CN109640631A

CN109640631A - 提高植物体耐盐性的方法

Info

Publication number: CN109640631A
Application number: CN201780028506.5A
Authority: CN
Inventors: 小野世吾; 岛谷善平
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2016-06-17
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2019-04-16
Also published as: US20190169631A1; AU2017285758A1; WO2017217508A1; EP3409105A1; JPWO2017217508A1; JP2018186834A; JP6435060B2; US20220411812A1; JP2018186835A; SG11201809744YA; US20190345508A1; EP3409105A4

Abstract

本发明提供一种提高植物体耐盐性的方法，使得可以在高盐浓度环境下进行栽培。本发明提供一种提高植物体耐盐性的方法，其包括：抑制或阻碍植物体的PERK13(富含脯氨酸的伸展蛋白样受体激酶13，Proline‑rich extensin‑like receptor kinase 13)的功能。所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，使PERK13的拮抗剂与所述植物体的根接触。所述任一项中记载的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述拮抗剂是一种或两种以上的微生物或它们的分泌物质。所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，通过抑制PERK13基因的表达来抑制PERK13的功能，或者，通过阻碍PERK13基因的表达来阻碍PERK13的功能。

Description

提高植物体耐盐性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高植物体耐盐性的方法。

本申请基于在日本2016年6月17日提交的日本特愿2016-121235号、2016年12月13日提交的日本特愿2016-241469号、2017年4月25日提交的日本特愿2017-086654号、以及2017年5月19日提交的日本特愿2017-100286号主张优先权，并引用其内容。

背景技术

近年来，由于世界各国人口增加导致粮食产量增大，需要大量的农业用水，缺水成为严重的问题。地球上最多的水资源是海水，若能将海水用作农业用水，可以解决该问题。然而，由于渗透压引起的吸水抑制和基于钠离子对细胞内酶的抑制，大多数植物体不能在高盐浓度下生长。若能够将原本耐盐性低的植物体的耐盐性提高至耐受海水的盐浓度，可以期待使用海水进行栽培。

作为提高植物体耐盐性的方法，可列举：使用基因重组技术导入与耐盐机制有关的基因的方法。例如，存在通过在植物体细胞中积累渗透物(脯氨酸和甜菜碱)而得到对渗透压具有耐性的盐植物体。据报道，已导入该渗透物积累基因的重组植物体得到了耐盐性。

此外，植物体中的细胞内钠离子浓度主要含有控制向细胞内摄取的非选择性阳离子通道(Non-slective cation channel；NSCC)，控制向细胞外排放的细胞膜型Na⁺/H⁺反向运输(Salt Overly Sentitive1；SOS 1)的SOS通道、控制向液泡内的摄取的液泡型Na⁺/H⁺反向转运蛋白，以及控制钾离子和钠离子从导管流入的高亲和性钠钾转运蛋白(Highaffinity K Transporter(HKT))(参见非专利文献1)。例如，专利文献1公开了使作为耐盐植物体的盐芥(Thellungiella halophila)中的SOS1基因过度表达而得到的转化植物体中，钠离子向细胞外的排出得到了促进，并且耐盐性得到了提高。专利文献2公开了，使作为构成SOS通道的蛋白激酶的SOS2基因过度表达而得到的转化植物体的耐盐性得到了提高。专利文献3公开了使大麦(Hordeum vulgare)的液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(HvNHX 1)基因过度表达而得到的转化植物体中，钠离子向液泡内的摄取得到了促进，耐盐性得到了提高。在非专利文献2中公开了，使拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HKT基因过度表达而得到的转化植物体中，根部的钠离子的积累量增加，芽的盐浓度的增加受到抑制，植物体整体耐盐性得到了提高。

作为不使用基因重组技术而提高植物体的耐盐性的方法，正在研究对植物体添加具有赋予植物体耐盐性效果的试剂和微生物的方法。作为具有赋予耐盐性效果的药物，已知，例如，吡咯并喹啉醌(例如，参见专利文献4)及植物体激素的独脚金内酯等。此外，作为具有赋予耐盐性效果的微生物，例如，已知Paenibacillus fukuinensis(例如，参见专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际专利WO 2006/053246

专利文献2：国际专利WO 2006/079045

专利文献3：澳大利亚专利申请公开第2009201381号说明书

专利文献4：日本特许第5013326号公报

专利文献5：日本特开第2013-75881号公报

非专利文献

非专利文献1：Takeda and Matsuoka，Nature Reviews Genetics，2008.Vol.9，p.444-457.

非专利文献2：Moller，et.al.The Plant Cell，2009，Vol.21，p.2163-2178.

非专利文献3：Bai，et.al.The Plant Journal，2009，Vol.60，p.314-327.

发明内容

本发明要解决的技术问题

如非专利文献1中所公开的，已经在一定程度上明确了控制植物体中钠离子浓度的机制。另外，如专利文献1等所述，已知通过SOS1基因等与该机制有关的基因的过度表达，可以提高植物体的耐盐性。然而，已经证实在导入了与该机制的相关基因的转化植物体中，基本对约100mM的氯化钠具有耐受性，并且需要进一步提高耐盐性。

本发明的目的在于提供一种提高植物体耐盐性的方法，使得可以在高盐浓度环境下进行栽培。

解决问题的手段

本发明的发明人进行了深入地研究，结果，发现功能尚未得到确定的PERK13(富含脯氨酸的伸展蛋白样受体激酶13，Proline-rich extensin-like receptor kinase 13)，与控制植物体中钠离子浓度的机制相关，通过抑制PERK13的功能，可以提高植物体的耐盐性，从而完成了本发明。

本发明的提高植物体耐盐性的方法如下[1]～[16]。

1、一种提高植物体耐盐性的方法，其包括：抑制或阻碍植物体的PERK13(富含脯氨酸的伸展蛋白样受体激酶13，Proline-rich extensin-like receptor kinase 13)的功能。

2、根据上述1所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，使PERK13的拮抗剂与所述植物体的根接触。

3、根据上述2所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，拮抗剂是一种或两种以上的微生物或它们的分泌物质。

4、根据上述2或3所述的提高植物体耐盐性的方法，其包括：将所述植物体的根的至少一部分浸入含有所述拮抗剂的水溶液中的工序。

5、根据上述1所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，通过抑制PERK13基因的表达来抑制PERK13的功能，或者，通过阻碍PERK13基因的表达来阻碍PERK13的功能。

6、根据上述1或5所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，对于所述植物体，使PERK13基因缺损，或向PERK13基因导入使PERK13基因的功能降低的突变。

7、根据上述1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体中，选自非选择性阳离子通道、细胞膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及高亲和性钾转运蛋白中一种以上的蛋白质的功能亢进。

8、根据上述1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，

所述植物体中，选自非选择性阳离子通道、细胞膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及高亲和性钾转运蛋白中一种以上的所述蛋白质过度表达。

9、根据上述1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是导入了外源基因的转化体，所述外源基因是选自SOS1基因、SOS2基因、SOS3基因、NHX1基因及HKT1基因中的一种以上。

10、根据上述1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体为双子叶植物。

11、根据上述1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体为单子叶植物。

12、根据上述1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是选自禾本科植物体、茄科植物体、十字花科植物体、葫芦科植物体、葡萄科植物体、芸香科植物体、蔷薇科植物体、豆科植物体、莲科植物体、胡麻科植物体、藜科植物体、棕榈科植物体、芭蕉科植物体、锦葵科植物体、桃金娘科植物体和白花菜科植物体中的一种植物。

13、根据上述1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是选自稻、玉米、高粱、小麦、大麦、黑麦、稗子、小米、番茄、茄子、红辣椒、青椒、马铃薯、烟草、拟南芥、油菜、荠菜、萝卜、甘蓝、紫甘蓝、结球甘蓝、大白菜、青梗菜、羽衣甘蓝、水芹、小松菜、花茎甘蓝、花椰菜、芜菁、山萮菜、芥末、黄瓜、苦瓜、南瓜、甜瓜、西瓜、葡萄、柠檬、柑橘、脐橙、葡萄柚、橘子、酸橙、酸橘、柚子、扁平橘、桶柑、苹果、樱、梅子、桃子、草莓、枇杷、杏子、李子、西梅、扁桃、梨、西洋梨、覆盆子、黑莓、黑醋栗、蔓越橘、蓝莓、大豆、菜豆、豌豆、蚕豆、毛豆、绿豆、鹰嘴豆、莲、芝麻、菠菜、甜菜(beet)、甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris)、藜、苋(Amaranthaceae)、苋菜红(Amaranthus)、青葙、海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(oilpalm)、椰子、巴西莓、香蕉、芭蕉、蕉麻、棉、秋葵、桉树、白花菜及醉蝴蝶花中的一种以上。

14、一种植物体的栽培方法，其包括：在氯化钠浓度为1.5质量％以上的环境下栽培共生有微生物的植物体，该植物体的存活率为10％以上。

15、一种植物体，其中，PERK 13的功能被抑制或阻碍。

16、一种耐盐植物体的制造方法，其包括：抑制或阻碍该植物体的PERK13的功能。

发明的效果

通过本发明的提高植物体耐盐性的方法，可以提高原耐盐性低的植物体的耐盐性。由此，通过该方法提高了耐盐性的植物体，可以在氯化钠浓度比较高的环境下栽培。

附图说明

[图1]图1是实施例3中，盐胁迫后的拟南芥野生株的荧光钠指示剂的荧光染色图像。

[图2]图2是实施例3中，盐胁迫后的拟南芥的PERK13的功能缺损突变体的荧光钠指示剂的荧光染色图像。

[图3]图3是显示实施例3中，盐胁迫后的拟南芥的野生株的根及PERK13的功能缺损突变体的根的荧光强度的测定结果的图。

[图4]图4是显示在实施例4中，野生型拟南芥和PERK 13的功能缺损突变体在确定的用于提高耐盐性微生物混合物的共生下进行水培时，在各氯化钠浓度下的生存率的结果的图。

[图5]图5是显示在实施例5中，在实施例4中得到的提高耐盐性用微生物混合物的存在下，对拟南芥的野生株和PERK 13的功能缺损突变体，进行盐胁迫(钠浓度2.5质量％)，然后显示各植物体的根的荧光强度的测定结果的图。

[图6]图6显示在实施例4得到的提高耐盐性用微生物混合物存在下，对实施例5中的野生型拟南芥和PERK 13的功能缺损突变体施加盐胁迫(钠浓度1.0质量％)，然后，测定各植物体的根的荧光强度。

[图7]图7是将实施例6中构建的番茄SlPERK基因作为目标的RNAi载体(pBI-SlPERKs-sense，反义载体)的结构分布图(map)。

[图8]图8是实施例6中得到的转化番茄在氯化钠浓度为0.5质量％或1.0质量％的环境下，进行21天水培栽培时的照片。

[图9]图9是显示使用从实施例7中制备的重组再分化植物体提取的基因组DNA作为模板得到的PCR产物的TspRI处理产物的电泳结果的图。

[图10]是显示实施例7中，将稻的非重组再分化植物体(WT)和导入PERK13直系同源基因敲除用载体的重组再分化植物体(KO)在1.5质量％的氯化钠浓度环境下进行2周生长时的照片。

具体实施方式

本发明的提高植物体耐盐性的方法包括：抑制或阻碍植物体的PERK13的功能。如以下的实施例中所述，在PERK13基因中导入突变并且其功能受到抑制的突变体中，钠离子从根流入植物体中被抑制，提高耐盐性。PERK13是在植物体的根中特异性表达的膜蛋白质，并且在细胞中具有激酶活性位点。从氨基酸序列的相似性，推断PERK13与具有促进NSCC的钙离子流入的作用的受体PERK 4(富含脯氨酸的伸展蛋白样受体激酶4，Proline-richextensin-like receptor kinase 4)(参见，例如，非专利文献3)具有相同的作用效果，但是根据本发明人的研究发现，其与控制钠离子流入植物体内的机制相关。

如非专利文献1中所述，钠离子浓度的控制机制在广泛的植物体中相同。作为该机制的一部分，PERK13是存在于多种植物体中的蛋白质，在许多植物体中具有控制钠离子流入植物体的作用。例如，作为PERK13基因，可列举NCBI的基因ID为At1g70460(拟南芥(Arabidopsis thaliana))的PERK13基因的直系同源基因，具体而言，可列举：NCBI的基因ID为101266034(番茄，Solanum lycopersicum)、107059185(马铃薯，Solanum tuberosum)、107279382(粳稻组，Oryza sativa Japonica Group)、4333279(粳稻组，Oryza sativaJaponica Group)、102703815(短花药野生稻，Oryza brachyantha)、103649394(玉米，Zeamays)、106804357(小米，Setaria italica)、101775206(小米，Setaria italica)、106322706(甘蓝，Brassica oleracea)、106405068(欧洲油菜，Brassica napus)、106416704(欧洲油菜，Brassica napus)、103852653(芜菁，Brassica rapa)、101215732(黄瓜，Cucumis sativus)、100247217(葡萄，Vitis vinifera)、104882493(葡萄，Vitisvinifera)、104822150(醉蝶花，Tarenaya hassleriana)、102616604(橙子，Citrussinensis)、105766022(雷蒙德氏棉，Gossypium raimondii)、104438961(大桉，Eucalyptusgrandis)、100807815(大豆，Glycine max)、106779893(绿豆，Vigna radiata)、101497672(鹰嘴豆，Cicer arietinum)、103321809(梅，Prunus mume)、103927247(梨，Pyrus xbretschneideri)、104586282(菡萏，Nelumbo nucifera)、100832398(二穗短柄草，Brachypodium distachyon)、103708226(海枣，Phoenix dactylifera)、105049377(油棕，Elaeis guineensis)、103989453(芭蕉，Musa acuminata)、105172671(芝麻，Sesamumindicum)、104904972(甜菜，Beta vulgaris subsp.vulgaris)、18429568(无油樟，Amborella trichopoda)、以及103452847(苹果，Malus domestica)等。

在本发明的提高植物体耐盐性的方法中，作为功能被抑制或阻碍的PERK 13，只要保留了PERK 13的功能即可，没有特别限定。本发明的提高植物体耐盐性的方法中，作为抑制或阻碍该功能的PERK13，可以是野生型植物体中存在的野生型PERK13，也可以是通过突变产生的PERK13突变体，还可以是通过紫外线照射处理等各种诱变处理而导入了变异的PERK13突变体，或者可以是通过基因修饰技术等进行了修饰的PERK13修饰体。例如，具有的PERK13是作为PERK13修饰体的植物体，所述PERK13修饰体通过对野生型PERK13进行各种修饰处理，基于PERK13产生的钠离子流入促进功能得到增强或减弱，通过本发明的提高植物体耐盐性的方法可以提高耐盐性。

作为为了提高植物体的耐盐性，抑制或阻碍植物体具有的PERK13的功能的程度，可列举，例如：就在1.0质量％氯化钠环境下对该植物体进行6至24小时的水培时的根中的氯化钠而言，将抑制或阻碍PERK 13的功能前的植物体在相同条件下栽培时的根中的氯化钠的量设为100％时，为90％以下，优选为80％以下，更优选为60％以下，进一步优选为50％以下，更进一步优选为40％以下，特别优选为30％以下。植物体根的氯化钠的相对量，例如，以与钠离子结合的荧光物质进行荧光染色时的根内部的荧光强度作为指标来测定。

对抑制或阻碍植物体原本具有的PERK13功能的方法，没有特别限制，可以是降低PERK13表达水平的方法，可以是使基因组DNA中的PERK13基因中导入了突变从而功能降低的PERK13突变体表达的方法，或者可以是抑制PERK13的细胞内信号转导的方法。

为了提高植物体的耐盐性而降低该植物体具有的PERK13的表达水平时，将降低前的植物体的PERK13的表达水平设为100％，优选：降低后的植物体的PERK13的表达水平为90％以下，优选为80％以下，更优选为60％以下，进一步优选为50％以下，更进一步优选为30％以下，特别优选为0％(完全不表达的状态)。植物体的PERK13的表达水平可以通过RT-PCR方法等该技术领域中用于测定蛋白质表达水平的各种方法测定。为了提高植物体的耐盐性而降低植物体所具有的PERK13的功能时，降低后的植物体的PERK13的功能设为100％时，优选：降低后的植物体的PERK13的功能为90％以下，优选为80％以下，更优选为60％以下，进一步优选为50％以下，更进一步优选为30％以下，特别优选为0％(完全丧失功能)。

作为降低PERK13的表达水平的方法，可以是修饰基因组DNA的方法，也可以是RNA干扰等不对基因组DNA进行修饰的方法。修饰基因组DNA以降低PERK13表达水平的方法，可列举：删除PERK13基因的方法，将无义突变导入至PERK13基因的方法，对PERK13基因的启动子序列等表达调控序列进行修饰的方法等。使PERK13功能降低或丧失的突变，可列举，例如：处于PERK13的细胞内区域的激酶结构域中，使激酶活性消失或下降等突变；在处于PERK13的细胞外区域中的配体结合位点，使与配体的亲和力降低的突变。

作为修饰基因组DNA中的PERK13基因区域的方法，广泛使用如下方法：利用同源重组，将全部或部分的PERK13基因区域置换为其他的DNA片段的方法。例如，将编码PERK13基因的区域置换为编码其他基因的DNA片段，或者置换为编码导入了突变的PERK13突变基因的DNA片段，由此，可以使PERK13缺损，使变异型PERK13表达代替野生型PERK13。同源重组所要求的碱基序列的同源性(序列同一性)优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。需要说明的是，已经在许多植物体中建立了通过同源重组进行的基因操作法。例如，将含有通过同源重组置换的DNA片段的转化用载体，导入至以提高耐盐性为目的的植物体的愈伤组织以制备转化体，通过使得到的转化体分化得到具有PERK13基因区域已被修饰的基因组DNA的植物体。可以通过常规方法制备未分化的愈伤组织。另外，作为转化用载体，可以是直链状DNA，也可以是质粒。载体向愈伤组织等植物体细胞中的导入，可以通过土壤杆菌(Agrobacterium)法、粒子枪法、聚乙二醇法、电穿孔(电穿孔法)、脂质体法、磷酸钙沉淀法、脂质转染法、显微注射法等本领域技术人员公知的各种方法进行。

RNA干扰可以如下实施：向植物体导入PERK13基因的cDNA的部分区域(RNAi(RNA干扰)目标区域)的、包含有义链和反义链的双链结构的siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)或者mi RNA(micro RNA)。可以作为目标的植物体细胞中，导入能够产生siRNA等的RNAi诱导载体。siRNA、shRNA、mi RNA以及RNAi诱导载体的制备可以由作为目标的PERK13基因的cDNA的碱基序列信息通过常规方法设计和制造。另外，RNAi诱导载体也可以通过将RNAi目标区域的核苷酸序列插入至各种市售RNAi载体的核苷酸序列中来制备。RNAi的诱导载体的导入，可以以与导入上述转化载体相同的方式导入。

作为抑制PERK13的细胞内信号转导的方法，可以是使PERK13的拮抗剂与植物体的根的表面接触的方法，也可以是将抑制PERK13的激酶活性的抑制剂导入至植物体的根的细胞的方法。如图1所示，PERK13的拮抗剂是指通过与PERK13的细胞外区域结合，抑制PERK13的配体与PERK13结合的物质。从不需要修饰基因组DNA并且处理更方便的观点出发，作为提高本发明的植物体的耐盐性的方法，特别优选使PERK13的拮抗剂与植物体的根的表面接触的方法。

本发明中使用的PERK 13的拮抗剂可以是化合物，可以是一种或两种以上种微生物，也可以是一种或两种以上微生物的分泌物质。该拮抗剂是特定微生物的分泌物质时，该微生物的培养上清液可以直接使用，或者可以使其粗糙纯化产物与植物体的根的表面接触。

作为使PERK13的拮抗剂与植物体的根的表面接触的方法，在植物体的根的至少一部分以浸入栽培用溶液中的状态下进行栽培的水栽法时，代替栽培用栽培用溶液，通过将植物体的根的至少一部分部浸入含有PERK13拮抗剂的处理溶液中一段时间，使该拮抗剂与植物体的根的表面的PERK13结合，从而抑制PERK13的功能，抑制钠离子从植物体的根流入，并提高该植物体的耐盐性。处理溶液的组成，特别是盐的组成可以与栽培用溶液相同，也可以不同。另外，PERK 13的拮抗剂可以直接与栽培用溶液混合。以土壤栽培植物体时，可以用含有拮抗剂的水溶液润湿种植有植物体的土壤，并且可以将含有拮抗剂的颗粒配置于土壤中的根附近。

本发明中作为提高耐盐性的植物体没有特别限制，在基因组DNA中原本具有PERK13基因或其同源基因的植物体即可，可以是被子植物，也可以是裸子植物，也可以是蕨类植物体或苔藓。而且，可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。具体而言，稻、玉米、高粱、小麦、大麦、黑麦、稗子、小米等禾本科植物；番茄、茄子、红辣椒、青椒、马铃薯、烟草等茄科植物；拟南芥、油菜、荠菜、萝卜、甘蓝(Petit vert)、紫甘蓝、结球甘蓝、大白菜、青梗菜、羽衣甘蓝、水芹、小松菜、花茎甘蓝、花椰菜、芜菁、山萮菜、芥末等十字花科植物体；黄瓜、苦瓜、南瓜、甜瓜、西瓜等瓜科植物；葡萄等葡萄科植物；柠檬、柑橘、脐橙、葡萄柚、橘子、酸橙、酸橘、柚子、扁平橘、桶柑等橘科植物；苹果、樱、梅子、桃子、草莓、枇杷、杏子、李子、西梅、扁桃、梨、西洋梨、覆盆子、黑莓、黑醋栗、蔓越橘、蓝莓等蔷薇植物；大豆、菜豆、豌豆、蚕豆、毛豆、绿豆、鹰嘴豆等豆科植物；莲(莲藕)等莲科植物；芝麻等胡麻科植物；菠菜、甜菜(beet)、甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris)、藜、苋(Amaranthaceae)、苋菜红(Amaranthus)、青葙等藜科植物；海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(oil palm)、椰子、巴西莓、香蕉、芭蕉、蕉麻等芭蕉科植物；棉、秋葵等锦葵科植物；桉树等桃金娘科植物；白花菜和醉蝴蝶花等白花菜科植物。

本发明的提高植物体的耐盐性的方法中，除了抑制或阻碍PERK13的功能之外，可以对使植物体的根的细胞中的钠离子浓度降低的其他处理进行组合使用。作为降低植物体的根的细胞内钠离子浓度的处理，可列举，例如：使植物体的选自非选择性阳离子通道、细胞膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白和高亲和性钾转运蛋白中的一种以上蛋白质的功能亢进。作为上述蛋白质，可列举：SOS1、SOS2、SOS3、NHX1和HKT1(非专利文献1)。通过提高蛋白质的表达水平使这些蛋白质的功能亢进。

通过导入编码该蛋白质的外源基因并转化，可以提高植物体中蛋白质的表达水平。作为该外源基因，可以是来源于与待导入植物体相同物种的生物的基因，或者可以是源自异源生物的基因。本发明的提高植物体耐盐性的方法中，关于导入来自与提高耐盐性的目标植物体同种或异种的SOS1基因、SOS2基因、SOS3基因、NHX1基因和HKT1基因的一种以上的外源基因的转化体，优选抑制或阻碍PERK13的功能。外源基因向植物体的导入，可以使用组入了含有编码外源基因的DNA片段的转化载体，并与导入上述转化载体相同的方式进行。

通过本发明的提高植物体耐盐性的方法，可以得到与抑制或阻碍PERK13功能之前的植物体相比耐盐性提高的植物体。就本发明的提高植物体耐盐性的方法而言，优选在耐盐性得到提高之前植物体只能生长10％～50％程度的钠浓度的环境下，使耐盐性提高到能够生长的程度，更优选在耐盐性得到提高之前植物体只能生长10％～30％程度的钠浓度的环境下，使耐盐性提高到能够生长的程度，进一步优选在耐盐性得到提高之前植物体只能生长10％以下程度的钠浓度的环境下，使耐盐性提高到能够生长的程度。

通过本发明的植物体耐盐性提高方法得到的植物体，可以使用钠离子浓度高的栽培用溶液进行水栽法来进行栽培，或者使用钠离子浓度高的土壤的土壤栽培来进行栽培。例如，通过本发明的提高植物体耐盐性的方法，有时可以得到即使使用如下栽培用溶液也能够栽培的植物体，所述栽培用溶液的钠离子浓度为0.2质量％以上，优选为0.5质量％以上，更优选为1质量％以上，进一步优选为1.5质量％以上，更进一步优选2.0质量％以上，特别优选2.5质量％以上。

作为耐盐性得到了提高的植物体的栽培中所使用的栽培用溶液，优选除氯化钠以外还含有氯化镁，更优选含有0.5质量％以下的氯化镁，进一步优选含有0.1～0.5质量％的氯化镁。

该栽培用溶液除氯化钠及氯化镁以外，优选还含有植物体生长所必须的各种营养成分。该营养成分可根据栽培的植物体的种类进行适当调整。特别是，优选以盐类的形式含有植物体生长所必需的氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、锰、铜、钼、硼等元素。另外，根据植物体的种类作，有时以盐类的形式含有铝及硅等元素。另外，可以根据植物体的生长阶段而改变栽培用溶液的组分。

作为该栽培用溶液，可以使用，例如，通过向市售液体肥料中加入以氯化钠为主的不充分的盐类而得到的溶液，或通过用海水代替水对市售的浓缩液体肥料进行稀释而得到的溶液。还可以使用在海水中适当添加磷等不充分的盐类而得到的溶液。

耐盐性得到了提高的植物体的水栽培，可以通过一般的水栽法进行。例如，可以通过淹水式水培方法进行，其将相对大量的培养溶液置于培养槽中，或者通过薄膜水栽法进行，其栽培用溶液少量多次地流到具有缓坡的平面上。

实施例

下文中，将参考实施例更具体说明本发明，但是本发明不限于这些实施例。

[实施例1]

对向拟南芥中导入了随机突变的突变体库，对具有耐盐性得到了提高的突变体进行筛选，并筛查有助于提高耐盐性的基因。该筛选使用属于类芽孢杆菌(Paenibacillus)属的微生物。类芽孢杆菌细菌促进氯化钠向拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞的流入。因此，类芽孢杆菌属共存下的拟南芥，即使在通常不会枯死0.5％重量的氯化钠环境下也会死亡。利用该特性，筛选在类芽孢杆菌存在的情况下也能使耐盐性提高的基因。

首先，用EMS(乙基甲磺酸)对拟南芥(Col-0)的种子进行处理，制备导入了随机突变的突变体库。将该库的种子用次氯酸灭菌，然后接种于MS(Murashige-Skoog)培养基的凝胶平板培养基上，在至少使凝胶板培养基的底部接触液体培养基的状态下进行水栽栽培。作为液体培养基，使用1/2MS培养基(MS培养基用等量水稀释得到的液体培养基)。

在发芽后2周龄时，向氯化钠处理用的植物体加入最终浓度达到0.5质量％的量的氯化钠和类芽孢杆菌属菌，并且进行1周的水栽栽培。对照处理用植物体中，仅加入类芽孢杆菌属菌，并且进行1周的水栽栽培。

结果，作为对照的野生株由于与类芽孢杆菌属菌的共存效应发生了枯死，但是约25000个随机突变株中的10株正常生长而没有死亡。从这10株中的4株收获种子，培育拟南芥，从叶中提取基因组。通过下一代序列对提取的基因组的核苷酸序列进行分析，发现这四株的全部突变体中均在PERK13基因(At1g70460)中导入有共同的突变。该PERK13基因的突变是在chr 5：13434602位置插入单核苷酸，由此导致移码，结果发现这些突变体丧失了PERK13的功能。需要说明的是，除了PERK13基因外，这四种菌株突变体没有其他的共有的突变基因。

如本实验所示，在PERK13基因中具有移码突变的突变体中，抑制了由类芽孢杆菌属菌引起的促进氯化钠流入植物体的影响，耐盐性得到了提高。根据这些结果，发现通过抑制或阻碍PERK13的功能，抑制或阻碍钠离子流入根部，提高植物体的耐盐性。

[实施例2]

在实施例1中，将确认为PERK13功能缺损型突变体的4株中的2株在1.5质量％氯化钠环境下栽培，检查其耐盐性。

具体而言，以次氯酸对种子进行灭菌后，将种子接种于MS培养基的凝胶平板培养基上，在至少使该凝胶平板培养基的底部与液体培养基接触的状态下进行水栽栽培。作为液体培养基，使用1/2MS培养基。对于各种突变体，分别播种24个作为氯化钠处理的种子和24个作为对照处理的种子。在发芽后2周龄时，向氯化钠处理用的植物体中加入最终浓度达到1.5质量％的量的氯化钠，并且进行水栽栽培1周。对照处理用植物中没有添加任何物质，并且进行水栽栽培一周。作为对照，对野生株进行相同的水栽栽培。

结果，进行了对照处理的植物体，即在没有添加氯化钠的1/2MS培养基中进行栽培的植物体中，野生株和PERK13功能缺损型突变体的24个个体均正常生长，并未枯死。在用氯化钠处理的植物体中，24个野生型植物体中的20个死亡([枯死植物个体数量]/[植物个体总数]＝20/24)，相对于此，2株PERK13功能缺损变异体均枯死的植物体个数在4个以下，大部分在含有1.5质量％氯化钠的液体培养基中生长而没有死亡([枯死植物个体数]/[植物个体总数])≤4/24)。通过该结果可以确认，通过抑制或阻碍PERK13的功能可以抑制钠离子从根部流入，提高植物体的耐盐性。

[实施例3]

在PERK 13的功能缺损突变体中，对实施例2中进行了耐盐性检测的2株中的一株的根的钠的量进行检测。

具体而言，以70％乙醇和次氯酸对种子进行灭菌，然后接种于含有1％蔗糖的MS培养基的凝胶平板培养基上，并将该凝胶平板培养基在至少底部与水栽培用液体培养基(1/2MS培养基)接触的状态下，在人工气候箱中进行水栽栽培。人工气候容箱中设定的条件为，温度25℃，照度5000lux，光照时间16小时，黑暗时间8小时。发芽后10天～14天后，与凝胶板培养基底部接触的液体培养基更换为含有氯化钠的最终浓度为1.0质量％的1/2MS培养基，并且进行水栽栽培6～24小时，并施加盐胁迫。对照处理用的植物体的液体培养基不添加任何物质，进行相同时间的栽培。

盐胁迫后的植物体的根用50μMCoroNa(注册商标)-Green AM溶液进行荧光染色，并用水洗涤该根的表面。用共聚焦激光扫描显微镜观察洗涤后根的内部。CoroNa-Green AM是通过与钠离子结合来增加绿色荧光强度的钠指示剂。在野生株及PERK13的功能缺损突变体中，盐胁迫后的根的荧光染色图像如图1和图2所显示。另外，在野生株及PERK13的功能缺损突变体中，盐胁迫后的根的单位横截面积的荧光强度的测定结果示于图3中。

在未经受盐胁迫的对照处理的植物体的根中，野生株及PERK13的功能缺损突变体中的任一者中，内部几乎未观察到绿色荧光(未显示)。对此，在野生株的根(图1)中，在内部绿色荧光很强，可确认由于盐胁迫钠离子的流入显著增加。对此，在PERK13功能缺损的突变体的根中(图2)，几乎观察不到绿色荧光，证实即使施加盐胁迫钠离子的流入也不会增加。根据该结果，可知PERK13与根中钠离子的流入相关，PERK13功能缺损的突变体中的盐胁迫耐受性的提高是基于在高盐浓度环境下抑制钠离子流入植物体内而产生的。

[实施例4]

使用野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)，从土壤中提取的微生物，筛选出具有提高耐盐性的共生效应的植物体共生菌群。

<微生物悬浮液的制备>

将在冲绳县回收的1g土壤悬浮于缓冲溶液中，充分搅拌，并用作微生物悬浮液。

<盆的制备>

将含有蔗糖的MS琼脂培养基(在MS培养基中加入0.5％(w/v)蔗糖和0.9％(w/v)琼脂的培养基)注入顶部和底部开口的圆柱形盆中，进行固化，制备用于培育植物体的盆。装有含有蔗糖的MS培养基(向MS培养基加入0.5％(w/v)蔗糖的液体培养基)的8个容器中，每个容器中分别设置多个该盆。

<种子的次氯酸处理>

拟南芥种子(Col-0)购自LEHLE公司(Round Rock TX，USA)。种子在浸入1％次氯酸的状态下搅拌1分钟，由此对种子的表面进行灭菌，然后，通过离心处理除去次氯酸。除去次氯酸处理后的种子，用灭菌水冲洗三次，然后，接种于所述盆的上部，并在黑暗中在4℃下储存24小时。

<植物体的水培植物体>

准备多个所述盆，全部设置于装有含蔗糖的MS培养基(向MS培养基添加含有0.5％(w/v)蔗糖的液体培养基)的一个容器中。设置各个盆，使得底面浸没于含有蔗糖的MS培养基，但顶面不会浸没的状态。在这些盆的上部，播种经次氯酸处理后用无菌水洗涤三次的野生型种子。将种子在25℃下，光照期16小时和黑暗期8小时的长日照条件下，在培养箱中培育14天。

<盐胁迫和微生物接种>

经过14天的水栽栽培后，浸泡于罐底部的含蔗糖的MS培养基中加入灭菌后的5M氯化钠水溶液，并使氯化钠的最终浓度为1质量％，进一步添加100μl的微生物悬浮液。然后，将该盆培养14天。

<具有提高盐胁迫耐受性作用的微生物的回收>

在盐胁迫下培养14天后，将生长的植物体的根与地上部分(叶和茎)切断，回收根，进行均质化，得到第一微生物回收溶液。

除使用下述溶液以外，同样地操作，进行水栽栽培，所述溶液通过向加入了氯化钠并使氯化钠的最终浓度为1.5质量％的含蔗糖的MS培养基中，添加所述第一微生物回收溶液100μL，在盐胁迫下培养14天后，将生长的植物体的根与地上部分(叶和茎)切断，回收根，进行均质化，得到第二微生物回收溶液。

除使用下述溶液以外，同样地操作，进行水栽栽培，所述溶液通过向加入了氯化钠并使氯化钠的最终浓度为3.0质量％的含蔗糖的MS培养基中，添加所述第二微生物回收溶液100μL，在盐胁迫下培养14天后，将生长的植物体的根与地上部分(叶和茎)切断，回收根，进行均质化，得到第三微生物回收溶液。

拟南芥，通过第3微生物回收溶液中含有的微生物混合物与植物体的根共生，从而使植物体在盐胁迫下生长。即，第3微生物回收溶液中含有的微生物混合物或它们的分泌物质具有提高植物体耐盐性的作用，即该微生物混合物是盐胁迫下的使植物体能够生长的植物体共生细菌群。

<微生物的确定>

对筛选出的、构成使植物体能够在盐胁迫下生长的植物体共生菌群(用于提高耐盐性的微生物混合物)的微生物进行确定。

首先，从所述第三微生物回收溶液中回收菌体，并使用GenElute BacterialGenomic DNA kit(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)从回收的菌体的一部分得到基因组DNA。

使用回收的基因组DNA作为模板，使用正向引物

(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，SEQ ID NO：1)和反向引物(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID NO：2)，通过PCR对16SrDNA进行扩增。PCR的温度条件是在95℃下保持3分钟的加热工序，然后，在95℃下保持30秒钟的变性工序，在50℃下保持30秒钟的退火工序，在72℃保持1分钟30秒钟的延伸工序构成的循环，进行30次上述循环后，最后再进行72℃下保持5分钟条件下的延伸反应。通过1.2％琼脂凝胶电泳确认得到的PCR产物，并使用QIAquick gel extraction kit(Quiagen，Germantown，MD，USA)从凝胶中提取。使用TOPO-TA cloning kit(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)将提取的PCR产物插入质粒中，并转化到大肠杆菌中。随机取30个在含氨苄青霉素的LB平板培养基上培养过夜的大肠杆菌菌落，移植于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养。使用QIAprepspin miniprep kit(Quiagen)从培养的大肠杆菌中纯化质粒。使用BigDye terminatorv3.1Cyclesequence kit(Life Techonologies)对纯化的质粒进行Thermalcycle反应(热循环反应)，并用DNA测序仪(ABI 3130×L)对组入该质粒中的16S rDNA的核苷酸序列进行确定。结果，确定了两种16S rDNA(YROK-1株和YROK-2株)。

对序列已经确定的两种16S rDNA的碱基序列分别进行EzBIOCloud搜索，结果表明两株中，YROK-1株(SEQ ID NO：3)与硝基愈疮木胶节杆菌(Arthrobacternitroguajacolicus)(登录号：AJ 512504)的序列同源性为98.89％，YROK-2株(SEQ ID NO：4)与Arthrobacter psychrochitiniphilus(登录号：AJ810896)的序列同一性为97.14％。根据这些结果，发现YROK-1株是硝基愈疮木胶节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)的新型株，YROK-2株是Arthrobacter psychrochitiniphilus的新型株。

此外，从确定的52个转化体中插入的16S rDNA的比例，对两种微生物的存在比率进行测定，硝基愈疮木胶节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)YROK-1株为98.0％，Arthrobacter psychrochitiniphilus YROK-2株为2.0％。

<确定的耐盐性提高用微生物混合物的提高耐盐性的共生效应>

对于拟南芥的野生株和PERK13的功能缺损突变体，对确定的耐盐性提高用微生物混合物的耐盐性提高效果进行测定。

首先，与上述<植物体的水栽栽培>相同地操作，准备通过盆栽进行水栽栽培14天的植物体。将该盆的底部浸泡于含有蔗糖的MS培养基，加入灭菌的5M氯化钠水溶液，使氯化钠的最终浓度为0质量％、0.5质量％、1.0质量％、1.5质量％、2.0质量％、2.5质量％或3.0质量％，进一步加入上述耐盐性提高用微生物混合物，然后进行水栽栽培，对水栽栽培14天后的存活率进行测定。作为对照，在未添加耐盐性提高用微生物混合物的培养溶液中，以相同方式进行水栽栽培，并对培养14天后的存活率进行测定。

存活率的测定结果显示于图4。在该图中，“无微生物WT”表示在没有共生耐盐性提高用微生物混合物的状态下栽培的野生型的结果，“有微生物WT”表示共生有耐盐性提高用微生物混合物的状态下栽培的野生型的结果，“有微生物MT”表示在共生有耐盐性提高用微生物混合物的状态下栽培PERK13的功能缺损突变体的结果。

结果，在野生株中，没有共生耐盐性提高用微生物混合物时，氯化钠浓度为1质量％时存活率为10％以下，对此，共生耐盐性提高用微生物混合物时，氯化钠浓度1质量％时的存活率高达90％以上，与PERK 13的功能缺损突变体相同，即使氯化钠浓度为3质量％，存活率也为30％以上。如图4所示，在共生耐盐性提高用微生物混合物时，氯化钠浓度为2％以上时，PERK13的功能缺损突变体的存活率略高于野生株的存活率。推测可能是，耐盐性提高用微生物混合物，不仅通过PERK13的功能缺损途径，而且还可能对提高耐盐性的其他途径产生某些影响。

在耐盐性提高用微生物混合物共生的状态下，野生株和PERK13的功能缺损突变体的存活曲线几乎相同，因此对耐盐性提高用微生物混合物对野生株的耐盐性的提高效果被认为是PERK13的功能缺损带来的耐盐性提高效果。即，暗示了该耐盐性提高用微生物混合物或它们的分泌物是PERK13的拮抗剂，该耐盐性提高用微生物混合物和植物体的根共生，由此来抑制或阻碍PERK13的功能，暗示了将PERK13拮抗剂与植物体的根的表面接触也可以得到与PERK13基因缺损体相同的耐盐性提高效果。

[实施例5]

关于拟南芥的野生株和PERK13的功能缺损型突变体，研究了实施例4中得到的耐盐性提高用微生物混合物对盐胁迫下的植物体的钠离子流入根的影响。

首先，分别用70％乙醇和次氯酸对拟南芥的野生株和PERK13的缺损突变体的种子进行灭菌，然后在含有1％蔗糖的MS培养基的凝胶平板培养基上接种，并且至少使凝胶板培养基的底部与用于水栽栽培的液体培养基(1/2MS培养基)接触，将人工气象箱设定为25℃，在照度5000lux，光照期16小时，黑暗期8小时的长日照条件。在种子发芽后10～14天后，将该植物体放置的凝胶板培养基的底部接触的液体培养基，交换为含有最终浓度为2.5质量％或1.0质量％的氯化钠的1/2MS培养基，并且添加所述耐盐性提高用微生物混合物。然后，水栽栽培6小时，在所述耐盐性提高用微生物混合物的存在下施加盐胁迫。

盐胁迫后的植物体的根，与实施例3同样地操作，用荧光钠指示剂(CoroNa-GreenAM)染色，在野生株和PERK13功能缺损突变体中，对盐胁迫后的根染色，测定盐胁迫后的根的单位横截面积的荧光强度。图5显示了在氯化钠浓度为2.5质量％时进行了水栽栽培的植物体的结果，图6显示了在氯化钠浓度为1.0质量％时进行了水栽栽培的植物体的结果。

结果，在实施例4中得到的在耐盐性提高用微生物混合物的存在下，野生型菌株和PERK13的功能缺损突变体的单位横截面积的根的荧光强度几乎相同，并不存在显著差异。从这些结果可以确认，在野生型菌株中，与PERK13的功能缺损突变体相同，通过上述耐盐性提高用微生物混合物抑制盐胁迫环境下的钠离子流入根，通过抑制流入，野生型菌株的盐胁迫耐受性提高到与PERK 13的功能缺损突变体相同的程度，并且上述耐盐性提高用微生物混合物具有抑制或阻碍PERK 13的功能的作用。

[实施例6]

制备番茄(Solanum lycopersicum)的PERK13功能缺损突变体并研究其耐盐性。

<目标基因的选择>

在番茄基因组DNA中包含的基因中，构建与拟南芥的PERK13的序列具有60％以上的同源性的三种基因(番茄的PERK13直系同源基因)：SlPERK 9b(Solyc 05g 010140.2.1)、SlPERK 10(Solyc 01g 010030.2.1))、SlPERK 9a(Solyc 04g 006930.2.1)作为目标基因的RNAi载体。它们相互间氨基酸序列序列同源性为98％以上，是番茄的PERK13直系同源基因(NCBI的Gene ID为101266034)的旁系同源基因。目标序列是各个基因的基因翻译区的5'末端侧是200个碱基。另外，为使各个基因同时制成RNAi，通过人工合成基因，制备SlPERK10基因的目标序列(SEQ ID NO：5)、SlPERK9a基因的目标序列(SEQ ID NO：6)和SlPERK9b基因的目标序列(SEQ ID NO：7)彼此连接的碱基序列组成的嵌合基因。

<构建载体>

通过同源重组将人工合成的嵌合基因导入pBI-sense、anti sense-GW载体(Clontech)的修饰载体中。具体而言，对该嵌合基因，该修饰载体花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子和胭脂碱合成酶基因终止子序列(NOS)的表达盒之间，分别在有义和反义方向上进行克隆，构建了将SlPERK基因作为目标的RNAi用载体(pBI-SlPERKs-sense、antisense)。该载体的结构分布图(map)如图7所示。在CaMV 35S启动子控制下转录的所述嵌合基因的RNA，通过内含子的切割，形成包含有义RNA和反义RNA的双链RNA。

<番茄的转化>

以常规方式将制备的RNAi用载体导入根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV 3101系统中，得到重组根癌土壤杆菌。通过对来自番茄品种Micro-Tom的子叶片，感染得到的重组根癌土壤杆菌，在愈伤组织形成培养基中诱导愈伤组织形成。然后，选择抗药性愈伤组织并进行再分化。

从再分化得到的番茄个体的叶中提取DNA，并进行PCR，选择导入了所述嵌合基因的转化番茄。从叶中提取DNA和PCR，以如下方式进行。

<DNA提取>

将100mg植物体样品在液氮中冷冻并制成粉末。通过向该粉末中加入300μL提取缓冲液(100mM Tris，50mM EDTA，500mM NaCl(pH8.0))和15μL的20％SDS进行混合，制备样品溶液，并在65℃下混合该样品溶液，进行10分钟培养。培养后，向样品溶液中加入90μL的5M乙酸钾，然后以14000rpm离心10分钟。将上清液转移到新管中，加入400μL异丙醇，并将混合物在室温下静置2分钟，然后以14000rpm离心2分钟。将得到的沉淀用500μL的70％乙醇洗涤，干燥后，将其溶解于100μL水中，制备DNA样品。

<PCR>

使用GoTaq聚合酶(Promega公司制造)，加入PCR反应溶液(5μg/ml)，使得正向引物(5'-GTTCTTCTACACCATTTGCAGC，SEQ ID NO：8)和反向引物(5'-ATTGTGGTAGTGTTGGTAAGGC，SEQ ID NO：9)的最终浓度为0.2μM，并进行PCR。将在95℃下保持3分钟，然后在95℃保持30秒钟，在55℃下保持30秒钟，在72℃下保持30秒钟，作为一个循环，并进行35次循环，最后在72℃下保持3分钟，在上述条件下进行。

<耐盐性的评价>

得到的转化番茄，由于导入的嵌合基因缺损，该番茄是PERK13(SlPERK)的功能缺损的番茄。将PERK13功能缺损型番茄在含有下述浓度的氯化钠的1/2MS培养基中进行水栽栽培，所述氯化钠最终浓度为0.5质量％、1.0质量％、1.5质量％或2.0质量％。在人工气候容箱(25℃、光照期16小时、黑暗期8小时)中进行水栽栽培。在野生型番茄的情况下，在含有终浓度为0.5质量％的氯化钠的1/2MS培养基中进行水栽栽培，在培养的第21天，不能耐受高浓度的氯化钠，叶子发生白化，根变成棕色并枯萎(未显示)。对此，在具有PERK13功能缺损功能的番茄中，在培养的第21天，在含有0.5质量％及1.0质量％氯化钠的1/2MS培养基中，确认到任一者中叶子都未发生白化，正常生长的个体(图8)。在含有1.5质量％及2.0质量％的氯化钠的1/2MS培养基中，观察到叶片变白，但未观察到根的褐变。从这些结果发现，通过在番茄中抑制或阻碍PERK13的功能，可以提高植物体的耐盐性。

[实施例7]

制备了水稻(Oryza sativa)的PERK13功能缺损突变体，并研究了其耐盐性。

<目标基因的选择和敲除用载体的构建>

在水稻基因组DNA中包含的基因中，构建了以与拟南芥的PERK13具有70％以上的氨基酸序列的序列同源性的基因(水稻的PERK13直系同源基因)OsPERK13(Os03g056880、NCBI GeneID 4333279)作为目标基因的敲除用载体。由于将该基因用作敲除的目标序列，通过基因人工合成制备包含OsPERK13基因的目标序列(SEQ ID NO：10)的多核苷酸。目标水稻PERK13直系同源基因的敲除用载体pOsPERK-KO1，将人工合成的所述多核苷酸通过同源重组，导入修饰型pRIT1载体(Terada et al.，Nature Biotechnology，2002，vol.20，p1030-1034)而构建。

<水稻的转化>

根据Toki等人的方法(Plant Journal，2006年，第47卷，第69～76页)进行水稻的转化。首先，通过常规方法将所述敲除用载体导入根癌土壤杆菌菌株EHA 101菌株或LBA4404菌株中，得到重组根癌土壤杆菌。用得到的重组土壤杆菌感染来自水稻品种“日本晴”的胚盘的愈伤组织。将感染的水稻愈伤组织在含有0.25μM双草醚盐的培养基中培养，并选出双草醚盐耐受性的愈伤组织。

使用DNA提取试剂盒“Maxwell 16LEV Plant DNA kit(Promega公司制造)”从选出的双草醚盐耐受性愈伤组织中提取基因组DNA并进行PCR，选出导入所述敲除用载体的转化愈伤组织。通过使用DNA聚合酶(Tks Gflex、Takara Bio株式会社制造)，正向引物

(5'-AAGCTCAAGCTCCAATACGCAAACCGCCTC，SEQ ID NO：11)和反向引物(5'-GACGGTATCGATAAGCTTGGCGCGCCATTA，SEQ ID NO：12)，在94℃下保持1分钟，在98℃下保持10秒钟，在60℃下保持15秒钟，在68℃下保持1分钟作为一个循环，重复35个循环，最后在68℃下保持7分钟的条件下，就目标大小的PCR产物而言，将双草醚盐耐性愈伤组织制成导入了所述敲除用载体的转化的愈伤组织而筛选出。

<水稻植物体的再分化>

将确认导入了所述敲除用载体的水稻愈伤组织在再分化培养基中进行传代培养，并在25℃的亮处培养约3周。结果，得到了导入了PERK13直系同源基因敲除用载体的重组再分化植物体和非重组再分化植物体。同样，从非重组水稻愈伤组织对再分化的植物体进行诱导。

<确认水稻PERK13直系同源基因的敲除状态>

通过CAPS(Cleared Amplified Polymorphic Sequences)方法，对重组再分化植物体中的OsPERK13基因的敲除状态进行分析。首先，使用DNA提取试剂盒“Maxwell 16LEVPlant DNA kit(Promega公司制造)”从各植物体中提取基因组DNA。然后，使用作为3g05688特异性引物的3g05688No.1-F引物(5'-AGTCAAGCTTCGCCGGCGCCAATGCCGATGTGAGCCCGGC，SEQIDNO：13)和3g 05688No 1-R引物

(5'-TGACGAATTCGCTCCGGCACGACGAGGGTTCTCCTGCGCG，SEQ IDNO：14)进行PCR。使用核酸纯化试剂盒“DNA Cleaner(和光纯药株式会社制造)”纯化得到的PCR扩增产物，然后进行限制酶(TspRI)处理，并通过琼脂电泳确认DNA片段的切割状态。

敲除目标基因时，PCR扩增片段中存在的含有限制酶识别序列的DNA序列丢失，因此，基于未被切断的PCR扩增产物的存在，可以判断敲除状态。图9显示了通过对源自OsPERK13基因的PCR扩增片段进行TspRI处理而得到的消化物的琼脂电泳结果。在该图中，“WT”的“-RE”是非重组再分化植物体的PCR扩增片段的泳道，“WT”的“+RE”是非重组再分化植物体的PCR扩增片段经过TspRI处理的消化物的泳道。“KO lines”的“#1”～“#4”分别是导入OsPERK13基因敲除用载体的重组再分化植物体的PCR扩增片段经过TspRI处理的消化物的泳道。根据CAPS方法分析的结果，如图9所示，在“WT”的“+RE”中未观察到“WT”的“-RE”中观察到的条带，对此，“KO lines”的“#1”～“#4”中，与“WT”的“-RE”相同，检测出未消化的PCR扩增片段的条带。从该结果可以确认，得到的重组再分化植物体中，在多个个体中，OsPERK13基因被敲除。

<水稻PERK13直系同源基因敲除修饰体的耐盐性评价>

将导入了PERK13直系同源基因敲除用载体的重组再分化植物体和非重组再分化植物体转移至含有1.5质量％氯化钠的生根培养基(固体1/2MS)中进行传代培养。之后，在人工气候项(25℃，经常光照期)中生长约两周，观察植物体的表现型。

将各植物个体生长2周时的照片显示于图2。在该图中，“WT”是非重组再分化植物体，“KO”是导入了PERK13直系同源基因敲除用载体的重组再分化植物体。另外，图10(A)和图10(C)分别是植物个体的地上部分的照片，图10(B)是图10(A)中所示的植物个体的地下部分的照片。图10(D)是图10(C)所示的植物个体的地下部分的照片。如图10(A)和图10(B)所示，在非重组再分化植物体中，观察到叶子均发生了黄变，另外，观察到基部发生了褐变，根几乎没有伸长，生长停止的现象。该叶子的黄变、基部的褐变及根伸长的抑制都是钠病症的典型表型。对此，在导入PERK13直系同源基因敲除用载体的重组再分化植物体中，观察到一部分叶子发生了黄变，但绿色叶子伸长，多条根顺利伸长。并且，如图10(C)和图10(D)所示，在导入了PERK13直系同源基因敲除用载体的重组再分化植物体中，未观察到叶的变黄，存在叶和根均健康地生长的个体。从上述结果可知，敲除了PERK13的水稻直系同源基因的OsPERK13基因的植物体个体，即使在1.5％重量的氯化钠环境下也可以生长，即，在水稻中，通过抑制或阻碍PERK13的功能，可以提高植物体的耐盐性。

SEQUENCE LISTING

<110> SEKISUI CHEMICAL CO., LTD.

<120> Method for Improving Salt Tolerance in Plants

<130> PC-23892

<160> 14

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Forward primer

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Reverse primer.

<400> 2

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1612

<212> DNA

<213> Paenarthrobacter nitroguajacolicus YROK-1

<220>

<223> 16S rDNA (partial)

<400> 3

acgcactttg gtgctcgaag cctcggatcc actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt 60

cgccctttac cttgttacga cttagtccca atcgccggtc ccaccttcga cggctccccc 120

cacaagggtt aggccaccgg cttcgggtgt taccaacttt cgtgacttga cgggcggtgt 180

gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag cgttgctgat ctgcgattac tagcgactcc 240

gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt ttgggattag 300

ctccacctca cagtatcgca accctttgta ccggccattg tagcatgcgt gaagcccaag 360

acataagggg catgatgatt tgacgtcgtc cccaccttcc tccgagttga ccccggcagt 420

ctcctatgag tccccgccat aacgcgctgg caacatagaa cgagggttgc gctcgttgcg 480

ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtgaaccg 540

accgcaagcg ggggacctgt ctccagatct ttccagtcca tgtcaagcct tggtaaggtt 600

cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc tccgccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 660

ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg cacttaatgc gttagctacg 720

gcgcggaaaa cgtggaatgt cccccacacc tagtgcccaa cgtttacggc atggactacc 780

agggtatcta atcctgttcg ctccccatgc tttcgctcct cagcgtcagt tacagcccag 840

agacctgcct tcgccatcgg tgttcctcct gatatctgcg catttcaccg ctacaccagg 900

aattccagtc tcccctactg cactctagtc tgcccgtacc cactgcagaa ccggagttga 960

gccccggtct ttcacagcag acgcgacaaa ccgcctacga gctctttacg cccaataatt 1020

ccggataacg cttgcgccct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccggcgct 1080

tcttctgcag gtaccgtcac ttacgcttct tccctactga aagaggttta caacccgaag 1140

gccgtcatcc ctcacgcggc gtcgctgcat caggcttccg cccattgtgc aatattcccc 1200

actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc ggtcaccctc 1260

tcaggccggc tacccgtcgt cgccttggta ggccattacc ccaccaacaa gctgataggc 1320

cgcgagtcca tccaaaaccg caaaagcttt ccaccaccac cacatgcgtg gaatggtcat 1380

atccggtatt agacccagtt tcccaggctt atcccagagt caagggcagg ttactcacgt 1440

gttactcacc cgttcgccac taatcccccc agcaagctgg agatcatcgt tcgacttgca 1500

tgtgttaagc acgccgccag cgttcatcct gagccaggat caaacaaggg cgaattctgc 1560

agatatccat cacactggcg gccgctcgag catgcatcaa aaagcgtttc cc 1612

<210> 4

<211> 1556

<212> DNA

<213> Arthrobacter psychrochitiniphilus YROK-2

<220>

<223> 16S rDNA (partial)

<400> 4

ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc gccctttacc ttgttacgac ttagtcccaa 60

tcgccggtcc caccttcgac ggctcccccc acaagggtta ggccaccggc ttcgggtgtt 120

accaactttc gtgacttgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcagc 180

gttgctgatc tgcgattact agcgactccg acttcatggg gtcgagttgc agaccccaat 240

ccgaactgag accggctttt tgggattagc tccacctcac agtatcgcaa ccctttgtac 300

cggccattgt agcatgcgtg aagcccaaga cataaggggc atgatgattt gacgtcgtcc 360

ccaccttcct ccgagttgac cccggcagtc tcctatgagt ccccgccata acgcgctggc 420

aacatagaac gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 480

gacgacaacc atgcaccacc tgtgaaccga ccgcaagcgg gggacctgtc tccagatctt 540

tccagtccat gtcaagcctt ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa tccgcatgct 600

ccgccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc 660

caggcggggc acttaatgcg ttagctacgg cgcggaaaac gtggaatgtc ccccacacct 720

agtgcccaac gtttacggca tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccatgct 780

ttcgctcctc agcgtcagtt acagcccaga gacctgcctt cgccatcggt gttcctcctg 840

atatctgcgc atttcaccgc tacaccagga attccagtct cccctactgc actctagtct 900

gcccgtaccc actgcagaac cggagttgag ccccggtctt tcacagcaga cgcgacaaac 960

cgcctacgag ctctttacgc ccaataattc cggataacgc ttgcgcccta cgtattaccg 1020

cggctgctgg cacgtagtta gccggcgctt cttctgcagg taccgtcact tacgcttctt 1080

ccctactgaa agaggtttac aacccgaagg ccgtcatccc tcacgcggcg tcgctgcatc 1140

aggcttccgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1200

tctcagtccc agtgtggccg gtcaccctct caggccggct acccgtcgtc gccttggtag 1260

gccattaccc caccaacaag ctgataggcc gcgggcccat cctgcaccga taaatctttc 1320

caccacccac catgcgatag gaggtcatat ccggtattag acccagtttc ccaggcttat 1380

cccgaagtgc agggcagatc acccacgtgt tactcacccg ttcgccgctc gtgtaccccg 1440

aaaggcctta ccgctcgact tgcatgtgtt aagcacgccg ccagcgttcg tcctgagcca 1500

ggatcaaaca agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct cgagca 1556

<210> 5

<211> 200

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<220>

<223> SlPERK10 (partial)

<400> 5

atgtcaattg tttcaccccc tctaagttct tctacaccat ttgcagctcc accaattgct 60

ttgaattctc cagcacctat atatcagccc aatgaaaact catcttcgat tgcatctccg 120

caatctgctc ctcttgtagc aacatcacca ctgccagaat cccctcctcc tccaacaaat 180

attacattgc ctcctccagc a 201

<210> 6

<211> 200

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<220>

<223> SlPERK9a (partial)

<400> 6

tggattcttc actactttat gaaggatctg ctcctccaac tgataatgca cctccaacgt 60

ctagtcctcc gcctacacct tctagtccac ctgttagctc accaccacct ccatcttcta 120

gtccacctcc tagttcaccg ccacctgcat cttctagtcc acctcctagt tcacctccac 180

ctgaatcaac tagtcctcca t 201

<210> 7

<211> 200

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<220>

<223> SlPERK9b (partial)

<400> 7

gtcagtagta gtttctccac ctccaagtct tgcaccaatt cctgtcccac caattgtctt 60

gagtccacct cctcagcttt cttctccgcc ccctgcatct cagcctaatg cgacagcacc 120

acccgtgtct tctcttcctc caacattacc cccacaatct tctcctcccc cggccttacc 180

aacactacca caatcgcc 198

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Forward primer

<400> 8

gttcttctac accatttgca gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Reverse primer.

<400> 9

attgtggtag tgttggtaag gc 22

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<223> OsPERK13 (partial)

<400> 10

cggcatctcc aggcaaaaac cagagtcccg cgtcgccgtc ccaagattca cctccgccag 60

tggcgtcccc gtcagtatcc tcacctcctc cggcaccgac 100

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Forward primer

<400> 11

aagctcaagc tccaatacgc aaaccgcctc 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Reverse primer.

<400> 12

gacggtatcg ataagcttgg cgcgccatta 30

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: 3g05688 No1-F primer

<400> 13

agtcaagctt cgccggcgcc aatgccgatg tgagcccggc 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Description of Artificial Sequence: 3g05688 No1-R primer

<400> 14

tgacgaattc gctccggcac gacgagggtt ctcctgcgcg 40

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种提高植物体耐盐性的方法，其包括：抑制或阻碍植物体的PERK13(富含脯氨酸的伸展蛋白样受体激酶13，Proline-rich extensin-like receptor kinase 13)的功能。

2.根据权利要求1所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，使PERK13的拮抗剂与所述植物体的根接触。

3.根据权利要求2所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，拮抗剂是一种或两种以上的微生物或它们的分泌物质。

4.根据权利要求2或3所述的提高植物体耐盐性的方法，其包括：将所述植物体的根的至少一部分浸入含有所述拮抗剂的水溶液中的工序。

5.根据权利要求1所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，通过抑制PERK13基因的表达来抑制PERK13的功能，或者，通过阻碍PERK13基因的表达来阻碍PERK13的功能。

6.根据权利要求1或5所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，对于所述植物体，使PERK13基因缺损，或向PERK13基因导入使PERK13基因的功能降低的突变。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体中，选自非选择性阳离子通道、细胞膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及高亲和性钾转运蛋白中一种以上的蛋白质的功能亢进。

8.根据权利要求1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体中，选自非选择性阳离子通道、细胞膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及高亲和性钾转运蛋白中一种以上的蛋白质过度表达

9.根据权利要求1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是导入了外源基因的转化体，所述外源基因选自SOS1基因、SOS2基因、SOS3基因、NHX1基因及HKT1基因中的一种以上。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体为双子叶植物。

11.根据权利要求1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体为单子叶植物。

12.根据权利要求1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是选自禾本科植物体、茄科植物体、十字花科植物体、葫芦科植物体、葡萄科植物体、芸香科植物体、蔷薇科植物体、豆科植物体、莲科植物体、胡麻科植物体、藜科植物体、棕榈科植物体、芭蕉科植物体、锦葵科植物体、桃金娘科植物体及白花菜科植物体中的一种植物。

13.根据权利要求1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是选自稻、玉米、高粱、小麦、大麦、黑麦、稗子、小米、番茄、茄子、红辣椒、青椒、马铃薯、烟草、拟南芥、油菜、荠菜、萝卜、甘蓝、紫甘蓝、结球甘蓝、大白菜、青梗菜、羽衣甘蓝、水芹、小松菜、花茎甘蓝、花椰菜、芜菁、山萮菜、芥末、黄瓜、苦瓜、南瓜、甜瓜、西瓜、葡萄、柠檬、柑橘、脐橙、葡萄柚、橘子、酸橙、酸橘、柚子、扁平橘、桶柑、苹果、樱、梅子、桃子、草莓、枇杷、杏子、李子、西梅、扁桃、梨、西洋梨、覆盆子、黑莓、黑醋栗、蔓越橘、蓝莓、大豆、菜豆、豌豆、蚕豆、毛豆、绿豆、鹰嘴豆、莲、芝麻、菠菜、甜菜(beet)、甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris)、藜、苋(Amaranthaceae)、苋菜红(Amaranthus)、青葙、海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(oilpalm)、椰子、巴西莓、香蕉、芭蕉、蕉麻、棉、秋葵、桉树、白花菜及醉蝴蝶花中的一种以上。

14.一种植物体的栽培方法，其包括：在氯化钠浓度为1.5质量％以上的环境下栽培共生有微生物的植物体，该植物体的存活率为10％以上。

15.一种耐盐植物体的制造方法，其包括：抑制或阻碍植物体的PERK13的功能。

Claims

8.根据权利要求1～6中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体中，选自非选择性阳离子通道、细胞膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及高亲和性钾转运蛋白中一种以上的蛋白质过度表达。

13.根据权利要求1～9中任一项所述的提高植物体耐盐性的方法，其中，所述植物体是选自稻、玉米、高粱、小麦、大麦、黑麦、稗子、小米、番茄、茄子、红辣椒、青椒、马铃薯、烟草、拟南芥、油菜、荠菜、萝卜、甘蓝、紫甘蓝、结球甘蓝、大白菜、青梗菜、羽衣甘蓝、水芹、小松菜、花茎甘蓝、花椰菜、芜菁、山萮菜、芥末、黄瓜、苦瓜、南瓜、甜瓜、西瓜、葡萄、柠檬、柑橘、脐橙、葡萄柚、橘子、酸橙、酸橘、柚子、扁平橘、桶柑、苹果、樱、梅子、桃子、草莓、枇杷、杏子、李子、西梅、扁桃、梨、西洋梨、覆盆子、黑莓、黑醋栗、蔓越橘、蓝莓、大豆、菜豆、豌豆、蚕豆、毛豆、绿豆、鹰嘴豆、莲、芝麻、菠菜、甜菜(beet)、甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris)、藜、苋(Amaranthaceae)、苋菜红(Amaranthus)、青葙、海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(oilpalm)、椰子、巴西莓、香蕉、芭蕉、蕉麻、棉、秋葵、桉树、白花菜及醉蝴蝶花中的一种植物。

15.一种植物体，其中，PERK 13的功能被抑制或阻碍。

16.一种耐盐植物体的制造方法，其包括：抑制或阻碍植物体的PERK13的功能。