KR101293453B1 - ＡｔＦＫＢＰ１６－１ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

ＡｔＦＫＢＰ１６－１ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애기장대 유래 AtFKBP16 -1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법, 상기 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

Description

ＡｔＦＫＢＰ１６－１ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased resistance to various environmental stresses using the AtFKBP16-1 gene and the plant thereof}
본 발명은 AtFKBP16 -1 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대 유래 AtFKBP16 -1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법, 상기 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물에 관한 것이다.
식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학 기술적 가치를 지닌다. 또한 식물방어관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.
환경친화적 식량생산의 측면에서 병 방어 관련 다양한 유전자, 또는 이들 형질을 이용한 작물 육종은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초, 그리고 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력 회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관된 다양한 산업의 활성화에 기여한다.
환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염해 스트레스, 산화스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다.
식물은 이러한 수분 또는 산화 스트레스에 대한 방어기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다. 지금까지 수분 또는 산화 스트레스에 관여하는 다수의 유전자들이 분리되었다.
한국등록특허 제0792169호에는 '전사인자 ＡｔＭＹＢ４４의 유전자 전이를 통한 광엽화, 개화지연 및 환경 스트레스 저항성이 강화된 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0742194호에서는 '환경 스트레스 저항성 조절 유전자를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 AtFKBP16 -1 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 애기장대 AtFKBP16 -1 유전자는 강한 빛, 메틸 비올로겐 및 과산화수소를 포함하는 엽록체 산화적 스트레스 조건하에서 강하게 발현이 유도되고 엽록체내 루멘에 위치하며 강한 빛 조건에서 조립되지 않은(unassembled) 상태에서 광계단백질 복합체로 조립됨(assembled)을 확인하였고, AtFKBP16 -1 유전자 발현이 억제된 애기장대 식물체에서는 강한 빛에 민감성을 나타낸 반면 AtFKBP16 -1 유전자 과발현 식물체에서는 강한 빛, ROS 유도성 메틸 비올로겐 및 과산화수소 처리시 대조구에 비해 저항성을 보여 AtFKBP16 -1이 환경스트레스에 중요한 유전자임을 증명하였다. 또한 AtFKBP16 -1 과발현체는 건조 스트레스에 매우 강한 저항성을 나타내어 신규한 복합 내재해성 유용 유전자로서의 활용성을 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 AtFKBP16 -1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명을 통해 AtFKBP16 -1 유전자 발현이 억제된 애기장대 식물체에서는 강한 빛에 민감성을 나타낸 반면 AtFKBP16 -1 유전자 과발현 식물체에서는 강한 빛, ROS 유도성 메틸 비올로겐 및 과산화수소 처리시 대조구에 비해 저항성을 보였고, AtFKBP16-1 과발현체는 건조 스트레스에 매우 강한 저항성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체의 개발을 위해 AtFKBP16-1 유전자는 유용할 것으로 기대된다.
또한 AtFKBP16 -1의 분자생화학적 분석으로 세포내 엽록체 루멘 기관으로의 표적 및 광계단백질 복합체에서의 위치와 상호작용 단백질과의 기능적 결합 등을 최초로 규명함으로써, 관련 분야에 기초지식으로 유용하게 제공될 수 있다.
도 1은 애기장대 AtFKBP16 -1 항체를 이용한 세포내 위치 추적, 발달시기 및 기관별 단백질 양을 조사한 도면이다. A) AtFKBP16-1 단백질이 엽록체내 루멘기관에 표적됨을 나타내는 면역 블럿. L, 루멘의 분획; M, 틸라코이드 막 분획; PC, 루멘의 마커 단백질 플라스토시아닌; Cytf, 막 마커 단백질 시토크롬 b6f 서브유닛 f. B) 식물발달 시기별 AtFKBP16-1 면역 블럿. 1, 1주된 유식물체; 2, 2주된 유식물체; 3, 3주된 식물체; 4, 4주된 성숙 식물체; 5, 5주된 개화 식물체. C) 식물기관별 AtFKBP16-1 면역 블럿. 1, 2주된 잎; 2, 4주된 잎; 3, 꽃; 4, 줄기; 5, 뿌리: 6, 장각과(siliques).
도 2는 애기장대 AtFKBP16 -1 유전자의 여러 환경 스트레스에 반응하는 유전자 발현 변화를 RT-PCR법으로 분석하고 특히 강한 빛 조건에서 AtFKBP16-1 단백질의 양적 변화를 면역 블럿으로 분석한 결과이다. A) 환경 스트레스별 AtFKBP16 -1 유전자발현 분석. 150 mM NaCl(NaCl), 400 mM 만니톨(Mannitol), 10μM 메틸 비올로겐(MV), 10 mM 과산화수소(H2O2), 100μM 앱시스산(ABA)의 0, 1, 3, 6, 9, 12, 36, 48, 72 시간별 유전자발현. B) 강한 빛에 의한 AtFKBP16 -1 유전자 발현 분석. GL, 일반 강도의 빛(general light intensity. 100 μmole photons m-2 sec-1); HL, 강한 빛(high light intensity, 880 μmole photons m-2 sec-1). C) 강한 빛 스트레스 반응 AtFKBP16-1 면역 블럿.
도 3은 역 유전학(Reverse genetics)에 의한 AtFKBP16 -1 유전자발현 억제 정도와 과발현 정도를 RT-PCR과 면역 분석으로 확인한 후 강한 빛 스트레스 조건에서 AtFKBP16-1 발현 정도에 따른 표현형을 보여주는 도면이다. A) DEX 유도제 특이적 AtFKBP16 -1 유전자 발현억제. RT-PCR에 의한 전사체 수준 및 면역 블럿에 의한 단백질 발현억제 정도. TA, pTA7002 벡터 대조구 T3 형질전환 식물체; R1, R2 및 R3, 독립적 RNAi T3 형질전환 식물체; -, 유도제 비처리구; +, 10μM DEX 유도제 처리구. B) AtFKBP16-1 과발현 면역 블럿. V, pCAMBIA 벡터 대조구 T3 형질전환 식물체; O1 및 O2, 독립적 AtFKBP16-1 과발현 형질전환 식물체. C) AtFKBP16 -1 유전자 발현억제에 의한 강한 빛 민감성 표현형. D) AtFKBP16-1 과발현에 의한 강한 빛 저항성 표현형.
도 4는 AtFKBP16 -1 유전자발현 억제 및 과발현체의 강한 빛 스트레스 시 광계 단백질 변화를 BN-PAGE 및 2-D PAGE 분석 결과로 AtFKBP16 -1 유전자발현 정도가 일차적으로 PSI 광계단백질 복합체 형성에 영향을 주고 있음을 확인한 도면이다. A) AtFKBP16 -1 유전자발현억제/과발현체에서의 BN-PAGE 분석을 통한 광계 단백질 복합체 분석. TA1, pTA7002 벡터 대조구 T3 형질전환 식물체; R3, RNAi; V1, pCAMBIA 벡터 대조구; O1 및 O2, 독립적 AtFKBP16-1 과발현 식물체; SC, PSI-PSII 슈퍼 복합체; PSII-D, PSII 다이머; PSII-M, PSII 모노머; CP43-less, CP-43 less PSII 모노머; LHCII-T, LHCII 트리머(trimer); LHCII-M, LHC-II 모노머. B) 2-D(2-Dimentional) 쿠마시 염색 결과.
도 5는 AtFKBP16-1 단백질이 정상조건에서는 광계 단백질에 조립되지 않은 상태(unassembled)로 존재하나 강한 빛 스트레스 조건에서는 PSI-PSII 단백질 복합체로 조립됨(assembled)을 과발현체를 대상으로 AtFKBP16-1 항체에 의한 면역 블럿 방법으로 BN-PAGE/2-D 젤에서 확인한 도면이다. A) AtFKBP16-1의 BN-PAGE 면역 블럿 결과. WT, 야생형 Col-0 식물체; HL, 강한 빛 처리된 AtFKBP16-1 과발현체; N, 정상 조건 AtFKBP16-1 과발현체. BN-PAGE, blue native PAGE. B) 정상조건과 강한 빛 조건에서의 AtFKBP16-1 2-D 면역 블럿.
도 6은 AtFKBP16-1 과발현에 의한 상호작용 단백질 AtPsaL 단백질의 양적 증가를 BN-PAGE/2-D 분석으로 확인한 도면이다. PsaL, PSI 서브유닛 PsaL 단백질; PsbD, PSII 서브유닛 D2 단백질; 플라스토시아닌, 전기적 수송 단백질(electro transport protein); AtFKBP16-1, AtFKBP 16-1 단백질. V1, pCAMBIA 벡터 대조구 식물체; O2, AtFKBP16-1 과발현 식물체.
도 7은 AtFKBP16-1 과발현체가 발달 시기별 강한 건조 내성이 있음을 보여주는 도면이다. A) AtFKBP16-1 과발현체의 성숙 시기 건조 스트레스 내성 표현형. B) 수분공급에 의한 건조 스트레스 회복력 정도. C) 유식물체 시기 AtFKBP16-1 과발현에 의한 건조 스트레스 내성 표현형.
도 8은 AtFKBP16-1 과발현체가 강한 빛, 메틸 비올로겐 및 과산화수소 등의 산화적 스트레스에 저항성이 있음을 광합성 효율 측정값 Fv/Fm으로 분석한 결과를 보여주는 도면이다. A) 강한 빛(880 μmole photons m-2 sec-1) 처리 0, 1, 3, 6 시간별 Fv/Fm 측정 값. B) 메틸 비올로겐(1, 2, 5 μM) 처리시 0, 0.5, 1, 3 시간별 Fv/Fm 측정값. C) 과산화수소(10, 20 mM) 처리시 0, 0.5, 1, 3 시간별 Fv/Fm 측정값. Fv/Fm, PSII의 최대 양자 수율.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래 AtFKBP16 -1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 방법은 애기장대 유래 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 건조 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 산화 스트레스는 강한 빛, 메틸 비올로겐 또는 과산화수소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 AtFKBP16 -1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 AtFKBP16 -1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
AtFKBP16 -1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 AtFKBP16 -1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현 예에 따른 방법은 애기장대 유래 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 상기 AtFKBP16 -1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 건조 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.
바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대이다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과(Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과(Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae),(연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과(Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과(Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과(Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과(Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과(Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과(Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과(Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과(Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과(Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과(Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과(Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 애기장대 유래 AtFKBP16-1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtFKBP16 -1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 환경 스트레스는 건조 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 애기장대 AtFKBP16 -1 단백질의 엽록체 루멘 기관 표적 및 식물체내 분포 양상
애기장대 AtFKBP16 -1 유전자는 207개 아미노산으로 구성된 펩티딜 프롤릴 이소머라제 도메인(peptidyl prolyl isomerase domain)을 갖는 이뮤노필린(immunophilin) 그룹의 유전자로 UC Berkeley의 Dr. Luan 그룹에 의해 분류되었다(He et al., 2004. Plant Physiol.134:1248-1267). AtFKBP16-1의 항체 제작을 위해 세포 내 성숙형(mature form) 단백질 코딩영역 72~207 아미노산 영역을 GST가 융합된 형태로 pGEX4T-1 벡터 시스템에서 단백질을 생성한 후 트롬빈을 처리하여 약 16 kDa의 AtFKBP16-1 단백질을 분리하고 토끼를 이용하여 AtFKBP16-1 특이적 항체를 제작하였다. 대장균 내 AtFKBP16-1 단백질 생성을 위한 특이적 프라이머는 정방향(5'-ATG AAG GAA CCT GAA GTG ATC-3'; 서열번호 2)과 역방향(5'-TCA TAA TAC TTT CAA GAG CTG GAT TT-3'; 서열번호 3) 염기서열을 사용하였다. 생성된 항체의 AtFKBP16-1 특이성을 대장균에서 발현된 단백질과 식물 엽록체에서 확인 후 이후의 실험에 사용하였다. 항체를 이용해 AtFKBP16-1 단백질의 세포내 위치를 조사하였다. 생물정보학적 분석으로 AtFKBP16-1 단백질이 엽록체 표적 시그널 펩티드 및 틸라코이드 루멘 기관 특이적 염기서열이 존재함이 기 발표 되었으나(He et al., 2004. Plant Physiol.134:1248-1267) 실험을 통한 식물 세포 내에서 위치 확인은 아직 보고되지 않았다. 본 발명에서는 엽록체를 분리한 후 가용성 루멘 기관 분획과 불용성의 막 분획을 구분한 후 두 개의 마커 단백질 항체를 이용해 구분하고자 하였다. 루멘 기관의 가용성 형태는 플라스토시아닌을, 불용성 형태는 막 단백질 시토크롬 f(Cytf) 항체를 마커로 면역 블럿 결과 AtFKBP16-1 단백질이 엽록체 루멘에 존재하는 플라스토시아닌과 같은 가용성 분획에서 확인되어 결과적으로 루멘 기관내 단백질임을 증명하였다(도 1A). 식물체 발달시기에 따른 AtFKBP16-1 단백질 양적 변화를 발아 후 1주된 유식물체, 2주된 유식물체, 3주, 4주 및 5주된 식물체를 대상으로 50㎍의 총 단백질을 면역 블럿에 사용한 결과 AtFKBP16-1 단백질은 1주된 유식물체 시기에 가장 발현양이 많으나 발달 시기 전반에 존재하는 단백질임을 확인하였다(도 1B). 기관별 단백질 분포를 확인하기 위해 50㎍의 총 단백질을 2주된 잎, 4주된 잎, 꽃 기관, 줄기, 뿌리, 장각과(silique) 기관에서 분리하여 조사한 결과 뿌리를 제외한 전 광합성 조직에 존재하고 있음을 확인하였다(도 1C). 이상의 결과로부터 AtFKBP16-1은 엽록체 루멘에 위치하고 식물발달 과정 중 광합성 전 조직에 존재하는 편재하는(ubiquitous) 단백질임을 증명하였다.
실시예 2: 다양한 환경 스트레스 처리에 의한 AtFKBP16 -1 유전자의 발현특성 분석
AtFKBP16 -1 유전자 발현이 다양한 환경 스트레스 처리에 반응하는 정도를 분석하기 위해, 염, 만니톨, 메틸 비올로겐, H2O2, ABA 호르몬 및 강한 빛 관련 화합물 처리를 한 후 AtFKBP16 -1 유전자의 발현 변화를 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 각 스트레스 처리는 종자 발아 후 2주된 애기장대 유식물체를 대상으로 염의 경우 150 mM NaCl 용액을, 만니톨의 경우 400 mM 농도의 용액에서 처리한 후 0, 1, 3, 6, 9, 12, 36, 48, 72 시간대별로 총 RNA를 추출하고, 2㎍ RNA로부터 MMLV 역전사효소(Invitrogen 사)에 의한 cDNA를 합성하여 RT-PCR에 사용하였다. AtFKBP16 -1 특이적 프라이머는 정방향(5'-AAG AAG ACT GTT GAC GAC GAC GG-3'; 서열번호 4) 과 역방향(5'-CTT CAT TAA CAG TCG GTG ACA GGA C-3'; 서열번호 5), AtRD29A 특이적 프라이머는 정방향(5'-CTT CAT TAA CAG TCG GTG ACA GGA C-3'; 서열번호 6)과 역방향(5'-AAG CTC CTT CTG CAC CGG AAC AAC AG-3'; 서열번호 7), 발현량 보정을 위한 AtActin2 프라이머는 정방향(5'-GGA AGG ATC TGT ACG GTA AC-3'; 서열번호 8) 및 역방향(5'-TGT GAA CGA TTC CTG GAC CT-3'; 서열번호 9) 염기서열을 각기 사용하였다. AtFKBP16 -1 유전자발현은 염 스트레스 처리 후 9시간째 매우 약하게 증가되었으나 36 시간부터 처리전 수준으로 회복되었다. AtRD29A 유전자 발현 분석은 다양한 환경 스트레스 처리구의 스트레스 유도 상태를 입증하기 위한 대조구로 사용하였다(Kasuga et al., 2004, Plant Cell Physiol. 45:346-350). 건조 스트레스를 유도하는 만니톨 처리시에도 AtFKBP16 -1은 처리후 9시간째 약하게 증가 되었으나 큰 변화는 없었다. ROS(Reactive oxygen species)을 유발하는 10mM H2O2 과 10μM 메틸 비올로겐 처리구도 상기와 같은 방법으로 처리한 후 cDNA 합성에 의한 RT-PCR 분석을 수행하였다. H2O2 와 MV 처리구 모두에서 AtFKBP16 -1의 유전자발현이 처리 후 1시간 내에서부터 강하게 증가함으로써 빠른 시간내에 산화적스트레스에 AtFKBP16 -1 유전자발현이 반응함을 확인하였다. MV의 경우 48시간까지 발현량이 증가하였으나 H2O2 처리구에서는 3시간 이후 발현량이 처리 전 수준으로 회복되어 매우 짧은 시간 내에 반응함을 알 수 있었다. 반면 ABA 호르몬 처리시에는 AtFKBP16 -1 발현량이 감소하였다(도 2A). 엽록체 단백질로서 강한 빛에 의한 유전자발현 변화를 관찰하기 위해 일반적 빛 세기 조건(100 μmole photons m-2 sec-1)과 강한 빛 조건(880 μmole photons m-2 sec-1)에서 비교 분석하였다. AtFKBP16 -1 유전자는 빛 조건 특이적으로 발현되며 특히 강한 빛 스트레스 처리시 유전자발현이 크게 증가함을 나타내었으며(도 2B) 항체를 이용한 단백질 수준에서도 강한 빛에 의한 AtFKBP16-1 단백질의 양적 증가가 확인되었다(도 2C). 상기의 결과로부터 AtFKBP16 -1 유전자발현은 다양한 환경 스트레스에 반응하며 특히 엽록체 산화적 스트레스에 매우 민감하게 조절되는 유전자로 사료된다.
실시예 3: AtFKBP16 -1 유전자 발현억제/과발현 형질전환체의 강한 빛 반응 분석
AtFKBP16-1의 DEX 유도성 RNA 간섭 기법에 의한 유전자발현 억제 식물체를 생산하기 위해 pTA7002 바이너리 벡터에 AtFKBP16 -1 특이적 안티센스 가닥 프라이머 정방향(5'-TCA AAG ACC AGA GGC TCG TTC GCA TG-3'; 서열번호 10)과 역방향(5'- ATG GCC TTA AGC GCG GGA AAA TCA AG-3'; 서열번호 11), 센스 가닥 프라이머 정방향(5'-ATG GCC TTA AGC GCG GGA AAA TCA AG -3'; 서열번호 12)과 역방향(5'-TCA AAG ACC AGA GGC TCG TTC GCA TG-3'; 서열번호 13) 염기서열을 각기 사용하여 클로닝 하였다. T3 세대로부터 하이그로마이신 항생제를 이용해 RNAi 호모 라인을 선발하고 DEX 유도제 특이적 유전자발현 억제 정도를 RT-PCR로 확인한 결과 유전자발현이 3개의 독립적 호모 라인에서 매우 약하거나 강한 억제 정도가 관찰되었고 단백질 수준에서도 대조구에 비해 3개 라인 모두 약하거나 강한 억제 현상이 확인되어 클로닝한 RNAi가 효과적으로 발현되어 작용함을 확인하였다(도 3A). 35S 프로모터를 이용한 과발현체 생산을 위해 AtFKBP16 -1 특이적 프라이머 정방향(5'- ATG GCG ATG GCT TAT GGA GAT TTC TCT TCC TTT CGT TGG ATC-3'; 서열번호 14)과 2-HA(Hemagglutinin) 펩티드 태그(YPYDVPDYA)가 결합된 역방향(5'-AAG CGT TAA ATC CTG GAA CAT CGT ATG GGT AAG CGT AAT CTG GAA CAT CGT ATG GGT ATA TAA TAC TTT CAA GAG CTG G-3'; 서열번호 15) 염기서열을 사용하여 pCAMBIA 벡터에 클로닝 하였다. RNAi에서와 동일하게 호모 라인을 T3 세대로부터 선별하고 단백질 과발현 정도를 분석한 결과 10㎍ 클로로필-기초의 면역 블럿에서 대조구에 비해 AtFKBP16-1 단백질이 과발현되고 있음이 확인되었다(도 3B). 유전자발현 변화에 따른 스트레스 표현형을 관찰하기 위해 정상 조건과 강한 빛 조건에서 RNAi 경우 DEX 유도제 특이적 민감성을 뿌리 길이로 확인하였으며(3C) 과발현체에서는 강한 빛 스트레스에 대한 저항성을 나타내어(도 3D) AtFKBP16-1 단백질의 양적 변화가 강한 빛 스트레스 기작에 관련성이 있음을 형질전환체를 통한 유전학적 방법으로 확인하였다. 또한 BN-PAGE/2-D 분석으로 AtFKBP16-1이 강한 빛 스트레스 시 광계 단백질 복합체 PSI에 우선적으로 영향이 있음을 관찰하였다. BN-PAGE 분석은 5-13.5% gradient native gel을 사용하여 UC Florida Dr. Kenneth Cline's lab 방법을 사용하였다(Lima et al, 2006, P.N.A.S. 103:12631-12636). RNAi 및 과발현체의 BN-PAGE에서의 광계단백질 복합체 변화는 RNAi의 경우 대조구에 비해 전체적으로 PSI-PSII 슈퍼 컴플렉스, PSI-PSII 다이머, PSI 모노머 및 LHCII 트리머가 감소하고 LHCII 모노머가 증가하였으나 과발현체에서는 대조구에 비해 PSI-PSII 슈퍼 컴플렉스, PSI-PSII 다이머 및 LHCII-트리머가 증가된 결과를 나타내었다(도 4A). 광계 단백질 변화를 심도있게 분석하기 위해 BN-PAGE 상의 각 샘플을 SDS-PAGE에서 2-D 분석하였다. 분자량에 의한 광계 단백질 분리 양상으로 RNAi의 경우 대조구 TA1에 비해 R3 유전자억제 식물체에서 PSI 복합체가 강한 감소를 보였고 PSII 모노머 복합체 단백질도 크게 감소되었음을 보여 주었으나 과발현체(O2)에서는 PSI 복합체가 대조구(V1)에 비해 증가되었으나 PSII 모노머 복합체 단백질은 증가되지 않아 두 시스템에서의 상대적 비교시 AtFKBP16-1 단백질은 PSI 복합체에 우선적으로 기능할 수 있음을 확인하였다(도 4B).
실시예 4: BN - PAGE /2-D 분석을 통한 AtFKBP16 -1 단백질의 광계 단백질 복합체내 위치 확인
AtFKBP16-1 항체를 이용해 광계단백질 복합체에서의 위치 추적을 위해 BN-PAGE 젤을 면역 블럿하였다. BN-PAGE 면역 블럿에서 AtFKBP1은 야생형 또는 벡터 대조구 틸라코이드에서는 항원-항체 반응 신호 감지가 어려워 과발현체에서 위치를 확인하였다. AtFKBP16-1 단백질은 정상조건에서는 광계 단백질 복합체에 조립되지 않은(unassembled) 상태로 존재하며 강한 빛(880 μmole photons m-2 sec-1) 조건에서는 PSI-PSII 광계단백질 복합체로 조립된(assembled) 변화를 보여 주어(도 5A) AtFKBP16-1 과발현체가 정상 조건에서는 대조구와 같은 표현형을 보이나 강한 빛 스트레스 조건에서는 저항성 결과에서와 같이 특정 스트레스에 민감하게 반응/기능하는 단백질임을 시사하고 있다. 2-D PAGE 분석을 통해 AtFKBP16-1 단백질이 강한 빛 특이적 광계단백질 복합체로 이동함을 확인하고자 하였다. 2-D 분석 결과 스트레스 특이적 AtFKBP16-1 16 kDa 단백질의 이동이 재확인 되었으며 강한 빛 조건(도 2C)에서와 같이 AtFKBP16-1 단백질 양이 증가하였으며 단백질의 2배 또는 3배 정도 분자량 크기에서도 AtFKBP16-1이 확인되어 강한 빛 조건시 AtFKBP16-1 단백질의 구조적 변화 또는 다른 단백질과의 결합 가능성 등의 변화가 있을 것으로 예측된다(도 5B).
실시예 5: AtFKBP16 -1 과발현에 의한 상호작용 단백질 AtPsaL 의 변화 분석
최근의 보고에 의하면 AtFKBP16-1의 상호작용 단백질이 PSI 구성 단백질 AtPsaL 임이 Y2H 분석으로 확인되었다(Gollan et al, 2011, Physiologia Plantarum. 143:385-395). AtPsaL의 고등식물에서의 기능은 현재까지 PSI 복합체 형성에 관여하고 있음이 보고되었지만 세포내 생화학적 역할에 대한 연구결과는 보고되고 있지 않다. AtPsaL과 AtFKBP16-1의 기능적 관련성을 확인하기 위해 BN-PAGE/2-D 분석으로 AtFKBP16-1 과발현체에서의 상호작용단백질 AtPsaL의 광계단백질 복합체 내 위치 및 양적 변화를 분석한 결과 벡터 대조구(V1)에 비해 AtFKBP16-1 단백질이 과발현된 식물체(O2)에서 AtPsaL 단백질의 양적 증가가 확인되었다. 반면 광계 II의 D2 단백질 및 PSII에서 PSI으로 전자를 전달하는 플라스토시아닌(Plastocyanin) 단백질의 양적 변화는 관찰되지 않아 엽록체내 AtPsaL 특이적 양적 변화와 두 단백질의 기능적 연관성을 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 6: AtFKBP16 -1 과발현에 의한 건조 스트레스 내성
AtFKBP16-1 단백질이 과발현된 식물체의 환경 스트레스 내성 분석 결과 건조 스트레스에 강한 내성을 나타내었다. 동일 조건에서 자란 3주된 식물체를 12일간 수분을 공급하지 않고 관찰한 결과 벡터 대조구(V1)에 비해 AtFKBP16-1 과발현 식물체가 건조에 강한 내성을 보여 주었다(도 7A). 건조 스트레스 후 수분 회복력을 관찰하기 위하여 15일간 건조 스트레스를 지속한 후 충분한 물을 공급하여 건조 스트레스 극복 정도를 비교한 결과 대조구에 비해 과발현체에서 빠른 시간내 건조 스트레스가 회복됨을 확인할 수 있었다(도 7B). 또한 발달 시기별 건조 스트레스 내성을 관찰하기 위해 발아후 일주일된 유식물체를 지속적으로 30일 동안 수분을 공급하지 않고 건조 스트레스를 주었을 때 대조구에 비해 강한 저항성을 보여 AtFKBP16 -1 유전자가 건조 스트레스 내성 형질에 활용될 수 있는 가능성을 확인하였다(도 7C).
실시예 7: AtFKBP16 -1 과발현에 의한 산화적 스트레스 내성
AtFKBP16 -1 유전자 발현이 강한 빛, 산화적 스트레스인 메틸 비올로겐 및 과산화수소 화합물 처리시 크게 증가되어 AtFKBP16-1 과발현체에서 스트레스 내성을 확인하고자 하였다. 3주된 식물체를 대상으로 강한 빛을 1, 3 그리고 6 시간 동안 처리후 각 시간대별 광합성 효율 정도를 Fv/Fm 값으로 측정하여 비교 분석하였다. 3시간 동안 처리구에서 벡터 대조구에 비해 과발현 식물체의 광합성 효율이 증가하였으며 처리 시간이 길어질수록 과발현체의 상대적 광합성 효율이 증가하여 6시간 처리구에서는 최대 2.5배 이상 증가 되었다(도 8A). ROS 유도성 메틸 비올로겐 스트레스 처리에서도 시간/농도별 조건에서 과발현체가 최고 2배 이상의 광합성 효율 값을 나타내 엽록체의 산화스트레스에 AtFKBP1이 기능함을 알 수 있었다(도 8B). 또 다른 ROS 유도물질 과산화수소 처리 조건에서도 과발현체에서 20 mM 농도 3시간 처리구에서 가장 높은 1.7배의 상대적 측정치를 나타내었다(도 8C). 이상의 결과로부터 AtFKBP16-1은 엽록체 광합성 반응의 산화 스트레스 방어기작에 중요한 역할을 하는 단백질로서 환경 스트레스 내성 작물 개발을 위한 기능이 확인되었다.
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Claims (13)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대 유래 AtFKBP16-1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 애기장대 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 애기장대 식물의 건조 또는 산화 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 AtFKBP16-1 유전자를 애기장대 식물세포에서 과발현시켜 애기장대 식물의 건조 또는 산화 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대 유래 AtFKBP16-1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 애기장대 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 애기장대 식물세포로부터 애기장대 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 건조 또는 산화 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 애기장대 식물체의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 애기장대 유래 AtFKBP16-1 유전자를 애기장대 식물세포에서 과발현시켜 건조 또는 산화 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 애기장대 식물체를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제5항의 방법에 의해 제조된 건조 또는 산화 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 애기장대 식물체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 애기장대 식물체는 건조 또는 산화 스트레스에 대한 내성이 증가된 것을 특징으로 하는 애기장대 식물체.
  11. 삭제
  12. 제9항에 따른 애기장대 식물체의 종자.
  13. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대 유래 AtFKBP16-1(Arabidopsis thaliana FK506-binding protein 16-1) 유전자를 포함하는, 애기장대 식물체의 건조 또는 산화 스트레스 내성 조절용 조성물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150142136A (ko) 2014-06-10 2015-12-22 전남과학대학교 산학협력단 오이 유래의 CsGolS1 유전자를 이용한 고온 또는 염에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 용도
KR20160057222A (ko) * 2014-11-13 2016-05-23 명지대학교 산학협력단 식물의 환경 스트레스 내성을 조절하는 AtLRK10L1.2 유전자 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100781075B1 (ko) 2007-02-14 2007-11-30 세종대학교산학협력단 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＯｓＭＳＲＰＫ1유전자
KR100834380B1 (ko) 2007-01-19 2008-06-02 명지대학교 산학협력단 식물의 수분 스트레스 저항성을 증가시키는 시토크롬ｐ４５０ 유전자
KR101200989B1 (ko) 2009-12-21 2012-11-13 연세대학교 산학협력단 건조 스트레스 저항성 관련 유전자 및 형질전환 식물체

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100834380B1 (ko) 2007-01-19 2008-06-02 명지대학교 산학협력단 식물의 수분 스트레스 저항성을 증가시키는 시토크롬ｐ４５０ 유전자
KR100781075B1 (ko) 2007-02-14 2007-11-30 세종대학교산학협력단 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＯｓＭＳＲＰＫ1유전자
KR101200989B1 (ko) 2009-12-21 2012-11-13 연세대학교 산학협력단 건조 스트레스 저항성 관련 유전자 및 형질전환 식물체

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150142136A (ko) 2014-06-10 2015-12-22 전남과학대학교 산학협력단 오이 유래의 CsGolS1 유전자를 이용한 고온 또는 염에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 용도
KR20160057222A (ko) * 2014-11-13 2016-05-23 명지대학교 산학협력단 식물의 환경 스트레스 내성을 조절하는 AtLRK10L1.2 유전자 및 이의 용도
KR101664943B1 (ko) 2014-11-13 2016-10-11 명지대학교산학협력단 식물의 환경 스트레스 내성을 조절하는 AtLRK10L1.2 유전자 및 이의 용도

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