植物細胞内にオスモライト（プロリンやベタイン）を蓄積させることによって浸透圧に対する耐性を獲得している塩生植物が存在している。このオスモライトを蓄積させる遺伝子を導入した組み換え植物は、耐塩性を獲得していることが報告されている。
また、植物における細胞内ナトリウムイオン濃度は、主に、細胞内への取り込みを制御する非選択性陽イオンチャネル（Non-selective cation channel；ＮＳＣＣ）、細胞外への排出を制御する細胞膜型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター（Salt Overly Sensitive 1；ＳＯＳ１）を含むＳＯＳ経路、液胞への取り込みを制御する液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、及び導管からカリウムイオンと共にナトリウムイオンを流入させる高親和性カリウムトランスポーター（High affinity K Transporter；HKT）により制御されている（非特許文献１参照。）。例えば、特許文献１には、耐塩性植物であるテランギエラ・ハロフィリア（Thellungiella halophila）から同定されたＳＯＳ１遺伝子を過剰発現させた形質転換植物では、細胞外へのナトリウムイオンの排出が促進され、耐塩性が向上したことが報告されている。特許文献２には、ＳＯＳ経路を構成する蛋白質キナーゼであるＳＯＳ２遺伝子を過剰発現させた形質転換植物でも耐塩性が向上したことが報告されている。特許文献３には、オオムギ（Hordeum vulgare）の液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター（ＨｖＮＨＸ１）遺伝子を過剰発現させた形質転換植物では、液胞へのナトリウムイオンの取り込みが促進され、耐塩性が向上したことが報告されている。非特許文献２には、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＨＫＴ遺伝子を過剰発現させた形質転換植物では、根でのナトリウムイオンの蓄積が増大し、シュートの塩濃度の増大が抑えられ、植物体全体の耐塩性が向上したことが報告されている。
遺伝子組換え技術を使用せずに植物の耐塩性を高める方法としては、植物体への耐塩性付与効果を有する薬剤や微生物を植物体に投与する方法が検討されてきている。耐塩性付与効果を有する薬剤としては、例えば、ピロロキノリンキノン（例えば、特許文献４参照。）や植物ホルモンのストリゴラクトン等が知られている。また、耐塩性付与効果を有する微生物としては、例えば、パエニバチルス・フクイネンシス（Paenibacillus fukuinensis）（例えば、特許文献５参照。）が知られている。
国際公開第２００６／０５３２４６号 国際公開第２００６／０７９０４５号 オーストラリア特許出願公開第２００９２０１３８１号明細書 日本国特許第５０１３３２６号公報 日本国特開２０１３−７５８８１号公報
Takeda and Matsuoka, Nature Reviews Genetics, 2008. Vol.9, p.444-457. Moller, et. al.，The Plant Cell，2009，Vol.21，p.2163-2178. Bai, et. al.，The Plant Journal，2009，Vol.60，p.314-327.
非特許文献１に開示されているように、植物におけるナトリウムイオン濃度を制御するメカニズムはある程度解明されている。また、特許文献１等に記載されているように、ＳＯＳ１遺伝子等の当該メカニズムに関与する遺伝子を過剰発現することによって植物の耐塩性を向上させられることが知られている。しかしながら、当該メカニズムに関与する遺伝子を導入した遺伝子組換え植物では、１００ｍＭ程度の塩化ナトリウムに対する耐性が確認されたものがほとんどであり、さらなる耐塩性の向上が望まれている。
本発明は、高塩濃度環境下での栽培が可能となるように、植物体の耐塩性を向上させるための方法を提供することを目的とする。
本発明者は鋭意研究した結果、機能が未同定であったＰＥＲＫ１３（Proline-rich extensin-like receptor kinase 13）が、植物におけるナトリウムイオン濃度を制御するメカニズムに関与しており、ＰＥＲＫ１３の機能を阻害することによって植物体の耐塩性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法等は、下記［１］〜［８］である。
［１］ 植物体のＰＥＲＫ１３（Proline-rich extensin-like receptor kinase 13）の植物体内へのナトリウムイオンの流入を制御する機能を抑制又は阻害し、
前記機能の抑制又は阻害を、ＰＥＲＫ１３遺伝子を欠損させる、又はＰＥＲＫ１３遺伝子にその機能を低下させる変異を導入することによって行う、植物体の耐塩性向上方法。
［２］ 前記植物体が、非選択性陽イオンチャネル、細胞膜型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、及び高親和性カリウムトランスポーターからなる群より選択される１種以上の蛋白質の機能が亢進している、前記［１］の植物体の耐塩性向上方法。
［３］ 前記植物体が、非選択性陽イオンチャネル、細胞膜型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、及び高親和性カリウムトランスポーターからなる群より選択される１種以上の蛋白質が過剰発現している、前記［１］の植物体の耐塩性向上方法。
［４］ 前記植物体が、外来遺伝子が導入された形質転換体であり、
前記外来遺伝子が、ＳＯＳ１遺伝子、ＳＯＳ２遺伝子、ＳＯＳ３遺伝子、ＮＨＸ１遺伝子、及びＨＫＴ１遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記［１の植物体の耐塩性向上方法。
［５］ 前記植物体が、双子葉植物である、前記［１］〜［４］のいずれかの植物体の耐塩性向上方法。
［６］ 前記植物体が、単子葉植物である、前記［１］〜［４］のいずれかの植物体の耐塩性向上方法。
［７］ 前記植物体が、イネ科の植物、ナス科の植物、アブラナ科の植物、ウリ科の植物、ブドウ科の植物、ミカン科の植物、バラ科の植物、マメ科の植物、ハス科の植物、ゴマ科の植物、アカザ科の植物、ヤシ科の植物、バショウ科の植物、アオイ科の植物、フトモモ科の植物、及びフウチョウソウ科の植物より選ばれる１種の植物である、前記［１］〜［４］のいずれかの植物体の耐塩性向上方法。
［８］ 前記植物体が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ（プチヴェール）、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード、キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、ブドウ、レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン、リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム（スモモ）、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー、ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ、ハス（レンコン）、ゴマ、ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ、ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー、バナナ、バショウ、マニラアサ、ワタ、オクラ、ユーカリ、フウチョウソウ 、及びセイヨウフウチョウソウより選ばれる１種の植物である、前記［１］〜［４］のいずれかの植物体の耐塩性向上方法。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法により、元々耐塩性が低い植物体の耐塩性を向上させることができる。よって、当該方法により耐塩性が向上された植物体は、塩化ナトリウム濃度が比較的高い環境下でも栽培できるようになる。
図１は、実施例３において、塩ストレス後のシロイヌナズナの野生株の蛍光ナトリウムインジケーターによる蛍光染色像である。 図２は、実施例３において、塩ストレス後のシロイヌナズナのＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体の蛍光ナトリウムインジケーターによる蛍光染色像である。 図３は、実施例３において、塩ストレス後のシロイヌナズナの野生株及びＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体の根の蛍光強度の測定結果を示した図である。 図４は、実施例４において、シロイヌナズナの野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体を、同定した耐塩性向上用微生物混合物の共生下で水耕栽培した場合の各塩化ナトリウム濃度下における生存率を調べた結果を示した図である。 図５は、実施例５において、シロイヌナズナの野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体に対して、実施例４で取得した耐塩性向上用微生物混合物の存在下で塩ストレス（ナトリウム濃度２．５質量％）をかけた後に、各植物体の根の蛍光強度の測定結果を示した図である。 図６は、実施例５において、シロイヌナズナの野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体に対して、実施例４で取得した耐塩性向上用微生物混合物の存在下で塩ストレス（ナトリウム濃度１．０質量％）をかけた後に、各植物体の根の蛍光強度の測定結果を示した図である。 図７は、実施例６において構築した、トマトＳｌＰＥＲＫ遺伝子を標的とするＲＮＡｉ用ベクター（pBI-SlPERKs-sense, anti senseベクター）の構造マップである。 図８は、実施例６において得られた形質転換トマトの、塩化ナトリウム濃度０．５又は１．０質量％環境下において２１日間水耕栽培した時点においける写真である。 図９は、実施例７において、作製された組換え再分化植物体から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物のＴｓｐＲＩ処理物を電気泳動した結果を示した図である。 図１０は、実施例７において、イネの非組換え再分化植物体（ＷＴ）とＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体（ＫＯ）を、塩化ナトリウム濃度１．５質量％環境下において２週間生育させた時点の写真である。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法は、植物体のＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することを特徴とする。後記実施例に記載されているように、ＰＥＲＫ１３遺伝子に変異が導入され、その機能が阻害された変異体では、根からの植物体内へのナトリウムイオンの流入が抑制され、耐塩性が向上する。ＰＥＲＫ１３は、植物体の根で特異的に発現している膜蛋白質であり、細胞内にキナーゼ活性部位を有する。ＰＥＲＫ１３は、アミノ酸配列の類似性から、ＮＳＣＣのカルシウムイオンの流入を促進する作用を有する受容体であるＰＥＲＫ４（Proline-rich extensin-like receptor kinase 4）（例えば、非特許文献３参照。）と同様の作用効果を有すると推定されていたが、本発明者の研究により、植物体内へのナトリウムイオンの流入の制御に関与していることがわかった。
非特許文献１に記載されているように、ナトリウムイオン濃度の制御メカニズムは、広く植物において共通している。当該メカニズムの一端を担うＰＥＲＫ１３も、多種多様な植物で保存されている蛋白質であり、多くの植物において植物体内へのナトリウムイオンの流入を制御する機能を担っている。例えば、ＰＥＲＫ１３遺伝子としては、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ ＩＤがAt1g70460（Arabidopsis thaliana）であるシロイヌナズナのＰＥＲＫ１３遺伝子のオーソログ遺伝子が挙げられ、具体的には、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ ＩＤが101266034（Solanum lycopersicum）、107059185（Solanum tuberosum）、107279382（Oryza sativa Japonica Group）、4333279（Oryza sativa Japonica Group）、102703815（Oryza brachyantha）、103649394（Zea mays）、106804357（Setaria italica）、101775206（Setaria italica）、106322706（Brassica oleracea）、106405068（Brassica napus）、106416704（Brassica napus）、103852653（Brassica rapa）、101215732（Cucumis sativus）、100247217（Vitis vinifera）、104882493（Vitis vinifera）、104822150（Tarenaya hassleriana）、102616604（Citrus sinensis）、105766022（Gossypium raimondii）、104438961（Eucalyptus grandis）、100807815（Glycine max）、106779893（Vigna radiata）、101497672（Cicer arietinum）、103321809（Prunus mume）、103927247（Pyrus x bretschneideri）、104586282（Nelumbo nucifera）、100832398（Brachypodium distachyon）、103708226（Phoenix dactylifera）、105049377（Elaeis guineensis）、103989453（Musa acuminata）、105172671（Sesamum indicum）、104904972（Beta vulgaris subsp. vulgaris）、18429568（Amborella trichopoda）、及び103452847（Malus domestica）等が挙げられる。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法において、機能が抑制又は阻害されるＰＥＲＫ１３としては、ＰＥＲＫ１３としての機能を保持している物であれば特に限定されるものではない。本発明に係る植物体の耐塩性向上方法において、機能を抑制又は阻害するＰＥＲＫ１３としては、野生型の植物体内に存在している野生型のＰＥＲＫ１３であってもよく、突然変異によって生じたＰＥＲＫ１３変異体であってもよく、紫外線照射処理等の各種変異処理によって変異が導入されたＰＥＲＫ１３変異体であってもよく、遺伝子改変技術等によって改変されたＰＥＲＫ１３改変体であってもよい。例えば、保有するＰＥＲＫ１３が、野生型のＰＥＲＫ１３に各種の改変処理を施してＰＥＲＫ１３によるナトリウムイオン流入促進機能が増強又は減弱されているＰＥＲＫ１３改変体である植物体であっても、本発明に係る植物体の耐塩性向上方法を行うことによって耐塩性を向上させることができる。
植物体の耐塩性を向上させるために当該植物体が保有するＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害させる程度としては、例えば、当該植物体を１．０質量％塩化ナトリウム環境下で６から２４時間水耕栽培した場合の根における塩化ナトリウム量が、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害させる前の植物体を同じ条件で栽培した場合の根における塩化ナトリウム量を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは３０％以下となるようにすることができる。植物体の根における塩化ナトリウムの相対量は、例えば、根の内部をナトリウムイオンと結合する蛍光物質で蛍光染色した場合の蛍光強度を指標として測定することができる。
植物体が本来有しているＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害させる方法としては、特に限定されるものではなく、ＰＥＲＫ１３の発現量を低減させる方法であってもよく、ゲノムＤＮＡ中のＰＥＲＫ１３遺伝子に変異を導入して機能が低下したＰＥＲＫ１３変異体を発現させる手法であってもよく、ＰＥＲＫ１３の細胞内シグナル伝達を阻害する方法であってもよい。
植物体の耐塩性を向上させるために当該植物体が保有するＰＥＲＫ１３の発現量を低減させる場合、低減後の植物体のＰＥＲＫ１３の発現量は、低減前の植物体のＰＥＲＫ１３の発現量を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは０％（完全に発現していない状態）になるようにすることが好ましい。植物体のＰＥＲＫ１３の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ法等の当該技術分野で蛋白質の発現量を測定する際に用いられる各種方法で測定することができる。植物体の耐塩性を向上させるために当該植物体が保有するＰＥＲＫ１３の機能を低下させる場合、低下後の植物体のＰＥＲＫ１３の機能は、低下前の植物体のＰＥＲＫ１３の機能を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは０％（完全に機能を失った状態）となるようにすることが好ましい。
ＰＥＲＫ１３の発現量を低減させる方法としては、ゲノムＤＮＡを改変する方法であってもよく、ＲＮＡ干渉のようにゲノムＤＮＡを改変しない方法であってもよい。ゲノムＤＮＡを改変してＰＥＲＫ１３の発現量を低減させる方法としては、ＰＥＲＫ１３遺伝子を削除する方法、ＰＥＲＫ１３遺伝子にナンセンス変異を導入する方法、ＰＥＲＫ１３遺伝子のプロモーター配列等の発現調節配列を改変する方法等が挙げられる。ＰＥＲＫ１３の機能が低下又は欠損する変異としては、例えば、ＰＥＲＫ１３の細胞内領域にあるキナーゼドメインに、キナーゼ活性が消失又は低下するような変異や、ＰＥＲＫ１３の細胞外領域にあるリガンド結合部位に、リガンドとの親和性を低下させる変異が挙げられる。
ゲノムＤＮＡ中のＰＥＲＫ１３遺伝子領域を改変する方法としては、相同組換えを利用して、ＰＥＲＫ１３遺伝子領域の全部又は一部を、別のＤＮＡ断片に置換する方法が汎用されている。例えば、ＰＥＲＫ１３遺伝子をコードする領域を、他の遺伝子をコードするＤＮＡ断片に置換したり、変異を導入したＰＥＲＫ１３の変異遺伝子をコードするＤＮＡ断片に置換することによって、ＰＥＲＫ１３遺伝子を欠損させたり、野生型のＰＥＲＫ１３にかえて変異型のＰＥＲＫ１３を発現させることができる。相同組換えに求められる塩基配列の相同性（配列同一性）は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。なお、相同組換え法による遺伝子操作法は既に多くの植物で確立されている。例えば、相同組換えにより置換するＤＮＡ断片を含む形質転換用ベクターを、耐塩性を向上させる目的の植物体のカルスに導入して形質転換体を作製し、得られた形質転換体を分化させることによってＰＥＲＫ１３遺伝子領域が改変されたゲノムＤＮＡを有する植物体が得られる。未分化のカルスは、常法により調製することができる。また、形質転換用ベクターとしては、直鎖状ＤＮＡであってもよく、プラスミドであってもよい。カルス等の植物細胞へのベクターの導入は、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、リポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
ＲＮＡ干渉は、植物体に、ＰＥＲＫ１３遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）を導入することにより実施できる。標的である植物細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターを導入してもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とするＰＥＲＫ１３遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。ＲＮＡｉ誘導ベクターの導入は、前記形質転換用ベクターの導入と同様にして行うことができる。
ＰＥＲＫ１３の細胞内シグナル伝達を阻害する方法としては、ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させる方法であってもよく、ＰＥＲＫ１３のキナーゼ活性を阻害する阻害剤を植物体の根の細胞内に導入する方法であってもよい。ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストとは、ＰＥＲＫ１３の細胞外領域に結合することによって、ＰＥＲＫ１３のリガンドがＰＥＲＫ１３に結合することを阻害する物質を意味する。ゲノムＤＮＡを改変する必要がなく、処理がより簡便である点から、本発明に係る植物体の耐塩性向上方法としては、ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させる方法が特に好ましい。
本発明において用いられるＰＥＲＫ１３のアンタゴニストは、化合物であってもよく、１種又は２種以上の微生物であってもよく、１種又は２種以上の微生物の分泌物質であってもよい。当該アンタゴニストが特定の微生物の分泌物質である場合には、当該微生物の培養上清をそのまま又はその粗精製物を、植物体の根の表面に接触させてもよい。
ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させる方法としては、植物体の根の少なくとも一部を栽培用溶液に浸漬させた状態で栽培する水耕栽培の場合、栽培用溶液に代えて、ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストを含む処理用溶液に植物体の根の少なくとも一部を一定期間浸漬させることによって、当該アンタゴニストを植物体の根の表面のＰＥＲＫ１３に結合させ、ＰＥＲＫ１３の機能を阻害し、植物体の根からのナトリウムイオンの流入を抑制し、当該植物体の耐塩性を向上させる。処理用溶液の組成、特に塩の組成は、栽培用溶液と同じであってもよく、異なっていてもよい。また、栽培用溶液に直接ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストを混合させてもよい。植物体を土壌で栽培する場合には、植物体を植えた土壌を当該アンタゴニストを含む水溶液で湿らせてもよく、土壌中の根付近に当該アンタゴニストを含む顆粒を配置してもよい。
本発明において耐塩性を向上させる植物体としては、元々ゲノムＤＮＡ中にＰＥＲＫ１３遺伝子又はそのホモログ遺伝子を有している植物であれば特に限定されるものではなく、被子植物であってもよく、裸子植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよい。また、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。具体的には、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ等のイネ科の植物；トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ等のナス科の植物；シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ（プチヴェール）、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード等のアブラナ科の植物；キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、等のウリ科の植物；ブドウ等のブドウ科の植物；レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン等のミカン科の植物；リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム（スモモ）、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー等のバラ科の植物；ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ等のマメ科の植物；ハス（レンコン）等のハス科の植物；ゴマ等のゴマ科の植物；ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ等のアカザ科の植物；ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー等のヤシ科の植物；バナナ、バショウ、マニラアサ等のバショウ科の植物；ワタ、オクラ等のアオイ科の植物；ユーカリ等のフトモモ科の植物；フウチョウソウ 、セイヨウフウチョウソウ等のフウチョウソウ科の植物等が挙げられる。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法においては、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することに加えて、植物体の根の細胞内のナトリウムイオン濃度を低下させるその他の処理を併用してもよい。植物体の根の細胞内のナトリウムイオン濃度を低下させる処理としては、例えば、植物体の非選択性陽イオンチャネル、細胞膜型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、及び高親和性カリウムトランスポーターからなる群より選択される１種以上の蛋白質の機能を亢進させる処理が挙げられる。これらの蛋白質としては、例えば、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＳＯＳ３、ＮＨＸ１、及びＨＫＴ１等が挙げられる（非特許文献１）。これらの蛋白質の機能は、当該蛋白質の発現量を増大させることにより亢進させることができる。
植物体内の蛋白質の発現量は、当該蛋白質をコードする外来遺伝子を導入し形質転換することにより増大させることができる。当該外来遺伝子としては、導入する植物体と同種の生物由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよい。本発明に係る植物体の耐塩性向上方法においては、耐塩性を向上させる標的の植物体と同種又は異種のＳＯＳ１遺伝子、ＳＯＳ２遺伝子、ＳＯＳ３遺伝子、ＮＨＸ１遺伝子、及びＨＫＴ１遺伝子からなる群より選択される１種以上の外来遺伝子が導入された形質転換体について、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することが好ましい。植物体への外来遺伝子の導入は、外来遺伝子をコードするＤＮＡ断片を組込んだ形質転換用ベクターを用いて、前記形質転換用ベクターの導入と同様にして行うことができる。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法により、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害する前の植物体よりも耐塩性を向上させた植物体を得ることができる。本発明に係る植物体の耐塩性向上方法では、耐塩性向上前の植物体の１０〜５０％しか生育できない程度のナトリウム濃度の環境下でも生育可能な程度にまで耐塩性を向上させられることが好ましく、耐塩性向上前の植物体の１０〜３０％しか生育できない程度のナトリウム濃度の環境下でも生育可能な程度にまで耐塩性を向上させられることがより好ましく、耐塩性向上前の植物体の１０％以下しか生育できない程度のナトリウム濃度の環境下でも生育可能な程度にまで耐塩性を向上させられることがさらに好ましい。
本発明に係る植物体の耐塩性向上方法により得られた植物体は、ナトリウムイオン濃度が高い栽培用溶液を用いた水耕栽培や、ナトリウムイオン濃度が高い土壌を用いた土耕栽培により栽培することができる。例えば、本発明に係る植物体の耐塩性向上方法により、ナトリウムイオン濃度が０．２質量％以上、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは１．５質量％以上、よりさらに好ましくは２．０質量％以上、特に好ましくは２．５質量％以上の栽培用溶液を用いた水耕栽培でも栽培可能な植物体を得られる場合がある。
耐塩性を向上させた植物体の栽培に用いる栽培用溶液としては、塩化ナトリウムに加えて塩化マグネシウムを含むことが好ましく、０．５質量％以下の塩化マグネシウムを含有することがより好ましく、０．１〜０．５質量％の塩化マグネシウムを含有することがさらに好ましい。
当該栽培用溶液は、塩化ナトリウムや塩化マグネシウム以外にも、植物体の生育に必要な各種栄養成分を含有していることが好ましい。当該栄養成分は、栽培する植物体の種類に応じて適宜調整することができる。特に、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄、鉄、マンガン、銅、モリブデン、ホウ素等の植物体の生育に必要な元素を塩類として含有していることが好ましい。その他、植物体の種類によっては、アルミニウムや珪素等の元素を塩類として含有する場合もある。また、植物体の生育段階に応じて栽培用溶液の組成を変更してもよい。
当該栽培用溶液としては、例えば、市販されている液肥に塩化ナトリウムをはじめとする不足の塩類を添加した溶液や、市販されている濃縮された液肥を、水に代えて海水で希釈した溶液を用いることができる。また、海水に、リン等の不足の塩類を適宜添加した溶液を用いることもできる。
耐塩性を向上させた植物体の水耕栽培は、一般的な水耕栽培方法によって行うことができる。例えば、比較的多量の栽培用溶液を栽培用槽にためる湛液型水耕法で行ってもよく、緩やかな傾斜を持つ平面上に培養液を少量ずつ流下させる薄膜水耕法で行ってもよい。
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１］
シロイヌナズナにランダム変異を導入した変異体のライブラリーに対して、耐塩性が向上している変異体をスクリーニングし、耐塩性向上に寄与している遺伝子を調べた。このスクリーニングには、パエニバシラス（Paenibacillus）属の微生物を用いた。パエニバシラス属菌は、シロイヌナズナの細胞内への塩化ナトリウムの流入を促進する。このため、パエニバシラス属菌共存下のシロイヌナズナは、通常は枯死することはない０．５質量％の塩化ナトリウム環境下でも枯死する。この性質を利用し、パエニバシラス属菌共存下でも耐塩性を向上させることができる遺伝子をスクリーニングした。
まず、シロイヌナズナ（Col-0）の種子をＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）処理し、ランダム変異を導入した変異体ライブラリーを作製した。このライブラリーの種子を、次亜塩素酸にて滅菌した後、ＭＳ（Murashige-Skoog）培地のゲル平板培地上に播種し、このゲル平板培地を少なくとも底部が水耕栽培用の液体培地に接する状態として水耕栽培を行った。液体培地としては、１／２ＭＳ培地（ＭＳ培地を等量の水で希釈した液体培地）を用いた。
発芽後の２週齢時に、塩化ナトリウム処理用の植物体に、終濃度が０．５質量％になる量の塩化ナトリウムと、パエニバシラス属菌とを添加し、さらに１週間水耕栽培を行った。コントロール処理用の植物体には、パエニバシラス属菌のみを添加し、さらに１週間水耕栽培を行った。
この結果、対照である野生株は、パエニバシラス属菌との共存効果により枯死したが、約２５，０００のランダム変異株のうちの１０株は、枯死することなく正常に生育した。この１０株のうちの４株から種子を収穫し、シロイヌナズナを育成させ、葉からゲノムを抽出した。抽出されたゲノムの塩基配列を、次世代シーケンスにより解析したところ、これら４株の変異体全てにおいて、ＰＥＲＫ１３遺伝子（At1g70460）に共通の変異が導入されていた。このＰＥＲＫ１３遺伝子の変異は、chr5:13434602の位置への一塩基の挿入であり、これによりフレームシフトが生じる結果、これらの変異体では、ＰＥＲＫ１３の機能が失われていることが判明した。なお、ＰＥＲＫ１３遺伝子以外には、これら４株の変異体に共通する変異遺伝子はなかった。
本実験で示すように、ＰＥＲＫ１３遺伝子にフレームシフト変異を有する変異体では、パエニバシラス属菌による植物体への塩化ナトリウムの流入促進の影響が抑えられ、耐塩性が向上した。これらの結果から、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することにより、根からのナトリウムイオンの流入を抑制し、植物体の耐塩性を向上させられることがわかった。
［実施例２］
実施例１において、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体であることを確認した４株のうちの２株について、１．５質量％の塩化ナトリウム環境下で栽培し、耐塩性を調べた。
具体的には、種子を次亜塩素酸にて滅菌した後、ＭＳ培地のゲル平板培地上に播種し、このゲル平板培地を少なくとも底部が水耕栽培用の液体培地に接する状態として水耕栽培を行った。液体培地としては、１／２ＭＳ培地を用いた。各変異体につき、それぞれ塩化ナトリウム処理用として２４種子、コントロール処理用として２４種子を播種した。発芽後の２週齢時に、塩化ナトリウム処理用の植物体に、終濃度が１．５質量％になる量の塩化ナトリウムを添加し、さらに１週間水耕栽培を行った。コントロール処理用の植物体には何も添加せず、さらに１週間水耕栽培を行った。対照として、野生株についても同様に水耕栽培を行った。
この結果、コントロール処理した植物体、すなわち塩化ナトリウムを添加していない１／２ＭＳ培地で栽培した植物体は、野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のいずれも２４個体全ての個体が枯死せず正常に生育していた。塩化ナトリウム処理した植物体では、野生型は２４個体のうち２０個体が枯死した（［枯死体数］／［全数植物体数］＝２０／２４）のに対して、２株のＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体ではいずれも枯死した植物個体数が４個以下であり、その大部分が１．５質量％の塩化ナトリウム含有液体培地中でも枯死することなく生長した（［枯死体数］／［全数植物体数］≦４／２４）。これらの結果から、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することにより、根からのナトリウムイオンの流入が抑制され、植物体の耐塩性が向上することが確認された。
［実施例３］
ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のうち、実施例２において耐塩性を調べた２株のうちの１株について、根におけるナトリウムの量を調べた。
具体的には、種子を７０％エタノールと次亜塩素酸を用いて滅菌した後、１％スクロース含有ＭＳ培地のゲル平板培地上に播種し、このゲル平板培地を少なくとも底部が水耕栽培用の液体培地（１／２ＭＳ培地）に接する状態として、人工気象器内にて水耕栽培を行った。人工気象器は、２５℃、照度５０００ｌｕｘ、明期１６時間、暗期８時間の条件にした。発芽後の１０日から１４日後に、ゲル平板培地の底部が接触している液体培地を、終濃度１．０質量％の塩化ナトリウム含有１／２ＭＳ培地に交換し、さらに６時間から２４時間水耕栽培して塩ストレスをかけた。コントロール処理用の植物体の液体培地に対しては何も添加せずに、同じ時間栽培した。
塩ストレス後の植物体の根を５０μＭのＣｏｒｏＮａ（登録商標）−Ｇｒｅｅｎ ＡＭ溶液で蛍光染色した後、当該根の表面を水洗した。水洗後の根の内部を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。ＣｏｒｏＮａ−Ｇｒｅｅｎ ＡＭは、ナトリウムイオンと結合することによって緑色蛍光強度が増大するナトリウムインジケーターである。野性株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のうち、塩ストレス後の根の蛍光染色像を図１及び図２に示す。また、野性株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のうち、塩ストレス後の根の断面積当たりの蛍光強度の測定結果を図３に示す。
塩ストレスをかけていないコントロール処理用の植物体の根では、野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のいずれにおいても、内部に緑色蛍光はほとんど観察されなかった（図示せず）。これに対して、野生株の根（図１）では、内部に緑色蛍光が強く生じており、塩ストレスによりナトリウムイオンの流入が顕著に増大したことが確認された。これに対して、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体の根（図２）では、緑色蛍光がほとんど観察されず、塩ストレスによってもナトリウムイオンの流入が増えていないことが確認された。この結果から、ＰＥＲＫ１３は根におけるナトリウムイオンの流入に関与しており、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体における塩ストレス耐性の向上は、高塩濃度環境下における植物体内へのナトリウムイオンの流入抑制によるものであることがわかった。
［実施例４］
野生型シロイヌナズナを用い、土壌から抽出された微生物から、耐塩性を高める共生効果を有する植物共生菌群を選抜した。
＜微生物懸濁液の調製＞
沖縄県にて採取された土壌１ｇを、緩衝液で懸濁し、十分に撹拌し、微生物懸濁液として用いた。
＜ポットの作成＞
天面と底面が開口した円柱状のポットに、スクロース含有ＭＳ寒天培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースと０．９％（ｗ／ｖ）アガーを加えた培地）を注入して固めることにより、植物体を育成するためのポットを作製した。当該ポットを、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた８つの容器にそれぞれ複数個ずつ設置した。
＜種子の次亜塩素酸処理＞
シロイヌナズナの種子（Col-0）は、LEHLE社(Round Rock, TX, USA)より購入した。種子は、１％次亜塩素酸に浸漬させた状態で１分間撹拌をすることによって表面を滅菌した後、遠心分離処理により次亜塩素酸を除いた。次亜塩素酸処理後の種子は、滅菌水にて３回水洗した後、前記ポットの上部に播種して、４℃で２４時間暗所にて保存した。
＜植物体の水耕栽培＞
前記ポットを複数個用意し、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた１つの容器に全て設置した。各ポットは、底面はスクロース含有ＭＳ培地に浸っているが天面は浸っていない状態となるように設置した。これらのポットの上部に、次亜塩素酸処理後に滅菌水にて３回水洗した後の野生型の種子を播種し、２５℃、明期１６時間と暗期８時間の長日条件のインキュベーター内で１４日間育成した。
＜塩ストレス及び微生物の接種＞
１４日間水耕栽培後に、当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、塩化ナトリウムの最終濃度が１質量％となるように滅菌済の５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液を添加し、さらに１００μＬの微生物懸濁液を添加した。その後、当該ポットを１４日間培養した。
＜塩ストレス耐性向上作用を有する微生物の回収＞
塩ストレス下での１４日間の培養後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして第１の微生物回収溶液とした。
栽培用溶液として、塩化ナトリウムの最終濃度が１．５質量％となるように塩化ナトリウムを添加したスクロース含有ＭＳ培地に、前記第１の微生物回収溶液１００μＬを添加した溶液を用いた以外は同様にして水耕栽培を行い、塩ストレス下での１４日間の培養後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして第２の微生物回収溶液とした。
栽培用溶液として、塩化ナトリウムの最終濃度が３．０質量％となるように塩化ナトリウムを添加したスクロース含有ＭＳ培地に、前記第２の微生物回収溶液１００μＬを添加した溶液を用いた以外は同様にして水耕栽培を行い、塩ストレス下での１４日間の培養後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして第３の微生物回収溶液とした。
シロイヌナズナは、第３の微生物回収溶液に含まれている微生物混合物が植物体の根に共生することにより、塩ストレス下での植物体の生育が可能となった。つまり、第３の微生物回収溶液に含まれている微生物混合物又はこれらの分泌物質が、植物の耐塩性を向上させる作用を有していること、すなわち当該微生物混合物は、塩ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群であることがわかった。
＜微生物の同定＞
選抜された塩ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群（耐塩性向上用微生物混合物）を構成する微生物を同定した。
まず、前記第３の微生物回収溶液から菌体を回収し、回収した菌体の一部からゲノムＤＮＡを、GenElute Bacterial Genomic DNA kit（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA）を用いて得た。
回収されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’、配列番号１）とリバースプライマー（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’、配列番号２）を用いて、16S rDNAをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの温度条件は、９５℃、３分間の加熱工程後、９５℃、３０秒間の変性工程、５０℃、３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、１分３０秒間の伸長工程からなるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７２℃、５分間の伸長反応を加える条件で行った。得られたＰＣＲ産物を、１．２％のアガロースゲル電気泳動により確認し、QIAquick gel extraction kit (Quiagen, Germantown, MD, USA)を用いてゲルから抽出した。抽出されたＰＣＲ産物を、TOPO-TA cloning kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いてプラスミド中に挿入し、大腸菌に形質転換を行った。アンピシリン含有ＬＢ平板培地上で一晩培養した大腸菌コロニーをランダムに３０個取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地に移植して培養した。QIAprep spin miniprep kit (Quiagen)を用いて培養された大腸菌からプラスミドを精製した。精製されたプラスミドに対して、BigDye terminator v3.1 Cycle sequence kit (Life Techonologies)を用いたThermalcycle反応を行い、DNAシークエンサー(ABI 3130xL)にて当該プラスミドに組み込まれた16S rDNAの塩基配列を決定した。この結果、２種類の16S rDNA（YROK-1株及びYROK-2株）が同定された。
配列が決定された２種類の16S rDNAの塩基配列についてそれぞれEzBIOCloud検索を行ったところ、２種類のうち、YROK-1株（配列番号３）はPaenarthrobacter nitroguajacolicus（アクセッション番号：AJ512504）と配列同一性が９８．８９％、YROK-2株（配列番号４）はArthrobacter psychrochitiniphilus（アクセッション番号：AJ810896）と配列同一性が９７．１４％であった。これらの結果から、YROK-1株はPaenarthrobacter nitroguajacolicusの新規株であり、YROK-2株はArthrobacter psychrochitiniphilusの新規株であることがわかった。
また、同定した５２個の形質転換体に挿入されていた16S rDNAの割合から、これら２種類の微生物の存在比を調べたところ、Paenarthrobacter nitroguajacolicus YROK-1株は９８．０％であり、Arthrobacter psychrochitiniphilus YROK-2株は２．０％であった。
＜同定した耐塩性向上用微生物混合物の耐塩性を高める共生効果＞
シロイヌナズナの野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体について、同定した耐塩性向上用微生物混合物の耐塩性向上効果を調べた。
まず、前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、塩化ナトリウムの最終濃度が０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、又は３．０質量％となるように滅菌済の５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液を添加し、さらに前記耐塩性向上用微生物混合物を添加して水耕栽培を行い、１４日間培養後の生存率を調べた。対照として、耐塩性向上用微生物混合物を添加していない栽培用溶液で同様に水耕栽培し、１４日間栽培後の生存率を調べた。
生存率の測定結果を図４に示す。図中、「微生物無ＷＴ」は耐塩性向上用微生物混合物が共生していない状態で栽培した野生株の結果を、「微生物有ＷＴ」は耐塩性向上用微生物混合物が共生している状態で栽培した野生株の結果を、「微生物有ＭＴ」は耐塩性向上用微生物混合物が共生している状態で栽培したＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体の結果を、それぞれ示す。
この結果、野生株では、耐塩性向上用微生物混合物が共生していない状態では、塩化ナトリウム濃度が１質量％で生存率が１０％以下であったのに対して、耐塩性向上用微生物混合物が共生している状態では、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体と同様に、塩化ナトリウム濃度が１質量％での生存率は９０％以上と高く、塩化ナトリウム濃度が３質量％でも生存率は３０％以上と高かった。図４に示すように、耐塩性向上用微生物混合物が共生している状態では、塩化ナトリウム濃度が２％以上では、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のほうが野生株の生存率よりもやや高かったが、これは、耐塩性向上用微生物混合物は、ＰＥＲＫ１３の機能欠失を介する経路のみならず、その他の耐塩性を向上させる経路にも何等かの作用を有するためではないかと推察された。
耐塩性向上用微生物混合物が共生している状態で、野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体の生存曲線がほぼ同一であったことから、耐塩性向上用微生物混合物の野生株に対する耐塩性向上効果は、ＰＥＲＫ１３の機能欠損によりもたらされる耐塩性向上効果であると考えられる。つまり、当該耐塩性向上用微生物混合物又はその分泌物が、ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストであり、当該耐塩性向上用微生物混合物が植物体の根に共生することによって、ＰＥＲＫ１３の機能が抑制又は阻害されることが示唆され、ＰＥＲＫ１３のアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させることによっても、ＰＥＲＫ１３の遺伝子欠損体と同様の耐塩性向上効果が得られることが示唆された。
［実施例５］
シロイヌナズナの野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体について、実施例４で取得した耐塩性向上用微生物混合物の、塩ストレス下における植物体の根へのナトリウム流入に対する影響を調べた。
まず、シロイヌナズナの野生株及びＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体について、それぞれ、種子を７０％エタノールと次亜塩素酸を用いて滅菌した後、１％スクロース含有ＭＳ培地のゲル平板培地上に播種し、このゲル平板培地を少なくとも底部が水耕栽培用の液体培地（１／２ＭＳ培地）に接する状態として、人工気象器内にて水耕栽培を行った。人工気象器は、２５℃、照度５０００ｌｕｘ、明期１６時間、暗期８時間の長日条件にした。種子が発芽してから１０〜１４日後に、当該植物体が置かれているゲル平板培地の底部が接触している液体培地を、終濃度２．５質量％又は１．０質量％の塩化ナトリウム含有１／２ＭＳ培地に交換し、さらに前記耐塩性向上用微生物混合物を添加した。その後、６時間水耕栽培して、前記耐塩性向上用微生物混合物存在下で塩ストレスをかけた。
塩ストレス後の植物体の根を、実施例３と同様にして、蛍光のナトリウムインジケーター（ＣｏｒｏＮａ−Ｇｒｅｅｎ ＡＭ）で染色し、野性株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体のうち、塩ストレス後の根の断面積当たりの蛍光強度を測定した。塩化ナトリウム濃度が２．５質量％で水耕栽培した植物体の結果を図５に、塩化ナトリウム濃度が１．０質量％で水耕栽培した植物体の結果を図６に、それぞれ示す。
この結果、実施例４で取得した耐塩性向上用微生物混合物の存在下では、野生株とＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体の根の断面積当たりの蛍光強度は、ほぼ同程度であり、有意差はなかった。これらの結果から、野生株において、前記耐塩性向上用微生物混合物により、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体都同様に塩ストレス環境下での根へのナトリウム流入が抑制されること、この根へのナトリウム流入抑制により、野生株の塩ストレス耐性が、ＰＥＲＫ１３の機能欠失変異体と同程度にまで改善されること、及び、前記耐塩性向上用微生物混合物が、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害する作用を有すること、がわかった。
［実施例６］
トマト（Solanum lycopersicum）のＰＥＲＫ１３機能欠失変異体を作製し、その耐塩性を調べた。
＜標的遺伝子の選定＞
トマトのゲノムＤＮＡに含まれている遺伝子のうち、シロイヌナズナのＰＥＲＫ１３に６０％以上の配列同一性のある３種の遺伝子（トマトのＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子）、ＳｌＰＥＲＫ９ｂ（Solyc05g010140.2.1）、ＳｌＰＥＲＫ１０（Solyc01g010030.2.1）、ＳｌＰＥＲＫ９ａ（Solyc04g006930.2.1）を標的遺伝子とするＲＮＡｉのベクターを構築した。これらは、互いにアミノ酸配列の配列同一性が９８％以上であり、トマトのＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子（ＮＣＢＩのＧｅｎｅ ＩＤが101266034）のパラログと考えられる。標的配列は各遺伝子の遺伝子翻訳領域の５’末端側の２００塩基とした。また、各遺伝子を同時にＲＮＡｉの標的配列とするため、遺伝子人工合成によって、ＳｌＰＥＲＫ１０遺伝子の標的配列（配列番号５）、ＳｌＰＥＲＫ９ａ遺伝子の標的配列（配列番号６）、及びＳｌＰＥＲＫ９ｂ遺伝子の標的配列（配列番号７）を連結した塩基配列からなるキメラ遺伝子を作製した。
＜ベクター構築＞
人工合成した前記キメラ遺伝子を、相同組換えによって、pBI-sense, anti sense-GWベクター（Clontech社製）の改変ベクターに導入した。具体的には、当該キメラ遺伝子を、当該改変ベクターのカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）プロモーターとノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列（ＮＯＳ）の発現カセットの間に、センス方向とアンチセンス方向にそれぞれクローニングし、ＳｌＰＥＲＫ遺伝子を標的とするＲＮＡｉ用ベクター（pBI-SlPERKs-sense, anti senseベクター）を構築した。当該ベクターの構造マップを図７に示す。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター制御下で転写された前記キメラ遺伝子のＲＮＡは、イントロンの切断を介して、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡを形成した。
＜トマトの形質転換＞
作製したＲＮＡｉ用ベクターをアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)ＧＶ３１０１系統に常法により導入し、組換えアグロバクテリウムを得た。トマト品種マイクロトム由来の子葉片に、得られた組換えアグロバクテリウムを感染させ、カルス形成培地にてカルス形成を誘導した。その後、薬剤耐性カルスを選抜し、再分化させた。
再分化により得られたトマト個体の葉からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行うことによって、前記キメラ遺伝子が導入された形質転換トマトを選抜した。葉からのＤＮＡ抽出及びＰＣＲは、以下の通りにして行った。
＜ＤＮＡ抽出＞
植物サンプル１００ｍｇを、液体窒素で凍結させて粉末状にした。この粉末に、３００μＬの抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ （ｐＨ８．０））と１５μＬの２０％ ＳＤＳを加えて混合してサンプル溶液を調製し、このサンプル溶液を６５℃、１０分間インキュベートした。インキュベート後のサンプル溶液は、９０μＬの５Ｍ 酢酸カリウムを添加した後、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった。上清を新しいチューブに移し、４００μＬのイソプロパノールを添加して、室温で２分間静置した後、１４，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行なった。得られたペレットを、５００μＬの７０％エタノールで洗い、乾燥後に１００μＬの水で溶解したものを、ＤＮＡサンプルとした。
＜ＰＣＲ＞
ＧｏＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、フォワードプライマー（5’-GTTCTTCTACACCATTTGCAGC、配列番号８）とリバースプライマー（5’-ATTGTGGTAGTGTTGGTAAGGC、配列番号９）の終濃度が０．２μＭになるようにＰＣＲ反応液を調製して、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で３分間保持した後、９５℃で３０秒間、次いで５５℃で３０秒間、次いで７２℃で３０秒間を１サイクルとするサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で３分間保持する、という条件で行なった。
＜耐塩性評価＞
得られた形質転換トマトは、導入された前記キメラ遺伝子により、トマトのＰＥＲＫ１３（ＳｌＰＥＲＫ）の機能が欠失したトマトである。このＰＥＲＫ１３機能欠失トマトを、塩化ナトリウムを終濃度が０．５、１．０、１．５、又は２．０質量％となるように含有させた１／２ＭＳ培地にて水耕栽培した。水耕栽培は、人工気象器内（２５℃、１６時間明期、８時間暗期）で行なった。野生型のトマトの場合、塩化ナトリウムを終濃度が０．５質量％となるように含有させた１／２ＭＳ培地で水耕栽培を行うと、栽培２１日目には、高濃度の塩化ナトリウムに耐え切れず、葉が白化し、根が褐変して枯れてしまう（図示せず。）。これに対して、ＰＥＲＫ１３機能欠失トマトでは、栽培２１日目において、０．５及び１．０質量％の塩化ナトリウム含有１／２ＭＳ培地では、いずれも葉が白化せずに生育している個体が確認された（図８）。また、１．５及び２．０質量％の塩化ナトリウム含有１／２ＭＳ培地では、葉の白化が観察されたが、根の褐変は観察されなかった。これらの結果から、トマトにおいても、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することにより、植物体の耐塩性を向上させられることがわかった。
［実施例７］
イネ（Oryza sativa）のＰＥＲＫ１３機能欠失変異体を作製し、その耐塩性を調べた。
＜標的遺伝子の選定及びノックアウト用ベクターの構築＞
イネのゲノムＤＮＡに含まれている遺伝子のうち、シロイヌナズナのＰＥＲＫ１３に７０％以上のアミノ酸配列の配列同一性のある遺伝子（イネのＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子）ＯｓＰＥＲＫ１３（Os03g056880、NCBI GeneID 4333279）を標的遺伝子とするノックアウト用ベクターを構築した。当該遺伝子をノックアウトの標的配列とするため、遺伝子人工合成によってＯｓＰＥＲＫ１３遺伝子の標的配列（配列番号１０）からなるポリヌクレオチドを作製した。イネＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子を標的とするノックアウト用ベクターpOsPERK-KO1は、人工合成した前記ポリヌクレオチドを、相同組換えによって、改変型pRIT1ベクター（Terada et al.，Nature Biotechnology，2002，vol.20，p.1030-1034)に導入して構築した。
＜イネの形質転換＞
イネの形質転換は、Toki らの方法（Plant Journal、２００６年、第４７巻、第６９〜７６ページ）の手法に沿って行った。まず、前記ノックアウト用ベクターをアグロバクテリウム菌ＥＨＡ１０１系統又はＬＢＡ４４０４系統に常法により導入し、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、イネ品種「日本晴」の胚盤由来カルスに感染させた。感染させたイネカルスを０．２５μＭ ビスピリバック塩を含む培地で培養し、ビスピリバック塩耐性カルスを選抜した。
選抜されたビスピリバック塩耐性カルスから、ＤＮＡ抽出キット「Ｍａｘｗｅｌｌ １６ ＬＥＶ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）」を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行うことによって、前記ノックアウト用ベクターが導入された形質転換カルスを選抜した。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ、タカラバイオ社製）とフォワードプライマー（5’- AAGCTCAAGCTCCAATACGCAAACCGCCTC、配列番号１１）とリバースプライマー（5’- GACGGTATCGATAAGCTTGGCGCGCCATTA、配列番号１２）を用いて、９４℃で１分間保持した後、９８℃で１０秒間、次いで６０℃で１５秒間、次いで６８℃で１分間を１サイクルとするサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に６８℃で７分間保持する、という条件で行ない、目的の大きさのＰＣＲ産物が得られたビスピリバック塩耐性カルスを、前記ノックアウト用ベクターが導入された形質転換カルスとして選抜した。
＜イネ植物体の再分化＞
前記ノックアウト用ベクターの導入が確認できたイネカルスを再分化培地へ継代し、２５℃の明所で約３週間培養した。その結果、ＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体と、非組換え再分化植物体とを得た。同様に、非組換えイネカルスからも再分化植物体を誘導した。
＜イネＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子のノックアウト状況確認
組換え再分化植物体におけるＯｓＰＥＲＫ１３遺伝子のノックアウト状況は、ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences）法により解析した。まず、各植物体からＤＮＡ抽出キット「Ｍａｘｗｅｌｌ １６ ＬＥＶ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）」を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、3g05688特異的プライマーである3g05688 No1-Fプライマー（5’-AGTCAAGCTTCGCCGGCGCCAATGCCGATGTGAGCCCGGC、配列番号１３）と3g05688 No1-Rプライマー（5’-TGACGAATTCGCTCCGGCACGACGAGGGTTCTCCTGCGCG、配列番号１４）を用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅産物は核酸精製キット「ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｅｒ（和光純薬社製）」を用いて精製した後、制限酵素（ＴｓｐＲＩ）処理し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片の切断状況を確認した。
標的遺伝子がノックアウトされた場合は、ＰＣＲ増幅断片中に存在する制限酵素の認識配列を含むＤＮＡ配列が失われるため、切断されないＰＣＲ増幅産物の存在によりノックアウト状況が判断可能となる。図９に、ＯｓＰＥＲＫ１３遺伝子由来のＰＣＲ増幅断片をＴｓｐＲＩ処理した消化物をアガロース電気泳動した結果を示す。図中、「ＷＴ」の「−ＲＥ」は、非組換え再分化植物体のＰＣＲ増幅断片をアプライしたレーンであり、「ＷＴ」の「＋ＲＥ」は、非組換え再分化植物体のＰＣＲ増幅断片をＴｓｐＲＩ処理した消化物をアプライしたレーンであり、「ＫＯ ｌｉｎｅｓ」の「＃１」〜「＃４」は、それぞれ、ＯｓＰＥＲＫ１３遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体のＰＣＲ増幅断片をＴｓｐＲＩ処理した消化物をアプライしたレーンである。ＣＡＰＳ法による解析の結果、図９に示すように、「ＷＴ」の「−ＲＥ」で観察されたバンドは「ＷＴ」の「＋ＲＥ」では観察されなかったのに対して、「ＫＯ ｌｉｎｅｓ」の「＃１」〜「＃４」では、「ＷＴ」の「−ＲＥ」と同様に未消化のＰＣＲ増幅断片のバンドが検出された。この結果から、得られた組換え再分化植物体のうちの複数個体において、ＯｓＰＥＲＫ１３遺伝子がノックアウトされていることが確認された。
＜イネＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト改変体の耐塩性評価＞
ＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体、及び非組換え再分化植物体は、個体ごとに１．５質量％の塩化ナトリウムを含む発根培地（固形１／２ＭＳ）に継代した。その後、人工気象器（２５℃、常時明期）にて約２週間育成し、植物体の表現型を観察した。
各植物個体を２週間生育させた時点の写真を図１０に示す。図中、「ＷＴ」が非組換え再分化植物体であり、「ＫＯ」がＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体である。また、図１０（Ａ）と（Ｃ）はそれぞれ植物個体の地上部の写真であり、図１０（Ｂ）は図１０（Ａ）に示す植物個体の地下部の写真であり、図１０（Ｄ）は図１０（Ｃ）に示す植物個体の地下部の写真である。図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、非組換え再分化植物体では、葉が全て黄変しており、また、基部が褐変しており、根はほとんど伸長しておらず、生長が停止していることが観察された。この葉の黄変、基部の褐変、及び根の伸長阻害は、いずれもナトリウム障害の典型的な表現型である。これに対して、ＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体では、葉の一部は黄変していたものの、緑の葉が伸長しており、また、複数の根が順調に伸長しており、生長していることが観察された。さらに、図１０（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、ＰＥＲＫ１３オーソログ遺伝子ノックアウト用ベクターを導入した組換え再分化植物体では、葉の黄変が観察されず、葉も根も健全に生長している個体もあった。これらの結果から、ＰＥＲＫ１３のイネオーソログ遺伝子であるＯｓＰＥＲＫ１３遺伝子をノックアウトした植物個体では耐塩性が向上し、１．５質量％の塩化ナトリウム環境下でも生育可能となること、すなわち、イネにおいても、ＰＥＲＫ１３の機能を抑制又は阻害することにより、植物体の耐塩性を向上させられることがわかった。

Claims (8)

  1. 植物体のＰＥＲＫ１３（Proline-rich extensin-like receptor kinase 13）の植物体内へのナトリウムイオンの流入を制御する機能を抑制又は阻害し、
    前記機能の抑制又は阻害を、ＰＥＲＫ１３遺伝子を欠損させる、又はＰＥＲＫ１３遺伝子にその機能を低下させる変異を導入することによって行う、植物体の耐塩性向上方法。
  2. 前記植物体が、非選択性陽イオンチャネル、細胞膜型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、及び高親和性カリウムトランスポーターからなる群より選択される１種以上の蛋白質の機能が亢進している、請求項１に記載の植物体の耐塩性向上方法。
  3. 前記植物体が、非選択性陽イオンチャネル、細胞膜型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、液胞型Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター、及び高親和性カリウムトランスポーターからなる群より選択される１種以上の蛋白質が過剰発現している、請求項１に記載の植物体の耐塩性向上方法。
  4. 前記植物体が、外来遺伝子が導入された形質転換体であり、
    前記外来遺伝子が、ＳＯＳ１遺伝子、ＳＯＳ２遺伝子、ＳＯＳ３遺伝子、ＮＨＸ１遺伝子、及びＨＫＴ１遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の植物体の耐塩性向上方法。
  5. 前記植物体が、双子葉植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体の耐塩性向上方法。
  6. 前記植物体が、単子葉植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体の耐塩性向上方法。
  7. 前記植物体が、イネ科の植物、ナス科の植物、アブラナ科の植物、ウリ科の植物、ブドウ科の植物、ミカン科の植物、バラ科の植物、マメ科の植物、ハス科の植物、ゴマ科の植物、アカザ科の植物、ヤシ科の植物、バショウ科の植物、アオイ科の植物、フトモモ科の植物、及びフウチョウソウ科の植物より選ばれる１種の植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体の耐塩性向上方法。
  8. 前記植物体が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード、キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、ブドウ、レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン、リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー、ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ、ハス、ゴマ、ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ、ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー、バナナ、バショウ、マニラアサ、ワタ、オクラ、ユーカリ、フウチョウソウ 、及びセイヨウフウチョウソウより選ばれる１種の植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体の耐塩性向上方法。
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