KR101622942B1 - 종자 발아 및 염색질의 구조 조절에 관여하는 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제 단백질 AtJmj11 및 AtJmj13, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 상기 유전자 발현을 조절하여 식물의 종자 발아를 조절하는 방법, 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 상기 유전자를 과발현시켜 식물의 종자 발아를 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물의 종자 발아가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 포함하는 식물의 종자 발아 증진용 조성물, 상기의 유전자가 돌연변이되어 종자 발아가 감소된 식물체 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtJmj11 유전자 및 AtJmj13 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

종자 발아 및 염색질의 구조 조절에 관여하는 유전자 및 이의 용도{Genes involved in controlling seed germination and chromatin structure and uses thereof}

본 발명은 종자 발아 및 염색질의 구조 조절에 관여하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제 단백질 AtJmj11 및 AtJmj13, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 상기 유전자 발현을 조절하여 식물의 종자 발아를 조절하는 방법, 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 상기 유전자를 과발현시켜 식물의 종자 발아를 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물의 종자 발아가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 포함하는 식물의 종자 발아 증진용 조성물, 상기의 유전자가 돌연변이되어 종자 발아가 감소된 식물체 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtJmj11 유전자 및 AtJmj13 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절하는 방법에 관한 것이다.

성숙시에 식물 배아는 환경이 발아 및 생장에 적합할 때까지 생장을 정지하고 휴면기를 시작한다. 빛, 습도 및 온도와 같은 몇몇의 환경 인자는 종자 발아에 영향을 끼치는 것으로 알려졌다. 종자 발아에서 빛의 영향이 잘 알려졌다. Borthwick 등(Borthwick et al., 1952 Proc Natl Acad Sci U S A 38, 662-666)이 상추 종자의 광-가역성 광질(light quality)-의존성 발아에 대해 보고한 이후, 광 신호가 종자 발아 동안 인지되고 다운스트림 신호전달로 변환되는 방법을 이해하는데 많은 진전이 이루어져 왔다. 간단히, 광-가역성 종자 발아는 주로 피토크롬 B(PHYB)에 의해 매개되고, 길항적으로 종자 발아를 조절하는 앱시스산(abscisic acid, ABA) 및 지베렐린산(gibberellic acid, GA)의 레벨은 광-의존성 방식으로 정반대로 조절된다(Seo et al., 2006 Plant J 48, 354-366).

ABA는 휴면의 종자 상태를 만들고 유지시키는데 도움을 주므로, 종자 발아를 저해한다(Koornneef et al., 2002 Curr Opin Plant Biol 5, 33-36). 빛에 의한 피토크롬 활성화는 종자의 ABA 농도를 감소시킨다. ABA 레벨의 변화와 일관되게, ABA 물질대사 효소를 코딩하는 유전자의 발현은 피토크롬이 활성화되었을 때 변화한다(Seo et al., 2006 Plant J 48, 354-366). 피토크롬이 활성화되었을 때, ABA 동화작용 유전자인 ABA - DEFICIENT 1 (ABA1), NINE - CIS - EPOXYCAROTENOID DEOXYGENASE 6 (NCED6) 및 NCED9은 억제되는 반면, ABA 이화작용 유전자인 ABA 8'-히드록실라제을 코딩하는 CYP707A2은 상향조절된다(Kim et al., 2008 Plant Cell 20, 1260-1277). 그러므로, ABA 물질대사 효소를 코딩하는 유전자의 상이한 발현은 ABA 함량의 감소 및 광 노출시 종자 발아 증진의 결과에 기여한다. ABA 물질대사 유전자의 광 조절에 더하여, ABA 신호전달 유전자 ABA INSENSITIVE 3 (ABI3)의 전사는 또한 애기장대 유묘에서 PHYB 돌연변이에 영향을 받는다(Mazzella et al., 2005 Plant Cell 17, 2507-2516). 따라서, 피토크롬은 물질대사 유전자뿐만 아니라 ABA 신호전달 유전자를 조절한다.

GA는 부분적으로 세포 분열 및 확장의 증진을 통해 종자 발아를 유도한다. 피토크롬의 광 활성화는 물질대사 유전자 외에 GA 신호전달 유전자의 발현을 조절하여 내생의 GA 레벨 및 GA 반응성을 증가시킨다(Seo et al., 2009 Plant Mol Biol 69, 463-472). 활성화된 피토크롬은 GA 동화작용 유전자, 즉 GIBBERELLIN 3 βHYDROXYLASE 1 (GA3ox1) 및 GA3ox2의 발현을 증가시키는 반면, GA 이화작용 유전자인 GA2ox2은 피토크롬 활성화시 억제된다(Yamauchi et al., 2007 Plant Cell Physiol 48, 555-561). 게다가, 종자 발아에서 중요한 기능을 수행하는 것으로 잘 알려진 GA -신호전달 DELLA 단백질을 코딩하는 RGA, GAI 및 RGL2은 또한 피토크롬 활성화에 의해 발현이 변화된다. ABA 및 GA는 광-의존성 종자 발아 경로에서 서로 길항적으로 조절한다. 예를 들어, ABA 물질대사 유전자 CYP707A2 및 ABA2에서 돌연변이는 애기장대 종자에서 GA3ox1 및 GA3ox2의 mRNA 레벨을 바꾼다. 반면에, ABA 물질대사 유전자의 발현은 GA-결함 돌연변이체에서 바뀌거나 외부의 GA가 적용될 때 바뀐다(Oh et al., 2007 Plant Cell 19, 1192-1208).

몇몇의 전사 인자가 광-의존성 종자 발아를 조절한다고 보고되었다. 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 (bHLH) 단백질인 PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 3-LIKE 5 (PIL5)은 암(dark) 기간 동안 종자 발아를 억제한다. 광-활성화된 피토크롬은 핵으로 이동하여 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 통하여 PIL5 단백질을 분해한다. PIL5는 종자 발아의 또 다른 중요한 억제자인 징크-핑거 전사인자 SOMNUS (SOM)의 발현을 직접적으로 상향조절한다(Kim et al., 2008 Plant Cell 19, 1192-1208). DOF AFFECTING GERMINATION 1 (DAG1)가 GA3ox2는 아니고 GA3ox1 만을 직접적으로 억제함으로써 PIL5의 종자 발아 다운스트림(downstream)을 또한 억제한다(Gabriele et al., 2010 Plant J 61, 312-323). PHYB-PIL5-SOM 경로는 광-의존성 종자 발아의 주요 조절자일 수 있고, 이 모델과 일치하게 많은 호르몬 관련 유전자는 PIL5 및 SOM에 의해 조절된다. SOM에서 PIL5의 기능이 직접적인 전사 활성화를 통한다고 할지라도, SOM이 호르몬-관련 유전자의 발현에 어떻게 영향을 끼치는지는 알려지지 않았다(Kim et al., 2008 Plant Cell 20, 1260-1277).

유전자 전사는 어느 라이신 또는 아르기닌 잔기가 메틸화되었는지에 따라 번역 후 히스톤 메틸화에 의해 활성화될 수 있거나 억제될 수 있다(Li et al., 2007 Cell 128, 707-719). 라이신 또는 아르기닌 히스톤 메틸화는 SET 도메인을 포함하는 단백질 및 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 패밀리 단백질인 두개의 구별되는 효소 패밀리에 의해 각각 촉진된다. 이들의 히스톤 메틸화는 라이신-특이적 디메틸라제 1 클래스 단백질 및 Jumonji C (JmjC) 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 적어도 두개의 구별되는 효소 클래스에 의해 제거될 수 있다는 많은 최근의 연구가 있어 왔다(reviewed in Pedersen and Helin, 2010 Trends Cell Biol 20, 662-671). JmjC 도메인을 포함하는 인간 단백질인 JMJD6은 비대칭적 및 대칭적으로 이메틸화된 히스톤 H3 아르기닌 2 (di-methylated histone H3 arginine 2, H3R2me2) 및 히스톤 H4 아르기신 3 (H4R3me2)을 탈메틸화한다고 보고되었다(Chang et al., 2007 Science 318, 444-447).

그러나, 이러한 활성은 JMJD6가 스플라이싱 인자인 U2AF2에 대하여 라이실 수산화 활성(lysyl hydroxylation activity)을 갖는다는 또 다른 연구의 보고에 의해 의문시되었다(Webby et al., 2009 Science 325, 90-93). H3R2me2 및 H4R3me2의 레벨은 전사 활성을 반영하는 잘 알려진 후생유전학적 마커(epigenetic marker)인 삼메틸화된 히스톤 H3 라이신 4(tri-methylated histone H3 lysine 4, H3K4me3)의 레벨과 역으로 관련된다고 알려졌기 때문에, H3R2me2 및 H4R3me2의 높은 레벨은 전사 억제를 야기하는 것으로 생각된다(Hyllus et al., 2007 Genes Dev 21, 3369-3380). 히스톤 라이신 디메틸라제의 생물학적 기능이 많은 진핵생물에서 광범위하게 연구되었다고 하더라도, 히스톤 아르기닌(HR) 디메틸라제의 생체 내 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 여기서 본 발명자는 애기장대 종자 발아에서 광-의존성 HR 탈메틸화에 관련된 증거를 보고한다.

한편, 본 발명은 SOM 전사인자에 의해 발현이 조절되는 히스톤 아르기닌 디메틸라제 단백질 AtJmj11 및 AtJmj13에 관한 것으로, 지금까지 AtJmj11 및 AtJmj13 유전자의 발현을 조절하여 종자 발아를 조절하는 내용 및 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절하는 방법에 관해서 밝혀진 바는 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제 단백질 AtJmj11 및 AtJmj13을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입된 이중 돌연변이체의 종자는 발아율이 감소되었고, 이 이중 돌연변이체는 AtJmj11 또는 AtJmj13 유전자의 도입에 의해 정상 발아율로 회복되는 것을 확인하였으며, 또한 AtJmj11 또는 AtJmj13 유전자는 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제 단백질 AtJmj11 및 AtJmj13을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 상기 유전자 발현을 조절하여 식물의 종자 발아를 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 상기 유전자를 과발현시켜 식물의 종자 발아를 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 종자 발아가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 종자 발아 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 유전자가 돌연변이되어 종자 발아가 감소된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtJmj11 유전자 및 AtJmj13 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 AtJmj11 및 AtJmj13 유전자에 의해 식물의 종자 발아를 조절할 수 있고, 종자의 발아가 변화된 식물 및 이의 종자를 얻을 수 있다. 또한 AtJmj11 또는 AtJmj13 유전자는 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절하여 염색질의 구조를 조절할 수 있다.

도 1은 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체 종자에서 발아효율이 감소되는 결과를 나타낸다. (A) AtJmj11 및 AtJmj13의 유전자 구조이다. 블랙 박스는 엑손이고, 회색 박스는 비번역 영역(UTRs)이다. 유전자간 영역(Intergenic regions) 또는 인트론은 라인으로 표시하였다. 전사 개시 자리는 +1로 표시하였고, 각 돌연변이 대립유전자에서 T-DNA 삽입 자리는 삼각형으로 표시하였다. (B) PHYB-의존성 발아 분석이다. 야생형(WT), 단일 및 이중 돌연변이체 종자는 암조건에서 1시간 동안 침윤시켰다(imbibed). 그런 다음, 종자는 5분의 원적색광(FR) 조사 후에 즉시 5분의 적색광(R) 조사에 노출시켰다(B, C 및 E). 광-처리 종자는 암 조건에서 배양하였고, 발아된 종자는 매 24시간마다 카운트 되었다(B 및 C). 에러 바는 표준편차를 의미한다(B-E). Col: Columbia-0 야생형. (C) AtJmj11 : GUS 또는 AtJmj13 : GUS에 의한 atjmj11 atjmj13의 결함성 발아 표현형의 상보성 결과이다. atjmj11 -1 atjmj13 -1으로 도입된 AtJmj11 : GUS 또는 AtJmj13 : GUS의 두개의 대표적인 형질전환 라인은 PHYB-의존성 발아 분석에 이용되었다. (D) 상이한 적색광(R) 기간을 갖는 PHYB-의존성 발아 분석이다. 종자는 5분의 원적색광(FR) 조사 후에 표시한 시간 동안 적색광(R)에 노출시켰다. 보여주는 결과는 광 처리 후 5일(d)에 발아된 종자의 퍼센트이다(D 및 E). (E) 외부의 GA₃를 갖는 PHYB-의존성 발아 분석이다. GA₃의 표시된 양은 발아 배지에 첨가되었다.
도 2는 배아에서 AtJmj11 및 AtJmj13의 발현 및 이들의 핵의 위치이다. (A) 배아에서 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS의 공간적 발현 패턴이다. 원적색광(F)- 및 적색광(R)-처리된 종자는 고정된 후 절단 되였다. 광 처리(원적색광(FR) 및 적색광(R) 각각 5분)는 위에 그림으로 표시하였다. 블랙 박스는 암 배양 기간을 표시한다. 꺼내진 배아는 GUS 발현분석에 사용되었다. (B) AtJmj11:GFP 및 AtJmj13:GFP의 핵 내 위치이다. 10일된 장일(LD)에서 자란 35S:: AtJmj11 : GFP 및 35S:: AtJmj13 : GFP 형질전환 식물체의 뿌리의 세포 내 위치가 공초점 형광 현미경으로 분석되었다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)는 핵을 염색하는데 사용되었다. 위로부터 DIC(differential interference contrast), DAPI, GFP 및 merged 이미지가 제시된다. 바는 10μm를 나타낸다.
도 3은 GA3ox1 및 GA3ox2의 발현이 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체에서 감소되는 것을 나타낸다. 야생형 및 atjmj11 atjmj13 종자는 암조건에서 1시간동안 침윤시켰고, 연이은 5분간의 적색광(R) 처리를 하거나(R) 처리하지 않고(F) 5분 동안 원적색광(FR)을 처리하였다. 그 후, 종자는 12시간 동안 암배양 되었고, RNA 추출을 위해 사용되었다. 전사체 레벨은 유전자 특이 프라이머를 이용한 RT-qPCR로 분석되었다(표 1). 표준화는 Actin 2 (ACT2)를 기준으로 하고, F 야생형에서의 레벨을 1로 세팅하였다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다. (A) PHYB의 다운스트림에서 작용하는 종자 발아 억제자인 PIL5, SOM 및 DAG1의 상대적인 전사체 레벨이다. (B) GA 물질대사 효소를 코딩하는 유전자(GA3ox1, GA3ox2 및 GA2ox2) 또는 신호전달 구성요소(GAI 및 RGA)의 상대적인 전사체 레벨이다. (C) ABA 물질대사 효소를 코딩하는 유전자(ABA1, NCED6, NCED9 및 CYP707A2) 또는 신호전달 구성요소(ABI3)의 상대적인 전사체 레벨이다.
도 4는 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS가 GA3ox1 및 GA3ox2 프로모터에 직접 결합하는 것을 나타낸다. (A) GA3ox1, GA3ox2 및 PIL5의 유전자 구조 및 ChIP 이후 qPCR로 증폭된 영역이다. 구조는 도 1A에서 설명하였다. (B) GA3ox1 및 GA3ox2에 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS의 결합에 대한 ChIP-qPCR 분석이다. 종자는 1시간 동안 침윤시켰고, 원적색광(FR)에 5분 동안 노출시킨 후 적색광(R)에 30분 동안 노출시키고, 적색광(R)에 30분 동안 노출시키고, 암 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이러한 종자로부터 분리한 염색질은 항-GUS 항체로 면역침강시켰고, 공동-면역침강된 DNA량은 표시된 영역(A)에 대한 위치-특이적 프라이머를 이용한 qPCR로 측정하였다(표 2). PIL5 프로모터의 P1 영역은 비특이적 대조구로 제공되었다(B 및 C). 비 형질전환 대조구(atjmj11 -1 atjmj13 -1) 종자에서의 레벨은 주입 DNA의 레벨로 표준화된 후 1로 세팅되었다(B 및 C). 에러 바는 표준편차를 나타낸다(B 및 C). (C) GA3ox1 및 GA3ox2에 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS의 결합에 대한 ChIP-qPCR 분석이다. 실험은 종자가 수확전 적색광(R) 노출 후 12시간 대신 27시간 동안 암조건에서 배양된 것을 제외하고는 (B)처럼 수행되었다.
도 5는 AtJmj13 고유의 HR 디메틸라제 활성 및 GA3ox1 및 GA3ox2 염색질에 대한 AtJmj11 및 AtJmj13의 영향을 나타낸다. (A) 야생형 및 atjmj11 atjmj13 종자의 GA3ox1 및 GA3ox2에서 H4R3me2s의 상대적인 enrichment이다. 원적색광(FR)- 및 적색광(R)- 처리된 야생형 및 이중 돌연변이체 종자는 표시된 특이 항체(A, C 및 D)를 이용한 ChIP 분석을 위해 이용되었고, 공동-면역침강된 DNA량은 도 4A에서 표시한 GA3ox1 및 GA3ox2 영역(A, C 및 D)에 대해 위치-특이적 프라이머를 이용한 qPCR로 측정되었다. 광 처리는 도 3에서 설명한대로 수행하였다. F 야생형 종자에서의 레벨은 AtMu1 (A 및 D) 또는 ACT2 (C) 위치에서의 레벨로 표준화된 후 1로 세팅되었다(A, C 및 D). 에러 바는 표준편차를 나타낸다(A, C 및 D). (B) 쿠마시-염색되고, 정제된 AtJmj13:6xHis 단백질이다(왼쪽). 기질로 송아지 흉선 히스톤(calf thymus histone)을 이용한 시험관 내 히스톤 디메틸라제 활성 분석이다(오른쪽). 디메틸화 반응은 정제된 AtJmj13:6xHis 단백질의 부존재(-) 또는 1μg (+) 또는 2μg (++)으로 존재 하에 수행되었다. (C) H3K4me3의 상대적인 enrichment (D) H3K9me3의 상대적인 enrichment.
도 6은 SOM에 의한 AtJmj11 및 AtJmj13의 직접적인 억제를 나타낸다. (A) 유전자 특이 프라이머(표 1)를 이용한 원적색광(FR)- 및 적색광(R)-처리된 야생형 및 som-1 종자에서 SOM, Atjmj11 및 AtJmj13의 전사체 레벨의 RT-qPCR 분석이다. 광 처리는 도 3과 같이 수행하였다. 표준화는 ACT2를 기준으로 하고, F 야생형에서 레벨은 1로 세팅되었다(A 및 C). 에러 바는 표준편차를 나타낸다(A-C 및 E). (B) 5분의 원적색광(FR) 처리된 종자의 발아 퍼센트이다. 발아된 종자는 광 처리 후 5일에 카운트되었다. (C) 유전자 특이 프라이머를 이용한 5분의 원적색광(FR)이 처리된 종자에서 GA3ox1 및 GA3ox2 전사체 레벨의 RT-qPCR 분석이다. (D) AtJmj11, AtJmj13 및 PIL5의 유전자 구조이다. 도식은 도 1A에 설명하였다. ChIP-qPCR (E)에서 증폭된 영역이 표시되었다. (E) 원적색광(FR)-처리된 야생형 및 35S:: SOM : GFP 형질전환 종자를 이용한 항-GFP 항체에 의한 ChIP-qPCR 분석이다. PIL5 프로모터의 P1 영역은 비특이적 대조구로 제공되었다. 각 영역은 위치-특이적 프라이머로 증폭되었다(표 2). 결과는 주입 DNA와 비교하여 fold enrichment로 나타내었고, 비 형질전환 대조구 (WT) 종자에서의 레벨은 1로 세팅되었다.
도 7은 PHYB-의존성 종자 발아에서 AtJmj11 및 AtJmj13의 기능에 대한 제안된 모델이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제(histone arginine demethylase) 단백질 AtJmj11 (Arabidopsis thaliana Jumonji 11) 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제(histone arginine demethylase) 단백질 AtJmj13 (Arabidopsis thaliana Jumonji 13)을 제공한다.

본 발명에 따른 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질의 범위는 각각 애기장대로부터 분리된 서열번호 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 종자 발아를 조절하는 활성 또는 히스톤 아르기닌 디메틸라아제 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 AtJmj11 및 AtJmj13 게놈 DNA는 각각 서열번호 1 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, AtJmj11 및 AtJmj13 cDNA는 각각 서열번호 2 및 4로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 내지 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 AtJmj11 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 AtJmj11 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 AtJmj11 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtJmj11 유전자 및 AtJmj13 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 종자 발아를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 AtJmj11 또는 AtJmj13을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체는 야생형과 차이를 나타내지 않았으나, AtJmj11 및 AtJmj13을 코딩하는 유전자에 T-DNA가 삽입된 이중 돌연변이체의 종자는 감소된 발아 효율을 나타내었고, 이 이중 돌연변이체는 AtJmj11 또는 AtJmj13 유전자에 의해 정상 발아율로 회복되었다.

또한, 본 발명은 상기 AtJmj11 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 AtJmj11 유전자 및 AtJmj13 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 종자 발아를 증가시키는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 AtJmj11 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 종자 발아가 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 종자 발아 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질은 식물의 종자 발아를 조절하므로, 상기 AtJmj11 및 AtJmj13 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시키면 형질전환된 식물의 종자 발아를 조절할 수 있는 것이다. 상기 식물은 바람직하게는 애기장대이다.

또한, 본 발명은 AtJmj11 및 AtJmj13 단백질을 코딩하는 유전자가 돌연변이되어 종자 발아가 감소된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 AtJmj11 및 AtJmj13 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtJmj11 유전자 및 AtJmj13 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 염색질에서 히스톤 단백질 내의 아르기닌의 메틸화를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 염색질은 GA3ox1 (GIBBERELLIN 3 β-HYDROXYLASE 1) 또는 GA3ox2 (GIBBERELLIN 3 β- HYDROXYLASE 2) 염색질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 메틸화는 히스톤(histone) 단백질의 메틸화로 히스톤 H3 또는 히스톤 H4의 아르기닌(Arginine: R) 또는 라이신(Lysine: K) 아미노산 잔기에 메틸기가 붙을 수 있으며, 바람직하게는 히스톤 H4의 3번 아르기닌의 메틸화일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

식물 및 성장 조건

atjmj11 -1 및 atjmj13 -1 돌연변이체는 콜럼비아-0 (Col; WT) 배경이고, SAIL (SAIL_680_G02) 및 SALK (SALK_146176) 콜렉션에서 각각 얻었다. som -1 돌연변이체 및 35S:: SOM : GFP 형질전환 식물체는 Col 배경이다. 식물체는 22℃에서 16시간 명/8시간 암의 광주기(LD)로 100 μE m^-2 sec^-1 시원한 백색 형광 빛 아래에서 키웠다.

발아분석

발아분석에 사용된 종자는 같은 트레이에서 나란히 재배된 식물로부터 수확되었고, 수확된 종자는 상온에서 2달 이상 건조시켰다. PHYB-의존성 발아분석을 위해, 종자는 수크로스가 없는 1/10 강도 MS 배지에 파종하고, 22℃, 암조건에서 1시간 동안 침윤시켰다(imbibed). 그런 다음, 5분 동안 1 μmol m^-2 sec^-1 원적색광(FR)에 노출시키고, 20 μmol m^-2 sec^-1 적색광(R)은 5분 동안 조사되었다. 발아된 종자는 유근(radicle)의 수로 카운트 되었다. 적어도 80~120 개의 종자가 하나의 세트로 사용되었고, 3중의 세트는 통계 평가를 위해 분석되었다.

유전자 발현 분석

총 RNA는 약간 변형하여 앞서 기술한대로 침윤된 종자로부터 추출했다(Suzuki et al., 2004 Biotechniques 37, 542, 544). RNA 추출 동안 게놈 DNA로부터 가능한 오염은 RT 전에 37℃에서 1시간 동안 RNase-free DNase I (Roche)을 처리하여 제거하였다. 첫번째 cDNA 가닥은 3μg의 총 RNA를 이용하여 제조사의 지시에 따라 M-MuLV 역전사 효소를 이용하여 합성하였다. qPCR은 20 μl으로 SYBR Green I master mix (Kappa)을 이용하여 Applied Biosystems 7300 real-time PCR system으로 수행하였다. 상대적인 ΔΔC_T 방법은 DNA의 상대값을 계산하는데 사용하였다. 표준은 ACT2였다.

ChIP 분석

침윤된 종자로부터 염색질 분리는 앞서 기술한대로 수행되었다(Oh et al., 2007 Plant Cell 19, 1192-1208). 본 발명에서 사용한 항체는 다음과 같다; α-H3K4me3 (Cell Signaling #9727S), α-H3K9me3 (Abcam ab8898), α-H3K27me3 (Upstate 07-449), α-H3R2me2 (Upstate 07-585), α-H4R3me2s (Abcam ab5823), α-GUS (Invitrogen A5790) 및 α-GFP (Invitrogen A6455). 면역침강된 DNA의 양은 특이 프라이머를 사용한 qPCR로 정량되었다(표 2). 히스톤 메틸화 레벨을 측정하는 ChIP 분석에서, 표준화는 각 실험에서 지정된 참고 유전자(reference genes)였다. ChIP 결합분석을 위해 면역 침강된 DNA의 양은 투입 DNA에 의해 표준화되었다.

조직화학적 GUS 분석

AtJmj11 : GUS 구축물을 제조하기 위해, 1-kb 프로모터 및 AtJmj11 총 길이 코딩 서열을 커버하는 게놈 영역이 야생형 DNA로부터 증폭되었고, pPZP211-GUS로 클로닝되었다(Noh and Amasino, 2003 Plant Cell 15, 1671-1682). 1.5-kb 프로모터 및 AtJmj13 총길이 코딩 영역을 포함하는 게놈 절편은 야생형 DNA로부터 증폭되었고, pMDC163 게이트웨이 바이너리 벡터로 클로닝되었고, AtJmj13 : GUS 구축물이 제조되었다. AtJmj11 : GUS 및 AtJmj13 : GUS 구축물은 플로랄 딥 방법(floral dip method)에 의한 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 atjmj11 -1 atjmj13 -1 이중 돌연변이체로 도입되었다(Clough and Bent, 1998 Plant J 16, 735-743). 한 시간 침윤시킨 형질전환 종자는 원적색광(FR) 및 적색광(R)으로 처리되었고, 12시간 동안 암실에서 보관되었다. 그런 다음, 얼음에서 30분 동안 green safe light 아래에서 90% 아세톤으로 고정시키고, KPO₄ 버퍼로 2회 세척하였다. 고정된 종자는 해부되었고, 노출된 배아는 37℃에서 3시간 동안 GUS 활성을 위해 앞서 기술한대로 염색하였다(Schomburg et al., 2001 Plant Cell 13, 1427-1436). GUS 발현 패턴은 앞서 기술한대로 분석되었다(Hong et al., 2009 Mol Cells 27, 481-490).

세포 소기관 위치 연구

35S:: AtJmj11 : GFP 구축물을 제조하기 위해, AtJmj11 cDNA 절편은 야생형 cDNA 풀로부터 PCR 증폭되었고, JJ461 바이너리 벡터로 클로닝되었다(Han et al., 2007 Plant J 49, 103-114). AtJmj13의 게놈 코딩 영역은 야생형 DNA로부터 PCR 증폭되었고, pEarleygate103 게이트웨이 바이너리 벡터로 도입시켜 35S:: AtJmj13 : GFP 구축물이 제조되었다. GFP 융합 구축물은 플로랄 딥 방법을 이용하여 아그로박테리움-매개 형질전환법을 통하여 야생형 식물체 내로 형질전환시켰다. 10일 된 LD-재배 형질전환 유묘의 뿌리 표피 세포를 DE/LSM510 NLO 다중광자공초점주사 레이져현미경 (Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다(Carl Zeiss). DAPI는 핵을 염색하기 위해 사용되었다. 병합된 이미지(merged images)는 LSM 이미지 브라우저 소프트웨어를 이용하여 얻어졌다.

시험관 내 히스톤 디메틸라제 분석

AtJmj13:6xHis는 대장균 BL21(DE3)에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드로 18℃에서 16시간 발현시켰다. 세포를 재현탁 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.3 mM 페닐메틸 설포닐 플루오라이드)에서 모아서 초음파분해시켰다. 세포 파쇄물은 원심분리로 제거되었고, 상층액은 4℃에서 2시간 동안 20 mM 이미다졸로 Ni-NTA 아가로스 비드 (QIAGEN)로 인큐베이션시켰다. 비드는 재현탁 버퍼, 세척 버퍼 A (50 mM Tris-HCl pH8.0, 1 M NaCl, 5% 글리세롤) 및 세척 버퍼 B (50 mM Tris-HCl pH8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤)로 세척하였다. AtJmj13:6xHis은 용출 버퍼(50 mM Tris-HCl pH8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 100 mM 이미다졸)를 사용하여 용출시켜졌다.

1 또는 2 μg의 정제한 AtJmj13:6xHis를 2 μg의 송아지 흉선 히스톤 타입 II-A (Sigma)와 함께 디메틸화 반응버퍼(50 mM HEPES-KOH pH 8.0, 20 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM 2-옥소글루타레이트, 500 μM 아스코르브산)에서 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 히스톤 메틸화 레벨은 다음의 항체를 이용하여 웨스턴 블럿으로 측정되었다; α-H3R2me2 (Upstate 07-585), α-H3K4me3 (Cell signaling #9727), α-H3K9me2 (Upstate 07-521), α-H3K9me3 (Upstate 07-523), α-H3K27me3 (Upstate 07-449), α-H3K36me2 (Upstate 07-369), α-H3K36me3 (Upstate 07-549), α-H3 (Abcam ab1791), α-H4R3me1 (Abcam 17339), α-H4R3me2s (Abcam ab5823) 및 α-H4 (Abcam ab7311).

실시예 1. PHYB ( phytochrome B)가 활성화되는 동안 AtJmj11 및 AtJmj13 의 손실( loss )은 종자의 발아 효율의 감소를 야기한다.

앞선 보고를 통하여 몇몇 AtJmj 단백질은 이들 JmjC 도메인과 이미 알려진 JmjC 단백질의 서열 유사성에 기초하여 예상되는 타겟 특이성을 갖는다는 것이 증명되었다(Ko et al., 2010 EMBO J 29, 3208-3215). 애기장대의 21개의 JmjC 도메인을 포함하는 단백질 중에서 추정적인 히스톤 아르기닌 디메틸라제(histone arginine (HR) demethylases)를 확인하기 위해, 본 발명자는 HR 디메틸라제로 알려진 인간 JMJD6의 JmjC-도메인과 이들 JmjC 도메인의 서열 유사성을 조사하였다(Hong et al., 2009 Mol Cells 27, 481-490). 21개의 AtJmj 단백질의 아미노산 서열의 분석은 AtJmj10 (JMJ21; At1g78280), AtJmj11 (JMJ22; At5g06550) 및 AtJmj13 (JMJ20; At5g63080)의 세 개의 AtJmj 단백질이 JMJD6에 가장 유사하다는 것을 보여 주었다.

AtJmj10, AtJmj11 및 AtJmj13의 생물학적 기능을 조사하기 위해, 본 발명자는 AtJmj11 (atjmj11 -1) 및 AtJmj13 (atjmj13 -1)의 T-DNA 삽입 돌연변이체를 얻었으나 AtJmj10에 대한 동형접합성의 돌연변이체는 얻지 못했다. AtJmj11 및 AtJmj13 사이의 높은 서열 유사성 및 가능성 있는 기능적인 중복성(possible functional redundancy)을 고려하여, 본 발명자는 atjmj11 -1 atjmj13 -1 이중 돌연변이체를 제조한 후, 단일 및 이중 돌연변이체에서 다양한 표현형 분석을 수행하였다. 이러한 돌연변이체가 정상 성장 조건에서 영양발육을 통해 야생의 표현형을 나타내었다고 하더라도, 이중 돌연변이체 종자는 적색광 조사 처리(red-light (R) pulse treatment) 후에 감소된 발아 효율을 나타내었다(도 1B). 이와 같은 실험을 위해, 본 발명자는 야생형 및 돌연변이체 식물을 나란히 키웠고, 이들의 수확된 종자는 PHYB-의존성 발아를 평가하는 적색광 처리 실험(R pulse experiments)을 수행하기 전 완전한 후-숙성을 이루기 위해 2달 이상 상온에서 건조 저장하였다. 이중 돌연변이체 종자의 감소된 발아 효율은 종자 발달의 결함 때문인 것 같지 않은데, 이는 이중 돌연변이체의 종자는 야생형 종자와 형태적으로 구별되지 않기 때문이다.

이중 돌연변이체 종자의 더 낮은 발아 효율이 AtJmj11 및 AtJmj13의 돌연변이에 의해 야기되는지 확인하기 위해, 본 발명자는 AtJmj11 및 AtJmj13의 자연 프로모터(native promoters) 및 게놈 코딩 영역을 포함하는 번역의 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS)-융합 구축물로 돌연변이 표현형의 회복을 시도하였다. 각 구축물(AtJmj11 : GUS 또는 AtJmj13 : GUS)을 아그로박테리움-매개 형질전환법에 의해 이중 돌연변이체로 도입시켰고, AtJmj11 : GUS 또는 AtJmj13 : GUS을 포함하는 두개의 대표적인 형질전환 라인은 PHYB-의존성 발아 조건에서 종자 발아 효율이 조사되었다. 도 1C는 AtJmj11 : GUS 또는 AtJmj13 : GUS의 도입이 이중 돌연변이체의 감소된 발아 효율을 완전하게 회복시키는 것을 보여주고, 이중 돌연변이체의 발아 결함(defect)은 AtJmj11 및 AtJmj13의 손상에 의해 야기되는 것을 증명한다. 이러한 결과는 이 두개의 연관 유전자가 종자 발아를 증진시키는데 중요한 역할을 하는 것을 설명한다.

적색광(R)의 더 긴 노출이 내생의 GA 레벨(endogenous levels)을 증가시켜 더 높은 발아율을 야기하기 때문에, 본 발명자는 상이한 기간 동안 적색광(R)을 처리한 이중 돌연변이체 종자의 발아 효율을 조사하였다. 도 1D에서 보여준 바와 같이, 이중 돌연변이체 종자는 야생형 및 각 단일 돌연변이체의 종자와 비교하여 1분 또는 5분의 적색광(R) 처리시 더 낮은 발아율을 보여주었다. 그러나, 이중 돌연변이체 종자의 발아율은 R 노출 60분 후에 야생형 및 각 단일 돌연변이체와 구별이 되지 않았다. 또한 이중 돌연변이체 종자에 1 및 10 μM의 외부 GA 적용은 부분적으로 그리고 완전하게 각각 발아 결함을 회복시켰다(도 1E). 요약하면, 이상의 데이터는 이중 돌연변이체 종자의 감소된 발아율이 더 낮은 내부의 GA 레벨에 의해 야기되었을 가능성을 공통적으로 설명한다.

실시예 2. 배아에서 AtJmj11 및 AtJmj13 의 발현 및 핵에서의 위치

AtJmj11 및 AtJmj13은 광 의존성 발아 경로에서 기능을 수행하므로, 본 발명자는 원적색광(far-red light, FR)- 및 적색광(R)- 처리 배아에서 AtJmj11 및 AtJmj13의 공간 발현 패턴을 연구하였다. 본 발명자는 상기 기술한대로 기능적인 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS 융합 단백질의 조직화학적 GUS-염색을 수행하였다(도 1C). 도 2A에서 보여준 바와 같이, 원적색광(FR)-처리된 AtJmj11 : GUS 종자에서, 염색은 배아의 유근(radicle)에서 주로 관찰되었다. 흥미롭게도, GUS 활성은 적색광(R)-처리 후 더 높았고, AtJmj11:GUS의 발현 도메인은 자엽(cotyledons)으로 퍼졌다. AtJmj13:GUS은 원적색광(FR)-처리 종자에서 배아의 모든 영역에서 발현되었다. 또한, AtJmj13:GUS 발현은 AtJmj11:GUS와 같이 적색광(R) 처리 후에 증가하였다(도 2A). 앞선 연구에서 GA3ox1 및 GA3ox2은 배아 축에서 주로 발현되었다고 보고되었다(Ogawa et al., 2003 Plant Cell 15, 1591-1604). 따라서, 본 발명에서는 비록 이 AtJmj 유전자의 발현 도메인이 GA 동화작용 유전자의 발현 도메인과 동일하지 않더라도, AtJmj11 및 AtJmj13은 GA3ox1 및 GA3ox2이 또한 발현되는 배아 영역에서 발현되는 것을 보여준다.

AtJmj11 및 AtJmj13이 HR 디메틸라제로 작용하는 것이 예상됨에 따라, 본 발명자는 이러한 단백질이 핵에 위치되는지 궁금했다. 이런 가능성을 테스트하기 위해, 본 발명자는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터 조절하의 GFP(Green Fluorescent Protein)-표지된 AtJmj11 또는 AtJmj13을 생산하는 구축물을 제조하였다. 각 구축물을 포함하는 형질전환 식물의 뿌리에서, AtJmj11:GFP 및 AtJmj13:GFP 융합 단백질은 핵에서만 위치되었다(도 2B). 이러한 결과는 히스톤 조절자(histone modifiers)로서 AtJmj11 및 AtJmj13의 가능한 기능에 부합한다.

실시예 3. GA3ox1 및 GA3ox2 의 하향 조절은 atjmj11 atjmj13 에서 감소된 발아 효율과 연관된다.

광-의존성 종자 발아는 대게 ABA 및 GA의 두 개의 식물 호르몬으로 조절된다. 배경기술에서 언급한 것처럼, 많은 연구들이 피토크롬의 광-활성화가 이러한 두개의 호르몬의 합성 또는 이화작용을 수행하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 것을 설명해왔다. 또한, ABA 및 GA의 신호전달 인자는 종자 발아의 조절에서 중요하다(Oh et al., 2007 Plant Cell 19, 1192-1208). 게다가, 최근 종자 발아의 억제자로 작용하는 PIL5, SOM 및 DAG1와 같은 전사 인자는 피토크롬에서 호르몬으로 광 신호를 매개하는 것으로 보고되었다(Gabriele et al., 2010 Plant J 61, 312-323). AtJmj11 및 AtJmj13이 전사레벨에서 작용할 수도 있기 때문에, 본 발명자는 광-의존성 발아에서 기능을 수행하는 것으로 알려진 유전자의 steady-state mRNA 레벨에 대한 atjmj11 및 atjmj13 돌연변이의 영향을 조사하였다. 따라서, 원적색광(FR)- 및 적색광(R)-처리 야생형 및 이중 돌연변이체 종자로부터 추출된 RNAs가 RT-qPCR 분석(quantitative real-time polymerase chain reaction analyses)으로 역전사에 사용되었다. 앞서 보고한대로, 본 발명자는 PIL5이 아닌 SOM 및 DAG1의 mRNA 레벨이 적색광(R)- 처리된 야생형 종자에서 하향 조절되는 것을 관찰하였다(도 3A)(Gabriele et al., 2010 Plant J 61, 312-323). 그러나, 이러한 유전자의 전사 레벨은 야생형 및 이중 돌연변이체 사이에서 크게 다르지 않았다(도 3A).

다음으로, 본 발명자는 GA 물질대사 및 신호전달과 연관이 있는 유전자의 전사체 레벨을 분석하였다(도 3B). GA3ox1 및 GA3ox2은 GA를 활성화된 형태로 전환하는 β-히드록실라제를 코딩하는 반면, GA2ox2은 GA 이화 효소를 코딩한다(Williams et al., 1998 Plant Physiol 117, 559-563). RGA 및 GAI은 GA-신호전달 DELLA 단백질을 코딩하고, PIL5의 직접적인 타겟이다(Oh et al., 2007 Plant Cell 19, 1192-1208). GA3ox1 및 GA3ox2의 전사체 레벨은 야생형에서 적색광(R) 처리에 의해 상당히 증가되었다(도 3B). 그러나, 적색광(R)에 의한 이러한 유전자의 유도는 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체에서 크게 약화되었다. 반면에, 적색광(R) 처리 전후로 야생형 및 이중 돌연변이체 사이에서 GA2ox2, RGA 및 GAI의 전사체 레벨은 유효한 차이가 없었다(도 3B). 또한, ABA-관련 유전자가 분석되었다(도 3C). ABA1, NCED6 및 NCED9은 ABA 생합성 유전자인 반면, CYP707A2 및 ABI3은 각각 ABA 이화작용 및 신호전달 유전자이다. ABA-관련 유전자 중 어떤 것도 적색광(R) 처리 전후로 야생형 및 이중 돌연변이체 사이에서 다르게 발현되지 않았다. 따라서, 본 발명자는 적색광(R) 처리 후에 GA3ox1 및 GA3ox2의 더 낮은 유도가 내생의 GA의 더 낮은 레벨을 야기할 수 있고, 결과적으로 야생형과 비교하여 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체에서 더 낮은 발아 효율을 야기할 수도 있을 것으로 추측한다(도 1B). 이러한 결과는 외부의 GA 처리가 이중 돌연변이체에서 발아 결함을 회복할 수 있다는 사실과 일치한다(도 1E).

실시예 4. AtJmj11 및 AtJmj13 에 의한 GA3ox1 및 GA3ox2 의 직접적인 조절

다음으로, 본 발명자는 도 1C에서 설명한 AtJmj11 : GUS 및 AtJmj13 : GUS을 이용하여 ChIP 분석(chromatin immunoprecipitation assays)을 수행함으로써 GA3ox1 및 GA3ox2 발현에서 AtJmj11 및 AtJmj13가 연관이 직접적인지 조사하였다. 적색광(R)-처리 종자의 12시간 암배양 후에, AtJmj11:GUS은 프로모터 근접 영역인 GA3ox2가 아닌 GA3ox1에 약하게 결합된 반면, AtJmj13:GUS은 전사 개시 자리 근접영역인 GA3ox2에는 약하게 결합되고, GA3ox1에 비교적 강하게 결합된 것을 보여주었다(도 4B). 따라서, GA3ox2에 이러한 융합 단백질의 결합은 적색광(R)-처리 종자에 대한 12시간 암배양 이후 GA3ox1에의 결합보다 더 약했다. 앞선 연구에서 적색광(R) 처리후 GA3ox1 및 GA3ox2 간 상이한 발현 역학이 보고되었다(Seo et al., 2006 Plant J 48, 354-366). 해당 연구에서 GA3ox1의 발현은 12시간 배양 후가 피크였고, 반면에 GA3ox2의 발현은 36시간 후에 피크에 달하는 더 늦은 역학을 나타냈다. 그러므로, 이들 두 유전자에의 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS의 상이한 결합은 적색광(R) 처리 후 12시간이 GA3ox2의 완전한 유도에 충분하지 않기 때문일 수도 있었다. 그러므로, 본 발명자는 암조건에서 더 긴 배양 시간(27 시간) 후에 ChIP을 수행하였다(도 4C). 이 경우, GA3ox2에 AtJmj11:GUS 및 AtJmj13:GUS의 결합은 GA3ox1에 결합한 것만큼 강했다. 더욱이, AtJmj11:GUS은 GA3ox1 보다 GA3ox2에 더 강하게 결합되는 것을 나타내었다. 요약하면, 상기 결과는 AtJmj11 및 AtJmj13이 전사개시 자리에 근접한 GA3ox1 및 GA3ox2 염색질에 직접적으로 작용하고, 결합 효율은 GA3ox1 및 GA3ox2의 발현유도 패턴과 연관있다는 것을 나타낸다.

실시예 5. AtJmj13 의 고유한 HR 디메틸라제 활성 및 GA3ox1 및 GA3ox2 염색 질에 대한 AtJmj11 및 AtJmj13 의 영향

AtJmj11 및 AtJmj13 단백질이 이미 알려진 HR 디메틸라제인 JMJD6의 JmjC 도메인과 유사한 JmjC 도메인을 갖고, GA3ox1 및 GA3ox2 염색질과 직접적인 연관이 있는 것을 보여주었으므로(도 4), 야생형에 비교하여 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체의 GA3ox1 및 GA3ox2에서 HR 메틸화 상태를 적색광(R) 처리 유무에 따라 비교하였다. 야생형에서, 대칭의 H4R3me2 (H4R3me2s) 레벨은 적색광(R) 처리 후 GA3ox1 및 GA3ox2의 다수 영역에서 감소되었으나 이중 돌연변이체에서는 감소되지 않았다(도 5A). 그러나, H3R2me2 레벨은 야생형 및 이중 돌연변이체 모두에서 적색광(R)에 의해 크게 영향을 받지 않았다(데이터 미제시). 이러한 결과는 AtJmj11 및 AtJmj13가 종자 발아 동안 적색광(R)-의존성 방식으로 생체 내(in vivo )의 GA3ox1 및 GA3ox2에서 H3R2me2가 아닌 H4R3me2s의 레벨에 영향을 끼치는 것을 나타낸다.

다음으로, 본 발명자는 시험관 내에서 AtJmj11 및 AtJmj13가 HR 디메틸라제 활성을 갖는지 조사하였다. 시도된 몇 개의 발현 시스템에서 전 길이(full-length) AtJmj11가 발현되지 않았다고 하더라도, 본 발명자는 대장균에서 카르복시-말단 6X 히스티딘-표지된 단백질(AtJmj13:6xHis)로서 전 길이 AtJmj13을 발현시켰다. AtJmj13:6xHis은 균질에 가깝게 정제하였고(도 5B, 왼쪽), 시험관 내 히스톤 디메틸라제 활성 분석에 사용되었다. 적용된 몇개의 발현 시스템에서 총 길이 AtJmj11가 발현되지 않는다고 하더라도, 본 발명자는 대장균에서 카르복시-말단 6X 히스티딘-표지된 단백질(AtJmj13:6xHis)로서 총길이 AtJmj13을 발현시켰다. AtJmj13:6xHis은 균질에 가깝게 정제하였고(도 5B, 왼쪽), 시험관 내 히스톤 디메틸라제 활성 분석을 수행하였다. AtJmj13:6xHis-매개 히스톤 디메틸라제 활성은 메틸화된 히스톤 H3 또는 H4 잔기에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블럿에서 감소된 신호로 반영되었다(도 5B, 오른쪽). 디메틸라제 분석에서 히스톤 기질과 함께 재조합 AtJmj13:6xHis 단백질의 배양은 H3K4me3, H3K9me2, H3K9me3, H3K27me3, H3K36me2 및 H3K36me3가 아닌 H3R2me2, H4R3me1 및 H4R3me2s의 감소된 레벨을 야기했다(도 5B, 오른쪽). 이러한 결과는 인간 JMJD6와 유사한 AtJmj13:6xHis 단백질이 내재적 H3R2- 및 H4R3-특이 디메틸라제 활성을 갖는 것을 나타낸다. 따라서 atjmj11 atjmj13이 아닌 야생형의 GA3ox1 및 GA3ox2의 H4R3me2s의 레벨에서 적색광(R)-의존성 감소는 AtJmj11 및 AtJmj13의 H4R3 디메틸라제 활성에 의해 직접적으로 야기되는 것 같다. 그러나, AtJmj13의 내재적 H3R2 디메틸라제 활성에 관계없이, AtJmj11 및 AtJmj13은 적색광(R) 처리 전후 야생형 및 atjmj11 atjmj13 종자의 GA3ox1 및 GA3ox2 위치에서 일정한 H3R2me2 레벨에 근거할 때, GA3ox1 및 GA3ox2에서 생체내 H3R2 디메틸라제로서는 작용하지 않는 것 같다(데이터 미제시).

H4R3me2s는 억제성 염색질 상태에 기여하며(reviewed in Di Lorenzo and Bedford, 2011 Histone arginine methylation. doi :10.1016/j. febslet .2010.11.010), H4R3me2s와 다른 히스톤 마커 사이의 몇몇의 cross-talk이 알려졌다(Fischle et al., 2003 Cell Biol 15, 172-183). 예를 들어, 이러한 cross-talk는 애기장대 FLOWERING LOCUS C (FLC) 염색질에서 관찰되었으며; FLC 염색질에서 Protein Arginine methyltransferase 5 (AtPRMT5)의 돌연변이로 야기된 감소된 H4R3me2s은 H3K9me3 및 H3K27me3의 더 낮은 레벨과 연관이 있다(Schmitz et al., 2008 Proc Natl Acad Sci U S A 105, 411-416). 따라서, 본 발명자는 유사한 cross-talk가 GA3ox1 및 GA3ox2에서 또한 관찰되는지 확인하기 위해 H4R3me2s 외의 몇개의 히스톤 메틸화 마커의 레벨을 측정하였다. 적색광(R) 처리는 야생형 종자의 GA3ox1 및 GA3ox2 유전자 부위에서 활성 염색질의 대표 마커인 H3K4me3의 증가된 레벨을 야기하는 반면, 그 증가 정도가 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체 종자에서는 약화되었다(도 5C). H3K9me3의 레벨은 적색광(R) 및 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이에 의해 H4R3me2s의 레벨과 유사하게 영향을 받았다(도 5D). 그러나, 억제성 염색질의 대표 마커인 H3K27me3의 레벨은 AtJmj11 및 AtJmj13에서 돌연변이 또는 적색광(R) 처리에 의해 크게 변화되지 않았다. 요약하면, GA3ox1 및 GA3ox2에서 H4R3me2s 레벨은 H3K27me3 레벨이 아닌 H3K9me3 및 H3K4me3의 레벨과 양성 및 음성 방식으로 각각 연관이 있다. 그러므로, 적색광(R)-유도 발아 동안 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체 종자에서 H4R3me2s/H3K9me3의 비효율적인 제거 및 H3K4me3의 감소된 축적은 GA3ox1 및 GA3ox2의 히포-유도(hypo-induction)를 야기할 것 같고, 이것은 더 낮은 발아 효율을 야기하는 것 같다.

실시예 6. SOM 은 AtJmj11 및 AtJmj13 발현을 직접 억제한다.

앞선 연구에서 PIL5은 SOM의 전사를 직접 활성화하고, PIL5 및 SOM은 적색광(R)이 없는 경우에 GA3ox1 및 GA3ox2의 업스트림 억제자(upstream repressors)로서 작용한다고 보고되었다(Kim et al., 2008 Plant Cell 20, 1260-1277). 그러나, GA3ox1 및 GA3ox2에 대한 SOM의 효과가 직접적인지 아직 밝혀지지 않았다. 본 데이터는 PIL5 및 SOM의 발현이 atjmj11 및 atjmj13의 돌연변이에 의해 영향을 받지 않고, AtJmj11/AtJmj13 단백질이 HR 디메틸라제로서 GA3ox1 및 GA3ox2 염색질에서 직접 작용하는 것을 보여준다(도 4 및 5). 따라서, 하나의 가능성은 SOM이 AtJmj11 및 AtJmj13을 통해 GA3ox1 및 GA3ox2에서 작용하는 것이다. 이러한 가능성을 확인하기 위해, 본 발명자는 원적색광(FR)- 및 적색광(R)-처리 종자의 AtJmj11 및 AtJmj13의 전사체 레벨에 대한 som -1 돌연변이의 효과를 분석하였다. 특히, AtJmj11 및 AtJmj13의 전사체 레벨은 원적색광(FR) 아래의 som 돌연변이체 종자 및 SOM의 하향조절이 야기된 적색광(R) 처리 후 야생형 종자에서 크게 증가하였다(도 6A).

도 6A의 데이터는 AtJmj11 및 AtJmj13이 SOM의 하위에서 기능할 것이라는 가설과 일치하였으므로, 본 발명자는 원적색광(FR) 아래에서 som atjmj11 atjmj13 삼중 돌연변이체의 발아 효율을 테스트하여 SOM 및 AtJmj11 / AtJmj13 사이의 epistatic 관계를 조사하였다. 야생형 및 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이체 종자는 원적색광(FR) 아래에서 발아되지 않는 반면, som 돌연변이체 종자의 약 80%는 발아되었다(도 6B). 그러나, som atjmj11 atjmj13 삼중의 돌연변이체 종자의 발아 효율은 약 50%로 감소되었는데(도 6B), 이것은 AtJmj11 / AtJmj13이 원적색광(FR) 아래에서 som 돌연변이의 효과적인 발아를 위해 적어도 부분적으로 요구되고, AtJmj11 / AtJmj13은 SOM의 다운스트림(downstream)에서 작용한다는 것을 나타낸다. 발아 효율과 일치하여, 원적색광(FR) 아래의 som 돌연변이체에서 GA3ox1 및 GA3ox2의 탈억제된 발현(de-repressed expression)은 atjmj11 atjmj13 이중 돌연변이에 의해 또한 약화되었다(도 6C). 요약하면, 도 6A-6C의 데이터는 SOM이 원적색광(FR) 아래에서 AtJmj11 및 AtJmj13의 상향의(upstream) 억제자로 작용하는 것을 나타낸다.

다음으로, 본 발명자는 AtJmj11 및 AtJmj13에 대한 SOM의 억제 효과가 직접적인지를 35S:: SOM : GFP 형질전환 종자(Kim et al., 2008)를 이용한 ChIP 분석을 수행함으로써 조사하였다. 도 6E에서 보여주는 바와 같이, SOM:GFP 융합 단백질은 원적색광(FR) 아래에서 PIL5의 프로모터 영역과는 결합하지 않은 반면, AtJmj11 및 AtJmj13의 말단 프로모터 영역과는 결합하였다. 따라서, AtJmj11 및 AtJmj13은 SOM의 직접적인 억제 타겟으로 보인다.

실시예 7. 광-의존성 종자 발아에서 AtJmj11 및 AtJmj13 의 기능에 대한 제안 모델

본 발명에 기초하여, 본 발명자는 PHYB-의존성 종자 발아 경로에 대한 모델을 제안했다(도 7). 원적색광(FR) 또는 암 조건하에서, PHYB은 세포질에 위치하며 비활성의 Pr 형태로 존재하여 PIL5의 핵 내 축적을 허락하고, 이러한 PIL5는 SOM을 전사적으로 활성화한다. 한편 SOM 단백질은 AtJmj11 및 AtJmj13의 발현을 직접 억제한다. 이들 HR 메틸라제의 발현이 낮을 때, 억제성 H4R3me2s는 GA3ox1 및 GA3ox2 염색질에서 높은 레벨을 유지하는데, 이것은 낮은 GA 레벨 및 종자 발아 효율을 야기한다. 그러나, 적색광(R) 조사에 의해 세포질-위치의 비활성 Pr에서 핵-위치의 활성 Pfr 형태로의 PHYB의 전환 및 위치변경은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통한 PIL5 단백질 분해를 야기한다. PIL5 단백질의 고갈은 SOM 전사의 하향조절 및 연속적 AtJmj11 및 AtJmj13의 탈억제(de-repression)를 유도한다. 기능적 중복성을 지닌 HR 디메틸라제들의 증가된 발현은 염색질로부터 억제성 H4R3me2s의 제거에 의해 GA3ox1 및 GA3ox2의 발현을 유도한다. 이들 GA 동화작용 유전자들의 증가된 발현은 종자에서 활성의 GA 축적을 야기하고, 이것은 배아를 발아하게 한다.

<110> Genes involved in controlling seed germination and chromatin structure and uses thereof <120> SNU R&DB FOUNDATION <130> PN11058 <160> 70 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1942 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gtcaaacatg ccaaagtgca agaatctgtt gctaacctcg aagcgacgta aatccaaatc 60 caaaagacta aagctccatc agcatgaacc tgagtctctg tttccagaga aggaggtaga 120 agaggaagat gaagatgaag gaggcttcaa gctgaaaatt gcagctcctt ctcaagagca 180 tggagttcaa cctctgggaa acctatattt caatcctggt gcggtcaatg tgcgaaacac 240 tggattaggt aatctccaga tactctcaga tgagctcgtt ttggatattc taggtcttct 300 tggcgccaat catttgggtg ttttggctac tgtaactaag tcattctata tatttgctaa 360 tcatgagcct ctctggagaa atcttgtgtt agaggagtta aaaggagatt ttttgtttaa 420 tgggtcgtgg agatctacct atgtagctgc ttaccatccg aaattcaagt ttgctggaga 480 tggtgaatcg aatttgaaga ttatagattt ctattctgat tatctgtttc agagctggtt 540 atgtgcgaat cttgaaatga aaccgaaatg gcttagaaga gataatatca cacgggtgag 600 aggcatttct gttgaagact tcattacaaa gtttgaggag ccgaataagc cagttttgtt 660 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Leu Leu Gly Ala Asn His Leu Gly Val Leu Ala Thr Val Thr Lys Ser 100 105 110 Phe Tyr Ile Phe Ala Asn His Glu Pro Leu Trp Arg Asn Leu Val Leu 115 120 125 Glu Glu Leu Lys Gly Asp Phe Leu Phe Asn Gly Ser Trp Arg Ser Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Ala Tyr His Pro Lys Phe Lys Phe Ala Gly Asp Gly Glu 145 150 155 160 Ser Asn Leu Lys Ile Ile Asp Phe Tyr Ser Asp Tyr Leu Phe Gln Ser 165 170 175 Trp Leu Cys Ala Asn Leu Glu Met Lys Pro Lys Trp Leu Arg Arg Asp 180 185 190 Asn Ile Thr Arg Val Arg Gly Ile Ser Val Glu Asp Phe Ile Thr Lys 195 200 205 Phe Glu Glu Pro Asn Lys Pro Val Leu Leu Glu Gly Cys Leu Asp Gly 210 215 220 Trp Pro Ala Ile Glu Lys Trp Ser Arg Asp Tyr Leu Thr Lys Val Val 225 230 235 240 Gly Asp Val Glu Phe Ala Val Gly Pro Val Glu Met Lys Leu Glu Lys 245 250 255 Tyr Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Ala Arg Glu Glu Arg Pro Leu Tyr Leu 260 265 270 Phe Asp Pro Lys Phe Ala Glu Lys Val Pro Val Leu Asp Ser Glu Tyr 275 280 285 Asp Val Pro Val Tyr Phe Arg Glu Asp Leu Phe Gly Val Leu Gly Asn 290 295 300 Glu Arg Pro Asp Tyr Arg Trp Ile Ile Ile Gly Pro Ala Gly Ser Gly 305 310 315 320 Ser Ser Phe His Ile Asp Pro Asn Ser Thr Ser Ala Trp Asn Ala Val 325 330 335 Ile Thr Gly Ser Lys Lys Trp Val Leu Phe Pro Pro Asp Val Val Pro 340 345 350 Pro Gly Val His Pro Ser Pro Asp Gly Ala Glu Val Ala Cys Pro Val 355 360 365 Ser Ile Ile Glu Trp Phe Met Asn Phe Tyr Asp Asp Thr Lys Asp Trp 370 375 380 Glu Lys Lys Pro Ile Glu Cys Ile Cys Lys Ala Gly Glu Val Met Phe 385 390 395 400 Val Pro Asn Gly Trp Trp His Leu Val Ile Asn Leu Glu Glu Ser Ile 405 410 415 Ala Ile Thr Gln Asn Tyr Ala Ser Arg Ser Asn Leu Leu Asn Val Leu 420 425 430 Glu Phe Leu Lys Lys Pro Asn Ala Lys Glu Leu Val Ser Gly Thr Thr 435 440 445 Asp Arg Glu Asn Leu His Asp Lys Phe Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ala 450 455 460 Tyr Pro Gly Thr Ile Gln Glu Leu Glu Lys Lys Ala Glu Glu Ala Lys 465 470 475 480 Arg Ala Glu Glu Gln Arg Val Ser Phe Trp Asp Ser Ala Lys Thr Asp 485 490 495 Thr Phe Lys Phe Ser Phe 500 <210> 6 <211> 462 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Gly Ile Gln Ile Ile Gly Gln Ile Glu Arg Ile Asn Gly Lys Glu 1 5 10 15 Leu Ser Tyr Gly Asp Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Ala Lys Asn Gln Pro 20 25 30 Val Val Ile Ser Asp Leu Thr Glu Asp Trp Arg Ala Arg Glu Asp Trp 35 40 45 Val Ser Glu Asn Gly Asn Pro Asn Leu His Val Phe Ala Thr His Phe 50 55 60 Gly Lys Ser Arg Val Gln Val Ala Asp Cys Asp Thr Arg Glu Phe Thr 65 70 75 80 Asp Gln Lys Arg Leu Glu Met Ser Val Thr Glu Phe Val Glu Gln Trp 85 90 95 Thr Asn Lys Asp Ser Ile Glu Glu Ser Val Leu Tyr Leu Lys Asp Trp 100 105 110 His Phe Val Lys Glu Tyr Pro Asp Tyr Thr Ala Tyr Gln Thr Pro Pro 115 120 125 Leu Phe Ser Asp Asp Trp Leu Asn Val Tyr Leu Asp Asn Tyr Gln Met 130 135 140 His Glu Asp Arg Asp Ser Phe Gln Lys Tyr Asp Gln Ile Ser Cys Ser 145 150 155 160 Asp Tyr Arg Phe Val Tyr Met Gly Gly Lys Gly Ser Trp Thr Pro Leu 165 170 175 His Ala Asp Val Phe Arg Ser Tyr Ser Trp Ser Ala Asn Val Cys Gly 180 185 190 Lys Lys Arg Trp Leu Phe Leu Pro Pro Pro Gln Ser His Leu Val Tyr 195 200 205 Asp 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcaagtcaag agatcattga cccatcc 27 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 acacggctac gatggaaact ag 22 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtattgttgt tctctatctt gggcat 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ccgaaggttt caccatcact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccccaaagga atgctacaga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tagatcgcat cccattcaca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tggataactg cttgggttcc 20 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aataacacgg cgggtcttca aatct 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcctcgatct ccttgtatcg gctaa 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agcgtcatga aacgttgagt cagtg 25 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgccaaccca acatgagaca gc 22 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cattcccgga aacgcgattt atcag 25 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcaccgtcgt tcctatgact cca 23 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gatgcagcca aatatgggtc aagg 24 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gccattgcat ggataatagc gactc 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 accgggtcgg atataaattg ggttg 25 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cccgggttgg ttctcctgat tc 22 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aaccgccgct atggttttag acg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ccagtcaccg gaaggttatg cac 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 atggggttgc cttacatcgg aga 23 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tggcttgaac aagtgagctt tgct 24 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 cttgaagcaa agcgacgtgg 20 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tgtcttactt taacccctcg tat 23 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 aggtccagga atcgttcaca gaaaat 26 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 agagggatca attcgatcac tcagag 26 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gttattgata tggtcgtacg gtag 24 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 caaaaatact ttggaaggga acg 23 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gacaacccat catgtgtatg tatc 24 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 catatgttaa agcacttgtt ttggt 25 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gtgtttagag gccatcccat tcac 24 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gcatgaccga tttggttagt cgcg 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tgaaatctag tgtagtagtg gacc 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 catatgttcc tcgtactctt caac 24 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ttgtaacggt ataaggcttg gc 22 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gcctctcact tgctagtgtt ata 23 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ttgttttaag ctgtctattt ccaag 25 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cttttggtgg agaagaggag tg 22 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gcatcccatt cacatcccac tctc 24 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 tggtgatctg gaacgctccc c 21 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 cctttggcta catgacgatt tcta 24 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gtcatgaggg tcgagtctgt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 aggcgattat gtcgatgagg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 agacgaatcc gtcaatgagg 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 cggtgaggct acactaaaag c 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 cagagactca ggttcatgct g 21 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 cacagaccat gggccgtac 19 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ggagtcacgg gacaaatgc 19 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ggcttttccc tagagagatc 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gatcaaagtc gccggtaaag 20 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 tccggtattc gatcttctat c 21 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 cggagataaa ataatcagcc tc 22 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 aggtccagga atcgttcaca gaaaat 26 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 agagggatca attcgatcac tcagag 26 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 ccgagaactg gttgtggttt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 gctcttgctt tggtgatggt 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 ttgcatcact ctcgtttacc c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 gcgtcacaga gaacagaaag c 21

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15. 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제(histone arginine demethylase) 단백질 AtJmj11 (Arabidopsis thaliana Jumonji 11)을 코딩하는 유전자 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래의 히스톤 아르기닌 디메틸라제(histone arginine demethylase) 단백질 AtJmj13 (Arabidopsis thaliana Jumonji 13)을 코딩하는 유전자가 돌연변이되어, 종자 발아가 감소된 식물체.
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