CN102206259A - 来自红薯根茎的IbLEA14基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与红薯的抗逆性或木质素生物合成相关的IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14)蛋白质，编码所述蛋白质的基因，包含所述基因的重组载体，由所述重组载体形质转换而来的宿主细胞，使所述重组载体在植物细胞内进行形质转换来提高植物的抗逆性或者植物的木质素生物合成的方法，包含利用所述重组载体来形质转换生物细胞的步骤的、制造抗逆性形质转换植物体或者木质素生物合成增加了的形质转换植物体的方法，从根据所述方法制造的增加了木质素生物合成的形质转换植物体获得的生物能，以及用于提高包含所述基因的植物体的抗逆性或者木质素生物合成的组成物。

Description

来自红薯根茎的IbLEA14基因及其用途

技术领域

本发明涉及来自红薯根茎的IbLEA14基因及其用途，更详细地，涉及与红薯的抗逆性或木质素生物合成相关的IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14)蛋白质，编码所述蛋白质的基因，包含所述基因的重组载体，由所述重组载体形质转换而来的宿主细胞，使所述重组载体在植物细胞内进行形质转换来提高植物的抗逆性或者植物的木质素生物合成的方法，包含利用所述重组载体来形质转换生物细胞的步骤的、抗逆性形质转换植物体或者木质素生物合成得到增强的形质转换植物体的制造方法，从根据所述方法制造的增强了木质素生物合成的形质转换植物体获得的生物能，以及用于提高包含所述基因的植物体的抗逆性或者木质素生物合成的组成物。

背景技术

红薯(Ipomoea batatas L.Lam)是用作粮食以及家畜饲料的代表性根茎作物，其不仅可以栽培在较为贫瘠的土地上，而且其每公顷的产量高，约为22吨。尤其是，干红薯中的约70％由淀粉构成，因此很久之前就用于酒精的原料作物，而其作为用于生物乙醇生产的绿色替代能源作物，最近被重新认识。

最近，由于高速工业化以及人口增加，地球规模的环境问题以及粮食问题凸现出来，因而，正广泛进行对在沙漠地区、被污染地区以及严寒地区等条件恶劣的区域中也能良好生长的抗环境灾害的农作物的开发。尤其是，为了开发适合条件恶劣的区域的工业用红薯，正尝试通过分子育种进行抗环境灾害形质转换红薯的研究(Lim et al.Mol Breeding 19，227-239，2007；Kim et al.Mol Breeding 24，233-244，2009)。

为开发在干燥、盐等恶劣的土壤中促进植物体的生存与生长的抗环境灾害红薯，迫切地需要对在干燥、盐等各种胁迫下特异性过度表达的基因进行开发。并且，因叶子中光合作用产物成为红薯块根的淀粉，想要在块根生产有用材料时，开发研究叶子中过度表达的基因非常重要。因此，很久以前就有对红薯块根(tuberous root)中过度表达的红薯贮藏(sporamin)蛋白质编码基因进行分离研究(Hattori et al.Plant Mol Biol 14，595-604，1990)。并且，最近有在干燥等各种胁迫条件下，关于红薯幼根特异性过度表达基因的报告(Kim et al.Plant Physiol Biochem 46，196-204，2008；Kim et al.BMB Rep 41，259-265，2008)，该观点中在胁迫条件下，关于红薯叶子特异性强烈表达基因的分离有利于对抗环境灾害植物体及各种生产有用材料的形质转换红薯进行开发。即，利用尖端生命工程技术的代谢工程，尤其是对在干燥地区、垦荒地区以及被污染地区等边际作物区(条件恶劣地区)中良好生长，并生产淀粉、功能性蛋白质等利于工业材料的红薯品种进行开发的话，有望对粮食供需不造成影响，并可以生产绿色生物能等。

植物细胞壁的木质化(lignification)是针对各种环境胁迫而产生的一种反应，木质化增加，并且该木质化又与植物生长减少及植物组织的结构坚固有关。木质素(lignin)一般通过p-香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(conifryl alcohol)、芥子醇(sinapyl alcohol)等单体木质素的脱氢聚合化来生成，这样的单体木质素在细胞质内，依靠各种与单体木质素生物合成相关的酶通过三个步骤来制造。第一步骤通过丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、肉桂酸羟-4-基化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL)等普通类苯基丙烷生物合成途径的酶来进行；下一步骤通过与单体木质素甲基化作用相关的咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyl-transferase)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeoyl coenzyme A O-methyl-transferase，CCAOMT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl-L-methionine synthetase，SAMS)、阿魏酸-5-羟化酶(ferulate-5-hydroxylase，F5H)等酶来进行；最后的步骤通过肉桂酰辅酶A还原酶(hydroxycinnamoyl-CoA：NADPH oxidoreductase，CCR)以及肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)来完成单体木质素生物合成。

木质素不仅可用作与病原菌感染相关的物理防御，还与干燥、低温、弧光以及紫外线等各种非生物学的环境灾害相关的植物的防御机制有关联(Moura et al.J Integr Plant Biol，52，360-376，2010)。尤其是，干燥胁迫期间木质素生物合成，由于芳香族化合物木质素具有细胞壁水分无法浸透的性质，有助于减少细胞内的蒸腾作用以及即便在干燥条件期间也能维持正常条件的膨压，因而与植物的耐干燥性有关。因此，植物的木质化的调节为开发耐干燥性植物的一种好方法。

本发明的IbLEA14(Late embryogenesis abundant 14)蛋白质是在种子一边干燥一边成熟的过程中大量表达的LEA蛋白质群中的一种。LEA蛋白质不仅在种子成熟时，而且在干燥胁迫下也可以表达。报告(Baker et al.Plant Mol Biol 11，277-291，1988；Dure et al.Plant Mol Biol 12，475-486，1989)中，记载了如下内容：LEA蛋白质通过保护特定的细胞结构或者隔离离子维持细胞的最小水分需求量，以加强其抗干燥胁迫性能。大部分的LEA蛋白质存在于细胞质中，由亲水性氨基酸残基所构成并以无规卷曲(random coil)或者α-螺旋(α-helices)来实现。但是，LEA14蛋白质存在很多疏水性氨基酸残基并具备三维结构(Cuming et al.Kluwer Academic Publishers，Dordercht，The Netherlands，pp 753～780，1999)。最近，对鼠耳芥进行cDNA微阵列实验的结果，发现LEA14蛋白质在干燥、低温及盐等胁迫情况下比正常条件的表达水平多5倍以上。此外，还有报告表明诱导LEA14蛋白质表达不仅与干燥及盐等多种环境胁迫有关，而且还与机械伤口有关(Seki et al.Plant Cell 13，61-72，2001；Singh et al.Protein Sci 14，2601-2609，2005)。LEA14在棉花、大豆及鼠耳芥等多种植物中被发现，在胁迫条件下对植物激素脱落酸(ABA)依赖表达或独立地进行表达(Wise et al.BMC Bioinformatics 4，52-70，2003；Bies-Etheve et al.Plant Mol Biol 67，107-124，2008)。但目前尚没有红薯中LEA14基因的报告。

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明是根据上述需求而提出的。发明人通过将来自红薯根茎IbLEA14基因引入到形质转换红薯愈伤组织中，确定能够增加抗逆性及木质素含量，从而完成了本发明。

技术方案

为解决上述问题，本发明提供与红薯的抗逆性或木质素生物合成相关的IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14)蛋白质。

此外，本发明提供编码所述蛋白质的基因。

此外，本发明提供包含所述基因的重组载体。

此外，本发明提供由所述重组载体进行形质转换而来的宿主细胞。

此外，本发明提供使所述重组载体在植物细胞内进行形质转换来提高植物的抗逆性或者植物的木质素生物合成的方法。

此外，本发明提供制造抗逆性形质转换植物体或者木质素生物合成增加了的形质转换植物体的方法，所述方法包含利用所述重组载体来形质转换生物细胞的步骤。

本发明提供从形质转换植物体获得的生物能，所述形质转换植物体根据所述方法制造的、并且木质素生物合成得到增强。

此外，本发明提供用于提高包含所述基因的植物体的抗逆性或者木质素生物合成的组成物。

(三)有益效果

本发明中的引入了来自红薯根茎IbLEA14基因的形质转换红薯愈伤组织表现出抗逆性，并且木质素含量增加。由此有望利用IbLEA14基因开发在恶劣环境下也能生存的具有抗逆性的形质植物体或生物燃料作物。

附图说明

图1为显示了本发明来自经干燥处理的红薯根茎IbLEA14基因的碱基序列及以此推论的氨基酸序列的图。

图2为用IbLEA14蛋白质的疏水性图谱(hydrophobicity plot)来显示氨基酸的亲水性及疏水性的图。

图3为对比了根据来自红薯IbLEA14基因推论出的蛋白质的氨基酸序列及各种植物(大豆，番茄，棉花及茶树)的IbLEA14基因的图。

图4为显示了根据来自红薯IbLEA14基因推论出的蛋白质的氨基酸序列及各种植物(大豆，番茄，棉花及茶树)的IbLEA14基因之间的亲缘关系的图。

图5为显示了对红薯各组织中IbLEA14基因表达的状态进行RT-PCR后实施电泳的结果的图。L：leaf(叶子)，S：stem(茎)，TR：tuberous root(块状根)，FR：fibrous root(须根)，TPR：thick pigmented root(粗根)。

图6为分析了红薯各组织中IbLEA14基因表达状态的实时荧光定量PCR图。L：leaf(叶子)，S：stem(茎)，TR：tuberous root(块状根)，FR：fibrous root(须根)，TPR：thick pigmented root(粗根)。

图7为显示了在红薯叶子及须根中进行干燥处理0，1，2，4，8，16及24小时后的IbLEA14基因表达的状态的实时荧光定量PCR图。

图8为显示了对红薯叶子用植物激素0.1mM的脱落酸(ABA)进行处理后0，1，2，4，8，16及24小时的IbLEA14基因表达的状态的实时荧光定量PCR图。

图9为显示了对红薯叶子用100mM氯化钠(NaCl)进行处理0，1，2，4，8，16及24小时后的IbLEA14基因表达的状态的实时荧光定量PCR图。

图10为显示了在各种低温条件25，15，10及4℃下培养红薯植物体24小时后，叶子中IbLEA14基因表达水平的实时荧光定量PCR图。

图11为显示了对红薯叶子用400mM过氧化氢，0.05mM甲基紫精(methyl viologen，paraquat)，0.5mM镉及0.5mM铜进行处理24小时后的IbLEA14基因表达状态的实时荧光定量PCR示意图。

图12为确认IbLEA14基因存在于红薯基因组中的DNA吸印转移法(Southern Blot)检测结果图。

图13为过度表达载体pGWB12和RNAi载体pH7GW1W2的结构示意图。

图14为用基因组DNA的PCR分析在用过度表达载体pGWB 12和RNAi载体pH7GW1W2形质转换的红薯愈伤组织系上是否能引入抗生素选择标记基因HPT(潮霉素磷酸转移酶类)及IbLEA14 cDNA的图。

图15为用实时荧光定量PCR分析用过度表达载体pGWB12和RNAi载体pH7GW1W2形质转换的红薯愈伤组织系上IbLEA14的表达状态的图。

图16为利用FLAG-tag抗体分析IbLEA14基因在过度表达的形质转换红薯愈伤组织中IbLEA14蛋白质的表达水平的图。

图17为对用过度表达载体pGWB12和RNAi载体pH7GW1W2形质转换的红薯愈伤组织系用PEG(干燥)及NaCl(盐)进行处理后，对视觉损伤程度及脂质过氧化程度进行分析的图。

图18为利用木质素染色法及定量分析来分析用过度表达载体pGWB12和RNAi载体pH7GW1W2形质转换的红薯愈伤组织系中木质素含量的图。

图19为用实时荧光定量PCR分析了用过度表达载体pGWB12和RNAi载体pH7GW1W2形质转换的红薯愈伤组织系中木质素单体生物合成关联基因的表达状态的图。

具体实施方式

为达到上述目的，本发明提供由序列号2表示的氨基酸序列构成的，来自红薯根茎的与抗逆性或木质素生物合成相关的IbLEA14(Ipomoea batatas s Late embryogenesis abundant 14)蛋白质。

根据本发明的IbLEA14蛋白质的范围包括具有从红薯分离的序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质及所述蛋白质的功能性等同物。所谓“功能性等同物”是指氨基酸附加、置换或缺失的结果，与所述序列号2表示的氨基酸序列具有至少70％以上，优选为80％以上，更优选为90％，进一步更优选为95％以上的序列相同性的物质，并且与序列号2表示的蛋白质实际上同质的生理活性的蛋白质。所谓“实际上同质的生理活性”是指增加植物抗逆性或木质素生物合成。

本发明还包括IbLEA14蛋白质的断片、诱导体及类似物(analogues)。本申请中使用的用语“断片”、“诱导体”及“类似物”是指保有与本发明的IbLEA14多肽实质上相同的生物学功能或者活性的多肽。本发明的断片、诱导体及类似物可以为如下情况的多肽：(i)一个以上的保守(conservative)或者非保守氨基酸残基(优选为保守氨基酸残基)被置换的多肽(所述被置换的氨基酸残基可被遗传密码编码或不被编码)，或(ii)在一个以上的氨基酸残基中具有置换基的多肽，或(iii)来自与其他化合物(可延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)结合的成熟多肽，或(iv)来自与附加氨基酸序列(例如，先导序列，分泌信号序列，用于整理上述多肽的序列，蛋白源序列(proteinogen)，融合蛋白)结合的所述多肽。本申请中定义的所述断片、诱导体及类似物被本领域的技术人员所公知。

此外，本发明提供编码所述IbLEA14蛋白质的基因。本发明的基因可以是编码IbLEA14蛋白质的DNA或者RNA。DNA包括cDNA，基因组DNA或者人工合成DNA。DNA可以是单链或者双链。DNA可以是编码(coding)链或非编码(non-coding)链。

优选的，本发明的基因可包括由序列号1表示的碱基序列。

加密表示为序列号2的成熟(mature)多肽的多核苷酸包括仅编码成熟多肽的编码序列；编码成熟多肽及多种附加编码序列的序列；编码成熟多肽(及任一附加编码序列)及非编码序列编码的序列。

用语“编码多肽的多核苷酸”是指编码多肽的多核苷酸，或者还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

此外，本发明还涉及编码包含与本申请中的记载相同的氨基酸序列或其断片、类似物及诱导物的多肽的所述多核苷酸的变异体。多核苷酸变异体可以是自然发生的等位基因变异体或者非自然产生的变异体。所述核苷酸变异体包括置换变异体、缺失变异体及插入变异体。如本领域中所知，等位基因变异体是多核苷酸的替代物，其可包括一个以上的置换、缺失或者插入的核苷酸，并且在由变异体编码的多肽中不会引发实质性的功能变化。

此外，本发明涉及与所述记载的序列号1的碱基序列及所述记载的序列号1的碱基序列具有至少50％，优选为至少70％，更优选为至少80％的相同性的序列杂交的多核苷酸。本发明尤其涉及在苛刻的条件下与本申请记载的多核苷酸进行杂交的多核苷酸。本发明中，“苛刻的条件”是指(1)在像0.2×SSC，0.1％SDS，60℃的更低的离子强度及更高的温度下的杂交及洗涤；或(2)50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清/0.1％Ficoll及42℃等变性体存在下的杂交；或(3)具有至少80％，优选为90％，更优选为95％以上的相同性的两个序列之间发生的杂交。而且，由可杂交的多核苷酸编码的多肽的生物学功能及活性与序列号2表示的成熟多肽的生物学功能及活性相同。

根据本发明的实施例，应当理解IbLEA14基因优选为来自红薯。但是，本发明的实施例还包括来自其他植物的，与红薯IbLEA14基因具有高的相同性(例如，60％以上，即70％、80％、90％、95％，甚至98％的序列相同性)的其他基因。序列比对方法及决定序列同一性或者相同性的方法(例如，BLAST)在本领域中是公知的方法。

此外，本发明提供根据本发明的包含IbLEA14基因的重组载体。

用语“重组”是指细胞复制两种核酸，或表达所述核酸或表达由肽、两种肽或者两种核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞可表达为所述细胞的天然状态下不被发现的基因或者基因断片表达为感知状或非感知状的一种。此外，重组细胞可表达在天然状态的细胞中发现的基因，不过所述基因为变异的基因，是通过人工手段再引入到细胞内的。

本发明中，编码IbLEA14蛋白质的所述多核苷酸序列可插入到重组表达载体内。用语“重组表达载体”是指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或者其他载体。大体上，任一质粒及载体只要能在宿主细胞内进行复制及稳定化就能被使用。所述表达载体的重要特性是具有复制原点、催化剂、标记基因及翻译控制要素(translation control element)。

包含IbLEA14蛋白质-编码DNA序列及适当的转录/翻译控制信号的表达载体可通过本领域的技术人员公知的方法构筑。所述方法包括试验管内重组DNA技术、DNA合成技术及生物体内重组技术等。为了引导mRNA的合成，所述DNA序列可有效连接到表达载体内的适当的催化剂上。此外，表达载体作为翻译起始部位可包括核糖体结合部位及转录终止端。

本发明重组载体的优选例子是，根癌土壤杆菌存在于适当的宿主时，可将自己的一部分，所谓T-区域转移到植物细胞的Ti-质粒载体。其他类型的Ti-质粒载体(参见EP 0 116 718 B1号)作为能够生成新植物的原生质体可将当前植物细胞或者杂种DNA适当地插入到植物的基因组内，用于转移杂种DNA序列。Ti-质粒载体的尤其优选形态是EP 0 120 516 B1号及美国专利第4,940,838号中要求保护的所谓双运(binary)载体。用于将根据本发明的DNA引入到植物宿主的其他适合的载体可选自双链植物病毒(例如，CaMV)及单链病毒，可来自双粒病毒组等的病毒载体，例如非完全性植物病毒载体。这样的载体的使用在难以使植物宿主适当形质转换的时候尤其有利。优选地，所述重组载体可以为pKBS1-1载体、pBI101载体及pCAMBIA载体，但不限于此。

表达载体优选地包括一个以上的选择性标记。所述标记为具有通常可通过化学方法选择的特性的核酸序列，将形质转换细胞从非形质转换细胞中区分开的所有基因就是所述标记。作为其例子有像草甘膦(glyphosate)或者注蓖麻膦(phosphinothricin)的除草剂抵抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、G418、博莱霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等的抗生素耐性基因，但不限于此。

本发明的重组载体中，催化剂可以为CaMV3 5S、肌动蛋白、泛素，pEMU、MAS或者组蛋白催化剂，但并不限于此。用语“催化剂”表示从结构基因的DNA上游区域，是指用于开始转录的RNA聚合酶激酶所结合的DNA分子。“植物催化剂”为可在植物细胞中开始转录的催化剂。“结构性(constitutive)催化剂”为在大部分环境条件及发达状态或者细胞分化下具有活性的催化剂。形质转换体的选择可在各个阶段由各个组织完成，因此本发明中应优选结构性催化剂。因此，结构性催化剂不限制选择的可能性。

本发明的重组载体中，可使用通常的终止端，作为其例子有一氧化氮合酶(NOS)，稻α-淀粉酶RAmy A终止端、菜豆碱(phaseoline)终止端、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的真蛸碱(octopine)基因的终止端等，但并不限于此。关于终止端的必要性，通常认为这样的区域能够提高植物细胞中转录的确实性及效率。因此，优选在在本发明内容中使用终止端。

本发明还提供由本发明重组载体形质转换的宿主细胞。可将本发明的载体稳定到原核细胞并能连续克隆并表达的宿主细胞可利用本领域中公知的任何宿主细胞，例如，像E.coli JM109、E.coli BL21、E.coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X 1776、E.coli W3110、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌类，以及像鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及多种假单胞杆菌种等肠内菌科。

此外，将本发明的载体形质转换到真核细胞时，可利用啤酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞、人体细胞(例如，CHO细胞株(Chinese hamster ovary)、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等作为宿主细胞。宿主细胞优选为植物细胞。

本发明的将载体搬运到宿主细胞内的方法，在宿主细胞为原核细胞时可由CaCl₂方法、哈纳汉方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166：557-580(1983))及电穿孔方法等实现。此外，宿主细胞为真核细胞时，可由显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖处理法及基因轰击等将载体注入到宿主细胞内。

植物的形质转换是指将DNA转移到植物中的任意方法。这样的形质转换并不是非要有再生及(或者)组织培养期间。植物种的形质转换现在不仅针对双子叶植物，而且也普遍针对包含单子叶植物的植物种。原则上，任意的形质转换方法都能用于将本发明中的杂种DNA引入到适当的先祖细胞。形质转换方法可从如下方法中适当选择：原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.et al.，1982，Nature 296，72-74；Negrutiu I.et al.，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)，原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.et al.，1985Bio/Technol.3，1099-1102)，植物要素的显微注射法(Crossway A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)，各种植物要素的(DNA或者RNA-覆盖了的)粒子冲击法(Klein T.M.et al.，1987，Nature 327，70)，在植物的浸润或者成熟花粉或者小孢子进行形质转换时、利用根癌土壤杆菌介导基因转移(非完全性)、引发病毒感染(EP 0 301 316号)的方法等。本发明的优选方法包括土壤杆菌介导的DNA转移。尤其可取的是利用EP A 120 516号及美国专利第4,940,838号中所记载的所谓二元载体技术。

此外，本发明还包括增加植物抗逆性的方法，所述方法包括通过将所述重组载体形质转换到植物细胞中来过度表达IbLEA14基因的步骤。所述胁迫可以为干燥、低温、盐或化合物胁迫，但并不限于此。所述低温可以为4～15℃，优选为15℃。所述盐优选为NaCl，但并不限于此。此外，所述化合物优选为过氧化氢、甲基紫精、镉或铜，但并不限于此。

此外，本发明提供胁迫耐性形质转换植物体的制造方法，所述制造方法包括用所述重组载体形质转换植物细胞的步骤；以及从所述形质转换的植物细胞中再分化植物的步骤。

本发明的方法包括用根据本发明的重组载体形质转换植物细胞的步骤，所述形质转换例如可由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefiaciens)进行介导。此外，本发明的方法包括从所述性质转换的植物细胞中再分化形质转换细胞的步骤。从形质转换植物细胞再分化形质转换植物的方法可利用本领域中公知的任意方法。

形质转换的植物细胞需再分化为全植物。用于从愈伤组织或原生质体到成熟植物的再分化技术对于很多种已被本领域所公知(Handbook of Plant Cell Culture，1-5册，1983-1989 Momillan，N.Y.)。

此外，本发明提供增加植物的木质素生物合成的方法，所述方法包括将所述重组载体形质转换到植物细胞来过度表达IbLEA14的基因。

此外，本发明提供木质素生物合成增加了的植物体的制造方法，所述方法包括：用所述重组载体来形质转换植物细胞的步骤；以及从所述形质转换的植物细胞中再分化植物的阶段。

此外，本发明提供由所述方法制造的抗逆性或者木质素生物合成增加了的形质转换植物体及其种子。优选地，所述植物体可为单子叶植物或双子叶植物，但并不限于此。

所述单子叶植物可为泽泻科(Alismataceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)、水麦冬科(Juncaginaceae)、芝菜科(Scheuchzeriaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)，、百合科(Liliaceae)、血皮草科(Haemodoraceae)、龙舌兰科(Agavaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、水玉簪科(Burmanniaceae)、灯心草科(Juncaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、禾本科(稻科，Gramineae，Poaceae)、天南星科(Araceae、浮萍科(Lemnaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、香蒲科(Typhaceae)、萍草科(莎草科，Cyperaceae)、芭蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蕉科(Cannaceae)或兰科(Orchidaceae)，但并不限于此。

所述双子叶植物可为岩梅科(Diapensiaceae)、桤叶树科(Clethraceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、紫金牛科(Myrsinaceae)、报春花科(Primulaceae)、蓝雪科(Plumbaginaceae)、柿树科(Ebenaceae)、安息香科(Styracaceae)、山矾科(Symplocaceae)、木犀科(Oleaceae)、马钱科(Loganiaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、萝摩科(Asclepiadaceae)、茜草科(Rubiaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、唇形科(Labiatae)、茄科(Solanaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、爵床科(Acanthaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、列当科(Orobanchaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、狸藻科(Lentibulariaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、车前草科(Plantaginaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、五福花科(Adoxaceae)、败酱科(Valerianaceae)、山萝卜科(Dipsacaceae)、桔梗科(Campanulaceae)、菊科(Compositae)、杨梅科(Myricaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、杨柳科(Salicaceae)、桦木科(Betulaceae)、山毛榉科(Fagaceae)、榆科(Ulmaceae)、桑科(Moraceae)、荨麻科(Urticaceae)、檀香科(Santalaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、蓼科(Polygonaceae)、商陆科(Phytolaccaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、番杏科(Aizoaceae)、马齿苋科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、苋科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、八角科(Illiciaceae)、樟科(Lauraceae)、连香树科(Cercidiphyllaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、小檗科(Berberidaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科(Menispermaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、金鱼藻科(Ceratophyllaceae)、莼菜科(Cabombaceae)、三白草科(Saururaceae)、胡椒科(Piperaceae)、金粟兰科(Chloranthaceae)、马兜铃科(Aristolochiaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、山茶科(Theaceae)、藤黄科(Guttiferae)、茅膏菜科(Droseraceae)、罂粟科(Papaveraceae)、白花菜科(Capparidaceae)、十字花科(景天科，Cruciferae)、悬铃木科(三球悬铃木科，Platanaceae)、金缕梅科(Hamamelidaceae)、景天科(Crassulaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)、海桐花科(Pittosporaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、旱金莲科(Tropaeolaceae)、蒺藜科(Zygophyllaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、水马齿科(Callitrichaceae)、芸香科(Rutaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、楝科(Meliaceae)、远志科(Polygalaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、槭树科(枫叶科，Aceraceae)、无患子科(Sapindaceae)、七叶树科(Hippocastanaceae)、清风藤科(Sabiaceae)、凤仙花科(Balsaminaceae、冬青科(Aquifoliaceae)、卫矛科(Celastraceae)、省沽油科(Staphyleaceae)、黄杨科(Buxaceae)、岩高兰科(Empetraceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、杜英科(Elaeocarpaceae)、椴树科(Tiliaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、瑞香科(Thymelaeaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、大风子科(Flacourtiaceae)、紫堇科(Violaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、沟繁缕科(Elatinaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、千屈菜科(Lythraceae)、石榴科(Punicaceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、小二仙草科(Haloragaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、五加科(五加皮树科，Araliaceae)或伞形科(Apiaceae)，但并不限于此。优选的，所述植物体为属于十字花科、茄科、蔷薇科或旋花科的植物体。

此外，本发明提供从根据本发明的方法制造的木质素生物合成增加了的形质转换植物体中获得的生物能。生物能是指利用生物质制造的可持续的能量，可从本发明的生物质增加了木质素生物合成的生物体中通过生物学、化学、物理变换过程生产液体燃料(生物乙醇、生物柴油)、沼气、固体燃料(生物颗粒)形态的生物能。

本发明还提供包含本发明的IbLEA14基因的用于增加植物体的胁迫耐性或木质素生物合成的组成物。本发明的组成物中，所述IbLEA14基因可由序列号1的碱基序列构成。本发明的组成物作物有效成分包含来自红薯的IbLEA14基因，可通过将所述基因IbLEA14形质转换到植物体来增加植物体的胁迫耐性或木质素生物合成。所述植物如前所述。

以下，根据实施例来详细说明本发明。但是，下述实施例只是例示本发明，本发明并不被下述实施例所限定。

实施例1：红薯IbLEA14基因的克隆、碱基序列分析及类缘关系分析

将红薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.cv.White star)植物体在MS(Murashige and Skoog，1962)基础培养基中培养60日。MS基础培养基中培养的红薯植物体在25℃恒温机中以16小时亮及8小时暗周期培养60日后，转移到土壤中。转移到土壤的红薯在25℃恒温机中，在16小时亮及8小时暗周期的条件下，经过14日的驯化过程后用于实验。从土壤中分离出栽培植物的须根，然后再25℃恒温机中进行6小时的干燥处理。干燥处理后，将须根(fibrous root)组织通过CTAB方法(Kim et al.BMB Rep 42，271-276，2009)分离出总RNA。使用Poly(A)Tract mRNA分离系统分离了mRNA，并使用SMART-cDNA合成试剂盒(Clontech公司)制造了干燥处理过的红薯须根的cDNA库(Kim et al.BMB Rep 42，271-276，2009)。使用RISA 384 multi-capillary sequencer(Shimadzu公司)分析了碱基序列后利用CAP3程序制造各序列簇(cluster)。各ESTs的功能分析利用了NCBI数据库。其中找到了3个LEA14，用同样的方法序列分析的结果确认了是一个同样的序列。

显示出IbLEA14 cDNA基因的全长为793bp，并且由102bp的5’-末端非翻译区域(UTR)、211bp的3′-末端非翻译区域及480bp的编码区域(由160个氨基酸构成)构成(图1)。此外，调查IbLEA14蛋白质的亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基的分布的结果，显示了高疏水性(图2)。

用BlastX调查红薯IbLEA14的编码区域时，在氨基酸水平上，与大豆(Glycinemax)的GmLEA14显示了70％的相同性，与番茄(Lycopersiconesculentum)的LeER5显示了61％的相同性(图3)。利用ClustalW程序(http://plant.pdrc.re.kr/gene/align/ClustalW.html)对红薯IbLEA14的推定蛋白质的氨基酸序列和多种植物种的LEA之间的亲缘关系进行调查的结果，确认红薯IbLEA14为LEA14系列的蛋白质。

实施例2：红薯各组织IbLEA14基因的表达分析

为了分析从干燥处理过的红薯根茎分离的本发明红薯IbLEA14的各组织表达状态，进行了RT-PCR及实时荧光定量PCR。用CTAB方(Kim and Hamada，Biotech Lett 27，1841-1845，2005)法从红薯组织(叶子、茎、块茎、须根及粗根)中分离出全部RNA后，使用RNA 2μg通过MMLV Reverse Transcription System cDNA合成试剂盒(Promega公司)合成了cDNA。使用IbLEA14基因特异性催化剂及Accel Taq Premix试剂盒(Genedocs公司)调查了IbLEA14基因的表达现象。关于IbLEA14的特异性催化剂使用了正方向(5′-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3′；序列号3)及逆方向(5′-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3′；序列号4)催化剂。其结果，IbLEA14基因在须根(fibrous root)及粗根(thick pigmented root)中表达强烈，并且在块根(tuberous root)及茎(stem)也有表达。但是在叶子(leaf)中表现出很弱的表达状态(图5及6)。因此，可以知道从干燥处理过的红薯根茎组织中分离的IbLEA14基因是在正常生育条件下主要在须根及粗根表达的基因。

实施例3：根据包含干燥处理在内的多种胁迫处理的IbLEA14基因的表达特性分析

为了分析IbLEA14基因对于包含干燥在内的多种胁迫处理的反应程度，处理了与多种胁迫条件，即干燥、植物激素(ABA)、低温及胁迫相关的化合物后，利用实时荧光定量PCR分析了IbLEA14基因的表达变化。

首先，为了分析IbLEA14基因对干燥处理的反应程度，对红薯的叶子及须根组织按时间段(0、1、2、8、16及24小时)进行干燥处理后，按实施例2中实施的方法分离RNA，之后分别合成了cDNA。用所述实施例2中使用的IbLEA14基因特异性催化剂进行了实时荧光定量PCR。其结果，IbLEA14基因在叶子组织中干燥处理16小时后表现了最强的表达水平，且其强的表达水平维持到24小时后(图7)。另一方面，在须根组织中由干燥处理的IbLEA14表达量在1小时后显示出最强的表达水平，且其表达水平维持到24小时后。

通常认为，在干燥胁迫下，植物激素脱落酸的量增加，植物激素脱落酸对应于干燥调整植物气孔的开启和关闭(Cornic et al.Trends Plant Sci 5，187-188，2000)。因此，为了观察在干燥处理时反应的IbLEA14基因是否根据植物激素脱落酸的处理而增加，对红薯叶子组织用0.1mM的植物激素脱落酸按时间段(0、2、4、8、12及24小时)处理后用同样的方法提取RNA并合成了cDNA，进行了实时荧光定量PCR。其结果，处理2小时后确认了表达增加，且其表达维持到处理24小时后(图8)。因此认为红薯IbLEA14基因的表达是由根据关于植物激素脱落酸的依赖性信号传输机制所调整。

鼠耳芥的LEA14基因表现出对干燥及盐的胁迫的诱导表达特性(Seki et al.Plant Cell 13，61-72，2001)。因此，为了知道IbLEA14对盐胁迫的反应性，将100mM的氯化钠按时间段(0、2、4、8、12及24小时)处理后，用相同的方法提取RNA并合成了cDNA，并且进行了实时荧光定量PCR。其结果，处理2小时后表达开始增加，且在处理12小时后显示了最高的表达水平(图9)。

然后，为了知道IbLEA14基因在多种低温条件下的反应性，在多种温度条件(25、15、10及4℃)下培养24小时并调查了基因的表达水平。其结果，在15℃温度下处理了12小时的植物体的叶子中显示了比25℃的对照群高出6倍的IbLEA14的表达增加(图10)。

然后，为了知道IbLEA14基因对多种化合物胁迫的反应性，对400mM过氧化氢(H₂O₂)，0.05mM甲基紫精(methyl viologen，paraquat)，0.5mM镉(Cd)及0.5mM铜(Cu)进行24小时处理后，用同样的方法提取了RNA并合成了cDNA，并且进行了实时荧光定量PCR。甲基紫精为非选择性除草剂，其通过大量产生活性氧杀死植物(Babbs et al.Plant Physiol 90，1267-1270，1989)。作为各自的对照群使用了消毒水。其结果，IbLEA14基因在处理了过氧化氢、甲基紫精及铜的时候在叶子组织中显示了表达增加，尤其进行了镉处理的时候显示了强的表达增加(图11)。所述结果显示了IbLEA14基因对多种胁迫具有反应性。因此，判断为IbLEA14基因有利于在干燥、盐等恶劣土壤中使生物体的初期成长变好的环境灾害耐性植物体(包括红薯)的开发。

实施例4：IbLEA14基因的DNA吸印转移分析

为了观察IbLEA14基因在红薯基因组(genome)内的存在及其他相同性基因的存在与否，实施了DNA吸印转移分析(Southern blot analysis)。用CTAB方法从红薯叶子中将基因组DNA进行分离及提炼后用EcoRI、HindIII及BamHⅠ进行了切割。对由限制酶切割的基因组DNA进行电泳后，使用由³²P放射性同位素标记的标识对IbLEA14cDNA的3’-末端特异性区域的300bp进行了DNA吸印转移检测。

其结果，IbLEA14基因在用限制酶切割的各断片中存在一个以上的IbLEA14标识识别的DNA带，因此可以知道本发明的IbLEA14基因在红薯基因组内以多个拷贝(copy)数存在(图12)。

实施例5：IbLEA14基因的过度表达载体和RNAi载体的制造及利用其形质转换的红薯愈伤组织

为了进行IbLEA14基因的功能分析，制造了形质转换表达载体。为了能够使IbLEA14基因过度表达，关于IbLEA14的编码区域特异性催化剂使用了包含attB1和attB2碱基序列的正方向(5′-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCTGGTGGACAAG-3′；序列号5)及逆方向(5′-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGCAGCTTCTGCCTC-3′；序列号6)催化剂。PCR最终产物引入到了利用BP克隆酶(clonase)重组反应的Invitrogen公司的pDONR 207载体中，BP克隆酶反应后以可调整CaMV35S催化剂表达的方式将DNA断片插入到在N末端包含有FLAG-tag的过度表达载体pGWB12和RNAi载体pH7GW1W2中。重组质粒是利用农杆菌EHA105菌株形质转换到红薯愈伤组织的(图13)。

通过基因组PCR确认了形质转换红薯愈伤组织引入的IbLEA14基因和HPT抗生素选择标记基因(图14)。用CTAB方法(Kim and Hamada，Biotech Lett 27，1841-1845，2005)提取出红薯愈伤组织系的基因组DNA后，使用IbLEA14和HPT抗生素选择标记基因的特异性催化剂及Accel Taq Premix试剂盒(Genedocs公司)调查了引入与否。关于IbLEA14的特异性催化剂使用了正方向(5′-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3′；序列号3)及逆方向(5′-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3′；序列号4)催化剂，并且关于HPT的特异性催化剂使用了正方向(5′-GATGTAGCAGGGCGTGGA-3′；序列号7)及逆方向(5′-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3′；序列号8)催化剂。其结果，在两种插入了载体的形质转换愈伤组织中可确认IbLEA14基因的引入与否。

为了分析形质转换红薯愈伤组织中IbLEA14基因的表达水平进行了实时荧光定量PCR(图15)。用CTAB方法(Kim and Hamada，Biotech Lett 27，1841-1845，2005)从红薯愈伤组织中提取出总RNA后，使用RNA 2μg通过MMLV逆转录酶系统cDNA合成试剂盒(Promega公司)合成了cDNA。使用IbLEA14基因特异性催化剂及Accel Taq Premix试剂盒(Genedocs公司)调查了IbLEA14基因的表达现象。关于IbLEA14的特异性催化剂使用了正方向(5′-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3′；序列号3)及逆方向(5′-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3′；序列号4)催化剂。其结果，过度表达愈伤组织系3、7、8、11及12号显示了比非形质转换体高出7倍以上的表达水平，并且RNAi线2、5、9及10号显示了比非形质转换体低约80％的表达水平。

为了分析过度表达的形质转换红薯愈伤组织中IbLEA14蛋白质的表达水平，利用FLAG-tag抗体进行了南方墨点分析(图16)。在过度表达的7、8及11号愈伤组织系中IbLEA14蛋白质显示出了强的表达。因此，通过所述结果确认了成功制造出了IbLEA14基因过度表达或表达受抑制的形质转换红薯愈伤组织。

实施例6：IbLEA14形质转换愈伤组织的关于干燥及盐胁迫的抗逆性分析

为了确认形质转换愈伤组织的关于干燥及盐胁迫的抗逆性变化，对红薯愈伤组织进行PEG(polyethylene glycol)及NaCl处理后，通过脂质过氧化的定量分析调查了其损伤程度(图17)。将培养了2周的形质转换愈伤组织在30％PEG及添加有300mM NaCl的MS固体培养基中处理了72小时，脂质过氧化的定量分析用了TBA(thiobarbituric acid)方法(Peever and Higgins，Plant Physiol 90，867-875，1989)。IbLEA14过度表达的愈伤组织系在PEG及NaCl处理群中比在RNAi线显示了低的脂质过氧化水准，关于干燥及盐胁迫显示了耐性。另一方面，RNAi线关于干燥及盐胁迫显示了缩水性增加。因此，可知道IbLEA14的表达与红薯愈伤组织中关于干燥及盐胁迫的抗逆性增加有关。

实施例7：IbLEA14形质转换愈伤组织中木质素定量分析及木质素生物合成基因的表达分析

为了在形质转换愈伤组织中确认木质素量的变化进行了木质素染色及定量分析(图18)。为了木质素染色，在1％间苯三酚(phloroglucinol)溶液中培养红薯愈伤组织16小时，并且在消毒水中洗涤后在50％HCl中培养(Mlickova et al.Plant Physiol Biochem 42，753-761，2004)。为木质素的定量分析使用了巯基醋酸(thioglycolic acid)方法(Hatfield and Fukushima，Crop Sci 45，832-839，2005)。IbLEA14过度表达的愈伤组织系中尤其是8号显示出高的木质素积累，RNAi线显示了与对照群愈伤组织类似的结果。木质素的定量分析结果，比起对照群7及8号过度表达线显示了高出1.9倍及3.3倍的木质素量。因此，确认了IbLEA14的过度表达在形质转换愈伤组织中增加木质素的量。

通过实时荧光定量PCR调查了IbLEA14形质转换愈伤组织中与木质素生物合成关联的单体木质素生物合成基因的表达变化(图19)。关于PAL基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-CCTTGCACGGTGGCAACTTC-3′；序列号9)及逆方向(5′-TTGGCAAAGCGCAACGAGAT-3′；序列号10)催化剂，关于C4H基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-ATCGAGTGGGGCATTGCAGA-3′；序列号11)及逆方向(5′-TTGGCGTCGTGGAGGTTCAT-3′；序列号12)催化剂，关于4CL基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-TATTTGAATGATCCGGCGGC-3′；序列号13)及逆方向(5′-ACAGCAGCATCTGCAATCATCG-3′；序列号14)催化剂，关于SAMS基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-AATTGTGCGGGACACTTGCC-3′；序列号15)及逆方向(5′-AGGGGTCTCATCGGTGGCAT-3′；序列号16)催化剂，关于COMT基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-CGACAGCCCGATGACAAACC-3′；序列号17)及逆方向(5′-GAATCCGGTCCAGCATGACG-3′；序列号18)催化剂，关于CCAOMT  基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-AAAGAAGGCCCAGCATTGCC-3′；序列号19)及逆方向(5′-TTCCTCATTGGAGCATCGGG-3′；序列号20)催化剂，关于CAD基因的特异性催化剂使用了正方向(5′-TGGTTGGGGAACCAATGCAC-3′；序列号21)及逆方向(5′-GCTTTTCGCCTTTTCCTGGG-3′；序列号22)催化剂。在IbLEA14过度表达的形质转换愈伤组织中与细胞质内的单体木质素生物合成关联的基因PAL、C4H、4CL、COMT、CCAOMT、SAMS及CAD的表达增加了，并且RNAi线显示出减少的倾向。因此，可知道红薯愈伤组织中由IbLEA14的过度表达引起的木质素合成的增加是通过单体木质素生物合成关联基因的表达调节来实现的。

Claims (14)

1.一种IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant14)蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由序列号2的氨基酸序列构成，并且与红薯的抗逆性或木质素合成相关。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的蛋白质。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由序列号1的碱基序列构成。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求2所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞由权利要求4所述的重组载体形质转换而来。

6.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，所述方法包括通过形质转换权利要求4所述的重组细胞来过度表达IbLEA14基因的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胁迫为干燥、低温、盐及化合物胁迫。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化合物为过氧化氢、甲基紫精、镉或铜。

9.一种抗压性形质转换植物体的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括：用权利要求4所述的重组载体形质转换生物细胞的步骤；以及

从所述形质转换的植物体中再分化植物的步骤。

10.一种增加植物的木质素生物合成的方法，其特征在于，所述方法包括通过使权利要求4所述的重组载体形质转换到植物细胞来过度表达IbLEA14基因的步骤。

11.一种增加了木质素生物合成的形质转换生物体的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括：用权利要求4所述的重组载体形质转换生物细胞的步骤；以及

从所述形质转换的植物细胞中再分化植物的步骤。

12.一种生物能，其特征在于，所述生物能从通过权利要求11所述的方法制造的木质素生物合成增加了的形质转换生物体中获得。

13.一种组成物，其特征在于，所述组成物包含权利要求2所述的基因，用于增加植物体的抗逆性。

14.一种组成物，其特征在于，所述组成物包含权利要求2所述的基因，用于增加植物体的生物合成。

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