KR101325044B1 - 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 ｍｉＲ399d 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 ｍｉＲ399d 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 애기장대 유래 miR399 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 애기장대 유래 miR399 유전자를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 ｍｉＲ399d 유전자 및 이의 용도{miR399d gene increasing drought stress tolerance of plant and uses thereof}
본 발명은 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 miR399 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 애기장대 유래 miR399 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 애기장대 유래 miR399 유전자를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.
앱시스산(ABA, abscisic acid)은 종자 휴면, 유묘 생장 및 엽수분 관계를 포함하는 다양한 식물 프로세스를 조절하는 주요 식물 호르몬이다. 영양생장기(vegetative phase) 동안, 앱시스산은 건조, 염 및 저온과 같은 비생물적 스트레스에 대한 적응 반응에서 중심적인 역할을 한다(Chinnusamy et al., 2008, J. Integr. Plant Biol. 50, 1187-1195). 식물은 고착성이므로, 바람직하지 않은 환경에 의해 야기되는 스트레스를 피할 수 없다. 식물은 다양한 생물적 및 비생물적 스트레스 조건에 지속적으로 노출된다. 식물은 이러한 스트레스 조건에 대처하기 위해 다른 조절 메커니즘을 발달시켰다. 유전자 조절 메커니즘 중 하나는 소형 RNA(small RNA)에 의한 전사후(post-transcriptional) 조절이다. 소형 RNA는 2개의 주요 클래스인 miRNA(microRNA) 및 siRNA(short-interfering RNA)로 분류될 수 있다. miRNA는 크기가 약 21 내지 24 뉴클레오티드이고, 절단(cleavage) 또는 번역 억제를 위해 mRNA를 타겟팅(targeting)함으로써 식물에서 중요한 조절 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Mendu, 2008, Kentucky Univ., Ph.D Thesis). 식물에서, miRNA 유전자는 RNA 중합효소(polymerase) II에 의해 전사된다. 성숙 miRNA는 단일 가닥의 초기 전사체인 pri-miRNA(primary miRNA)에 위치한다. 상기 pri-miRNA는 약 500 뉴클레오티드 길이의 불완전한 스템-루프(stem-loop) 2차 구조를 형성하고, RNase III-유사 효소인 DCL1(Dicer-like 1)과 이와 연관된 RNA 결합 보조인자(cofactor)인 HYL1(dsRNA binding protein) 및 SE(C2H2-type zinc finger protein)에 의해 처리되어 더 짧은 스템-루프 전구체 전사체인 pre-miRNA(precursor miRNA) 및 miRNA/miRNA* 이중체(duplex)를 순차적으로 생성한다. 상기 성숙 miRNA는 RISC(RNA induced silencing complex)에 포함되고, miRNA*는 분해된다. RISC는 포함된 성숙 miRNA에 의해 mRNA로 인도되어, 표적 mRNA의 miRNA-매개 절단 또는 번역 억제를 가능케 한다(Zhu, 2008, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105, 9851-9852).
몇몇 miRNA는 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 식물 반응에서 중대한 역할을 한다. 산화 스트레스에 대한 반응에서, miR398는 ROS(reactive oxygen species) 신호전달과 관련되어 있는 CSD1(Cu/Zn-superoxide dismutase 1) 및 CSD2 유전자의 억제를 풀어주기 위해 전사적으로 하향조절된다(Covarrubias and Reyes, 2010, Plant Cell Environ. 33, 481-489). miR159는 앱시스산에 의해 유도되며 2가지 MYB 인자의 전사 수준을 제어하여 종자의 발아를 조절한다(Reyes and Chua, 2007, Plant J. 49, 592-606). miR169g는 건조 스트레스에 대한 반응에서 DREB(dehydration responsive element-binding) 전사 인자에 의해 상향조절된다(Li et al., 2010, Plant Sci. 178, 271-280). miR160 및 miR393은 옥신(auxin) 신호전달 경로를 조절한다(Shukla et al., 2008, Biochim. Biophys. Acta, Gene Regul. Mech. 1779, 743-748). 게다가, miRNA는 식물 조직 및 기관 발생을 조절한다(Poethig, 2009, Curr. Opin. Genetics Dev. 19, 374-378). 예를 들면, miR172는 AP2 전사 인자를 코딩하는 전사체를 타겟팅함으로써 개화 시간 및 꽃의 발달을 조절하고(Lee et al., 2010, Nucleic Acids Res. 38, 3081-3093), miR166는 도관 세포 분화를 조절한다(Jung and Park, 2007, Planta 225, 1327-1338). 식물의 영양 항상성을 위해서, miR395는 황 결핍에 의해 상향조절된다(Kawashima et al., 2009, Plant J. 57, 313-321). miR399는 포스페이트(phosphate) 결핍에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 식물에서의 포스페이트 항상성 조절을 위한 장거리 신호로서의 역할을 한다(Branscheid et al., 2010, Mol. Plant Microbe Interact. 23, 915-926). 6가지 miR399는 신초에서 뿌리까지의 포스페이트의 재구동화(remobilization)를 조절하며(Lin et al., 2008, Plant Physiol. 147, 732-746), 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 PHO2 전사체의 5' UTR(untranslated region)을 일반적으로 절단한다(도 1)(Allen et al., 2005, Cell 121, 207-221).
본 발명자들의 마이크로어레이 연구(비공개)는 애기장대에서 miR399의 발현이 앱시스산- 및 건조-유도성 AP2/ERF(apetala 2/ethylene responsive factor)형 전사 인자인 AIA(ABA inducible AP2/ERF transcription factor)와 앱시스산-매개 반응에서의 양성(positive) 조절자에 의해 조절될 수도 있다는 것을 제안하였다. 상기 연구에서, AIA-매개 앱시스산 신호전달에서 miR399의 기능을 결정하기 위해 발아, 뿌리 생장 및 건조 내성 시험이 miR399-과발현 형질전환 식물을 이용하여 수행되었다. AIA-과발현 형질전환 식물 및 aia 돌연변이체는 상기 시험을 위한 대조군 식물로 사용되었다. AIA-과발현체와 유사하게도, 상기 miR399-과발현체는 앱시스산으로 처리시 종자 발아의 감소, 기공 개도(stomatal aperture)의 감소, 증산율의 감소, 그리고 건조 스트레스에 대한 반응에서 야생형 식물에 비해 생존 증가를 나타내었다. 상기 결과들은 miR399가 AIA-매개 앱시스산 반응의 신호전달에 관여한다는 것을 나타낸다.
한국공개특허 제2011-0064993호에는 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 고추 유래 CaBI-1 유전자가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2010-0007772호에는 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 감자 유래 StMyb 유전자가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 이용하여 형질전환시킨 애기장대에서 건조 스트레스에 대한 내성이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 miR399 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 miR399 유전자를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 이용하면 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물체를 제조할 수 있으므로, 작물의 생산량 증대 및 식량 수요의 충족에 유용할 것으로 사료된다.
도 1은 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 miR399s의 구조, 서열 및 표적 부위(target site)를 나타낸 것이다. 도 1A는 miR399 전구체 전사체의 추정 헤어핀 2차 구조(http://asrp.cgrb.oregonstate.edu/)를 나타낸 것이다. 녹색 및 적색 서열은 전구체 전사체의 가공 후, 성숙 miR399 및 이의 안티센스 서열에 대한 영역을 각각 나타낸다. 도 1B는 6가지 성숙 miR399의 서열을 나타낸 것이다. 도 1C는 PHO2 (At2g33770) 전사체의 5' UTR(untranslated region)에서 miR399의 표적 부위(적색)를 나타낸 것이다(Allen et al., 2005, Cell 121, 207-221).
도 2는 2주 된 애기장대 식물에서 miR399 전구체 전사체의 수준을 전사체-특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다. β-튜불린(tubulin)은 각 레인(lane)에서 동일한 양의 RNA 로딩을 확인하기 위한 대조군으로 사용되었다.
도 3은 100 μM 앱시스산(A) 또는 건조 스트레스(B)로 처리한 후, 2주 된 애기장대 식물에서 성숙 miR399d 전사체의 축적 증가를 보여주는 노던 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다. miR399d-특이적 안티센스 RNA 유도체(LNA, locked nucleic acid)는 프로브로 이용되었다. 각 레인에서의 동일한 양의 RNA 로딩은 에티디움 브로마이드로 염색한 겔 상에서 rRNA를 시각화함으로써 확인되었다.
도 4는 야생형 식물, AIA-과발현체 및 aia 돌연변이체에서 성숙 miR399d 전사체의 상대적인 수준(A)과 100 μM 앱시스산으로 처리한 후, AIA-과발현체에서 miR399d의 축적 증가(B)를 보여주는 노던 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다. 2주 된 식물이 실험에 이용되었고, miR399d-특이적 안티센스 LNA는 프로브로 이용되었다. 각 레인에서의 동일한 양의 RNA 로딩은 에티디움 브로마이드로 염색한 겔에서 rRNA를 시각화하여 확인되었다.
도 5는 100 μM 앱시스산(A) 또는 건조 스트레스(B) 처리 후, 2주 된 애기장대 식물에서 PHO2 전사체의 축적 감소를 보여주는 노던 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다. PHO2-특이적 DNA는 프로브로 이용되었다. 각 레인에서의 동일한 양의 RNA 로딩은 에티디움 브로마이드로 염색한 겔에서 rRNA를 시각화하여 확인되었다.
도 6은 100 μM 앱시스산의 부재 또는 존재 하에 야생형, AIA-과발현체 및 aia 돌연변이에서 PHO2 전사체의 수준을 보여주는 노던 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다. 2주 된 식물이 실험에 이용되었고, PHO2-특이적 DNA는 프로브로 이용되었다. 각 레인에서의 동일한 양의 RNA 로딩은 에티디움 브로마이드로 염색한 겔에서 rRNA를 시각화하여 확인되었다.
도 7은 miR399c-(A) 또는 miR399d-과발현(35S::miR399) 형질전환 식물(B)의 3가지 독립적인 라인에서 성숙 miR399 전사체의 과발현을 보여주는 노던 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다. 2주 된 식물이 실험에 이용되었고, miR399c- 또는 miR399d-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 DNA는 프로브로 이용되었다. 각 레인에서의 동일한 양의 RNA 로딩은 에티디움 브로마이드로 염색한 겔에서 rRNA를 시각화하여 확인되었다. WT: 야생형 식물.
도 8은 miR399c- 또는 miR399d-과발현체(35S::miR399)의 3가지 독립적인 라인에서 PHO2의 발현 억제를 보여주는 노던 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다. 2주 된 식물이 실험에 이용되었고, PHO2-특이적 DNA는 프로브로 이용되었다. 각 레인에서의 동일한 양의 RNA 로딩은 에티디움 브로마이드로 염색한 겔에서 rRNA를 시각화하여 확인되었다.
도 9는 miR399-과발현(35S::miR399), 야생형 및 AIA-과발현(35S::AIA) 형질전환 식물의 발아율에 대한 앱시스산 처리의 효과를 나타낸 것이다. 종자는 0(A) 또는 1 μM 앱시스산(B)을 포함하는 1/2×MS 배지에서 발아 및 생장되었다. 발아율은 표시된 시간(경과일)에 기록되었다. 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균±표준오차(n = 8) 이다. *P < 0.05에서 야생형과 유의차가 있음. **P < 0.01에서 야생형과 유의차가 있음. WT: 야생형 식물.
도 10은 miR399-과발현(35S::miR399), 야생형(WT) 및 AIA-과발현(35S::AIA) 형질전환 식물의 뿌리 신장에 대한 앱시스산 처리의 효과를 나타낸 것이다. miR399c- 또는 miR399d-과발현체의 3개의 독립적인 라인이 실험에 이용되었다. 종자는 앱시스산-무첨가 1/2×MS 배지에서 발아되었고, 그 후 0 또는 1 μM 앱시스산을 포함하는 배지로 이동되었다. 사진은 이동 7일째에 촬영되었다. A: miR399c-과발현체(앱시스산 무첨가), B: miR399c-과발현체(1 μM 앱시스산 처리), C: miR399d-과발현체(앱시스산 무첨가), D: miR399d-과발현체(1 μM 앱시스산 처리).
도 11은 miR399-과발현(35S::miR399), 야생형(WT), 및 AIA-과발현(35S::AIA) 형질전환 식물의 기공개도를 나타낸 것이다. 4주 된 식물 유래의 로제트 잎은 분석 완충액(assay buffer)에 띄워졌고, 0 또는 10 μM 앱시스산으로 2시간 동안 처리되었다. 기공개도(기공 너비)는 현미경으로 측정되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±표준편차(n = 30) 이다. **P < 0.01에서 야생형과 유의차가 있음.
도 12는 miR399-과발현(35S::miR399), 야생형(WT), 및 AIA-과발현(35S::AIA) 형질전환 식물의 증산율을 나타낸 것이다. 수분 손실은 개방형 무게측정 디쉬(open weighing dish) 위에 4주 된 개별 식물로부터 획득한 로제트 잎의 배축면을 위치시킨 후 실험실 벤치에서 건조시킨 다음, 정해진 시간 간격으로 측정되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±표준편차 이다. *P < 0.05에서 야생형과 유의차가 있음. **P < 0.01에서 야생형과 유의차가 있음.
도 13은 miR399-과발현, 야생형, 및 AIA-과발현 형질전환 식물의 건조 스트레스 반응을 나타낸 것이다. 4주 동안 토양에서 생장시킨 애기장대 식물은 13일 동안 물이 공급되지 않았고(A), 그 후 4일 동안 다시 물이 공급되었다(B). a: 야생형, b: 35S::AIA, c: 35S::miR399c #21, d: 35S::miR399c #28, e: 35S::miR399d #9, f: 35S::miR399d #15.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 miR399 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 miR399 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 miR399c 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 miR399d 유전자일 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 miR399 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
miR399 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜메파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 miR399 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 miR399c 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 miR399d 유전자일 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, miR399 유전자는 전술한 바와 같다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다.
상기 쌍자엽 식물은 십자화과(겨자과, Cruciferae), 콩과(Leguminosae), 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399(microRNA 399) 유전자를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 miR399 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 miR399c 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 miR399d 유전자일 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 miR399 유전자를 포함하며, 상기 miR399 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것이다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다. 상기 쌍자엽 식물은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
박테리아 균주, 벡터 및 배양 배지
본 발명에서 형질전환을 위해 사용된 박테리아 균주는 대장균(E. coli) DH10B 균주(F- mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)ρ80dlacZ ΔM15ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara , leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ-)였다. 대장균은 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 1% NaCl)에서 배양되었다. 고체 배지는 1.5%(w/v) 박토-한천(Bacto-agar)을 이용하여 제조되었다. 카나마이신과 같은 항생제를 포함하는 LB 배지를 대장균 형질전환체의 선별에 이용하였다. 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefacience) CS58C1 균주는 바이너리 벡터 pCAMBIA1301과 함께 형질전환에 이용되었다. 상기 형질전환된 아그로박테리움은 리팜피신(100 ㎍/ml), 겐타마이신(50 ㎍/ml) 및 카나마이신(50 ㎍/ml)이 첨가된 YEP 배지(1% 박토 트립톤, 1% 효모 추출물 및 0.5% NaCl)에서 3일 동안 28℃의 조건으로 배양되었다.
식물 재료 및 처리
애기장대(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)(Col-0)는 본 발명에서 야생형 식물로 이용되었다. 식물 생장을 위해, 종자는 30% 블리치 용액(bleach solution) 및 80% 에탄올을 이용해 멸균되었고, 1% 수크로오스, 0.05% MES(2-morpholinoethanesulfonic acid)-KOH(pH 5.7) 및 파이토한천(phytoagar)(발아 및 비생물적 스트레스 처리용으로 0.6%; 뿌리 신장 시험용으로 1%)이 첨가된 1/2×MS 배지에 플레이팅되었다. 멸균된 종자는 종자 휴면을 깨우기 위해 4℃의 암실에서 4일 동안 층상으로 둔 다음, 장일 조건(16시간 명/8시간 암, 100 μ/Em2/s의 조도) 하 23℃의 생장 챔버로 옮겼다. 앱시스산 처리를 위해 1/2×MS 배지에서 생장시킨 2주된 애기장대 유묘는 100 μM 앱시스산으로 처리되었다. 탈수를 위해, 2주된 애기장대 유묘는 MS 배지 플레이트로부터 분리되었고, 페트리 디쉬(60% 상대 습도, 22℃ 및 약광) 내 여과지에 위치되었다(Jin et al., 2011, New Phytol. 190, 57-74). 상기 처리 후, 애기장대 유묘는 수확되었고 추가적인 분석을 위해 액체 질소에서 냉동시켰다.
효소, 화학물질, 키트 및 올리고뉴클레오티드
본 발명에서 모든 화학물질은 이용가능한 최고 품질의 것이 사용되었다. 2-단계 RT-PCR을 위한 제한효소, T4 DNA 연결효소(ligase) 및 랜덤 프라이머는 Promega(Madison, USA)로부터 구입하였고, RealTaq DNA 중합효소는 RBC(Banqiao, Taiwan)로부터 구입하였다. 앱시스산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였다. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(kinase)는 New England Biolabs (Hitchin, UK)에서 구입하였다. 1-단계 RT-PCR 키트는 Qiagen(Hilden, Germany)으로부터 구입하였다. 트리졸(Trizol) 시약은 Invitrogen(Carlsbad, USA)로부터 구입하였다. Hybond-N+ 나일론 멤브레인은 Amersham Bioscience(Buckinghamshire, UK)로부터 구입하였다. PCR 및 재조합 DNA 구축을 위한 모든 올리고뉴클레오티드는 Bioneer(Chungwon, South Korea)에서 합성되었다. miR399 노던 혼성화(Northern hybridization) 분석에 사용된 RNA-유래 LNA(locked nucleic acid) 프로브는 Exiqon(Vedbaek, Denmark)로부터 구입하였다(Varallyay et al., 2008, Nat. Protoc. 3, 190-196).
RT - PCR 분석
총 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 2주된 애기장대 유묘로부터 추출되었다. RT-PCR은 Superscript III reverse transcriptase kit(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 이용하여 수행되었다. 5 ㎍의 총 RNA가 역전사를 위한 주형으로 이용되었고, 그 후 1 ㎕의 cDNA가 각 miR399 전구체의 특이적 프라이머와 함께 PCR에 사용되었다. 2-단계 RT-PCR은 하기와 같이 수행되었다. cDNA 합성을 위해, 총 RNA는 65℃에서 5분 동안 변성되었고, 그 후 얼음에서 1분 동안 냉각되었다. 역전사는 50℃에서 60분간 수행되었고, 70℃에서 15분 동안 종결되었다. cDNA의 PCR 증폭을 위해, 상기 합성된 cDNA는 95℃에서 2분간 변성되었고, PCR 반응(94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 신장)의 35주기에 의해 증폭되었다. 최종 종결 반응은 72℃에서 7분간 수행되었다. β-튜불린(tubulin)은 정량적 대조 반응을 위해 이용되었다.
노던 혼성화 분석
노던 혼성화 분석을 위해, 총 RNA는 McCarty(1986, Coop. News Lett. 60, 61)의 방법에 따라 RNA 분리 완충액(200 mM Tris-HCl(pH 8.5), 20 mM EDTA, 300 mM NaCl 및 1% SDS) 및 페놀/클로로포름을 이용하여 MS 배지에서 생장시킨 2주된 애기장대 식물로부터 분리되었다. 10~15 ㎍의 총 RNA는 RNA 로딩 완충액(50% 포름아미드, 1×MOPS(3-morpholinopropanesulfonic acid) 및 16% 포름알데히드)과 혼합되었고, 65℃에서 5분 동안 인큐베이션된 다음, 얼음에서 2분간 냉각되었다. 상기 혼합물은 1.07%(v/v) 포름알데히드/아가로스 겔 상에서 전기영동하여 분리되었고, Hybond-N+ 나일론 멤브레인 상에 블로팅(blotting)되었다. 혼성화는 PHO2를 위한 [α-32P] dCTP-표지 DNA 프로브를 첨가하여 수행되었다.
miRNA의 노던 혼성화 분석을 위해, 총 RNA는 Varallyay 등(2008, Nat. Protoc. 3, 190-196)의 방법에 따라 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 이용하여 MS 배지에서 생장시킨 2주 된 식물로부터 추출되었다. 20~40 ㎍의 총 RNA는 RNA 로딩 완충액(90% 포름아미드 및 10 mM EDTA)과 혼합되었고, 65℃에서 10~20분 동안 인큐베이션된 다음, 얼음에서 2분 동안 냉각되었다. 상기 혼합물은 15% 폴리아크릴아미드(19:1) 겔 상에서 전기영동하여 분리되었고, Hybond-N+ 나일론 멤브레인 상에 블로팅되었다. 혼성화는 PerfectHybTM Plus Hybridization buffer(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 이용하여 수행되었다. [γ-32P] dATP-표지 올리고뉴클레오티드 또는 LNA 프로브는 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(NEB, Hitchin, UK)를 이용하여 제조되었다. 블로팅된 RNA의 에티디움 브로마이드 염색은 로딩 대조군으로 이용되었다. 방사능(radioactivity)은 방사능 사진촬영(autoradiography)으로 검출되었다. 노던 혼성화 분석에 사용한 프로브는 표 1에 나타내었다.
Figure 112013012837469-pat00001
35S:: miR399 재조합 플라스미드의 구축
게놈 DNA 추출은 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)로부터 제공되는 프로토콜에 따라 수행되었다. 식물 재료(약 50 mg)는 액체 질소를 이용해 잘 분쇄되었다. 상기 분쇄된 샘플은 DNA 추출 완충액(0.2 M Tris-HCl(pH 9.0), 0.4 M LiCl, 25 mM EDTA 및 1% SDS)과 혼합되었고, 55℃에서 10분간 인큐베이션되었다. 세포 찌꺼기(debris)는 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛으로 만들어졌다. 그 후, 상등액은 새로운 튜브로 옮겨졌고, 동일한 부피의 이소프로판올과 혼합되었다. 상기 혼합물을 거꾸로 뒤집어서 살짝 섞은 다음에 4℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상기 상등액은 제거되었고, DNA 펠렛은 100 ㎕의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1 mM EDTA)에 재현탁되었다. miR399s를 포함하는 DNA 절편은 주형인 애기장대 게놈 DNA 및 miR399a-miR399f 전구체-특이적 프라이머를 각각 이용하여 PCR로 증폭되었다. 상기 PCR 반응의 전체 단계는 하기와 같다: 95℃에서 5분간의 초기 변성, PCR 반응(94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 30초간 증폭)의 35주기, 그리고 72℃에서 10분간 최종 증폭. 상기 PCR 산물은 NcoⅠ 및 BstEⅡ로 절단되었고, T4 DNA 연결효소(Promega, Madison, USA)를 사용함으로써 NcoⅠ 및 BstEⅡ로 절단된 pCAMBIA1301 벡터에 재조합되었다.
열충격(heat-shock)에 의한 대장균의 형질전환
먼저, 대장균 DH10B 균주(컴피턴트 세포)는 하기 과정에 따라 제조되었다. 밤새 배양한 저장액(stock) 500 ㎕는 500 ml의 LB 배지에 옮겨졌고, OD600가 약 0.4~0.6이 될 때까지 37℃에서 진탕배양되었다. 그 후, 상기 배양된 세포는 얼음에서 20분간 유지되었고 4℃, 4,000×g에서 15분 동안 원심분리되었다. 상기 펠렛은 빙냉(ice-cold) 10% 글리세롤 50 ml에 재현탁되었고, 그 후 또 다른 빙냉 10% 글리세롤 50 ml과 혼합되었다. 상기 혼합물은 4℃, 4,000×g에서 15분간 원심분리되었다. 상기 재현탁 및 원심분리가 1회 더 반복되었다. 상기 펠렛은 빙냉 10% 글리세롤 0.7 ml에 재현탁되었다. 최종적으로, 상기 DH10B 컴피턴트 세포는 튜브에 50 ㎕ 씩 나뉘어졌고, -70℃에서 저장되었다. 상기 언급된 라이게이션(ligation) 산물은 1.5 mL 멸균 튜브 내 컴피턴트 세포 50 ㎕와 혼합되었고, 얼음에서 30분간 유지되었다. 다음으로, 상기 세포는 42℃에서 90초간 가열되었고, 그 후 즉시 얼음에서 2분간 냉각되었다. 항생제가 없는 LB 배지 1 ml가 첨가되었고, 상기 혼합물 내 형질전환된 세포는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 되었다. 그 후, 상기 세포는 카나마이신(50 ㎍/ml)을 포함하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅되었고, 콜로니 선별을 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션 되었다.
애기장대로 아그로박테리움-매개 형질전환
한천 플레이트 상의 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) CS58C1의 단일 콜로니는 리팜피신(100 ㎍/ml), 겐타마이신(50 ㎍/ml) 및 카나마이신(50 ㎍/ml)과 같은 항생제를 포함하는 YEP 배지 5 ml에 접종되었고, 28℃에서 밤새 진탕배양되었다. 상기 밤새 배양한 저장액 1 ml은 항생제를 포함하는 YEP 배지 500 ml에 계대배양되었고, OD600가 2.0를 초과할 때까지 진탕배양되었다. 상기 배양된 세포는 원심분리되었고, 침윤(infiltraion) 배지(0.22% MS 기본 염, 5% 수크로오스, 0.05% MES-KOH(pH 5.7), 0.044 μM BA(6-benzylaminopurine) 및 50~200 ㎕의 Silwet L-77) 500 ml에 재현탁되었다.
4~5주 된 애기장대 식물은 침지법(floral dip method)에 따라 형질전환되었다(Clough and Bent, 1998, Plant J. 16, 735-743). 식물 화분은 침윤 배지에 푹 잠기도록 뒤집어 놓아졌다. 하기의 단계가 3~4회 반복되었다: 10초 동안 침잠시킨 후, 10초 동안 배지에서 꺼내 둠. 간단한 배수 후, 트레이 위의 식물 화분은 습도를 유지시키기 위해 플라스틱 랩으로 덮어졌고, 생장 챔버로 다시 옮겨졌다. 형질전환체들은 하이그로마이신(30 ㎍/ml) 을 함유하는 MS 배지에서 선별되었다.
발아 시험
발아 검정을 위해, 야생형, AIA - 또는 miR399-과발현 형질전환 식물의 멸균된 종자 약 50개가 1 μM의 앱시스산을 첨가 또는 첨가하지 않은, 0.6% 파이토한천을 포함하는 1/2×MS 배지 상에 파종되었다. 암 조건 하에 4일간 4℃에서 층화(stratification)시킨 후, 상기 플레이트는 장일 조건(16시간 명/8시간 암) 하에 23℃에서 배양되었다. 상기 종자의 어린 뿌리(radicle) 길이가 0.5 mm 이상 되었을 때, 종자가 발아된 것으로 간주되었다. 실험은 4회 반복하여 수행되었다.
뿌리 신장 시험( Root elongation test )
뿌리 신장 분석을 위해, 멸균된 종자는 1/2×MS 배지에 파종되었고 암 조건 하에 4일간 4℃에서 춘화처리(vernalization) 되었다. 종자는 40시간 동안 앱시스산-무첨가 배지에서 발아되었고, 그 후 발아된 종자는 0 또는 1 μM의 앱시스산이 첨가된 1% 파이토한천을 포함하는 MS 플레이트에 옮겨졌다. 실험은 2회 반복하여 수행되었다.
기공개도( Stomatal aperture ) 측정
기공개도 측정을 위해, 기공은 앱시스산 처리 전에 완전히 개방되었다. 토양에서 생장시킨 식물의 4주 된 로제트(rosettte) 잎이 분리되었고, 분석 완충액(10 mM MES-KOH(pH 6.1), 30 mM KCl 및 1 mM CaCl2) 상에 배축면을 아래로 향하게 하여 띄운 다음, 다른 농도의 앱시스산으로 처리되었다. 배축 상피편(epidermal strip)이 즉시 분리되었고, 기공개도(기공 너비)는 CCD 카메라가 장치된 PersonalDV imaging system(Applied Precision, Washington, USA) 현미경을 이용하여 측정되었다. 각 식물 라인 당 30개의 기공 개도가 측정되었다. 실험은 3회 반복하여 수행되었다.
증산율 측정
증산율(수분 손실) 측정을 위해, 각 식물 라인으로부터 분리된 5~6개의 로제트 잎은 개방형 무게측정 디쉬(open weighing dish) 상에 배축면이 위로 향하게 위치되었고, 실험실 벤치에서 건조되었다. 잎들은 여러 시간 간격으로 무게가 측정되었고, 생체중(fresh weight) 손실(%)은 수분 손실을 나타내기 위해 사용되었다. 실험은 3회 반복하여 수행되었다.
건조 스트레스 내성 시험
건조 스트레스 처리를 위해, 토양에서 생장시킨 4주 된 애기장대 식물의 관개가 13일 동안 정지되었다. 그 후, 상기 식물은 4일 동안 다시 물이 공급되었다. 각 식물 라인 당 총 40~45개의 식물이 시험되었다.
실시예 1: RT - PCR 에 의한 애기장대( Arabidopsis thaliana )에서 miR399s 의 전사 수준 비교
애기장대 야생형 식물(Col-0)의 유묘에서 6개의 miR399 유전자(miR399a-f)의 발현 수준을 조사하기 위해, RT-PCR 분석이 2주 된 애기장대로부터 분리한 총 RNA 및 miR399 전사체-특이적 프라이머를 이용하여 수행되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, miR399 전구체에 대한 전사체는 다르게 축적되었다. 특히, miR399c 및 miR399d 전구체는 가장 많이 축적되었다.
실시예 2: 앱시스산 및 건조 스트레스에 대한 반응에서의 miR399 의 발현
앱시스산 처리 또는 건조 스트레스에 대한 반응에서 애기장대 식물의 miR399d 발현을 조사하기 위해, 노던 혼성화 분석이 수행되었다. 상기 목적을 위해, 1/2×MS 배지에서 생장시킨 2주 된 애기장대 유묘는 100 μM 앱시스산 또는 건조 스트레스로 처리되었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 성숙 miR399d 전사체의 수준은 앱시스산 처리 또는 건조 스트레스에 의해 점차 증가하였다. 그러나, 식물을 증류수로 처리했을 때, 상기 전사체의 수준은 변화가 없었다(데이터 미제시). 상기 결과는 miR399의 발현이 앱시스산 및 건조 스트레스에 의해 유도된다는 것을 나타낸다.
실시예 3: AIA 에 대한 반응에서 miR399 의 발현
야생형, AIA-과발현 형질전환 식물 및 aia 돌연변이체에서 miR399d의 발현 수준을 비교하기 위해, 노던 혼성화 분석이 1/2×MS 배지에서 생장시킨 2주 된 식물로부터 추출한 총 RNA를 이용하여 수행되었다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 야생형에서 성숙 miR399d 전사체의 수준은 AIA-과발현 식물에 비해 더 낮으며, aia 돌연변이체에 비해서는 더 높다.
앱시스산에 대한 반응에서 AIA-과발현 형질전환 식물에서의 miR399d 발현을 조사하기 위해, 1/2×MS 배지에서 생장시킨 2주 된 AIA-과발현 유묘는 일정시간(0, 0.5, 2, 6, 10 및 24 시간) 동안 100 μM 앱시스산으로 처리되었다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, AIA-과발현 식물에서 miR399d 전사체의 수준은 앱시스산 처리에 의해 점차적으로 증가하였다. 종합해보면, 상기 결과는 miR399의 발현이 AIA에 의해 유도되며, 더 나아가 앱시스산에 의해 조절된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 앱시스산 및 건조 스트레스에 대한 반응에서의 PHO2 의 발현
앱시스산 처리 또는 건조 스트레스에 대한 반응에서 miR399의 표적 전사체인 PHO2 mRNA의 축적에서의 변화를 조사하기 위해, 노던 혼성화 분석이 수행되었다. 상기 목적을 위해, 1/2×MS 배지에서 생장시킨 2주 된 애기장대 유묘는 100 μM 앱시스산 또는 건조 스트레스로 처리되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, PHO2 전사체의 수준은 앱시스산 처리 또는 건조 스트레스에 의해 점차적으로 감소되었다(도 5).
실시예 5: AIA 에 대한 반응에서의 PHO2 의 발현
앱시스산의 부재 또는 존재 하에서 야생형, AIA-과발현 형질전환 식물 및 aia 돌연변이체에서의 PHO2 전사체 수준을 비교하기 위해, 노던 혼성화 분석이 수행되었다. 상기 목적을 위해, 1/2×MS 배지에서 생장시킨 2주 된 야생형, AIA-과발현 및 aia 돌연변이체 유묘는 100 μM 앱시스산으로 6시간 동안 처리 또는 무처리되었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 야생형 식물에서 PHO2 전사체의 수준은 AIA-과발현체에 비해 더 높은 반면, aia 돌연변이체에 비해서는 더 낮았다(도 6). PHO2 전사체의 수준은 100 μM 앱시스산으로 처리한 모든 식물에서 감소되었다. 상기 결과는 PHO2의 발현이 AIA에 의해 억제되었으며, 더 나아가 앱시스산에 의해 음성(negatively) 조절되었다는 것을 나타낸다.
실시예 6: miR399 -과발현 형질전환 식물의 생산
miR399의 생물학적 기능을 더 이해하기 위해, miR399c 또는 miR399d를 과발현하는 형질전환 식물이 CaMV 35S 프로모터와 융합된 miR399c 또는 miR399d에 대한 전구체 DNA를 포함하는 pCAMBIA1301를 이용하여 구축되었다. 상기 재조합 플라스미드는 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 애기장대 식물체로 옮겨졌다. 하이그로마이신 저항성의 분리 비율을 기초로 하여, miR399c- 또는 miR399d-과발현 동형접합성 형질전환체(T4 세대)가 선별되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 3개의 독립적인 miR399c- 또는 miR399d-과발현 형질전환체 라인이 획득되었다. 상기 miR399-과발현 형질전환 식물에서 PHO2 전사체의 수준은 노던 혼성화에 의해 분석되었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, PHO2 전사체의 수준은 야생형 식물에 비해 miR399-과발현체에서 훨씬 더 낮았다. 상기 miR399-과발현 형질전환체는 애기장대에서 miR399의 기능 분석을 위해 이용되었다.
실시예 7: 앱시스산에 대한 반응에서 miR399 -과발현 형질전환 식물의 종자 발아
식물의 앱시스산 반응에서 miR399의 관련성은 애기장대의 다른 발달 단계에서 시험되었다. 우선, 앱시스산의 부재 또는 존재 하에서 miR399-과발현 형질전환 종자의 발아율이 분석되엇다. 야생형, AIA- 및 miR399-과발현 형질전환 종자는 앱시스산-무첨가 배지에서 거의 동일한 종자 발아율을 나타내었다(도 9A). 그러나, AIA-과발현체와 유사하게, miR399-과발현 형질전환 종자는 1 μM 앱시스산-첨가 MS 배지에서 야생형에 비해 현저하게 더 낮은(p < 0.01) 발아율을 나타내었다(도 9B). 예를 들어, 종자의 계층화 후 1일째에, miR399c- 및 miR399d-과발현체 종자는 AIA-과발현체의 발아율인 30%와 유사하게 41% 및 34%의 발아율을 각각 나타낸 반면, 야생형은 76%의 발아율을 나타내었다. 상기 결과는 miR399가 AIA와 마찬가지로, 종자 발아의 앱시스산-매개 억제에 관여하고 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 앱시스산에 대한 반응에서 miR399 -과발현 형질전환 식물의 뿌리 신장
앱시스산-매개 유묘 생장 억제에서 miR399의 관련성은 miR399-과발현체를 이용하여 시험되었다. 우선, miR399-과발현체, 야생형 및 AIA-과발현 식물을 포함하는 모든 식물 라인은 MS 배지에서 유사한 뿌리 신장을 나타내었다(도 10A 및 10C). 1 μM 앱시스산-첨가 MS 배지에서, miR399-과발현 형질전환 식물은 야생형과 마찬가지로 약간의 뿌리 신장 억제를 나타낸 반면, AIA-과발현체는 현저한 억제를 나타내었다(도 10B 및 10D). 상기 결과는 miR399가 AIA와는 달리 뿌리 신장의 앱시스산-매개 억제에 관여하고 있지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 9: miR399 -과발현 형질전환 식물의 기공 폐쇄
앱시스산 또는 건조 스트레스로 처리된 애기장대에서 miR399d 전사체의 축적 증가를 기초로 하여(도 3), miR399d가 AIA와 마찬가지로 건조 내성 반응에도 관여할 수 있다는 것이 예상되었다. 상기 가능성을 시험하기 위해, miR399-과발현체에서 앱시스산 처리에 대한 기공의 반응, 탈수에 대한 증산율 및 건조 스트레스에 대한 내성이 분석되었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, miR399- 및 AIA-과발현 형질전환 식물의 기공은 야생형 식물에 비해 더 많이 폐쇄되었다(P < 0.01). miR399- 및 AIA-과발현 식물의 기공은 10 μM 앱시스산 처리에 의해 약간 더 폐쇄되었고, 앱시스산-처리 야생형 식물에 비해서는 더 많이 폐쇄되었다(P < 0.01). 상기 결과들은 miR399이 앱시스산- 및 AIA-매개 기공 폐쇄에 관여하고 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10: miR399 -과발현 형질전환 식물의 증산율
로제트 잎의 증산율은 4주 된 식물체로부터 떼어낸 후 잎의 생체중 손실을 기초로 하여, miR399-과발현체, 야생형 및 AIA-과발현 식물 중에서 비교되었다. 상기 기공 폐쇄 결과와 일관되게, miR399-과발현 식물은 야생형에 비해 현저하게 더 낮은 증산율을 나타내었다(P < 0.01)(도 12). AIA-과발현체에서도 유사한 결과가 획득되었다.
실시예 11: miR399 -과발현 형질전환 식물의 건조 스트레스 내성
건조 스트레스 내성은 4주간 토양에서 생장시킨 야생형, AIA- 및 miR399-과발현 형질전환 식물 중에서 비교되었다. 건조 스트레스에 대한 내성을 비교하기 위해 관개를 13일간 중단하였다. 시험한 모든 식물의 잎은 탈수 동안 안토시아닌의 축적을 나타내면서 시들기 시작했다. 13일째에, 대부분의 야생형 식물은 시들었다(도 13A). 그러나, 4일 동안 물을 다시 공급한 후에 miR399- 및 AIA -과발현 형질전환 식물은 탈수로부터 회복되었다(도 13B). 상기 결과는 miR399가 AIA와 마찬가지로 건조 스트레스 내성에 관여하고 있다는 것을 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399d(microRNA 399d) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 애기장대 식물세포에 형질전환시켜 miR399d 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 애기장대 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  2. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399d(microRNA 399d) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 애기장대 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 애기장대 식물세포로부터 애기장대 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 애기장대 식물체의 제조 방법.
  3. 제2항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 애기장대 식물체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제3항에 따른 애기장대 식물체의 종자.
  7. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 miR399d(microRNA 399d) 유전자를 포함하는, 애기장대 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
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Taylor P. Frazier 등. Mol Biotechnol. Published online 2011.02.27., Vol. 49, 페이지 159-165. *
Tianzuo Wang 등. BMC Genomics. 2011.07.15., Vol. 12, 페이지 367. *

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