KR101305277B1 - 애기장대 유래의 ｓｄａ1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 증가시키는 방법, 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 인 유용성을 증가시키는 방법, 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자의 발현을 조절하여 식물의 APase 활성을 조절하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 APase 활성이 조절되는 형질전환 식물체 및 식물 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 바이오매스 또는 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

애기장대 유래의 ＳＤＡ1 유전자 및 이의 용도{SDA1 gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof}
본 발명은 애기장대 유래의 SDA1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 증가시키는 방법, 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 인 유용성을 증가시키는 방법, 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자의 발현을 조절하여 식물의 APase 활성을 조절하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 APase 활성이 조절되는 형질전환 식물체 및 식물 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 바이오매스 또는 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
모든 살아있는 유기체에 필수 다량영양소(macronutrient)로 역할을 하는 인(P)은 생화학적 및 생리학적 과정의 조절에 관여하는 많은 중요 생물학적 화합물의 구성요소 중 하나이다. 식물은 뿌리에 있는 인산 트랜스포터(Pi transporter)를 통해 인산 (Pi) 음이온으로서 인을 획득할 수 있다. 그러나, Pi는 토양에서의 부동화(immobilization) 때문에 식물 생장 및 작물 생산성에 대해 가장 제한적인 영양소 중 하나이다 (Sanchez-Calderon et al, 2005, Plant Cell Physiol 46: 174-184). 식물 뿌리에서의 Pi 결핍에 반응하는 주요 적응 과정은 뿌리 시스템 발달, Pi 가동화(mobilization) 및 수송과 같은 Pi 대사의 변화를 포함한다 (Fang et al, 2009, Plant Sci 176: 170-180). 벼, 밀, 토마토 및 애기장대를 포함하는 많은 식물은 뿌리에서 분비되는 APase (acid phosphatase)의 활성 증가와 함께 외인성 Pi의 결핍에 반응하는 것으로 알려졌는데, 이로 인해 Pi 획득에 대한 능력을 증진시킨다 (Coello, 2002, Physiol Plant 116: 293-298). 식물에서 Pi 유용성을 모니터링하고 영양 신호를 전달하는 분자 메커니즘은 여전히 불분명하고, Pi를 감지하는 기관 또는 조직조차도 아직 논란 중에 있다 (Fang et al, 2009, Plant Sci 176: 170-180). 따라서, Pi 제한에 대한 식물의 반응을 조절하는 신호전달 네트워크를 확인하고자 하는 노력이 필요하다.
T-DNA 활성화 표지 돌연변이 유발 (activation-tagging mutagenesis)은 기능 손실(loss-of-functional) 돌연변이 유발의 한계를 해결할 수 있는 기능 획득(gain-of-functional) 유전학적 방법이다 (Weigel et al., 2000, Plant Physiol 122:1003-1014). 테트라머릭(tetrameric) CaMV 35S 인핸서(enhancer)를 포함하는 T-DNA 활성화 벡터는 식물 게놈에 삽입된 후, 인근 유전자의 전사 활성화를 매개한다. 그러나, 상기 벡터를 사용한 형질전환에 의해 획득된 돌연변이의 빈도는 놀랍게도 예상치 보다 훨씬 더 낮은 약 0.1 ~ 1%에 불과한 것으로 알려져 있다 (Marsch-Martinez et al, 2002, Plant Physiol 129:1544-1556). 인핸서 요소 (element)의 메틸화(methylation) 및 이은 전사 침묵(silencing)은 기능 획득 돌연변이의 낮은 빈도에 대한 타당성 있는 이유인 것으로 사료된다 (Chalfun-Junior et al. 2003, FEBS Lett 555: 459-463).
본 발명자들은 애기장대 활성화-표지된 집단의 스크리닝에 기초하여, P 결핍에 반응하여 감소된 뿌리 APase 활성을 나타내는 lap3 (low acid phosphatase 3) 돌연변이체를 분리하고 규명하였다.
한국공개특허 제2010-0045654호에는 인산의 흡수에 관여하는 벼 유래 OsPAP1 유전자가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 활성화-표지된 애기장대 집단에서 낮은 APase 활성을 나타내는 돌연변이체를 스크리닝하고, 상기 돌연변이체에서 SDA1 유전자의 발현이 감소한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 인 유용성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자의 발현을 조절하여 식물의 APase 활성을 조절하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 APase 활성이 조절되는 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 바이오매스 또는 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 애기장대 유래 SDA1 유전자는 인산-결핍 조건하에 낮은 APase 활성을 나타내는 돌연변이체에서 그 발현이 감소하였다. 따라서 SDA1 유전자를 이용하면 인 결핍 환경에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 사료된다.
도 1은 lap3 돌연변이체의 유묘 표현형 및 APase 활성뿐만 아니라 BCIP의 화학적 구조를 나타낸다. 도 1a는 애기장대 뿌리에서 APase 활성의 색도(colorimetric) 분석을 위한 기질로서 BCIP의 화학적 구조를 나타낸다. 도 1b는 APase 돌연변이체 lap3의 표현형을 나타낸다. 야생형 및 lap3 식물은 발아된 다음, 감소된 Pi를 포함하는 MS 배지로 옮겨졌다. 7일 후, 뿌리의 APase 활성에 대한 조직화학적 염색법은 기질로서 BCIP를 이용하여 수행되었다. 스케일 바(scale bar)는 2 cm를 나타낸다. 도 1c는 APase 활성의 정량적 측정을 나타낸다. 유묘는 Pi-결핍 MS 배지에서 배양되었다. 총 단백질은 유묘의 뿌리에서 제조되었고 APase 활성은 기질로서 5 mM ρ-니트로페닐 인산을 이용하여 분광광도계로 측정되었다. 막대 그래프 위의 선은 3회 반복 실험에 대한 표준오차를 나타낸다.
도 2는 lap3 게놈 DNA로부터 회수된 플라스미드를 나타낸다. 도 2a는 lap3 게놈 DNA의 BamHI 제한 효소 분해에 의해 회수된 활성화-표지 플라스미드의 지도를 나타낸다. 흰색 및 검은색 화살표는 테트라머릭(tetrameric) CaMV 35S 인핸서 요인 및 회수된 식물 게놈 DNA를 각각 나타낸다. 도 2b는 상기 BamHI-회수된 플라스미드를 아가로스 겔에서 전기영동한 결과를 나타낸다. 상기 활성화-표지 벡터에서 2.9 kb 절편은 pUC19 부분에 해당한다. M: 마커(1kb plus DNA ladder), 레인 1: 절단되지 않은 플라스미드, 레인 2: BamHI 및 KpnI로 절단된 플라스미드.
도 3은 35S 인핸서에 인접한 유전자에서 발현되는 전사체의 수준을 나타낸다. 도 3a는 인핸서의 양쪽 측면으로부터 10 kb 영역에 위치하는 35S 인핸서에 인접한 유전자의 지도를 나타낸다. 도 3b는 야생형 및 lap3 식물에서 At4g31500, At4g31510, At4g31520, At4g31530, At4g31540, At4g31550, At4g31560 및 At4g31570를 포함하는 전사체의 반정량 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 유전자-특이적 프라이머는 전사체의 수준을 측정하기 위해 사용되었다. β-튜불린 (At5g62690) 유전자는 mRNA 정량 대조군으로서 사용되었다. 각 전사체의 RT-PCR 분석에 대한 사이클 횟수는 최적화하여 나타내었다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 SDA1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 T-DNA 활성화 표지 돌연변이 유발 (activation-tagging mutagenesis) 방법을 이용하여 인(P) 결핍 환경에 반응하여 뿌리 APase 활성이 감소된 lap3 (low acid phosphatase 3) 돌연변이체를 분리하였다. 플라스미드 회수를 통해 상기 lap3 돌연변이체 게놈 내에 활성화-표지 벡터의 위치를 확인하였고, 상기 활성화 표지에 의해 야기된 유전자 발현의 변화를 모니터링한 결과, 상기 돌연변이체에서 SDA1 유전자의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 이는 인(P) 결핍 환경에서 SDA1 유전자의 발현 감소가 뿌리 APase 활성 감소의 원인이라는 것을 나타낸다. 따라서, SDA1 유전자를 식물세포에 형질전환하여 그 발현을 조절하면 APase 활성을 증가시킬 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 SDA1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
SDA1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 APase 활성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 SDA1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 인(P) 결핍 환경에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체일 수 있다. 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 SDA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 인 유용성을 증가시키는 방법을 제공한다. SDA1 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 APase 활성이 증가할 수 있으며, APase 활성의 증가로 인해 인(P) 유용성이 증가할 수 있다.
또한, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 SDA1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 식물의 APase 활성이 감소된 애기장대 돌연변이체에서 SDA1 유전자의 발현이 감소하였으므로, SDA1 유전자의 발현을 조절함으로써 식물의 APase (acid phosphatase) 활성의 조절이 가능할 수 있다. 예를 들면, SDA1 유전자의 발현을 증가시키면 APase 활성이 증가할 수 있으며, 반대로 SDA1 유전자의 발현을 감소시키면 APase 활성이 감소할 수 있다.
또한, 본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 조절되는 형질전환 식물체를 제공한다. 전술한 바와 같이, SDA1 유전자의 발현을 조절함으로써 APase 활성이 조절되는 형질전환 식물체를 얻을 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 식물 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 바이오매스 또는 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 식물 유래 SDA1 유전자는 바람직하게는 애기장대 유래이나, 이에 제한되지 않고, 기타 다른 식물에 존재하면서 애기장대 유래의 SDA1 유전자와 동일한 기능을 수행하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 SDA1 유전자를 식물에서 과발현시키면 식물 내의 APase 활성이 증가하여 인 유용성이 증가하며, 이로 인해 식물의 바이오매스 또는 생산성이 증가할 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 식물 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 바이오매스 또는 생산성이 증가된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
돌연변이체 스크리닝
활성화-표지된 종자 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, United Kingdom)는 MS 배지에서 7일 동안 발아되었고, 감소된 Pi 농도 (10 μM)를 포함하는 MS 배지로 옮겨져서, 지속적인 광조건하에 추가적인 10일 동안 23℃에서 배양되었다. 그 후, 0.008% BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)가 애기장대 뿌리 유래 APase 활성의 색도(colorimetric) 분석을 위해 첨가되었다.
APase ( acid phosphatase ) 활성의 정량
야생형 및 돌연변이체의 애기장대 종자는 MS 배지에서 7일 동안 발아되었고, Pi-결핍 (10 μM) MS 배지로 옮겨져서 추가적인 10일 동안 배양되었다. 그 후, 총 단백질이 약간의 수정을 가한 Yen 등의 방법 (Yen et al., 1991, Plant Physiol 97: 1487-1493)에 따라 애기장대 뿌리로부터 추출되었다. 단백질 농도는 브래드포드법 (Bradford 1976, Anal Biochem 72: 248-254)에 따라 결정되었다. APase 활성은 이전에 기재된 바와 같이 기질로서 ρ-니트로페닐 인산 (ρ-nitrophenyl phosphate)을 사용하여 결정되었다 (Chen et al., 2000, Planta 211: 13-22). 상기 반응의 총 부피는 100 mM의 아세트산-NaOH (pH 5.5), 기질인 5 mM의 ρ-니트로페닐 인산, 및 적절한 양의 식물 단백질 (5 내지 10 ㎍)을 포함하여 0.06 mL이었다. 상기 반응은 37℃에서 인큐베이션한 후, 1 M Na2CO3의 첨가에 의해 종료되었고, 분광광도계로 분석되었다. APase 활성은 405 nm에서 ρ-니트로페닐에 대한 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)인 18.3 cm2/μmol을 사용하여 계산되었다.
플라스미드 회수 ( Plasmid rescue )
상기 돌연변이체 게놈 내에 활성화-표지 벡터의 위치를 확인하기 위해, 플라스미드 회수가 이전에 기재된 방법을 약간 수정하여 수행되었다 (Weigel et al. 2000, Plant Physiol 122:1003-1014). 1 ㎍의 게놈 DNA가 BamHI을 이용하여 밤새 절단되었고, 그 후 상기 효소는 65℃에서 15분 동안 불활성화되었다. 절단된 DNA는 자가-라이게이션되었고 대장균(Escherichia coli) DH10B 내로 형질전환되었다. pUC19 서열을 가지는 활성화-표지 벡터를 포함하는 상기 플라스미드는 상기 세균 형질전환체의 암피실린(ampicillin) 선택에 기초하여 획득되었고, 그 후 시퀀싱되었다.
반정량 RT - PCR
총 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 2주된 애기장대 유묘로부터 추출되었다. 2 단계 RT-PCR이 전사체의 수준을 검출하기 위해 사용되었다. 1 ㎍의 총 RNA가 High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용한 cDNA 합성을 위해 사용되었다. 10배 희석된 cDNA 2 ㎕가 PCR 증폭을 위해 사용되었다. 반정량 RT-PCR에 사용된 유전자 특이적 프라이머는 표 1에 나타내었다.
2단계 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머
유전자 좌 정방향 프라이머 (5'-3') 역방향 프라이머 (5'-3')
At4g31500 TCAACGGATGATGGACAAGA (서열번호 2) CCGGCACAACAATATCCAAT (서열번호 3)
At4g31510 TTTAGGGATCGTAGCAGCGT (서열번호 4) GCAACGGCATAGAATTAGGG (서열번호 5)
At4g31520 AAAAAGCAAGCAAAACTGCAA (서열번호 6) ACAGGAATAGCCTCCGGACT (서열번호 7)
At4g31530 TATCTTCGTCAATCACGCCA (서열번호 8) AAGGTTCATGATGCTCCAGG (서열번호 9)
At4g31540 GAAAGCGTATCCGGATCAAA (서열번호 10) ACTTGCTTGAACTCGCGTCT (서열번호 11)
At4g31550 CTAAACCAAGCATCTTCGGC (서열번호 12) TAGTAACCACGTGGGTGTGG (서열번호 13)
At4g31560 TGGCGAGACTTTTCGTCTCT (서열번호 14) TTTAGGCCGGTTACGTGTTC (서열번호 15)
At4g31570 TGTGAATGTTGCTGAGGAGG (서열번호 16) TCCTGCATTTCCCCTACATC (서열번호 17)
At5g62690 CTCAAGAGGTTCTCAGCAGT (서열번호 18) TCACCTTCTTCATCCGCAGT (서열번호 19)
실시예 1: 활성화- 표지된 집단으로부터 낮은 APases 활성을 나타내는 애기장대 돌연변이체의 분리
식물 뿌리는 Pi 결핍에 반응하여 APase를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Goldstein et al., 1989, Plant Mol Biol Rep 7: 7-16). 본 발명에서, 색도 분석법은 낮은 Pi 조건 (10 μM Pi)하에 뿌리의 낮은 APase 활성을 나타내는 애기장대 돌연변이체를 스크리닝하기 위해 수행되었다. APase 활성은 애기장대 유묘의 뿌리 주변에서 시각적으로 검출되었다. 즉, BCIP (도 1a)를 포함하는 낮은 Pi 배지에서 배양된 야생형 식물은 뿌리로부터 분비된 APase에 의한 BCIP의 분해 때문에 배지에서 강한 청색의 변화를 나타내었다 (도 1b).
11,199개의 독립적 표지 라인(line)을 나타내는 활성화-표지된 애기장대 집단의 33,597개 유묘의 스크리닝으로부터, Pi-결핍 조건하에서 야생형 식물에 비해 뿌리가 더 낮은 APase 활성을 나타내는 몇몇 돌연변이체가 획득되었고 lap (low acid phosphatase)로 명명되었다. 야생형 식물에 비해 더 낮은 APase 활성뿐만 아니라 더 작은 식물 크기 및 덜 발달된 뿌리 시스템을 나타내는, 가장 우성 음성적인(dominant negative) 돌연변이체 중 하나인 lap3 는 뿌리로부터 추출된 총 단백질 및 기질로서 ρ-니트로페닐 인산을 사용한 정량적 효소 분석에 기초하여 APase 활성에 대해 추가로 시험 되었다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, lap3 돌연변이체의 뿌리는 Pi-결핍 조건하에서 야생형 식물의 뿌리에 비해 19% 더 낮은 APase 활성을 나타내었다 (도 1c).
BCIP 염색 및 ρ-니트로페닐 인산을 사용한 정량적 효소 분석에 의해 나타난, 상기 lap3 돌연변이체 뿌리의 비정상적으로 낮은 APase 활성은 lap3 게놈에 활성화 표지의 삽입이 Pi-결핍 조건하에 뿌리에서 APase의 활성 감소를 야기한다는 분명한 증거이며, 상기 돌연변이체의 낮은 APase 활성이 또한 식물의 왜소증을 야기하였다.
실시예 2: 플라스미드 회수에 의한 lap3 게놈에서 활성화-표지 벡터 위치의 확인
플라스미드 회수 실험은 상기 lap3 게놈 내에 활성화 표지의 위치를 결정하기 위해 수행되었다. 시험된 다양한 제한 효소 중에서, 오직 BamHI을 이용한 lap3 게놈의 절단만이 플라스미드를 회수하는데 성공적이었다. 상기 회수된 플라스미드를 BamHI 및 KpnI을 이용하여 절단 후, 활성화-표지 벡터에 존재하는 pUC19 절편과 동일한 2.9 kb DNA 절편이 획득되었다 (도 2). 상기 회수된 플라스미드에서 T-DNA 플랭킹(flanking) 영역은 시퀀싱되었고, 상기 시퀀싱된 서열은 GenBank에 등록된 애기장대 게놈 DNA 서열과 비교되었다. 상기 활성화-표지 벡터 PSKI015는 At4g31540 및 At4g31550 유전자의 인터제닉(intergenic) 영역 내로 삽입된 것이 증명되었고, 이는 At4g31540의 개시 코돈에서 약 2.3 kb 업스트림(upstream) 및 At4g31550에서 약 7.4 kb 다운스트림(downstream)에 위치한다 (도 2).
실시예 3: lap3 돌연변이체의 낮은 APase 활성에 대한 원인이 되는 후보 유전자의 확인
lap3 식물에서 상기 활성화 표지에 의해 야기된 유전자 발현의 변화를 모니터링하기 위해, 본 발명자들은 T-DNA의 양쪽 (왼쪽(LB) 또는 오른쪽 경계(RB))으로부터 약 10 kb 영역에 위치하는 8개의 유전자에서 발현된 전사체의 수준을 조사하였다. At4g31500 (CYP83B1, cytochrome P450 monooxygenase 83B1), At4g31510 (기능이 밝혀지지 않음), At4g31520 (SDA1, Severe Depolymerization of Actin 1), At4g31530 (nucleoside-diphosphate-sugar epimerase), At4g31540 (exocyst subunit EXO70 family protein G1), At4g31550 (WRKY11), At4g31560 (기능이 밝혀지지 않음), 및 At4g31570 (기능이 밝혀지지 않음)을 포함하는 상기 유전자의 전사체 수준은 야생형 및 lap3 식물 사이에 비교되었다 (도 3a). 반정량 RT-PCR 분석은 전사체 수준의 비교를 위해 야생형 및 lap3 식물에서 추출된 총 RNA와 유전자-특이적 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 수행되었다. T-DNA 삽입 부위에 바로 인접한 At4g31540 및 At4g31550 유전자뿐만 아니라 β-튜불린 (At5g62690)를 포함하는 대부분의 전사체 수준은 야생형에 비해 거의 변화가 없었다 (도 3b). 그러나 흥미롭게도, lap3 식물은 35S 인핸서 요소에서 약 7.4 kb 거리에 위치하는 At4g31520(SDA1) 유전자의 전사체 수준에서 현저한 감소를 나타내었다. lap3 식물에서 상기 At4g31520 전사체의 감소 수준은 상기 35S 인핸서 표지를 통해 매개된 유전자 침묵 때문인 것으로 사료된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 쌍자엽 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 쌍자엽 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 증가된 형질전환 쌍자엽 식물체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제3항에 따른 쌍자엽 식물체의 종자.
  7. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 쌍자엽 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 쌍자엽 식물의 인 유용성을 증가시키는 방법.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 쌍자엽 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 쌍자엽 식물의 APase (acid phosphatase) 활성을 조절하는 방법.
  9. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 APase 활성이 조절된 형질전환 쌍자엽 식물체.
  10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물 유래 SDA1 (severe depolymerization of actin 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 쌍자엽 식물세포에 형질전환시켜 SDA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 쌍자엽 식물의 바이오매스 또는 생산성을 증가시키는 방법.
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KR20090052575A (ko) * 2007-11-21 2009-05-26 동아대학교 산학협력단 인산결핍조건에서 발현되는 탈인산화효소유전자(ＯｓＰＡＰ2) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체
KR100925798B1 (ko) 2008-05-30 2009-11-11 동아대학교 산학협력단 인산 흡수력이 증강된 벼 형질전환체 및 그의 제조 방법

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