CN107266542B

CN107266542B - 厚藤IpLEA基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN107266542B
Application number: CN201710660671.4A
Authority: CN
Inventors: 张美�; 张会; 简曙光; 夏快飞
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: CN107266542A

Abstract

本发明提供了厚藤盐胁迫应答相关基因IpLEA，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.2所示。本发明IpLEA基因编码的胚胎发生丰富蛋白(Late embryogenesis abundant proteins)IpLEA与提高酿酒酵母、大肠杆菌和植物的耐盐耐旱性相关。通过构建IpLEA基因的酵母、大肠杆菌和植物转基因超表达载体，将IpLEA基因在酵母、大肠杆菌和拟南芥中超表达，可以提高酵母、大肠杆菌和拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。该基因可应用于工程菌及植物针对高盐干旱胁迫的遗传工程育种，具有很大的应用价值。

Description

厚藤IpLEA基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及厚藤(Ipomoea pes-caprae L.)中一个新的耐盐抗旱基因IpLEA，该基因编码厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白(Late-EmbryogenesisAbundant Proteins，LEA蛋白)，在调控生物体耐盐抗旱性方面的应用。

背景技术

厚藤(Ipomoea pes-caprae L.)是一种具有高度耐盐和抗旱能力的盐生植物，在全世界热带亚热带滨海及岛屿地区均有分布，是典型的盐生植物之一。由于厚藤具有高度的抗逆能力，其抗逆分子机制的探讨具有重要的理论意义，而通过对其抗逆遗传资源的发掘以及对抗逆功能基因的深入研究具有广泛的应用前景。

植物在其生长过程中，通常会遭遇多种逆境胁迫对其生长和发育产生不利的影响，其中水分缺失是常见的一种。造成植物或细胞缺水的逆境主要包括以下几种：冷冻、干旱和盐胁迫。植物在适应这些逆境的进化过程中，发展了一系列的生理及分子机制减缓逆境胁迫对植物生长发育的伤害，维持其完成正常的生长周期和世代交替。LEA蛋白是植物中广泛存在的一类小分子亲水性蛋白，自从首次从棉花胚胎中获得分离以来，经过三十多年的研究，尽管该类蛋白确切的生化功能和作用机制仍不完全清楚，但已有越来越多的研究表明，植物LEA 蛋白广泛地参与应答非生物逆境胁迫(尤其是失水胁迫)的生理过程中，并在提高植物抗逆性方面发挥重要的功能。

LEA蛋白的全称为晚期胚胎发生丰富蛋白(Late embryogenesis abundantproteins,LEA proteins)，首次由Dure等(1981)在棉花胚胎发育后期的分离得到其mRNA，该mRNA翻译的产物即为LEA蛋白。几十年来，在多种植物、蓝藻、细菌及动物中均分离得到了LEA蛋白，由此可见，LEA蛋白并不是植物所特有的，而是广泛分布于生物界中。LEA蛋白及其mRNA在生物体内的积累往往与耐脱水性密切相关，但由于其分布的广泛性及成员的多样性，该类蛋白具体的生物学功能并不完全清楚。在植物中，早期关于LEA蛋白的研究表明，该类蛋白及其编码的mRNA主要积累于种子发育过程中胚胎发生的晚期(种子形成并干燥之前)，以及一些暴露于脱水、渗透压、低温等失水胁迫环境下的营养组织中，这些结果暗示该类蛋白可能参与植物应答水分限制相关的逆境胁迫，并通过改善失水胁迫中的细胞状况而发挥相应的生物学功能。由于LEA蛋白通常在缺水的组织/细胞中聚集，且通常含有较多的亲水性氨基酸，因此也被称为亲水素(Hydrophilin)。

而目前，厚藤的LEA蛋编码白及其基因的作用还有待开发。

在本发明中，我们公开了厚藤体内的一个编码LEA蛋白基因IpLEA，该基因表达能够提高酵母菌对盐和氧化胁迫的耐受性，提供了将该基因应用于工程菌酿酒酵母的耐盐和抗氧化遗传改良的应用；IpLEA在大肠杆菌中的表达能够提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱的耐受性，提供了将该基因用于包括大肠杆菌在内的工程菌耐盐和耐脱水的遗传改良方面的应用。本发明也简单阐述了可将该基因应用于植物的遗传改造，培育用于提高耐盐/耐旱性的转基因转基因植物。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐盐、耐旱植物功能性蛋白——厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白 IpLEA及其应用。我们在厚藤cDNA文库筛选过程中发现一个代表胚胎发生晚期丰富蛋白基因的克隆能够提高酵母菌株的耐盐性，本研究在前期研究的基础上，克隆了该胚胎发生晚期丰富蛋白基因，功能研究表明，该基因可提高生物体的耐盐和抗旱能力。

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA和/或IpLEA基因在提高植物对高盐/干旱的耐受中的应用，所述IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ IDNO.2 所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白的核苷酸序列。

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA和/或IpLEA基因在农作物转基因育种中改良农作物对高盐/干旱耐受性、和/或调控农作物对氧化胁迫耐受性的应用，所述厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白的核苷酸序列。

本发明的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因IpLEA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

本发明的另一目的是公开一组厚藤IpLEA蛋白重组表达载体及其应用，该重组载体插入了IpLEA基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在高盐和过氧化氢胁迫处理下，提高酵母对盐胁迫和氧化胁迫的耐受性。

同时，公开构建厚藤IpLEA蛋白重组原核表达载体及其运用，该重组载体插入了IpLEA 基因，将该载体转化进入大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导该基因在大肠杆菌中的超表达，证明IpLEA基因能够提高工程菌大肠杆菌的耐盐和耐旱性。

实现上述目的的技术方案如下：

插入有IpLEA基因的酿酒酵母重组表达载体，所述IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或编码为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpLEA蛋白的核苷酸序列。

上述酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性中的应用。

插入有IpLEA基因的大肠杆菌表达载体，所述IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpLEA蛋白的核苷酸序列。

上述大肠杆菌重组表达载体在提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱胁迫耐受性中的应用。

此外，本发明的另一目的是公开了厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA在模式植物拟南芥中的超表达载体及其应用，该重组载体通过农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥进行转基因，能够提高拟南芥的耐盐和抗旱性。

实现上述目的的技术方案如下：

本发明以厚藤幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，并将cDNA分别以pDONR222和pYES-DEST52为目标载体，采用技术(Invitrogen)构建cDNA表达文库，并将文库质粒转化酵母对盐敏感的突变株AXT3，挑取耐盐酵母克隆，并提取质粒，对质粒进行测序，通过序列分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA的cDNA全长，其序列如SEQ ID NO.2所示。

将含有IpLEA的cDNA全长的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒转化野生型酵母菌株W303，以转化酵母表达载体pYES2空载体的W303为对照，分别在含盐量5％，7.5％和8.8％的培养基上测试转基因酵母的耐盐性。

以含有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，设计以下引物分别扩增IpLEA基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1的cDNA阅读框片段。引物如SEQ ID NO.3(IpLEAEEF:5’-GGGGCCCCTGGGATCCATGGCATCGTCTGATAATCC-3’)和SEQ ID NO.4(IpLEAEER:5’-GGAATTCCGGGGATCCTCAATCCTCCTCATCATCAT-3’)所示。

以上PCR采用高保真的Taq酶进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1上(BamHI切点)，形成重组载体IpLEA-pGEX 6p-1，并测序。

采用CaCl₂的方法将上述厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白大肠杆菌蛋白表达重组载体转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，通过添加1mM的IPTG诱导IpLEA基因在大肠杆菌中的超表达。之后检测表达有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白的大肠杆菌的耐盐性和抗旱性。

以含有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，设计以下引物分别扩增IpLEA基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至拟南芥转基因超表达载体pMD1的cDNA阅读框片段，用于构建厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白转基因超表达重组载体IpLEA-pMD1。引物如SEQ ID NO.5(IpLEAOXF:5’-GGACTCTAGAGGATCCATGGCATCGTCTGATAATCCA-3’)和SEQ ID NO.6(IpLEAOXR: 5’-GTCGACCCGGGGATCCTCAATCCTCCTCATCATCAT-3’)所示。

采用CaCl₂的方法将上述厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白转基因超表达重组载体IpLEA-pMD1转化进入农杆菌GV3101感受态菌株中，通过拟南芥花序侵染法转化拟南芥植株，通过Kan抗性筛选获得转基因后代，对转基因超表达厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因的拟南芥后代进行耐盐性和抗旱性检测。

本发明的有益效果如下：

在本发明中，我们通过筛选获得的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA基因的进行应用性探索，发现该基因以下应用方式：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性；(2)通过诱导厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白在大肠杆菌中表达后，能够提高大肠杆菌的耐盐性和耐旱性；(3)该基因在拟南芥中的超量表达能够提高转基因拟南芥对高盐和干旱胁迫的耐受性。

本发明也可推广至农业生物技术领域，通过改变IpLEA基因在农作物中的表达，调控农作物对高盐和干旱胁迫的耐受，以及参与农作物对多种逆境胁迫的适应性改变。

附图说明

图1示酿酒酵母重组表达载体IpLEA-pYES-DEST 52示意图。

图2示转化IpLEA-pYES-DEST 52的转基因酵母对盐敏感的突变株AXT3对盐胁迫的耐受性提高。

图3示转化IpLEA-pYES-DEST 52的转基因野生型酵母W303对盐胁迫的耐受性提高。

图4示转化IpLEA-pYES-DEST 52的转基因酵母对H₂O₂敏感的突变株yap1Δ(A)和skn7Δ(B) 对氧化胁迫的耐受性提高。

图5示大肠杆菌重组蛋白表达载体IpLEA-pGEX 6p-1示意图。

图6示转化IpLEA-pGEX 6p-1的转基因大肠杆菌对高盐(A)和脱水(B)胁迫的耐受性提高。

图7示模式植物拟南芥转基因超表达载体IpLEA-pMD1示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1：通过厚藤cDNA酵母表达文库筛选获得厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA 的cDNA全长

1.1厚藤全长cDNA表达文库的构建

厚藤cDNA文库的构建主要参考CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的说明书，采用(Invitrogen)技术进行。具体包括以下步骤：总RNA提取、mRNA的分离、cDNA 初级文库的构建和cDNA次级文库的构建。各步骤主要概述如下：

(1)总RNA提取

取2g等量的厚藤叶片、叶芽、藤及幼根，在预冷的研钵中用液氮研磨成粉末，将粉末适量移至多个RNase-free的1.5mL离心管中，每个离心管加入1mL Trizol Reagent，迅速震荡混匀，并按照试剂说明书操作，获得厚藤不同组织的总RNA混合样。将干燥后的总RNA溶于100μL RNase-free的水中。用紫外分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳测定总RNA的浓度和质量。

(2)mRNA的分离

取大于500μg的厚藤总RNA，按照FastTrack MAG mRNA isolation Kit说明书分离纯化 mRNA，用紫外分光光度法测定mRNA浓度，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。

(3)cDNA初级文库的构建

取约3μg的厚藤mRNA，加入RNase-free的水至总体积为9μL；然后加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer(30pM)1uL和dNTPs(10mM each)1uL混匀，70℃5min，45℃孵育2min；加入SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR的5×FirstStrand Buffer 4μL和DTT(0.1M)2μL，最后加入3μL的SuperScript III逆转录酶至中反应体积为 20μL，混匀后置于PCR仪上反应45℃20min；50℃20min；55℃20min。以上步骤为合成cDNA第一链。

在cDNA第一链反应液中依次加入E.coli DNA Ligase，E.coli DNA PolymeraseI，E.coli RNaseH和T4 DNA Polymerase等合成第二链，此时即获得厚藤双链cDNA。将双链cDNA 纯化后与attB1重组接头连接，连接好接头的厚藤双链cDNA使用CloneMiner II cDNALibrary Construction Kit的分级分离层析柱，去除分子量小于500bp的小片段cDNA，保留大于500bp 的cDNA片段用于后续的cDNA文库的构建。

参照CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的说明书进行BP重组反应构建cDNA 初级文库。具体步骤包括：在洁净的PCR管中依次添加cDNA(100ng/μL)13μL，pDONR222 (250ng/μL)2μL，BPII enzyme mix 5μL至总体积20μL，混合均匀后，置于25℃下进行BP重组反应16～20h。通过电穿孔仪将纯化后的BP重组反应产物导入大肠杆菌DH10B 感受态细胞中，电击后迅速向电转杯中加入2ml SOC培养基，经预培养后，即为初级文库菌液。

(4)cDNA次级文库的构建

采用LR重组反应进行cDNA次级文库的构建，具体步骤包括：初级文库用LB培养基扩增培养后，然后用PureLink^TMHQ Mini Plasmid DNA Purification Kit提取质粒。初级cDNA 文库质粒使用适量的TE溶解，并采用紫外分光光度法测定浓度。将初级文库质粒浓度调整至300ng/μL，取1μL文库质粒依次加入pYES-DEST 52(300ng/uL)1μL，LR Clonase IIMix 1μL，补加双蒸水12μL至总体积20μL。置于25℃下进行LR重组反应16～20h。之后使用电穿孔仪将纯化后的LR重组反应产物导入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，电击后迅速向电转杯中加入2mL SOC培养基，经预培养后，即为次级文库菌液。

1.2厚藤cDNA文库的筛选

厚藤cDNA文库的筛选采用质粒文库转化酵母盐敏感的突变株AXT3的方法。AXT3在含有75mM的NaCl的培养基上无法生长，而野生型酵母则可以正常生长。AXT3经转化酵母质粒文库后，涂布于含有75mM的NaCl的培养基上，经30℃培养3至7天，可得到若干个可以恢复对盐敏感的酵母克隆。对这些克隆扩增培养并提取质粒，即可获得多个厚藤耐盐基因，其中一个为编码厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA的cDNA全长序列。详细步骤如下：

(1)厚藤cDNA文库质粒的获取

文库质粒的获取采用固体LB培养基平板扩增法，即根据文库的总克隆数，将厚藤次级文库菌液涂布于100个含有Amp抗生素14cm的LB平板上过夜37℃培养，确保文库的每个克隆都得到了等量的扩增。待长出菌落后，加液体LB培养基洗脱，碱裂解法提取质粒。

(2)厚藤cDNA文库质粒转化酵母盐敏感的突变株AXT3

调整纯化后的次级文库质粒浓度至1μg/μL，采用乙酸锂法转化酵母对盐敏感的突变株 AXT3。挑取酵母单克隆接种于液体YPD培养基中，30℃震荡培养过夜。之后按照1:100的比例将酵母菌液转接于新鲜的液体YPD培养基中，30℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5左右，锂盐溶液重悬，加适量鲑鱼精载体DNA，50％PEG。根据沉淀量稀释菌体，涂布于含有75mM 的NaCl的酵母筛选培养基(酵母极限培养基添加腺嘌呤，缺少尿嘧啶)上培养，直至出现转化子。

1.3厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA的cDNA全长的获得及序列分析

在含有75mM的NaCl的酵母筛选培养基上挑取酵母单克隆，接菌于未添加NaCl的液体筛选培养基中进行扩增培养。离心收集酵母菌体后，按照HiPure Yeast Plasmid MiniKit的说明书提取酵母质粒。由于酵母质粒含量较低，无法直接进行测序分析，故将酵母质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆扩增培养后，采用碱裂解法提取质粒，进行测序分析。测序由广州艾基生物公司完成。

测序后的cDNA核苷酸序列比较、翻译等在DNAStar7.0生物软件上进行，序列同源性分析采用BLAST程序，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行。

测序结果表明，其中一个克隆含有编码厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白的cDNA全长，其结构示意图如图1所示。去掉pYES-DEST 52载体序列后，厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白的cDNA 全长序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其最长阅读框为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpLEA蛋白。

实施例2：IpLEA基因在酵母中超表达提高酵母的耐盐性和对氧化胁迫的耐受性

2.1 IpLEA-pYES-DEST 52转化酵母菌株

将测序结果得到验证的IpLEA-pYES-DEST 52重组质粒调整浓度至0.1μg/μL，采用乙酸锂法的方法分别转化酵母对盐敏感的突变株AXT3和对应的野生型酵母株系W303，以及转化酵母对H₂O₂敏感的突变株yap1Δ和skn7Δ和对应的野生型酵母株系WT。同时采用酵母表达载体空载体pYES2做对照，分别转化上述酵母株系。

2.2 IpLEA基因在酵母盐敏感突变株AXT3和野生型菌株W303中表达均可以提高转基因酵母的耐盐性

挑取酵母菌株AXT3转化空载体pYES2和IpLEA基因超表达载体IpLEA-pYES-DEST52 的单克隆，接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD₆₀₀值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有50mM，75mM和200mM NaCl的酵母极限固体培养基平板上。 30℃培养7天，观察酵母生长情况。

如图2所示，超表达IpLEA基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的AXT3酵母突变株而言，能够在添加50mM和75mM NaCl的培养基平板上生长，而在添加200mM NaCl的培养基平板上也可以轻微生长；而未表达厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的酵母(转化空载体pYES2)则不能生长，表明IpLEA基因在酵母中的表达能够提高酵母盐敏感突变株AXT3 对盐胁迫的耐受性。

同时，挑取野生型酵母株系W303转化空载体pYES2和IpLEA基因超表达载体IpLEA-pYES-DEST 52的单克隆，按照上述方法进行液体培养基培养，并逐级稀释后滴至添加有5％，7.5％和8.8％(均为质量体积比)NaCl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。

如图3所示，超表达IpLEA基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的W303酵母突变株而言，能够在添加5％和7.5％NaCl的培养基平板上生长，且生长状况良好，而在添加 8.8％NaCl的培养基平板上也可以轻微生长；而未表达厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的酵母(转化空载体pYES2)则不能生长，表明IpLEA基因在酵母中的表达能够提高野生型酵母株系W303对盐胁迫的耐受性。

2.3 IpLEA基因在酵母对H₂O₂敏感突变株yap1Δ和skn7Δ中表达均可以提高转基因酵母对氧化胁迫的耐受性

挑取酵母对H₂O₂敏感突变株yap1Δ和skn7Δ转化空载体pYES2和IpLEA基因超表达载体 IpLEA-pYES-DEST 52的单克隆，同时也挑取野生型酵母WT转化空载体pYES2的单克隆作为对照，将上述克隆分别接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，30℃恒温摇床 (200rpm)培养至菌液OD₆₀₀值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有0.75mM的H₂O₂的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。

如图4所示，超表达IpLEA基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的yap1Δ酵母突变株而言，能够在添加0.75mM H₂O₂的培养基平板上生长；而未表达厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的酵母yap1Δ(转化空载体pYES2)则几乎不能生长(图4A)。同样，超表达IpLEA 基因的转基因酵母skn7Δ也能够在添加0.75mM H₂O₂的培养基平板上生长；而未表达厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的酵母skn7Δ(转化空载体pYES2)则几乎不能生长(图4B)。这些结果表明IpLEA基因在H₂O₂敏感酵母突变株yap1Δ和skn7Δ中的表达能够提高酵母对氧化胁迫胁迫的耐受性。

SEQ ID NO.1

氨基酸序列

>IpLEA protein

MASSDNPEIVERGIKDKEDKEEEKGGFLDKVKDFIHDVGEKIEETIGFGKPTADVSEIHIPHINLERAEIVVDVLVKNPNPVPIPLIDINYLIESDGRKLISGLIPDAGTIHAHGSETVKIPVNLIYDDIKSTYKDIEPGSIIPYRIKVDLIVDVPVFGRLTLPLEKTGEIPIPYKPDIDLEKIHFERFSFEETVAILHLKLENMNDFDLGLNSLDYELWLSDVSIGSAELEKAAKIEKKGTSYIDLPVTFRPKDFGSALWDMIRGKGTGYTMKGHINVDTPFGAMKLPISKEGGTTRLKKNKEDGGDDDEED

cDNA序列(涂阴影部分为cDNA阅读框SEQ ID NO.2，上游为5’非翻译区，下游为3’非翻译区)

>IpLEA

GGACAATCTCTTCGTCTTCACCATTTGCAGCCGATTATCTCTCGTTAGCTTGTGAGAAGGT AGCTGTGCTTTACAATGATGTGGGGAATAAACTGTCGGGTTATGATGTTGATTATGAATCCATATTTATATCAAGGAATTTGAACTGGGGTGTCGATTTTCAAAGGCATTGAGTGTGTGTTTTAGAACAAAGACTTGGAAGTATGTTATTTAGTTGTGCGTTTGGTGTTTCAGACTTAAAGAGAGAGGCTGTTGTTTAAACCATGAGAGTGATATGCCGACGTGTTGTTTGTGGTTATGTTCAATAGATATATGGTAATTTATATTCGCCTCATTTGGTACATGCTCCTATTTTAATTTTAATGATAATGTATATAGGGTAGATGGCAAATTACACCGAAGATCACTAATAAATGTTCATTTTTAATTAAaAAAAAAAAAAAA AAAAAAA

实施例3：IpLEA基因在大肠杆菌中超表达提高大肠杆菌的耐盐性和耐脱水性

3.1大肠杆菌重组蛋白表达载体IpLEA-pGEX 6p-1的构建

以含有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST 52重组质粒为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，采用高保真的Taq酶通过PCR扩增IpLEA基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerasewith GC Buffer说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书。回收得到的片段用于插入至大肠杆菌重组蛋白表达载体pGEX 6p-1中。pGEX 6p-1质粒经 BamHI单酶切处理，回收线性化质粒。回收后的IpLEA的cDNA阅读框PCR片段和线性化pGEX 6p-1质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的HD Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。经测序分析后，IpLEA的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。构建好的大肠杆菌重组蛋白表达载体 IpLEA-pGEX 6p-1如图5所示。

3.2厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

采用碱裂解法提取IpLEA-pGEX 6p-1重组质粒，并转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，挑取单克隆至液体LB培养基中，通过添加1mM的IPTG诱导IpLEA基因在大肠杆菌中的超表达。

3.3表达有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的大肠杆菌的耐盐性检测

挑取转化厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白表达载体IpLEA-pGEX 6p-1的大肠杆菌单克隆，以转化pGEX 6p-1空载体的大肠杆菌单克隆为对照，分别接种于液体LB培养基中(添加终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素)，在恒温摇床(37℃，200rpm)中培养12小时。之后按照1:100 的比例转接于新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，培养2到4 小时至OD₆₀₀值达0.5，之后添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导培养2到4小时至OD₆₀₀值达1。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有1％NaCl(对照，145mM NaCl)和4％NaCl(高盐胁迫，680mM NaCl)的LB培养基 (培养基中添加终浓度为0.2mM的IPTG和100μg/ml的氨苄青霉素)上，37℃培养12至24 小时，观察大肠杆菌生长情况。

如图6的A所示，在添加低浓度NaCl(LB培养基，1％NaCl)的正常生长条件下，转化空载体pGEX 6p-1和表达IpLEA蛋白(转化IpLEA蛋白表达载体IpLEA-pGEX 6p-1)的大肠杆菌的生长状况一致，但在高盐浓度(LB培养基，4％NaCl)的正常生长条件下，转化表达IpLEA蛋白载体(IpLEA蛋白表达载体IpLEA-pGEX 6p-1)的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pGEX 6p-1的大肠杆菌，表明厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐盐性。

3.4表达有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的大肠杆菌的耐脱水性检测

挑取转化厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白表达载体IpLEA-pGEX 6p-1的大肠杆菌单克隆，以转化pGEX 6p-1空载体的大肠杆菌单克隆为对照，分别接种于液体LB培养基中(添加终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素)，在恒温摇床(37℃，200rpm)中培养12小时。之后按照1:100 的比例转接于新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，培养2到4 小时至OD₆₀₀值达0.5，之后添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导培养2到4小时至OD₆₀₀值达1。分别取1μL的菌液各六份，三份为对照，另外三份置于37℃干燥培养箱中干燥1小时至菌体完全干燥，之后再加入1mL的新鲜液体培养基恢复培养0.5小时，涂布至LB培养基平板上，对照则直接涂布于LB培养基平板上，37℃培养12至24小时，观察大肠杆菌的克隆数。

如图6的B所示，未经脱水干燥处理的菌液，对照(转化pGEX 6p-1空载体)和表达IpLEA 蛋白的大肠杆菌(转化IpLEA-pGEX 6p-1)1μL原始菌液形成的单克隆菌落(CFU)介于6x10⁶和7x10⁶之间，两者并不具备显著性差异。1μL原始菌液经脱水干燥后，表达IpLEA蛋白的大肠杆菌(转化IpLEA-pGEX 6p-1)形成的单克隆菌落数要远远多于仅转化pGEX 6p-1空载体的大肠杆菌，两者有极显著的差异，表明厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐脱水性(耐旱性)。实施例4：IpLEA基因在拟南芥中超表达提高拟南芥的耐盐性和耐旱性

4.1拟南芥转基因超表达载体IpLEA-pMD1的构建

以含有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST 52重组质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，采用高保真的Taq酶通过PCR扩增IpLEA基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerasewith GC Buffer说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书。回收得到的片段用于插入至拟南芥转基因超表达载体pMD1中。pMD1质粒经BamHI单酶切处理，回收线性化质粒。回收后的IpLEA的cDNA阅读框PCR片段和线性化pMD1质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的HDCloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒IpLEA-pMD1备用。

4.2拟南芥转基因超表达植株的获取

采用冻融法将植物转基因超表达载体IpLEA-pMD1转化进入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌。

然后利用重组农杆菌，通过花浸泡法(Clough SJ,Bent AF.1998.Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.16:735-743) 将IpLEA基因导入哥伦比亚生态型(Col)拟南芥，得到T1代种子。

T1代种子收获后在MS培养基(含有50mg/L卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子。将T2代种子培育为植株(T2代植株)，提取叶片的基因组DNA，用引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即为T2代转基因植株。T2代转基因植株自交产生T3代种子，对T3代种子进行卡那霉素抗性筛选，全部具有卡那霉素抗性的即为纯合体。随机选取三个转基因纯合体株系的T3代种子进行耐盐和耐旱性的鉴定。

4.3拟南芥转基因超表达植株后代的耐盐性和耐旱性检测

随机选取三个转基因植株纯合株系(OX1、OX2、OX3)的T3代种子(每个株系50粒)，以野生型拟南芥(WT)的种子(50粒)为对照，分别进行如下耐盐性鉴定：将各个株系植株的种子同时播种在含有300mM的NaCl的MS培养基平板上，置于22光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中，萌发6天后，统计萌发率。与野生型相比，转基因超表达IpLEA基因的转基因株系种子的萌发率均高于野生型拟南芥对照的种子，表明转基因超表达IpLEA的拟南芥种子萌发过程能够提高对盐胁迫耐受性。

同样，随机选取三个转基因植株纯合株系(OX1、OX2、OX3)的T3代幼苗(每个株系20株)，以野生型拟南芥幼苗(20株)为对照，栽种于营养土中并于温室中(22℃，16小时光照/8小时黑暗)正常培养20天，之后进行干旱处理(不浇水)20天，随后复水处理后7天统计存活率。与野生型相比，转基因超表达IpLEA基因的转基因株系复水后的存活率显著高于野生型对照，表明转基因超表达IpLEA的拟南芥植株具有较强的耐旱性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 厚藤IpLEA基因及其编码蛋白和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> 厚藤IpLEA protein

<400> 1

Met Ala Ser Ser Asp Asn Pro Glu Ile Val Glu Arg Gly Ile Lys Asp

1 5 10 15

Lys Glu Asp Lys Glu Glu Glu Lys Gly Gly Phe Leu Asp Lys Val Lys

20 25 30

Asp Phe Ile His Asp Val Gly Glu Lys Ile Glu Glu Thr Ile Gly Phe

35 40 45

Gly Lys Pro Thr Ala Asp Val Ser Glu Ile His Ile Pro His Ile Asn

50 55 60

Leu Glu Arg Ala Glu Ile Val Val Asp Val Leu Val Lys Asn Pro Asn

65 70 75 80

Pro Val Pro Ile Pro Leu Ile Asp Ile Asn Tyr Leu Ile Glu Ser Asp

85 90 95

Gly Arg Lys Leu Ile Ser Gly Leu Ile Pro Asp Ala Gly Thr Ile His

100 105 110

Ala His Gly Ser Glu Thr Val Lys Ile Pro Val Asn Leu Ile Tyr Asp

115 120 125

Asp Ile Lys Ser Thr Tyr Lys Asp Ile Glu Pro Gly Ser Ile Ile Pro

130 135 140

Tyr Arg Ile Lys Val Asp Leu Ile Val Asp Val Pro Val Phe Gly Arg

145 150 155 160

Leu Thr Leu Pro Leu Glu Lys Thr Gly Glu Ile Pro Ile Pro Tyr Lys

165 170 175

Pro Asp Ile Asp Leu Glu Lys Ile His Phe Glu Arg Phe Ser Phe Glu

180 185 190

Glu Thr Val Ala Ile Leu His Leu Lys Leu Glu Asn Met Asn Asp Phe

195 200 205

Asp Leu Gly Leu Asn Ser Leu Asp Tyr Glu Leu Trp Leu Ser Asp Val

210 215 220

Ser Ile Gly Ser Ala Glu Leu Glu Lys Ala Ala Lys Ile Glu Lys Lys

225 230 235 240

Gly Thr Ser Tyr Ile Asp Leu Pro Val Thr Phe Arg Pro Lys Asp Phe

245 250 255

Gly Ser Ala Leu Trp Asp Met Ile Arg Gly Lys Gly Thr Gly Tyr Thr

260 265 270

Met Lys Gly His Ile Asn Val Asp Thr Pro Phe Gly Ala Met Lys Leu

275 280 285

Pro Ile Ser Lys Glu Gly Gly Thr Thr Arg Leu Lys Lys Asn Lys Glu

290 295 300

Asp Gly Gly Asp Asp Asp Glu Glu Asp

305 310

<210> 2

<211> 942

<212> DNA

<213> 厚藤IpLEAcDNA阅读框

<400> 2

atggcatcgt ctgataatcc agagatagtg gaaaggggta tcaaggacaa ggaagacaag 60

gaggaagaaa agggtgggtt cttggacaag gtgaaagatt ttatccatga tgtaggggag 120

aagatagagg agacaatcgg gtttggaaaa ccaactgcag atgtgtccga gattcatatt 180

cctcatatca atcttgaaag ggcagaaata gttgttgatg tgcttgtgaa gaatccaaat 240

cctgttccaa tccctctcat tgacataaac tacttaattg agagtgatgg aaggaagctg 300

atctcggggc tgatccctga tgctggaacg atacatgcac atggttcaga aactgtcaag 360

ataccagtta atctgattta tgatgacatt aagagtacat ataaagatat agagcctgga 420

agcataattc catataggat aaaggtggac ctcatagtgg atgtgcctgt ttttggtagg 480

ttaactctgc ctctggagaa aactggtgaa attcccatcc cttacaagcc agatattgat 540

cttgagaaaa ttcatttcga gaggttctct tttgaagaaa ctgttgctat tcttcacttg 600

aaattggaaa acatgaatga ctttgatctg ggtctcaact cacttgacta tgagctttgg 660

ctgtctgatg tgagcattgg gagtgcagaa cttgagaagg cagccaaaat tgagaaaaaa 720

ggaactagct acattgatct tcccgtcacc ttcaggccca aggactttgg ctctgctcta 780

tgggacatga ttagaggtaa aggcactggc tacacaatga aaggacatat caatgtggat 840

acaccgtttg gagcaatgaa gttacccatc agcaaggagg gtggtaccac ccgtcttaag 900

aagaataagg aagatggagg agatgatgat gaggaggatt ga 942

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggcccctg ggatccatgg catcgtctga taatcc 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaattccgg ggatcctcaa tcctcctcat catcat 36

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggactctaga ggatccatgg catcgtctga taatcca 37

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcgacccgg ggatcctcaa tcctcctcat catcat 36

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA和/或IpLEA基因在提高植物对高盐/干旱的耐受中的应用，所述IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的核苷酸序列。

2.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA和/或IpLEA基因在农作物转基因育种中改良农作物对高盐/干旱耐受性、和/或调控农作物对氧化胁迫耐受性的应用，所述厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQID NO.1所示的厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白IpLEA的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征为，所述农作物为拟南芥。

4.插入有厚藤IpLEA基因的酿酒酵母重组表达载体，其特征为，所述厚藤IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或编码为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpLEA蛋白的核苷酸序列。

5.权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性中的应用。

6.插入有IpLEA基因的大肠杆菌表达载体，其特征为，所述IpLEA基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpLEA蛋白的核苷酸序列。

7.权利要求6所述的大肠杆菌重组表达载体在提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱胁迫耐受性中的应用。

8.一种提高拟南芥的耐盐和/或抗旱性的方法，其特征为，包括以下步骤：

(1)获得厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因IpLEA的cDNA全长，其cDNA阅读框序列如SEQID NO.2所示；

(2)将含有IpLEA的cDNA全长的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒转化野生型酵母菌株W303，分别在含盐量5％-8.8％的培养基上测试转基因酵母的耐盐性；

(3)以含有厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，以引物扩增IpLEA基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至拟南芥转基因超表达载体pMD1的cDNA阅读框片段，构建厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白转基因超表达重组载体IpLEA-pMD1；

将上述厚藤胚胎发生晚期丰富蛋白转基因超表达重组载体IpLEA-pMD1转化进入农杆菌GV3101感受态菌株中，通过拟南芥花序侵染法转化拟南芥植株，通过Kan抗性筛选获得拟南芥转基因后代。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征为，步骤(3)中的引物为SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6。